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WO2001098493A1 - Insulin-like growth factor-binding protein - Google Patents

Insulin-like growth factor-binding protein Download PDF

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WO2001098493A1
WO2001098493A1 PCT/JP2001/005112 JP0105112W WO0198493A1 WO 2001098493 A1 WO2001098493 A1 WO 2001098493A1 JP 0105112 W JP0105112 W JP 0105112W WO 0198493 A1 WO0198493 A1 WO 0198493A1
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WO
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protein
amino acid
disease
acid sequence
seq
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2001/005112
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuya Yamano
Susumu Sekine
Mitsuo Satoh
Toshio Ota
Akiko Furuya
Kenji Shibata
Yuki Kobayashi
Miho Takebayashi
Yusuke Nakamura
Sumio Sugano
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Definitions

  • the present invention relates to a novel insulin-like growth factor binding protein, DNA encoding the protein and an antibody recognizing the protein, and a method for determining a disease involving the protein, a diagnostic agent, a prophylactic agent or a therapeutic agent.
  • IGFBP Insulin-like growth factor binding protein
  • IGFBP The function of IGFBP has been suggested to have a direct action by binding to integrin, but the main action is to regulate the activity, distribution and metabolism of IGF and insulin by binding to it.
  • Rev., IS, 801 (1997), Bioscience Term Library Cytokine 'Growth Factor Revised Edition, P14-17 (1988)]
  • IGFBPs It is thought that it exerts its function by suppressing the transport and degradation of IGF outside the blood vessel and regulating the binding to receptors.
  • IGFBP-1 to 6 are structurally similar and bind to IGF with a higher affinity than insulin. Classified into subfamilies as high affinity I GFBP Endocrinol., Z, 404 (1988), EMBO J., S, 2497 (1989), Mol. Endocrinol., 2, 1176 (1989), Mol. Endocrinol., 4, 1806 (1990), Biochem. Biophys. Res. Commun., Jp., 219 (1991), J. Biol. Chem., Roppongi, 9043 (1991), J. Biol. Chem., 2 L, 10646 (1991)].
  • IGF high affinity Amino acid sequence homology between one molecule of the IGFBP subfamily is 49% -60% in humans. In addition, 18 kinds of cysteine residues are conserved in 5 kinds of IGFBP except IGFBP-6, and 3 of the N-terminals are G1y-Cys-G1y-Cys-Cys.
  • X X—Homologous sequence represented by Cys [X represents an arbitrary amino acid, and the homologous sequence is called an insulin-like growth factor binding motif (hereinafter, also referred to as “IGFBP motif”)] Has been shown to be involved in the binding of IGF [Prog. Growth Factor Res., 243 (1991)].
  • IGFBP-1 and 3 both suppress and promote the action of IGF.
  • IGFBP-2, 4, and 6 are inhibitory, and IGFBP-5 is an promoting IGF-binding protein.
  • IGF is produced in the liver and bone tissue in a growth hormone-dependent manner and functions as a growth factor to promote physical growth.IGF-I and a large amount of it are expressed in the central nervous system and bone tissue.
  • IGF-II is presumed to play an important role in embryonic growth
  • IGFBP-1, 3, and 4 have binding activities equivalent to IGF-I and IGF-II.
  • IGFBP-2, 5, and 6 mainly show strong binding activity to IGF-II.
  • IGFBP-1 is mainly found in amniotic fluid and fetal serum.
  • IGF ⁇ ⁇ -3 is mainly in liver and serum
  • I GFBP-4 is mainly found in renal glomeruli, skin and intestinal epithelium
  • I GFBP-5 is mainly found in intestinal epithelium and bone
  • I GFBP-6 is mainly found in skin and heart ing.
  • IGFBP-4 and 5 have important functions in bone metabolism, and the expression of IGFBP-5 is decreased in osteoporosis, and the expression of IGFBP-4 is reduced in elderly female fracture patients with elevated parathyroid hormone. It is reported to rise.
  • IGF-I Increased paracrine action of IGF-I was observed in compensatory hypertrophy after nephrectomy and small intestine resection, but IGF-I mRNA level did not change and IGFBP-3 expression decreased Has been reported to increase the IGF-I of the release [J. Fuller; Baillieres Clin. Endocrinol. Metab., S, 165 (1994)]. Furthermore, it has been reported that the expression of IGFBP-1 is lower in malignant tumors of the endometrial gland than in benign tumors [Growth Regul., 2, 74, (1993)].
  • IGFBP-7 to 10 are considered to be structurally similar and have the common property of having low affinity for IGF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, M, 12981 (1997), Cancer Res., S2, 2787 (1999), which has been classified into another subamylie as IGF low affinity IGFBP.
  • IGFBP-7 Various physiological activities have been reported for IGFBP-7, and many reports have been made especially on cancer and its relationship to pathological conditions.
  • IGFBP-7 is up-regulated in senescent human epithelial cells [J. Clin. Endocrinol. Metab., I, 715 (1993)], whereas it is expressed in carcinoma cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2Z, 4472 (1995), which is thought to have a function as a tumor suppressor activity gene due to its decreased activity.
  • the locus of IGFBP-7 on the human chromosome is 4q12, and its expression is also known to increase when human epithelial cells are treated with retinoic acid [Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 2Z, 4472 (1995)].
  • IGFBP-7 and IGFBP-3 in cerebrospinal fluid have been reported in leukemia patients, and their relationship with the pathology of leukemia has been noted [J. Clin. Endocrinol. Metab., 1283 (1999)].
  • IGFBP-7 expression is decreased in large uterine leiomyomas, and that IGFBP-7 expression is increased in patients treated with gonadotropin-releasing hormone. [J. Reprod. Immunol., 53 (2000)].
  • mouse liver cancer cells induced by the SV40 T antigen the 5 'upstream region of the IGFBP-7 gene is methylated and its expression level is reduced.
  • Has been proposed [Biochem. Biophys. Res. Commun., 2 ⁇ L, 109 (2000)].
  • PGI2 proscycycline PGI 2
  • IGFBP-7 In coronary artery smooth muscle cells of type II diabetics, decreased expression of IGFBP-7 has also been observed at the protein level [Diabetes, 4 £, 1627 (1997)]. Furthermore, it has been confirmed at the mRNA and protein levels that IGFBP-7 expression decreases when bovine artery-derived smooth muscle cells are cultured in a high glucose medium [Diabetes,, 1627 (1997), Diabetologia, 41 , 134 (1998)].
  • TGF-? Transforming growth factor- /?
  • P'TH Parathyroid hormone
  • PGE2 prostaglandin E2
  • IGFBP-7 also influences differentiation into skeletal muscle by suppressing the differentiation promoting effect of IGF [Exp. Cell Res., 192 (1997) Endocrinology, Hi, 100 (2000)].
  • I GFBP-7 was the same molecule as PSF, a factor that promotes the production of proscine cyclin PGI 2, it was concluded that the physiological function of 108 It is considered.
  • PGI 2 a type of prostaglandin, has potent platelet aggregation inhibitory action and vasorelaxant action, and is antagonistic to TXA 2, which has the opposite action, and is involved in maintaining homeostasis in vivo.
  • PGI2 a type of prostaglandin
  • PSF is a factor present in the bloodstream that stimulates PGI 2 production in the blood vessel wall [Nature, m, 549 (1978)], and that the factor is a hemolytic uremic syndrome.
  • Group [Lancet, Z, 871 (1978)], thrombotic thrombocytopenic purpura [Lancet, Z, 748 (1979)], sickle cell anemia [Br. J. Haematol., 4S, 545 (1981)) Acute myocardial infarction [Coronary, Z, 49 (1985)], diabetic vascular disorder [Metabolism, M, 837 (1989), Haemostasis, Jl, 447 (1986), Diab. Res. Clin. Pract., 243 (1987) )], It has been reported that blood levels are reduced in arteriosclerotic diseases. In other words, I GFBP-7 promotes PGI 2 production by vascular endothelial cells and
  • dwarfism acromegaly, pediatric chronic renal failure, osteoporosis, breast cancer, prostate cancer, acute leukemia, colon cancer, uterine leiomyoma, liver cancer, type I diabetes, type II diabetes, thrombosis, arteriosclerosis, It has also been shown to be involved in diseases such as hemolytic uremic syndrome, thrombotic thrombocytopenic purpura, sickle cell anemia, acute myocardial infarction, and diabetic vascular disorders.
  • diseases such as hemolytic uremic syndrome, thrombotic thrombocytopenic purpura, sickle cell anemia, acute myocardial infarction, and diabetic vascular disorders.
  • a protein belonging to the IGFBP superfamily and having activity as an IGFBP can be used as a disease associated with abnormal cell proliferation or a disease associated with vascular disorder.
  • a disease with abnormal bone metabolism, a disease with impaired IGF or growth hormone action, a disease with abnormal differentiation and proliferation of smooth muscle cells, a disease with abnormal differentiation and proliferation of skeletal muscle cells, gastric acid secretion It is considered to be a drug for the judgment, treatment or prevention of diseases with abnormalities or inflammatory diseases with abnormal lymphocyte infiltration. Has been attracting much attention as an evening get.
  • the present invention provides a novel insulin-like growth factor binding protein, a DNA encoding the protein, an antibody recognizing the protein, a method for determining a disease involving the protein, a diagnostic agent, a prophylactic agent, and a therapeutic agent.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, succeeded in obtaining a novel insulin-like growth factor binding protein belonging to the IGFBP family and the protein; and obtaining DNA.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following (1) to (60).
  • An insulin-like growth factor binding protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • (A) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having substantially the same activity as the protein of (1);
  • (B) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having substantially the same activity as the protein of (2);
  • (B) a protein consisting of the amino acid sequence of amino acid Nos. 75 to 82 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having substantially the same activity as the protein of (2);
  • the amino acid sequence of (5) of (5) comprises one or more amino acid deletion, substitution or addition, and is substantially the same as the protein of (1).
  • (A) a protein comprising an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence described in (A) of (5) and having substantially the same activity as the protein described in (1);
  • (B) a protein consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence described in (B) of (5), and having substantially the same activity as the protein described in (2);
  • (A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, comprising a partial amino acid sequence including the amino acid sequence of amino acids 171 to 304, and having substantially the same activity as the protein of (1). 5.
  • the protein according to (A) is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, comprising a partial amino acid sequence including the amino acid sequence of amino acids 171 to 304, and having substantially the same activity as the protein of (1). 5.
  • amino acid sequence of (8) of (8) comprises one or more amino acid deletion, substitution or addition, and is substantially the same as the protein of (1).
  • (A) a protein consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence described in (A) of (8) and having substantially the same activity as the protein described in (1);
  • (B) a protein consisting of an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence described in (B) of (8), and having substantially the same activity as the protein described in (2);
  • A a polypeptide comprising at least amino acid sequence Nos. 171 to 304 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising at least 5 consecutive amino acids or more;
  • (B) DNA encoding the protein of (2), DNA encoding the protein or polypeptide of any of (3) to (12), or represented by SEQ ID NO: 4.
  • a transformant selected from the transformants according to any one of (18) to (21) is cultured in a medium, and the transformant is cultured in a culture medium.
  • (36) including performing hybridization using the DNA according to any one of (13) to (16) or the oligonucleotide or the oligonucleotide derivative described in (33).
  • a disease characterized by detecting a mutation in a DNA encoding the protein according to any one of (1) to (10) or measuring an expression level thereof and comparing the detected amount with a healthy person. Judgment method
  • (B) A method for determining a disease, characterized by detecting a mutation of the protein according to any one of (1) to (10) or measuring an expression level thereof, and comparing the expression with a healthy person.
  • (A) the mutation or expression level of the DNA encoding the protein according to any one of (1) or (3) to (; L0), and (2) or (3) to (12)
  • a method for determining a disease characterized by comparing the amount of DNA encoding the protein according to any one of the above (B) with the mutation or expression level thereof.
  • the disease is a disease with abnormal cell proliferation, a disease with vascular disorders, a disease with abnormal bone metabolism, a disease with disorders of insulin-like growth factor or growth hormone action, abnormal differentiation of smooth muscle cells.
  • the disease associated with abnormal cell proliferation is acute myeloid leukemia, breast cancer, prostate cancer, colorectal cancer, liver cancer, myeloma, uterine leiomyoma, malignant tumor, or solid tumor.
  • Inflammatory diseases with abnormal lymphocyte infiltration include microbial infection, chronic hepatitis B, rheumatoid arthritis, sepsis, graft-versus-host disease, insulin-dependent diabetes mellitus, nephritis, traumatic injury, inflammatory bowel (40)
  • the determination method according to (40) which is a disease, allergy, atopy, asthma, hay fever, airway hyperreactivity or autoimmune disease.
  • a medicament comprising the DNA according to any one of (13) to (16) or the oligonucleotide or the oligonucleotide derivative according to (33).
  • Pharmaceutical is a disease with abnormal cell proliferation, a disease with vascular disorders, a disease with abnormal bone metabolism, a disease with disorders of insulin-like growth factor or growth hormone action, abnormal smooth muscle cell differentiation
  • the disease associated with abnormal cell proliferation is acute myeloid leukemia, breast cancer, prostate cancer, colorectal cancer, liver cancer, myeloma, uterine leiomyoma, malignant tumor or solid tumor
  • the disease associated with vascular disorders is myocardium Infarction, cerebral infarction, peripheral vascular obstruction, angina, hypertension, hyperlipidemia, diabetes, diabetic retinopathy, glomerulonephritis, arteriosclerosis, thrombus, hemolytic uremic disease And thrombotic thrombocytopenic purpura, ischemic heart disease, ischemic encephalopathy, heart failure, depressed blood or choroidal circulatory disorders, and diseases with abnormal bone metabolism are osteoporosis, insulin-like growth factor, Diseases with impaired growth hormone action are dwarfism, acromegaly or pediatric chronic renal failure; diseases with abnormal smooth muscle cell differentiation and proliferation are arteriosclerosis, bronchial disease or restenosis; Diseases with skeletal muscle cell differentiation and proliferation are myasth
  • the transformed transformant is brought into contact with a test sample, and a compound that controls the expression of the gene encoding the protein described in (1) to (10) is selected from the test sample.
  • Pharmaceutical drugs are diseases with abnormal cell proliferation, diseases with vascular disorders, diseases with abnormal bone metabolism, diseases with disorders of insulin-like growth factor or growth hormone action, abnormal smooth muscle cell differentiation It is a prophylactic or therapeutic agent for diseases involving proliferation, diseases involving abnormal proliferation and differentiation of skeletal muscle cells, diseases involving abnormal gastric acid secretion, or inflammatory diseases involving abnormal lymphocyte infiltration.
  • the disease associated with abnormal cell proliferation is acute myeloid leukemia, breast cancer, prostate cancer, colorectal cancer, liver cancer, myeloma, uterine leiomyoma, malignant tumor or solid tumor
  • the disease associated with vascular disorders is myocardium Infarction, cerebral infarction, peripheral vascular atresia, angina, hypertension, hyperlipidemia, diabetes, diabetic retinopathy, glomerulonephritis, arteriosclerosis, thrombosis, hemolytic uremic syndrome group, thrombotic thrombocytopenia Purpura, ischemic heart disease, ischemic brain disease, heart failure, depressed blood or choroidal circulatory disorder, a disease with abnormal bone metabolism is osteoporosis, and a disease with impaired insulin-like growth factor or growth hormone action If you have dwarfism, acromegaly or pediatric chronic renal failure, a disease with abnormal smooth muscle cell differentiation and proliferation Atherosclerosis, bronchial disease or restenosis, disease with abnormal skeletal muscle
  • a protein or polypeptide according to any one of (1) to (12) is brought into contact with a test sample, and a substance that specifically binds to the protein or polypeptide is selected from the test sample.
  • (Ii) a protein consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having substantially the same activity as the protein of (a);
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 consisting of a partial amino acid sequence including the amino acid sequence of amino acids 75 to 82, and having substantially the same activity as the protein described in (b) above;
  • the amino acid sequence representing the protein described in (g) above is composed of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and is substantially the same as the protein described in (a) above. With the same activity
  • amino acid sequence representing the protein described in (h) above, wherein the amino acid sequence comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and substantially the same as the protein described in (b) above. Proteins with the same activity
  • (k) a protein consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence representing the protein of (g), and having substantially the same activity as the protein of (a);
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 which comprises a partial amino acid sequence containing the amino acid sequence of amino acids 171 to 197 and has substantially the same activity as the protein described in (b) above;
  • (P) an amino acid sequence described in (n) above, wherein the amino acid sequence has one or more amino acids deleted, substituted or added, and has substantially the same activity as the protein described in (b) above.
  • Factors belonging to the insulin-like growth factor binding protein superfamily are protein factors having affinity for IGF or insulin, and have an insulin-like growth factor binding motif (IGFBP motif).
  • the motif is conserved in the N-terminal portion of a protein belonging to the insulin-like growth factor binding protein super family 1 and comprises a protein comprising an amino acid sequence represented by Gly-Cys-Gly-Cys-Cys-XX-Cys. (X represents an arbitrary amino acid).
  • Proteins belonging to the insulin-like growth factor binding protein superfamily have at least 10 cysteine residues conserved around the IGFBP motif, and exhibit an affinity for IGF or insulin via the IGFBP motif portion.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 the amino acid sequence represented by amino acid Nos. 75 to 82 is represented, and in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence represented by amino acids 75 to 82 Amino acid sequence is an IGFBP motif o
  • the protein having substantially the same activity as the protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2
  • examples of such proteins include proteins in which the same proteins as integrin, IGF, insulin or receptor bind. Substantially identical indicates that the activities are identical in nature. Therefore, quantitative factors such as the degree of binding activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 which is the protein of the present invention, comprising one or more amino acids deleted, substituted or added, and SEQ ID NO: A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, or added is one or more, and the number is not particularly limited. However, the number of amino acids that can be deleted, substituted, or added by well-known techniques such as the site-directed mutagenesis method described above For example, 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • the present invention includes not only such artificially created mutants but also mutants generated in nature.
  • the protein of the present invention is a protein having a partial amino acid sequence in the amino acid sequence of the protein of the present invention, and has substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. Including proteins.
  • a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added to the protein is also a protein of the present invention.
  • the protein is a protein in which the number of amino acids which can be introduced by the known site-directed mutagenesis method is deleted, substituted or added, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • a protein having substantially the same activity as the protein can be mentioned.
  • one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 comprises a deleted amino acid sequence, and a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the protein having substantially the same activity include a protein from which a signal peptide has been removed.
  • Proteins having substantially the same activity are also proteins of the present invention.
  • homology to the amino acid sequence of the protein of (g), (h), (m) or (n) is required. Is at least 60%, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, Preferably it is 97% or more.
  • polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it can be used as an antigen polypeptide when producing the antibody recognizing the protein of the present invention.
  • a polypeptide comprising at least 5 amino acids, preferably at least 10 amino acids, more preferably at least 15 amino acids in the amino acid sequence represented by 2.
  • polypeptide consisting of amino acids or more, more preferably 15 amino acids or more can distinguish the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 from the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Useful for producing antibodies.
  • DNA of the present invention the DNA of the present invention,
  • a DNA that hybridizes under stringent conditions is, for example, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.]
  • the DNA of the present invention such as NA or a partial DNA fragment thereof is used as a probe for colonies. ⁇ Hybridization method, plaque ⁇ DNA obtained by using the hybridization method, Southern plot hybridization method, etc., and specifically, a file in which DNA derived from colonies or plaques is immobilized. Using the evening, 0.
  • Hybridization is Morekiyura 1 ⁇ Cloning 2nd edition, Current 'Protocols'in' Molecular ⁇ , ⁇ Logic, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995), etc. It can be done according to the method.
  • a hybridizable DNA for example, a DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 when calculated using analysis software such as BLAST described above.
  • DNAs having homology of 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more can be mentioned.
  • the DNA described in the above (7) and (8) is a DNA encoding the polypeptide of the present invention, and the DNA is produced by the polypeptide of the present invention and represented by SEQ ID NO: 3 or 4. It can be used for detecting the expression of DNA containing the coding region of the nucleotide sequence or measuring the expression level.
  • the DNAs encoding the polypeptides of the above (u) and (V) include a DNA containing the coding region of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a coding region of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 3 a DNA containing the coding region of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 4 a DNA containing the coding region of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 4 By comparing the expression level of DNA, it is useful for diagnosing a disease characterized in that the expression ratio of the protein of SEQ ID NO: 1 to the protein of SEQ ID NO: 2 is different from normal.
  • the DNA of the present invention is prepared by isolating mRNA from human tissues, for example, mRNA from human small intestine, preparing a cDNA library thereof, and then screening the cDNA library to obtain a desired clone. be able to.
  • Human small intestine mRNA may be a commercially available one (for example, manufactured by Clontech) or may be prepared from human small intestinal tissue as follows. In the latter case, first, total RNA can be prepared from the small intestine tissue, and mRNA can be isolated from the total RNA. Methods for preparing total RNA from small intestinal tissue include guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymology, III, 3 (1987)], guanidine acid thiocyanate / phenol / clonal form (AGPC) method [ Analytical Biochemistry,, 156 (1987), Experimental Medicine, S, 1937 (1991)].
  • guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method Methods for preparing total RNA from small intestinal tissue include guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymology, III, 3 (1987)], guanidine acid thiocyanate
  • mRNA can be prepared by using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) ⁇ Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • a cDNA library is prepared from the prepared human small intestinal tissue mRNA.
  • Examples of the method for preparing a cDNA library include the methods described in Molecular 'Clothing Second Edition, Current' Protocols' in 'Molecular' Biology, etc., or commercially available kits such as the Superscript Plasmid System For example, a method using a cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (manufactured by Life Technologies), a ZAP-cDNA Synthesis Kit (manufactured by STRATAGENE) and the like.
  • any phage vector, plasmid vector, or the like can be used as long as it can replicate autonomously in the E. coli K12 strain.
  • ZAP Express [STRATAGENE, Strategies, ⁇ , 58 (1992)], pBluescript II SK (+) (Nucleic Acids Research, II, 9494 (1989)), Lambda ZAP II (STRATAGENE), gtlO, Agtll CDNA cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], ATriplEx (Clontech), input ExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol.,, 280 (1983)] and pUC18 [Gene, 22, 103 (1985)).
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia particularly those belonging to Escherichia coli (hereinafter, also referred to as “Escherichia coli”). Any living organism can be used. Specifically, Escherichia, coli XLl-Blue MRF '(STRATAGENE, Strategies, 5, 81 (1992)) ⁇ Escherichia coli C600 CGenetics,, 440 (1954)], Escherichia coli Y1088 (Science, 221, 778 (1983) )), Escherichia coli i1090 fScience.222., 778 (1983)), Escherichia coli NM522 (J.Mol.Biol., L, 1 (1983)), Escherichia coli K8Q2 (J.Mol.Biol., Lfi, 118 (1966)] and 7 scherichia coli JM105 [Gene, 2SL, 275 (1985)
  • This cDNA library may be used as it is for the following analyses, but the oligocap method developed by Sugano et al. To reduce the percentage of incomplete full-length cDNA and obtain full-length cDNA as efficiently as possible! : Gene, 1, 171 (1994), Gene, 2 ⁇ , 149 (1997), Protein nucleic acid enzyme, 41, 603 (1996), Experimental medicine, 11, 2491 (1993), cDNA cloning, Yodosha (1996) ), A method for preparing a gene library, Youtosha (1994)], and a cDNA library prepared using the method described below may be used for the following analysis.
  • Each clone was isolated from the prepared cDNA library, and the cDNA base sequence of each clone was analyzed from the end using a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Pro Natl. Acad. Sci. USA, ⁇ , 5463 (1977)] or AB IPR I SM377 DN ⁇ sequencer (manufactured by PE Biosystems) to determine the nucleotide sequence of the DNA. .
  • each cDNA nucleotide sequence has a novel sequence can be determined by searching a nucleotide sequence database such as GenBank, EMBL and DDBJ using a homology search program such as BLAST. This can be confirmed by the absence of a nucleotide sequence showing obvious homology, which is considered to be completely identical to the nucleotide sequence of the existing gene in the evening base.
  • nucleotide sequence of cDNA containing the novel sequence obtained by the above method examples include the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 3 and 4.
  • a protein obtained by translating a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is BLAST 2 CNuc. Acid.
  • Gly—Cys—Gly—Cys is a typical insulin-like growth factor binding motif in the portion corresponding to the insulin-like growth factor binding motif.
  • the amino acid sequence consisting of Al a — Gly — Gly — Cy s — Cy s — Trp — G1 u_ Cys is very similar to the amino acid sequence consisting of -Cy sXX-Cy s (X represents any amino acid).
  • IGFBP superfamily proteins abnormal cell proliferation of acute myeloid leukemia, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, liver cancer, myeloma, uterine leiomyoma, malignant tumor, solid tumor, etc.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 Comparison of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 reveals that the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 3 and 4 share the same sequence.
  • the human genomic library was converted to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4. It can be determined by screening using a specific sequence and determining the nucleotide sequence of the obtained genomic clone.
  • a commercially available human genome library (for example, a BAC library manufactured by Research Genetics) may be used, or a method known per se from human cells or tissues [Genomics, 29, 413 (1995), Genomics, 2 ⁇ , 527]. (1994) and the like].
  • a genomic DNA clone (for example, a human genome BAC clone) containing both the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 is obtained.
  • the nucleotide sequence of this genomic DNA is determined and compared with the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is divided into five parts, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 It can be seen that the sequence is divided into seven parts and exists over about 7 kb on the same human genome.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is composed of five exons
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is composed of four exons.
  • the exons are completely identical.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are derived from the same gene and have the unique feature that they have different amino acid sequences. It can be seen that each of these is a product of a different slice form.
  • the primers based on the nucleotide sequences at the 5 ′ and 3 ′ ends of the nucleotide sequence are obtained.
  • a PCR method (PCR Protocols, Academic Press (1990)) using a cDNA or cDNA library synthesized from mRNA contained in tissues or cells such as the small intestine of a human or non-human animal as type III.
  • the DNA of the present invention can be obtained by amplifying the DNA using the DNA.
  • the DNA of the present invention can be obtained.
  • the DNA of the present invention is chemically synthesized with a DNA synthesizer such as Perkin'Elma's DNA synthesizer mode 1392 using the phosphoramidite method. You can also get it.
  • the protein is expressed using a transformant obtained by introducing a recombinant vector containing the DNA into a host cell, or the amino acid sequence encoded by the DNA and human IGFBP_1, human The amino acid sequence of IGFBP-2, human IGFBP-3, human IGFBP-4, human IGFBP-5, human IGFBP-6, human IGFBP-7, human IGFBP-8, human IGFBP-9 or human IGFBP-10
  • a transformant obtained by introducing a recombinant vector containing the DNA into a host cell, or the amino acid sequence encoded by the DNA and human IGFBP_1, human The amino acid sequence of IGFBP-2, human IGFBP-3, human IGFBP-4, human IGFBP-5, human IGFBP-6, human IGFBP-7, human IGFBP-8, human IGFBP-9 or human IGFBP-10
  • the DNA is DNA encoding a protein having activity as an IGFBP superfamily.
  • the DNA base sequence of the present invention for example, represented by SEQ ID NO: 3 or 4 by using a conventional method or a DNA synthesizer.
  • Oligonucleotide having a sequence corresponding to 5 to 60 bases, preferably 10 to 40 bases, or an oligonucleotide corresponding to a sequence complementary to the oligonucleotide (hereinafter referred to as “antisense” oligonucleotide). Can be prepared.
  • oligonucleotide of the present invention examples include oligonucleotides such as oligo DNA and oligo RNA, and derivatives of the oligonucleotide (hereinafter, referred to as oligonucleotide derivatives).
  • oligonucleotide or antisense oligonucleotide for example, in a part of the base sequence of the mRNA to be detected, a sense primer corresponding to the base sequence at the 5 'end and an antisense corresponding to the base sequence at the 3' end are used.
  • Sense bra I can give the first class.
  • the base corresponding to peracyl in mRNA is thymidine in the oligonucleotide primer.
  • the sense primer and the antisense primer are oligonucleotides whose melting angles ⁇ temperature (T m) and the number of bases do not extremely change, and have 5 to 60 bases, preferably 10 to 50 bases. Are given.
  • Oligonucleotide derivatives include oligonucleotide derivatives in which the phosphodiester bond in the oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and the phosphodiester bond in the oligonucleotide is N3,1-P5, phosphoamidate.
  • Oligonucleotide derivative converted to bond Oligonucleotide derivative in which ribose and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond, oligo in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C-5 propynyl peracyl Nucleotide derivatives, oligonucleotide derivatives in which peracyl in the oligonucleotide is substituted with C-15 thiazylperacyl, oligonucleotide derivatives in which cytosines in oligonucleotides are substituted with C-5 propynylcytosine, oligonucleotides Oligonucleotide derivatives in which the cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivatives in which the ribose in the oligonucleotide is
  • the protein or polypeptide of the present invention can be prepared by the method described in Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols, In Molecular Biology, or the like. DNA can be expressed in host cells for production.
  • cDNA Based on the full-length cDNA, if necessary, include a portion encoding the protein. Prepare a DNA fragment of appropriate length.
  • the recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length cDNA into the appropriate expression vector downstream of the promoter.
  • a transformant producing the protein of the present invention By introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing the protein of the present invention can be obtained.
  • any cell that can express the target gene such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, can be used.
  • An expression vector which is capable of autonomous replication in the above host cell can be integrated into a chromosome, and contains a promoter at a position where the DNA encoding the protein of the present invention can be transcribed. Is used.
  • the recombinant vector containing the DNA encoding the protein of the present invention is capable of autonomous replication in the prokaryote, and at the same time, promotes ribosome binding. It is preferable that the vector be composed of a sequence, a gene encoding the protein of the present invention, and a transcription termination sequence. It may contain a gene that controls the promoter.
  • Examples of the expression vector include pBTrp2, pBTacK pBTac2 (all sold by Berlingermanheim), PKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE- 8 (QIAGfEN Co., Ltd.), ⁇ (JP-A-58- ⁇ 0600), pKYP200 Agricultural Biological Chemistry 5 4S, 669 (1984) ], pLSAl
  • ICE promoter Isseki one P TRP
  • 1 promoter evening one P L promoter
  • P R promoter one can include one such as T7 promoter evening, Promo one evening one derived from Escherichia coli or phage, or the like.
  • the promoter Isseki one obtained by two series P TRP (P trp x 2) , tac promoter Isseki one, lacT7 promoter Isseki one, the let I promoter Isseki one way artificially designed and modified promoter such as Can also be used.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is the ribosomal binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • the production rate of the target protein can be improved.
  • the transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., for example, Escherichia coli XL1-Blue-Escherichia coli XL2-Blue s Escherichia ool i M1, Escherichia coli MC1000 Escherichia col i KY3276s Escherichia £ oli W1485, Escherichia coli, recitation 9, Escherichia col i HB101, Escheri chia coli No.
  • any method for introducing DNA into the above host cells can be used. For example, a method using calcium ions
  • yeast When yeast is used as a host cell, as an expression vector, for example, YEP13
  • promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PHO5 promoter, PGK Promoter, GAP Promoter, ADH Promoter, gal1 Promoter, gal10 Promoter, Heat Shock Protein Promoter, MF1 Promoter, CUP1 Promoter, etc. be able to.
  • Examples of the host cell include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, the genus Krybetella, the genus Trichosporon, the genus Schneyomyces, for example, Saccharomyces cerevisia ScM zosaccharomyces uombe, KluvveromyceR lactiss Trichosporon nlllllanss Schwanniomyces.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast: for example, an electroporation method [Methods.
  • examples of the expression vector include pcD NAI, pcDM8 (Funakoshi), pAGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 3-22979; Cytotechnology, 2, 133, (1990)] and pAS3-3. (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 2-227075), pCDM8 (Nature, 840, (1987)), pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 CJ.
  • any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • the promoter of the IE (immediate early) gene of cytomegalovirus (CMV) can be used.
  • CMV cytomegalovirus
  • Examples include the early promoter of SV40, the promoter of retrovirus, the promoter of the meta mouth, the heat shock promoter, the promoter of SR, and the like. Hanser with promoter It may be used.
  • Examples of the host cells include Namalwa cells, which are human cells, COS cells, which are monkey cells, CH0 cells, which are Chinese 'hams cells, and HBT5637 (Japanese Patent Publication No. 63-299). it can.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • Examples of such methods include the electrophoresis method (Cytotechnology,, 133 (1990)) and the calcium phosphate method (special method). Kaihei 2-227075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ⁇ III, 7413 (1987)], and the like.
  • Proteins can be expressed by the method described in £, 47 (1988) and the like. That is, the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is infected into insect cells to express the protein. Can be done.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, PVL1393, pBlueBacII (all manufactured by Invitorogen) and the like.
  • the baculovirus for example, autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects insects of the night moth family, such as Atographa, Ariformi, Nuclea, and Polyhedrosis virus can be used.
  • Methods for co-transferring the above-described recombinant gene into insect cells and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), and Lipofexion method. Natl. Acad. Sci. USA, 7413 (1987)].
  • examples of the expression vector include Ti plasmid and a tobacco mosaic virus vector.
  • Any promoter can be used as long as it functions in a plant cell, and examples thereof include 35S promoter of Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) and Inactin 1 Promoter.
  • Examples of the host cell include plant cells of tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, abrana, alfa alfa, rice, wheat, wheat, and the like.
  • the method of introducing the recombinant vector is a method of introducing DNA into plant cells. Any of these can be used, for example, Agrobacterium (Agrobacterium) (JP-A-59-140885, JP-A-60-70080, W094 / 00977), an electroporation method (Japanese Patent -251887), a method using a particle gun (gene gun) (Patent No. 2606856, Patent No. 2517813), and the like.
  • proteins or polypeptides to which sugars or sugar chains are added can be obtained.
  • the transformant obtained as described above is cultured in a medium, the protein or polypeptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and collected from the culture to obtain the protein or polypeptide of the present invention.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism. Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture C.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by the organism; glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or hydrolyzed starch, organic acids such as acetic acid, propionic acid, and the like. Alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other inorganic or organic acid ammonium salts, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, colony. Plyka, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • Inorganic salts include potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate magnesium, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, mangan sulfate, sulfuric acid Copper, calcium carbonate, or the like can be used.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • isopropyl 1 /?-D-thiogalactovyranoside and the like are transformed with the recombinant vector using the ire promoter.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • RPMI1640 medium As a medium for culturing the transformant obtained using animal cells as a host, commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, ⁇ , 519 (1967)], Eagle's MEM medium (Science, 501) (1952)), Dulbecco's modified MEM medium !: Virology, S, 396 (1959)), 199 medium !: Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 11, 1 (1950)) or fetal bovine serum And the like can be used.
  • Culture is usually performed at pH 6-8, 30-40. Performing 5% C0 2 under the conditions such as the presence 1-7 days.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • TM-FH media As culture media for transformants obtained using insect cells as a host, commonly used TM-FH media (Pharmingen), Sf-900 II SFM media (Life
  • ExCell400 ExCell405 (all manufactured by JRH Biosciences)
  • Grace's Insect Medium Grace, TCC, Nature, IBS, 788 (1962)] and the like can be used.
