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WO2001004160A1 - Anti-idiotypic antibodies of fibroblast growth factors and their use as medicines - Google Patents

Anti-idiotypic antibodies of fibroblast growth factors and their use as medicines Download PDF

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Publication number
WO2001004160A1
WO2001004160A1 PCT/FR2000/001952 FR0001952W WO0104160A1 WO 2001004160 A1 WO2001004160 A1 WO 2001004160A1 FR 0001952 W FR0001952 W FR 0001952W WO 0104160 A1 WO0104160 A1 WO 0104160A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
idiotypic
fgf
ig2id
antibodies
igl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2000/001952
Other languages
French (fr)
Inventor
Jean PLOUËT
Jacqueline Jouanneau
Jean-Paul Thiery
Pierre Savagner
Bernard André MALAVAUD
Sylvie Sordello
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Priority to AU62947/00A priority patent/AU6294700A/en
Priority to JP2001509769A priority patent/JP2003504379A/en
Priority to EP00949660A priority patent/EP1189947A1/en
Publication of WO2001004160A1 publication Critical patent/WO2001004160A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the invention is anti-idiotypic antibodies to fibroblast growth factors and their use as medicaments.
  • Fibroblast growth factors or fibroblast growth factors (FGFs, “fibroblast growth factors”) are currently recognized as the major players in cell homeostasis.
  • FGFs fibroblast growth factors
  • the role of FGFs has been demonstrated in angiogenesis, tumorigenesis and neuronal degeneration.
  • the decrease in FGFs causes apoptosis (programmed death of the cell), and their overabundance causes cell multiplication.
  • the fibroblast growth factors are a family of 16-30 kDa peptides that bind to heparin. Examples of members of the FGF family are: acidic fibroblast growth factor (aFGF) / FGF-1 (Jaye et al, Science 233: 541, 1986), basic fibroblast growth factor bFGF ("Basic fibroblast growth factor”) / FGF-2 (Abraham et al, Science 233: 545, 1986), int-2 / FGF-3 (Smith et al, EMBO J. 7: 1013, 1988), FGF-4 (Delli-Bovi et al., Cell 50: 729, 1987), FGF-5 (Zhan et al., Mol. Cell Biol.
  • FGF-6 Maries et al., Oncogene 4: 335 , 1989
  • FGF-7 Full et al., Science 245: 752, 1989
  • FGF-8 Tumor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8928, 1992
  • FGF-9 (Miyamoto et al., Mol. Cell Biol. 13: 4251, 1993).
  • Patent application WO 90/05184 (CHIRON) describes compositions containing basic and acidic human FGFs, which are acetylated in the amino-terminal position.
  • Applications WO 96/35708 and WO 96/35716 (HOPKLNS UNTV ⁇ RSITY OF MEDICLNE) describe homologs of fibroblast growth factors 1 and 2 respectively.
  • FGF-R 1 to 4 transmembrane tyrosine kinases identified as FGF receptors.
  • FGF-R 1 to 4 transmembrane tyrosine kinases
  • Each of these genes can generate several isoforms by optional splicing of premessage RNA.
  • the structure of these genes is conserved, that is to say that their extracellular domain consists of 2 or 3 immunoglobulin type domains and an intracellular domain endowed with tyrosine kinase activity.
  • the isoform of FGF-R1 comprising the 3 domains of the immunoglobulin type (FGF-R1 / 3 loops) binds FGF2 and not FGF1, while the FGF-R1 / 2 loop isoform binds with the same affinity FGF1 and FGF2.
  • the use of the exon IJIb confers on FGF-R2 (FGF-R2b) the competence to bind FGF1 without binding FGF2, while the use of exon LUc confers on it the competence to bind FGF1 and FGF2 (Bikfalvi A. Klein S., Pintucci G., Rifkin DM., Endocrine reviews, 1997, 18, 26-45).
  • a growth factor can induce many different effects, for example proliferation or survival, depending on whether it binds to one or the other of its receptors. Muneutralization can therefore have beneficial effects by inhibiting proliferation, but also undesirable effects by reducing survival.
  • the combination of interactions between ligands (such as FGFs) and receptors is very complex, because a growth factor can bind to several receptors and similarly, several growth factors can bind to the same receptor.
  • ligands such as FGFs
  • the products of the 18 genes coding for FGFs have the products of the 4 genes coding for receptors for FGFs.
  • glycosaminoglycans have strong affinity for glycosaminoglycans.
  • growth factors such as FGF are sequestered in the extracellular matrices and are found only in the immediate vicinity of their place of synthesis, which makes it difficult to apprehend their role in vivo.
  • One of the aims of the invention is to propose the use of anti-idiotypic antibodies to growth factors with heparin affinity, making it possible to specifically target on one or the other of their receptors, a new type of circulating agonists.
  • Another aspect of the invention is to provide growth factor receptor antagonists having appropriate specificity and a long half-life.
  • Another object of the invention is to provide internal images of the binding domains of FGFs to their receptors, which by virtue of their immunoglobulin structure are circulating.
  • one of the aims of the invention is to provide internal images of the binding domains of FGF1 to FGF-R2b, and of FGF2 to FGF-R1, which by virtue of their immunoglobulin structure are circulating.
  • One of the other aims of the invention is to propose the use of anti-idiotypic antibodies to stimulate or inhibit the activity of FGF1 receptors and / or FGF2 receptors, or to propose drug vectors for interest via FGF1 and / or FGF2 receptors.
  • the present invention relates to the use of anti-idiotypic fibroblast growth factor 1 antibodies and / or anti-idiotypic fibroblastic growth factor 2 antibodies, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies involving cells.
  • endothelial cells engaged in an angiogenesis process either to inhibit angiogenesis or to promote angiogenesis, without affecting quiescent endothelial cells, or for the preparation of a diagnostic product for pathologies involving endothelial cells engaged in a process angiogenesis.
  • endothelial cells engaged in a process of angiogenesis means endothelial cells migrating through the basal lamina and multiplying.
  • immunostaining using antibodies directed against the ⁇ 3 integrin can be used (Brooks et al., Cell, 1994, 79: 1157-1164 ) or VEGF-R2 (Ortega N. et al, American Journal of Pathology, Vol. 151, 1215-1224, 1997).
  • the term "quiescent endothelial cells” means endothelial cells of normal, non-angiogenic adult vessels.
  • the invention relates to the use of anti-idiotypic fibroblast growth factor 1 antibodies and or anti-idiotypic fibroblastic growth factor 2 antibodies, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies involving endothelial cells. angiogenic, by respective selective stimulation of the FGFR2b and FGF-R1 receptor.
  • the expression “angiogenic endothelial cells” designates the cells involved in an angiogenesis process.
  • the invention relates to the use of anti-idiotypic fibroblastic growth factor 1 antibodies and / or anti-idiotypic fibroblastic growth factor 2 antibodies, for the preparation of a medicament intended to the treatment of pathologies involving endothelial cells engaged in an angiogenesis process, to inhibit angiogenesis, without affecting quiescent endothelial cells, which anti-idiotypic antibody is coupled to a toxin whose function is to block the translation of proteins, said toxin being chosen in particular from saporin, ricin or else a radioactive element such as iodine 125 or 131, or which anti-idiotypic antibody is in the form of a Fab fragment.
  • the invention relates to the use of anti-idiotypic fibroblast growth factor 1 antibodies and / or anti-idiotypic fibroblast growth factor 2 antibodies, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies involving endothelial cells engaged in an angiogenesis process to promote angiogenesis, without affecting the quiescent endothelial cells.
  • anti-idiotypic antibodies to fibroblastic growth factor 1 or anti-idiotypic antibodies to fibroblastic growth factor 2 for the preparation of a medicament intended for: - favor physiological angiogenesis to increase the speed of the formation of blood vessels during scarring, maturation of the ovarian yellow body, and / or
  • FGF1 and / or FGF2 receptors selectively stimulate the activity of FGF1 and / or FGF2 receptors in pathologies where said receptors are functionally deficient, and / or
  • the invention relates to an anti-idiotypic antibody, in particular monoclonal, and in particular humanized, of fibroblastic growth factor 1, characterized in that it is respectively a ligand of the human receptor FGFR2b.
  • the invention relates to an anti-idiotypic antibody, in particular monoclonal, and in particular humanized, of fibroblastic growth factor 1, characterized in that it has the following properties:
  • the invention relates to an anti-idiotypic antibody, in particular monoclonal, and in particular humanized, of fibroblastic growth factor 2, characterized in that it is respectively a ligand of the human receptor FGF-Rl.
  • the invention relates to an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor 2, in particular monoclonal, and in particular humanized, characterized in that it has the following properties:
  • the anti-idiotypic FGF1 antibodies of the invention recognize the human FGF-R2b receptor, but do not recognize the FGF-R1 receptor.
  • the anti-idiotypic FGF2 antibodies of the invention recognize the human FGF-R1 receptor but do not recognize the FGF-R2b receptor.
  • anti-idiotypic antibody to fibroblast growth factor 1 characterized in that it is specific with respect to the FGF-R2b receptor”, means that it activates the functions of FGF-R2b.
  • anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor 2 characterized in that it is specific with respect to the FGF-R1 receptor”, means that it activates the functions of FGF-R1.
  • the specificity of the anti-idiotypic antibodies of FGF1 with respect to FGF-R2b can be determined according to the competition test with the radioiodinated FGF1 with respect to its binding to CHO cells transfected with eukaryotic expression vectors containing the sequence of the FGF-R2b receptor.
  • the specificity of the anti-idiotypic antibodies of FGF2 vis-à-vis FGF-R1 can be determined according to the competition test with the radioiodinated FGF2 vis-à-vis its binding to CHO cells transfected with d vectors. containing the sequence of the FGF-R1 receptor.
  • the expression “circulating anti-idiotypic antibody” means carried freely in the circulating blood and not picked up by the vascular walls.
  • the growth factors FGF1 and FGF2 are not circulating.
  • the advantage of the anti-idiotypic antibodies of the invention being specific and circulating, is to target on the angiogenic endothelial cells drugs which do not affect the quiescent endothelial cells.
  • the half-life of anti-idiotypic antibodies is variable from one species to another.
  • the half-life of the anti-idiotypic antibodies FGF1 or FGF2 of the invention can be measured according to the following test: intravenous injection of the ligand
  • FGFl or FGF2 radioiodinated, then collected at different blood time intervals and counting of radioactivity.
  • the half-life is the time it takes for 50% of the initial radioactivity to disappear from the circulating blood.
  • the half-life of FGFl is less than 2 minutes; the half-life of FGF2 is less than 2 minutes. As an indication, the half-life of IgG is around 23 days.
  • the 140 kDa protein on which the anti-idiotypic antibodies of the FGF1 of the invention induce the phosphorylation of a tyrosine is FGF-R2b.
  • the 140 kDa protein on which the anti-idiotypic antibodies to FGF2 of the invention induce the phosphorylation of a tyrosine is FGF-R1.
  • FGF-R2b can trigger functions, such as proliferation, migration, resistance to apoptosis, requiring the phosphorylation of FGF-R2b.
  • FGF-R1 can trigger functions such as proliferation, migration, resistance to apoptosis, requiring the phosphorylation of FGF-R1.
  • This aspect can be measured by the phosphorylation test, intended to verify that the anti-idiotypic antibodies according to the invention are functional, that is to say that they induce phosphorylation at the level of tyrosine residues of FGF receptors, otherwise there can be no biological functions such as proliferation, dissociation, angiogenesis etc ...
  • a conventional method for measuring the phosphorylation activity of the FGF receptor for example FGF-R1 consists firstly in incubating VSM cells for 24 hours in a serum-free medium, then for 10 minutes in the presence or in the absence of 100 ng / ml of FGF2 or FGFl, or 500 ⁇ g / ml of Ig2Id FI or Ig2Id F2. The cells are then rinsed with a cold phosphate buffer solution (PBS) and then lysed, and the FGF-R1 is immunoprecipitated using an anti FGF-R1 antibody.
  • PBS cold phosphate buffer solution
  • the complex is separated by electrophoresis on dodecyl sodium sulfate gel (SDS), transferred to a nitrocellulose membrane, and the phosphorylation of FGF-R1 is revealed using an anti-phosphotyrosine antibody.
  • SDS dodecyl sodium sulfate gel
  • the induction of proliferation of vascular endothelial cells means that they multiply. This can be determined according to the test described below (see examples, paragraph 3.1 "Mitogenicity").
  • Stimulation of angiogenesis means that the binding of anti-idiotypic FGF1 antibodies to the FGF-R2b receptor followed by phosphorylation on an FGF-R2b tyrosine and cell proliferation are sufficient to trigger angiogenesis.
  • stimulation of angiogenesis means that the binding of anti-idiotypic FGF2 antibodies to the FGF-R1 receptor followed by phosphorylation on an FGF-R1 tyrosine and cell proliferation are sufficient to trigger angiogenesis. This can be quantified by the test described below (see examples, section 3.3
  • the invention also relates to the Fab fragment of the anti-idiotypic antibodies FGF1 and / or FGF2 according to the invention.
  • the invention also relates to the complex between an anti-idiotypic antibody according to the invention (namely an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor FGF1 and / or to fibroblastic growth factor FGF2), and a toxin, in particular chosen from saporin, ricin, or a radioactive element such as iodine 125 or 131, or strontium.
  • an anti-idiotypic antibody according to the invention namely an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor FGF1 and / or to fibroblastic growth factor FGF2
  • a toxin in particular chosen from saporin, ricin, or a radioactive element such as iodine 125 or 131, or strontium.
  • the subject of the invention is also a process for preparing an anti-idiotypic antibody to fibroblast growth factor 1 and / or an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor 2 according to the invention, characterized in that: a) injecting the fibroblastic growth factor 1 (FGFl) and / or the purified fibroblastic growth factor 2 (FGF2) into an animal, in particular a rabbit, b) drawing the blood to recover the purified immunoglobulins (Ig) containing specific anti-FGF1 (Igl FI) and or anti-FGF2 (Igl F2) antibodies, for example by affinity chromatography for protein A, then specific Igl FI and / or Igl F2 are purified from purified Ig, for example by affinity chromatography for FGFl and or FGF2, c) the above purified Ig or the above specific and purified Igl FI and or Igl F2 are injected into the animal of the same species as that used during the injection of FGFl and
  • specific anti-FGFl antibodies Igl FI
  • the antibodies directed against FGFl anti-FGFl antibodies
  • FGF2 anti-FGFl antibodies
  • anti-FGFl antibodies do not recognize FGF2: in fact, less than 5% of cross-reaction with FGF2 is observed, this which means that at least 20 times more FGF2 than FGF1 is required to neutralize the same amount of anti-FGFl antibodies.
  • specific anti-FGF2 (Igl F2) antibodies do not recognize FGF1: indeed, less than 5% of cross-reaction with FGF1 is observed.
  • the subject of the invention is also an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor 1 and / or fibroblastic growth factor 2, capable of being obtained according to the following process: a) fibroblastic growth factor 1 (FGFl) is injected ) and / or the fibroblast growth factor 2 (FGF2) purified in an animal, in particular a rabbit, b) the blood is taken to recover the purified immunoglobulins (Ig) containing anti-FGFl (Igl FI) and / or anti -FGF2 (Igl F2) specific, for example by affinity chromatography for protein A then, the Igl FI and / or Igl F2 specific are optionally purified from purified Ig, for example by affinity chromatography for FGFl and / or FGF2, c) injecting the above purified Ig or the above specific and purified Igl FI and / or Igl F2 Ig in animals of the same species as that used during the injection of FGFl and / or