  • the cultivation is usually carried out for 1 to 5 days under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C and the like. If necessary, an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culturing.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a cell organ of a plant.
  • a medium for culturing the transformant commonly used Murashige's and Squirg (MS) medium, white (White) medium or plant medium such as auxin, cytokinin, etc. may be added. And the like can be used.
  • the cultivation is usually performed at pH 5 to 9, 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • an antibiotic such as kanamycin or hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector into which DNA encoding the protein or polypeptide of the present invention has been incorporated is cultured according to a conventional culture method.
  • the protein or polypeptide By producing and accumulating the protein or polypeptide, and collecting the protein or polypeptide from the culture, the protein or polypeptide can be produced.
  • the method of producing the protein or polypeptide of the present invention includes a method of producing it in a host cell, a method of secreting it out of the host cell, a method of producing it as a fusion protein, and a method of producing it on the host cell outer membrane.
  • the method can be selected by changing the host cell to be transformed or the structure of the protein to be produced.
  • the protein can be actively secreted out of the host cell.
  • the protein of the present invention is expressed outside the host cell by adding a signal peptide in front of the protein containing the active site of the protein of the present invention using a gene recombination technique. It can be secreted.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the protein is produced by breeding or cultivating according to a usual method to produce and accumulate the protein, and collecting the protein from the animal or plant individual. can do.
  • Methods for producing the protein of the present invention using animal individuals include, for example, known methods (American Journal of Clinical Nutrition, fiS, 639S (1996) ⁇ American Journal of Clinical Nutrition, ⁇ , 627S (1996), Bio / Technology, S, 830 (1991)] and a method for producing the protein of the present invention in an animal constructed by introducing a gene.
  • the protein is produced in the animal, and the protein is allowed to accumulate. By collecting, the protein can be produced.
  • the place of production and accumulation in the animal include milk of the animal (JP-A-63-309192), eggs, and the like.
  • the promoter used at this time any promoter that can be expressed in animals can be used.
  • casein promoter which is a breast cell-specific promoter
  • casein promoter Promoter lactoglobulin promoter
  • Examples of the method for producing the protein of the present invention using plant individuals include, for example, transgenic plants into which DNA encoding the protein of the present invention has been introduced [Tissue culture, 2Q (1994), Tissue culture, 21. (1995), Trends in Biotechnology, 1 ⁇ , 45 (1997)], producing and accumulating the protein in the plant, and collecting the protein from the plant to obtain the protein.
  • a production method For example, when the protein of the present invention is expressed in a dissolved state in cells, the cells produced by the transformant of the present invention are collected by centrifugation after completion of the cultivation, and collected in an aqueous buffer.
  • the cells are disrupted using an ultrasonic disrupter, French press, Manton-Gaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Tylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), anion exchange chromatography using resin, cation using S-Sepharose ⁇ (Pharmacia), etc.
  • the cells When the protein is expressed in the form of an insoluble form in the cells, the cells are similarly recovered, crushed, and centrifuged to collect the insoluble form of the protein as a precipitate fraction.
  • the insoluble form of the recovered protein is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the solubilized solution to return the protein to a normal three-dimensional structure, a purified sample of the protein can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein of the present invention or its derivative such as a modified sugar is secreted extracellularly
  • the protein or its derivative such as a sugar chain adduct is recovered in the culture supernatant.
  • a soluble fraction is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Obtainable.
  • Examples of the protein thus obtained include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the protein of the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). be able to. Chemical synthesis can also be carried out using a peptide synthesizer such as Advanced ChemTech, Parkin 'Elma, Pharmacia, Protein Technology Instrument ⁇ Synthecel Vega, PerSeptive, Shimadzu.
  • a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). be able to.
  • Chemical synthesis can also be carried out using a peptide synthesizer such as Advanced ChemTech, Parkin 'Elma, Pharmacia, Protein Technology Instrument ⁇ Synthecel Vega, PerSeptive, Shimadzu.
  • An antibody that recognizes the protein of the present invention can be prepared.
  • a polyclonal antibody is obtained by administering the protein of the present invention or a purified preparation of a partial fragment polypeptide of the protein, or a peptide having a partial amino acid sequence of the protein of the present invention as an antigen to an animal.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to 100 g per animal.
  • a peptide When a peptide is used, it is desirable to use, as the antigen, a peptide covalently bonded to a carrier protein such as keyhole limpet haemocyanin or bovine ostium globulin.
  • a carrier protein such as keyhole limpet haemocyanin or bovine ostium globulin.
  • the peptide used as the antigen is Can be synthesized.
  • the administration of the antigen is performed 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration.
  • Blood is collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and the reaction of the serum with the antigen used for immunization is determined by an enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical Shoin (1976). ) Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)
  • a polyclonal antibody can be obtained by obtaining serum from a non-human mammal whose serum has a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum.
  • Separation and purification methods include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, and prillic acid precipitation.
  • Rats whose serum shows a sufficient antibody titer against the partial fragment polypeptide of the protein of the present invention used for immunization are used as a source of antibody-producing cells.
  • the spleen is removed.
  • the spleen is shredded in MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded.
  • MEM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the spleen cells of the obtained sediment fraction were washed with Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.6).
  • myeloma cells cell lines obtained from mice or rats are used.
  • an 8-azaguanine-resistant mouse derived from BALB / c
  • myeloma cell line P3-X63Ag8-Ul (hereinafter abbreviated as P3-U1) CCurr. Topics. Microbiol. Immunol.,, 1 (1978), Europ. J. Immunol., Fi, 511 (1976)), SP2 / 0-Agl4 (SP-2) (Nature, m, 269 (1978) P3-X63-Ag8653 (653) CJ.
  • the cells of the resulting precipitate fraction were loosened well, and the cells were added to the cells with stirring.
  • a partial fragment polypeptide of the protein of the present invention used as the antigen was coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or the purified antibody obtained in (d) described below was reacted as the first antibody.
  • an enzyme, a chemiluminescent substance or a radioactive compound as a second antibody, a reaction corresponding to the labeling substance is carried out to specifically react with the protein of the present invention. Is selected as a hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention.
  • Cloning is repeated twice by the limiting dilution method using the hybridoma (the first time uses HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), and the second time uses normal medium), stable
  • the antibody with a strong antibody titer is selected as a hybridoma strain producing the monoclonal antibody of the present invention.
  • Pristane-treated [2,6,10, .14-tetramethyl pentane (0.5 ml) is intraperitoneally administered and bred for 2 weeks] to 8-10 week old mice or nude mice.
  • the protein monoclonal antibody-producing hybridoma cells of the present invention obtained in (c) of 5 to 20 ⁇ 10 6 cells / animal are injected intraperitoneally. In 10 to 21 days, the hybridoma becomes ascites cancer.
  • Ascites is collected from the mouse with ascites tumor and centrifuged at 300 rpm for 5 minutes to remove solids.
  • a monoclonal antibody can be purified and obtained in the same manner as in the polyclonal method.
  • the antibody subclass is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the amount of protein is calculated by the Lowry method or the absorbance at 28 O nm.
  • RT-PCR method Since the RT-PCR method is a simple method, it is particularly useful as a method for detecting the expression of DNA.
  • DNA having the same sequence as the continuous 100 to 1772 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 DNA having a sequence complementary to the DNA, or DNA having the sequence complementary to the DNA, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • a DNA having the same sequence as continuous 100 to 2698 bases or a DNA having a sequence complementary to the DNA is used as a probe for Northern hybridization, and the DNA described in SEQ ID NO: 3 or 4 is used.
  • the above-mentioned disease can be determined by quantifying the expression level of DNA and comparing it with a healthy person.
  • RNA derived from leukocyte cells or tissues from subjects and healthy subjects (10 to 2
  • RNA in the gel is plotted on a nitrocellulose filler (Optimal BA-S85; manufactured by Schleicher & Schuell), heated at 80 ° C under reduced pressure for 1 hour, and fixed.
  • a nitrocellulose filler Optimal BA-S85; manufactured by Schleicher & Schuell
  • a probe is added to the solution, and hybridization is performed at 65 ° C.
  • probe for example, those obtained by labeling the DNA fragment of SEQ ID NO: 3 or the DNA fragment of SEQ ID NO: 4 with 32 P using a multiprime DNA labeling system (Amersham) can be used.
  • a set of oligonucleotides specific to the DNA encoding the protein of the present invention is used as a primer, and total RNA derived from leukocyte cells or tissues of a subject and a healthy subject, their mRNA, or the Prepared cD
  • the above-mentioned disease can be determined by performing PCR with NA as type III, detecting and quantifying the amplified fragment, and comparing the expression levels of the DNA between the test subject and the healthy subject.
  • the oligonucleotide the oligonucleotide of the present invention can be used as the oligonucleotide.
  • MRNA or total RNA which is a type II of PCR, can be extracted from various types of white blood cells isolated or obtained from blood or from tissues suspected of having a disease, etc. ⁇
  • each leukocyte cell examples include polymorphonuclear leukocytes, monocytes, lymphocytes, T cells, B cells and the like.
  • Polymorphonuclear leukocytes and mononuclear cells can be separated and obtained from peripheral blood of a subject by using Polymorphprep TM, a kit manufactured by Nycomed Pharma.
  • Monocytes and lymphocytes were obtained from the obtained mononuclear cells by the method described in J. Immunol., 1, 706 (1983), etc., using Tissue Antigen, S, 153 (1977), J. Immunol., 11, 273. (1976), T cells and B cells can be separated and obtained by methods described in Nycomed's manual for blood cell isolation.
  • T cells can also be obtained using the nylon wool method [Eur. J. Immunol., 645 (1973)].
  • each cell can be separated and obtained using magnetic beads (for example, Dynabeads manufactured by Dynal) in which specific antibodies are bound to T cells, B cells, and monocytes / macrophages.
  • guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method As a method for preparing total RNA from leukocyte cells or tissues, the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., I ⁇ , 3 (1987)] and the like can be mentioned.
  • Examples of a method for preparing poly (A) + RNA from total RNA include an oligo (dT) -immobilized cellulose column method (Molecular 'Cloning 2nd Edition) and the like.
  • kits such as the Fast 'Track' mRNA 'Isolation Kit; ASTTrack mRNA Isolation Kit; manufactured by Invitrogen) and the Quick' Prep 'mRNA Purification Kit' (Quick Prep mRNA Purification Kit; manufactured by Pharmacia) Can also be used to prepare mRNA.
  • Single-stranded cDNA can be synthesized from total RNA or mRNA using a single-stranded cDNA synthesis kit Superscript preamplification system (BRL). The synthesis can be performed according to the manual attached to the kit. RT using total RNA, mRNA or cDNA that can be prepared as described above
  • the expression level of the gene encoding the protein of the present invention can be determined by the PCR method CPCR Protocolss Academic Press (1990)].
  • the genomic DNA is subjected to the Southern Hive'reduction method (Molecular 'Cloning Second Edition), the PCR method, and the like to obtain the gene encoding the protein of the present invention. Mutations can be detected.
  • the detection method is reported to be related to acute myeloid leukemia, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, liver cancer, myeloma, uterine leiomyoma, malignant tumor, solid tumor Diseases associated with abnormal cell proliferation, such as myocardial infarction, cerebral infarction, peripheral vascular obstruction, angina pectoris, hypertension, hyperlipidemia, diabetes mellitus, glycemic retinopathy, glomerulonephritis, arteriosclerosis, thrombosis, Hemolytic uremic syndrome, thrombotic thrombocytopenic purpura, ischemic heart disease, ischemic brain disease, diseases associated with vascular disorders such as heart failure, depressed blood, choroidal circulatory disorder, and abnormal bone metabolism such as osteoporosis Diseases associated with insulin-like growth factors and growth hormone action disorders such as dwarfism, acromegaly, pediatric chronic renal failure, abnormal smooth muscle cell differentiation such as arteriosclerosis, bronchial disease, and restenosis Prolifer
  • the translation region of the DNA encoding the protein of the present invention possessed by the patient after PCI by amplifying the translation region of the DNA encoding the protein of the present invention possessed by the patient after PCI, determining the nucleotide sequence, and comparing the nucleotide sequence with the nucleotide sequence of the DNA possessed by a healthy subject. The presence or absence of a mutation in the translation region can be examined.
  • the cDNA of type II to be subjected to the PCR method can be obtained by the method described in (1).
  • the nucleotide sequence of the obtained cDNA can be determined using a DNA sequencer 377 of PerkinElmer and a reaction kit (ABI Prism TM BigDye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit: manufactured by Applied Biosystems).
  • the following diseases can be determined by immunologically detecting or quantifying the expression of the protein of the present invention in blood or tissues of a subject and a healthy subject using the antibody of the present invention, and comparing the expression with that of a healthy subject.
  • Examples of the immunological detection method include the ELISA method using a microtiter plate, a fluorescent antibody method, a Western blot method, and an immunohistological staining method.
  • the immunological method includes the use of acute myeloid leukemia, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, liver cancer, myeloma, uterine leiomyoma, malignant tumor, solid tumor, etc., for which the involvement of proteins belonging to IGFBP family has been reported.
  • ischemic Insulin such as heart disease, ischemic brain disease, heart failure, depressed blood, diseases involving vascular disorders such as choroidal circulatory disorders, diseases involving abnormal bone metabolism such as osteoporosis, dwarfism, acromegaly, and pediatric chronic renal failure Diseases with impaired growth factor or growth hormone action, diseases with abnormal smooth muscle cell proliferation such as arteriosclerosis, bronchial disease, restenosis, abnormal skeletal muscle cell differentiation such as myasthenia gravis Proliferative diseases, diseases with abnormal gastric acid secretion such as gastric ulcer, microbial infection, chronic hepatitis B, rheumatoid arthritis, sepsis,
  • SEQ ID NO: 1 in the blood or tissue of a subject and a healthy subject
  • the expression level of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was compared with the expression level of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Diseases characterized by being different from healthy subjects can be determined.
  • the above determination method is based on the report that the involvement of proteins belonging to the IGFBP family is reported for acute myeloid leukemia, breast cancer, prostate cancer, colon cancer, liver cancer, myeloma, uterine smoothness Diseases involving abnormal cell proliferation such as fibroids, malignant tumors, and solid tumors, myocardial infarction, cerebral infarction, peripheral vascular obstruction, angina, hypertension, hyperlipidemia, diabetes, diabetic retinopathy, glomerulonephritis , Arteriosclerosis, thrombosis, hemolytic uremic syndrome, thrombotic thrombocytopenic purpura, ischemic heart disease, ischemic brain disease, heart failure, depressed blood, diseases involving vascular disorders such as choroidal circulation disorders, bones such as osteoporosis Diseases associated with metabolic disorders, dwarfism, acromegaly, infantile chronic renal failure, etc., disorders involving insulin-like growth factors or growth hormone action, arteriosclerosis, bronchial disease, abnormal smooth muscles,
  • IGFBP-2 or 3 [Electroiyte Mrtab., IS, 320 (1992)], elevated parathyroid hormone Increased expression of IGFBP-4 in elderly women with fractures and increased levels of IGFBP_7 and IGFBP-3 in cerebrospinal fluid in patients with leukemia (J. Clin. Endocrinol. Metab. , 84, 1361 (1996)], and in colorectal cancer, it has been reported that the expression of IGFBP-7 is increased in colorectal cancer tissues and colorectal cancer cell lines [J. Gastroenterology, 213 (1998)]. .
  • TGF- /? And PTHPGE2 increase the expression of IGFBP-7 [Endocrinology,, 1998 (1999)].
  • Treating osteoblasts with glucocorticoid suppresses IGF-I expression.
  • Increases expression of IGFBP-7 (Endocrinology, 228 (1999)), and that IGF BP-7 also affects differentiation into skeletal muscle by suppressing the differentiation promoting effect of IGF [Exp. Cell Res.,, 192 (1997) ), Endocrinology,, 100 (2000)], IG FBP-7 is considered to be involved in diseases related to bone metabolism and skeletal muscle differentiation.
  • the above-mentioned disease can be symptomatically treated by reducing the transcription amount or translation amount of the gene encoding the protein of the present invention or suppressing the function of the protein of the present invention. Can be prevented or treated.
  • the DNA, oligonucleotide or derivative thereof of the present invention when there is a patient whose receptor-mediated physiological action is enhanced due to an increase in the expression of IGFBP, administration of the DNA, oligonucleotide or derivative thereof of the present invention to the patient can enhance the physiological action.
  • the present invention relates to a disease in which symptomatic treatment can be performed by administering the DNA, oligonucleotide or derivative thereof of the present invention, even if the increase in IGFBP expression is not a direct cause of the disease.
  • DNA, oligonucleotides or derivatives thereof can be effective prophylactic and therapeutic agents.
  • Methods for using the prophylactic or therapeutic agents include, for example, antisense RNA
  • the DNA, oligonucleotide or derivative thereof of the present invention may be used alone or in a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus vector. After insertion into an appropriate vector such as a sheathed virus vector, it can be formulated, formulated and administered according to the usual methods described below.
  • a gene vector for gene therapy incorporated into a viral vector such as a retrovirus or an adenovirus or another vector for gene therapy as a gene therapy drug or a prophylactic drug
  • a gene therapy vector and gene therapy drug can be produced by preparing a base [Nature Genet., S, 42 (1994)].
  • any base may be used as long as it is a base usually used for an injection, and a salt solution such as distilled water, sodium chloride and a mixture of sodium chloride and an inorganic salt, Examples thereof include saccharide solutions such as mannitol, lactose, dextran and glucose, amino acid solutions such as glycine and arginine, and organic acid solutions or mixed solutions of salt solutions and glucose solutions.
  • a salt solution such as distilled water, sodium chloride and a mixture of sodium chloride and an inorganic salt
  • saccharide solutions such as mannitol, lactose, dextran and glucose
  • amino acid solutions such as glycine and arginine
  • organic acid solutions or mixed solutions of salt solutions and glucose solutions such as glycine and arginine
  • Injectables may be prepared as solutions, suspensions, or dispersions. These injections can also be prepared as preparations for dissolution at the time of use by operations such as powdering and freeze-drying.
  • the gene of the present invention The therapeutic agent can be used for the treatment as it is in the case of a liquid, or dissolved in the above-mentioned base which has been sterilized if necessary in the case of an individual, immediately before gene therapy. Examples of the method of administering the gene therapy agent of the present invention include a method of local administration so that it is absorbed at the treatment site of the patient.
  • DNA can be transported to a target treatment site by a non-viral gene transfer method.
  • Non-viral gene transfer methods known in the art include the calcium phosphate coprecipitation method [Virology, ⁇ , 456-467 (1973); Science, Huang 1414-1422 (1980)], and the microphone mouth injection method CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 11, 5399-5403 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11, 7380-7384 (1980); Cell, 27, 223-231 (1981); Nature, 2, 92-94. (1981)), liposome-mediated membrane fusion-mediated transfer method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, M, 7413-7417 (1987); Biochemistry, 2S, 9508-9514.
  • IGF BP-7 expression is reduced [; Growth Regul., 3, 74 (1993)], and in breast cancer tissues, the IGF BP-7 locus on human chromosomes is more than 50% frequent.
  • IGFBP-7 stimulates PGI 2 production in the vessel wall [Nature, 231,
  • TGF- ⁇ and PTHPGE2 increase the expression of IGFBP-7 [Endocrinology, M, 1998 (1999)]. Treating osteoblasts with glucocorticoid suppresses IGF-I expression. Increase the expression of IGFBP-7 (Endocrinology, 140, 228 (1999)), and that IGFBP-7 also affects differentiation into skeletal muscle by suppressing the differentiation promoting effect of IGF [Exp Cell Res., Z21, 192 (1997), Endocrinology, 1 ⁇ , 100 (2000)] suggest that IG FBP-7 is also involved in diseases related to bone metabolism and skeletal muscle differentiation.
  • IGFBP-7 Forced expression of IGFBP-7 in prostate cancer cell lines with reduced expression of IGFBP-7 prolongs cell division time, reduces colony-forming ability in soft agar medium, and forms tumors when transplanted into nude mice CCancer Res., 5S, 2370 (1999)], and the forced expression of IGFBP-7 in the osteosarcoma cell line, in which p53 function is lost, Because the growth of cell lines can be suppressed in the same way as when the p53 gene is introduced.
  • the DNA, the oligonucleotide or the oligonucleotide of the present invention may be used.
  • the physiological action can be promoted, and symptomatic treatment can be performed even if the decrease in IGFBP expression or function is not the direct cause of the disease
  • the DNA, oligonucleotide or derivative thereof of the present invention, or the protein of the present invention are useful as preventive and therapeutic agents for the above-mentioned diseases.
  • the method for administering the prophylactic and therapeutic agents includes, for example, the following: (i) D encoding the protein of the present invention when there is a patient who cannot expect a normal physiological action due to decreased expression or mutation of the protein of the present invention. Administering and expressing NA to the patient; (ii) inserting the DNA encoding the protein of the present invention into a target cell and expressing it, and then transplanting the cell into the patient; or (Hi) the present invention.
  • the amount of the protein of the present invention in the body of the patient can be increased, and the physiological action of the protein can be sufficiently exerted.
  • the DNA encoding the protein of the present invention or the protein of the present invention may be used as a disease in which the expression level or function of the protein of the present invention is reduced, or a disease caused by abnormal function due to mutation of the protein, or the protein of the present invention. It is useful as a safe and low-toxic prophylactic or therapeutic agent for diseases that can be treated symptomatically by administration of the protein of the present invention or the present invention, even if not directly related. It is.
  • the DNA of the present invention may be used alone or as a retrovirus vector, adenovirus vector, or adenovirus vaccine. After insertion into an appropriate vector, such as a viral vector, it can be formulated, formulated and administered according to the usual methods described in (5) above.
  • a medicament containing the protein of the present invention as an active ingredient can be administered alone, but usually, the active ingredient is one or more pharmacologically acceptable carriers.
  • the active ingredient is one or more pharmacologically acceptable carriers.
  • pharmacologically acceptable additives such as buffering agents and tonicity agents to bring the formulation solution closer to physiological conditions, for example, sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate, potassium chloride, quencher Sodium acid or the like can also be added. It can also be stored after lyophilization and dissolved in an appropriate solvent before use.
  • the administration route is preferably the one that is most effective in the treatment, and may be oral administration or parenteral administration such as oral, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules.
  • liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, It can be produced using preservatives such as P-hydroxybenzoic acid esters and flavors such as peridotized flavor and peppermint as additives.
  • sugars such as sucrose, sorbitol, fructose
  • glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol
  • oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil
  • preservatives such as P-hydroxybenzoic acid esters and flavors such as peridotized flavor and peppermint as additives.
  • excipients such as lactose, pudose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol It can be produced using a binder such as hydroxypropyl cell mouth, gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • the propellant does not irritate the protein itself or the oral and respiratory tract mucosa of the recipient, and disperses the protein as fine particles and absorbs it. It is prepared using a carrier or the like that facilitates the collection.
  • Specific examples of the carrier include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the protein and the carrier used.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, duration of treatment, age, body weight, etc., but is usually 10 mg / kg to 8 mg / kg per adult per day.
  • the promoter region examples include all promoter regions involved in transcription of a gene encoding the protein of the present invention in mammalian cells. For example, in human small intestine, a promoter region involved in transcription of a gene encoding the protein of the present invention can be mentioned.
  • the promoter can be used in a screening method for a substance that controls the transcription or translation of DNA encoding the protein of the present invention described in (8) below.
  • a possible cause of the above-mentioned diseases is a change in the transcription amount of DNA encoding IGFBP or a change in the function of the protein of the present invention.
  • the transcription amount or translation of DNA encoding the protein of the present invention is considered. Controlling the amount is effective in preventing and treating the disease. Even for diseases not directly caused by IGFBP, it is possible to prevent or treat the above diseases symptomatically by controlling the amount of transcription or translation of the gene encoding the protein of the present invention. .
  • a compound that promotes or suppresses the transcription process of a gene encoding the protein of the present invention or the translation process from a transcript to a protein is exerted through the protein by controlling the expression of the protein. It can control cell functions and is useful as a safe and low toxic pharmaceutical composition.
  • the compound can be obtained by the following methods (a) to (c).
  • a detection method using an ELISA method using a micro tie plate for example, there can be mentioned a detection method using an ELISA method using a micro tie plate, a fluorescent antibody method, a Western plot method, an immunohistological staining and the like.
  • a cell expressing the protein of the present invention and [ii] a cell expressing the protein of the present invention in the presence of the test substance are cultured for 2 hours to 1 hour by the culture method described in 2 above. After culturing for a week, the amount of the transcript of the DNA encoding the protein in the cells is measured and compared using a method such as the Northern hybridization method or the PCR method described in (1) above, and the transcript is determined.
  • a method for selecting and obtaining a compound having an activity of increasing or decreasing the amount for example, there can be mentioned a detection method using an ELISA method using a micro tie plate, a fluorescent antibody method, a Western plot method, an immunohistological staining and the like.
  • a plasmid in which a DNA obtained by linking a repo overnight gene to the downstream of the promoter obtained in (7) above is prepared by a known method, and introduced into animal cells according to the method described in 2 above.
  • [i] the transformant and [ii] the transformant in the presence of a test substance by culturing for 2 hours to 1 week by the culture method described in 2 above, and expressing the repo overnight gene in the cells.
  • a method for determining the amount [Kansei Research Laboratory, Institute of Medical Science, Tokyo University, New Cell Engineering Protocol, Shujunsha (1993), Biotechniques, 20, 914 (1996), J. Antibiotics, 453 (1996), 448 (1995), Cell Engineering, Ifi, 581 (1997)] and select compounds having an activity to increase or decrease the expression level.
  • Reporter genes include, for example, chloramphenicol acetyltransferase gene,? -Galactosidase gene, 5-lactamase gene, luciferase gene, green 'fluorescent' protein (GFP) gene and the like. Can be.
  • One of the causes of the above-mentioned disease may be a change in the function of IGFBP.
  • inhibiting or enhancing the function of the protein of the present invention is effective for the prevention and treatment of the disease.
  • the above-mentioned diseases can be prevented or treated symptomatically by inhibiting or enhancing the function of the protein of the present invention.
  • the physiological function can be controlled by administering a compound that controls the function of the present invention.
  • diseases in which symptomatic treatment can be achieved by controlling the function of the protein of the present invention, even if the function of the protein of the present invention is not a direct cause of the disease, can also be prevented and treated by administering the compound. .
  • the compound can be obtained, for example, by the following method.
  • [i] Cells expressing the protein of the present invention, and [ii] Cells expressing the protein of the present invention in the presence of the test substance are cultured for 2 hours to 1 week by the culture method described in 2 above.
  • a method for detecting and comparing the cellular response caused by the functioning of, and selecting and obtaining a compound having an activity of inhibiting or enhancing the function of the protein are cultured for 2 hours to 1 week by the culture method described in 2 above.
  • Examples of a method for detecting a cellular response caused by the function of the protein of the present invention include, for example, a method that depends on insulin or insulin-like growth factor contained in a medium.
  • Known methods for detecting changes in the underlying intracellular signal transduction, gene transcription, sugar uptake, proliferation and the like can be mentioned.
  • There are also known methods for measuring changes in prostaglandin production (Nature,, 663, 1976; Clinical Science, 11, 958, 1981).
  • a method for screening a substance that specifically binds to the protein of the present invention is used for the development of a preventive or therapeutic drug for a disease caused by the protein of the present invention. can do.
  • the receptor of the protein of the present invention has a function of binding to the protein of the present invention, transmitting information into cells and expressing a physiological action, the activity of the receptor, or
  • the substance that regulates the transcription or translation of the gene encoding the receptor is caused by the dysfunction of the protein of the present invention, like the protein of the present invention or the substance that regulates the transcription or translation of the gene encoding the protein of the present invention. It is useful as a prophylactic and therapeutic agent for diseases that occur.
  • Examples of the substance include a low molecular weight compound and a protein.
  • methods for screening for a protein that specifically binds to the protein of the present invention include Molecular 'Cloning Second Edition, Current' Protocols' in 'Molecular' Biology, Science, 255, 989 (1992). ) Etc. can be used.
  • a protein that specifically binds to the protein of the present invention is selected from the test sample. Can be obtained.
  • a recombinant vector is prepared by introducing the cDNA downstream of a promoter in an appropriate expression vector to prepare a cDNA library.
  • a transformant expressing a gene expressed in a tissue is obtained.
  • a transformant that produces a protein to which the labeled protein of the present invention specifically binds is selected.
  • a protein that specifically binds to the protein of the present invention can be obtained.
  • Methods for introducing a recombinant vector, methods for obtaining a transformant, and methods for culturing the obtained transformant in a medium include the methods described in 2 above.
  • a gene product that specifically binds to the labeled protein of the present invention can be obtained.
  • a transformant to be produced can be selected.
  • Methods for isolating cDNA introduced into selected transformants include Molecular Cloning, 2nd Edition, Current 'Protocols' in Molecular.
  • the antibodies of the present invention are useful as preventive and therapeutic agents for diseases related to the protein of the present invention.
  • IGFBP-4 Increased expression of IGFBP-4 in elderly female fracture patients with elevated parathyroid hormone, IGFBP-7 and IG in cerebrospinal fluid in leukemia patients
  • TGF-5, PTH and PGE2 increase the expression of IGFBP-7.
  • CEndocrinology, Cliff, 1998 (1999)] while treatment of osteoblasts with Darcocorticoid suppresses IGF-I expression.
  • Increase the expression of IGFBP-7 [Endocrinology, 228 (1999)] and that IGFBP-7 also influences differentiation into skeletal muscle by suppressing the IGF differentiation promoting effect [Exp. Cell Res.,, 192 (1997), Endocrinology, 1, 100 (2000)] suggests that IGFBP-7 is also involved in diseases related to bone metabolism and skeletal muscle differentiation.
  • suppressing the expression level or inhibiting the function of the protein of the present invention is useful for the prevention and treatment of the disease. It is valid.
  • the above-mentioned diseases for which symptomatic treatment can be performed by suppressing the expression level of the protein of the present invention or inhibiting the function thereof can be performed.
  • the physiological activity is suppressed by administering an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • Diseases in which symptomatic treatment is possible by suppressing the function of the protein of the present invention even if the protein of the present invention is not a direct cause of the disease can also be prevented and administered by administering the antibody of the present invention. Can be treated.
  • compositions containing the antibody as an active ingredient can be prepared by any method well-known in the technical field of pharmaceutics according to the preparation of the pharmaceutical preparations containing the protein of the present invention described in (6) above. Can be provided as
  • a compound that promotes or suppresses the transcription process of the gene encoding the protein of the present invention or the translation process from a transcript to protein is a safe and low-toxic pharmaceutical composition. Useful as a thing.
  • the compound obtained in (8) is provided as a pharmaceutical preparation produced by any method well-known in the technical field of pharmaceutics according to the method for producing a pharmaceutical containing the protein of the present invention described in (6). be able to.
  • a non-human animal of interest for example, embryonic stem cells (e.g., porcine, ovine, goat, bush, porcine, mouse, chicken, etc.)
  • embryonic stem cells e.g., porcine, ovine, goat, bush, porcine, mouse, chicken, etc.
  • a gene encoding the protein of the present invention on the chromosome can be obtained by a known homologous recombination method [for example, Nature, 22S., 6110, 295 (1987), Cell, 51, 3, 503 ( 1987)) to produce a mutant clone inactivated or substituted with an arbitrary sequence [for example, Nature,, 6315, 243 (1991)].
  • chimeric individuals consisting of embryonic stem cells and normal cells can be injected into the blastcyst (blastcyst) of an animal fertilized egg by a chimera method or a chimera method. Can be prepared.
  • blastcyst blastcyst
  • a chimera method a chimera method
  • an individual having an arbitrary mutation in the gene encoding the protein of the present invention on the chromosome of the whole cell can be obtained.
  • a knockout non-human animal can be obtained as an individual in which the expression of the gene encoding the protein of the present invention is partially or completely suppressed from homozygous individuals having mutations in both chromosomes.
  • a knockout non-human animal by introducing a mutation into any position of the gene encoding the protein of the present invention on the chromosome, a knockout non-human animal can be produced.
  • the activity of the product can be modified by introducing a mutation by replacing, deleting, or inserting a base into the translation region of the gene encoding the protein of the present invention on the chromosome.
  • the degree, timing, tissue specificity and the like of the expression can be altered.
  • the expression timing, expression site, and expression It is also possible to control the amount and the like.
  • Examples of such cases include the use of promoters expressed in a specific region of the brain and deletion of the target gene only in that region [Cell, 81, 7, 1317 (1996)] and Cre.
  • An example in which an organ-specific gene of interest is deleted at an intended time using an adenovirus that expresses [Science, m, 5335, (1997)] is known.
  • the expression of the gene encoding the protein of the present invention on the chromosome can be controlled at any time or at such a tissue, or the gene has any insertion, deletion, or substitution in its translation region or expression control region. Knockout non-human animals can be produced.
  • the knockout non-human animal can induce the symptoms of various diseases caused by the protein of the present invention at any time, at any degree, or at any site.
  • the knockout non-human animal of the present invention becomes an extremely useful animal model in the treatment and prevention of various diseases caused by the protein of the present invention.
  • it is very useful as a model for evaluating therapeutic and prophylactic agents, functional foods, and health foods.
  • FIG. 1 is a diagram showing a comparison of the amino acid sequences of C-hsil3412 and C-kaia397 with the IGFBP family factor.
  • FIG. 2 is a view showing a hydrophobic plot of a protein encoded by C-hsil3412.
  • FIG. 3 is a view showing a hydrophobicity plot of a protein encoded by C-kaia397.
  • FIG. 4 is a view showing a comparison between C-hsil3412 and C-kaia397 and a human genome sequence.
  • FIG. 5 is a diagram showing expression of C-hsil3412 and C-kaia397 by RT-PCR.
  • A shows the results of analysis of the expression in each tissue
  • B shows the results of analysis of the expression in each cell line.
  • FIG. 6 shows the expression of C-hsil3412 and C-kaia397 by RT-PCR.
  • FIG. 7 is a view showing expression of proteins encoded by C-hsil3412 and C-kaia397 using COS-1 cells as a host. mock represents the target.
  • FIG. 8 is a view showing expression and sugar chain modification of a protein encoded by C-hsil3412 and C-kaia397 using CH0 cells as a host.
  • V is the CHO / mock strain
  • C-kaia397 is the CH0 / C-kaia397 strain
  • C-kaia397h is the CH0 / C-kaia397h strain
  • C-hsil3412 is the CH0 / C-hsil3412 strain
  • C-hsil3412h Indicates the CH0 / C-hsil3412h strain.
  • + indicates the case where a sugar chain-cleaving enzyme was added
  • 1 indicates the case where a 100 ⁇ l Ol-Tris-HCl buffer (pH 7.5) was added instead of the sugar chain-cleaving enzyme
  • n indicates that no enzyme reaction was performed. It shows the case where
  • FIG. 9 is a view showing expression of proteins encoded by C-hsil3412 and C-kaia397 using insect cells as a host. mock represents the target.
  • FIG. 10 is a diagram showing an analysis by Western blotting of a polyclonal antibody recognizing a protein encoded by C-hsil3412 or C-kaia397.
  • the plot on the right shows the results obtained using the antibody obtained using Compound 2 as the immunizing antigen
  • the plot on the left shows the results obtained using the antibody obtained using Compound 3 as the immunizing antigen.
  • FIG. 5 shows detection of a protein encoded by C-hsil3412 or C-kaia397 by western blotting using KM2961 and KM2962. mock represents the target.
  • FIG. 12 is a diagram showing the binding between a protein encoded by C-hsil3412 or C-kaia397 and IGF by far western. mock represents the target.
  • FIG. 13 is a view showing the effect of a protein encoded by C-hsil3412 or C-kaia397 on IGF-dependent proliferation of HT-29 cells.
  • mock represents the target
  • FIG. 14 shows the binding activity of KM2961 and M2962 to antigen peptides.
  • 2961 indicates the culture supernatant obtained by culturing the hybridoma producing the monoclonal antibody KM2961 for 3 days
  • KM2961 indicates the culture supernatant obtained by culturing the hybridoma producing the monoclonal antibody KM2961 for 3 days.
  • Open columns contain antigen peptides. The reaction between the uncultured plate and these culture supernatants is shown. The black and shaded columns show the reaction between the antigen-coated plate and these culture supernatants.
  • MRNA was extracted from human small intestinal mucosal tissue by the method described in Molecular Cloning, 2nd edition. Furthermore, polyA (+) A was purified using an oligo dT cell opening. A cDNA library was prepared from each polyA (+) RNA by the oligocap method [Gene, 1, 171 (1994)]. Using Oligo-cap linker (SEQ ID NO: 5) and Oligo dT primer (SEQ ID NO: 6), the literature [Protein nucleic acid enzyme, ⁇ , 197 (1996),
  • the base sequences at the 5 'and 3 After performing a sequencing reaction using a sequencing reagent (Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit or BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems) according to the manual, DNA The determination was performed using a sequencer (ABI PRISM 377, manufactured by PE Biosystems).
  • a sequencing reagent Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit or BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems
  • the nucleotide sequence of each clone of the prepared cDNA library was compared with a known protein belonging to the IGFBP super-family registered in the protein amino acid database SWISSPROT or the nucleotide sequence database GenBank.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of C-hsil3412, and SEQ ID NO: 3 shows its nucleotide sequence.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of C-kaia397, and SEQ ID NO: 4 shows its nucleotide sequence.
  • C-hsil3412 was determined by homology analysis using BLAST2 to indicate that human I GFBP, a protein belonging to the insulin-like growth factor binding protein family.
  • GF-2 an insulin-like growth factor binding motif containing 10 cysteine residues that are important for binding to insulin, including 4 cysteine residues [GCGCCXXC
  • IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6 and IGFBP-7 in Fig. 1 are human IGFBP-1, human IGFBP-2 and human, respectively. Refers to IGFBP-3, human IGFBP-4, human IGFBP-5, human IGFBP-6, and human IGFBP-7.
  • GenBank / EMBL / DDBJ using BLAST2 revealed that these sequences matched the nucleotide sequence encoding the amino acid of C-hsil3412 with two nucleotide sequences considered to be ESTs derived from the same gene.
  • EST's GenBank Accession Nanno, 'One is
  • nucleotide sequence matched the nucleotide sequence encoding the amino acid of C-kaia397 and one nucleotide sequence considered to be EST derived from the same gene.
  • a gene showing homology to the nucleotide sequence of each EST was searched for from the GenBank, EMBL, and DDBJ databases using BLAST2, and was found to be the insulin-like growth factor binding protein superfamily. Does not show significant homology. Therefore, it was found that C-hsi 13412 and Cki397 were novel genes obtained for the first time according to the present invention.
  • ATG located at position 179 was identified as an initiation codon, and TAG located at positions 1089-1091 was identified as a termination codon, and the protein encoded by ORF was estimated to be composed of 304 amino acids.
  • ATG located at positions 926 to 928 is identified as a start codon, TAG located at positions 1517 to 1519 as a stop codon, and the protein encoded by 0RF is presumed to be composed of 197 amino acids.
  • Comparison of the obtained human genome gene sequence with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 shows that the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is divided into five parts and represented by SEQ ID NO: 4
  • the nucleotide sequence was found to be divided into seven parts and existed over about 7 kb on the same human chromosome 10 genome (FIG. 4).
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is composed of five exons
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is composed of seven exons
  • the second and fourth exons are composed of Exact match.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are derived from the same gene having the unique feature that they have different amino acid sequences. It turned out that they were products of different squirrel forms.
  • Example 5 Organs expressing C-hsil3412 and C-kaia397 R30743, an EST corresponding to a part of the nucleotide sequence encoding the amino acid of C-hsil3412, was isolated from fetal heart.
  • the nucleotide sequence was searched using Genome, EMBL, and DDBJ using BLAST2. The nucleotide sequence was found to be consistent with 11 nucleotide sequences considered to be ESTs.
  • GenBank accession numbers of these ESTs are AI658885.
  • AI658885, W28828, AI377545, M896981, AA688321 AW370932 are registered as UniGene Hs.155234.
  • AI658885 and M688321 were isolated from the prostate, W28828 was isolated from the eye, AA896981 was isolated from the spleen, AW370932 was isolated from the mammary gland, and M126609 was isolated from the uterus of pregnant women.
  • C-hsil3412 was expressed in the fetal heart, prostate, eyes, spleen, mammary gland, and uterus of pregnant women.
  • GenBank accession numbers of these ESTs are M937577, AW080122, AA534966, AW374463, AQ394346, F23541, and F23538.
  • AW080122 was isolated from the esophagus, M534966 from the large intestine, and F23538 from muscle. Therefore, it was presumed that C-kaia397 was expressed in the esophagus, large intestine, and muscle.
  • Example 6 Expression analysis of C-hsil3412 and C-kaia397 using RT-PCR method
  • Human organs polyA + RM include brain, kidney, kidney, pituitary, small intestine, bone marrow, heart PolyA + RNA from the gut, liver, lung, lymph node, mammary gland, placenta, prostate, skeletal muscle, spleen, stomach, testis, thymus, thyroid, and uterus was used.
  • T cell line CJurkat (Riken Cell Bank; RCB 086), Molt-3
  • SK-N-MC ATCC HTB-10
  • SK-N-SH ATCC HTB-11
  • lung cancer cell line [ PC-9 (Immune Biology Research Institute), HLC-1 (Osaka University Cancer Research Institute), QG90 (Aichi Cancer Center Yuichi)], Gastric cancer cell line AT0-III (Immune Biology Research Institute)], Tengger cancer cells Strains (Capan-1 (ATCC HTB-79), Capan-2 (ATCC HTB-80)), colon cancer cell line
  • PCR was performed using the synthesized cDNA as type III. That is, using a primer containing a sequence specific for human C-hsil3412 and C-kaia397 and human 5-actin shown below, a solution obtained by diluting the synthesized cDNA 50-fold with sterile water, and the Advantage 11 cDNA PCR kit ( After preparing a reaction solution using a conventional method using Clontech, the reaction was carried out at 94 ° C for 7 minutes, and then a cycle of 94 ° C for 1 minute and 68 ° C for 3 minutes was repeated 32 times. PCR was performed under the conditions of reacting at 68 ° C for 7 minutes.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and the expression levels were compared semi-quantitatively by comparing the DNA band concentrations specific to the primers used.As a result, C-hsil3412 and C-kaia397 were compared. Was found to have a different expression pattern (Fig. 5).
  • oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 are represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11 as a primer set specific to C-hsil3412.
  • Oligonucleotides consisting of the base sequence were used as a set of specific C-kaia397 primers.
  • the reaction was performed using an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by as a set of primers specific to human ⁇ actin.
  • the two clones C-hsil3412 or C-kaia397 prepared in Example 2 were used as type I, a primer set consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 14, Ex Taq DNA Polymerase (TMMA ), React at 94 ° C for 10 minutes, and then repeat the reaction at 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes 35 times. Finally, PCR was performed under the condition of reacting at 72 ° C for 10 minutes. Thereafter, a DNA probe common to C-hsi 13412 and C-kaia397 was prepared by separating about 300 b of the amplified product by 1 agarose electrophoresis.
  • the primer set consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 14 is based on the common nucleotide sequence of the translation regions of C-hsil3412 and C-kaia397 represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. Designed. (2) Preparation of labeled DNA probe
  • the DNA probe prepared in the above (1) was subjected to radioisotope (hereinafter abbreviated as “M”) by the random prime method [Anal. Biochem. 1226 (1983), Anal. Biochem., 266 (1984)]. Labeled.
  • M radioisotope
  • the membrane After 3 hours of prehybridization, the membrane is immersed in 2 ml of a new prehybridization solution, and the single-stranded denatured DNA probe is converted to a specific activity of RI of 2 ⁇ 10 6 cpm / ml. Then, the mixture was allowed to stand for 20 hours while shaking at 42 ° C. to perform hybridization.
  • the clone C-hsil3412 prepared in Example 2 was used as type II, and a primer set consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, KOD DNA Polymerase (manufactured by T0Y0B0) was used in a conventional manner. After preparing a reaction solution by PCR, PCR was performed under the conditions of repeating 25 cycles of 98 ° C for 15 seconds, 65 ° C for 2 seconds, and 74 ° C for 30 seconds. The primer set consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 was designed so that FLAG peptide was added to the C-terminal of C-hsil3412.
  • the obtained amplification product of about 990 bp was placed at the Sial site of pBluescriptll SK- (Stratagene), the 5 side of C-hsi 13412 was located at 1 site side of pBluescriptll SK-, and the 3 side of C-hsil3412 was located at the 3 side of pBluescriptll.
  • PSK-C-hsil3412 was produced by inserting it so as to be on the SK- site side.
  • the I-Kotl fragment (900 bp) of pSK-C-hsil3412 was inserted into the EeaRI-MJ site of pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), an expression vector for animal cells, and pcDNA3-C- hsil3412 was produced.
  • a primer set consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 15 and 17 and KOD DM Polymerase manufactured by TOYOBO
  • PCR was performed under the conditions of repeating 25 cycles of 98 ° C for 15 seconds, 65 ° C for 2 seconds, and 74 ° C for 30 seconds.
  • the primer set consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 17 was designed such that a FLAG marker peptide was added to the C-terminal of C-kaia397.
  • the obtained amplification product of about 620 p was placed at the Sial site of pBluescriptll SK- (Stratagene), the 5 side of C-kaia397 was placed at the KEHI site side of pBluescriptll SK-, and the 3 side of C-kaia397 was placed at the 3 side of pBluescriptll.
  • PSK-C-kaia397 was produced by inserting it so as to be on the Saal site side of SK-.
  • ECQRI-Ml fragment (600 bp) of pSK-C-kaia397 was inserted into the I-I site of an expression vector pcDNA3 (manufactured by Invitrogen) for animal cells. kaia397 was produced.
  • COS-1 cells (Riken Cell Bank; RCB0143) were seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / well.
  • the cells of the COS-1 / mock, COS-l / C-hsil3412, and C0S-1 / C-kaia397 strains prepared in (2) above were plated on a 6-well plate using a cell scraper (Sumitomo Becrite). After separation from the suspension, the suspension was suspended in 2 ml of Phosphate Buffered Saline (pH 7.2) [hereinafter referred to as “PBS” (manufactured by Gibco)], and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes to remove the supernatant.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • a cell lysate was obtained by suspending in 1 ml of PBS containing animal protein protease inhibitor cocktail (manufactured by Sigma) and sonication.
  • the obtained cell lysate was stored at -20 ° C, thawed if necessary, and used for the following experiments.
  • the culture supernatant prepared in the above (3) (i) or the cell lysate 5-1 prepared in the above (3) (ii) was used as the detection antibody in accordance with the description in Example 14 as an anti-FLAG M2 monoclonal antibody.
  • Western blotting was performed using a null antibody (manufactured by Sigma).
  • the pSK-C-hsil3412 prepared in Example 8 was designated as type III, and a primer set of the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, or SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 2
  • a reaction solution is prepared by a conventional method using an oligonucleotide primer set consisting of the nucleotide sequence represented by 0 and native pfu polymerase (manufactured by STRATAGENE), and reacted at 94 ° C for 5 minutes, and then reacted at 94 ° C for 1 minute.
  • the cycle was repeated 25 times at 55 ° C. for 1 minute and at 72 ° C. for 2 minutes, and finally PCR was performed under the conditions of reacting at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the obtained amplification product of about 900 b was inserted into the iLindlll-Xhal site of pBluescriptll SK- to prepare pSK-C-hsil3412c and pSK-C-hsil3412h.
  • Hindlll-hal fragment (900 bp) of pSK-C-hsil3412c and pSK-C-hsil3412h was ligated to the Hindlll-Xhal site of an animal cell expression vector pAGE210 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)]. Then, pAGE210-C-hsil3412 and pAGE210-C-hsil3412h were produced.
  • the pSK-C-caia397 prepared in Example 8 was designated as type I, and a primer set of oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: PCR was performed in the same manner as in (i) above, using an oligonucleotide primer set consisting of the nucleotide sequence represented by 22.
  • the obtained amplification product of about 600 b was inserted into the Hifldlll-M site of pBluescriptll SK- to produce pSK-C-kaia397c and pSK-C-kaia397h.
  • the Eindlll-Xhal fragment (600 bp) of pSK-C-kaia397c and pSK-C-kaia397h was PAGE210 and pUC18 (Amershajn Pharmacia) were inserted into Hindlll-hal sites to prepare pAGE210-C-kaia397 and pUC-C-kaia397h.
  • PAGE210, pAGE210-C-hsil3412, pAGE210-C-hsil3412h, pAGE210-C-kaia397, and pUC-C-kaia397h were cut with ESEI and linearized. After phenol-cloth form extraction, ethanol precipitation was performed, and the obtained linearized plasmid was dissolved in a TE solution. On the other hand, CH0 cells contain 5% fetal serum (Gibco), 0.09% sodium bicarbonate (Gibco),
  • Penicillin-streptomycin manufactured by Gibco
  • ⁇ : ⁇ 1900 medium manufactured by Gibco, hereinafter referred to as “ ⁇ medium”.
  • CH0 cells were washed with ⁇ -PBS buffer (137 nmol / l chloride, 2.7 nmol / l sodium chloride, 8.1 mol / l disodium hydrogen phosphate, 1.5 nmol / l sodium dihydrogen phosphate, 4 mol ol / l Magnesium chloride buffer) to make 8 x 10 6 cells / ml and add 200 ⁇ 1 of cell suspension (containing 1.6 x 10 6 cells) to 4 g of the above linearized plasmid. Mixed.
  • ⁇ -PBS buffer 137 nmol / l chloride, 2.7 nmol / l sodium chloride, 8.1 mol / l disodium hydrogen phosphate, 1.5 nmol / l sodium dihydrogen phosphate, 4 mol ol / l Magnes
  • the mixture was transferred to a cuvette (distance between electrodes: 2), and gene transfer was performed using a GenePulserII (BioRad) device under the conditions of a pulse voltage of 0.30 kV and an electric capacity of 250 F. Place the cuvette on ice. After standing, suspend the cell suspension in the cuvette in 15 ml of A medium. Dispense 5 ml of the suspension into a flask at 37 ° C; in a 5% CO 2 incubator. And cultured.
  • a cuvette distance between electrodes: 2
  • GenePulserII BioRad
  • ⁇ 2000 medium hereinafter referred to as ⁇ medium
  • ⁇ medium ⁇ 2000 medium
  • Penicillin-streptomycins 300 ⁇ g / ml hygromycin B manufactured by Gibco.
  • Subculture was continued with dilution in the middle, and about two weeks after gene transfer, a transformed cell line resistant to hygromycin ⁇ was obtained.
  • the transformant was subcultured in a medium.
  • pAGE210, pAGE210-C-hsil3412s pAGE210-C-hsil3412hs pAGE210-C-kaia397 Transformants prepared by introducing pUC-C-kaia397h were transformed into CHO / mock, CH0 / C-hsil3412, CHO / C-hsil3412h, and CHO / C, respectively.
  • the CHO / mock strain, CHO / C-hsil3412 strain, CHO / C-hsil3412h strain, CHO / C-kaia397 strain, and CH0 / C-kaia397h strain prepared in (2) above were statically cultured using the B medium. Cells seeded at a cell density of about one-fifth of the confluent were allowed to grow until they filled almost the entire surface of the 25 cm 2 culture vessel, and the culture supernatant and cells were collected separately. The collected culture supernatant was subjected to organic solvent precipitation using acetone for 100 ⁇ 1 of the culture supernatant, and redissolved in 50 l of 100 mmol / l Tris-HC1 buffer (pH 7.5).
  • Example 13 The cells were collected using a cell scraper, suspended in 500 ⁇ 1 of 100 mmol / l Tris-HCl buffer (PH7.5), and sonicated to obtain a cell fraction. After separating 11.25 ⁇ 1 of the prepared supernatant fraction or cell fraction by SDS polyacrylamide electrophoresis using the Lae Lotus method, the anti-C-hsil3412 / C-kaia397 monoclonal antibody KM2962 prepared in Example 13 was used. In accordance with the description of Example 14 and Western processing analysis.
  • Example 10 Expression of a protein encoded by C-hsil3412 using insect cells as a host
  • a process of preparing a special vector having a cDNA encoding a desired protein (2) cotransfection of baculovirus MA and a transfer vector into an insect cell, followed by homologous recombination. This includes the steps of producing and further growing a recombinant virus, and (3) the step of infecting cells with the recombinant virus and expressing the target protein. The details are described below.
  • Sf9 cells were cultured in 50 ml of ESF921 medium at 5 ⁇ 10 5 / ml in a 125 ml Erlenmeyer flask at 27 ° C. with shaking at 125 rpm.
  • the culture was centrifuged at 1,200 rpm for 10 minutes to remove the cells, and a recombinant virus solution used for protein expression was obtained.
  • the titer of the recombinant virus solution was measured by the following method.
  • Plaque agarose (Pharmingen)] Medium agar plaque plus agarose aqueous solution and 4 ml of TM-FH Insect Medium (manufactured by Pharmingen) are mixed and kept at 42 ° C]. I poured it. After standing at room temperature for 15 minutes, a vinyl tape was wrapped around a Petri dish to prevent drying, the Petri dish was placed in a sealable plastic container, and cultured at 27 ° C for 5 days.
  • the Sf9 cells were cultured in 100 ml of ESF921 medium in a 250 ml Erlenmeyer flask at 27 ° C. with shaking at 125 rpm at 5 ⁇ 10 V ml.
  • an anti-FLAG M2 monoclonal antibody (Sigma) was used as described in Example 14. Wes evening printing was performed using
  • the antigen is identified from the highly hydrophilic part, the N-terminal, the C-terminal, the secondary structure, the turn structure, and the random coil structure.
  • Compound 1 a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23
  • Compound 2 a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24
  • Compound 3 a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25
  • a polypeptide having the amino acid sequence shown A polypeptide having the amino acid sequence shown.
  • Trp L-tryptophan
  • Trt Trityl
  • Fmoc-Arg (Pmc) -0H ⁇ ⁇ -9-fluorenylmethyloxycarbonyl- N g -2,2,5,7,8-pentanomethylchroman-6-sulfonyl-L-arginine
  • Fmoc- Trp (Boc) -0H N a -9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-N ind -t-butyloxycarbonyl -L-Tributophan
  • Fmoc-Tyr (tBu) -OH IT-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl -0-t-butyl-L- Tyrosine
  • the physicochemical properties of the compounds were measured by the following methods. Mass spectrometry was performed by the FAB-MS method using JEOL JMS-HX110A, or by the MALD I-T0FMS method using the BULLICHI mass spectrometer REFLEX. Amino acid analysis was performed by the method of Cohen, SA (Analytical Biochemistry, 19 (1994)). Hydrolysis was performed in hydrochloric acid steam at 110 ° C for 20 hours, and the amino acid composition of the hydrolyzate was analyzed using a Waters AccQ-T1 ⁇ 2 amino acid analyzer (Waters).
  • Compound 1 (peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 H-Cys-Arg-Pro-Ser-Pro-Gly-Pro-Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Gly-Trp-Met -Arg-Leu- NH 2 )
  • Fmoc-Leu-NH was synthesized on the carrier.
  • step (c) Fmoc-Met-0H, Fmoc-Trp (Boc) -0H, Fmoc-Gly-0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Leu -OH ⁇ Fmoc-Tyr (tBu) -0H, Fmoc-Asp (0tBu) -0H Fmoc-Pro-OH ⁇ Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-0H, Fmoc- Ser (tBu) -0H, Fmoc-Pro -0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, and Fmoc-Cys (Trt) -0H in order, (a) to () were repeated, followed by (a) and (b) deprotection and washing steps.
  • a carrier resin to which the side-chain-protected peptide was bound was obtained, and TFA (82.5%) containing 2-methylindole at a concentration of 5 mg / mL was obtained. %), Thioanisole (5%), water (5%), ethyl methyl sulfide (3%), 1,2-ethanedithiol (2.5%) and thiophenol (2%) After adding lml, the mixture was left at room temperature for 6 hours to remove the side chain protecting groups and to cut out the peptide from the resin.
  • Compound 2 (peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 H-Cys-Arg-Pro-Pro-Ala-Phe-Thr-Pro-Arg-Ala-Pro-Asp-Arg-Val-Thr- Synthesis of Ser-Ile-0H)
  • Compound 3 (peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 H-Cys-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ser-Glu-Glu-Asn-Asp -Asp-Tyr- Tyr-OH)
  • Fmoc-Tyr (tBu), 18 ⁇ mol bonded carrier resin (SynProPep Resin resin, manufactured by Shimadzu Corporation) Starting from 30iDg, Fmoc-Asp (OtBu) -0H, Fmoc-Asp (OtBu) -0H ,; Fmoc-Asn (Trt) -0H, Fmoc-Glu (OtBu) -0H, Fmoc-Glu (OtBu) -0H, Fmoc-Ser (tBu) -0H, Fmoc-Glu (OtBu)- 0H, Fmoc-Ala-0H, Fmoc-Glu (OtBu) -0H, Fmoc-Glu (0tBu) -0H, Fmoc-Glu (0tBu) -0H, Fmoc-Glu (0tBu) -0H, Fmoc-Glu (0tBu) -0H, Fm
  • This crude product was dissolved in a mixed solution consisting of acetic acid, dithiothreitol, DMF and water, passed through a reversed-phase silica gel packing column (YMC Dispo SPE C18) to adsorb the peptide, and 0.1% TFA, After washing with a 10% aqueous solution of acetonitrile, elution was carried out with a 0.1% aqueous solution of TFA and a 25% aqueous solution of acetonitrile to obtain a fraction containing the compound 3 This was freeze-dried to obtain 17.1 mg of compound 3.
  • a mixed solution consisting of acetic acid, dithiothreitol, DMF and water
  • YMC Dispo SPE C18 reversed-phase silica gel packing column
  • the cell lysate 5-1 of the COS-1 / C-hsil3412 strain and the COS-l / C-kaia397 strain obtained in Example 8 was used as a sample of the protein encoded by C-hsil3412 and C-kaia397.
  • Western blotting was performed using the immunized mouse antiserum 50 (il) obtained in (2) above as a detection antibody.
  • mice antisera obtained using Compound 2 and Compound 3 as immunogens can specifically recognize the protein encoded by C-hsil3412 C-kaia397, respectively (FIG. 10).
  • Example 13 Monoclonal Antibody Recognizing Protein Coated by 3 C-hsil3412 or C-kaia397
  • Compound 1 obtained in Example 11 was conjugated with KLH in the same manner as in Example 12 (1), and used as an immunogen.
  • each KLH conjugate of Compound 1 prepared in the above (1) 100 mg was mixed with 2 mg of aluminum hydroxide adjuvant and 2 mg of aluminum hydroxide (Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p99, 1988) and pertussis vaccine (Chiba Prefectural Serum) (Laboratory) 1 ⁇ 10 s cells were administered to each of three 6-8 week old female BALB / c mice. Two weeks after the administration, each KLH conjugate was administered once a week for a total of four times. Blood was collected from the neck of the mouse, and its serum antibody titer was measured by the following oxygen immunoassay. The mouse showing a sufficient antibody titer was excised from the spleen after the final immunization.
  • the excised spleen was minced in a MEM (Minimum Essential Medium) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with pinset, and centrifuged (250 ⁇ g, 5 minutes).
  • the obtained precipitate fraction was added with tris-ammonium chloride buffer (PH7.6), and the mixture was treated for 1 to 2 minutes to remove erythrocytes.
  • the obtained precipitate fraction (cell fraction) was washed three times with MEM medium and used for cell fusion.
  • Compound 1 obtained in Example 11 was used as an antigen for Atsushi.
  • TTY TTY
  • SMCC C4- (N-Maleimidomethyl) -cyclohexane-l-carboxylic acid N-hydroxysuccinimido ester manufactured by Sigma
  • the conjugate (10 ⁇ g / ml) prepared above was dispensed at 50/1 / well onto a 96-well EIA plate (manufactured by Grainer Co., Ltd.), and allowed to stand at 4 ° C overnight for adsorption.
  • a 96-well EIA plate manufactured by Grainer Co., Ltd.
  • BSA serum albumin
  • PBS Phosphate buffered saline
  • An 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cell line P3X63Ag8U.l [P3-U1: purchased from ATCC] is cultured in normal medium [RPI medium supplemented with 10% fetal serum (hereinafter abbreviated as “FCS”)]. , 2 ⁇ 10 7 or more cells were obtained and used as parent strains for cell fusion.
  • FCS fetal serum
  • the mouse splenocytes obtained in (2) and the myeloma cells obtained in (4) were mixed at a ratio of 10: 1, and centrifuged (250 ⁇ g, 5 minutes). After loosening the cells in the precipitate fraction, mix 2 g of polyethylene glycol-1000 (PEG-1000), 2 ml of MEM medium and 0.7 ml of dimethyl sulfoxide at 37 ° C with stirring. liquid added 0.5 ml per 1 0 8 mouse splenocytes, after MEM medium is added several times, 1 ml every 1-2 minutes to the suspension, as the total amount by adding MEM medium is 50 ml did. The suspension is centrifuged (900 rpm, 5 minutes), and the cells in the obtained precipitate fraction are loosened gently.
  • the HAT medium was suspended in 100 ml of RPMI medium supplemented with 10% FCS and supplemented with HAT / Media Supplement (Roche's Diagnostics). 96 ⁇ l of the suspension Dispensed at 200 ⁇ 1 / Ueru the culture plate min, in 5% C0 2 incubator primary, 10 at 37 ° C; and 14 days of culture.
  • the hybridoma cell line that produces the anti-C-hsil3412 / C-kaia397 monoclonal antibodies KM2961 and KM2962 was established on May 24, 2001 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Ibaraki, Japan) It has been deposited with Tsukuba East 1-chome, 1-1-1, Central No. 6 as FERM BP-7603 and FERM BP-7604 at Postal Code 305-8566), respectively.
  • the ascites was centrifuged (1200 ⁇ g, 5 minutes) to remove solids.
  • Purified IgG monoclonal antibody was obtained by purifying by the force prillic acid precipitation method (Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • the subclass of the monoclonal antibody was determined to be IgGl ⁇ ⁇ K2962 as IgG3 by ELISA using a subcluster typing kit.
  • Example 14 Detection of Protein Coated by C-hsil3412 or C-kaia397 Using KM2961 and KM2962 by Western Processing Cell lysates of the COS-l / mock, C0S-l / C-hsil3412, and C0S-1 / C-kaia397 strains prepared in Example 8 were used at 2.5 ⁇ 1 / lane, and the culture supernatant was used at 10 zl / lane. After fractionation by 15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), the resultant was subjected to PVDF membrane (Millipore) according to a conventional method.
  • anti-C-hsil3412ZC-kaia397 monoclonal antibody KM2961, or KM2962 was added to the membrane to a concentration of 2/011, It was left at room temperature for 1 hour. After thoroughly washing the membrane with Tween-TBS, detection was performed using a peroxidase-labeled ⁇ sagi anti-mouse immunoglobulin (manufactured by DAK0) diluted 2,000-fold as a secondary antibody.
  • C-hsil3412 and because C-kaia397 has examined the binding property between IGF protein coding, C0S-l / C-hsil3412 strain obtained in Example 8, C0S-l / C- kaia397 N and COS as control Using the cell lysate of the -1 / mock strain, examination was performed by far western (Molecular Cloning A Laboratory Manual Third Edition Cold Spring Harbor Laboratory II protein experiment protocol 1 Shujunsha).
  • COS-l / mock strain, COS-l / C-hsil3412 strain, and COS-l / C-kaia397 strain were used as the SDS- PAGE was performed, transferred to a PVDF membrane, and blocked. Then, human IGF-1 diluted in blocking solution
  • an anti-human IGF-II monoclonal antibody Upstate Biotechnology
  • anti-human insulin polyclonal antibody Santa Cz
  • Tween-TBS After thoroughly washing the membrane with Tween-TBS, detection was carried out using a peroxidase-labeled mouse heron anti-mouse immunoglobulin (manufactured by DAK0) diluted 2,000-fold as a secondary antibody.
  • Anti-IGF-1 antibody and anti-IGF-II antibody detected bands with molecular weights of about 33 kDa and about 22 kDa, respectively, derived from proteins encoded by C-hsil3412 and C-kaia397, but anti-insulin antibodies were used. In these cases, these bands were not detected. Therefore, it was shown that the protein encoded by C-hsil3412 or C-kaia397 binds to and IGF-II, but may not bind to insulin (FIG. 12 ').
  • Serum albumin 200 g / ml
  • human transferrin 20 / g / ml
  • penicillin 20 unit / ml
  • streptomycin 20 g / ml
  • human IGF-I Peprotech
  • human IGF-II Peprotech
  • the culture supernatant of the COS-1 / mock strain, COS-l / C-hsil3412 strain, or COS-1 / C-kaia397 strain was added to a concentration of 5 ⁇ l / well, and then added at 37 ° C. after 3 days of culture in a C0 2 incubator one, the number of viable cells were measured by cell Proliferation Reagent WST-1 (manufactured by Roche die ⁇ Diagnostics stick, Inc.).
  • the culture supernatants of the COS-l / C-hsil3412 and COS-l / C-kaia397 strains were shown to inhibit the growth of the human colon cancer cell line HT-29 cells dependent on IGF (Fig. 13 ). Items that can be stabbed
  • a novel insulin-like growth factor binding protein a DNA encoding the protein, an antibody recognizing the protein, a method for determining a disease involving the protein, a diagnostic agent, a prophylactic agent, and a therapeutic agent can be provided. .