  • a subject of the invention is also a process for preparing an anti-idiotypic FGF1 monoclonal antibody and / or an anti-idiotypic FGF2 monoclonal antibody according to the invention, characterized in that: a) FGFl is injected and / or FGF2 from an animal, and in particular from a mouse, b) recovering the splenocytes from the animal synthesizing Igl FI and / or Igl F2, c) fusing the above-mentioned splenocytes with myeloma cells, d) selecting the hybridomas obtained at the end of step c) above in that they synthesize immunoglobulins directed against FGFl and / or FGF2, e) injecting the Igl FI and / or Igl F2 thus selected at the end of l step d) to an animal, and in particular to a mouse, of the same allotype as that which produced Igl FI and / or Igl F2, f
  • Igl F2 i) said Ig2Id FI and / or Ig2Id F2 are recovered.
  • the methods of step a) consist in injecting to a mouse, first, 3 times subcutaneously 15 days apart, then a fourth time intraperitoneally or intravenously, fibroblast growth factor 1 and / or fibroblast growth factor 2, in one quantity varying from 5 to 50 ⁇ g of FGFl and / or FGF2.
  • the spleen of the mouse is removed to recover the splenocytes synthesizing IglF1 and / or Igl F2.
  • Step i) of recovery of the anti-idiotypic antibodies according to the invention more particularly consists in:
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions characterized in that they comprise, as active substance, at least one anti-idiotypic antibody FGF1 and / or FGF2 according to the invention, or at least the fragment
  • PBS phosphate buffer saline
  • Ig immunoglobulins
  • immunoglobulins G immunoglobulins G
  • Igl FI rabbit immunoglobulins 1 purified by protein A-sepharose from blood taken after immunization with FGFl, (antibodies directed against FGFl).
  • Igl F2 rabbit immunoglobulins 1 purified by protein A-sepharose from blood taken after immunization with FGF2, (antibodies directed against FGF2).
  • Ig2Id FI rabbit immunoglobulins 2 purified by protein A-sepharose from blood taken after immunization with Igl FI, (anti-idiotypic antibodies to
  • Ig2Id F2 rabbit immunoglobulins 2 purified by protein A-sepharose from blood taken after immunization with Igl F2 (anti-idiotypic FGF2 antibodies).
  • FGF-Rs FGF receptors, for example FGF-R1 and FGF-R2b. According to an advantageous embodiment, the invention relates to the use of anti-idiotypic FGF1 antibodies for:
  • Ig2Id FI couple Ig2Id FI to drugs or genes of interest in order to vectorize them on cells expressing the FGF1 receptors and stimulate the activity of these receptors
  • Ig2Id FI couples drugs, toxins or genes of interest in order to vectorize them on cells expressing FGF1 receptors and destroy them,
  • Ig2Id FI couple Ig2Id FI to radioactive tracers in order to vectorize them on cells expressing FGFl receptors and visualize them in any medical imaging system.
  • the invention relates to the use of anti-idiotypic antibodies to FGF2 for:
  • Ig2Id F2 to drugs or genes of interest in order to vectorize them on cells expressing FGF2 receptors and stimulate the activity of these receptors
  • Ig2Id F2 to drugs, toxins or genes of interest in order to vectorize them on cells expressing FGF2 receptors and destroy them
  • Ig2Id F2 to radioactive tracers in order to vectorize them on cells expressing FGF2 receptors and visualize them in any medical imaging system.
  • FIGS. 1A and 1B represent the specificity of the anti-idiotypic antibodies Ig2Id FI and Ig2Id F2 for the FGF-Rs receptors.
  • FIG. 1A represents the specificity of the anti-idiotypic antibodies Ig2Id FI and Ig2Id F2 for the FGF-R1 / 2 loop receptor
  • FIG. 1B represents the specificity of the anti-idiotypic antibodies Ig2Id FI and Ig2Id F2 for the FGF receptor -R 1/3 loops.
  • the abscissa axis of FIGS. 1A and IB represents the concentration of modulators, namely the concentration of FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2, expressed in nM.
  • FIG. 1 A The ordinate axis of FIG. 1 A represents the bond of iodized FGF2 on FGF-R1 / 2 loops (expressed in%) and that of FIG. 1B represents the bond of iodized FGF2 on FGF-R1 / 3 loops (expressed in%) in %).
  • CHO pgsA-745 cells transfected with FGF-Rl / 2 loops or FGF-R1 / 3 loops are inoculated with the desired concentrations of FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2, and 2 ng / ml of FGF2 radioiodinated for 3 h at 4 ° C.
  • the wells are then rinsed, the cell layer is then lysed with 0.2 M NaOH as described below.
  • the curve comprising the black diamond () corresponds to FGF2
  • the curve comprising the black triangle ( ⁇ ) corresponds to Ig2Id FI
  • the curve comprising the black square (•) corresponds to Ig2Id F2.
  • Figure 2 shows the proliferation of smooth aortic muscle cells
  • VSM virus-derived anti-idiotypic antibodies
  • Ig2Id FI anti-idiotypic antibodies
  • Ig2Id F2 proliferative action of the anti-idiotypic antibodies
  • the abscissa axis of FIG. 2 represents the concentration of modulators, namely the concentration of FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2; the concentration of FGF 1, FGF2, Ig2Id F 1 and Ig2Id F2 being expressed in nM.
  • the ordinate axis of FIG. 2 represents the number of VSM cells per well (X 10 "3 ).
  • the curve comprising the black diamond () corresponds to FGF2
  • the curve comprising the black square (H) corresponds to Ig2Id FI
  • the curve comprising the black triangle ( A ) corresponds to Ig2Id F2.
  • VSM cells are seeded at low density (5000 cells / well) in 24-well dishes. Variable doses of FGF2, Ig2Id FI or Ig2Id F2 are added after adhesion of the cells to the culture plastic. Each condition is studied in two different wells. The cells are trypsinized and counted on the fourth day.
  • FIG. 3 represents the inhibition of the mitogenic action of Ig2Id (anti-idiotypic antibodies FGF1 and / or FGF2) by the antibodies Igl FI and Igl F2 on the VSM cells.
  • the gray histograms correspond to the absence of antibodies
  • the hatched histograms correspond to the presence of anti-FGF2 antibodies (Igl F2)
  • the black histograms with dots whites correspond to the presence of anti-FGFl antibodies (Igl FI).
  • the abscissa axis represents respectively, from left to right: bringing together the control or Igl FI or Igl F2 respectively with the control, with FGF2, with Ig2Id F2, with FGFl, with Ig2Id FI.
  • the ordinate axis of FIG. 3 represents the number of VSM cells per well (XI 0 "3 ).
  • VSM cells are seeded at low density (5000 cells / well) in 24-well dishes. 5 ng / ml of FGFl or FGF2 or, 20 ⁇ g / ml of Ig2Id FI or Ig2Id F2 are added after adhesion of the cells to the culture plastic in the presence or absence of 50 ⁇ g / ml of Igl FI or Igl F2. Each condition is studied in two different wells. The cells are trypsinized and counted on the fourth day.
  • FIGS. 4A and 4B respectively represent the proliferation of NBT- ⁇ and NBT-LT / R1 cells, and more particularly, the proliferative action of the anti-idiotypic antibodies Ig2Id FI and Ig2Id F2 on said cells.
  • the abscissa axis of FIGS. 4A and AB represents the concentration of modulators, namely the concentration of FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2, expressed in ng / ml.
  • the ordinate axis of FIGS. 4A and 4B represents the number of cells per well (X 10 "3 ).
  • the curve comprising the black diamond (*) in FIGS. 4A and 4B corresponds to FGFl
  • the curve comprising the black square ( ⁇ ) in FIGS. 4 A and 4B corresponds to Ig2Id Fl.
  • the curve comprising the black triangle ( ⁇ ) of FIG. 4B corresponds to FGF2
  • the curve comprising the cross in FIG. 4B corresponds to Ig2Id F2.
  • NBT-II or NBT-II R1 cells are seeded at 5000 cells / well in 24-well dishes. Varying doses of FGFl, FGF2, Ig2Id FI or Ig2Id F2 are added after adhesion of the cells to the culture plastic. Each condition is studied in two different wells. The cells are trypsinized and counted on the fourth day.
  • Figure 5 shows the dissociation of NBT- ⁇ and NBT-II / R1 cells.
  • NBT-II or NBT-LT / FGF-R1 cells are seeded at low density in 12-well plates (5000 cells per well). The next day the modulators, namely
  • FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2 are added to the medium and, on the fourth day, the cells are observed and photogaphiized using an inverted microscope with NIKON diaphot phase contrast.
  • Figure 6 shows corneal angiogenesis
  • the gray rectangles (on the left) correspond to the angiogenesis score on day D7, and the hatched rectangles (on the right) correspond to the angiogenesis score on day D14.
  • the abscissa axis represents respectively, from left to right, the control,
  • FGF2 Ig2Id F1, Ig2Id F2.
  • the ordinate axis represents the angiogenesis score.
  • a 3 mm long incision, involving half the corneal thickness, is made with a corneal dome, under an operating microscope.
  • the corneal stroma is cleaved, in diametrically opposite directions, up to 2 mm from the limbus.
  • the implants previously rehydrated with 2 ⁇ l of PBS containing 30 ⁇ g of Ig2Id FI and Ig2Id F2.
  • the neovascularization is quantified.
  • Each modulator has been studied in at least 4 eyeballs from 4 separate rabbits (8 lenticles). The differences in angiogenesis score between each condition and the control lenticles are evaluated by the Student's t test.
  • Figures 7A and 7B respectively represent the tumor growth of NBT-II and NBT-LT / R1 cells in nude mice.
  • the abscissa axis of FIGS. 7A and 7B represents the number of days after implantation in the nude mouse, and the ordinate axis represents the tumor volume
  • the curve with the black square (B) corresponds to Ig2Id F2
  • the curve with the black triangle ( ⁇ ) corresponds to Ig2Id FI
  • the curve with the black diamond (*) corresponds to the control.
  • 3.5 million NBT-II or NBT-LI / R1 cells are injected under the skin of the right flank of 2 groups of 30 6-week-old female nude mice. 4 days later, each of the 2 preceding groups is divided into 3 groups of 10 mice by drawing lots and the dimensions of any tumors are measured using a caliper.
  • the serum is fractionated immediately after collection and 15 ml of serum are chromatographed on a protein A column (0.9 x 18 cm). The column is washed with PB S and the immunoglobulins are eluted with 0.2 M glycine buffered at pH 2.5, immediately neutralized by adding 1/5 of the volume of 1 M K2HPO4, then dialyzed against PB S. Immunoglobulins (Ig PI) are stored at -80 ° C until used.
  • FGFl 100 ⁇ g of FGFl are emulsified in 0.25 ml of complete Freund's adjuvant and then injected into a rabbit, 4 times at 15 day intervals.
  • the blood drawn between 3 and 7 months after the first injection is fractionated and the Ig are purified by affinity chromatography for protein A (Igl FI).
  • Igl FI protein A
  • the animals are premedicated, and 1 ml of an Evans Blue solution is injected into the plant of the hind legs; 15 minutes later the rabbits are anesthetized.
  • the popliteal cavities are shaved and disinfected with Betadine.
  • a horizontal incision of 2 cm, centered on the popliteal fossa is made with scissors, then the cellulose spaces are torn apart.
  • One to three lymph nodes 2 mm in diameter are identified by their blue coloring and 10 ⁇ g of Igl FI mixed volume by volume with complete Freund's adjuvant is injected there using a micro-syringe of Hamilton in a final volume of 100 ⁇ l and a quantity of primary antibody of 20 ⁇ g. The technique is repeated on the other leg.
  • the blood drawn between 4 and 7 months after the first injection is purified as described above.
  • the anti-idiotype Ig (Ig2Id FI) are then purified by affinity chromatography for protein A.
  • Igl F2 was injected which gave rise to the formation of anti-idiotypic antibodies to FGF2 (Ig2 F2).
  • the sorting and / or the purification of the anti-idiotypic antibodies according to the invention is carried out as described previously, by subjecting the total Ig to two immunoadsorption (see step d) described previously in the method of preparation of the anti-idiotypic antibodies).
  • FGF-R1 / 3 loops seeded at 30,000 cells per well of 2 cm ⁇ are cultured in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) containing 10% fetal calf serum, 100 IU / ml of penicillin and 50 ⁇ g / ml of streptomycin .
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the binding of radioiodinated FGF2 (1.10 ⁇ to 2.10 ⁇ cpm / ng) to the transfected cells is measured at 4 ° C.
  • the cells are washed twice with binding buffer (DMEM containing 20 mM Hepes (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane sulfonic acid) and 2 mg / ml gelatin adjusted to a pH of 7.4).
  • 2 ng / ml of iodized FGF2 are added with variable concentrations of FGF1 or of unlabeled FGF2 or of Ig2Id FI or Ig2Id F2 in a final volume of 0.5 ml.
  • Nonspecific binding is determined in the presence of an excess (500 ng) of purified FGF2. Total and non-specific bonds are determined in duplicate. After two hours, the cells are washed 3 times with cold buffer and lysed with 0.5 ml of
  • the iodine 125 contained in the solubilized material is counted in a gamma counter.
  • VSM Smooth aortic muscle cells
  • the modulators FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2 are added after adhesion of the cells to the culture plastic, and after
  • Ig2Id FI and IG2Id F2 trigger a mitogenic effect on VSM cells.
  • NBT-II or NBT-LT / FGF-R1 cells are seeded at low density in 12-well plates (5000 cells per well). The following day, FGF1, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2 are added to the medium, and on the fourth day the cells are observed and photographed with an inverted microscope of NIKON diaphot phase contrast.
  • Premedicated rabbits are anesthetized.
  • the eye is externalized and immobilized using a latex membrane, carrying in its center a slit of 1 cm long.
  • An incision 3 mm long, involving half the thickness of the corneal stroma, is made with a corneal dome, under an operating microscope (OPMI microscope, Zeiss).
  • the corneal stroma is cleaved, in diametrically opposite directions, up to 2 mm from the limbus.
  • the implants previously rehydrated with 20 ⁇ l of the test solution are inserted (FGF2 200 ng, anti-idiotypic antibodies or control antibodies 40 ⁇ g).
  • Score 1 neovessels not reaching the half distance separating the implant from the limbus
  • Score 3 new vessels exceeding half a distance but not invading the implant
  • Score 4 involvement and invasion of the implant by the new vessels.
  • the rabbits are then sacrificed and the eyeballs removed and fixed in Bouin's fluid for histological analyzes.
  • Each modulator (FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2) has been studied in at least 4 eyeballs from 4 separate rabbits (8 lenticles). The differences in angiogenesis score between each of the conditions tested and the control lenticles are evaluated by the Student's t test.
  • the NBT-II and NBT-II / FGF-R1 cells are detached from the culture plastics using trypsin-EDTA, homogenized, centrifuged and suspended in culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. 1 ml corresponding to 3.5 million cells, is injected under the skin of the right flank of each mouse. The viability of the suspension is checked beforehand by vital staining with trypan blue; the dye is excluded from more than 99% of the cells. 2 groups of 30 6-week-old female nude mice were implanted with NBT-III or NBT- ⁇ / FGF-R1 cells.
  • each of the 2 preceding groups is divided into 3 groups of 10 mice by drawing lots.
  • the dimensions of any tumors are measured using an electronic caliper and, the modulators (FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2) in a final volume of 100 ⁇ l of phosphate + gelatin buffer (2 mg / ml) , are injected intravenously into the tail veins (anti-idiotypic antibodies FGFl and FGF2: 500 ⁇ g, non-immune antibodies: 500 ⁇ g / injection).
  • the injections are repeated twice a week, the measurements are carried out at the same intervals by an operator ignoring the treatment received by each group of mice in each of the 6 groups.
  • the natural ligands FGF1 and FGF2 inhibit the binding of iodized FGF2 to FGF-
  • the internal Ig2Id FI image of FGFl inhibits the binding of iodized FGF2 to CHO cells transfected with FGF-R1 / 2 loops while the internal Ig2IdF2 image of
  • FGF2 inhibits the binding of iodinated FGF2 to CHO cells transfected either by FGF-R 1/2 loops or by FGF-R1 / 3 loops.
  • Ig2Id F2 is therefore an internal image of FGF2 and Ig2Id FI is an internal image of FGFl.
  • Ig2Id FI and FGFl induce the dissociation of NBTIL cells Conversely, FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2 induce dissociation of NBT-LT / FGFR1 cells.
  • non-immune control immunoglobulins inconstantly (15% of cases) cause minor angiogenesis, causing an average score of 0.4 at D15, comparable to that obtained by saturating the lenticles. with a carrier protein (bovine serum albumin).
  • a carrier protein bovine serum albumin
  • the kinetics of appearance of the neo-vessels appear to be different from that obtained with the natural ligand.
  • the FGF2 reaches the threshold of statistical significance with 80% of the maximum effect, while the effects induced by Ig2Id FI and Ig2Id F2 are at 10% and 41% of the maximum scores.
  • Ig2Id FI and Ig2Id F2 induce angiogenesis like the ligands FGFl and FGF2.
  • Tumor growth ( Figure 8).
  • Ig2Id FI nor Ig2Id F2 affect the growth of NBT-II cell xenografts.