  • SEQ ID NO: 12 Description of artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 22 Description of artificial sequence: Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 23 Description of one artificial sequence: synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 23 Description of one artificial sequence: synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 25 Description of artificial sequence: synthetic peptide

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Description

明 細 書
インスリン様増殖因子結合蛋白質
本発明は、 新規なインスリン様増殖因子結合蛋白質、 該蛋白質をコードする D N Aおよび該蛋白質を認識する抗体、 および該蛋白質が関与する疾患の判定 法、 診断薬、 予防薬または治療薬に関する。
蜚景技術
インスリン様増殖因子結合蛋白質 (insulin-like growth factor binding protein 以下、 「IGFBP」という） は、 体液中のインスリン様増殖因子 （ insulin-like growth factors 以下、 「IGF」という） が高分子複合体として 存在することから発見された分子群で、 現在までに、 IGFBP— 1~10ま での 10種類の分子の存在が報告されており、 スーパーフアミリーを形成して いることが知られている 〔Endocr. Rev., IS, 801 (1997)、 Prog. Growth Factor Res., 2., 243 (1991)、 Mol. Reprod. Dev., ， 368 (1993)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, M, 12981 (1997)〕 。
IGFBPの機能としては、 ィンテグリンへの結合などによる直接作用の存 在も示唆されているが、 主な作用は、 I GFやインスリンに結合してその活性 や分布、代謝などを調節することによつて発揮されると考えられ〔Endocr. Rev. , IS, 801 (1997)、 Bio Science用語ライブラリー サイトカイン '増殖因子 改 訂版 P14-17 (1988)〕 、 具体的には IGFBPは、 血中および血管外への IG Fの運搬と分解の抑制、 受容体への結合調節などによりその機能を発揮してい ると考えられている。
I GF BPス一パーフアミリーのうち、 IGFBP— 1〜6までの 6種類の 分子は構造的にも類似しており、 インスリンよりも I GFに高い親和性をもつ て結合することから、 I GF高親和性 I GFBPとしてサブファミリ一に分類 されている CMol. Endocrinol., Z, 404 (1988)、 EMBO J., S， 2497 (1989)、 Mol. Endocrinol., 2, 1176 (1989)、 Mol. Endocrinol. , 4, 1806 (1990)、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , J £， 219 (1991)、 J. Biol. Chem. , 繩， 9043 (1991) 、 J. Biol. Chem. , 2 L, 10646 (1991)〕。
I GF高親和性 I GFBPのサブファミリ一分子間のアミノ酸配列の相同性 はヒトで 49%〜60%である。 また、 I GFBP— 6を除く 5種類の I GF BPでは 18個のシスティン残基保存されており、 このうち N末端の 3個が G 1 y— Cy s— G 1 y— Cy s— Cy s— X—X— Cy sで代表される相同配 列 [Xは任意のアミノ酸を表しており、 該相同配列はインスリン様増殖因子結 合モチーフと呼ばれる （以下、 「I GFBPモチーフ」 ともいう） ]を形成し、 I GFの結合に関与することが示されている〔Prog. Growth Factor Res., 243 (1991)〕。
I GFBP— 1と 3は、 I GFの作用を抑制する場合と促進する場合の両方 があることが知られている。 また I GFBP— 2、 4、 6は抑制性の、 I GF BP— 5は促進性の I GF結合蛋白質である。 I GFには、 成長ホルモン依存 的に肝、 骨組織などで産生され、 身体的成長を促進させる増殖因子として機能 している I GF— Iと中枢神経系、 骨組織などに多量に発現し、 まとして胎生期 の成長に重要な役割を果たしていると推定される I GF— IIとが存在するが、 I GFBP— 1、 3、 4は I GF— I及び I GF— IIに同等の結合活性を示し、 I GFBP— 2、 5、 6は主として I GF— IIに強い結合活性を示すことが知
ί
られている。
また、 I GF高親和性 I GFBPのサブファミリー分子の組織分布は、 各分 子によって異なっており、 I GFBP— 1は主に羊水や胎児血清中に、 I GF
ΒΡ-2は主に胎児肝臓や成人脳に、 I G F Β Ρ— 3は主に肝臓や血清中に、
I GFBP— 4は主に腎糸球体、 皮膚および腸上皮に、 I GFBP— 5は主に 腸上皮や骨に、 I GFBP— 6は主に皮膚や心臓に存在していることが知られ ている。
I GFBPと病態との関わりに関しては、 以下にあげるような知見が報告さ れている。
小人症や末端肥大症患者では I GFや I GF BPの発現変動が病態生理に直 接関与していることが知られている。 また、 小児慢性腎不全においてもしばし ば成長障害が起こるが、 成長ホルモンや I GFの発現レベルは正常であり、 多 くは IGFBP— 2や 3の増加による I G Fの機能障害が原因であることが知 られている 〔Miner. Electrolyte Mrtab., IS, 320 (1992)〕。 IGFBP— 4および 5は骨代謝に重要な機能を有しており、 骨粗鬆症では I G F B P— 5 の発現量が減少し、 副甲状腺ホルモンの上昇を伴う老人女性の骨折患者では I GFBP— 4の発現が上昇することが報告されている。 また、 腎摘出後や小腸 切除後の代償性肥大において I GF— Iの傍分泌作用の亢進が観察されている が、 I GF— Iの mRNA量は変化せず、 I GFBP— 3の発現低下によって遊 離の I GF— Iが増加することが報告されている 〔J. Fuller; Baillieres Clin. Endocrinol.Metab., S, 165 (1994)〕 。 さらに、 子宫内膜の悪性腫瘍では、 良 性腫瘍に比べて I G F B P— 1の発現が低下していることが報告されている 〔 Growth Regul., 2, 74, (1993)〕。
一方、 GFBPスーパーファミリ一のうち、 I GFBP— 7〜10までの 4 種類の分子は構造的に類似し、 かつ、 I GFに低い親和性を有するという共通 の性質を持つと考えられることから、 I GF低親和性 I GFBPとして別のサ ブフアミリーに分類されている Proc. Natl. Acad. Sci. USA, M, 12981 (1997) 、 Cancer Res., S2， 2787 (1999)〕。
I GFBP— 7については様々な生理活性についての報告がなされ、 特に癌 およびその病態との関係について多くの報告がなされている。
IGFBP— 7は、 老化したヒト上皮細胞で発現が上昇している 〔J. Clin. Endocrinol. Metab., i, 715 (1993)〕一方で、 カルシノーマ細胞株などでは発 現が低下していることから、 癌抑制活性遺伝子としての機能を有するのではな いかと考えられている Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2Z, 4472 (1995)〕。 I GFBP— 7のヒト染色体上の遺伝子座は 4 q 12で、 ヒト上皮細胞をレチノ イン酸で処理することでその発現が上昇することも知られている 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2Z, 4472 (1995)〕。
乳癌組織では、 染色体 4 q l 2〜 1 3の位置に L O H (loss of heterozygosity) が約 50 %の頻度で観察され、 かつ、 I G F B P— 7の発現 が減少していることが確認されている 〔0ncogene， 2459 (1998)〕。 前立腺 癌組織でも I GFBP— 7の発現が mRNAレベルで減少しており、 特に悪性 の前立腺癌由来の細胞株では検出されないことが報告されている 〔J. Clin. Endocrinol. Metab., 4355 (1998)〕。
さらに、 IGFBP— 7の発現が減少した前立腺癌細胞株に I G F B P— 7 を強制発現させると、 細胞分裂時間の延長、 軟寒天培地中でのコロニー形成能 の低下、 ヌードマウス移植時の腫瘍形成能の低下、 薬剤処理によるアポトーシ ス誘導率の上昇が観察されており、 I G F B P— 7の発現と前立腺癌の悪性度 との関係が示唆されている 〔Cancer Res., S2， 2370 (1999)〕。
白血病患者では、 脳脊髄液中の IGFBP— 7および IGFBP— 3の濃度 が上昇することが報告されており、 白血病の病態との関係が注目されている 〔 J. Clin. Endocrinol. Metab., , 1283 (1999)〕。
大腸癌では、 大腸癌組織および大腸癌細胞株において I G F B P— 7の発現 が上昇していることから、病態との関係が注目されている〔 J . Gastroenterology, ， 213 (1998)〕。
大型の子宮平滑筋腫部位では、 IGFBP— 7の発現が低下しており、 ゴナ ドトロピン分泌促進ホルモン (Gonadotropin- releasing hormone)治療をうけ た患者では I G F B P— 7の発現が上昇することが報告されている〔J. Reprod. Immunol., 53 (2000)〕。 S V 40 T抗原で誘導されたマウス肝臓癌細胞では、 I G F B P— 7遺伝子 の 5 ' 上流域がメチル化され発現量が減少していることから、 癌化にともなう I GFBP- 7の発現調節に遺伝子のメチル化による機構が提唱されている 〔 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2^L, 109 (2000)〕 。
I GFBP- 7と糖尿病との関連についても報告されている。
血管内皮細胞に作用しプロス夕サイクリン P G I 2の産生を促進する因子 （ PGI2-stimulating factorヽ 以下、 「P SF」という） が、 I GFBP— 7と同一 であることが示され CBiochem. J., m, 591, (1994)〕、 血管内皮細胞及び平 滑筋細胞において発現している該因子は CThromb Haemostリ ΊΑ, 1407 (1995) 〕、 ストレブトゾトシン投与による I型糖尿病モデルでは腎臓および血管障害部 位で発現が低下していることが報告されている 〔Diabetes， 4S， Sill (1996)、 J. Diabetes & its Complications, 1Z, 252 (1998)〕 。 また II型糖尿病患者の 冠状動脈平滑筋細胞においても I GF B P— 7の発現低下が蛋白質レベルで観 察されている 〔Diabetes, 4£, 1627 (1997)〕 。 さらに、 牛の動脈由来平滑筋細 胞を高グルコース培地で培養すると I G F B P— 7の発現量が低下することが mRN Aおよび蛋白レベルで確認されている 〔Diabetes, ， 1627 (1997)、 Diabetologia, 41, 134 (1998)〕 。
T GF- ? (Transforming growth factor-/?) 、 副甲状腺ホルモン （P'T H) およびプロスタグランジン E 2 (PGE 2) によって I GFBP— 7の発 現が骨芽細胞において上昇することから、 I G F B P— 7が骨芽細胞に生理的 作用を及ぼすことが示唆されている 〔Endocrinology， 14Q, 1998 (1999)〕 。 ま た、 骨芽細胞をグルココルチコィドで処理すると I GF— Iの発現を抑制する一 方で I GFBP— 7の発現を上昇させることも報告されている （Endocrinology, , 228 (1999)〕 o
また、 I GFBP— 7は骨格筋への分化にも I G Fの分化促進作用を抑制す ることで影響していることが示唆されている 〔Exp. Cell Res., 192 (1997) 、 Endocrinology, Hi, 100 (2000)〕 。
I GFBP- 7がプロス夕サイクリン P G I 2の産生を促進する因子 P S F と同一分子であったことから、 10 8卩_7の生理機能のー部は卩012を エフヱクタ一分子として発揮されていると考えられている。
プロスタグランジンの一種である P G I 2は強力な血小板凝集抑制作用と血 管弛緩作用を有し、 逆の作用を有する TX A 2と拮抗的に作用し生体内の恒常 性の維持に関与していることが知られており 〔Br. J. Pharmac, Ί3., 3 (1982) 〕、 血栓症や動脈硬化症などでは TX A 2および PG I 2の産生の不均衡、 と りわけ P G I 2の産生が低下し血管障害が発症することが知られている〔Br. J. Pharmac, I£, 3 (1982))。 糖尿病性血管障害の発症や進展においても、 血小 板由来の TXA 2の産生亢進に加え 〔Thromb. Res., 12., 211 (1980)、 J. Lab. Clin. Med., 91, 87 (1981)〕、 血管由来の PG I 2の産生低下が血小板凝集の 亢進を引き起こすことが糖尿病患者や実験糖尿病動物で確認されている 〔 Lancet, 1, 325 (1979)、 Lancet, 2, 1365 (1979)、 N. Engl. J. Med.,舰， 366 (1979)、 Life Sci., ， 351 (1978)〕 。
また、 P SFは血流中に存在する因子であり、 血管壁での： PGI 2産生を刺 激すること 〔Nature, m, 549 (1978) 〕 、 および該因子は、 溶血性尿毒症症 候群〔Lancet， Z, 871 (1978)〕、 血栓性血小板減少性紫斑病 〔Lancet， Z, 748 (1979)〕 、 鎌形赤血球性貧血症 〔Br. J. Haematol.， 4S, 545 (1981))、 急性 心筋梗塞〔Coronary， Z, 49 (1985)〕、 糖尿病性血管障害 〔Metabolism， M, 837 (1989)、 Haemostasis, Jl, 447 (1986)、 Diab. Res. Clin. Pract. , 243 (1987) 〕、動脈硬化性疾患において血中レベルが低下していることが報告されている。 すなわち、 I GFBP— 7は血管内皮細胞の PGI 2産生を促し血中の PG
I 2濃度を高めることにより血小板凝集抑制作用、 平滑筋弛緩作用、 胃酸分泌 抑制作用を発揮することが明らかになつている。
以上のように、 I GFBPスーパ一ファミリーに属する因子は、 IGFゃィ ンスリンの機能の調節、 妊娠、 消耗性疾患における代償作用、 骨代謝、 骨格筋 細胞の分化、 血管内皮細胞に対する PGI 2産生促進、 PGI 2を介した血小 板凝集抑制、 血管平滑筋弛緩、 気管支平滑筋弛緩、 胃酸分泌抑制など様々な生 理現象に関与していることが示されている。 また、 小人症、 末端肥大症、 小児 慢性腎不全、 骨粗鬆症、乳癌、 前立腺癌、 急性白血病、 大腸癌、 子宮平滑筋腫、 肝臓癌、 I型糖尿病、 II型糖尿病、 血栓症、 動脈硬化症、 溶血性尿毒症症候群、 血栓性血小板減少性紫斑病、 鎌形赤血球性貧血症、 急性心筋梗塞、 糖尿病性血 管障害等の疾患に関与していることも示されている。
したがって、 I GFBPスーパーフアミリーに属する I GFBPとしての活 性を有する蛋白質、 該蛋白質をコードする遺伝子、 アンチセンス DNA、 蛋白 質を認識する抗体は、 異常な細胞増殖を伴う疾患、 血管障害を伴う疾患、 骨代 謝の異常を伴う疾患、 IGFや成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、 異常な平 滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 胃 酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患の判定、 治療または予防のための医薬になりうると考えられており、 I GF BPスーパ 一ファミリ一に属する因子は有用な新薬開発の夕一ゲットとして非常に注目さ れている。
また、 IGF BPスーパーフアミリーに属する新規な因子が存在する可能性 も想起され、 新規 I GF BP遺伝子を取得できれば、 該 IGFBPのアミノ酸 配列と既知 I G F B Pのァミノ酸配列とを比較したり、 該 I'G F B P遺伝子の 転写物の発現分布を調べることにより、 該 I GF BPの機能を推定し、 医薬品 開発に有用な情報を得ることができる。 また、 新規 IGFBP遺伝子が取得で きれば、 該 I G F B Pの発現または機能を抑制する物質をスクリーニングする ことが可能になる o 該スクリーニングにより得られる化合物は有用な医薬品と して期待される。 本発明は、 新規インスリン様増殖因子結合蛋白質、 該蛋白質をコードする D NA、該蛋白質を認識する抗体、該蛋白質が関与する疾患の判定方法、診断薬、 予防薬および治療薬を提供する。
本発明者らは、 上記課題を解決すベく鋭意検討を行った結果、 I G F B Pフ ァミリーに属する新規ィンスリン様増殖因子結合蛋白質および該蛋白質をコー ドする; DN Aを取得することに成功し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の（1)〜（ 60)を提供するものである。
( 1 ) 配列番号 1で表されるァミノ酸配列からなるインスリン様増殖因子結合 蛋白質。
(2) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるインスリン様増殖因子結合
(3) 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ（1)に記載の蛋白質と 実質的に同一の活性を有する蛋白質
(B) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ（2)に記載の蛋白質と 実質的に同一の活性を有する蛋白質
(4) 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 60%以上 ώ相同性を有するァ ミノ酸配列からなり、 かつ（ 1 こ記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する
(Β) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するァ ミノ酸配列からなり、 かつ（2)に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する
(5) 以下の （Α) または （Β) に記載の蛋白質 c (A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 75〜8 2番のァミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、 かつ（ 1 )に記載の蛋白質と 実質的に同一の活性を有する蛋白質
(B) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 75〜8 2番のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、 かつ （2) に記載の蛋白質 と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(6) 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) (5) の （A) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ （1) に記載の蛋白 質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(B) (5) の （B) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ （2) に記載の蛋白 質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(7) 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) (5) の （A) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、 かつ （1) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有 する蛋白質
(B) (5) の （B) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、 かつ （2) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有 する蛋白質
(8) 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 171〜 304番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、 かつ （1) に記載 の蛋白質と実質的に同一の活性を有する請求項 5の （A) に記載の蛋白質
(B) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 171〜
197番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、 かつ （2) に記載 の蛋白質と実質的に同一の活性を有する請求項 5の （B) に記載の蛋白質
(9) 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) (8) の （A) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ （1) に記載の蛋白 質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(B) (8) の （B) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ （2) に記載の蛋白 質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(10) 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) (8) の （A) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、 かつ （1) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有 する蛋白質
(B) (8) の （B) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、 かつ （2) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有 する蛋白質
(11) 以下の （A) または （B) に記載のポリペプチド。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 少なくとも連続した 5 アミノ酸以上のァミノ酸配列からなるポリべプチド
(B) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 少なくとも連続した 5 ァミノ酸以上のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(12) 以下の （A) または （B) に記載のポリペプチド。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号 171〜304 番において、 少なくとも連続した 5ァミノ酸以上のァミノ酸配列からなるポリ ぺプチド
(B) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号 171〜197 番において、 少なくとも連続した 5アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるポリ ぺプチド
(13) (1) 〜 （12) のいずれか 1項に記載の蛋白質またはポリペプチドを コードする DNA。
(14) 配列番号 3で表される塩基配列のコード領域を含む DNA。
(15) 配列番号 4で表される塩基配列のコード領域を含む DNA。
(16) 以下の （A) または （B) に記載の DNA。
(A) (1) に記載の蛋白質をコードする DNA、 （3)〜 （12)のいず れかの （A) に記載の蛋白質またはポリペプチドをコードする DNA、 または 配列番号 3で表される塩基配列のコ一ド領域を含む DNAとストリンジヱント な条件下でハイプリダイズし、 かつ （1) に記載の蛋白質と実質的に同一の活 性を有する蛋白質をコードする DN A
(B) (2) に記載の蛋白質をコードする DNA、 (3)〜 （12) のいず れかの （B) に記載の蛋白質またはポリペプチドをコードする DNA、 または 配列番号 4で表される塩基配列のコード領域を含む DNAとストリンジ工ント な条件下でハイプリダイズし、 かつ （2) に記載の蛋白質と実質的に同一の活 性を有する蛋白質をコードする DNA
(17) (13) 〜 （16) のいずれか 1項に記載の DN Aをべクタ一に組込ん で得られる組換え体 DNA。
(18) (13) に記載の組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる形質転 換体。
(19) 宿主細胞が、 細菌、 酵母、 昆虫細胞、 植物細胞または動物細胞からなる 群から選ばれる細胞である （18) に記載の形質転換体。
(20) (14) に記載の DNAを含有する形質転換体 FERM BP— 718 l o
(21) (15) に記載の DNAを含有する形質転換体 FERM BP— 718
0 o (22) (18) 〜 （21) のいずれか 1項に記載の形質転換体から選ばれる形 質転換体を培地に培養し、 培養物中に （1) 〜 （12) のいずれか 1項に記載 の蛋白質またはポリペプチドを生成蓄積させ、 該培養物から該蛋白質またはポ リペプチドを採取することを特徴とする、 （1) 〜 （12)のいずれか 1項に 記載の蛋白質またはポリぺプチドの製造方法。
(23) (1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質を認識する抗体。
(24) (1) または （3) 〜 （10) のいずれかの （A) に記載の蛋白質を認 識する抗体であり、 かつ （2) または （3) 〜 （10) のいずれかの （B) に 記載の蛋白質を認識しない抗体。
(25) (2) または （3)〜 （10) のいずれかの （B) に記載の蛋白質を認 識する抗体であり、 かつ （1) または （3) 〜 （10) のいずれかの （A) に 記載の蛋白質を認識しない抗体。
(26) (11) の （A) または （12) の （A) に記載のポリペプチドを免疫 原として用いる （1) または （3) 〜 （10) のいずれかの （A) に記載の蛋 白質を認識する抗体の作製方法。
(27) (11) の （B) または （12) の （B) に記載のポリペプチドを免疫 原として用いる （2) または （3)〜 （10) のいずれかの （B) に記載の蛋 白質を認識する抗体の作製方法。
(28) ( 26) に記載の方法により得られる （1) または （3) 〜 （10)の いずれかの （A) に記載の蛋白質を特異的に認識する抗体。
(29) ( 27 ) に記載の方法により得られる （2) または （3)〜 （10) の いずれかの （B) に記載の蛋白質を特異的に認識する抗体。
(30) 寄託番号が FERM BP— 7603であるハイプリドーマが産生する モノクローナル抗体。
(31) 寄託番号が PERM BP— 7604であるハイプリドーマが産生する モノクローナル抗体。 (32) ( 23) 〜 （25) および （28) 〜 （31)のいずれか 1項に記載の 抗体を用いる （1) 〜 （10)のいずれか 1項に記載の蛋白質を免疫学的に検 出または定量する方法。
(33) (13) 〜 （16) のいずれか 1項に記載の DN Aの塩基配列中の連続 した 5〜60塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド、 該オリゴヌクレ ォチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、 またはそれらオリゴヌク レオチドの誘導体。
(34) ( 13) ~ ( 16) のいずれか 1項に記載の DNA、 または （33) に 記載のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体をプローブとして 用いてハイプリダイゼ一シヨンを行うことを含む、 （1) 〜 （10)のいずれ か 1項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出または定量する方法。
(35) ( 33 ) に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体 をプライマーとして用いてポリメラ一ゼ ·チェイン · リアクションを行うこと を含む、 （1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする遺伝子 の発現を検出または定量する方法。
(36) (13) 〜 （16)のいずれか 1項に記載の DNA、 または （33)に記 載のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体を用いてハイプリダ ィゼ一シヨンを行うことを含む、 （1)〜 （10)のいずれか 1項に記載の蛋 白質をコードする遺伝子の変異を検出する方法。
(37) ( 33 )に記載のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体を 用いてポリメラ一ゼ ·チェイン . リアクションを行うことを含む、 （1)〜 （ 10) のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する方
(38) 以下の （Α) または （Β) に記載の疾患の判定方法。
(A) (1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする DNA の変異を検出または発現量を測定し、 健常人と比較することを特徴とする疾患 の判定方法
(B) (1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質の変異を検出または 発現量を測定し、 健常人と比較することを特徴とする疾患の判定方法
(39) 以下の （A) または （B) に記載の疾患の判定方法。
(A) (1)または （3)〜 （； L0) のいずれかの （A) に記載の蛋白質をコ ードする DNAの変異または発現量と、 （2)または （3)〜 （ 12)のいずれ かの （B) に記載の蛋白質をコードする DN Aの変異または発現量とを比較す ることを特徴とする疾患の判定方法
(B) (1)または （3)〜 （10) のいずれかの （A)に記載の蛋白質の変 異または発現量と、 （2)または （3)〜 （10) のいずれかの （B) に記載の 蛋白質の変異または発現量とを比較することを特徴とする疾患の判定方法
(40) 疾患が、 異常な細胞増殖を伴う疾患、 血管障害を伴う疾患、 骨代謝の異 常を伴う疾患、 ィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 異常な骨格筋細胞の分ィヒ増殖を伴う 疾患、 胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾 患である、 （38) または （ 39 )に記載の判定方法。
(41) 異常な細胞増殖を伴う疾患が、 急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大 腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋腫、 悪性腫瘍または固形腫瘍であり、 血管 障害を伴う疾患が心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高脂 血症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症 症候群、 血栓性血小板減少性紫斑病、 虚血性心疾患、 虛血性脳疾患、 心不全、 うつ血または脈絡膜循環障害であり、 骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であ り、 インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、 末 端肥大症または小児慢性腎不全であり、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾 患が動脈硬化、 気管支疾患または再狭窄であり、 異常な骨格筋細胞の分化増殖 を伴う疾患が重症筋無力症であり、 胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、 異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、 慢性 B型肝炎、 慢性関 節リウマチ、 敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過 敏または自己免疫疾患である、 （40)に記載の判定方法。
(42) 判定方法が、以下の（A)または（B)に記載の方法によるものである、 (38)〜 （41)のいずれか 1項に記載の判定方法。
(A) (36) または （37)に記載の検出方法
(B) (32)、 (34) または （35)に記載の検出または定量方法
(43) (1) 〜 （12) のいずれか 1項に記載の蛋白質またはポリペプチドを 含有する医薬。
(44) (13)〜 （16) のいずれか 1項に記載の DNA、 または （33)に記 載のォリゴヌクレオチド若しくはォリゴヌクレオチド誘導体を含有する医薬。
(45) 医薬が、 遺伝子予防用べクタ一または遺伝子治療用ベクターである、 （ 44)に記載の医薬。
(46) (23) 〜 （25) および （28) 〜 （31)のいずれか 1項に記載の 抗体を含有する医薬。 .
(47) 医薬が、 異常な細胞増殖を伴う疾患、 血管障害を伴う疾患、 骨代謝の異 常を伴う疾患、 ィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う 疾患、 胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾 患に対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 （43)〜 （46 )に記載の医 薬。
(48) 異常な細胞増殖を伴う疾患が急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸 癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋腫、 悪性腫瘍または固形腫瘍であり、 血管障 害を伴う疾患が心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高脂血 症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症症 候群、 血栓性血小板減少性紫斑病、 虚血性心疾患、 虚血性脳疾患、 心不全、 う つ血または脈絡膜循環障害であり、 骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であり、 ィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、 末端肥 大症または小児慢性腎不全であり、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患が 動脈硬化、 気管支疾患または再狭窄であり、 異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴 う疾患が重症筋無力症であり、 胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、 異 常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、 慢性 B型肝炎、 慢性関節 リゥ'マチ、 敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 ィンスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外 傷性悩損傷、 炎症性腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過敏 または自己免疫疾患である、 （47)に記載の医薬。
(49) (i) (1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質を発現する細胞 での該蛋白質の発現量と、 （ii) 該蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触さ せた場合の該蛋白質の発現量とを比較し、 被験試料より （1) ~ (10) のい ずれか 1項に記載の蛋白質の発現量を制御する化合物を選択することを特徴と する、 （1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質の発現量を制御する化 合物のスクリ一ニング方法。
(50) (i) (1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質を発現する該細 胞の機能と （ii)該蛋白質を発現する細胞と被検試料を接触させた場合の該細 胞の機能とを比較し、 被験試料より （1) 〜 （10)のいずれか 1項に記載の 蛋白質の機能を制御する化合物を選択することを特徴とする、 （1)〜 （10 ) のいずれか 1項に記載の蛋白質の機能を制御する化合物のスクリ一ニング方 法。
(51) (1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の 転写を制御する領域の下流にレポ一夕一遺伝子の連結された DN Aを含むブラ スミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させ、 被験試料より （ 1)〜 （10)に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御する化合物を選 択することを特徴とする、 （1 ) 〜 （1 0 ) のいずれか 1項に記載の蛋白質を コ一ドする遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニング方法。
(52) ( 1 ) 〜 （1 0 ) のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞を用い、 該 蛋白質を発現する細胞と被検試料を接触させた場合の、 （ i ) 該細胞での （ 1 ) または （3 ) 〜 （1 0 ) のいずれかの （A) に記載の蛋白質の発現量と、 （ii )該細胞での （2 )または （3 ) 〜 （： L 0 ) のいずれかの （B ) に記載の蛋白質 の発現量とを比較し、 被検試料より （1 ) 〜 （1 0 ) のいずれか 1項に記載の 蛋白質をコ一ドする遺伝子のスプライシングを制御する化合物のスクリーニン グ方法。
(53) ( 4 9 ) 〜 （5 2 ) のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法により 得られる化合物またはその薬理学的に許容される塩。
(54) ( 5 3 )に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有する医 薬。
(55) 医薬が、 異常な細胞増殖を伴う疾患、 血管障害を伴う疾患、 骨代謝の異 常を伴う疾患、 ィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う 疾患、 胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾 患に対する予防薬または治療薬である、 （ 5 4 )に記載の医薬。
(56) 異常な細胞増殖を伴う疾患が急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸 癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋腫、 悪性腫瘍または固形腫瘍であり、 血管障 害を伴う疾患が心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高脂血 症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症症 候群、 血栓性血小板減少性紫斑病、 虚血性心疾患、 虚血性脳疾患、 心不全、 う つ血または脈絡膜循環障害であり、 骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であり、 ィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、 末端肥 大症または小児慢性腎不全であり、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患が 動脈硬化、 気管支疾患または再狭窄であり、 異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴 う疾患が重症筋無力症であり、 胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、 異 常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、 慢性 B型肝炎、 慢性関節 リウマチ、 敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外 傷性悩損傷、 炎症性腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過敏 または自己免疫疾患である、 （ 55 )に記載の医薬。
(57) (1) 〜 （12) のいずれか 1項に記載の蛋白質またはポリペプチドと 被検試料を接触させ、 被検試料より該蛋白質またはポリぺプチドと特異的に結 合する物質を選択することを特徴とする、 （1) 〜 （12) のいずれか 1項に 記載の蛋白質またはポリべプチドと特異的に結合する物質のスクリーニング方 法。
(58) ( 57 )に記載のスクリーニング法により得られる （1) 〜 （： 12) のい ずれか 1項に記載の蛋白質またはポリペプチドと特異的に結合する物質。
(59) (1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の 発現が低下または完全に抑制されたノックァゥト非ヒト動物。
(60) (1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の蛋白質の有する機能が低下ま たは完全に抑制されたノックアウト非ヒト動物。 本発明の蛋白質およびポリペプチドとしては、
(a) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するィンスリン様増殖因子結 合蛋白質
(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するィンスリン様増殖因子結 合蛋白質
(c) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ （a) に記載の蛋白質 と実質的に同一の活性を有する蛋白質 (d) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ （b) に記載の蛋白質 と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(Θ) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するァ ミノ酸配列からなり、 かつ （a) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有す る蛋白質
(f ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するァ ミノ酸配列からなり、 かつ （b) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有す る蛋白質
(g) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 75〜8 2番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、 かつ上記 (a) に記載 の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(h) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 75〜8 2番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、 かつ上記 （b) に記載 の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(i) 上記 （g) に記載の蛋白質を表すアミノ酸配列において、' 1以上のァ ミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ上記 （a) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
( j) 上記 （h) に記載の蛋白質を表すアミノ酸配列において、 1以上のァ ミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ上記 (b) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(k) 上記 （g) に記載の蛋白質を表すアミノ酸配列と 60%以上の相同性 を有するアミノ酸配列からなり、 かつ上記 （a) に記載の蛋白質と実質的に同 一の活性を有する蛋白質
(1) 上記 （h) に記載の蛋白質を表すアミノ酸配列と 60%以上の相同性 を有するアミノ酸配列からなり、 かつ上記 （b) に記載の蛋白質と実質的に同 一の活性を有する蛋白質
(m) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 171〜3 04番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、 かつ上記 （a) に記 載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(n) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 171〜1 97番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、 かつ上記 （b) に記 載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(o) 上記 （m) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠出、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ上記 （a) に記載の蛋白質 と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(P) 上記 （n) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠出、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ上記 （b) に記載の蛋白質 と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(q) 上記 （m) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ上記 （a) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有す る蛋白質
(r) 上記 （n) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ上記 （b) に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有す る蛋白質
(s) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 連続した少なくとも 5ァ ミノ酸以上のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(t ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 連続した少なくとも 5ァ ミノ酸以上のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(u) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号 171〜304番 において、 連続した少なくとも 5アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるポリべ プチド (v)配列番号 2で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号 17：!〜 197番 において、 連続した少なくとも 5アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるポリべ プチド
をあげることができる。
ィンスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーに属する因子は、 I G Fあるいはィンスリンと親和性を有する蛋白性の因子であり、 ィンスリン様増 殖因子結合モチーフ （IGFBPモチーフ） を有している。該モチーフはイン スリン様増殖因子結合蛋白質スーパ一ファミリ一に属する蛋白質の N末端部分 で保存されており、 Gly—Cys—Gly—Cys—Cys—X-X—Cy sで代表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の部分 （Xは任意のアミノ酸を表 す） をさす。
ィンスリン様増殖因子結合蛋白質スーパーファミリーに属する蛋白質では、 I GF BPモチーフを中心に少なくとも 10個のシスティン残基が保存されて おり、 I GFBPモチーフ部分を介して I GFあるいはインスリンに親和性を 示す。 配列番号 1で表されるアミノ酸配列においては、 アミノ酸番号 75〜8 2番で表されるァミノ酸配列、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列においては、 アミノ酸番号 75-82番で表されるアミノ酸配列が I GFBPモチーフであ る o
上述した配列番号 1、 または配列番号 2で表されるァミノ酸配列を有する蛋 白質と実質的に同一な活性を有する蛋白質としては、 配列番号 1、 または配列 番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と、 結合するインテグリン、 I GF、 インスリンまたは受容体等の蛋白質が同一である蛋白質があげられる。 実質的に同一とは、 活性が性質的に同一であることを示す。 したがって、 結合 活性の程度、 蛋白質の分子量などの量的要素は異なつていてもよい。
本発明の蛋白質である配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1以上の アミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白 質、 または配列番号 2で表されるァミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列番号 2で表される アミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以下、 モレキュラー 'クローニング第 2版と略す） ヽ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジーと略 す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 19, 6409(1982)、 Gene, M， 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, la, 4431 (1985) 、 Proc. Natl. Acad. Sci USA,823 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入 法を用いて、 例えば配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白 質をコードする D N Aに部位特異的変異を導入することにより取得することが できる。 欠失、 置換もしくは付加されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数 は特に限定されないが、 上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、 欠失、 置換もしくは付加できる程度の数であり、 例えば、 1〜数十個、 好まし くは 1〜2 0個、 より好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個であ る。 また、 本発明には、 このような人為的に作成した変異体のみならず、 自然 界において生じた変異体も含まれる。
配列番号 1または 2に記載のァミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の 活性を有するためには、 配列番号 1または 2に記載のアミノ酸配列と少なくと も 6 0 %以上、 好ましくは 7 0 %以上、 より好ましくは 8 0 %以上、 さらに好 ましくは 9 0 %以上、 特に好ましくは 9 5 %以上、 最も好ましくは 9 7 %以上 の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であることが好ましい。
ァミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるァルゴリズ ム BLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, , 5873(1993)] FASTA[Methods Enzymol.， , 63 (1990) ]を用いて決定することができる。 このアルゴリズム BLASTに基 づいて、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [ J. Mol . Biol . , m, 403(1990)] 。 BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合 には、パラメ一夕一は例えば Score = 100、 wordlength=12とする。 また、 BLAST に基づいて BLASTXによってァミノ酸配列を解析する場合には、 パラメ一夕一は 例えば score=50、 wordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを 用いる場合には、 各プログラムのデフォルトパラメ一夕一を用いる。 これらの 解析方法の具体的な手法は公知である （http：〃 ww.ncbi .nlm.nih.gov. ) 。
本発明の蛋白質は、 上記本発明の蛋白質のアミノ酸配列中の部分アミノ酸配 列を有する蛋白質であり、 かつ配列番号 1または 2に記載のアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質も含む。
配列番号 1または 2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の 活性を有するには、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番 号 7 5〜8 2番のアミノ酸配列、 または配列番号 2で表されるアミノ酸配列に おいて、 アミノ酸番号 7 5〜8 2番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列か らなる蛋白質であることが好ましい。
また該蛋白質に 1以上のァミノ酸の欠失、 置換または付加したアミノ酸配列 を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。 該蛋白質としては、 上述した周 知の部位特異的変異導入法により導入可能な数のアミノ酸が欠失、 置換または 付加した蛋白質であり、 かつ配列番号 1または 2に記載のアミノ酸配列を有す る蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をあげることができる。
本発明の蛋白質である配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列において 1以上のァミノ酸は欠失されたァミノ酸配列からなり、 かつ配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白 質としては、 例えば、 シグナルペプチドが除去された蛋白質をあげることがで さ 。 また、 上記 （g)、 (h)、 （m) または （n) に記載の蛋白質と 60%以 上の相同性を有し、 かつ配列番号 1または 2に記載のアミノ酸配列を有する蛋 白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。 配列 番号 1または 2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を 有するには、 （g)、 (h)、 （m) または （n) に記載の蛋白質のアミノ酸 配列との相同性が、 上記 BLAST等の解析ソフトを用いて計算したときに、 少なくとも 60 %以上、 好ましくは 70 %以上、 より好ましくは 80 %以上、 さらに好ましくは 90%以上、 特に好ましくは 95%以上、 最も好ましくは 9 7%以上である。
本発明のポリぺプチドとしては、 上記本発明の蛋白質を認識する抗体を作製 する際に抗原ポリぺプチドとして使用できるポリぺプチドであれば特に制限さ れないが、 具体的には配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列中の連線し た 5アミノ酸以上、 好ましくは 10アミノ酸以上、 より好ましくは 15ァミノ 酸以上のアミノ酸からなるポリペプチドをあげることができる。 特に、 配列番 号 1で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号 171〜304番、 および配列 番号 2で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号 171〜197番において連 続した 5アミノ酸以上、 好ましくは 10アミノ酸以上、 より好ましくは 15ァ ミノ酸以上のアミノ酸からなるポリペプチドは、 配列番号 1で表されるァミノ 酸配列からなる蛋白質と配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質と を区別できる抗体の作製に有用である。 本発明の DN Aとしては、
(1)配列番号 3の塩基配列を有する DNA
(2)配列番号 4の塩基配列を有する DN A
(3)上記定義した （a)、 （c) 、 (e) , (g) 、 （i) 、 （k)、 （m
)、 (o) または （q) に記載の本発明の蛋白質をコードする DNA (4)上記定義した （b)、 （d)、 （f) 、 （h)、 （j) 、 （1) 、 (n )、 （p) または （r) に記載の本発明の蛋白質をコードする DNA
(5) (3) に記載の DNA、 または配列番号 3で表される塩基配列の塩基番 号 177〜1088の塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下で ハイブリダィズし、 かつ配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と 実質的に同一な活性を有する蛋白質をコードする DN A
(6) (4) に記載の DNA、 または配列番号 4で表される塩基配列の塩基番 号 926〜 1516の塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下で ハイブリダィズし、 かつ配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と 実質的に同一な活性を有する蛋白質をコードする DNA
(7)上記定義した （s) または （u) に記載のポリペプチドをコードする D NA
(8)上記定義した （t ) または （V) に記載のポリペプチドをコードする D NA
をあげることができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、 例えば配列番 号 3または 4で表される塩基配列を有する] N Aなどの本発明の D N Aまたは その一部の DN A断片をプロ一ブとして、 コロニー ·ハイブリダィゼ一シヨン 法、 プラーク ·ハイブリダィゼ一シヨン法あるいはサザンプロットハイブリダ ィゼ一ション法等を用いることにより得られる D N Aを意味し、 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィル夕一を用いて、 0.