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Abstract

The invention concerns the use of anti-idiotypic antibodies of the fibroblast growth factor (1) and/or anti-idiotypic antibodies of the fibroblastic growth factor (2), for preparing a medicine for treating pathologies involving endothelial cells implied in an angiogenic process, either for inhibiting angiogenesis, or for promoting angiogenesis, without affecting the quiescent endothelial cells, or for preparing a diagnostic product for pathologies involving endothelial cells implied in an angiogenic process.

Description

ANTICORPS ANTI-IDIOTYPIQUES DES FACTEURS DE CROISSANCE DES FIBROBLASTES ET LEUR UTILISATION COMME MEDICAMENTS.ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES OF FIBROBLAST GROWTH FACTORS AND THEIR USE AS MEDICAMENTS.

L'invention a pour objet des anticorps anti-idiotypiques des facteurs de croissance des fibroblastes et leur utilisation comme médicaments.The subject of the invention is anti-idiotypic antibodies to fibroblast growth factors and their use as medicaments.

Les facteurs de croissance des fibroblastes, ou facteurs de croissance fibroblastiques (FGFs, « fibroblast growth factors ») sont actuellement reconnus comme les acteurs majeurs de l'homéostasie cellulaire. Le rôle des FGFs a été démontré dans l'angiogénèse, la tumorigénèse et les dégénérescences neuronales. La diminution des FGFs provoque l'apoptose (mort programmée de la cellule), et leur surabondance provoque la multiplication cellulaire.Fibroblast growth factors, or fibroblast growth factors (FGFs, “fibroblast growth factors”) are currently recognized as the major players in cell homeostasis. The role of FGFs has been demonstrated in angiogenesis, tumorigenesis and neuronal degeneration. The decrease in FGFs causes apoptosis (programmed death of the cell), and their overabundance causes cell multiplication.

Les facteurs de croissance des fibroblastes sont une famille de peptides de 16-30 kDa se liant à l'héparine. Des exemples des membres de la famille des FGFs sont : facteur de croissance des fibroblastes acides aFGF (« acidic fibroblast growth factor »)/FGF-l (Jaye et al, Science 233 : 541, 1986), facteur de croissance des fibroblastes basiques bFGF (« basic fibroblast growth factor »)/FGF-2 (Abraham et al, Science 233 : 545, 1986), int-2/FGF-3 (Smith et al, EMBO J. 7 : 1013, 1988), FGF-4 (Delli-Bovi et al., Cell 50 :729, 1987), FGF-5 (Zhan et al., Mol. Cell Biol. 8 :3487, 1988), FGF-6 (Maries et al., Oncogene 4 : 335, 1989) ; FGF-7 (Finch et al., Science 245 :752, 1989), FGF-8 (Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 8928, 1992) etThe fibroblast growth factors are a family of 16-30 kDa peptides that bind to heparin. Examples of members of the FGF family are: acidic fibroblast growth factor (aFGF) / FGF-1 (Jaye et al, Science 233: 541, 1986), basic fibroblast growth factor bFGF ("Basic fibroblast growth factor") / FGF-2 (Abraham et al, Science 233: 545, 1986), int-2 / FGF-3 (Smith et al, EMBO J. 7: 1013, 1988), FGF-4 (Delli-Bovi et al., Cell 50: 729, 1987), FGF-5 (Zhan et al., Mol. Cell Biol. 8: 3487, 1988), FGF-6 (Maries et al., Oncogene 4: 335 , 1989); FGF-7 (Finch et al., Science 245: 752, 1989), FGF-8 (Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8928, 1992) and

FGF-9 (Miyamoto et al., Mol. Cell Biol. 13 :4251, 1993).FGF-9 (Miyamoto et al., Mol. Cell Biol. 13: 4251, 1993).

La demande de brevet WO 90/05184 (CHIRON) décrit des compositions contenant des FGFs humains basiques et acides, qui sont acétylés en position amino- terminale. Les demandes WO 96/35708 et WO 96/35716 (HOPKLNS UNTVΕRSITY OF MEDICLNE) décrivent respectivement des homologues des facteurs de croissance des fibroblastes 1 et 2.Patent application WO 90/05184 (CHIRON) describes compositions containing basic and acidic human FGFs, which are acetylated in the amino-terminal position. Applications WO 96/35708 and WO 96/35716 (HOPKLNS UNTVΕRSITY OF MEDICLNE) describe homologs of fibroblast growth factors 1 and 2 respectively.

A ce jour, au moins 18 gènes codant pour des peptides de cette famille ont été identifiés. Quatre gènes différents codent pour des tyrosine kinases transmembranaires identifiées comme des récepteurs des FGFs, appelés FGF-R 1 à 4. Chacun de ces gènes peut générer plusieurs isoformes par épissage optionnel de TARN prémessager. La structure de ces gènes est conservée, c'est-à-dire que leur domaine extracellulaire est constitué de 2 ou 3 domaines de type immunoglobuline et d'un domaine intracellulaire doué d'activité tyrosine kinase. Ainsi, l'isoforme de FGF-R1 comportant les 3 domaines de type immunoglobuline (FGF-R1/3 boucles) lie le FGF2 et non le FGF1, alors que l'isoforme FGF-R1/2 boucles lie avec la même affinité FGF1 et FGF2. Par ailleurs, l'utilisation de l'exon IJIb confère au FGF-R2 (FGF-R2b) la compétence à lier le FGF1 sans lier FGF2, alors que l'utilisation de l'exon LUc lui confère la compétence à lier FGF1 et FGF2 (Revue Bikfalvi A. Klein S., Pintucci G., Rifkin DM., Endocrine reviews, 1997, 18, 26-45).To date, at least 18 genes coding for peptides of this family have been identified. Four different genes code for transmembrane tyrosine kinases identified as FGF receptors, called FGF-R 1 to 4. Each of these genes can generate several isoforms by optional splicing of premessage RNA. The structure of these genes is conserved, that is to say that their extracellular domain consists of 2 or 3 immunoglobulin type domains and an intracellular domain endowed with tyrosine kinase activity. Thus, the isoform of FGF-R1 comprising the 3 domains of the immunoglobulin type (FGF-R1 / 3 loops) binds FGF2 and not FGF1, while the FGF-R1 / 2 loop isoform binds with the same affinity FGF1 and FGF2. Furthermore, the use of the exon IJIb confers on FGF-R2 (FGF-R2b) the competence to bind FGF1 without binding FGF2, while the use of exon LUc confers on it the competence to bind FGF1 and FGF2 (Bikfalvi A. Klein S., Pintucci G., Rifkin DM., Endocrine reviews, 1997, 18, 26-45).

Or un facteur de croissance peut induire de nombreux effets différents par exemple la prolifération ou la survie, selon qu'il se lie à l'un ou à l'autre de ses récepteurs. L'i munoneutralisation peut donc avoir des effets bénéfiques en inhibant la prolifération, mais aussi des effets indésirables en diminuant la survie. L'analyse des fonctions in vivo résultant de l'activation de l'un quelconque des récepteurs de facteurs de croissance se liant à l'héparine, tels que les FGFs, se heurte à deux écueils majeurs.However, a growth factor can induce many different effects, for example proliferation or survival, depending on whether it binds to one or the other of its receptors. Muneutralization can therefore have beneficial effects by inhibiting proliferation, but also undesirable effects by reducing survival. The analysis of in vivo functions resulting from the activation of any of the heparin-binding growth factor receptors, such as FGFs, comes up against two major pitfalls.

D'une part, la combinaison des interactions entre ligands (tels que les FGFs) et récepteurs est fort complexe, car un facteur de croissance peut se lier à plusieurs récepteurs et de même, plusieurs facteurs de croissance peuvent se lier à un même récepteur. Ainsi, les produits des 18 gènes codant pour les FGFs disposent des produits des 4 gènes codant pour des récepteurs des FGFs.On the one hand, the combination of interactions between ligands (such as FGFs) and receptors is very complex, because a growth factor can bind to several receptors and similarly, several growth factors can bind to the same receptor. Thus, the products of the 18 genes coding for FGFs have the products of the 4 genes coding for receptors for FGFs.

D'autre part, leur forte affinité pour les glycosaminoglycanes fait que les facteurs de croissance tels que FGF sont séquestrés dans les matrices extracellulaire et ne sont retrouvés qu'au voisinage immédiat de leur lieu de synthèse, ce qui rend difficile l'appréhension de leur rôle in vivo.On the other hand, their strong affinity for glycosaminoglycans means that growth factors such as FGF are sequestered in the extracellular matrices and are found only in the immediate vicinity of their place of synthesis, which makes it difficult to apprehend their role in vivo.

A ce jour, il n'existe pas d'autres ligands que les FGFs pour chacune des isoformes des récepteurs des FGFs. Etant donné leur séquestration dans les matrices extracellulaires, l'utilisation des FGFs ne permet pas de distinguer in vivo la fonction de chacune de ces isoformes, et donc leur rôle réel en physiopathologie.To date, there are no ligands other than the FGFs for each of the isoforms of the FGF receptors. Given their sequestration in extracellular matrices, the use of FGFs does not make it possible to distinguish in vivo the function of each of these isoforms, and therefore their real role in pathophysiology.

L'un des buts de l'invention est de proposer l'utilisation d'anticorps anti- idiotypiques de facteurs de croissance à affinité pour l'héparine, permettant de cibler spécifiquement sur l'un ou l'autre de leurs récepteurs, un nouveau type d'agonistes circulants. L'un des autres aspects de l'invention est de fournir des antagonistes de récepteurs de facteurs de croissance ayant une spécificité appropriée et une longue durée de demi- vie. L'un des autres buts de l'invention est de fournir des images internes des domaines de liaison des FGFs à leurs récepteurs, qui du fait de leur structure immunoglobulinique sont circulants.One of the aims of the invention is to propose the use of anti-idiotypic antibodies to growth factors with heparin affinity, making it possible to specifically target on one or the other of their receptors, a new type of circulating agonists. Another aspect of the invention is to provide growth factor receptor antagonists having appropriate specificity and a long half-life. Another object of the invention is to provide internal images of the binding domains of FGFs to their receptors, which by virtue of their immunoglobulin structure are circulating.

Plus particulièrement, l'un des buts de l'invention est de fournir des images internes des domaines de liaison du FGFl à FGF-R2b, et du FGF2 à FGF-Rl, qui du fait de leur structure immunoglobulinique sont circulants.More particularly, one of the aims of the invention is to provide internal images of the binding domains of FGF1 to FGF-R2b, and of FGF2 to FGF-R1, which by virtue of their immunoglobulin structure are circulating.

L'un des autres buts de l'invention est de proposer l'utilisation d'anticorps anti- idiotypiques pour stimuler ou inhiber l'activité des récepteurs du FGFl et/ou des récepteurs du FGF2, ou de proposer des vecteurs de médicaments d'intérêt par l'intermédiaire des récepteurs du FGFl et/ou du FGF2.One of the other aims of the invention is to propose the use of anti-idiotypic antibodies to stimulate or inhibit the activity of FGF1 receptors and / or FGF2 receptors, or to propose drug vectors for interest via FGF1 and / or FGF2 receptors.

La présente invention concerne l'utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 et/ou d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 2, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant des cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogenèse, soit pour inhiber l'angiogénèse, soit pour favoriser l'angiogénèse, sans affecter les cellules endothéliales quiescentes, ou pour la préparation d'un produit de diagnostic de pathologies impliquant des cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogenèse.The present invention relates to the use of anti-idiotypic fibroblast growth factor 1 antibodies and / or anti-idiotypic fibroblastic growth factor 2 antibodies, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies involving cells. endothelial cells engaged in an angiogenesis process, either to inhibit angiogenesis or to promote angiogenesis, without affecting quiescent endothelial cells, or for the preparation of a diagnostic product for pathologies involving endothelial cells engaged in a process angiogenesis.

L'expression "cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogenèse" signifie cellules endothéliales migrant à travers la lame basale et se multipliant.The expression "endothelial cells engaged in a process of angiogenesis" means endothelial cells migrating through the basal lamina and multiplying.

Pour déterminer si des cellules sont engagées dans un processus d'angiogenèse, on peut avoir recours à l'immunomarquage à l'aide d'anticorps dirigés contre l'intégrine β3 (Brooks et al., Cell, 1994, 79 : 1157-1164) ou le VEGF-R2 (Ortega N. et al, American Journal ofPathology, Vol. 151, 1215-1224, 1997). L'expression "cellules endothéliales quiescentes" signifie cellules endothéliales des vaisseaux adultes normaux, non angiogéniques.To determine whether cells are involved in an angiogenesis process, immunostaining using antibodies directed against the β3 integrin can be used (Brooks et al., Cell, 1994, 79: 1157-1164 ) or VEGF-R2 (Ortega N. et al, American Journal of Pathology, Vol. 151, 1215-1224, 1997). The term "quiescent endothelial cells" means endothelial cells of normal, non-angiogenic adult vessels.

L'invention concerne l'utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 et ou d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 2, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant les cellules endothéliales angiogéniques, par stimulation sélective respective du récepteur FGFR2b et FGF-Rl.The invention relates to the use of anti-idiotypic fibroblast growth factor 1 antibodies and or anti-idiotypic fibroblastic growth factor 2 antibodies, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies involving endothelial cells. angiogenic, by respective selective stimulation of the FGFR2b and FGF-R1 receptor.

L'expression « cellules endothéliales angiogéniques » désigne les cellules impliquées dans un processus d'angiogenèse. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 et/ou d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 2, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant des cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogenèse, pour inhiber l'angiogénèse, sans affecter les cellules endothéliales quiescentes, lequel anticorps anti-idiotypique est couplé à une toxine dont la fonction est de bloquer la traduction des protéines, ladite toxine étant notamment choisie parmi la saporine, la ricine ou bien un élément radioactif tel que l'iode 125 ou 131, ou lequel anticorps anti-idiotypique est sous forme de fragment Fab. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 et/ou d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 2, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant des cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogenèse pour favoriser l'angiogénèse, sans affecter les cellules endothéliales quiescentes.The expression “angiogenic endothelial cells” designates the cells involved in an angiogenesis process. According to an advantageous embodiment, the invention relates to the use of anti-idiotypic fibroblastic growth factor 1 antibodies and / or anti-idiotypic fibroblastic growth factor 2 antibodies, for the preparation of a medicament intended to the treatment of pathologies involving endothelial cells engaged in an angiogenesis process, to inhibit angiogenesis, without affecting quiescent endothelial cells, which anti-idiotypic antibody is coupled to a toxin whose function is to block the translation of proteins, said toxin being chosen in particular from saporin, ricin or else a radioactive element such as iodine 125 or 131, or which anti-idiotypic antibody is in the form of a Fab fragment. According to another advantageous embodiment, the invention relates to the use of anti-idiotypic fibroblast growth factor 1 antibodies and / or anti-idiotypic fibroblast growth factor 2 antibodies, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies involving endothelial cells engaged in an angiogenesis process to promote angiogenesis, without affecting the quiescent endothelial cells.

Ainsi, on pourra notamment citer, selon l'invention, l'utilisation d'anticorps anti- idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 ou d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 2 pour la préparation d'un médicament destiné à : - favoriser l'angiogénèse physiologique pour augmenter la vitesse de la formation des vaisseaux sanguins au cours de la cicatrisation, de la maturation du corps jaune de l'ovaire, et/ouThus, mention may in particular be made, according to the invention, of the use of anti-idiotypic antibodies to fibroblastic growth factor 1 or anti-idiotypic antibodies to fibroblastic growth factor 2 for the preparation of a medicament intended for: - favor physiological angiogenesis to increase the speed of the formation of blood vessels during scarring, maturation of the ovarian yellow body, and / or

- favoriser l'angiogénèse au cours de pathologies obstructives des vaisseaux afin de reperfuser des territoires ischémies lors de trombose vasculaire comme notamment dans l'artérite des membres inférieurs et l'infarctus du myocarde, et/ou- favor angiogenesis during obstructive pathologies of the vessels in order to reperfuse ischemic territories during vascular trombosis as in particular in arteritis of the lower limbs and myocardial infarction, and / or

- stimuler sélectivement l'activité des récepteurs du FGFl et/ou du FGF2 dans des pathologies où lesdits récepteurs sont fonctionnellement déficients, et/ou- selectively stimulate the activity of FGF1 and / or FGF2 receptors in pathologies where said receptors are functionally deficient, and / or

- inhiber sélectivement l'activité des récepteurs du FGFl et/ou du FGF2 à l'aide de fragments Fab ou d'anticorps anti-idiotypiques bloquants, et/ou - retarder ou arrêter le processus de dégénères ence des photorécepteurs de la neuroretine observé au cours des rétinites pigmentaires génétiques ou acquises lors des surdosages de médicaments inhibant la phosphodiesterase dépendant du GMP-cyclique, et/ou - stimuler la phagocytose des segments externes des bâtonnets par les cellules épithéliales pigmentées de la rétine comme traitement de certaines rétinopathies pigmentaires et des formes sèches de la dégénérescence maculaire liée à l'âge.- selectively inhibit the activity of FGF1 and / or FGF2 receptors using Fab fragments or blocking anti-idiotypic antibodies, and / or - delay or stop the process of degeneration of neuroretin photoreceptors observed in the course of genetic or acquired pigmentary retinitis in overdoses of drugs inhibiting phosphodiesterase dependent on GMP-cyclic, and / or - stimulate phagocytosis of the external segments of the rods by the pigmented epithelial cells of the retina as a treatment for certain pigmentary retinopathies and dry forms of age-related macular degeneration.

De même, on pourra citer, selon l'invention, l'utilisation d'anticorps anti- idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 et/ou d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 2, associés à une toxine ou de fragment Fab d'anticorps anti-idiotypique, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant inhibition de l'angiogénèse telles que cancer, rétinopathies diabétiques et le rejet de greffes de cornée. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps anti- idiotypique, notamment monoclonal, et notamment humanisé, du facteur de croissance fibroblastique 1, caractérisé en ce qu'il est respectivement un ligand du récepteur humain FGFR2b.Similarly, mention may be made, according to the invention, of the use of anti-idiotypic antibodies to fibroblast growth factor 1 and / or of anti-idiotypic antibodies to fibroblastic growth factor 2, associated with a toxin or fragment Fab of anti-idiotypic antibodies, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies requiring inhibition of angiogenesis such as cancer, diabetic retinopathies and rejection of corneal transplants. According to an advantageous embodiment, the invention relates to an anti-idiotypic antibody, in particular monoclonal, and in particular humanized, of fibroblastic growth factor 1, characterized in that it is respectively a ligand of the human receptor FGFR2b.

Plus particulièrement, l'invention concerne un anticorps anti-idiotypique, notamment monoclonal, et notamment humanisé, du facteur de croissance fibroblastique 1, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes :More particularly, the invention relates to an anti-idiotypic antibody, in particular monoclonal, and in particular humanized, of fibroblastic growth factor 1, characterized in that it has the following properties:

- il est spécifique vis-à-vis du récepteur FGF-R2b,- it is specific with respect to the FGF-R2b receptor,

- il est circulant,- it is circulating,

- il présente une durée de demi-vie d'environ 23 jours, notamment d'environ 21 jours, et en particulier de 22,5 jours,- it has a half-life of approximately 23 days, in particular approximately 21 days, and in particular 22.5 days,

- il induit la phosphorylation sur une tyrosine d'une protéine de 140 kDa,- it induces phosphorylation on a tyrosine of a 140 kDa protein,

- il induit la prolifération des cellules endothéliales vasculaires,- it induces the proliferation of vascular endothelial cells,

- il stimule l'angiogénèse,- it stimulates angiogenesis,

- il ne provoque pas d'hypotension artérielle. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps anti-idiotypique, notamment monoclonal, et notamment humanisé, du facteur de croissance fibroblastique 2, caractérisé en ce qu'il est respectivement un ligand du récepteur humain FGF-Rl .- it does not cause hypotension. According to another advantageous embodiment, the invention relates to an anti-idiotypic antibody, in particular monoclonal, and in particular humanized, of fibroblastic growth factor 2, characterized in that it is respectively a ligand of the human receptor FGF-Rl.

Plus particulièrement, l'invention concerne un anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 2, notamment monoclonal, et notamment humanisé, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes :More particularly, the invention relates to an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor 2, in particular monoclonal, and in particular humanized, characterized in that it has the following properties:

- il est spécifique vis-à-vis du récepteur FGF-Rl,- it is specific with respect to the FGF-Rl receptor,

- il est circulant, - il présente une durée de demi-vie d'environ 23 jours, notamment d'environ 21 jours, et en particulier de 22,5 jours,- it is circulating, - it has a half-life of approximately 23 days, in particular approximately 21 days, and in particular 22.5 days,

- il induit la phosphorylation sur une tyrosine d'une protéine de 140 kDa,- it induces phosphorylation on a tyrosine of a 140 kDa protein,

- il induit la prolifération des cellules endothéliales vasculaires, - il stimule l'angiogénèse,- it induces the proliferation of vascular endothelial cells, - it stimulates angiogenesis,

- il ne provoque pas d'hypotension artérielle.- it does not cause hypotension.

Les anticorps anti-idiotypiques du FGFl de l'invention reconnaissent le récepteur humain FGF-R2b, mais ne reconnaissent pas le récepteur FGF-Rl.The anti-idiotypic FGF1 antibodies of the invention recognize the human FGF-R2b receptor, but do not recognize the FGF-R1 receptor.

Les anticorps anti-idiotypes du FGF2 de l'invention reconnaissent le récepteur humain FGF-Rl mais ne reconnaissent pas le récepteur FGF-R2b.The anti-idiotypic FGF2 antibodies of the invention recognize the human FGF-R1 receptor but do not recognize the FGF-R2b receptor.

L'expression « anticorps anti-idiotypique du facteur de croissance fibroblastique 1, caractérisé en ce qu'il est spécifique vis-à-vis du récepteur FGF-R2b », signifie qu'il active les fonctions de FGF-R2b.The expression “anti-idiotypic antibody to fibroblast growth factor 1, characterized in that it is specific with respect to the FGF-R2b receptor”, means that it activates the functions of FGF-R2b.

De même, l'expression « anticorps anti-idiotypique du facteur de croissance fibroblastique 2, caractérisé en ce qu'il est spécifique vis-à-vis du récepteur FGF-Rl », signifie qu'il active les fonctions de FGF-Rl.Likewise, the expression “anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor 2, characterized in that it is specific with respect to the FGF-R1 receptor”, means that it activates the functions of FGF-R1.

La spécificité des anticorps anti-idiotypiques de FGFl vis-à-vis de FGF-R2b peut être déterminée selon le test de compétition avec le FGFl radioiodé vis-à-vis de sa liaison à des cellules CHO transfectées avec des vecteurs d'expression eucaryote contenant la séquence du récepteur FGF-R2b.The specificity of the anti-idiotypic antibodies of FGF1 with respect to FGF-R2b can be determined according to the competition test with the radioiodinated FGF1 with respect to its binding to CHO cells transfected with eukaryotic expression vectors containing the sequence of the FGF-R2b receptor.

De même, la spécificité des anticorps anti-idiotypiques de FGF2 vis-à-vis de FGF- Rl peut être déterminée selon le test de compétition avec le FGF2 radioiodé vis-à-vis de sa liaison à des cellules CHO transfectées avec des vecteurs d'expression contenant la séquence du récepteur FGF-Rl. L'expression « anticorps anti-idiotypique circulant » signifie véhiculé librement dans le sang circulant et non capté par les parois vasculaires.Likewise, the specificity of the anti-idiotypic antibodies of FGF2 vis-à-vis FGF-R1 can be determined according to the competition test with the radioiodinated FGF2 vis-à-vis its binding to CHO cells transfected with d vectors. containing the sequence of the FGF-R1 receptor. The expression “circulating anti-idiotypic antibody” means carried freely in the circulating blood and not picked up by the vascular walls.

A la différence des anticorps anti-idiotypiques FGFl et FGF2 de l'invention, les facteurs de croissance FGFl et FGF2 ne sont pas circulants.Unlike the anti-idiotypic antibodies FGF1 and FGF2 of the invention, the growth factors FGF1 and FGF2 are not circulating.

L'intérêt de ce que les anticorps anti-idiotypiques de l'invention soient spécifiques et circulants, est de cibler sur les cellules endothéliales angiogéniques des drogues qui n'affectent pas les cellules endothéliales quiescentes.The advantage of the anti-idiotypic antibodies of the invention being specific and circulating, is to target on the angiogenic endothelial cells drugs which do not affect the quiescent endothelial cells.

S 'agissant de la durée de demi- vie des anticorps anti-idiotypiques, elle est variable d'une espèce à l'autre. La durée de demi-vie des anticorps anti-idiotypiques FGFl ou FGF2 de l'invention, peut être mesurée selon le test suivant : injection intraveineuse du ligandAs regards the half-life of anti-idiotypic antibodies, it is variable from one species to another. The half-life of the anti-idiotypic antibodies FGF1 or FGF2 of the invention can be measured according to the following test: intravenous injection of the ligand

(FGFl ou FGF2) radioiodé, puis recueil à différents intervalles de temps de sang et comptage de la radioactivité. La durée de demi-vie correspond au temps nécessaire pour que 50% de la radioactivité initiale ait disparu du sang circulant.(FGFl or FGF2) radioiodinated, then collected at different blood time intervals and counting of radioactivity. The half-life is the time it takes for 50% of the initial radioactivity to disappear from the circulating blood.

La durée de demi-vie du FGFl est inférieure à 2 minutes ; la durée de demi-vie du FGF2 est inférieure à 2 minutes. A titre indicatif, la durée de demi-vie des IgG est de l'ordre de 23 jours.The half-life of FGFl is less than 2 minutes; the half-life of FGF2 is less than 2 minutes. As an indication, the half-life of IgG is around 23 days.

La protéine de 140 kDa sur laquelle les anticorps anti-idiotypiques du FGFl de l'invention induisent la phosphorylation d'une tyrosine est FGF-R2b.The 140 kDa protein on which the anti-idiotypic antibodies of the FGF1 of the invention induce the phosphorylation of a tyrosine is FGF-R2b.

La protéine de 140 kDa sur laquelle les anticorps anti-idiotypiques du FGF2 de l'invention induisent la phosphorylation d'une tyrosine est FGF-Rl .The 140 kDa protein on which the anti-idiotypic antibodies to FGF2 of the invention induce the phosphorylation of a tyrosine is FGF-R1.

Cet aspect signifie que l'activation de FGF-R2b par les anticorps anti-idiotypiques FGFl, peut déclencher des fonctions, telles que la prolifération, la migration, la résistance à l'apoptose, nécessitant la phosphorylation de FGF-R2b.This aspect means that the activation of FGF-R2b by anti-idiotypic antibodies FGF1, can trigger functions, such as proliferation, migration, resistance to apoptosis, requiring the phosphorylation of FGF-R2b.

De même, l'activation de FGF-Rl par les anticorps anti-idiotypiques FGF2, peut déclencher des fonctions telles que la prolifération, la migration, la résistance à l'apoptose, nécessitant la phosphorylation de FGF-Rl.Similarly, the activation of FGF-R1 by anti-idiotypic antibodies FGF2, can trigger functions such as proliferation, migration, resistance to apoptosis, requiring the phosphorylation of FGF-R1.

Cet aspect peut être mesuré par le test de phosphorylation, destiné à vérifier que les anticorps anti-idiotypiques selon l'invention sont fonctionnels, c'est-à-dire qu'ils induisent la phosphorylation au niveau de résidus tyrosine des récepteurs de FGF, faute de quoi il ne peut y avoir de fonctions biologiques telles que la prolifération, la dissociation, l'angiogénèse etc...This aspect can be measured by the phosphorylation test, intended to verify that the anti-idiotypic antibodies according to the invention are functional, that is to say that they induce phosphorylation at the level of tyrosine residues of FGF receptors, otherwise there can be no biological functions such as proliferation, dissociation, angiogenesis etc ...

Une méthode conventionnelle de mesure de l'activité de phosphorylation du récepteur FGF, par exemple FGF-Rl, consiste dans un premier temps, à incuber pendant 24 heures des cellules VSM en milieu sans sérum, puis pendant 10 minutes en présence ou en l'absence de 100 ng/ml de FGF2 ou FGFl, ou 500 μg/ml de Ig2Id FI ou Ig2Id F2. Les cellules sont ensuite rincées avec une solution de tampon phosphate (PBS) froid puis lysées, et le FGF-Rl est immunoprécipité à l'aide d'un anticorps anti FGF-Rl . Le complexe est séparé par électrophorèse sur gel de dodécyle sulfate de sodium (SDS), transferré sur une membrane de nitrocellulose, et la phosphorylation de FGF-Rl est révélée à l'aide d'un anticorps anti-phosphotyrosine. L'induction de la prolifération des cellules endothéliales vasculaires signifie qu'elles se multiplient. Ceci peut être déterminé selon le test décrit ci-après (voir exemples, paragraphe 3.1 « Mitogénicité »).A conventional method for measuring the phosphorylation activity of the FGF receptor, for example FGF-R1, consists firstly in incubating VSM cells for 24 hours in a serum-free medium, then for 10 minutes in the presence or in the absence of 100 ng / ml of FGF2 or FGFl, or 500 μg / ml of Ig2Id FI or Ig2Id F2. The cells are then rinsed with a cold phosphate buffer solution (PBS) and then lysed, and the FGF-R1 is immunoprecipitated using an anti FGF-R1 antibody. The complex is separated by electrophoresis on dodecyl sodium sulfate gel (SDS), transferred to a nitrocellulose membrane, and the phosphorylation of FGF-R1 is revealed using an anti-phosphotyrosine antibody. The induction of proliferation of vascular endothelial cells means that they multiply. This can be determined according to the test described below (see examples, paragraph 3.1 "Mitogenicity").

La stimulation de l'angiogénèse signifie que la liaison des anticorps anti- idiotypiques FGFl au récepteur FGF-R2b suivie de la phosphorylation sur une tyrosine de FGF-R2b et de la prolifération cellulaire suffisent à déclencher l'angiogénèse.Stimulation of angiogenesis means that the binding of anti-idiotypic FGF1 antibodies to the FGF-R2b receptor followed by phosphorylation on an FGF-R2b tyrosine and cell proliferation are sufficient to trigger angiogenesis.

De même, la stimulation de l'angiogénèse signifie que la liaison des anticorps anti-idiotypiques FGF2 au récepteur FGF-Rl suivie de la phosphorylation sur une tyrosine de FGF-Rl et de la prolifération cellulaire suffisent à déclencher l'angiogénèse. Ceci peut être quantifié par le test décrit ci-après (voir exemples, paragraphe 3.3Likewise, stimulation of angiogenesis means that the binding of anti-idiotypic FGF2 antibodies to the FGF-R1 receptor followed by phosphorylation on an FGF-R1 tyrosine and cell proliferation are sufficient to trigger angiogenesis. This can be quantified by the test described below (see examples, section 3.3

« Angiogénèse cornéenne »)."Corneal angiogenesis").

L'invention concerne également le fragment Fab des anticorps anti-idiotypiques FGFl et/ou FGF2 selon l'invention.The invention also relates to the Fab fragment of the anti-idiotypic antibodies FGF1 and / or FGF2 according to the invention.

L'invention concerne également le complexe entre un anticorps anti-idiotypique selon l'invention (à savoir un anticorps anti-idiotypique du facteur de croissance fibroblastique FGFl et/ou du facteur de croissance fibroblastique FGF2), et une toxine, en particulier choisie parmi la saporine, la ricine, ou bien un élément radioactif tel que l'iode 125 ou 131, ou le strontium.The invention also relates to the complex between an anti-idiotypic antibody according to the invention (namely an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor FGF1 and / or to fibroblastic growth factor FGF2), and a toxin, in particular chosen from saporin, ricin, or a radioactive element such as iodine 125 or 131, or strontium.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un anticorps anti- idiotypique du facteur de croissance fibroblastique 1 et/ou d'un anticorps anti- idiotypique du facteur de croissance fibroblastique 2 selon l'invention, caractérisé en ce que: a) on injecte le facteur de croissance fibroblastique 1 (FGFl) et/ou le facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2) purifié chez un animal, notamment un lapin, b) on prélève le sang pour récupérer les immunoglobulines (Ig) purifiées contenant des anticorps anti-FGFl (Igl FI) et ou anti-FGF2 (Igl F2) spécifiques, par exemple par chromatographie d'affinité pour la protéine A puis, on purifie éventuellement les Igl FI et/ou Igl F2 spécifiques à partir des Ig purifiées, par exemple par chromatographie d'affinité pour le FGFl et ou FGF2, c) on injecte les susdites Ig purifiées ou les susdites Igl FI et ou Igl F2 spécifiques et purifiées chez l'animal de la même espèce que celui utilisé lors de l'injection de FGFl et/ou FGF2, notamment dans les ganglions poplités de lapin de même allorype que celui qui a produit Igl FI et/ou Ig2 F2, lors de l'injection de FGFl et/ou FGF2, d) on prélève le sang pour récupérer les Ig totales, par exemple par la protéine A, puis pour soumettre les Ig totales à deux immunoadsorptions :The subject of the invention is also a process for preparing an anti-idiotypic antibody to fibroblast growth factor 1 and / or an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor 2 according to the invention, characterized in that: a) injecting the fibroblastic growth factor 1 (FGFl) and / or the purified fibroblastic growth factor 2 (FGF2) into an animal, in particular a rabbit, b) drawing the blood to recover the purified immunoglobulins (Ig) containing specific anti-FGF1 (Igl FI) and or anti-FGF2 (Igl F2) antibodies, for example by affinity chromatography for protein A, then specific Igl FI and / or Igl F2 are purified from purified Ig, for example by affinity chromatography for FGFl and or FGF2, c) the above purified Ig or the above specific and purified Igl FI and or Igl F2 are injected into the animal of the same species as that used during the injection of FGFl and / or FGF2, especially in the rabbit popliteal ganglia of the same allorype as that which produced Igl FI and / or Ig2 F2, during the injection of FGFl and / or FGF2, d) the blood is taken to recover the total Ig, for example by protein A, then to subject the total Ig to two immunoadsorption:

- une immunoadsorption sur une colonne d'affinité préparée avec les Ig preimmunes du lapin (Ig PI) qui a servi à faire les Igl FI et/ou Igl F2, pour éliminer les anticorps anti-allotypes ou isotypes,- immunoadsorption on an affinity column prepared with rabbit preimmune Ig (Ig PI) which was used to make the Igl FI and / or Igl F2, to eliminate the anti-allotype or isotype antibodies,

- une immunoadsorption sur une colonne d'affinité préparée avec des Igl FI et/ou des Igl F2, pour purifier les anticorps anti-idiotypiques (Ig2Id FI ou Ig2Id F2).- an immunoadsorption on an affinity column prepared with Igl FI and / or Igl F2, to purify the anti-idiotypic antibodies (Ig2Id FI or Ig2Id F2).