7〜1. 0 mo 1/Lの塩化ナトリウム存在下、 65 °Cでハイプリダイゼ一シ ヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶液 （1倍濃度の SSC溶液の組 成は、 15 Ommo 1ZL塩化ナトリウム、 15 mmo 1ノ Lクェン酸ナトリ ゥムよりなる） を用い、 65°C条件下でフィル夕一を洗浄することにより同定 できる DN Aをあげることができる。 ハイブリダィゼ一シヨンは、 モレキユラ 一 ·クロ一ニング第 2版、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー■ ノ、'ィォロジ一、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うこと ができる。 ハイブリダィズ可能な DNAとして具体的には、 例えば上記 BLA S T等の解析ソフ トを用いて計算したときに、 配列番号 3または 4で表される 塩基配列と、 少なくとも 60%以上の相同性を有する DNA、 好ましくは 70 %以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 特に好ま しくは 95%以上、 最も好ましくは 98%以上の相同性を有する DN Aをあげ ることができる。
上記 （7) および （8) に記載の DN Aは、 本発明のポリペプチドをコード する DNAであり、 該 DNAは、 本発明のポリペプチドの製造、 および配列番 号 3または 4で表される塩基配列のコード領域を含む D N Aの発現の検出また は発現量の測定に使用できる。 特に上記 （u) および （V) のポリペプチドを コードする D N Aは、 配列番号 3で表される塩基配列のコ一ド領域を含む D N Aと配列番号 4で表される塩基配列のコード領域を含む DN Aの発現量を比較 することによる、 配列番号 1に記載の蛋白質と配列番号 2に記載の蛋白質との 発現比が正常とは異なることを特徴とする疾病の診断に有用である。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1. 本発明の DN Aの調製
本発明の DNAは、 ヒト組織由来の mRNA、 例えばヒト小腸由来の mRN Aを単離し、 その cDNAライブラリ一を作製し、 次いで該 cDNAライブラ リ一をスクリーニングして目的のクローンを得ることにより調製することがで きる。
ヒト小腸 mRNAは、市販のもの (例えば、 Clontech社製）を用いてもよいし、 以下のごとくヒト小腸組織から調製してもよい。 後者の場合には、 まず、 小腸 組織から全 RNAを調整し、 該全 RNAから mRNAを単離することができる。 小腸組織から全 R NAを調製する方法としては、 チォシアン酸グァニジン— トリフルォロ酢酸セシウム法 〔Methods in Enzymology, Μ, 3 (1987)〕 、 酸 性チオシアン酸グァニジン · フエノール · クロ口ホルム （A G P C ) 法 〔 Analytical Biochemistry, , 156 (1987)、 実験医学， S, 1937 (1991)〕 な どがあげられる。 全 R NAから p o l y (A) + R NAとして mR NAを調製す る方法としては、 オリゴ （d T ) 固定化セルロースカラム法 （モレキュラー ' クローニング第 2版） 等があげられる。 あるいは、 Fast Track mRNA Isolation Kit ( Invitrogen社製) ヽ Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製 ) などのキヅトを用いることにより mR NAを調製することができる。
調製したヒト小腸組織 mR N Aから c D N Aライブラリ一を作製する。 c D NAライブラリ一作製法としては、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、 カレ ント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー 'バイオロジー等に記載された方 法、 あるいは市販のキヅ ト、 例えば Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies社製)、 ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE社製） を用いる方法などがあげられる。
c D NAライプラリーを作製するためのクローニングベクタ一としては、 大 腸菌 K12株中で自立複製できるものであれば、 ファージベクタ一、 プラスミ ドべ ク夕一等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express 〔STRATAGENE社、 Strategies, ί, 58 (1992)〕、 pBluescript II SK (+) (Nucleic Acids Research, II, 9494 (1989)〕、 Lambda ZAP II (STRATAGENE社製） 、 入 gtlO、 Agtll CDNA cloning, A Practical Approach, 1， 49 (1985)〕、 ATriplEx (Clontech社製 )、 入 ExCell (Pharmacia社製）、 pT7T318U (Pharmacia社製）、 pcD2〔Mol. Cell. Biol. , ， 280 (1983)〕 および pUC18〔Gene, 22, 103 (1985))等をあげること ができる。
宿主微生物としては、 エシュリヒア属 （Escherichia) に属する微生物、 特に エシュリヒア 'コ.リ (Escherichia coli、 以下、 「大腸菌」ともいう） に属する微 生物であればいずれでも用いることができる。 具体的には、 Escherichia, coli XLl-Blue MRF' 〔STRATAGENE社、 Strategies, 5, 81 (1992)〕ヽ Escherichia coli C600 CGenetics, , 440 (1954)〕、 Escherichia coli Y1088 (Science, 221, 778 (1983)〕、 Escherichia col i Y1090 fScience.222., 778 (1983)〕、 Escherichia coli NM522 〔J. Mol. Biol., L, 1 (1983)〕、 Escherichia coli K8Q2〔J. Mol. Biol.,lfi, 118 (1966)〕 およ 7 scherichia coli JM105 〔Gene, 2SL, 275 (1985) 〕等が用いられる。
この cDNAライブラリ一を、 そのまま以下の解析に用いてもよいが、 不完 全長 c D N Aの割合を下げ、 完全長 cDNAをできるだけ効率よく取得するた めに、 菅野らが開発したオリゴキャップ法！: Gene, 1 , 171 (1994)、 Gene, 2Μ, 149 (1997)、 蛋白質核酸酵素， 41, 603 (1996)、 実験医学， 11, 2491 (1993)、 cDNAクロ一ニング， 羊土社 （1996)、 遺伝子ライブラリ一の作製法， 羊土社 (1994)〕 を用いて調製した cDNAライブラリーを以下の解析に用いてもよい。 作製した cDNAライブラリーから各クローンを単離し、 それぞれのクロ一 ンについて cDN Aの塩基配列を末端から、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, Ί , 5463 (1977)〕 あるいは AB I PR I SM377 DN Αシークェンサ一 （PE Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、 該 DN Aの塩基配列を決定する。
それぞれの c D N Aの塩基配列が新規な配列を有しているかどうかは、 B L AS T等の相同性検索プログラムを用いて、 GenBank、 EMBLおよび D D B Jなどの塩基配列データベースを検索することにより、 デ一夕ベース中 の既存の遺伝子の塩基配列と完全に一致すると考えられるような明らかな相同 性を示す塩基配列がないことにより確認できる。
上記の方法で得られる新規な配列を含む c D N Aの塩基配列として、 例えば 配列番号 3および 4で表される塩基配列があげられる。 配列番号 3で表される塩基配列からなる D N Aを翻訳して得られる蛋白質 （ 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質） は、 BLAST 2 CNuc. Acid. Res., 2S, 3389 (1997)〕 を用いた相同性解析において、 IGFBPスー パ一フアミリーに属する蛋白質ヒト I GFBP— 7と 38%の相同性を有する c 配列番号 4で表される塩基配列からなる DN Aを翻訳して得られる蛋白質 （ 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質） は、 BLAST2を用い た相同性解析において、 I GF BPスーパ一ファミリ一に属する蛋白質ヒト I GFBP—7と 35%の相同性を有する。
I GFBPスーパ一フアミリ一においては、 I GFあるいはィンスリンとの 結合に重要なィンスリン様増殖因子結合モチーフ部分および I GFBPモチ一 フを中心とした少なくとも 10個のシスティン残基の位置が保存されているこ とが知られている。 配列番号 1および 2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白 質においても、 インスリン様増殖因子結合モチーフに相当する部分に、 代表的 なインスリン様増殖因子結合モチ一フである Gly— Cys— Gly— Cys -Cy s-X-X-Cy s (Xは任意のアミノ酸を示す） からなるアミノ酸配 列と非常に類似した Al a— Gl y— Gl y— Cy s— Cy s— Trp— G1 u_ Cysからなるアミノ酸配列が存在し、 このモチーフ部分を中心に 10個 のシスティン残基が I G F B Pスーパーファミリ一に属する因子間で保存され ている位置に存在する。 従って、 配列番号 1および配列番号 2で表されるアミ ノ酸配列からなる蛋白質が I GFBPスーパーファミリ一に属する蛋白質とし ての活性を有することがわかる。
I GFBPスーパーフアミリーに属する蛋白質と疾患の関係については、 急 性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋腫、 悪性腫瘍、 固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、 心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢 血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高旨血症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球体腎 炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症症候群、 血栓性血小板減少性紫斑病、 虚血 性心疾患、 虚血性脳疾患、 心不全、 うつ血、 脈絡膜循環障害等の血管障害を伴 う疾患、 骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、 小人症、 末端肥大症、 小児慢 性腎不全等のィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、 動 脈硬化、 気管支疾患、 再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 重 症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 胃潰瘍等の胃酸分泌 の異常を伴う疾患、 微生物感染、 慢性 B型肝炎、 慢性関節リウマチ、 敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性 腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過敏、 自己免疫疾患等の 異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等について報告があることから、 本発 明の蛋白質もまた、 上記疾患と関連がある蛋白質であることが予想される。 配列番号 3で表される塩基配列と配列番号 4で表される塩基配列の比較から、 配列番号 3と 4で表される塩基配列は同じ配列を共有していることが分かる。 このような場合、 これら分子が c D N Aライブラリ一作製の際に人工的に生じ たものではないことを確認するためには、 ヒトゲノムライブラリーを、 配列番 号 3または 4で表される塩基配列に特異的な配列を用いてスクリーニングし、 得られたゲノムクローンの塩基配列を決定することで判断することができる。 ヒトゲノムライブラリ一は市販のもの （例えば、 Research Genetics社製 B A Cライブラリー） を用いてもよいし、 ヒトの細胞や組織から自体公知の方法〔 Genomics, 29, 413 ( 1995)、 Genomics, 2Ά, 527 ( 1994)等に記載の方法〕 を用 いて調製してもよい。
ヒトゲノムライブラリ一を、 配列番号 3または 4で表される塩基配列に特異 的な配列を用いてスクリーニングする方法としては、 配列番号 3または 4で表 される塩基配列に特異的なプライマ一を用いた P C R法 〔PCR Protocols, Academic Press ( 1990)〕や、 配列番号 3または 4で表される塩基配列に特異的 なォリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブリダイゼーシヨンやプラークハ イブリダィゼ一シヨン法（モレキユラ一'クロ一ニング第 2版） などがあげられ る。
上記の方法で配列番号 3と配列番号 4で表される塩基配列の両方を含むゲノ ム D N Aクローン（例えば、 ヒトゲノム B A Cクローン）が得られる。 このゲノ ム D N Aの塩基配列を決定し配列番号 3および配列番号 4で表される塩基配列 と比較すると、 配列番号 3で表される塩基配列は 5つの部分に、 配列番号 4で 表される塩基配列は 7つの部分に別れて同一ヒトゲノム上に約 7 k bにわたつ て存在していることが分かる。 すなわち、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質は 5つのェクソンから、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を 有する蛋白質は Ίつのェクソンから構成されており、 それぞれの 2番目と 4番 目のェクソンは完全に一致していることが分かる。 しかしながら、 それぞれの 3番目のェクソンの始まりおよび 5番目のェクソンの終わりがお互いに異なつ ているために、 配列番号 1と 2の比較で観察されるアミノ酸配列の違いが生じ ていることが分かる。 したがって、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有す る蛋白質と配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質とは、 お互いに 異なるアミノ酸配列を持つというユニークな特徴を有した、 同じ遺伝子由来の それぞれ別のスブラィス形態の産物であることが分かる。
配列番号 3および 4で表される塩基配列からなる D N Aが一旦取得され、 そ の塩基配列が決定された後は、 該塩基配列の 5'端および 3'端の塩基配列に基づ いたプライマ一を調製し、 ヒトまたは非ヒト動物の小腸等の組織または細胞に 含まれる mR N Aから合成した c D N Aあるいは c D NAライブラリ一を錡型 として、 P C R法 〔PCR Protocols, Academic Press (1990)〕 を用いて D N A の増幅を行うことにより、 本発明の D N Aを取得することができる。
また、 配列番号 3および 4で表される D N Aの全長あるいは一部をプローブ として、 ヒトまたは非ヒト動物の小腸等の組織または細胞に含まれる mR NA から合成した c D N Aあるいは c D N Aライプラリーに対してコロ二一ハイブ リダイゼ一ションゃプラークハイプリダイゼ一シヨン （モレキュラー ·クロ一 ニング第 2版） を行うことにより、 本発明の DNAを取得することができる。 決定された DN Aの塩基配列に基づいて、 フォスフォアミダイ ト法を利用し たパーキン 'エルマ一社の D N A合成機 mode 1392等の D N A合成機で化学合成 することにより、 本発明の DNAを取得することもできる。
取得した DN Aについて、 該 DN Aを含む組換えベクターを宿主細胞に導入 して得られる形質転換体を用いて蛋白質を発現させることにより、 または該: D N Aがコードするアミノ酸配列とヒト IGFBP_1、 ヒト IGFBP— 2、 ヒト IGFBP— 3、 ヒト IGFBP— 4、 ヒト IGFBP— 5、 ヒト IGF BP— 6、 ヒト IGFBP— 7、 ヒト IGFBP— 8、 ヒト IGFBP— 9若 しくはヒト IGFBP— 10のアミノ酸配列との相同性およびシスティン残基 の位置を比較することにより、 該 DNAが I GFBPスーパ一フアミリーとし ての活性を有する蛋白質をコードする DN Aであることを確認することができ る。
配列番号 3および 4で表される塩基配列またはその断片の塩基配列に関する 情報に基づき、 常法または DNA合成機を用いることにより、 本発明の DNA の塩基配列、 例えば配列番号 3または 4で表される塩基配列のうち、 連続した 5〜60塩基、 好ましくは 10〜40塩基に相当する配列を有するオリゴヌク レオチドまたは該ォリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレ ォチド （以下、 アンチセンス 'オリゴヌクレオチドという） を調製することが ぎる。
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、 オリゴ DNA、 オリゴ RNA等のォ リゴヌクレオチド、 および該オリゴヌクレオチドの誘導体 （以下、 オリゴヌク レオチド誘導体という） 等があげられる。
該オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス ·オリゴヌクレオチドとして、 例 えば、 検出したい mRNAの一部の塩基配列において、 5'末端側の塩基配列に 相当するセンスプライマ一、 3'末端側の塩基配列に相当するアンチセンスブラ イマ一等をあげることができる。 ただし、 mR NAにおいてゥラシルに相当す る塩基は、 オリゴヌクレオチドプライマ一においてはチミジンとなる。
センスプライマ一およびアンチセンスプライマ一としては、 両者の融角军温度 ( T m) および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドで、 5〜 6 0塩基、 好ましくは 1 0〜 5 0塩基数のものがあげられる。
ォリゴヌクレオチド誘導体としては、 ォリゴヌクレオチド中のリン酸ジエス テル結合がホスフォロチォェ一ト結合に変換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3，一 P 5，ホスフォアミデ ート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリ ボースとリン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換されたォリゴヌクレ ォチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5プロピニルゥラシル で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5チアゾ一ルゥラシルで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 ォリゴヌ クレオチド中のシトシンが C— 5プロピニルシトシンで置換されたォリゴヌク レオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンがフヱノキサジン修飾シト シン （phenoxazine- modified cytosine)で置換されたォリゴヌクレオチド誘導 体、 オリゴヌクレオチド中のリボースが 2 '— 0—プロピルリポースで置換され たオリゴヌクレオチド誘導体、 あるいはォリゴヌクレオチド中のリボースが 2 ' —メ トキシェトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげ られる 〔細胞工学， , 1463 (1997)〕。
2 . 本発明の蛋白質またはポリペプチドの製造
本発明の蛋白質またはポリペプチドは、 モレキュラ一 'クロ一ニング第 2版 やカレント ·プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー■バイオロジー等に記載さ れた方法等を用い、 例えば以下の方法により、 本発明の D N Aを宿主細胞中で 発現させて、 製造することができる。
全長 c D N Aをもとにして、 必要に応じて、 該蛋白質をコードする部分を含 む適当な長さの D N A断片を調製する。
該 D N A断片、 または全長 c D N Aを適当な発現べクタ一のプロモー夕一の 下流に挿入することにより、 組換えべクタ一を作製する。
該組換えベクターを、 該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することに より、 本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的と する遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製可能な ヽしは染色体 中への組込が可能で、 本発明の蛋白質をコードする D N Aを転写できる位置に プロモー夕一を含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、 本発明の蛋白質をコード する D N Aを含有してなる組換えべクタ一は原核生物中で自立複製可能である と同時に、 プロモー夕一、 リボソーム結合配列、 本発明の蛋白質をコードする 遺伝子、 及び転写終結配列より構成されたベクターであることが好ましい。 プ ロモ—夕—を制御する遺伝子が含まれていてもよい。 発現ベクターとしては、 例えば、 pBTrp2、 pBTacK pBTac2 (いずれもべ一リ ンガーマンハイム社より巿販）、 PKK233- 2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen 社製）、 pGEMEX- 1 (Promega社製）、 pQE- 8 (QIAGfEN社製）、 ρΠΡΙΟ (特開昭 58- Π0600 ) 、 pKYP200 Agricultural Biological Chemistry54S, 669 (1984)〕、 pLSAl
CAgric. Biol. Chem. , SS, 277 (1989)〕、 pGELl 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, S2， 4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-) ( Stratagene社製）、
Figure imgf000035_0001
coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) より調製〕、 pTrs32 rEscherichia mli J 109/pTrS32 (FEM BP-5408) より調製〕、 pGHA2 rEscherir.hia coli IGHA2 ( FERM B-400) より調製、 特開昭 60-221091〕、 pGKA2 CEscherinhia £fili IGKA2
(FERMBP-6798) より調製、特開昭 60-221091〕、 Term2 (US4686191 US4939094
、 US5160735)、 pSupexヽ pUB110s pTP5ヽ pC194、 pEG400〔J. Bacteriol. ,112, 2392 (1990)〕 、 pGEX (Pharmacia社製） 、 pETシステム （Novagen社製） 、 pSupex等を あげることができる。
プロモ一夕一としては、 宿主細胞中で機能するものであればいかなるもので もよい。例えば、 ICEプロモ一夕一（PTRP)、 1 プロモー夕一、 PLプロモーター、 PRプロモータ一、 T7プロモー夕一等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモ一 夕一をあげることができる。 また PTRPを 2つ直列させたプロモ一夕一 （Ptrp x 2 ) 、 tacプロモ一夕一、 lacT7プロモ一夕一、 let Iプロモ一夕一のように人為的に 設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソ一ム結合配列であるシャイン一ダルガノ （ Shine- Dalgarno) 配列と開 始コドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜； 18塩基） に調節したプラスミ ドを用 いることが好ましい。
本発明の蛋白質をコードする部分の塩基配列を、 宿主の発現に最適なコドン となるように、 塩基を置換することにより、 目的とする蛋白質の生産率を向上 させることができる。
本発明の組換えべクタ一においては、 本発明の D N Aの発現には転写終結配 列は必ずしも必要ではないが、 構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置するこ とが好ましい。
宿主細胞としては、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 ブレビパク テリゥム属、 コリネバクテリウム属、 ミクロバクテリウム属、 シュ一ドモナス 属等に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XL1 - Blueヽ Escherichia coli XL2-Blues Escherichia ool i M1、 Escherichia coli MC1000 Escherichia col i KY3276s Escherichia £oli W1485, Escherichia coli ,誦 9、 Escherichia col i HB101、 Escheri chia coli No.49、 Escherichia coli W3110、 Escherichia col i NY49、 Serratia fkaniaヽ Serratia. fonticola, Serrat a. liauefaciens. Serratia marcescens. Bacillus subtil is, Rao il l us amvloliaiiefaninfts. BrevibaRteriiim iitmia op i lum ATCCUOfiR、 Brevibanterium saceharolvtimim ATHH nfifi . Rrevibactftrtmn ΠΜΙΜ ATCC14067 、 Brevibacteriiim ammoniagenes 、 Brevibac erium lactofermentuni ATCC13869、 Corynebacterium glutamic™ ATCC13032 s Corynebacterium acetoaoidophi Inm ATCC13870S MiorobacteriiiTn ammoriaphi lum ATCC1 354, Pseudomonas sp. D- 0110等をあげることができる。 組換えべク夕一の導入方法としては、 上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法 であればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法
CProc. Natl. Acad. Sci. USA, ， 2110 (1972)〕 、 プロトプラスト法 （特開 昭 63-248394) 、 または Gene， II， 107 (1982 )や Molecular & General Genetics, lS , 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YEP13
(ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 等をあげることがで きる。
プロモ一夕一としては、 酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモ一夕 一、 P H O 5プロモーター、 P G Kプロモーター、 GA Pプロモー夕一、 AD Hプロモー夕一、 gal 1プロモータ一、 gal 10プロモ一夕一、 ヒートショック蛋 白質プロモ一夕一、 MF 1 プロモ一夕一、 CUP 1プロモー夕一等をあげることが できる。
宿主細胞としては、 サッカロミセス属、 クリュイべ口ミセス属、 トリコスポ ロン属、 シュヮニォミセス属等に属する微生物、 例えば、 Saccharomyces cerevisia ScM zosaccharomyces uombe、 KluvveromyceR lactiss Trichosporon nlllllanss Schwanniomyces alluidim等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 酵母に： D N Aを導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 エレクトロボレ一シヨン法 〔Methods.
Enzymol. , , 182 (1990)〕、 スフエロプラスト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, M, 1929 (1978)〕、 酢酸リチウム法 〔J. Bacteriology, ， 163 (1983) 〕 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, IS, 1929 (1978)記載の方法等をあげること ができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 pcD NAI、 pcDM8 (フナコシ社製）、 pAGE107〔特開平 3- 22979； Cytotechnology, 2， 133，（1990)〕、 pAS3-3 (特開平 2- 227075)、 pCDM8 (Nature, , 840, (1987) 〕 、 pcDNAI/Amp (Invitrogen社製） 、 pREP4 (Invitrogen社製） 、 pAGE103 CJ. Biochemistry, lfll, 1307 (1987)〕 、 pAGE210等をあげることができる。 プロモーターとしては、 動物細胞中で機能するものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺伝子のプロモ一夕一、 SV40の初期プロモ一夕一、 レトロウイルスのプロモー 夕一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショックプロモ一夕一、 SRひ プロモー夕一等をあげることができる。 また、 ヒト CMVの I E遺伝子のェン ハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒトの細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞 である COS細胞、 チャイニーズ 'ハムス夕一の細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特 開昭 63-299) 等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に DN Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、 例えば、 エレク トロボレ一シヨン法 〔 Cytotechnology, , 133 (1990)) 、 リン酸カルシウム法 (特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, βέ, 7413 (1987)〕 等をあ げることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばカレント 'プロトコールズ ' ィン · モレキュラー■ノ、、ィォロシ一、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)ヽ Bio/Technology, £， 47 (1988)等に記載された方法によって、 タンパク質を発 現することができる。 即ち、 組換え遺伝子導入べクタ一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導 入して昆虫細胞培養上清中に組換えゥィルスを得た後、 さらに組換えウィルス を昆虫細胞に感染させ、 タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 pVL1392、 PVL1393, pBlueBacI I I (ともに Invitorogen社製) 等をあげることができる。 バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであ るァゥトグラファ ·力リフォルニ力 ·ヌクレア一 ·ポリへドロシス .ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus )等を用いることができ る。
昆虫細胞としては、 Spodoptera fni iEerdaの卵巣細胞である Sf9、 Sf21 〔 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York ( 1992)〕、 Tri choplusia niの卵巣細胞である High 5 ( Invitrogen社製） 等を用いることができる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べク 夕一と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシゥ ム法 （特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨン法 〔ΡΓΟ(Ϊ . Natl . Acad. Sci . USA, ， 7413 ( 1987)〕 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 T iプラスミ ド、 タバコモザイクウィルスベクタ一等をあげることができる。 プロモーターとしては、 植物細胞中で機能するものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 35Sプロモ一 夕一、 ィネアクチン 1プロモー夕一等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 アブ ラナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞等をあげること ができる。
組換えべクタ一の導入方法としては、 植物細胞に D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテリゥム (Agrobacterium ) (特開昭 59- 140885、 特開昭 60- 70080、 W094/00977) 、 エレクトロポレ一ショ ン法 （特開昭 60- 251887) 、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （特許 第 2606856、 特許第 2517813) 等をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞を宿主細胞として用いた場合には、 糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質またはポリぺプチドを得ることができる。 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中に本発明の 蛋白質またはポリべプチドを生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 本発明の蛋白質またはポリぺプチドを製造することができる。 本発明の形質転 換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行 うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転 換体を培養する培地としては、 該生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類 等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成 培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、 該生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラ クトース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加 水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパ ノ一ルなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、' アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸 アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム 塩、 その他の含窒素化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コ 一ンスチ一プリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マン癌、 硫酸 銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培養温度は 1 5〜4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 1 6時間〜 7日間である。 培養中の p Hは 3 . 0〜9 . 0に保持する。 p Hの調整は、 無機または有機の 酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。 また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質 を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えべクタ—で形質転 換した微生物を培養するときには、 必要に応じてインデュ一サーを培地に添カロ してもよい。例えば、 laaプロモー夕一を用いた組換えべクタ一で形質転換した 微生物を培養するときにはイソプロピル一/?— D—チォガラクトビラノシド等 を、 ireプロモーターを用いた組換えべクタ—で形質転換した微生物を培養する ときにはィンドールァクリル酸等を培地に添カ卩してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている RPMI1640培地 〔The Journal of the American Medical Association,^, 519 (1967)〕 、 Eagleの MEM培地 (Science, 501 (1952) 〕、ダルベッコ改変 MEM培地!: Virology, S, 396 (1959)〕、 1 9 9培地!: Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 11, 1 (1950)〕 またはこれら 培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 6〜 8、 3 0〜 4 0。 5 %C02存在下等の条件下で 1〜 7 日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている TM- FH培地 （Pharmingen社製）、 Sf-900 II SFM培地 （Life
Technologies社製） 、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製） 、 Grace' s Insect Medium 〔 Grace, T.C.C. , Nature, IBS, 788 (1962)〕 等を用 いることができる。
培養は、 通常 p H 6〜7、 2 5〜3 0 °C等の条件下で、 1〜5日間行う。 また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加して もよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、 細胞として、 または植物の細 胞ゃ器官に分化させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地と しては、 一般に使用されているムラシゲ 'アンド .スク一グ (MS)培地、 ホワイ ト（White)培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイ トカイニン等、 植物ホル モンを添カ卩した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 5〜9、 2 0〜4 0 °Cの条件下で 3〜6 0日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質 を培地に添カ卩してもよい。
上記のとおり、 本発明の蛋白質またはポリペプチドをコードする D N Aを組 み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、 動物細胞、 あるいは植物細胞由 来の形質転換体を、 通常の培養方法に従って培養し、 該蛋白質またはポリぺプ チドを生成蓄積させ、 該培養物より該蛋白質またはポリべプチドを採取するこ とにより、 該蛋白質またはポリペプチドを製造することができる。
本発明の蛋白質またはポリペプチドの生産方法としては、 宿主細胞内に生産 させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、融合蛋白質として生産させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用する宿主細胞や、 生産 させる蛋白質の構造を変えることにより、 該方法を選択することができる。 本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポ —ルソンらの方法 〔J. Biol. Chem. , 2 , 17619 (1989)〕 、 ロウらの方法 [； Proc. Natl. Acad. ScL , USA, , 8227 (1989)、 Genes Develop. , i, 1288 (
1990)〕、 または特開平 5-336963、 W094/23021等に記載の方法を準用することに より、 該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 本発明の蛋白質の活性部位を含む 蛋白質の手前にシグナルぺプチドを付加した形で発現させることにより、 本発 明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、 特開平 2- 227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵 素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる c さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺伝子が導入された動物個体 （トランスジヱニック非ヒト動物） または植物個 体 （トランスジヱニヅク植物） を造成し、 これらの個体を用いて本発明の蛋白 質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育 または栽培し、 該蛋白質を生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該蛋 白質を採取することにより、 該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、 例えば公知の方 法〔American Journal of Clinical Nutrition, fiS, 639S ( 1996)ヽ American Journal of Clinical Nutrition, Ά, 627S (1996)、 Bio/Technology, S， 830 (1991)〕 に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法が あげられる。