L'étape a) d'injection du FGFl ou du FGF2 chez un animal, notamment un lapin, a lieu sous la peau. L'expression « anticorps anti-FGFl (Igl FI) spécifiques » signifie que les anticorps dirigés contre le FGFl (anticorps anti-FGFl) ne reconnaissent pas le FGF2 : en effet, on observe moins de 5% de réaction croisée avec FGF2, ce qui signifie qu'il faut au moins 20 fois plus de FGF2 que de FGFl pour neutraliser la même quantité d'anticorps anti-FGFl. De même que pour les anticorps anti-FGFl spécifiques, les anticorps anti-FGF2 (Igl F2) spécifiques ne reconnaissent pas le FGFl : en effet, on observe moins de 5% de réaction croisée avec FGFl.Step a) of injecting FGF1 or FGF2 into an animal, in particular a rabbit, takes place under the skin. The expression “specific anti-FGFl antibodies (Igl FI)” means that the antibodies directed against FGFl (anti-FGFl antibodies) do not recognize FGF2: in fact, less than 5% of cross-reaction with FGF2 is observed, this which means that at least 20 times more FGF2 than FGF1 is required to neutralize the same amount of anti-FGFl antibodies. As for specific anti-FGF1 antibodies, specific anti-FGF2 (Igl F2) antibodies do not recognize FGF1: indeed, less than 5% of cross-reaction with FGF1 is observed.

L'invention a également pour objet un anticorps anti-idiotypique du facteur de croissance fibroblastique 1 et/ou du facteur de croissance fibroblastique 2, susceptible d'être obtenu selon le procédé suivant : a) on injecte le facteur de croissance fibroblastique 1 (FGFl) et/ou le facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2) purifié chez un animal, notamment un lapin, b) on prélève le sang pour récupérer les immunoglobulines (Ig) purifiées contenant des anticorps anti-FGFl (Igl FI) et/ou anti-FGF2 (Igl F2) spécifiques, par exemple par chromatographie d'affinité pour la protéine A puis, on purifie éventuellement les Igl FI et/ou Igl F2 spécifiques à partir des Ig purifiées, par exemple par chromatographie d'affinité pour le FGFl et/ou FGF2, c) on injecte les susdites Ig purifiées ou les susdites Igl FI et/ou Igl F2 spécifiques et purifiées chez l'animal de la même espèce que celui utilisé lors de l'injection de FGFl et/ou FGF2, notamment dans les ganglions poplités de lapin de même allotype que celui qui a produit Igl FI et/ou Ig2 F2, lors de l'injection de FGFl et/ou FGF2, d) on prélève le sang pour récupérer les Ig totales, par exemple par la protéine A, puis pour soumettre les Ig totales à deux immunoadsorptions : - une immunoadsorption sur une colonne d'affinité préparée avec les Ig preimmunes du lapin (Ig PI) qui a servi à faire les Igl FI et/ou Igl F2, pour éliminer les anticorps anti-allotypes ou isotypes,The subject of the invention is also an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor 1 and / or fibroblastic growth factor 2, capable of being obtained according to the following process: a) fibroblastic growth factor 1 (FGFl) is injected ) and / or the fibroblast growth factor 2 (FGF2) purified in an animal, in particular a rabbit, b) the blood is taken to recover the purified immunoglobulins (Ig) containing anti-FGFl (Igl FI) and / or anti -FGF2 (Igl F2) specific, for example by affinity chromatography for protein A then, the Igl FI and / or Igl F2 specific are optionally purified from purified Ig, for example by affinity chromatography for FGFl and / or FGF2, c) injecting the above purified Ig or the above specific and purified Igl FI and / or Igl F2 Ig in animals of the same species as that used during the injection of FGFl and / or FGF2, in particular in poplit lymph nodes és of rabbit of the same allotype as that which produced Igl FI and / or Ig2 F2, during the injection of FGFl and / or FGF2, d) the blood is taken to recover the total Ig, for example by protein A, then to subject the total Ig to two immunoadsorption: - immunoadsorption on an affinity column prepared with rabbit preimmune Ig (Ig PI) which was used to make the Igl FI and / or Igl F2, to eliminate the anti-allotype or isotype antibodies,

- une immunoadsorption sur une colonne d'affinité préparée avec des Igl FI et/ou des Igl F2, pour purifier les anticorps anti-idiotypiques (Ig2Id FI ou Ig2Id F2).- an immunoadsorption on an affinity column prepared with Igl FI and / or Igl F2, to purify the anti-idiotypic antibodies (Ig2Id FI or Ig2Id F2).

L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un anticorps monoclonal anti-idiotypique de FGFl et/ou d'un anticorps monoclonal anti-idiotypique de FGF2 selon l'invention, caractérisé en ce que : a) on injecte FGFl et/ou FGF2 à un animal, et notamment à une souris, b) on récupère les splénocytes de l'animal synthétisant des Igl FI et/ou Igl F2, c) on fusionne les susdits splénocytes avec des cellules de myélome, d) on sélectionne les hybridomes obtenus à l'issue de l'étape c) précédente en ce qu'ils synthétisent des immunoglobulines dirigées contre FGFl et/ou FGF2, e) on injecte les Igl FI et/ou Igl F2 ainsi sélectionnés à l'issue de l'étape d) à un animal, et notamment à une souris, de même allotype que celui ayant produit Igl FI et/ou Igl F2, f) on récupère les splénocytes synthétisant des Ig2Id FI et/ou Ig2Id F2, g) on fusionne les cellules de la rate (splénocytes) avec des cellules de myélome, h) on sélectionne les hybridomes obtenus à l'issue de l'étape g) précédente en ce qu'ils synthétisent des Ig2Id FI dirigés contre Igl FI et/ou des Ig2Id F2 dirigés contreA subject of the invention is also a process for preparing an anti-idiotypic FGF1 monoclonal antibody and / or an anti-idiotypic FGF2 monoclonal antibody according to the invention, characterized in that: a) FGFl is injected and / or FGF2 from an animal, and in particular from a mouse, b) recovering the splenocytes from the animal synthesizing Igl FI and / or Igl F2, c) fusing the above-mentioned splenocytes with myeloma cells, d) selecting the hybridomas obtained at the end of step c) above in that they synthesize immunoglobulins directed against FGFl and / or FGF2, e) injecting the Igl FI and / or Igl F2 thus selected at the end of l step d) to an animal, and in particular to a mouse, of the same allotype as that which produced Igl FI and / or Igl F2, f) the splenocytes synthesizing Ig2Id FI and / or Ig2Id F2 are recovered, g) the spleen cells (splenocytes) with myeloma cells, h) the hybridomas obtained are selected us at the end of step g) above in that they synthesize Ig2Id FI directed against Igl FI and / or Ig2Id F2 directed against

Igl F2, i) on récupère lesdits Ig2Id FI et/ou des Ig2Id F2.Igl F2, i) said Ig2Id FI and / or Ig2Id F2 are recovered.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de préparation décrit ci- dessus, d'un anticorps monoclonal anti-idiotypique de FGFl et/ou d'un anticorps monoclonal anti-idiotypique de FGF2, les modalités de l'étape a) consistent à injecter à une souris, dans un premier temps, 3 fois par voie sous cutanée à 15 jours d'intervalle, puis une quatrième fois par voie intrapéritonéale ou intraveineuse, le facteur de croissance fibroblastique 1 et/ou le facteur de croissance fibroblastique 2, en une quantité variant de 5 à 50 μg de FGFl et/ou FGF2. Après l'étape a) d'injection, on prélève la rate de la souris pour récupérer les splénocytes synthétisant des IglFl et/ou des Igl F2. Lors du prélèvement de la rate, on fusionne les splénocytes totaux avec des cellules du myélome. Les cellules hybrides en résultant se multiplient et l'on trie ensuite celles qui sécrètent l'anticorps d'intérêt. Les splénocytes non fusionnés meurent en 8 jours. L'étape i) de récupération des anticorps anti-idiotypiques selon l'invention consiste plus particulièrement à :According to an advantageous embodiment of the method of preparation described above, of an anti-idiotypic FGF1 monoclonal antibody and / or of an anti-idiotypic FGF2 monoclonal antibody, the methods of step a) consist in injecting to a mouse, first, 3 times subcutaneously 15 days apart, then a fourth time intraperitoneally or intravenously, fibroblast growth factor 1 and / or fibroblast growth factor 2, in one quantity varying from 5 to 50 μg of FGFl and / or FGF2. After step a) of injection, the spleen of the mouse is removed to recover the splenocytes synthesizing IglF1 and / or Igl F2. When the spleen is removed, the total splenocytes are fused with myeloma cells. The resulting hybrid cells multiply and those that secrete the antibody of interest are then sorted. Unmerged splenocytes die within 8 days. Step i) of recovery of the anti-idiotypic antibodies according to the invention more particularly consists in:

- sélectionner les anticorps anti-idiotypiques FGFl par leur capacité d'inhiber la liaison de FGFl iodé au récepteur FGF-R2b et de pas inhiber la liaison de FGFl iodé au récepteur FGF-R 1 ,- select the anti-idiotypic FGF1 antibodies by their capacity to inhibit the binding of iodized FGFl to the FGF-R2b receptor and not to inhibit the binding of iodized FGFl to the FGF-R 1 receptor,

- sélectionner les anticorps anti-idiotypiques FGF2 par leur capacité d'inhiber la liaison de FGF2 iodé au récepteur FGF-Rl et de pas inhiber la liaison de FGF2 iodé au récepteur FGF-R2b.- select the anti-idiotypic FGF2 antibodies by their capacity to inhibit the binding of iodized FGF2 to the FGF-R1 receptor and not to inhibit the binding of iodized FGF2 to the FGF-R2b receptor.

Pour préparer les fragments Fab des anticorps anti-idiotypiques FGFl et/ou FGF2 de l'invention, on peut procéder tel que décrit dans le manuel intitulé « Antibodies, a laboratory manual, 628-629, Harlow and David Lane Editeurs, Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 ».To prepare the Fab fragments of the anti-idiotypic antibodies FGF1 and / or FGF2 of the invention, one can proceed as described in the manual entitled “Antibodies, a laboratory manual, 628-629, Harlow and David Lane Editors, Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 ”.

L'invention est également relative à des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent à titre de substance active au moins un anticorps anti-idiotypique FGFl et/ou FGF2 selon l'invention, ou au moins le fragmentThe invention also relates to pharmaceutical compositions characterized in that they comprise, as active substance, at least one anti-idiotypic antibody FGF1 and / or FGF2 according to the invention, or at least the fragment

Fab selon l'invention ou au moins le complexe selon l'invention, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.Fab according to the invention or at least the complex according to the invention, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.

Les abréviations utilisées ci-dessus, ainsi que dans les exemples et les figures ci- dessous ont les significations suivantes : PBS : phosphate buffer saline.The abbreviations used above, as well as in the examples and the figures below, have the following meanings: PBS: phosphate buffer saline.

Ig : immunoglobulinesIg: immunoglobulins

IgG : immunoglobulines GIgG: immunoglobulins G

Ig PI : immunoglobulines de lapin purifiées par protéine A-sepharose à partir de sang prélevé avant rimmunisation par FGFl et/ou FGF2. Igl FI : immunoglobulines de lapin 1 purifiées par protéine A-sepharose à partir de sang prélevé après immunisation par le FGFl, (anticorps dirigés contre FGFl).PI Ig: rabbit immunoglobulins purified by protein A-sepharose from blood taken before immunization with FGFl and / or FGF2. Igl FI: rabbit immunoglobulins 1 purified by protein A-sepharose from blood taken after immunization with FGFl, (antibodies directed against FGFl).

Igl F2 : immunoglobulines de lapin 1 purifiées par protéine A-sepharose à partir de sang prélevé après immunisation par le FGF2, (anticorps dirigés contre FGF2).Igl F2: rabbit immunoglobulins 1 purified by protein A-sepharose from blood taken after immunization with FGF2, (antibodies directed against FGF2).

Ig2Id FI : immunoglobulines de lapin 2 purifiées par protéine A-sepharose à partir de sang prélevé après l'immunisation par le Igl FI, (anticorps anti-idiotypiques deIg2Id FI: rabbit immunoglobulins 2 purified by protein A-sepharose from blood taken after immunization with Igl FI, (anti-idiotypic antibodies to

FGFl).FGF).

Ig2Id F2 : immunoglobulines de lapin 2 purifiées par protéine A-sepharose à partir de sang prélevé après l'immunisation par le Igl F2 (anticorps anti-idiotypiques de FGF2). FGF-Rs : récepteurs des FGF, par exemple FGF-Rl et FGF-R2b. Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'anticorps anti-idiotypiques de FGFl pour :Ig2Id F2: rabbit immunoglobulins 2 purified by protein A-sepharose from blood taken after immunization with Igl F2 (anti-idiotypic FGF2 antibodies). FGF-Rs: FGF receptors, for example FGF-R1 and FGF-R2b. According to an advantageous embodiment, the invention relates to the use of anti-idiotypic FGF1 antibodies for:

- stimuler l'activité des récepteurs du FGFl, - inhiber l'activité des récepteurs du FGFl par des anticorps bloquants ou des fragments Fab,- stimulate the activity of FGF1 receptors, - inhibit the activity of FGF1 receptors by blocking antibodies or Fab fragments,

- coupler Ig2Id FI à des médicaments ou gènes d'intérêt afin de les vectoriser sur des cellules exprimant les récepteurs du FGFl et stimuler l'activité de ces récepteurs,- couple Ig2Id FI to drugs or genes of interest in order to vectorize them on cells expressing the FGF1 receptors and stimulate the activity of these receptors,

- coupler Ig2Id FI à des médicaments, toxines ou gènes d'intérêt afin de les vectoriser sur des cellules exprimant les récepteurs du FGFl et les détruire,- couple Ig2Id FI to drugs, toxins or genes of interest in order to vectorize them on cells expressing FGF1 receptors and destroy them,

- coupler Ig2Id FI à des traceurs radioactifs afin de les vectoriser sur des cellules exprimant les récepteurs du FGFl et les visualiser dans tout système d'imagerie médicale.- couple Ig2Id FI to radioactive tracers in order to vectorize them on cells expressing FGFl receptors and visualize them in any medical imaging system.

Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'anticorps anti-idiotypiques de FGF2 pour :According to another advantageous embodiment, the invention relates to the use of anti-idiotypic antibodies to FGF2 for:

- stimuler l'activité des récepteurs du FGF2,- stimulate the activity of FGF2 receptors,

- inhiber l'activité des récepteurs du FGF2 par des anticorps bloquants ou des fragments Fab,- inhibit the activity of FGF2 receptors by blocking antibodies or Fab fragments,

- coupler Ig2Id F2 à des médicaments ou gènes d'intérêt afin de les vectoriser sur des cellules exprimant les récepteurs du FGF2 et stimuler l'activité de ces récepteurs,- couple Ig2Id F2 to drugs or genes of interest in order to vectorize them on cells expressing FGF2 receptors and stimulate the activity of these receptors,

- coupler Ig2Id F2 à des médicaments, toxines ou gènes d'intérêt afin de les vectoriser sur des cellules exprimant les récepteurs du FGF2 et les détruire,- couple Ig2Id F2 to drugs, toxins or genes of interest in order to vectorize them on cells expressing FGF2 receptors and destroy them,

- coupler Ig2Id F2 à des traceurs radioactifs afin de les vectoriser sur des cellules exprimant les récepteurs du FGF2 et les visualiser dans tout système d'imagerie médicale.- couple Ig2Id F2 to radioactive tracers in order to vectorize them on cells expressing FGF2 receptors and visualize them in any medical imaging system.

DESCRIPTION DES FIGURESDESCRIPTION OF THE FIGURES

Les Figures 1A et 1B représentent la spécificité des anticorps anti-idiotypiques Ig2Id FI et Ig2Id F2 pour les récepteurs FGF-Rs.FIGS. 1A and 1B represent the specificity of the anti-idiotypic antibodies Ig2Id FI and Ig2Id F2 for the FGF-Rs receptors.

Plus particulièrement, la figure 1A représente la spécificité des anticorps anti- idiotypiques Ig2Id FI et Ig2Id F2 pour le récepteur FGF-R1/2 boucles, et la figure 1B représente la spécificité des anticorps anti-idiotypiques Ig2Id FI et Ig2Id F2 pour le récepteur FGF-R 1/3 boucles. L'axe des abscisses des figures 1A et IB représente la concentration de modulateurs, à savoir la concentration de FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2, exprimée en nM.More particularly, FIG. 1A represents the specificity of the anti-idiotypic antibodies Ig2Id FI and Ig2Id F2 for the FGF-R1 / 2 loop receptor, and FIG. 1B represents the specificity of the anti-idiotypic antibodies Ig2Id FI and Ig2Id F2 for the FGF receptor -R 1/3 loops. The abscissa axis of FIGS. 1A and IB represents the concentration of modulators, namely the concentration of FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2, expressed in nM.

L'axe des ordonnées de la figure 1 A représente la liaison de FGF2 iodé sur FGF- Rl/2 boucles (exprimée en %) et, celui de la figure IB représente la liaison de FGF2 iodé sur FGF-R1/3 boucles (exprimée en %).The ordinate axis of FIG. 1 A represents the bond of iodized FGF2 on FGF-R1 / 2 loops (expressed in%) and that of FIG. 1B represents the bond of iodized FGF2 on FGF-R1 / 3 loops (expressed in%) in %).

Des cellules CHO pgsA-745 transfectées avec FGF-Rl/2boucles ou FGF-R1/3 boucles sont inoculées avec les concentrations désirées de FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2, et 2 ng/ml de FGF2 radioiodé pendant 3 h à 4°C. Les puits sont ensuite rincés, le tapis cellulaire est ensuite lysé avec NaOH 0.2 M comme décrit ci-dessous.CHO pgsA-745 cells transfected with FGF-Rl / 2 loops or FGF-R1 / 3 loops are inoculated with the desired concentrations of FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2, and 2 ng / ml of FGF2 radioiodinated for 3 h at 4 ° C. The wells are then rinsed, the cell layer is then lysed with 0.2 M NaOH as described below.

Dans la figure 1A ainsi que dans la figure IB, la courbe comportant le losange noir ( ) correspond à FGF2, la courbe comportant le triangle noir ( ^ ) correspond à Ig2Id FI, et la courbe comportant le carré noir ( • ) correspond à Ig2Id F2.In FIG. 1A as well as in FIG. 1B, the curve comprising the black diamond () corresponds to FGF2, the curve comprising the black triangle (^) corresponds to Ig2Id FI, and the curve comprising the black square (•) corresponds to Ig2Id F2.

La Figure 2 représente la prolifération des cellules musculaires lisses d'aorteFigure 2 shows the proliferation of smooth aortic muscle cells

(VSM), et plus particulièrement, l'action proliférative des anticorps anti-idiotypiques Ig2Id FI et Ig2Id F2 sur lesdites cellules.(VSM), and more particularly, the proliferative action of the anti-idiotypic antibodies Ig2Id FI and Ig2Id F2 on said cells.

L'axe des abscisses de la figure 2 représente la concentration de modulateurs, à savoir la concentration de FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2 ; la concentration de FGF 1 , FGF2, Ig2Id F 1 et Ig2Id F2 étant exprimée en nM.The abscissa axis of FIG. 2 represents the concentration of modulators, namely the concentration of FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2; the concentration of FGF 1, FGF2, Ig2Id F 1 and Ig2Id F2 being expressed in nM.

L'axe des ordonnées de la figure 2 représente le nombre de cellules VSM par puits (X 10"3).The ordinate axis of FIG. 2 represents the number of VSM cells per well (X 10 "3 ).

La courbe comportant le losange noir ( ) correspond à FGF2, la courbe comportant le carré noir ( H ) correspond à Ig2Id FI, et la courbe comportant le triangle noir ( A ) correspond à Ig2Id F2.The curve comprising the black diamond () corresponds to FGF2, the curve comprising the black square (H) corresponds to Ig2Id FI, and the curve comprising the black triangle ( A ) corresponds to Ig2Id F2.

Les cellules VSM sont ensemencées à faible densité (5000 cellules/puits) dans des boîtes de 24 puits. Des doses variables de FGF2, Ig2Id FI ou Ig2Id F2 sont ajoutées après adhésion des cellules au plastique de culture. Chaque condition est étudiée dans deux puits différents. Les cellules sont trypsinisées et comptées au quatrième jour. La Figure 3 représente l'inhibition de l'action mitogénique des Ig2Id (anticorps anti-idiotypiques FGFl et/ou FGF2) par les anticorps Igl FI et Igl F2 sur les cellules VSM.VSM cells are seeded at low density (5000 cells / well) in 24-well dishes. Variable doses of FGF2, Ig2Id FI or Ig2Id F2 are added after adhesion of the cells to the culture plastic. Each condition is studied in two different wells. The cells are trypsinized and counted on the fourth day. FIG. 3 represents the inhibition of the mitogenic action of Ig2Id (anti-idiotypic antibodies FGF1 and / or FGF2) by the antibodies Igl FI and Igl F2 on the VSM cells.

Les histogrammes gris (voir celui du côté gauche) correspondent à l'absence d'anticorps, les histogrammes hachurés (voir celui du milieu) correspondent à la présence d'anticorps anti-FGF2 (Igl F2) et, les histogrammes noirs avec des points blancs (voir celui de droite) correspondent à la présence d'anticorps anti-FGFl (Igl FI).The gray histograms (see the one on the left) correspond to the absence of antibodies, the hatched histograms (see the middle one) correspond to the presence of anti-FGF2 antibodies (Igl F2) and, the black histograms with dots whites (see the one on the right) correspond to the presence of anti-FGFl antibodies (Igl FI).

L'axe des abscisses représente respectivement, de gauche à droite : la mise en présence du contrôle ou des Igl FI ou des Igl F2 respectivement avec le contrôle, avec FGF2, avec Ig2Id F2, avec FGFl , avec Ig2Id FI .The abscissa axis represents respectively, from left to right: bringing together the control or Igl FI or Igl F2 respectively with the control, with FGF2, with Ig2Id F2, with FGFl, with Ig2Id FI.

L'axe des ordonnées de la figure 3 représente le nombre de cellules VSM par puits (X I 0"3).The ordinate axis of FIG. 3 represents the number of VSM cells per well (XI 0 "3 ).

Les cellules VSM sont ensemencées à faible densité (5000 cellules/puits) dans des boîtes de 24 puits. 5 ng/ml de FGFl ou FGF2 ou, 20 μg/ml de Ig2Id FI ou Ig2Id F2 sont ajoutées après l'adhésion des cellules au plastique de culture en présence ou absence de 50 μg/ml de Igl FI ou Igl F2. Chaque condition est étudiée dans deux puits différents. Les cellules sont trypsinisées et comptées au quatrième jour.VSM cells are seeded at low density (5000 cells / well) in 24-well dishes. 5 ng / ml of FGFl or FGF2 or, 20 μg / ml of Ig2Id FI or Ig2Id F2 are added after adhesion of the cells to the culture plastic in the presence or absence of 50 μg / ml of Igl FI or Igl F2. Each condition is studied in two different wells. The cells are trypsinized and counted on the fourth day.

Les Figures 4A et 4B représentent respectivement la prolifération des cellules NBT-ϋ et NBT-LT/R1, et plus particulièrement, l'action proliférative des anticorps anti- idiotypiques Ig2Id FI et Ig2Id F2 sur lesdites cellules.FIGS. 4A and 4B respectively represent the proliferation of NBT-ϋ and NBT-LT / R1 cells, and more particularly, the proliferative action of the anti-idiotypic antibodies Ig2Id FI and Ig2Id F2 on said cells.

L'axe des abscisses des figures 4A et AB représente la concentration de modulateurs, à savoir la concentration de FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2, exprimée en ng/ml. L'axe des ordonnées des figures 4A et 4B représente le nombre de cellules par puits (X 10"3).The abscissa axis of FIGS. 4A and AB represents the concentration of modulators, namely the concentration of FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2, expressed in ng / ml. The ordinate axis of FIGS. 4A and 4B represents the number of cells per well (X 10 "3 ).

La courbe comportant le losange noir ( * ) dans les figures 4A et 4B correspond à FGFl, et courbe comportant le carré noir ( β ) dans les figures 4 A et 4B correspond à Ig2Id Fl. La courbe comportant le triangle noir ( ^ ) de la figure 4B correspond à FGF2, et la courbe comportant la croix de la figure 4B correspond à Ig2Id F2.The curve comprising the black diamond (*) in FIGS. 4A and 4B corresponds to FGFl, and the curve comprising the black square ( β ) in FIGS. 4 A and 4B corresponds to Ig2Id Fl. The curve comprising the black triangle (^) of FIG. 4B corresponds to FGF2, and the curve comprising the cross in FIG. 4B corresponds to Ig2Id F2.

Les cellules NBT-II ou NBT-II R1 sont ensemencées à 5000 cellules/puits dans des boîtes de 24 puits. Des doses variables de FGFl, FGF2, Ig2Id FI ou Ig2Id F2 sont ajoutées après adhésion des cellules au plastique de culture. Chaque condition est étudiée dans deux puits différents. Les cellules sont trypsinisées et comptées au quatrième jour.NBT-II or NBT-II R1 cells are seeded at 5000 cells / well in 24-well dishes. Varying doses of FGFl, FGF2, Ig2Id FI or Ig2Id F2 are added after adhesion of the cells to the culture plastic. Each condition is studied in two different wells. The cells are trypsinized and counted on the fourth day.

La Figure 5 représente la dissociation des cellules NBT-ϋ et NBT-II/R1.Figure 5 shows the dissociation of NBT-ϋ and NBT-II / R1 cells.

Les cellules NBT-II ou NBT-LT/FGF-R1 sont ensemencées à faible densité dans des plaques de 12 puits (5000 cellules par puits). Le lendemain les modulateurs, à savoirNBT-II or NBT-LT / FGF-R1 cells are seeded at low density in 12-well plates (5000 cells per well). The next day the modulators, namely

FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2 sont ajoutés au milieu et, au quatrième jour les cellules sont observées et photogaphiées au microscope inversé à contraste de phase NIKON diaphot.FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2 are added to the medium and, on the fourth day, the cells are observed and photogaphiized using an inverted microscope with NIKON diaphot phase contrast.

La Figure 6 représente l'angiogénèse cornéenne.Figure 6 shows corneal angiogenesis.

Les rectangles gris (à gauche) correspondent au score d'angiogenèse au jour J7, et les rectangles hachurés (à droite) correspondent au score d'angiogenèse au jour J14. L'axe des abscisses représente respectivement, de gauche à droite, le contrôle,The gray rectangles (on the left) correspond to the angiogenesis score on day D7, and the hatched rectangles (on the right) correspond to the angiogenesis score on day D14. The abscissa axis represents respectively, from left to right, the control,

FGF2, Ig2Id Fl, Ig2Id F2.FGF2, Ig2Id F1, Ig2Id F2.

L'axe des ordonnées représente le score d'angiogenèse.The ordinate axis represents the angiogenesis score.

Une incision de 3 mm de long, intéressant la moitié de l'épaisseur cornéenne, est réalisée au dôme cornéen, sous microscope opératoire. Le stroma cornéen est clivé, en directions diamétralement opposées, jusqu'à 2 mm du limbe. Les implants, préalablement réhydratés par 2 μl de PBS contenant 30 μg de Ig2Id FI et Ig2Id F2. Après 14 jours, la néovascularisation est quantifiée. Chaque modulateur a été étudié dans au moins 4 globes oculaires de 4 lapins distincts (8 lenticules). Les différences de score d'angiogenèse entre chaque condition et les lenticules contrôles sont évaluées par le test du t de Student.A 3 mm long incision, involving half the corneal thickness, is made with a corneal dome, under an operating microscope. The corneal stroma is cleaved, in diametrically opposite directions, up to 2 mm from the limbus. The implants, previously rehydrated with 2 μl of PBS containing 30 μg of Ig2Id FI and Ig2Id F2. After 14 days, the neovascularization is quantified. Each modulator has been studied in at least 4 eyeballs from 4 separate rabbits (8 lenticles). The differences in angiogenesis score between each condition and the control lenticles are evaluated by the Student's t test.

Les Figures 7A et 7B représentent respectivement la croissance tumorale des cellules NBT-II et NBT-LT/R1 chez la souris nude.Figures 7A and 7B respectively represent the tumor growth of NBT-II and NBT-LT / R1 cells in nude mice.

L'axe des abscisses des figures 7A et 7B représente le nombre de jours après l'implantation chez la souris nude, et l'axe des ordonnées représente le volume tumoralThe abscissa axis of FIGS. 7A and 7B represents the number of days after implantation in the nude mouse, and the ordinate axis represents the tumor volume

(en mm3).(in mm 3 ).

La courbe comportant le carré noir ( B ) correspond à Ig2Id F2, la courbe comportant le triangle noir ( ^ ) correspond à Ig2Id FI, et celle comportant le losange noir ( * ) correspond au contrôle. 3,5 millions de cellules NBT-II ou NBT-LI/R1 sont injectés sous la peau du flanc droit de 2 groupes de 30 souris nude femelles âgées de 6 semaines. 4 jours plus tard, chacun des 2 groupes précédents est divisé en 3 groupes de 10 souris par tirage au sort et les dimensions des éventuelles tumeurs sont mesurées à l'aide d'un pied à coulisse. 500 μg de Ig2Id FI ou de Ig2Id F2 dilués dans un volume final de 100 μl de tampon phosphate + gélatine (2mg/ml) sont injectés par voie intraveineuse au niveau des veines de la queue. Cette injection est répétée tous les 3 jours pendant 50 jours. Les mesures sont réalisées aux mêmes intervalles par un opérateur ignorant le traitement reçu par chaque groupe de souris dans chacun des 6 groupes.The curve with the black square (B) corresponds to Ig2Id F2, the curve with the black triangle (^) corresponds to Ig2Id FI, and the curve with the black diamond (*) corresponds to the control. 3.5 million NBT-II or NBT-LI / R1 cells are injected under the skin of the right flank of 2 groups of 30 6-week-old female nude mice. 4 days later, each of the 2 preceding groups is divided into 3 groups of 10 mice by drawing lots and the dimensions of any tumors are measured using a caliper. 500 μg of Ig2Id FI or Ig2Id F2 diluted in a final volume of 100 μl of phosphate + gelatin buffer (2 mg / ml) are injected intravenously into the tail veins. This injection is repeated every 3 days for 50 days. The measurements are carried out at the same intervals by an operator ignoring the treatment received by each group of mice in each of the 6 groups.

METHODES D'ETUDE EXEMPLE :EXAMPLE STUDY METHODS:

1. Fabrication d'anticorps anti-idiotypiques de FGFl et FGF21. Manufacture of anti-idiotypic antibodies to FGFl and FGF2

1-1 Fabrication d'anticorps préimmuns (Ig PI).1-1 Manufacture of pre-immune antibodies (Ig PI).

Avant chaque immunisation, du sang est prélevé, le sérum est fractionné immédiatement après le recueil et 15 ml de sérum sont chromatographiés sur une colonne de protéine A (0,9 x 18 cm). La colonne est lavée par du PB S et les immunoglobulines sont éluées par de la glycine 0,2 M tamponnée à pH 2,5, immédiatement neutralisées par adjonction de 1/5 du volume de K2HPO4 1 M, puis dialysées contre du PB S. Les immunoglobulines (Ig PI) sont conservées à - 80 °C jusqu'à leur utilisation.Before each immunization, blood is taken, the serum is fractionated immediately after collection and 15 ml of serum are chromatographed on a protein A column (0.9 x 18 cm). The column is washed with PB S and the immunoglobulins are eluted with 0.2 M glycine buffered at pH 2.5, immediately neutralized by adding 1/5 of the volume of 1 M K2HPO4, then dialyzed against PB S. Immunoglobulins (Ig PI) are stored at -80 ° C until used.

1-2 Fabrication d'anticorps anti-FGFl (Ig FI) et anti-FGF2 (Ig F2).1-2 Manufacture of anti-FGF1 (Ig FI) and anti-FGF2 (Ig F2) antibodies.

100 μg de FGFl sont émulsionnés dans 0.25 ml d'adjuvant de Freund complet puis injectés chez un lapin, 4 fois à 15 jours d'intervalle. Le sang prélevé entre 3 et 7 mois après la première injection est fractionné et les Ig sont purifiées par chromatographie d'affinité pour la protéine A (Igl FI). Ces anticorps neutralisent l'activité du FGFl sans inhiber celle du FGF2.100 μg of FGFl are emulsified in 0.25 ml of complete Freund's adjuvant and then injected into a rabbit, 4 times at 15 day intervals. The blood drawn between 3 and 7 months after the first injection is fractionated and the Ig are purified by affinity chromatography for protein A (Igl FI). These antibodies neutralize the activity of FGF1 without inhibiting that of FGF2.