動物個体の場合は、 例えば、 本発明の蛋白質をコードする D N Aを導入した トランスジエニック非ヒト動物を飼育し、 該蛋白質を該動物中に生成'寧積さ せ、 該動物中より該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を製造することが できる。 該動物中の生成 ·蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク （特開 昭 63-309192)、卵等をあげることができる。 この際に用いられるプロモー夕一 としては、 動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、 例 えば、 乳腺細胞特異的なプロモ一夕一である カゼインプロモ一夕一、 5カゼ インプロモーター、 ?ラクトグロブリンプロモーター、 ホエー酸 I1生プロテイン プロモー夕一等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、 例えば本発明の 蛋白質をコードする D NAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法 〔 組織培養， 2Q ( 1994)、 組織培養， 21 (1995)、 Trends in Biotechnology, 1^， 45 (1997)〕 に準じて栽培し、 該蛋白質を該植物中に生成 -蓄積させ、 該植物中よ り該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を生産する方法があげられる。 本発明の形質転換体により製造された蛋白質は、 例えば本発明の蛋白質が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回 収し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波破砕機、 フレンチプレス、 マントンガウ リンホモゲナイザ一、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、 通常の酵素の単 離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による 沈殿法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) —セファロ一ス、 DIAION HPA- 75 (三菱 化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose π (Pharmacia社製） 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 プチルセファロース、 フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマ トグラフィ一法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一法、 クロマトフオーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法 を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができる。
. また、 該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞を 回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分として蛋白質の不溶体を 回収する。 回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液 を希釈または透析することにより、 該蛋白質を正常な立体構造に戻した後、 上 記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合 には、 培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収すること ができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理するこ とにより可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記と同様の単離精製法を 用いることにより、 精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、 例えば、 配列番号 1または配列番 号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、 本発明の蛋白質は、 F m o c法 （フルォレニルメチルォキシカルボ二 ル法） 、 t B o c法 （t—プチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法によつ ても製造することができる。 また、 Advanced ChemTech社、 パ一キン 'エルマ一 土、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument^ Synthecelト Vega社、 PerSeptive社、 島津製作所等のぺプチド合成機を利用して化学合成することも できる。
3 . 本発明の蛋白質を認識する抗体の調製
本発明の蛋白質、 またそれら蛋白質の部分断片ポリペプチドの精製標品、 あ るいは本発明の蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用 いることにより、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体等、 本発明の蛋白 質を認識する抗体を作製することができる。
( 1 ) ポリクロ一ナル抗体の作製
本発明の蛋白質、 またそれら蛋白質の部分断片ポリペプチドの精製標品、 あ るいは本発明の蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用 い、 動物に投与することによりポリクロ一ナル抗体を作製することができる。 投与する動物として、 ゥサギ、 ャギ、 ラット、 マウス、 ハムスター等を用い ることができる。
該抗原の投与量は動物 1匹当たり 5 0〜1 0 0 gが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、 ペプチドをスカシガイへモシァニン （keyhole limpet haemocyanin) ゃ牛チ口グロブリンなどのキヤリァ蛋白に共有結合させ たものを抗原とするのが望ましい。 抗原とするペプチドは、 ペプチド合成機で 合成することができる。
該抗原の投与は、 1 回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜1 0回行う。 各投 与後、 3〜 7日目に眼底静脈叢より採血し、 該血清が免疫に用いた抗原と反応 することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法 （E L I S A法） ：医学書院刊 ( 1976) Antibodies-A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory (1988)
〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、 その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物 より血清を取得し、 該血清を分離、 精製することによりポリクロ一ナル抗体を 取得することができる。
分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 4 0〜 5 0 %飽和硫酸アンモニゥ ムによる塩析、 力プリル酸沈殿 CAntibodies, A Laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕、 または D E A E—セファロ一スカラム、 陰ィォ ン交換カラム、 プロティン Aまたは G—カラムあるいはゲル濾過カラム等を用 いるクロマトグラフィー等を、 単独または組み合わせて処理する方法があげら れ 。
( 2 ) モノクローナル抗体の作製
( a) 抗体産性細胞の調製
免疫に用いた本発明の蛋白質の部分断片ポリペプチドに対し、 その血清が十 分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後 3〜 7日目に、 脾臓を 摘出する。
該脾臓を ME M培地（日水製薬社製）中で細断し、 ピンセットでほぐし、 1， 2 0 0 r p mで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス—塩化アンモニゥム緩衝液 （p H 7 . 6
5 ) で 1〜2分間処理し赤血球を除去した後、 M E M培地で 3回洗浄し、 得ら れた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。 (b)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、 マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。 例えば、 8—ァザグァニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8-Ul( 以下、 P 3 -U 1と略す） CCurr. Topics. Microbiol. Immunol., ， 1 (1978) 、 Europ. J. Immunol., fi, 511 (1976)〕、 SP2/0- Agl4(SP- 2) (Nature, m, 269 (1978) P3-X63-Ag8653(653)CJ. Immunol., m 1548 (1979)〕、P3- X63- Ag8(X63) CNature, , 495 (1975)〕 等を用いることができる。 これらの細胞株は、 8 ―ァザグァニン培地 〔RPMI— 1640培地にグルタミン （ 1. 5 mm 01 /L)、 2一メルカプトエタノール ( 5 X 10"5mo 1/L)、 ジェンタマイシ ン （10〃g/ml) および牛胎児血清 （FCS) (CSL社製、 10%) を 加えた培地 （以下、 正常培地という） に、 さらに 8—ァザグァニン （1 /ml) を加えた培地〕 で継代するが、 細胞融合の 3〜4日前に正常培地で培 養し、 融合には該細胞を 2 X 107個以上用いる。
(c) ハイプリ ドーマの作製
(a) で取得した抗体産生細胞と （b) で取得した骨髄腫細胞を MEM培地 または PBS (リン酸ニナトリウム 1. 83g、 リン酸一カリウム 0. 2 lg、 食塩 7. 65g、 蒸留水 1リットル、 pH7. 2)でよく洗浄し、 細胞数が、 抗体産生細胞：骨髄腫細胞 = 5〜： ί 0 ： 1になるよう混合し、 1 , 200 r ρ mで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、 該細胞群に、 攪拌しながら、 37
°Cで、 108抗体産生細胞あたり、 ポリエチレングライコ一ルー 1000 (PE
G— 1000) 2 g、 MEM 2mlおよびジメチルスルホキシド （DMSO)
0. 7mlを混合した溶液を 0. 2〜lml添加し、 さらに 1〜2分間毎に M
EM培地l〜2mlを数回添加する。 添加後、 MEM培地を加えて全量が 5
0 mlになるように調製する。 該調製液を 900 rpmで 5分間遠心分離後、 上清を捨てる。 得られた沈殿画分の細胞を、 ゆるやかにほぐした後、 メスピぺ ットによる吸込み、 吹出しでゆるやかに HAT培地 〔正常培地にヒポキサンチ ン （ 10—4mo 1/L)、 チミジン （ 1. 5x10"5mo 1/L) およびァミノ プテリン （4 X 10—7mo 1/L) を加えた培地〕 10 Oml中に懸濁する。 該懸濁液を 96穴培養用プレートに 10 穴ずつ分注し、 5%( 02ィ ンキュベ一夕一中、 37 °Cで？〜 14日間培養する。
培養後、 培養上清の一部をとりアンチボディィズ 〔Antibodies， A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕 等に述べられ ている酵素免疫測定法により、 本発明の蛋白質の部分断片ポリペプチドに特異 的に反応するハイプリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、 以下の方法をあげることができる。
免疫の際、 抗原に用いた本発明の蛋白質の部分断片ポリべプチドを適当なプ レートにコートし、 ハイプリ ドーマ培養上清もしくは後述の （d) で得られる 精製抗体を第一抗体として反応させ、 さらに第二抗体としてピオチン、 酵素、 化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスィム ノグロプリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、 本発明の 蛋白質に特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイ プリ ド一マとして選択する。
該ハイプリ ドーマを用いて、 限界希釈法によりクロ一ニングを 2回繰り返し 〔1回目は、 HT培地 （HAT培地からアミノプテリンを除いた培地） 、 2回 目は、 正常培地を使用する〕 、 安定して強い抗体価の認められたものを本発明 のモノクローナル抗体を産生するハイプリド一マ株として選択する。
(d) モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理 〔2, 6, 10, .14—テトラメチルペン夕デカン （Pr i s t ane) 0. 5mlを腹腔内投与し、 2週間飼育する〕 した 8〜10週令 のマウスまたはヌ一ドマウスに、 （c) で取得した本発明の蛋白質モノクロ一 ナル抗体産生ハイプリ ドーマ細胞 5〜20 X 106細胞/匹を腹腔内に ¾射する。 1 0〜2 1日間でハイプリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、 3 0 0 0 r p mで 5分間遠心分離 して固形分を除去する。
得られた上清より、 ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクロー ナル抗体を精製、 取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、 マウスモノクローナル抗体タイピングキヅトま たはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。 蛋白質量は、 ローリ一法あるいは 2 8 O nmでの吸光度より算出する。
4 . 本発明の D NA、 蛋白質または抗体の利用
( 1 ) 本発明の蛋白質をコードする D NAの発現を検出 '定量することによる 疾患の判定方法
本発明の D NAまたはオリゴヌクレオチドを用い、 ノーザンハイプリダイゼ
—シヨン法 （モレキュラー 'クロ一ニング第 2版） 、 P C I 去および R T ( reverse-transcribed)— P C R法〔ともに PCR Protocols、 Academic Press (1990)
〕 （以上、 併せて P C R法ともいう） 等を行い、 本発明の蛋白質をコードする
D N Aの発現を検出することで、急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋腫、 悪性腫瘍、 固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴 う疾患、 心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 髙脂血症、 糖 尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症症候群、 血栓性血小板減少性紫斑病、 虚血性心疾患、 虚血性脳疾患、 心不全、 うつ血、 脈絡膜循環障害等の血管障害を伴う疾患、 骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾 患、 小人症、 末端肥大症、 小児慢性腎不全等のインスリン様増殖因子や成長ホ ルモン作用の障害を伴う疾患、 動脈硬化、 気管支疾患、 再狭窄等の異常な平滑 筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖 を伴う疾患、 胃潰瘍等の胃酸分泌の異常を伴う疾患、 微生物感染、 慢性 B型肝 炎、 慢性関節リウマチ、 敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿 病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉 症、 気道過敏、 自己免疫疾患等の異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の
I G F B Pスーパ一ファミリ一に属する蛋白質の関与の報告がある疾患の判定 を行うことができる。
RT-P C R法は簡便な方法であるため、 D N Aの発現の検出法として特に 有用である。
例えば、 配列番号 3で表される塩基配列中の連続した 100〜 1772塩基 と同じ配列を有する DNA、 または該 DNAと相補的な配列を有する DNA、 または配列番号 4で表される塩基配列中の連続した 100〜2698塩基と同 じ配列を有する DNA、 または該 DNAと相補的な配列を有する DNAをプロ —プとしてノ一ザンハイプリダイゼ一ションを行い、 配列番号 3または 4に記 載の D N Aの発現量を定量し、 健常者と比較することにより上記疾患を判定す ることができる。
該判定の具体的方法として、 例えば、 以下の方法をあげることができる。 被検者および健常者の白血球細胞または組織由来全 RNA ( 10〜2
) 、 またはそれらの mRNA (l〜5 zg) を、 変性溶液 〔50% (v/v) ホルムアミド、 2. 2mo 1/Lホルムアルデヒド、 20mmol/L MOP S [3— (N—モルホリノ） プロパンスルホン酸] (PH7. 0) 、 5mmo 1/L 酢酸ナトリウム、 ImmolZL EDTA〕 中、 65°Cで 5分間加熱 し、 変性させ、 2. 2mo 1/L ホルムアルデヒドを含む 1 %ァガロースゲル で電気泳動する。
電気泳動後、ゲル中の R N Aをニトロセルロースフィル夕一（ Opt imal BA- S85； Schleicher & Schuell社製)上にプロッティングし、 減圧下 80°Cで 1時間加熱 し固定ィ匕する。
該フィルタ一をハイプリダイゼーシヨン溶液 〔5xSSPE (75 Ommo
1/L NaC 1, 5 Ommo 1/L NaH2P04、 5mmo 1/L EDTA ； pH7. 4) 、 5xデンハルト溶液 （0. 1%フイコール、 0. 1%ポリビ ニルピロリ ドン、 0. 1%ゥシ血清アルブミン） 、 1%SDS (ドデシル硫酸 ナトリウム） 、 0. 2 mg/mlのサケ精子 DN A (Pharmacia Biotech社製）〕 中に浸漬しプレハイブリダイゼーションを行う。
プレハイブリダイゼ一シヨン後、 該溶液にプローブを添加し、 65°Cでハイ ブリダイゼーシヨンを行う。
プローブとしては、 例えば配列番号 3に記載の D N A断片または配列番号 4 に記載の D N A断片をマルチプライム D N A標識システム （アマシャム社製） を用いて32 Pで標識したものを使用できる。
ハイブリダイゼーション後のフィルターを、 以下の順で洗浄する。
(a) 0. 1%SDSを含む 2XSSC (30 Ommo 1/L NaCl、 30 mmo 1/L クェン酸ナトリウム） 溶液中、 室温で 15分間洗浄する。 これを 数回繰り返す。
(b) 0. 1%SDSを含む 1 xS SC ( 15 Ommo 1/L NaCl、 15 mmo 1/L クェン酸ナトリウム）溶液中、 50〜 70 °Cで 15分間洗浄する。 これを数回繰り返す。
(c) 50〜70°〇の0. 1%303を含む0. lxSSC ( 15mmo 1/ L NaCl、 1. 5 mmo 1/L クェン酸ナトリウム） 溶液中、 50〜70 °Cで 15分間洗浄する。 これを数回繰り返す。
フィル夕一洗浄後、 ィメ一ジングプレ一トを用いてオートラジオグラフィ一 を行い、 バイオイメージングアナライザー BAS 2000 (富士写真フィルム 社製） で配列番号 3または 4に記載の D N Aの発現を検出し定量することがで きる。
また、 例えば、 本発明の蛋白質をコードする DNAに特異的な 1組のオリゴ ヌクレオチドをプライマ一として用い、 被検者および健常者の白血球細胞また は組織由来全 RNA、 それらの mRNAまたはこれら RNAから調製した cD NAを鎵型として P C Rを行い、 増幅断片を検出 ·定量し、 被験者と健常者の 該 D N Aの発現量を比較することにより上記疾患を判定することができる。 ォリゴヌクレオチドとしては、 本発明のォリゴヌクレオチドを用いることが できる。
P C Rの錡型となる mR N Aまたは全 R N Aは、 血液より分離 ·取得した各 種白血球細胞から、 または組織としては疾患の疑いがある組織等から抽出でき る ο
各白血球細胞としては、 多形核白血球、 単球、 リンパ球、 T細胞、 B細胞等 をあげることができる。
多形核白血球および単核球は、 被検者の末梢血より、 ナイコメッド ·ファー マ（Nycomed Pharma)社製のキットである Polymorphprep™を用いることにより、 分離 '取得することができる。
取得した単核球より、 J. Immunol. , 1 , 706 (1983)等に記載の方法により、 単球およびリンパ球を、 Tissue Antigen, S， 153 (1977)、 J. Immunol. , 11， 273 ( 1976 )、 Nycomed社の血球細胞の単離法に関するマニュアル等に記載の方法によ り、 T細胞や B細胞を分離 '取得することができる。
T細胞はナイロンウール法 〔Eur. J. Immunol. , 645 (1973)〕 を用いて取 得することもできる。 また、 T細胞、 B細胞、 単球/マクロファージにそれぞ れ特異的な抗体を結合した磁気ビーズ （例えば、 Dynal社製の Dynabeads) を用 いて、 各細胞を分離 '取得することができる。
白血球細胞または組織から全 R NAを調製する方法としては、 チォシアン酸 グァニジン—トリフルォロ酢酸セシウム法〔Methods in Enzymol. , I^, 3 (1987) 〕 等をあげることができる。
全 R N Aからポリ （A) +R N Aを調製する方法としては、 オリゴ （d T ) 固 定化セルロースカラム法 （モレキュラー 'クロ一ニング第 2版） 等をあげるこ とができる。 また、ファースト 'トラック 'mRNA'アイソレーション'キット astTrack mRNA Isolation Kit； Invitrogen社製〕、 クイック 'プレヅプ' mRNA ·ピ ユリフィケ一シヨン 'キット （Quick Prep mRNA Purification Kit；フアルマ シァ社製） 等のキヅトを用いて mRNAを調製することもできる。
一本鎖 cDNAは、 全 RNAまたは mRNAから、 一本鎖 cDNA合成キッ ト Superscript preamplification system (BRL社製) を用いて、 合成するこ とができる。 合成は、 キットに添付のマニュアルに従って行うことができる。 上記のように調製できる全 RNA、 mRNAまたはcDNAを用ぃたRT—
PCR法 CPCR Protocolss Academic Press (1990)〕 により、 本発明の蛋白質 をコードする遺伝子の発現量を定量することができる。
(2)本発明の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出することによる疾患の 判定方法
本発明のォリゴヌクレォチドをプローブとして、 ゲノム D N Aに対してサザ ンハイブ'リダィゼーシヨン法 （モレキュラー 'クロ一ニング第 2版） 、 PCR 法等を行うことにより、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出する ことができる。 該検出方法は、 I GFBPファミリ一に属する蛋白質が関与し ているとの報告がある急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋腫、 悪性腫瘍、 固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、 心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高脂血症、 糖尿病、 糖 尿病性網膜症、 糸球体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症症候群、 血栓性血 小板減少性紫斑病、 虚血性心疾患、 虚血性脳疾患、 心不全、 うつ血、 脈絡膜循 環障害等の血管障害を伴う疾患、 骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、 小人 症、 末端肥大症、 小児慢性腎不全等のインスリン様増殖因子や成長ホルモン作 用の障害を伴う疾患、 動脈硬化、 気管支疾患、 再狭窄等の異常な平滑筋細胞の 分化増殖を伴う疾患、 重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾 患、 胃潰瘍等の胃酸分泌の異常を伴う疾患、 微生物感染、 慢性 B型肝炎、 慢性 関節リゥマチ、敗血症、移植片 -対-宿主疾患、 ィンスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過 敏、 自己免疫疾患等の異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の判定に利用 することができる。
具体的には、 例えば、 患者が保有する本発明の蛋白質をコードする D N Aの 翻訳領域を P C I 去で増幅させ、 塩基配列を決定し、 健常者が有する該 D NA の塩基配列と比較することにより、 翻訳領域における変異の有無を調べること ができる。
P C R法に供する鎵型となる c D NAは （1 ) に記載した方法により取得で きる。 取得された c D N Aの塩基配列は、 パーキンエルマ一社の D NAシーク ェンサ一3 7 7と反応キヅト（ABI Prism™ BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit: Applied Biosystems社製) を用いて決定できる。
( 3 ) 免疫学的検出法 ·定量法による疾患の判定法
本発明の抗体を用いて、 被験者および健常者の血液中または組織における本 発明の蛋白質の発現を免疫学的に検出または定量し、 健常者と比較することで 下記疾患を判定することができる。
免疫学的に検出する方法としては、 マイクロタイ夕一プレートを用いる E L I S A法、 蛍光抗体法、 ウエスタンプロット法、 免疫組織染色法等をあげるこ とができる。
免疫学的に定量する方法としては、 例えば液相中で本発明の蛋白質と反応す る抗体のうちェピトープが異なる 2種類のモノクローナル抗体を用いたサンド ィツチ E L I S A法、 1251等の放射性同位体で標識した本発明の蛋白質と該蛋白 質を認識する抗体を用いるラジオィムノアヅセィ法等があげられる。
該免疫学的方法は、 I G F B Pフアミリーに属する蛋白質の関与が報告され ている急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平 滑筋腫、 悪性腫瘍、 固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、 心筋梗塞、 脳梗 塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高脂血症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症症候群、 血栓性血小板減少性紫斑 病、 虚血性心疾患、 虚血性脳疾患、 心不全、 うつ血、 脈絡膜循環障害等の血管 障害を伴う疾患、骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、小人症、末端肥大症、 小児慢性腎不全等のィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾 患、 動脈硬化、 気管支疾患、 再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾 患、 重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 胃潰瘍等の胃 酸分泌の異常を伴う疾患、 微生物感染、 慢性 B型肝炎、 慢性関節リウマチ、 敗 血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過敏、 自己免疫疾 患等の異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の疾患の判定に利用すること ができる。
また、 配列番号 1で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合す る抗体および配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結 合する抗体を用いることにより、 上記疾患のうち、 それら蛋白質の発現比が異 なることを特徴とする疾患を、 上記免疫学的方法により判定することができる。 ( 4 ) 本発明の D NA、 または蛋白質の発現パターンを解析することによる疾 患の判定方法
上記 （1 ) 〜 （3 ) のいずれかに記載の本発明の D NA、 または蛋白質の発 現量を定量する方法を用いて、 被験者および健常者の血液中または組織におけ る配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする D N Aと配 列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする D N Aの発現量 を定量 '比較し、 該 D N A、 または該蛋白質の発現量比が健常者とは異なるこ とを特徴とする疾患を判定することができる。
上記判定方法は、 I G F B Pファミリーに属する蛋白質の関与が報告されて いる急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑 筋腫、悪性腫瘍、 固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、心筋梗塞、脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高脂血症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球 体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症症候群、 血栓性血小板減少性紫斑病、 虚血性心疾患、 虚血性脳疾患、 心不全、 うつ血、 脈絡膜循環障害等の血管障害 を伴う疾患、 骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、 小人症、 末端肥大症、 小 児慢性腎不全等のィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、 動脈硬化、 気管支疾患、 再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 胃潰瘍等の胃酸分 泌の異常を伴う疾患、微生物感染、慢性 B型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性 腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過敏、 自己免疫疾患等の 異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の疾患の判定に利用することができ る。
(5)本発明の蛋白質をコードする DN Aの転写または翻訳を抑制することに よる疾患の予防および治療
I GF BPの発現量の上昇と疾患の関係については、 小児慢性腎不全は I G F B P— 2や 3の増加が原因であること 〔Electroiyte Mrtab.， IS, 320 (1992) 〕、 副甲状腺ホルモンの上昇を伴う老人女性の骨折患者では I GFBP— 4の 発現が上昇すること、 白血病患者では脳脊髄液中の I G F B P _ 7および I G F BP— 3の濃度が上昇すること 〔J. Clin. Endocrinol. Metab. , 84, 1361 (1996)〕、 大腸癌では、 大腸癌組織および大腸癌細胞株において IGFBP— 7の発現が上昇していること 〔J. Gastroenterology, 213 (1998)〕等が報 告されている。
また、 TGF— /?、 PTHPGE2によって IGFBP— 7の発現が上昇す ること 〔Endocrinology, ， 1998 (1999)〕、 骨芽細胞をグルココルチコィド で処理すると I G F— Iの発現を抑制する一方で I G F B P— 7の発現を上昇 させること （Endocrinology, 228 (1999)〕、 IGF BP— 7は骨格筋へ の分化にも I GFの分化促進作用を抑制することで影響していること 〔Exp. Cell Res., , 192 (1997)、 Endocrinology, , 100 (2000)〕 から、 I G FBP-7は骨代謝および骨格筋分化に関わる疾患にも関与すると考えられて いる。
従って、 I GF BP遺伝子の発現量の増大、 あるいは IGFBPの機能亢進 がー因となっている疾患については、 本発明の蛋白質をコードする DNAの転 写量若しくは翻訳量を減少させることが疾患の予防および治療に有用である。 また I GFBPに直接起因しない疾患であっても、 本発明の蛋白質をコードす る遺伝子の転写量若しくは翻訳量を低下させる、 または本発明の蛋白質の機能 を抑制することにより対症療法的に上記疾患の予防または治療を行うこともで きる。
また、 I GF BPの発現増加が原因で受容体を介した生理作用が亢進してい る患者がいる場合、 本発明の DNA、 オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を 患者に投与することにより、 該生理作用を抑制することができ、 また IGFB Pの発現増加が疾患の直接の原因でなくても本発明の D NA、 オリゴヌクレオ チドまたはその誘導体の投与により対症療法が可能な疾患に対して、 本発明の DNA、 オリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、 有効な予防薬および治療薬 となり得る。
該予防薬または治療薬を使用する方法としては、 例えばアンチセンス RNA
/D N A技術〔バイォサイエンスとィンダストリ一， ， 322 (1992)、 化学， 4 &，
681 (1991)、 Biotechnology, 95358 (1992)、 Trends in Biotechnology, Ιϋ, 87
(1992)、 Trends in Biotechnology, lfl， 152 (1992)、 細胞工学， Jl, 1463 (1997)
〕、 トリプル 'ヘリヅクス技術 (Trends in Biotechnology, 1ΰ3 132 (1992)〕
、 リボザィム技術 Current Opinion in Chemical Biology, , 274 (1999)、
FEMS Microbiology Reviews, 22， 257 (1999)、 Frontiers in Bioscience, i, D497 (1999)、 Chemistry & Biology, £， R33 (1999)、 Nucleic Acids Research, 23., 5237 (1998)、 Trends In Biotechnology, lfi, 438 (1998)〕 、 あるいはデコイ D NA法 Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 5β， 563 (1998)、 Circulation Research, B , 1023 (1998)、 Experimental Nephrology, S, 429 (1997)、 Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, , 2583 (1996)) をあげることができ、 該方法を用いることにより任意の遺伝子の 発現を抑制することができる。
本発明の D N A、 オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を上記予防薬および 治療薬として使用する場合は、 本発明の D NA、 オリゴヌクレオチドまたはそ の誘導体を単独あるいはレトロウィルスベクター、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウィルスァソシェ一テツドウィルスベクターなどの適当なベクタ一に揷 入した後、 下記に記載した常法に従って製剤化、 処方および投与することがで きる。
レトロウィルス、 アデノウイルス等のウィルスベクターやその他遺伝子治療 用のベクタ一に組み込んだ遺伝子治療用ベクタ一を遺伝子治療薬または予防薬 として用いるには、 該遺伝子治療用べクタ一と遺伝子治療剤に用いる基剤を調 合することにより製造することができる 〔Nature Genet.， S， 42 (1994)〕。 遺伝子治療剤に用いる基剤としては、 通常注射剤に用いる基剤であればどの ようなものでもよく、 蒸留水、 塩ィ匕ナトリウム又は塩ィ匕ナトリウムと無機塩と の混合物等の塩溶液、 マンニトール、 ラクトース、 デキストラン、 グルコース 等の糖溶液、 グリシン、 アルギニン等のアミノ酸溶液、 有機酸溶液又は塩溶液 とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。 また常法に従い、 これらの基 剤に浸透圧調整剤、 p H調整剤、 ゴマ油、 ダイズ油等の植物油又はレシチンも しくは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、 溶液、 懸濁液、 分散液として注射剤を調製してもよい。 これらの注射剤を、 粉末化、 凍結乾燥 等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。 本発明の遺伝子 治療剤は、 液体の場合はそのままで、 個体の場合は必要により滅菌処理をした 上記の基剤に遺伝子治療の直前に溶解して治療に使用することができる。 本発 明の遺伝子治療剤の投与方法としては、 患者の治療部位に吸収されるように、 局所的に投与する方法をあげることができる。
また、 非ウイルス遺伝子移入法によっても目的とする治療部位に D N Aを輸 送することができる。
当該分野で公知の非ウィルス遺伝子移入法には、 リン酸カルシウム共沈法 〔 Virology, Ζ, 456-467 (1973)； Science, 凰 1414-1422 (1980)〕、 マイク 口インジェクション法 CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 11, 5399-5403 (1980) ； Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 11, 7380-7384 (1980)； Cell, 27, 223-231 ( 1981) ； Nature, 2 , 92-94 ( 1981))、 リポソ一ムを介した膜融合-介在移入法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, M, 7413-7417 (1987)； Biochemistry, 2S, 9508-9514
(1989) ; J. Biol. Chemリ ， 12126-12129 (漏）； Hum. Gene Ther. 267-275, (1992)； Science, m, 1285-1288 (1990)； Circulation, 2007-2011 (1992) 〕あるいは直接 D N A取り込みおよび受容体-媒介 D N A移入法〔Science, 241, 1465-1468 (1990) ; J. Biol. Chem.，篇， 14338-14342 (1991) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, SL 3655-3659 (1991)； J. Biol. Chem. , 16985-16987 (1989)
； BioTechniques, 11, 74-485 ( 1991) ;Proc. Natl. Acad. Sci. USA, SI, 3410-3414
(1990)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, M, 4255-4259 ( 1991)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, SL 4033-4037 ( 1990)； Proc. Natl . Acad. Sci. USA, SS, 8850-8854
(1991)； Hum. Gene Ther. , ， 147-154 (1991 )〕等をあげることができる。
リボソームを介した膜融合一介在移入法ではリポソ一ム調製物を標的とする 組織に直接投与することにより、 当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび 発現が可能であることが腫瘍に関する研究において報告されている 〔Hum. Gene Ther. , Z, 399 (1992)〕 。
( 6 ) 本発明の蛋白質の発現量または機能が低下している疾患の予防および治 I G F B Pの発現減少と疾患の関係については、 骨粗鬆症では I G F B P—
5の発現が減少していること、 腎摘出後や小腸切除後の代償性肥大では I G F
BP— 3の発現低下に伴う遊離 I GF— Iの増加がみられること 〔Baillieres
Clin. Endocrinol. Metab., S, 165 (1994)〕、 子宮内膜の悪性腫瘍では I G F
BP— 1の発現が低下していること [； Growth Regul., 3, 74 (1993)〕、 乳癌組 織においてはヒト染色体上の I GF BP— 7の遺伝子座に 50%以上の頻度で
L0Hが観察され、 I GFBP— 7の発現の減少が見られること（Oncogene, IS,
2459 (1996)〕、 前立腺癌組織における I GF BP— 7の発現の mRNAレベル での減少、 および悪性の前立腺癌由来細胞株において I G F B P— 7の発現が 検出されないこと 〔J. Clin. Endocrinol. Metab., SS, 4355 (1998)〕 、 大型 の子宮平滑筋腫部位では、 隣接する子宮平滑筋細胞や腫瘍容積が 120 cm3以 下の小さな子宮平滑筋に比べ I G FBP- 7の mRNAの発現が低下している こと 〔Am. J. Reprod. Immunol., ^, 53 (2000)〕、 SV40 T抗原で誘導さ れたマウス肝臓癌細胞では、 I G F Β Ρ— 7遺伝子の 5 '上流領域がメチルかさ れ発現量が減少していること〔Biochem. Biophys. Res. Comun. , 2fiZ, 109 (2000)
〕、 ストレブトゾトシン投与による I型糖尿病モデルでは腎臓および血管障害部 位で I GFBP— 7の発現が低下していること 〔Diabetes, ， S111 (1996)、
J. Diabetes & its Complications, 1Z, 252 (1998)〕、 II型糖尿病患者の冠状 動脈平滑筋細胞においても I G F Β Ρ— 7の発現低下が蛋白質レベルで観察さ れていること 〔Diabetes， £, 1627 (1997)〕、 牛の動脈由来平滑筋細胞を高グ ルコース培地で培養すると I G F B P— 7の発現量が mRNAおよび蛋白レぺ ルで低下すること (Diabetes, 4£, 1627(1997)、 Diabetologia, ΐ, 134 (1998)
〕、また I GFBP— 7は血管壁での P GI 2産生を刺激すること〔Nature, 231,
549 (1978) 〕、 および溶血性尿毒症症候群 〔Lancet， 2, 871 (1978)〕、 血栓 性血小板減少性紫斑病〔Lancet, ， 748 (1979)〕、 鎌形赤血球性貧血症 Br. J. Haematol.， 4S， 545 (雇）〕、 急性心筋梗塞〔Coronary， Z, 49 (1985)〕、 糖 尿病性血管障害 (Metabolism, SS, 837 (1989)、 Haemostasis, 447 (1986) 、 Diab. Res. Clin. Pract., 243 (1987)〕、 動脈硬化性疾患において血中 レベルが低下していること等が報告されている。