Selon le même protocole il a été fabriqué des anticorps neutralisants anti-FGF2 (Igl F2) qui ne neutralisent pas l'activité du FGFl. 1-3 Fabrication d'anticorps anti-idiotypiques de FGFl (Ig2Id FI) et de FGF2

Figure imgf000018_0001
According to the same protocol, neutralizing anti-FGF2 (Igl F2) antibodies were produced which do not neutralize the activity of FGF1. 1-3 Manufacture of anti-idiotypic antibodies to FGFl (Ig2Id FI) and FGF2
Figure imgf000018_0001

Les animaux sont prémédiqués, et 1 ml d'une solution de Bleu Evans est injectée dans la plante des pattes arrières ; 15 minutes plus tard les lapins sont anesthésiés. Les creux poplités sont rasés et désinfectés à la Bétadine. Une incision horizontale de 2 cm, centrée sur le creux poplité est faite aux ciseaux, puis les espaces celluleux sont dilacérés. De un à trois ganglions de 2 mm de diamètre sont repérés grâce à leur coloration bleue et 10 μg d'Igl FI mélangé volume à volume avec de l'adjuvant complet de Freund y est injecté à l'aide d'une micro-seringue de Hamilton sous un volume final de 100 μl et une quantité d'anticorps primaire de 20 μg. La technique est répétée au niveau de l'autre patte.The animals are premedicated, and 1 ml of an Evans Blue solution is injected into the plant of the hind legs; 15 minutes later the rabbits are anesthetized. The popliteal cavities are shaved and disinfected with Betadine. A horizontal incision of 2 cm, centered on the popliteal fossa is made with scissors, then the cellulose spaces are torn apart. One to three lymph nodes 2 mm in diameter are identified by their blue coloring and 10 μg of Igl FI mixed volume by volume with complete Freund's adjuvant is injected there using a micro-syringe of Hamilton in a final volume of 100 μl and a quantity of primary antibody of 20 μg. The technique is repeated on the other leg.

De quatre à cinq rappels toutes les trois semaines sont effectués de manière percutanée en utilisant une émulsion volume à volume de l'immunogène (IglFl ou IglF2) et d'adjuvant incomplet de Freund. Les prélèvements sanguins de 40 ml sont réalisés toutes les trois semaines du 4ème mois au 9ème mois.Four to five boosters every three weeks are performed percutaneously using a volume-to-volume emulsion of the immunogen (IglFl or IglF2) and incomplete Freund's adjuvant. Blood 40 ml samples are taken every three weeks of the 4th month 9th month.

Le sang prélevé entre 4 et 7 mois après la première injection est purifié comme décrit précédemment. Les Ig anti-idiotypes (Ig2Id FI) sont alors purifiées par chromatographie d'affinité pour la protéine A.The blood drawn between 4 and 7 months after the first injection is purified as described above. The anti-idiotype Ig (Ig2Id FI) are then purified by affinity chromatography for protein A.

Selon le même protocole il a été injecté des Igl F2 qui ont donné lieu à la formation d'anticorps anti-idiotypiques du FGF2 (Ig2 F2).According to the same protocol, Igl F2 was injected which gave rise to the formation of anti-idiotypic antibodies to FGF2 (Ig2 F2).

Le tri et/ou la purification des anticorps anti-idiotypiques selon l'invention est effectué tel que décrit précédemment, en soumettant les Ig totales à deux immunoadsorptions (voir étape d) décrite précédemment dans le procédé de préparation des anticorps anti-idiotypiques).The sorting and / or the purification of the anti-idiotypic antibodies according to the invention is carried out as described previously, by subjecting the total Ig to two immunoadsorption (see step d) described previously in the method of preparation of the anti-idiotypic antibodies).

2. Etude de la spécificité des anticorps anti-idiotypiques selon l'invention.2. Study of the specificity of the anti-idiotypic antibodies according to the invention.

Des cellules CHO pgsA 745 natives ou transfectées par FGF-R1/2 boucles ouNative CHO pgsA 745 cells or transfected with FGF-R1 / 2 loops or

FGF-R1/3 boucles ensemencées à 30 000 cellules par puits de 2 cm^ sont cultivées en milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) contenant 10% de sérum de veau foetal, 100 Ul/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine.FGF-R1 / 3 loops seeded at 30,000 cells per well of 2 cm ^ are cultured in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) containing 10% fetal calf serum, 100 IU / ml of penicillin and 50 μg / ml of streptomycin .

La liaison de FGF2 radioiodé (1.10^ à 2.10^ cpm/ng) aux cellules transfectées est mesurée à 4 °C. Les cellules sont lavées 2 fois avec du tampon de liaison (DMEM contenant 20 mM Hepes (Acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthane sulfonique) et 2 mg/ml de gélatine ajustée à un pH de 7,4). 2 ng/ml de FGF2 iodé sont ajoutés avec des concentrations variables de FGFl ou de FGF2 non marqué ou d'Ig2Id FI ou Ig2Id F2 sous un volume final de 0.5 ml.The binding of radioiodinated FGF2 (1.10 ^ to 2.10 ^ cpm / ng) to the transfected cells is measured at 4 ° C. The cells are washed twice with binding buffer (DMEM containing 20 mM Hepes (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane sulfonic acid) and 2 mg / ml gelatin adjusted to a pH of 7.4). 2 ng / ml of iodized FGF2 are added with variable concentrations of FGF1 or of unlabeled FGF2 or of Ig2Id FI or Ig2Id F2 in a final volume of 0.5 ml.

La liaison non spécifique est déterminée en présence d'un excès (500 ng) de FGF2 purifié. Les liaisons totales et non spécifiques sont déterminées en double. Après deux heures, les cellules sont lavées 3 fois avec du tampon froid et lysées avec 0.5 ml deNonspecific binding is determined in the presence of an excess (500 ng) of purified FGF2. Total and non-specific bonds are determined in duplicate. After two hours, the cells are washed 3 times with cold buffer and lysed with 0.5 ml of

NaOH 0.2 M. L'iode 125 contenu dans le matériel solubilisé est compté dans un compteur gamma.0.2 M NaOH. The iodine 125 contained in the solubilized material is counted in a gamma counter.

3. Activités biologiques des anticorps anti-idiotypiques selon l'invention3. Biological activities of the anti-idiotypic antibodies according to the invention

3.1 Mitogénicité3.1 Mitogenicity

Les cellules musculaires lisses d'aorte (VSM) sont ensemencées à faible densitéSmooth aortic muscle cells (VSM) are seeded at low density

(5000 cellules/puits) dans des boîtes de 24 puits. Les modulateurs FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2, sont ajoutés après adhésion des cellules au plastique de culture, et après(5000 cells / well) in 24-well dishes. The modulators FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2, are added after adhesion of the cells to the culture plastic, and after

2 jours. Chaque condition est étudiée dans deux puits différents. Les cellules sont trypsinisées et comptées au quatrième jour.2 days. Each condition is studied in two different wells. The cells are trypsinized and counted on the fourth day.

Ig2Id FI et IG2Id F2 déclenchent un effet mitogène sur les cellules VSM.Ig2Id FI and IG2Id F2 trigger a mitogenic effect on VSM cells.

3.2 Différenciation cellulaire3.2 Cell differentiation

Les cellules NBT-II ou NBT-LT/FGF-Rl sont ensemencées à faible densité dans des plaques de 12 puits (5000 cellules par puits). Le lendemain, FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2 sont ajoutés au milieu, et au quatrième jour les cellules sont observées et photographiées au microscope inversé à contraste de phase NIKON diaphot.NBT-II or NBT-LT / FGF-R1 cells are seeded at low density in 12-well plates (5000 cells per well). The following day, FGF1, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2 are added to the medium, and on the fourth day the cells are observed and photographed with an inverted microscope of NIKON diaphot phase contrast.

3.3 Angiogénèse cornéenne3.3 Corneal angiogenesis

Les lapins prémédiqués sont anesthésiés. L'œil est extériorisé et immobilisé à l'aide d'une membrane de latex, porteuse en son centre d'une fente de 1 cm de long. Une incision de 3 mm de long, intéressant la moitié de l'épaisseur du stroma cornéen est réalisée au dôme cornéen, sous microscope opératoire (microscope OPMI, Zeiss). Le stroma cornéen est clivé, en directions diamétralement opposées, jusqu'à 2 mm du limbe. Les implants préalablement réhydratés par 20 μl de la solution à tester sont insérés (FGF2 200 ng, Anticorps anti-idiotypiques ou anticorps contrôles 40 μg). L'apparition de néovaisseaux, naissant de la vascularisation limbique est étudiée en simple aveugle (sans connaissance du numéro du lapin, correspondant à la substance étudiée) après 7 et 14 jours sous anesthésie générale, et quantifiée en fonction d'une échelle à 5 niveaux ou score d'angiogenèse. Score 0 = absence de néovaisseaux,Premedicated rabbits are anesthetized. The eye is externalized and immobilized using a latex membrane, carrying in its center a slit of 1 cm long. An incision 3 mm long, involving half the thickness of the corneal stroma, is made with a corneal dome, under an operating microscope (OPMI microscope, Zeiss). The corneal stroma is cleaved, in diametrically opposite directions, up to 2 mm from the limbus. The implants previously rehydrated with 20 μl of the test solution are inserted (FGF2 200 ng, anti-idiotypic antibodies or control antibodies 40 μg). The appearance of new vessels, originating from the limbic vascularization is studied in single blind (without knowledge of the rabbit number, corresponding to the substance studied) after 7 and 14 days under general anesthesia, and quantified according to a 5-level scale or angiogenesis score. Score 0 = absence of new vessels,

Score 1 = néovaisseaux n'atteignant pas la demi distance séparant l'implant du limbe,Score 1 = neovessels not reaching the half distance separating the implant from the limbus,

Score 2 = néovaisseaux atteignant la demi distance,Score 2 = new vessels reaching half a distance,

Score 3 = néovaisseaux dépassant la demi distance mais n'envahissant pas l'implant,Score 3 = new vessels exceeding half a distance but not invading the implant,

Score 4 = atteinte et envahissement de l'implant par les néovaisseaux.Score 4 = involvement and invasion of the implant by the new vessels.

Les lapins sont ensuite sacrifiés et les globes oculaires prélevés et fixés dans du liquide de Bouin, aux fins d'analyses histologiques.The rabbits are then sacrificed and the eyeballs removed and fixed in Bouin's fluid for histological analyzes.

Chaque modulateur (FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2) a été étudié dans au moins 4 globes oculaires de 4 lapins distincts (8 lenticules). Les différences de score d'angiogenèse entre chacune des conditions testées et les lenticules contrôles sont évaluées par le test du t de Student.Each modulator (FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2) has been studied in at least 4 eyeballs from 4 separate rabbits (8 lenticles). The differences in angiogenesis score between each of the conditions tested and the control lenticles are evaluated by the Student's t test.

3.4 Croissance tumorale3.4 Tumor growth

Croissance chez la souris nude de la lignée de carcinome vésicalGrowth in nude mice of the bladder carcinoma line

Les cellules NBT-II et NBT-II/FGF-R1 sont décollées des plastiques de culture à l'aide de trypsine-EDTA, homogénéisées, centrifugées et mises en suspension dans du milieu de culture additionné de 10% de sérum de veau foetal. 1ml correspondant à 3,5 millions de cellules, est injecté sous la peau du flanc droit de chaque souris. La viabilité de la suspension est vérifiée au préalable par coloration vitale au bleu trypan ; le colorant est exclu de plus de 99% des cellules. 2 groupes de 30 souris nude femelles âgées de 6 semaines ont été implantées avec des cellules NBT-ÏÏ ou NBT-ϋ/FGF-Rl .The NBT-II and NBT-II / FGF-R1 cells are detached from the culture plastics using trypsin-EDTA, homogenized, centrifuged and suspended in culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. 1 ml corresponding to 3.5 million cells, is injected under the skin of the right flank of each mouse. The viability of the suspension is checked beforehand by vital staining with trypan blue; the dye is excluded from more than 99% of the cells. 2 groups of 30 6-week-old female nude mice were implanted with NBT-III or NBT-ϋ / FGF-R1 cells.

4 jours plus tard, chacun des 2 groupes précédents est divisé en 3 groupes de 10 souris par tirage au sort. Les dimensions des éventuelles tumeurs sont mesurées à l'aide d'un pied à coulisse électronique et, les modulateurs (FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2) dans un volume final de 100 μl de tampon phosphate + gélatine (2mg/ml), sont injectés par voie intraveineuse au niveau des veines de la queue (Anticorps anti- idiotypiques FGFl et FGF2 : 500 μg, Anticorps non-immuns : 500 μg / injection). Les injections sont répétées deux fois par semaine, les mesures sont réalisées aux mêmes intervalles par un opérateur ignorant le traitement reçu par chaque groupe de souris dans chacun des 6 groupes.4 days later, each of the 2 preceding groups is divided into 3 groups of 10 mice by drawing lots. The dimensions of any tumors are measured using an electronic caliper and, the modulators (FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2) in a final volume of 100 μl of phosphate + gelatin buffer (2 mg / ml) , are injected intravenously into the tail veins (anti-idiotypic antibodies FGFl and FGF2: 500 μg, non-immune antibodies: 500 μg / injection). The injections are repeated twice a week, the measurements are carried out at the same intervals by an operator ignoring the treatment received by each group of mice in each of the 6 groups.

Au terme de ces trois types d'études chez la souris nude, les animaux sont sacrifiés. Les tumeurs et certains organes sains (rein, foie, vessie) sont prélevés et conservés pour moitié dans du liquide de conservation (FAE : Formol 4%, EthanolAt the end of these three types of studies in nude mice, the animals are sacrificed. Tumors and certain healthy organs (kidney, liver, bladder) are removed and stored for half in preservation liquid (FAE: Formol 4%, Ethanol

40%, Acide Acétique 10%, H2O qsp 100%) et pour moitié sont congelés par immersion dans l'azote liquide après protection par l'iso-thiopentane.40%, Acetic Acid 10%, H 2 O qs 100%) and half are frozen by immersion in liquid nitrogen after protection with iso-thiopentane.

4. Résultats4. Results

4.1 Spécificité des Ig2Id FI et Ig2Id F2 pour les FGF-Rs (Figures 1A et IB)4.1 Specificity of Ig2Id FI and Ig2Id F2 for FGF-Rs (Figures 1A and IB)

Les ligands naturels FGFl et FGF2 inhibent la liaison de FGF2 iodé sur FGF-The natural ligands FGF1 and FGF2 inhibit the binding of iodized FGF2 to FGF-

Rl/2 boucles. L'image interne Ig2Id FI de FGFl inhibe la liaison de FGF2 iodé aux cellules CHO transfectées par FGF-R1/2 boucles alors que l'image interne Ig2IdF2 deRl / 2 loops. The internal Ig2Id FI image of FGFl inhibits the binding of iodized FGF2 to CHO cells transfected with FGF-R1 / 2 loops while the internal Ig2IdF2 image of

FGF2 inhibe la liaison de FGF2 iodé aux cellules CHO transfectées soit par FGF-R 1/2 boucles soit par FGF-R1/3 boucles.FGF2 inhibits the binding of iodinated FGF2 to CHO cells transfected either by FGF-R 1/2 loops or by FGF-R1 / 3 loops.

Compte tenu d'une fraction spécifique estimée à 1% des immunoglobulines obtenues après purification sur protéine A, les inhibitions observées sont comparables en terme de molarité. Le plateau est obtenu avec 10 ng/ml (0,5 nM) de FGF2 et 10 μg/ml (0,6 nM) de Ig2Id FI et Ig2Id F2.Given a specific fraction estimated at 1% of the immunoglobulins obtained after purification on protein A, the inhibitions observed are comparable in terms of molarity. The plateau is obtained with 10 ng / ml (0.5 nM) of FGF2 and 10 μg / ml (0.6 nM) of Ig2Id FI and Ig2Id F2.

En revanche ni FGFl ni Ig2Id FI n'inhibent la liaison de FGF2 iodé à FGF-R1/3 boucles. Le plateau est atteint à 3 nM de FGF2 ou Ig2Id F2.On the other hand, neither FGF1 nor Ig2Id FI inhibits the binding of iodinated FGF2 to FGF-R1 / 3 loops. The plateau is reached at 3 nM of FGF2 or Ig2Id F2.

Ig2Id F2 est donc une image interne de FGF2 et Ig2Id FI est une image interne de FGFl.Ig2Id F2 is therefore an internal image of FGF2 and Ig2Id FI is an internal image of FGFl.

4.2 Prolifération cellulaire (Figures 2, 3, 4A et 4B).4.2 Cell proliferation (Figures 2, 3, 4A and 4B).

Culture primaire VSM (Figure 2) : FGFl et FGF2 induisent une prolifération dose-dépendante. Ig2Id FI et Ig2Id F2 ont des effets comparables à ceux de FGF2. Les croissances maximales sont obtenues pour 1,2 nM.Primary VSM culture (Figure 2): FGFl and FGF2 induce dose-dependent proliferation. Ig2Id FI and Ig2Id F2 have effects comparable to those of FGF2. The maximum growths are obtained for 1.2 nM.

La preuve de la nature anti-idiotypique est apportée par l'observation que l'action mitogène de Ig2Id FI (comme FGFl) est inhibée par Igl FI mais pas par Igl F2. En revanche Ig2Id F2 est inhibé par Igl F2 mais pas par Igl FI (Figure 3). Lignées NBT-II et NBT-II/FGF-R1 (Figures 4A et 4B) : ni FGF2 ni Ig2Id F2 n'inhibent la croissance des cellules NBT-II puisque ces cellules n'expriment pas le récepteur FGF-Rl. Bien que ces cellules expriment le récepteur FGF-R2, Ig2Id FI n'inhibe pas la prolifération alors que FGFl (0,05 nM) le fait. A l'inverse FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2 induisent une diminution du nombre de cellules NBT-II/FGF-R1, correspondant à 30% des valeurs des puits contrôles.Proof of the anti-idiotypic nature is provided by the observation that the mitogenic action of Ig2Id FI (like FGF1) is inhibited by Igl FI but not by Igl F2. On the other hand Ig2Id F2 is inhibited by Igl F2 but not by Igl FI (Figure 3). NBT-II and NBT-II / FGF-R1 lines (Figures 4A and 4B): neither FGF2 nor Ig2Id F2 inhibit the growth of NBT-II cells since these cells do not express the FGF-R1 receptor. Although these cells express the FGF-R2 receptor, Ig2Id FI does not inhibit proliferation whereas FGF1 (0.05 nM) does. Conversely, FGF1, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2 induce a reduction in the number of NBT-II / FGF-R1 cells, corresponding to 30% of the values of the control wells.

4.3 Différenciation cellulaire et effet de dissociation (Figure 5). La différenciation cellulaire est comparée dans le sens de l'acquisition d'un phénotype mésenchymateux sous l'effet des FGFs.4.3 Cell differentiation and dissociation effect (Figure 5). Cell differentiation is compared in the sense of acquiring a mesenchymal phenotype under the effect of FGFs.

On observe que ni FGF2, ni Ig2Id F2 n'induisent la différenciation des cellules NBT-π puisqu'elles n'expriment pas le récepteur FGF-Rl.It is observed that neither FGF2 nor Ig2Id F2 induce the differentiation of NBT-π cells since they do not express the FGF-R1 receptor.

Ig2Id FI et FGFl induisent la dissociation des cellules NBTIL A l'inverse, FGFl, FGF2, Ig2Id FI et Ig2Id F2 induisent une dissociation des cellules NBT-LT/FGFRl .Ig2Id FI and FGFl induce the dissociation of NBTIL cells Conversely, FGFl, FGF2, Ig2Id FI and Ig2Id F2 induce dissociation of NBT-LT / FGFR1 cells.

4.4 Angiogénèse cornéenne (Figure 6).4.4 Corneal angiogenesis (Figure 6).

Dans le modèle d'angiogenèse cornéenne, les immunoglobulines contrôles non immunes entraînent de manière inconstante (15% des cas) une angiogénèse mineure à l'origine d'un score moyen de 0,4 à J15, comparable à celui obtenu en saturant les lenticules avec une protéine porteuse (Sérum albumine bovine).In the corneal angiogenesis model, non-immune control immunoglobulins inconstantly (15% of cases) cause minor angiogenesis, causing an average score of 0.4 at D15, comparable to that obtained by saturating the lenticles. with a carrier protein (bovine serum albumin).

10 pm/ implant de FGFl et FGF2 induisent une angiogénèse significative (scores de 2,35 et 2,05 respectivement). Ig2Id FI et Ig2Id F2 à la dose de 4 pm/implant entraînent une angiogénèse (scores de 1,3 et 1,85 respectivement à J15) significativement supérieure à celle obtenue avec les immunoglobulines contrôles ( p<0,05).10 pm / implant of FGF1 and FGF2 induce significant angiogenesis (scores of 2.35 and 2.05 respectively). Ig2Id FI and Ig2Id F2 at a dose of 4 pm / implant cause angiogenesis (scores of 1.3 and 1.85 respectively on D15) significantly higher than that obtained with the control immunoglobulins (p <0.05).

La cinétique d'apparition des néo-vaisseaux apparaît différente de celle obtenue avec le ligand naturel. A J7, le FGF2 atteint le seuil de significativité statistique avec 80% de l'effet maximal, alors que les effets induits par Ig2Id FI et Ig2Id F2 sont à 10% et 41% des scores maximum.The kinetics of appearance of the neo-vessels appear to be different from that obtained with the natural ligand. At D7, the FGF2 reaches the threshold of statistical significance with 80% of the maximum effect, while the effects induced by Ig2Id FI and Ig2Id F2 are at 10% and 41% of the maximum scores.

Ig2Id FI et Ig2Id F2 induisent une angiogénèse comme les ligands FGFl et FGF2. 4.5 Croissance tumorale (Figure 8).Ig2Id FI and Ig2Id F2 induce angiogenesis like the ligands FGFl and FGF2. 4.5 Tumor growth (Figure 8).

Ni Ig2Id FI ni Ig2Id F2 n'affectent la croissance des xénogreffes de cellules NBT- II.Neither Ig2Id FI nor Ig2Id F2 affect the growth of NBT-II cell xenografts.

En revanche, si la croissance des cellules NBT-II/FGF-Rl n'est pas affectée par Ig2Id FI, elle est inhibée par Ig2Id F2, ce qui reproduit l'effet inhibiteur de la prolifération observé in vitro après l'inoculation de FGF2 ou de Ig2Id F2. On the other hand, if the growth of NBT-II / FGF-R1 cells is not affected by Ig2Id FI, it is inhibited by Ig2Id F2, which reproduces the proliferation-inhibiting effect observed in vitro after the inoculation of FGF2 or Ig2Id F2.

Claims

REVENDICATIONS 1. Utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant des cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogenèse, soit pour inhiber l'angiogénèse, soit pour favoriser l'angiogénèse, sans affecter les cellules endothéliales quiescentes, ou pour la préparation d'un produit de diagnostic de pathologies impliquant des cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogenèse.1. Use of anti-idiotypic fibroblast growth factor 1 antibodies for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies involving endothelial cells engaged in an angiogenesis process, either to inhibit angiogenesis or to promote angiogenesis, without affecting quiescent endothelial cells, or for the preparation of a product for diagnosing pathologies involving endothelial cells engaged in an angiogenesis process. 2. Utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant les cellules endothéliales angiogéniques, par stimulation sélective du récepteur FGFR2b.2. Use of anti-idiotypic fibroblastic growth factor 1 antibodies according to claim 1, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies involving angiogenic endothelial cells, by selective stimulation of the FGFR2b receptor. 3. Utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 selon l'une des revendications 1 ou 2, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant des cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogenèse, pour inhiber l'angiogénèse, sans affecter les cellules endothéliales quiescentes, lequel anticorps anti-idiotypique est couplé à une toxine dont la fonction est de bloquer la traduction des protéines, ladite toxine étant notamment choisie parmi la saporine, la ricine ou bien un élément radioactif tel que l'iode 125 ou 131, ou lequel anticorps anti-idiotypique est sous forme de fragment Fab.3. Use of anti-idiotypic antibodies to fibroblast growth factor 1 according to one of claims 1 or 2, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies involving endothelial cells engaged in an angiogenesis process, for inhibit angiogenesis, without affecting the quiescent endothelial cells, which anti-idiotypic antibody is coupled to a toxin whose function is to block the translation of proteins, said toxin being chosen in particular from saporin, ricin or a radioactive element such that iodine 125 or 131, or which anti-idiotypic antibody is in the form of a Fab fragment. 4. Utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 selon l'une des revendications 1 ou 2, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies impliquant des cellules endothéliales engagées dans un processus d'angiogenèse pour favoriser l'angiogénèse, sans affecter les cellules endothéliales quiescentes.4. Use of anti-idiotypic fibroblastic growth factor 1 antibodies according to one of claims 1 or 2, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies involving endothelial cells engaged in an angiogenesis process to promote angiogenesis, without affecting the quiescent endothelial cells. 5. Utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 4, pour la préparation d'un médicament destiné à : - favoriser l'angiogénèse physiologique pour augmenter la vitesse de la formation des vaisseaux sanguins au cours de la cicatrisation, de la maturation du corps jaune de l'ovaire, et/ou5. Use of anti-idiotypic fibroblastic growth factor 1 antibodies according to any one of claims 1, 2 or 4, for the preparation of a medicament intended for: - favor physiological angiogenesis to increase the speed of the formation of blood vessels during scarring, maturation of the ovarian yellow body, and / or - favoriser l'angiogénèse au cours de pathologies obstructives des vaisseaux afin de reperfuser des territoires ischémies lors de trombose vasculaire, comme notamment dans l'artérite des membres inférieurs et l'infarctus du myocarde, et/ou- favor angiogenesis during obstructive pathologies of the vessels in order to reperfuse ischemic areas during vascular thrombosis, as in particular in arteritis of the lower limbs and myocardial infarction, and / or - stimuler sélectivement l'activité des récepteurs du FGFl dans des pathologies où lesdits récepteurs sont fonctionnellement déficients, et/ou- selectively stimulate the activity of FGF1 receptors in pathologies where said receptors are functionally deficient, and / or - inhiber sélectivement l'activité des récepteurs du FGFl à l'aide de fragments Fab ou d'anticorps anti-idiotypiques bloquants, et/ou- selectively inhibit the activity of FGF1 receptors using Fab fragments or blocking anti-idiotypic antibodies, and / or - retarder ou arrêter le processus de dégénérescence des photorécepteurs de la neuroretine observé au cours des rétinites pigmentaires génétiques ou acquises lors des surdosages de médicaments inhibant la phosphodiesterase dépendant du GMP-cyclique, et/ou- delay or stop the degeneration process of neuroretin photoreceptors observed during genetic retinitis or acquired during overdoses of drugs inhibiting phosphodiesterase dependent on GMP-cyclic, and / or - stimuler la phagocytose des segments externes des bâtonnets par les cellules épithéliales pigmentées de la rétine comme traitement de certaines rétinopathies pigmentaires et des formes sèches de la dégénérescence maculaire liée à l'âge.- stimulate phagocytosis of the external segments of the rods by the pigmented epithelial cells of the retina as a treatment for certain pigmentary retinopathies and dry forms of age-related macular degeneration. 6. Utilisation d'anticorps anti-idiotypiques du facteur de croissance fibroblastique 1 selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, associés à une toxine ou de fragment Fab d'anticorps anti-idiotypique, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de l'angiogénèse telles que cancer, rétinopathies diabétiques et le rejet de greffes de cornée.6. Use of anti-idiotypic antibodies to fibroblast growth factor 1 according to any one of claims 1 to 3, associated with a toxin or Fab fragment of anti-idiotypic antibody, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies requiring the inhibition of angiogenesis such as cancer, diabetic retinopathies and rejection of corneal transplants. 7. Anticorps anti-idiotypique, notamment monoclonal, et notamment humanisé, du facteur de croissance fibroblastique 1, caractérisé en ce qu'il est respectivement un ligand du récepteur humain FGFR2b.7. Anti-idiotypic antibody, in particular monoclonal, and in particular humanized, of fibroblastic growth factor 1, characterized in that it is respectively a ligand of the human receptor FGFR2b. 8. Anticorps anti-idiotypique selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes :8. Anti-idiotypic antibody according to claim 7, characterized in that it has the following properties: - il est spécifique vis-à-vis du récepteur FGF-R2b,- it is specific with respect to the FGF-R2b receptor, - il est circulant,- it is circulating, - il présente une durée de demi-vie d'environ 23 jours, notamment d'environ 21 jours, et en particulier de 22,5 jours, 2S- it has a half-life of approximately 23 days, in particular approximately 21 days, and in particular 22.5 days, 2S - il induit la phosphorylation sur une tyrosine d'une protéine de 140 kDa,- it induces phosphorylation on a tyrosine of a 140 kDa protein, - il induit la prolifération des cellules endothéliales vasculaires,- it induces the proliferation of vascular endothelial cells, - il stimule l'angiogénèse,- it stimulates angiogenesis, - il ne provoque pas d'hypotension artérielle.- it does not cause hypotension. 9. Fragment Fab d'un anticorps anti-idiotypique selon la revendication 7 ou la revendication 8.9. Fab fragment of an anti-idiotypic antibody according to claim 7 or claim 8. 10. Complexe entre un anticorps anti-idiotypique selon la revendication 7 ou la revendication 8 et une toxine, en particulier choisie parmi la saporine, la ricine, ou bien un élément radioactif tel que l'iode 125 ou 131, ou le strontium.10. Complex between an anti-idiotypic antibody according to claim 7 or claim 8 and a toxin, in particular chosen from saporin, ricin, or else a radioactive element such as iodine 125 or 131, or strontium. 11. Procédé de préparation d'un anticorps anti-idiotypique du facteur de croissance fibroblastique 1 selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce que: a) on injecte le facteur de croissance fibroblastique 1 (FGF-1) purifié chez un animal, notamment un lapin, b) on prélève le sang pour récupérer les immunoglobulines Ig purifiées contenant des anticorps anti-FGF-1 (Igl FI) spécifiques, par exemple par chromatographie d'affinité pour la protéine A puis, on purifie éventuellement les Igl FI spécifiques à partir des Ig purifiées, par exemple par chromatographie d'affinité pour le FGF-1, c) on injecte les susdites Ig purifiées ou les susdites Igl FI spécifiques et purifiées chez l'animal de la même espèce que celui utilisé lors de l'injection de FGF-1, notamment dans les ganglions poplités de lapin de même allotype que celui qui a proαuit Igl FI, lors de l'injection de FGF-1, d) on prélève le sang pour récupérer les Ig totales, par exemple par la protéine A, puis pour soumettre les Ig totales à deux immunoadsorptions :11. A method of preparing an anti-idiotypic antibody to fibroblastic growth factor 1 according to claim 7 or claim 8, characterized in that: a) purified fibroblastic growth factor 1 (FGF-1) is injected into a animal, in particular a rabbit, b) the blood is taken to recover the purified Ig immunoglobulins containing specific anti-FGF-1 antibodies (Igl FI), for example by affinity chromatography for protein A, then, Igl is optionally purified Specific IFs from purified Ig, for example by affinity chromatography for FGF-1, c) the above purified Ig or the above specific and purified IFIgl IF are injected into animals of the same species as that used during the injection of FGF-1, in particular in the popliteal ganglia of the rabbit of the same allotype as that which proαuit Igl FI, during the injection of FGF-1, d) the blood is taken to recover the total Ig, for example by protein A, then to subject the total Ig to two immunoadsorption: - une immunoadsorption sur une colonne d'affinité préparée avec les Ig preimmunes du lapin (Ig PI) qui a servi à faire les Igl FI, pour éliminer les anticorps anti-allotypes ou isotypes,- immunoadsorption on an affinity column prepared with rabbit preimmune Ig (Ig PI) which was used to make the Igl FI, to eliminate the anti-allotype or isotype antibodies, - une immunoadsorption sur une colonne d'affinité préparée avec des Igl FI, pour purifier les anticorps anti-idiotypiques (Ig2Id Fl).- immunoadsorption on an affinity column prepared with Igl FI, to purify the anti-idiotypic antibodies (Ig2Id Fl). 12. Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal anti-idiotypique de FGFl selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce que : a) on injecte FGF-1 à un animal, et notamment à une souris, b) on récupère les splénocytes de ranimai synthétisant des Igl FI, c) on fusionne les susdits splénocytes avec des cellules de myélome, d) on sélectionne les hybridomes obtenus à l'issue de l'étape c) précédente en ce qu'ils synthétisent des immunoglobulines dirigées contre FGF-1, e) on injecte les Igl FI ainsi sélectionnés à l'issue de l'étape d) à un animal, et notamment à une souris, de même allotype que celui ayant produit Igl FI, f) on récupère les splénocytes synthétisant des Ig2Id FI, g) on fusionne les cellules de la rate (splénocytes) avec des cellules de myélome, h) on sélectionne les hybridomes obtenus à l'issue de l'étape g) précédente en ce qu'ils synthétisent des Ig2Id FI dirigés contre Igl FI, i) on récupère lesdits Ig2Id FI.12. Process for the preparation of an anti-idiotypic FGF1 monoclonal antibody according to claim 7 or claim 8, characterized in that: a) injecting FGF-1 into an animal, and in particular a mouse, b) recovering the splenocytes of ranimai synthesizing Igl FI, c) fusing the above-mentioned splenocytes with myeloma cells, d) selecting the hybridomas obtained at the end of step c) above in that they synthesize immunoglobulins directed against FGF-1, e) the Igl FIs thus selected at the end of step d) are injected into an animal, and in particular to a mouse, of the same allotype as that which produced Igl FI, f) the splenocytes synthesizing Ig2Id FI are recovered, g) the cells of the spleen (splenocytes) are fused with myeloma cells, h) the hybridomas obtained are selected at the end of step g) above in that they synthesize Ig2Id FI directed against Igl FI, i) recovering said Ig2Id FI. 13. Compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent à titre de substance active au moins un anticorps anti-idiotypique selon la revendication 7 ou la revendication 8, ou au moins le fragment Fab selon la revendication 9 ou au moins le complexe selon la revendication 10, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 13. Pharmaceutical compositions characterized in that they comprise, as active substance, at least one anti-idiotypic antibody according to claim 7 or claim 8, or at least the Fab fragment according to claim 9 or at least the complex according to claim 10, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
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