また、 TGF— ^、 PTHPGE 2によって IGFBP— 7の発現が上昇す ること 〔Endocrinology， M, 1998 (1999)〕、 骨芽細胞をグルココルチコィド で処理すると I G F— Iの発現を抑制する一方で I G F B P— 7の発現を上昇 させること 〔Endocrinology, 140, 228 (1999)〕、 I G F B P— 7は骨格筋へ の分化にも I GFの分化促進作用を抑制することで影響していること 〔Exp. Cell Res., Z21, 192 (1997)、 Endocrinology, 1ϋ, 100 (2000)〕 から、 I G FBP-7が骨代謝および骨格筋分化に関わる疾患にも関与すると考えられて いる。
I GFBP-7の発現が減少した前立腺癌細胞株に I G F B P— 7を強制発 現させると、 細胞分裂時間の延長、 軟寒天培地中でのコロニー形成能の低下、 ヌードマウス移植時の腫瘍形成能の低下、 薬剤処理によるアポトーシス誘導率 の上昇すること CCancer Res., 5S, 2370 (1999)〕、 p 53の機能が失われて いるォステオザルコ一マ細胞株に I GFBP— 7を強制発現させると、 p 53 遺伝子を導入したときと同様に細胞株の増殖を抑制することができることから
(Oncogene, 12, 1361 (1996)〕、 本発明の D N Aおよび蛋白質の発現を増大さ せることで、 I GFBPの発現減少が関与する上記疾患を予防または治療でき る。 また I GFBPに直接起因しない疾患であっても、 本発明の蛋白質をコ一 ドする遺伝子の転写量若しくは翻訳量を増大させる、 または本発明の蛋白質量 を増大させることにより対症療法が可能な上記疾患の予防または治療を行うこ とも可能である。
従って、 I GFBPの発現減少または機能低下により該蛋白質の生理作用が 減退している患者がいる場合、 本発明の DNA、 オリゴヌクレオチドまたはそ の誘導体、 あるいは本発明の蛋白質を患者に投与することにより、 該生理作用 を促進することができ、 また I G F B Pの発現減少、 または機能低下が疾患の 直接の原因でなくても対症療法が可能な疾患に対しては、 本発明の D NA、 ォ リゴヌクレオチドまたはその誘導体、 あるいは本発明の蛋白質は、 上記疾患の 予防薬および治療薬として有用である。
該予防薬および治療薬の投与方法としては、 例えば、 本発明の蛋白質の発現 低下や変異のために正常な生理作用が期待できない患者がいる場合に、 （i) 本 発明の蛋白質をコードする D NAを該患者に投与し発現させること （ii) 対象 となる細胞に本発明の蛋白質をコードする D N Aを挿入し発現させた後に、 該 細胞を該患者に移植すること、 あるいは （Hi) 本発明の蛋白質を該患者に投与 することなどによって、 患者の体内における本発明の蛋白質の量を増加させ、 該蛋白質の生理作用を充分に発揮させることができる。 したがって、 本発明の 蛋白質をコードする D N Aまたは本発明の蛋白質は、 本発明の蛋白質の発現量 または機能が低下した疾患、 または該蛋白質の変異による機能異常に起因する 疾患、 あるいは本発明の蛋白質に直接起因しなくとも、 本発明の蛋白質をコ一 ドする D NA、 あるいは本発明の蛋白質の投与により対症療法的な治療が可能 な疾患に対して安全で低毒性な予防薬および治療薬として有用である。
本発明の蛋白質をコードする D N Aを上記予防薬および治療薬として使用す る場合は、 本発明の D N Aを単独あるいはレトロウイルスぺク夕一、 アデノウ ィルスべクタ一、 アデノウイルスァソシェ一テヅドウィルスベクタ一などの適 当なベクタ一に挿入した後、 上記 （5 ) に記載した常法に従って製剤化、 処方 および投与することができる。
また、 本発明の蛋白質を有効成分として含有する医薬は、 該有効成分を単独 で投与することも可能ではあるが、 通常は該有効成分を薬理学的に許容される 一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく 知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。 好 ましくは水、 あるいは食塩、 グリシン、 グルコース、 ヒトアルブミン等の水溶 液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。 また、 製剤溶液を生理 的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、 薬理学的に許容される 添加剤、 例えば、 酢酸ナトリゥム、 塩化ナトリゥム、 乳酸ナトリゥム、 塩化力 リウム、 クェン酸ナトリウム等を添加することもできる。 また、 凍結乾燥して 貯蔵し、 使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投 与、 あるいは口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口 投与をあげることができる。 投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。 経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散 剤、 顆粒剤等があげられる。 例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物 は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリエチレングリコ一ル、 プ ロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 オリープ油、 大豆油などの油 類、 P—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、スト口ペリ一フレーバー、 ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。 カプセル 剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 プドウ糖、 ショ糖、 マンニトール等の賦 形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシゥ ム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセル口一 ス、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の可 塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。 例えば、 注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担 体等を用いて調製する。 座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担 体を用いて調製される。 また、 噴霧剤は該蛋白質そのもの、 ないしは 容者の 口腔および気道粘膜を刺激せず、 かつ該蛋白質を微細な粒子として分散させ吸 収を容易にさせる担体等を用いて調製する。 担体として具体的には乳糖、 グリ セリン等が例示される。該蛋白質および用いる担体の性質により、エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経 口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、 体重等により異なるが、 通常成人 1日当たり 10〃 g/kg〜 8 mg/kgである。
( 7 ) 本発明の蛋白質をコードする遺伝子のプロモ一夕一領域を取得する方法 本発明の D NAまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして、 公知の方法〔 東京大学医科学研究所制癌研究部編、 新細胞工学実験プロトコール、 秀潤社 （ 1 9 9 3年） 〕 を用いて、 該遺伝子のプロモ一夕一領域を取得することができ る。
プロモーター領域としては、 哺乳動物細胞において本発明の蛋白質をコード する遺伝子の転写に関与するすべてのプロモー夕一領域があげられる。例えば、 ヒトの小腸で、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写に関与するプロモー 夕一領域をあげることができる。 該プロモー夕一は後述 （8 ) に記載した本発 明の蛋白質をコードする D N Aの転写または翻訳を制御する物質のスクリー二 ング法に利用することができる。
( 8 ) 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写または翻訳を制御する物質の スクリーニング法
急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋 腫、 悪性腫瘍、 固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、 心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高脂血症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球 体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症症候群、 血栓性血小板減少性紫斑病、 虚血性心疾患、 虚血性脳疾患、 心不全、 うつ血、 脈絡膜循環障害等の血管障害 を伴う疾患、 骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、 小人症、 末端肥大症、 小 児慢性腎不全等のィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、 動脈硬化、 気管支疾患、 再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 胃潰瘍等の胃酸分 泌の異常を伴う疾患、微生物感染、慢性 B型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性 腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過敏、 自己免疫疾患等の 異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の疾患は、 I G F B Pスーパーファ ミリーに属する蛋白質が関与していると報告されている。
上記疾患の一因として、 I G F B Pをコードする D NAの転写量の変動、 ま たは本発明の蛋白質の機能変化が考えられ、 この場合、 本発明の蛋白質をコー ドする D N Aの転写量若しくは翻訳量を制御することが疾患の予防および治療 に有効である。 また I G F B Pに直接起因しない疾患であっても、 本発明の蛋 白質をコードする遺伝子の転写量若しくは翻訳量を制御することにより対症療 法的に上記疾患の予防または治療を行うことが可能である。
従って、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写過程、 あるいは転写産物 から蛋白質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、 該蛋白質の発現を制 御することにより、 該蛋白質を介して発揮される細胞機能を制御することが可 能であり、 安全で低毒性な医薬組成物として有用である。
. 該化合物は、 以下 （a ) 〜 （c ) に示す方法により取得できる。
( a) [i] 本発明の蛋白質を発現する細胞と、 [ii]試験物質の存在下、 本発 明の蛋白質を発現する細胞を、 上記 2に記載の培養法で 2時間から 1週間培養 後、細胞中の該蛋白質量を、上記（3 )で記載した本発明の抗体を用いて測定、 比較し、 該蛋白質量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し取得 する方法。
本発明の抗体を用いた測定法としては、 例えば、 マイクロタイ夕一プレート を用いる E L I S A法、 蛍光抗体法、 ウエスタンプロット法、 免疫組織染色等 を用いた検出法をあげることができる。 ( b ) [i]本発明の蛋白質を発現する細胞と、 [ii]被験物質の存在下、 本発 明の蛋 ή質を発現する細胞を、 上記 2に記載の培養法で 2時間から 1週間培養 後、 細胞中の該蛋白質をコードする D N Aの転写産物量を、 上記 （1 ) で記載 したノーザンハイブリダィゼーシヨン法または P C R法等の方法を用いて測定、 比較し、 該転写産物量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し取 得する方法。
( c ) 上記 （7 ) で取得したプロモーターの下流にレポ一夕一遺伝子を連結し た D N Aを組み込んだプラスミドを公知の方法により作製し、 上記 2に記載の 方法に準じて動物細胞に導入し、 形質転換体を取得する。 [i]該形質転換体と 、 [ii] 被験物質の存在下、 該形質転換体を、 上記 2に記載の培養法で 2時間 から 1週間培養し、 細胞中のレポ一夕一遺伝子の発現量を公知の方法〔東京大 学医科学研究所制癌研究部編， 新細胞工学実験プロトコール， 秀潤社 （1993)、 Biotechniques, 20, 914 (1996)、 J. Antibiotics, 453 (1996)、 Trends in Biochemical Sciences, , 448 (1995)、 細胞工学， Ifi, 581 ( 1997)〕 を用い て測定、 比較し、 該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択
•取得する方法。
レポーター遺伝子としては、 例えば、 クロラムフエニコ一ル ·ァセチルトラ ンスフェラ一ゼ遺伝子、 ?—ガラクトシダーゼ遺伝子、 5—ラク夕マ一ゼ遺伝 子、 ルシフェラ一ゼ遺伝子、 グリーン 'フルォレツセント 'プロテイン （G F P ) 遺伝子等をあげることができる。
( 9 ) 本発明の蛋白質の機能を制御する物質のスクリーニング方法
急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋 腫、 悪性腫瘍、 固形腫瘍等の異常な細胞増殖を伴う疾患、 心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 髙脂血症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球 体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒症症候群、 血栓性血小板減少性紫斑病、 虚血性心疾患、 虚血性脳疾患、 心不全、 うつ血、 脈絡膜循環障害等の血管障害 を伴う疾患、 骨粗鬆症等の骨代謝の異常を伴う疾患、 小人症、 末端肥大症、 小 児慢性腎不全等のィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患、 動脈硬化、 気管支疾患、 再狭窄等の異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 重症筋無力症等の異常な骨格筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 胃潰瘍等の胃酸分 泌の異常を伴う疾患、微生物感染、慢性 B型肝炎、慢性関節リウマチ、敗血症、 移植片 -対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性 腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過敏、 自己免疫疾患等の 異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患等の疾患は、 I G F B Pスパーフアミ リーに属する蛋白質が関与していると報告されている。
上記疾患の一因として、 I G F B Pの機能変化が考えられ、 この場合、 本発 明の蛋白質の機能を阻害または亢進させることが該疾患の予防および治療に有 効である。 また I G F B Pに直接起因しない疾患であっても、 本発明の蛋白質 の機能を阻害または亢進させることにより対症療法的に上記疾患の予防または 治療を行うことができる。
よって、 本発明の蛋白質の機能変化が原因で、 細胞の生理作用が減退または 亢進している患者がいる場合、 本発明の機能を制御する化合物を投与すること により該生理作用を制御することができ、 また本発明の蛋白質の機能変化が疾 患の直接の原因でなくても本発明の蛋白質の機能を制御することで対症療法が 可能な疾患もまた、 該化合物の投与により予防および治療できる。
該化合物は、 例えば以下に示す方法により取得できる。
[i]本発明の蛋白質を発現する細胞と、 [ii]被験物質の存在下、 本発明の 蛋白質を発現する細胞を、 上記 2に記載の培養法で 2時間から 1週間培養後、 該蛋白質が機能することにより生じる細胞応答を検出、 比較し、 該蛋白質の機 能を阻害または亢進させる活性を有する化合物を選択し取得する方法。
本発明の蛋白質が機能することにより生じる細胞応答を検出する方法として は、 例えば、 培地中に含まれるインスリンあるいはインスリン様増殖因子に依 存的な細胞内情報伝達、 遺伝子の転写、 糖の取り込み、 増殖などの変化を検出 する公知の方法が挙げられる。 また、 プロスタグランジン産生の変化を測定す る公知の方法も挙げられる （Nature, , 663, 1976;臨床科学， 11, 958, 1981
) o
( 1 0 ) 本発明の蛋白質と特異的に結合する物質をスクリーニングする方法 本発明の蛋白質と特異的に結合する物質は、 本発明の蛋白質に起因する疾患 の予防薬または治療薬の開発に利用することができる。 例えば、 本発明の蛋白 質の受容体は、 本発明の蛋白質と結合して、 細胞内に情報を伝達し、 生理作用 を発現する機能を有しているので、 該受容体の活性、 または該受容体をコード する遺伝子の転写若しくは翻訳を制御する物質は、 本発明の蛋白質、 または本 発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写若しくは翻訳を制御する物質と同様、 本発明の蛋白質の機能異常に起因する疾患の予防薬および治療薬として有用で ある。 該物質としては、 低分子化合物、 蛋白質などをあげることができる。 例えば、 本発明の蛋白質と特異的に結合する蛋白質をスクリーニングする方 法としては、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー 'バイオロジー、 Science, 255， 989 (1992)等に記載の 発現クロ一ニングの方法を挙げることができ、 本発明の蛋白質と被験試料を接 触させたとき、 本発明の蛋白質に特異的に結合する蛋白質を被験試料より選択 することで取得できる。
具体的には、 以下の方法があげられる。 '
組織より c D N Aを調製する。 該 c D N Aを適当な発現べクタ一のプロモー 夕一の下流に揷入することにより、 組換えベクターを作製し c D NAライブラ リーを作製する。 該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に 導入することにより、 組織で発現している遺伝子を発現する形質転換体を得る。 標識した本発明の蛋白質が特異的に結合する蛋白質を産生する形質転換体を選 択する。 選択した該形質転換体に導入した c DNAにコ一ドされている遺伝子配列を 決定することにより、 本発明の蛋白質と特異的に結合する蛋白質を取得するこ とができる。
c D N Aライブラリ一を調製する方法としては、 上記 1に記載した方法が挙 げられる。
組換えベクターの導入方法、 形質転換体を得る方法、 および得られた形質転 換体を培地に培養する方法としては、 上記 2に記載した方法が挙げられる。 放射性同位元素ゃビォチン化等公知の蛋白質を標識する方法で標識した本発 明の蛋白質と形質転換体とを共培養することで、 標識された本発明の蛋白質と 特異的に結合する遺伝子産物を産生する形質転換体を選択することができる。 選択した形質転換体に導入した c D N Aを単離する方法としては、 モレキュ ラ— ·クローニング第 2版、 カレント 'プロトコールズ 'イン .モレキュラー
'バイオロジー、 Mol. Cell. Biol., S, 2837 (1988)等に記載のファージぺク ターやプラスミ ドベクタ一を回収する方法あるいは H i r t法を挙げることが できる。
単離した c D N Aの遺伝子配列を決定する方法としては、 上記 1に記載した 方法が挙げられる。
(11) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、 本発明の蛋白質に関与する疾患の予防薬および治療薬とし て有用である。
I GFBPの発現量の上昇と疾患の関係については、 小児慢性腎不全は I G
F B P— 2や 3の増加が原因であること 〔Electroiyte Mrtab. , , 320 (1992)
〕、 副甲状腺ホルモンの上昇を伴う老人女性の骨折患者では I GFBP— 4の 発現の上昇すること、 白血病患者では脳脊髄液中の IGFBP— 7および IG
F BP— 3の濃度が上昇すること 〔J. Clin. Endocrinol. Metab. , , 1361
(1996)〕、 大腸癌では、 大腸癌組織および大腸癌細胞株において IGFBP— 7の発現が上昇していること 〔J. Gastroenterology, ， 213 (1998)〕等が報 告されている。
また、 TGF— 5、 PTHおよび PGE 2によって I GFBP— 7の発現が 上昇すること CEndocrinology,崖, 1998 (1999)〕、 骨芽細胞をダルココルチ コイ ドで処理すると I G F— Iの発現を抑制する一方で I G F B P— 7の発現 を上昇させること 〔Endocrinology， 228 (1999)〕、 I G F B P— 7は骨 格筋への分化にも I GFの分化促進作用を抑制することで影響していること 〔 Exp. Cell Res., , 192 (1997)、 Endocrinology, l, 100 (2000)〕 から、 I GFBP-7が骨代謝および骨格筋分化に関わる疾患にも関与すると考えら れている。
よって、 I GFBPの発現量の増大、 あるいは機能の亢進が一因である疾患 に対しては、 本発明の蛋白質の発現量を抑制する、 あるいは機能を阻害するこ とが疾患の予防および治療に有効である。 また I G F B Pに直接起因しない疾 患であっても、 本発明の蛋白質の発現量を抑制、 あるいは機能を阻害すること により対症療法が可能な上記疾患の予防または治療を行うこともできる。
従って、 IGF BPの発現量の増大、 あるいは機能亢進が原因で、 細胞の生 理作用が亢進している患者がいる場合、 本発明の蛋白質と結合する抗体を投与 することにより該生理作用を抑制することができ、 また本発明の蛋白質が疾患 の直接の原因でなくても本発明の蛋白質の機能を抑制することで対症療法が可 能な疾患もまた、 本発明の抗体の投与により予防および治療できる。
該抗体を有効成分として含有する医薬は、 上記 （6) に記載した本発明の蛋 白質を含有する医薬の製造に準じ、 製剤学の技術分野においてよく知られる任 意の方法により製造した医薬製剤として提供することができる。
(12) (8) の探索法で得られた化合物を含有する医薬
本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写過程、 あるいは転写産物から夕ン パク質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、 安全で低毒性な医薬組成 物として有用である。
( 8 ) で得られた化合物は （6 ) に記載した本発明の蛋白質を含有する医薬 の製造法に準じ、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製 造した医薬製剤として提供することができる。
( 1 3 ) 本発明の： D NAを用いたノヅクァゥト非ヒト動物の作製
本発明の D NAを含有してなる組換えベクターを用い、 目的とする非ヒト動 物、 例えばゥシ、 ヒヅジ、 ャギ、 ブ夕、 ゥマ、 マウス、 ニヮトリ等の胚性幹細 胞 (embryonic stem cell)において、 染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺 伝子を公知の相同組換えの手法〔例えば、 Nature, 22S., 6110, 295 (1987)、 Cell, 51， 3， 503 (1987)等〕 により不活化または任意の配列と置換した変異クローン を作製する 〔例えば、 Nature, , 6315, 243 (1991)〕 。胚性幹細胞の変異ク ローンを用い、 動物の受精卵の胚盤胞 (blastcyst)への注入キメラ法または集合 キメラ法等の手法により、 胚性幹細胞ク口一ンと芷常細胞からなるキメラ個体 を調製することができる。 このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、 全 身の細胞の染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子に任意の変異を有す る個体を得ることができ、 さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双 方に変異が入ったホモ個体の中から、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発 現が一部または完全に抑制された個体としてノックアウト非ヒト動物を得るこ とができる。
また、 染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子の任意の位置へ変異を 導入することにより、 ノックァゥト非ヒト動物を作製することも可能である。 例えば染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子の翻訳領域中へ塩基を置 換、 欠失、 挿入等させて変異を導入することにより、 その産物の活性を改変さ せることも可能である。 また、 その発現制御領域への同様な変異を導入するこ とにより、 発現の程度、 時期、 組織特異性等を改変させることも可能である。 さらに Cre-loxP系との組合せにより、 より積極的に発現時期、 発現部位、 発現 量等を制御することも可能である。 このような例として、 脳のある特定の領域 で発現されるプロモ一夕を利用して、 その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた 例 〔Cell, 81, 7, 1317 (1996)〕 や Creを発現するアデノウイルスを用いて、 目 的の時期に、 臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例 〔Science, m, 5335, (1997)〕 が知られている。
従って、 染色体上の本発明の蛋白質をコードする遺伝子についても、 このよ うに任意の時期や組織で 現を制御できる、 または任意の挿入、 欠失、 置換を その翻訳領域や発現制御領域に有する、 ノックァゥト非ヒト動物を作製するこ とができる。
ノックアウト非ヒト動物は、 任意の時期、 任意の程度または任意の部位で、 本発明の蛋白質に起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。
このように、 本発明のノックアウト非ヒト動物は、 本発明の蛋白質に起因す る種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。 特にその 治療薬、 予防薬、 また機能性食品、 健康食品等の評価用モデルとして非常に有 用である。
[¾而の簡 な説昍
第 1図 C-hsil3412および C- kaia397と I G F B Pフアミリー因子とのァミノ 酸配列の比較を示す図である。
第 2図 C- hsil3412がコードする蛋白質の疎水性プロヅトを示す図である。 第 3図 C- kaia397がコードする蛋白質の疎水性プロットを示す図である。 第 4図 C-hsil3412および C-kaia397とヒトゲノム配列との比較を示す図であ る。
第 5図 RT- PCRによる C- hsil3412と C- kaia397の発現を示す図である。 （A) は各組織における発現を、 （B ) は各細胞株における発現を解析した結果を示 す。
第 6図 RT- PCRによる C- hsil3412と C-kaia397の発現を示す図である。 第 7図 COS- 1細胞を宿主とした C-hsil3412と C- kaia397がコードする蛋白質 の発現を示す図である。 mockは対象を表す。
第 8図 CH0細胞を宿主とした C- hsil3412と C- kaia397がコ一ドする蛋白質の 発現及び糖鎖修飾を示す図である。 図中、 Vは CHO/mock株を、 C- kaia397は CH0/C-kaia397 株を、 C-kaia397h は CH0/C-kaia397h株を、 C- hsil3412 は CH0/C-hsil3412株を、 C-hsil3412hは CH0/C-hsil3412h株を示している。また、 +は糖鎖切断酵素を添加した場合を、 一は糖鎖切断酵素の代わりに 100腿 ol八 Tris-HCl緩衝液 (pH7.5)を加えた場合を、 nは酵素反応を行わなかった場合を示 している。
第 9図 昆虫細胞を宿主とした C- hsil3412と C-kaia397がコードする蛋白質の 発現を示す図である。 mockは対象を表す。
第 10図 C-hsil3412又は C- kaia397がコードする蛋白質を認識するポリクロー ナル抗体のウエスタンブロヅティングによる解析を示す図である。 図中、 右の プロヅティング図は化合物 2を免疫抗原として得られた抗体を、 左のブロッテ ィング図は化合物 3を免疫抗原として得られた抗体を用いた結果を示す。
第 Π図 KM2961及び KM2962を用いた C-hsil3412または C-kaia397がコ一ドす る蛋白質のウエスタンブロッテイングによる検出を示す図である。 mockは対象 を表す。
第 12図 ファーウエスタンによる C-hsil3412又は C- kaia397がコードする蛋白 質と IGFとの結合性を示す図である。 mockは対象を表す。
第 13図 HT- 29細胞の IGF依存的な増殖に及ぼす C- hsil3412又は C-kaia397が コードするタンパク質の影響を示す図である。 mockは対象を表す
第 14図 KM2961及び M2962の抗原ペプチドへの結合活性を示す図である。 図中、 2961はモノク口一ナル抗体 KM2961を産生するハイプリド一マを 3日間培養し た培養上清を、 KM2961はモノクローナル抗体 KM2961を産生するハイプリドーマ を 3日間培養した培養上清を示している。 白抜きのカラムは抗原ぺプチドをコ —トしていないプレートとこれら培養上清との反応を示し、 黒いカラム及び斜 線のカラムは抗原べプチドをコ一トしたプレートとこれら培養上清との反応を 示している。 発明を実施するための最良の形態
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、 実施例は本発明の単 なる例示にすぎず、 本発明の範囲を限定するものではない。
実施例 1 ヒト小腸粘膜組織由来 cDNAラィブラリ一の作製
ヒト小腸粘膜組織より、 モレキュラー ·クローニング第 2版に記載の方法に より mRNAを抽出した。さらに、オリゴ dTセル口一スで polyA( + ) Aを精製した。 それぞれの polyA(+) RNAよりオリゴキヤプ法 〔Gene, 1 , 171 (1994)〕 によ り cDNAライブラリ一を作製した。 Oligo- cap linker (配列番号： 5 )及び Oligo dT primer (配列番号： 6 ) を用いて文献 〔蛋白質核酸酵素， έϊ, 197 (1996)、
Gene, 2Μ, 149 (1997) ) に記載の方法に従って BAP (Bacterial Alkaline
Phosphatase)処理、 TAP (Tobacco Acid Phosphatase)処理、 RNAライゲ一ショ ン、 第一鎖 cDNAの合成と RNAの除去を行った。 次いで、 5，末端側のセンスプライ マ一 （配列番号： 7 ) と 3，末端側のアンチセンスプライマー （配列番号： 8 ) の 2種の PCRプライマ一を用いる PCR (polymerase chain reaction) により二本 鎖 cDNAに変換し、 Siilで切断した。なお、 この PCIUま市販のキヅトである Geneamp
XL PCRキット （Perkin Elmer社製）を使用して、 95°Cで 5分間熱処理後、 95°Cで 1 分間、 58°Cで 1分間及び 72°Cで 10分間の反応サイクルを 12回繰り返し、 その後 4
°Cで保持することにより行った。次いで、 Ikalllで切断したベクタ一 PME18SFL3
(GeneBank AB009864、 発現ベクター、 3392bp) に cDMを一定方向で連結して組 換え体 DNAを作製し、 該組換え体 DNAを用いて Esehenkhia eali DH5ひを形質転 換することにより cDNAラィブラリ一を作製した。 得られた形質転換体が保持す る各々のプラスミ ド DNAについて、 cDNAの 5'端と 3，端の塩基配列を、 MAシーク ェンシング試薬 (Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit又は BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製) を用い、 マニュアルに従ってシークェンシング反応を行った後、 DNAシ一クェン サー （ABI PRISM 377, PE Biosystems社製） を用いて決定した。
実施例 2 I GFBPスーパーファミリーに属する新規蛋白質の同定
作製した cDNAライブラリ一の各クローンの塩基配列について、 蛋白アミ ノ酸デ一夕ベース SWISSPROTあるいは塩基配列データべ一ス G e n B a nkに登録されている I GFBPスーパ一フアミリ一に属する既知蛋白質と してヒト IGFBP— 1、 ヒト IGFBP— 2、 ヒト IGFBP— 3、 ヒト I GFBP— 4、 ヒト IGFBP— 5、 ヒ卜 IGFBP— 6、 ヒ卜 IGFBP— 7、 ヒト IGFBP— 8、 ヒト IGFBP— 9若しくはヒト IGFBP— 10 の 10分子を用い、 これら分子のアミノ酸配列と相同性を有する 2種類のクロ ーン、 C-hsil3412および C- kaia397を選択した。 配列番号 1に C- hsil3412のアミ ノ酸配列を配列番号 3にその塩基配列を示した。配列番号 2に C- kaia397のァミ ノ酸配列を配列番号 4にその塩基配列を示した。
C-hsil3412のアミノ酸配列は、 BLAST2を用いた相同性解析において、 インス リン様増殖因子結合蛋白質フアミリーに属する蛋白質であるヒト I GFBP—
7 (ァクセッションナンバー： 152825) と P値 4.0X10— 41で 38%の有意な相 同性を示した。 同様に、 C-kaia397のアミノ酸配列は、 BLAST 2を用いた相 同性解析において、 インスリン様増殖因子結合蛋白質ファミリ一に属する蛋白 質であるヒト IGFBP— 7と P値 2 X 10—16で 35%の有意な相同性を示した。 ィン スリン様増殖因子結合蛋白質スーパ一ファミリーにおいては、 IGF— 1や I
GF— 2、 インスリンとの結合に重要な 10個のシスティン残基が存在し、 その うち 4個のシスティン残基を含むィンスリン様増殖因子結合モチーフ 〔GCGCCXXC
(G:グリシン残基、 C:システィン残基、 X：任意のアミノ酸残基） 〕 を中心に、 このフアミ リーに属する因子間で高く保存されている。 C- hsil3412及び C - kaia397のアミノ酸配列をィンスリン様増殖因子結合蛋白質スーパ一フアミ リ一の各因子と比較してみると、 配列番号 1および 2で表されるァミノ酸配列 においても、 システィン残基の位置と数が保存されており、 インスリン様増殖 因子結合モチーフ部分も高く保存されていることが分かった （図 1)。 また、 N 末端側のシグナル配列も、 C-hsil3412及び C- kaia397とィンスリン様増殖因子結 合蛋白質スーパ一ファミリ一に属する因子間で高く保存されていた （図 1)。 以上の結果より、 C-hsil3412及び C- kaia397がィンスリン様増殖因子結合蛋白 質スーパーフアミリーに属する新規蛋白質であり、 インスリン様増殖因子結合 蛋白質スーパ一フアミリーに属する蛋白質としての活性を有することが明らか となった。なお、 図 1中の I GFBP— 1、 IGFBP— 2、 I GFBP-3, IGFBP— 4、 IGFBP— 5、 IGFBP— 6、 IGFBP— 7は、 それ それヒト IGFBP— 1、 ヒト IGFBP— 2、 ヒト IGFBP— 3、 ヒト I GFBP-4, ヒト IGFBP— 5、 ヒト IGFBP— 6、 ヒト IGFBP— 7を指す。
また、 C- hsil3412及び C-kaia397とィンスリン様増殖因子結合蛋白質スーパ一 ファミリ一間で保存されているアミノ酸配列を白抜きで示し、 ファミリ一間で 高く保存されているシスティン残基に *印を記した。
配列番号 3に示した塩基配列をもとに、 塩基配列データベース
GenBank/EMBL/DDBJを、 BLAST2を用いて検索したところ、 C- hsil3412のアミノ酸 をコードしている塩基配列と同一遺伝子由来の ESTと考えられる塩基配列 2個 と一致していることが分かつたこれら ESTの GenBankァクセヅシヨンナンノ、'一は、
AI667734、 R30743である。 同じく、 配列番号 4に示した塩基配列をもとに、 塩 基配列デ一夕べ一ス GenBank/EMBL/DDBJを、 BLAST2を用いて検索したところ、
C-kaia397のアミノ酸をコードしている塩基配列と同一遺伝子由来の ESTと考え られる塩基配列 1個と一致していることが分かった。 この ESTの GenBankァクセ ヅシヨンナンバーは、 AI667734である。 これら EST塩基配列は C-hsil3412及び C- kaia397の完全長をカバーしていない。 また、 それぞれの E S Tの塩基配列と 相同性を示す遺伝子を Ge nB ank、 E MB L及び D D B Jの各データべ一 スより BLAST2を用い検索しても、 ィンスリン様増殖因子結合蛋白質ス一 パーファミリーと有為な相同性を示さない。従って、 C-hsi 13412及び C-k ia397 は、 本発明により初めて取得された新規な遺伝子であることが分かった。
配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコ一ドする cDNA ( 配列番号 3の全塩基配列） を含有するプラスミド C- hsil3412を含む大腸菌： Escherichia coli DH5a/pM.E 18SFL3-C-hs i l 3412及び配 列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする cDNA (配列 番号 4の全塩基配列） を含有するプラスミ ド C- kaia397を含む大腸菌 ： Escherichia coli DH5 /pME 18SFL3— C— kaia397は、 それ ぞれ； FERM BP— 7181及び FERM B P— 7180として、 平成 1 2年 6月 2日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン夕一、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 856 6 )に寄託されている（旧称 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、 旧住所 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号） 。
実施例 3 C- hsil3412及び C-kaia397の塩基配列の解析
配列番号 3に示した C- hsil3412及び配列番号 4に示した C- kaia397の塩基配 列をもとに、 蛋白質の開始コドン予測プログラム ATGPr CBioinformatics, 1A,
384, (1998)〕 を用いて開始コドン周辺配列を解析した。 C-hsil3412は、 177-
179番目に位置する ATGが開始コドン、 1089〜1091番目に位置する TAGが終始コド ンと特定され、 0RFにコードされる蛋白質は 304アミノ酸から構成されると推定 された。 C-kaia397は、 926〜928番目に位置する ATGが開始コドン、 1517〜1519 番目に位置する TAGが終始コドンと特定され、 0RFにコードされる蛋白質は 197ァ ミノ酸から構成されると推定された。 配列番号 1に示した C-hsil3412及び配列 番号 2に示した C- kaia397のコードするァミノ酸配列をもとに、 GENETYX-MAC 7.3 (SOFTWARE DEVELOPMENT CO.，LTD製）を用いて疎水性プロットを作製した結果、 両遺伝子の N末端部分には分泌蛋白質に特徴的な疎水性の高い領域が存在した (図 2、 図 3 )。
実施例 4 C-hsil3412及び C- kaia397のゲノム遺伝子の解析
配列番号 3に示した C-hsil3412及び配列番号 4に示した C- kaia397の塩基配 列をもとに、 GenomeWalker™kits (Clontech社製） を用い添付のプロトコ一ルに 従い配列番号 3と配列番号 4で表される塩基配列の両方を含むヒトゲノム D N A領域の塩基配列情報を取得した。 また、 塩基配列デ一夕べ一ス GenBank/EMBL/DDBJを BLAST2を用いて検索し、 配列番号 3と配列番号 4で表され る塩基配列の両方を含むゲノムクローン AL133215の塩基配列情報を得た。
取得したヒトゲノム遺伝子配列と配列番号 3で表される塩基配列および配列 番号 4で表される塩基配列の比較から、 配列番号 3で表される塩基配列は 5つ の部分に、 配列番号 4で表される塩基配列は 7つの部分に別れて同一ヒト第 1 0染色体ゲノム上に約 7 k bにわたつて存在していることが分かった（図 4 )。 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は 5つのェクソンから、 配 列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は 7つのェクソンから構成さ れており、 2番目と 4番目のェクソンは完全に一致していた。 また、 C - hsil3412C-kaia397とでは、 3番目のェクソンの始まりおよび 5番目のェクソ ンの終わりがお互いに異なっているために、 配列番号 1と 2の比較で観察され るアミノ酸配列の違いが生じていることが分かった。 したがって、 配列番号 1 で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と配列番号 2で表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質とは、 お互いに異なるアミノ酸配列を持つというユニークな特 徴を有した、 同じ遺伝子由来のそれぞれ別のスブラィス形態の産物であること が分かった。
実施例 5 C-hsil3412及び C- kaia397を発現している臓器 C- hsil3412のアミノ酸をコードしている塩基配列部分の一部と一致した EST である R30743は胎児の心臓より単離された。また、 C- hsil3412をコ一ドする cMA クローンの 3'末端非翻訳領域の塩基配列をもとに、 塩基配列デ一夕ペース GenBank, EMBL、 DDBJを B L A S T 2を用いて検索したところ、 同一遺伝子由来 の ESTと考えられる塩基配列 11個と一致していることが分かった。 これら ESTの GenBankァクセヅシヨンナンパ一は、 AI658885. W28828、 AI377545、 AA896981S AA68832 AW370932, AA126609, AQ431640N AQ742986、 AI971557、 AL030921で ある。 そのうち、 AI658885, W28828、 AI377545, M896981、 AA688321 AW370932 は、 UniGene Hs.155234として登録されている。 AI658885と M688321は前立腺、 W28828は目、 AA896981は脾臓、 AW370932は乳腺、 M126609は妊娠女性の子宮よ り単離された。
従って、 C-hsil3412が胎児心臓、 前立腺、 目、 脾臓、 乳腺、 妊娠女性の子宮 で発現していることが推定された。 同様に、 C- kaia397をコードする cDNAクロ一 ンの 3'末端非翻訳領域の塩基配列をもとに、 塩基配列データベース GenBank、 EMBLs DDBJを BLAST2を用いて検索したところ、 同一遺伝子由来の ESTと考えられ る塩基配列 7個と一致していることが分かった。 これら ESTの GenBankァクセヅ シヨンナンバーは、 M937577、 AW080122、 AA534966, AW374463, AQ394346, F23541 、 F23538である。 AW080122は食道、 M534966は大腸、 F23538は筋肉より単離さ れた。 従って C- kaia397が食道、 大腸、 筋肉で発現していることが推定された。 実施例 6 RT-PCR法を用いた C- hsil3412及び C-kaia397の発現解析
Clontech社より購入したヒト臓器 polyA+ RNA 4〃g、および癌細胞株から AGPC 法（Analytical Biochemistry, ， 156 (1987)、 実験医学、 1937 ( 1991)〕 にて調製した全 A 4 aもを鎵型とし、 市販の SUPER SCRIPT Preamplification System for first strand cDNA Synthesis (GIBCO BRL社製） を用い、 添付マ二 ュアルに従って cDNAを合成した。
ヒト臓器 polyA+ RMとしては、 脳、 腎臓、 脬臓、 脳下垂体、 小腸、 骨髄、 心 臓、 肝臓、 肺、 リンパ節、 乳腺、 胎盤、 前立腺、 骨格筋、 脾臓、 胃、 精巣、 胸 腺、 甲状腺、 子宮由来の polyA+ RNAを用いた。
癌細胞株としては、 T細胞株 CJurkat (Riken Cell Bank;RCB 086)、 Molt-3
(ATCC CRL -1552) 〕、 B細胞株 Namalwa KJM-1 (J.Biol. C em. , M, 22782, 1993)、 Daudi (ATCC CCL-213))、 単球系細胞株〔HL - 60 (ATCC CCL-240)) 、 血 管内皮細胞株 CHUVEC (クラボウ社）、 IVEC (J.Cell . Physiol. , 151, 41， 1993;N. T.L.FRANCE社）〕、 メラノ一マ細胞株 CWM266-4 (ATCC CRL-1676), WM115 (ATCC CRL- 1675)〕、神経芽細胞種細胞株!: SK- N- MC (ATCC HTB-10)、 SK-N-SH (ATCC HTB- 11 )〕、 肺癌細胞株〔PC-9 (免疫生物研究所)、 HLC-1 (大阪大学癌研究所)、 QG90 (愛知がんセン夕一)〕、 胃癌細胞株 AT0-III (免疫生物研究所)〕、 滕臓 癌細胞株〔Capan- 1 (ATCC HTB-79)、 Capan-2 (ATCC HTB- 80)〕 、 大腸癌細胞株
CColo 205 (ATCC CCL-222)、 SW1116 (愛知がんセン夕一）、 LS180 (ATCC CCL- 187)〕 を用いた。
次いで、 合成した cDNAを錶型として PCRを行った。 すなわち、 下記に示す C-hsil3412及び C-kaia397、 ヒト 5ァクチンに特異的な配列を含むプライマ一 を用い、合成した cDNAを滅菌水を用いて 50倍に希釈した溶液および Advantage11 cDNA PCR kit (Clontech社製）を用いて常法により反応液を調製後、 94°Cで 7分 間反応させ、 次いで 94°Cで 1分間、 68°Cで 3分間のサイクルを 32サイクル反復 し、 最後に 68°Cで 7分間反応させる条件で PCRを行った。 該反応液をァガロー スゲル電気泳動し、 用いたプライマーに特異的な D N Aバンドの濃さを比較す ることで、 発現量の半定量的な比較を行った結果、 C-hsil3412と C-kaia397で は発現様式が異なることが分かった （第 5図） 。
尚、 該 PCRでは、 配列番号 9及び配列番号 1 0で表される塩基配列からなる オリゴヌクレオチドを C- hsil3412に特異的なプライマ一セヅトとして、 配列番 号 9及び配列番号 1 1で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを C-kaia397に特異的なブラィマ一セヅトとして、配列番号 1 2及び配列番号 1 3 で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをヒト^アクチンに特異的な プライマ一セットとして用い反応を行った。 これらのプライマ一セットを用い た上記の RT-PCR反応では、 プライマ一特異的な DNAのバンドが確認され、 その 大きさは C- hsil3412、 C- kaia397、 及びヒ卜/?ァクチンでそれぞれ約 730 bp、 310 bp、 600 bpであった。
さらに、 ヒト正常組織と癌組織間での発現量の違いについて、 Single Tumor Tissue Multi Sample Breast 1 (BioChain社 ) を錶型とし、 上記と同様の条 件で RT-PCRを行った。 C- hsil3412及び C- kaia397は、正常組織及び癌組織のい ずれにも発現しているが、 検討した乳癌組織では発現量の低下傾向が観察され た （第 6図） 。
実施例 7 ノ一ザンプロヅティング法を用いた C- hsil3412及び C- kaia397の発 現解析
96 Dot Tumor/Normal Tissue Total RNA Dot Blot (BioChain社製） を用い、 C-hsil3412及び C- kaia397のヒト癌組織と正常組織間での発現様式について、 以下のように検討した。
( 1 ) DNAプローブの作製
実施例 2で作製した 2つのクロ一ン C- hsil3412または C-kaia397を錡型とし、 配列番号 9および配列番号 1 4で表される塩基配列からなるプライマーセット、 Ex Taq DNA Polymerase (TMMA社製）を用いて常法により反応液を調製後、 94°C で 10分間反応させ、 次いで 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 2分間の反応 を 35回反復し、最後に 72°Cで 10分間反応する条件で PCRを行った。その後、 1 ァガロース電気泳動によって約 300 b の増幅産物を分離することで、 C-hsi 13412及び C-kaia397に共通の DNAプロ一ブを作製した。
配列番号 9および配列番号 1 4で表される塩基配列からなるブラィマ一セッ トは、 配列番号 3と配列番号 4で示される C-hsil3412及び C- kaia397の翻訳領 域の共通な塩基配列に基づいて設計した。 ( 2 ) 標識 DNAプローブの作製
上記 （ 1 ) で作製した DNAプロ一ブを、 ランダムプライム法〔Anal. Biochem. 122 6 (1983)、 Anal. Biochem. , 266 (1984)〕 によりラジオアイソトープ (以下、 「M」 と略す） で標識した。
上記 （ 1 ) の DNA プローブ 75 ng及び [ α- 32 P ]dCTP (NEN社製） 5〃1、 Oligolabelling Kit (Amersham Pharmacia社製） を用い、 添付マニュアルに従 い反応液を調整後、 37°Cで 1 時間反応を行った。 その後、 未反応の標識ヌクレ ォチドを Centri-Sep Spin Column (PRONCETON SEPARATIONS社製） を用い、 3， 000 rpmで 2分間遠心分離して除去することにより、 RI標識した DNAプロ一ブを作 製した。
( 3 ) ハイブリダイゼーション
上述の 96 Dot Tumor/Normal Tissue Total RNA Dot Blot メンプレンをプレ ハイプリダイゼ一シヨン溶液 [6 XSSPE C6 x (0.15MNaCls 8.65mMNa¾P04'2H20、 1.25 mM EDTA)〕、 2xデンハルト溶液 （ナカライテスク社製） 、 50 ¾ ホルムァ ミド、 0.5 % SDS、 100 z サケ精子 MA (Stratagene社製） ] 5 ml中に浸し、 42。Cで振盪させながら、 3時間放置することでプレハイプリダイゼ一シヨンを行 つた。 この間に上記 （2 ) で作製した標識 DNAプローブを 94°Cで 5分間熱変性 し、 一本鎖とした。 3時間のプレハイブリダィゼ一シヨン後、 メンプレンを新た なプレハイプリダイゼーシヨン溶液 2 ml中に浸し、 一本鎖に変性した標識 DNA プローブを RIの比活性が 2 X 106 cpm/ml となるように加え、 42°Cで振盪させな がら、 20.時間放置することでハイブリダィゼ一シヨンを行った。
( 4 ) メンプレンの洗浄
ハイプリダイゼ一シヨン溶液からメンブレンを取り出し、 0.1 % SDSを含む 2 X SSPE中で、 42°C：、 10分間の振盪を 2回、 溶液を交換して行い、 次いで 50°Cで 30分間の振盪を 3回行うことで、 メンブレンを洗浄した。
( 5 ) シグナルの検出 洗浄後のメンブレンを X線フィルム用力セットに X線フィルムとともに入れ、 - 80°Cで 24時間放置することでォ一トラジオグラフィーを行い、 シグナルを検 出した。
シグナルを解析した結果、 正常組織では主に、 胃、 小腸、 胆嚢、 甲状腺、 腎 臓、 膀胱、 胸腺、 前立腺、 乳腺で発現が観察された。 一方、 癌組織では主に、 胃、 脬臓、 膀胱、 前立腺、 乳腺、 甲状腺、 胸腺で発現が観察された。 また、 腎 臓、 胆嚢、 小腸、 甲状腺では正常組織と比べ、 癌組織において発現の低下が観 察されたが、 他の組織では必ずしも有為な差は観察されなかった。 実施例 6で 示したように、 C- hsil3412と C- kaia397の発現様式は組織及び癌種によって異 なることから、 C- hsil3412及び C- kaia397を区別しないプロ一ブを用いたノ一 ザンプロヅティングによる発現解析とともに、 C- hsil3412と C-kaia397を区別 した発現解析の重要性が示唆された。
実施例 8 動物細胞を宿主とした C-hsil3412又は C-kaia397がコードする蛋白 質の発現 （ 1 )
( 1 ) 組換えベクターの作製
( i) pcDNA3-C-hsil3412
実施例 2で作製したクローン C- hsil3412を錡型とし、配列番号 1 5および配 列番号 1 6で表される塩基配列からなるプライマ一セヅト、 KOD DNA Polymerase (T0Y0B0社製）を用いて常法により反応液を調製後、 98°Cで 15秒間、 65°Cで 2秒 間、 74°Cで 30秒間のサイクルを 25サイクル反復する条件で PCRを行った。なお、 配列番号 1 5および配列番号 1 6で表される塩基配列からなるプライマ一セッ トは、 C-hsil3412の C末端に FLAGマ一力一ぺプチドが付加されるように設計し た。 次いで、 得られた約 990 bpの増幅産物を pBluescriptll SK- (Stratagene 社製）の Sial部位に、 C-hsi 13412の 5， 側が pBluescriptll SK-の 1部位側 に、 C-hsil3412の 3， 側が pBluescriptll SK-の 部位側になるように揷入 することにより、 pSK- C- hsil3412を作製した。 次に、 pSK-C- hsil3412の I-Kotl断片 （900 bp) を動物細胞用発現べクタ 一 pcDNA3 ( イ ン ビ ト ロ ジェ ン社製）の EeaRI-MJ 部位に挿入し、 pcDNA3-C-hsil3412を作製した。
(ii) pcDNA3-C-kaia397
実施例 2で作製したクローン C-kaia397を錡型とし、 配列番号 1 5および配 列番号 1 7で表される塩基配列からなるプライマ一セヅト、 KOD DM Polymerase (TOYOBO社製)を用いて常法により反応液を調製後、 98°Cで 15秒間、 65°Cで 2秒 間、 74°Cで 30秒間のサイクルを 25サイクル反復する条件で PCRを行った。なお、 配列番号 1 5と配列番号 1 7で表される塩基配列からなるプライマーセヅトは、 C-kaia397の C末端に FLAGマーカ一ぺプチドが付加されるように設計した。 次 いで、得られた約 620 pの増幅産物を pBluescriptll SK- (Stratagene社製）の Sial部位に、 C- kaia397の 5，側が pBluescriptll SK-の KEHI部位側に、 C-kaia397 の 3，側が pBluescriptll SK-の Saal部位側になるように揷入することにより、 pSK-C-kaia397を作製した。
次に、 pSK- C- kaia397の ECQRI- Ml断片 （600 bp) を動物細胞用発現べクタ 一 pcDNA3 ( イ ン ビ ト ロ ジェ ン社製）の I- I 部位に挿入し、 pcDNA3-C-kaia397を作製した。
( 2 ) 細胞へのベクターの導入
Opti-MEM (ギブコ社製） 100〃 1に FuGENETM6 トランスフエクション試薬 （口シ ュ -ダイァグノスティヅクス社製） 2 /1を加え、 室温で 5分間放置した。 次い でコントロールプラスミ ド pcDNA3、 上記 （1 ) ( i)で作製した C-hsil3412発現 プラスミド pcDNA-3-C- hsil3412、 又は上記 ( 1 ) (ii)で作製した C-kaia397発 現ブラスミ ド PCDNA3-C- kaia397を l〃g添加し、さらに室温で 15分間放置した。 この間に 6ゥエルプレートに 10%dFCSを含む DMEM培地を 2 ml/ゥヱル分注し、 さらに C0S-1細胞 (Riken Cell Bank; RCB0143) を 3 X 105個/ゥヱルで播種した。
15分間放置後、 プラスミ ドと FuGENETM6 トランスフエクシヨン試薬の混合液を 25〃1/ゥ: ϋルずつ 6ゥエルプレ一トへ添加し、 37°Cの C02インキュべ一夕一中で 72 時間培養し、 一過性形質転換株を取得した。 以下、 pcDNA3、 C-hsil3412、 C-kaia397 を導入して作製した形質転換株を、 それぞれ COS-1/mock株、 C0S-l/C-hsil3412株、 C0S-1/C- kaia397株と称する。
( 3 ) 発現の確認
( i )培養上清の調製
上記（2 )で作製した COS- 1/mock株、 COS- 1/C- hsil3412株、 C0S-l/C-kaia397 株の培養上清を 4ml回収し、 1, 200 rpmで 5分間遠心分離して固形物を除去し、 培養上清を取得した。 なお、 取得した培養上清は- 20°Cで保存し、 必要に応じて 解凍後、 以下の実験に用いた。
( ii )細胞破砕液の取得
上記（2 )で作製した COS- 1/mock株、 COS- l/C-hsil3412株、 C0S-1/C- kaia397 株の細胞を、 セルスクレーパー （住友べ一クライト社製） で 6 ゥエルプレート から剥離後、 Phosphate Buffered Saline(pH7.2) 〔以下、 「PBS」 と称す （ギブ コ社製） 〕 2 mlに懸濁し、 1200rpmで 5分間遠心分離して上清を除去した。 次 いで、 動物細胞用プロテア一ゼインヒビ夕一カクテル （シグマ社製） を 含む PBS 1 mlに懸濁した後、 超音波破砕することにより、 細胞破砕液を取得し た。 なお、 取得した細胞破砕液は、 - 20°Cで保存し、 必要に応じて解凍後、 以下 の実験に用いた。
( iii )ウエスタンプロヅティングによる検出
上記 （3 ) ( i )で調製した培養上清 または上記 （3 ) ( ii )で調製した細 胞破砕液 5〃1を、 実施例 1 4の記載に従い、 検出抗体として抗 FLAG M2モノク 口一ナル抗体（シグマ社製） を用いてウエスタンブロッテイングを行った。
COS- l/C-hsil3412株、 COS- l/C-kaia397株では、 COS-1/mock株には観察され ないバンドが細胞破砕液、培養上清のいずれにも検出された。従って、 C0S-1細 胞において、 C- hsil3412および C-kaia397がコ一ドする蛋白質の発現が確認さ れた （第 7図） 。
実施例 9 動物細胞を宿主とした C-hsil3412または C- kaia397がコ一ドする蛋 白質の発現 （2 )
( 1 ) 組換えべクタ一の作製
(i) pAGE210-C-hsi 13412および pAGE210- C-hsil3412hの作製
実施例 8で作製した pSK-C- hsil3412を錶型とし、 配列番号 1 8および配列番 号 1 9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマ一セヅト、 または配列番号 1 8および配列番号 2 0で表される塩基配列からなるオリゴヌ クレオチドのプライマーセヅトと native pfu polymerase (STRATAGENE社製） を用いて常法により反応液を調製後、 94°Cで 5分間反応させ、 次いで 94°Cで 1 分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 2分間のサイクルを 25サイクル反復し、最後に 72°C で 7分間反応させる条件で PCRを行った。
次いで、 得られた約 900 b の増幅産物を pBluescriptll SK-の iLindlll-Xhal 部位に挿入し、 pSK-C- hsil3412c及び pSK- C-hsil3412hを作製した。
次に、 pSK- C- hsil3412c及び pSK-C-hsil3412hの Hindlll- hal断片 （900 bp) を動物細胞発現用べクタ一 pAGE210[J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]の Hindlll -Xhal部位に揷入し、 pAGE210- C- hsil3412および pAGE210-C- hsil3412hを作製 した。
(ii) pAGE210-C- kaia397および pUC -C-kaia397h
実施例 8で作製した pSK-C- kaia397を錶型とし、 配列番号 1 8および配列番 号 2 1で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのプライマ一セットま たは配列番号 1 8および配列番号 2 2で表される塩基配列からなるオリゴヌク レオチドのプライマーセヅトを用い、 上記 (i)と同様に PCRを行った。
次いで、 得られた約 600 b の増幅産物を pBluescriptll SK-の Hifldlll-M 部位に挿入し、 pSK-C- kaia397c及び pSK-C- kaia397hを作製した。
次に、 pSK- C-kaia397c及び pSK- C-kaia397hの Eindlll-Xhal断片 （600 bp) を PAGE210及び pUC18 (Amershajn Pharmacia社製） の Hindlll- hal部位に挿入し、 pAGE210-C-kaia397および pUC- C- kaia397hを作製した。
( 2 ) 細胞へのベクタ一の導入
上記（ 1 ) ( i )、（ii)で作製した PAGE210- C- hsil3412、 pAGE210- C- hsil3412h、 及び pAGE210-C-kaia397、 pUC-C-kaia397h は、 エレクト口ポレーシヨン法 CCytotechnology, 3, 133(1990)〕 により以下のようにして CH0細胞 Somatic Cell and Molecular Genetics, 1Z, 555(1986)〕 へ導入した。
PAGE210, pAGE210- C- hsil3412、 pAGE210-C-hsil3412h、 pAGE210- C- kaia397、 pUC- C- kaia397hは ESEIで切断し、線状化した。 フエノール—クロ口ホルム抽出 処理の後、 エタノール沈殿を行い、 得られた線状化プラスミドを TE溶液に溶解 した。一方、 CH0細胞は 5%ゥシ胎児血清 (ギブコ社製)、 0.09%重曹 (ギブコ社製)、
1¾ Penicillin- streptomycin (ギブコ社製）を添加した α:ΜΕΜ1900培地 (ギブコ社 製、 以下、 「Α培地」 という）で継代したものを用いた。 CH0細胞を Κ- PBS緩衝 液（137nmol/l塩化力リゥム、 2.7nmol/l塩ィ匕ナトリゥム、 8.1腿 ol/lリン酸ー 水素ニナトリウム、 1.5nmol/lリン酸ニ水素ーナトリウム、 4腿 ol/l塩化マグネ シゥム緩衝液）に懸濁して 8 X 106細胞個/ mlとし、細胞懸濁液 200〃1 (1.6 X 106 個の細胞を含む） を上記線状化プラスミド 4〃gと混和した。該混和液をキュべ ヅト（電極間距離 2腿)に移し、 GenePulserII (BioRad社製)装置を用いてパルス 電圧 0.30kV、電気容量 250 Fの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上 で.静置後、 キュべヅト中の細胞懸濁液を 15mlの A培地に懸濁し、 うち 5mlをフ ラスコに分注して 37°C；、 5%炭酸ガス培養器中で培養した。 1 日間培養後、 5% ゥシ胎児血清、 0.09%重曹、 1% Penicillin-streptomycins 300〃g/mlハイグロ マイシン B (ギブコ社製） を添加した αΜΕΜ2000培地（以下、 「Β培地」 という） に培地交換し、 培養を続けた。 途中希釈しながら継代を続け、 遺伝子導入より 約 2週間後に、 ハイグロマイシン Βに耐性を持つ形質転換細胞株を取得した。 該形質転換株は、 Β培地で継代した。 以下、 pAGE210、 pAGE210-C-hsil3412s pAGE210-C-hsil3412hs pAGE210-C-kaia397 pUC-C-kaia397hを導入して作製し た形質転換株を、 それぞれ CHO/mock株、 CH0/C-hsil3412株、 CHO/C- hsil3412h 株、 CHO/C- kaia397株、 CHO/C- kaia397h株と称する。
( 3 ) 発現の確認
上記（ 2 )で作製した CHO/mock株、 CHO/C- hsil3412株、 CHO/C- hsil3412h株、 CHO/C- kaia397株、 CH0/C-kaia397h株を B培地を用いて静置培養した。 コンフ ルェン卜の約 5分の 1の細胞密度で播種した細胞が 25cm2の培養容器のほぼ全面 を埋め尽くす状態まで生育させ、 培養上清と細胞を分けて回収した。 回収した 培養上清は、培養上清 100 ^1に対して、ァセトンを用いた有機溶媒沈殿を行い、 100mmol/l Tris- HC1緩衝液 (pH7.5)50 lに再溶解し上清画分とした。 また、 細 胞はセルスクレーパーを用いて回収し、 500〃1 の 100mmol/l Tris-HCl緩衝液 (PH7.5)に懸濁後、 超音波破砕を行い細胞画分とした。 調製した上清画分または 細胞画分それぞれ 11.25〃 1を Lae蓮 li法による SDSポリアクリルアミド電気泳 動で分離後、 実施例 1 3で作製した抗 C-hsil3412/C-kaia397モノクローナル抗 体 KM2962を用いて、 実施例 1 4の記載に従い、 ウエスタンプロヅティング解析 ¾行つに。
CHO/C- hsil3412株、 CH0/C-hsil3412h株、 CH0/C-kaia397株、 CH0/C-kaia397h 株のいずれにおいても、培養上清'細胞画分共に、 C-hsil3412または C-kaia397 の発現が認めらた。 その発現量は、 いずれの形質転換株でも培養上清より細胞 画分の方が高かった。 さらに、 分子量は COS- 1細胞を宿主として発現させた C0S-l/C-hsil3412株、 C0S-1/C- kaia397株の場合とほぼ同じ移動度を示した。 以上より、 C-hsil3412および C- kaia397の CH0細胞での発現が確認された（第 8図） 。
( 4 )糖鎖修飾の確認
次に、 上記（3 ) で調製した上清画分 36〃1または細胞画分 に、 SDS を加え、 95°Cで 5分間熱変性させた。 変性後、 上清画分 14.5 zlまたは 細胞画分 14.5〃1 に、 5% Nonidet P-40 〔NP-40；ポリオキシエチレンノニルフ ェニルエーテル （シグマ社製） 〕 5 1、 25 mM/50〃lの Glycopeptidase F 〔N型 糖鎖切断酵素 (宝酒造社製)〕 Ι λ、 および 25 mM/50〃lの o-Glycosidase 〔o型 糖鎖切断酵素（ロシュ ·ダイァグノスティヅクス社製)〕 1〃1 を加え、 37°Cで一 晚反応させた。 対照として、 糖鎖切断酵素溶液の代わりに 100腿 ol/l Tris-HCl 緩衝液 (pH7.5)8 lを加えた反応液を調製した。 反応後の上清画分 11.25〃1ま たは細胞画分 11.25〃1を用い、 上記 （3 ) と同様にウエスタンブロッテイング 解析を行った。
糖鎖切断酵素を添加したことにより分子量が変化していることから、 該形質 転換細胞により生産された C- hsil3412および C- kaia397がコ一ドする蛋白質は、 糖鎖修飾されていることが推定された （第 8図） 。
実施例 1 0 昆虫細胞を宿主とした C- hsil3412がコードする蛋白質の発現 昆虫細胞による組換え蛋白質の生産には目的遺伝子を組み込んだ組換えウイ ルスの作製が必要であるが、 その作製には、 （ 1 ) 目的の蛋白質をコードする cDNAを持つ特殊なベクタ一を作製する過程、 ( 2 ) バキュロウィルス MAとト ランスファーべクタ一とを昆虫細胞にコトランスフエクシヨンし、 相同組換え により組換えウィルスを作製し、 さらに増殖させる過程、 および （3 ) 組換え ウィルスを細胞に感染させ、 目的の蛋白質を発現させる過程が含まれる。 以下 に詳細を説明する。
( 1 ) トランスファーベクタ一の作製 ' C-hsil3412 の全長 （配列番号 1のアミノ酸番号 1〜 3 0 4番目のアミノ酸配 列） をコードするトランスファ一ベクタ一、 pVL-C- hsil3412 を実施例 8に記載 のプラスミ ド pSK- C-hsil3412の l- EamHI断片 （900 bp) を昆虫細胞トラン スファ一ベクタ一 PVL1392 (ファーミンジェン社製） の I- I部位に挿入 して作製した。
( 2 ) 組換えウィルスの作製 ESF921 メディウム （プロテインエクスプレッション社製） にて培養した昆虫 細胞 Sf9 (岩城硝子社製） に線状パキュロウィルス D NA 〔バキュロゴ一ルド - バキュロウィルス DNA (ファーミンジヱン社製） 〕および、 上記 （ 1 ) で作製し たトランスファ一ベクタ一をリボフヱクチン法 〔蛋白質核酸酵素， 31, 2701 (1992) 〕 で導入することにより、 組換えバキュロウィルスを作製した。 以下 に詳細を説明する。
pVL-C-hsil3412と線状バキュロウィルス D NA 15 ngを 12〃1の滅菌蒸留水 に溶解し、 さらに、 リポフエクチン 6〃1 と滅菌蒸留水 6 1 とを混和したもの を添加し、 室温で 15分間放置した。 一方、 Sf9細胞 l x 106個を 2 mlの ESF921 培地に懸濁し、 直径 50讓の細胞培養用プラスチックシャーレに入れた。 ここ に、 上記のプラスミ ド D N A、 線状バキュロウィルス D NA、 およびリポフエ クチン混和溶液全量を加え、 27°Cで 3 日間培養後、 組換えウィルスを含む培養 上清 l mlを採取した。 シャーレには新たに ESF921培地 1 mlを添加し、 さらに 27°Cで 3日間培養し組換えウィルスを含む培養上清をさらに 1.5 ml取得した。 つぎに、 C-hsil3412遺伝子を運ぶ組換えウィルスを以下の手順で増殖させた。
Sf 9細胞を 50 mlの ESF921培地中で 5 X 105 /mlとなるようにして、 125 mlの 三角フラスコを用い、 27°Cにて 125 rpmで振盪培養した。 細胞が Z x lO^/mlまで 増殖した時点で、 組換えウィルスを M0I = 10 となるように感染させ、 さらに 3 日間培養した。 培養液を 1,200 rpmで 10分間遠心分離して細胞を除去し、 蛋白 質発現に使用する組換えウィルス溶液を得た。
組換えウィルス溶液の力価は以下に示す方法で測定した。
Sf 9細胞 6 X 105個を 4 mlの ESF921培地に懸濁し、 直径 50雇の細胞培養用プ ラスチックシャーレに入れ、 室温で 1時間放置して細胞をシャーレに付着させ た。 上清を除き、 ESF921培地 400 zlと ESF921培地で希釈した上記組換えウイ ルス溶液 100 /1を加え、室温で 1時間放置した後、培地を除き、 5mlの 1%低融 点ァガロース 〔ァガ一プラーク ·ァガロース （ファーミンジェン社製） 〕 を含 む培地 〔滅菌した 1 mlの 5%ァガープラークプラス ·ァガロース水溶液と 4 ml の TM - FHインセクトメディウム （ファーミンジェン社製） を混和し、 42°Cに保 温したもの〕 を該シャーレに流し込んだ。 室温で 15分間放置した後、 乾燥を防 ぐためにビニールテープをシャーレに巻き、 密閉可能なプラスチック製容器に 該シャーレを入れ、 27°Cで 5日間培養した。該シャーレに 0.01%のニュートラル レッドを含む PBSを 1 ml加え、 さらに 1日培養した後、 出現したプラークの数 を数え、 0.5〜2 X lOVmlの組換えゥィルス溶液を調製できたことを確認した。
( 3 ) 蛋白質の発現
Sf9細胞を 5 x lOVmlとなるように 100 mlの ESF921培地中で、 250 mlの三角 フラスコを用い、 27°Cにて 125 rpmで振盪培養した。 細胞が 3〜4x l06/mlにま で増殖した時点で、 3X 107個になるように、 25 mlの ESF921培地をあらかじめ 添加してある底面積 182 cm2のフラスコに継代した。 室温で 1時間放置して細胞 を付着させた後、培地を除去し、 C-hsil3412遺伝子を運ぶ組換えウィルスを M0I = 5になるように添加し、 さらに ESF921培地を添加して 10 mlとし、 室温で 1 時間感染させた。 その後、 ESF921培地を 20 ml添加し、 27°Cで 3日間培養して 目的の組換え蛋白質を発現させた。
C-hsil3412遺伝子を運ぶ組換えウィルスを感染させた細胞の細胞懸濁液 と培養上清 20 / 1を試料として、 実施例 1 4の記載に従い、 抗 FLAG M2モノク 口一ナル抗体 （シグマ社製） を用いたウェス夕ンプロッテイングを行った。
C-hsil3412を感染させた細胞の細胞懸濁液、 培養上清中にはともに、 非感染 細胞のそれらには見られない分子量約 33 kDaのバンドが検出された（第 9図）。 実施例 1 1 C-hsil3412又は C-kaia397がコ一ドする蛋白質に対する抗体作製 用の抗原の調製
C-hsil3412及び C- kaia397がコ一ドする蛋白質のアミノ酸配列を解析し、 親 水性の高い部分、 N末端、 C末端、 二次構造上ターン構造、 ランダムコイル構造 を有する部分のなかから、 抗原として適当と考えられる部分配列として、 化合 物 1 (配列番号 2 3で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）、 化合物 2 (配列番号 2 4で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド） 、 および化 合物 3 (配列番号 2 5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド） を選択 した。
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、 生化学 命名に関する IUPAC- IUB委員会 （IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature) の勧告 〔ョ一口ビアン ·ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリ ― (European Journal of Biochemistry) , 138卷， 9頁 （1984年） 〕 に従つ た。
以下の略号は、 特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ala: L-ァラニン
Asn: L-ァスパラギン
Asp: L-ァスパラギン酸
Asx: L-ァスパラギン酸または L-ァスパラギン
Arg: L-アルギニン
Cys: L-システィン
Glu: L-グル夕ミン酸
Glx: L -グルタミン酸
Gly: グリシン
Leu: L-ロイシン
Phe: L-フエ二ルァラニン
Pro: L-プロリン
Ser: L-セリン
Thr: L-スレオニン
Trp: L-トリプトファン
Tyr: L-チロシン Met: L-メチォニン
Val : L -バリン
以下の略号は、 対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を 表す。
Fmoc : 9-フルォレニルメチルォキシカルボニル
tBu: t -プチル
Trt: トリチル
Boc : t-ブチルォキシカルボニル
Pmc : 2, 2， 5， 7, 8-ペン夕メチルクロマン- 6-スルフォニル
Fmoc-Arg(Pmc)-0H: Να- 9-フルォレニルメチルォキシカルボニル- Ng- 2,2, 5, 7, 8- ペン夕メチルクロマン- 6-スルホニル- L-アルギニン
Fmoc-Asn(Trt)-OH: Να- 9-フルォレニルメチルォキシカルボニル -Ny-トリチル -L-ァスパラギン
Fmoc-Asp(0tBu)-0H: Να-9-フルォレニルメチルォキシカルボニル- L-ァスパラギ ン酸- β - 1-プチルエステル
Fmoc-Cys(Trt)-0H: Να-9-フルォレニルメチルォキシカルボニル- S-トリチル -L- システィン
Fmoc-61u(0tBu)-0H: Να— 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル -L-グルタミ ン酸-ァ -t-ブチルエステル
Fmoc-Ser(tBu)-OH: Να- 9-フルォレニルメチルォキシカルボニル- 0- 1-プチル -L- セリン
Fmoc-Thr(tBu)-0H： Να -9-フルォレニルメチルォキシ力ルボニル -0-t -プチル -L- スレオニン
Fmoc- Trp(Boc )-0H: Na- 9-フルォレニルメチルォキシカルボニル - Nind-t-プチル ォキシカルボニル -L-トリブトファン
Fmoc-Tyr(tBu)-OH: IT- 9-フルォレニルメチルォキシカルボニル -0-t-プチル- L- チロシン
以下の略号は、 対応する下記の反応溶媒、 反応試薬等を表す。
HBTU: 2- (1H -ペンゾトリアゾ一ル -1-ィル） -1, 1，3, 3-テトラメチルゥロニゥム■ へキサフルォロホスフヱ一ト
HOBt: N-ヒドロキシベンゾ'トリァゾ一ル
DIEA: ジイソプロピルェチルァミン
DMF : Ν,Ν-ジメチルホルムアミド
TFA: トリフルォロ酢酸
以下の実施例において、 化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。 質量分析は、 日本電子 JMS-HX110Aを用い FAB-MS法により、 もしくはブル力 一社質量分析装置 REFLEXを用い MALD I- T0FMS法により行った。ァミノ酸分析は、 コ一ェン （Cohen, S. A. ) らの方法 〔アナリティカル 'バイオケミストリ一 (Analytical Biochemistry), 19 (1994)〕 により行った。 加水分解は塩酸 蒸気中 110°Cで 20時間行い、 加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ ·アキ ュ ·タグ （Waters AccQ-T½) アミノ酸分析計（Waters社製） を用い分析した。 ( 1 ) 化合物 1 (配列番号 2 3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド H-Cys-Arg-Pro-Ser-Pro-Gly-Pro-Asp-Tyr-Leu-Arg-Arg-Gly-Trp-Met-Arg-Leu- NH2) の合成
Fmoc - NHヽ 18 zmol が結合した担体樹脂 (Rink amide MBHA resin樹脂、 ノバ ビオケム社製） 30fflgを自動合成機 （島津製作所） の反応容器に入れ、 600〃1の DMFを加えて 3分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従 い次の操作を行った。
(a) 30% ピぺリジン- DMF溶液 500〃1 を加えて混合物を 4分間攪拌し、 該溶液 を排出し、 この操作をもう 1 回繰り返した。
(b) 担体樹脂を 600〃1 の DMF で 1 分間洗浄し、 該溶液を排出し、 この操作 を 5 回繰り返した。 (c) Fmoc-Leu-OH (165〃mol)、 HBTU (165Admol )、 HOBt 1水和物 ( 165 mol )お よび DIEA (330〃mol ) を DMF (660〃1)中で 3分間攪拌し、 得られた溶液を樹 脂に加えて混合物を 60分間攪拌し、 溶液を排出した。
(d) 担体樹脂を 900 /1 の DMF で 1分間洗浄後溶液を排出し、 これを 5 回繰 り返した。
以上の工程により、 Fmoc-Leu- NHが担体上に合成された。
次に、 （a) (b)の工程の後、 （c)の工程で Fmoc-Arg(Pmc)- 0H を用いて縮合反 応を行い、 （d)の洗浄工程を経て、 Fmoc- Arg(Pmc)- Leu- NHが担体上に合成され た。
以下、 工程（c)において、 Fmoc-Met- 0H、 Fmoc- Trp(Boc)-0H、 Fmoc-Gly- 0H、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Leu-OH ^ Fmoc-Tyr(tBu)- 0H、 Fmoc-Asp(0tBu)-0H Fmoc-Pro-OHヽ Fmoc-Gly-OH, Fmoc- Pro-0H、 Fmoc- Ser(tBu)-0H、 Fmoc- Pro-0H、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Cys(Trt)-0H を順次用いて、 （a)〜（ を繰り返した後、 （a)(b)の脱保護、 洗浄工程を経て、 メタノール、 プチルェ一 テルで順次洗浄し、 減圧下 12 時間乾燥して、 側鎖保護ペプチドの結合した担 体樹脂を得た。これに、 5mg/mLの濃度で 2-メチルインドールを含む TFA(82.5%)、 チオア二ソ一ル （5%) 、 水 （5%) 、 ェチルメチルスルフィ ド （3%)、 1,2-エタ ンジチオール （2.5%) およびチォフエノール （2%) からなる混合溶液 lml を加 えて室温で 6時間放置し、 側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを 切り出した。 樹脂を濾別後、 得られた溶液にエーテル約 10ml を加え、 生成し た沈澱を遠心分離およびデカンテ一シヨンにより回収し、 粗ぺプチドとして 42.1mgを取得した。 この粗生成物を、 酢酸水溶液に溶解後、 逆相シリカゲル充 填力一トリッジ（YMC Dispo SPE C18)に通塔してぺプチドを吸着させ、 0.1% TFA、 15%ァセトニトリル水溶液で洗浄後、 0.1%TFA、 25%ァセトニトリル水溶液で溶出 させ、 化合物 1を含む画分を得た。 これを凍結乾燥して、 化合物 1を 28.9mg得 た。 質量分析 [FABMS] ； m/z = 2058.9 (M+H+)
アミノ酸分析； Asx 1.0 (1), Ser 1.0 (1)， Gly 2.0 (2), Arg 3.9 (4)， Pro 2.9 (3), Tyr 1.0 (1), Met 1.0 (1), Leu 2.1 (2), Cys 1.2 (1)
( 2) 化合物 2 (配列番号 24で表されるアミノ酸配列からなるペプチド H-Cys-Arg-Pro-Pro-Ala-Phe-Thr-Pro-Arg-Ala-Pro-Asp-Arg-Val-Thr-Ser-Ile- 0H) の合成
Fmoc-Ile, 14.4 mol が結合した担体樹脂 （Wang '樹脂、 ノバビオケム社製） 30mg を出発物質として、 （ 1 ) と同様にして、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-0H, Fmoc- Va 0H、 Fmoc- Arg(Pmc)-0H、 Fmoc-Asp(OtBu)- 0H、 Fmoc-Pro-0Hs Fmoc- Ala-0H、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Pro- 0H、 Fmoc-Thr(tBu)-0Hs Fmoc-Phe-OHs Fmoc- Ala- 0H、 Fmoc-Pro-0H Fmoc- Pro- 0H、 Fmoc-Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Cys(Trt)-0Hを順次縮合した後に、 Fmoc基除去、 洗浄、 乾燥を経て、 側鎖 保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。 これに、 TFA (82.5%) 、 チオアニソ —ル (5¾) 、 水 (5%) 、 ェチルメチルスルフィ ド ) 、 1，2-エタンジチォー ル （2.5%) およびチォフエノール （2%) からなる混合溶液 1ml を加えて室温で 8時間放置し、 側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。 樹脂を濾別後、'得られた溶液にエーテル約 10ml を加え、 生成した沈澱を遠心 分離およびデカンテーシヨンにより回収し、 粗ペプチドとして 29.2m を取得し た。 この粗生成物を、 酢酸水溶液に溶解し、 逆相シリカゲル充填力一トリッジ (YMC Dispo SPE C18) に通塔してぺプチドを吸着させ、 0.1% TFA、 10%ァセト 二トリル水溶液で洗浄後、 0.1%TFA、 25%ァセトニトリル水溶液で溶出させ、 ィ匕 合物 2を含む画分を得た。 これを凍結乾燥して、 化合物 2を 24.5mg得た。 質量分析 [T0FMS] ； m/z = 1883.6 (M+H+)
アミノ酸分析； Asx 1.0 (1)， Ser 1.0 (1)， Arg 3.0 (3), Thr 1.9 (2), Ala 2.1
(2), Pro 4.0 (4), Val 1.0 (1), lie 1.0 (1), Phe 1.0 (1), Cys 1.3 (1) ( 3 ) 化合物 3 (配列番号 2 5で表されるアミノ酸配列からなるペプチド H-Cys-Asn-Leu-Val-Pro-Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ser-Glu-Glu-Asn-Asp-Asp-Tyr- Tyr-OH) の合成
Fmoc-Tyr(tBu), 18〃mol が結合した担体樹脂 (SynProPep Resin樹脂、 島津 製作所製） 30iDgを出発物質として、 （ 1 ) と同様にして、 Fmoc- Asp(OtBu)- 0H、 Fmoc- Asp(OtBu)- 0H、； Fmoc- Asn(Trt)- 0H、 Fmoc- Glu(OtBu)- 0H、 Fmoc-Glu(OtBu)- 0H、 Fmoc-Ser(tBu)- 0H、 Fmoc-Glu(OtBu)- 0H、 Fmoc- Ala-0H、 Fmoc-Glu(OtBu)- 0H、 Fmoc-Glu(0tBu)-0H、 Fmoc-Glu(0tBu)-0H、 Fmoc- Pro- OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-0H、 Fmoc- Cys(Trt)-0Hを順次縮合した後に、 Fmoc 基除去、 洗浄、 乾燥を経て、 側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。 こ れに、 TFA (90%)、 チオア二ソ一ル （5%)、 および 1,2 -エタンジチオール （5%) からなる混合溶液 1ml を加えて室温で 2時間放置し、 側鎖保護基を除去すると ともに樹脂よりペプチドを切り出した。 樹脂を濾別後、 得られた溶液にェ一テ ル約 10ml を加え、 生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーシヨンにより回 収し、 粗ペプチドとして 32.5mgを取得した。 この粗生成物を、 酢酸、 ジチォス レイトール、 DMFおよび水からなる混合溶液に溶解し、逆相シリカゲル充填力一 トリヅジ （YMC Dispo SPE C18) に通塔してぺプチドを吸着させ、 0.1% TFA、 10%ァセトニトリル水溶液で洗浄後、 0.1%TFA、 25%ァセトニトリル水溶液で溶出 させ、 ィ匕合物 3を含む画分を得た。 これを凍結乾燥して、 化合物 3を 17.1mg得 た。
質量分析 [T0FMS] ； m/z = 2148 (M+H+)
アミノ酸分析; Asx 4.0 (4), Glx 6.2 (6), Ser 1.0 (1)， Ala 1.1 (1 ), Pro 1.0 (1), Tyr 1.8 (2), Val 0.9 (1), Leu 0.9 (1), Cys 1.0 (1) 実施例 1 2 C-hsil3412又は C-kaia397がコ一ドする蛋白質を認識するポリク 口一ナル抗体の作製
( 1 ) 免疫原の調製
実施例 1 1で得られた化合物 2及び化合物 3は、 免疫原性を高める目的で以 下の方法で KLH (カルビオケム社製） とのコンジュゲートを作製し、 免疫原とし た。 すなわち、 KLHを PBSに溶解して 10 fflg/mlに調製し、 1/10容量の 25 mg/ml MBS N-(m-Maleimidobenzoyloxy succinimide；ナカライテスク社製〕 を滴下 して 30分間撹拌反応させた。あらかじめ PBSで平衡化したセフアデックス G-25 カラム（アマシャムフアルマシァ社製）でフリ一の MBSを除いて得られた KLH- MB 2.5 mgを 0.1 Mリン酸ナトリウムバヅファー （pH7.0) に溶解したペプチド 1 m と混合し、 室温で 3時間、 撹拌反応させた。 反応後、 PBSで透析したものを免疫 原として用いた。
( 2 ) 動物の免疫と抗血清の調製
上記 （1 ) で調製した化合物 2及び化合物 3の KLHコンジュゲート 100〃gを それぞれ水酸化アルミニゥムアジュバンド 〔Antibodies - A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, p99、 1988〕 2 mg及び百日咳ワクチン （千葉 県血清研究所製） 1 X 109細胞とともに 6-8週齢雌 BALB/cマウス各 1匹に投与し た。 投与 2週間後より、 各 KLHコンジュゲート 100 zgを 1週間に 1回、 計 4.回 投与した。 該マウスの頸動脈より採血し、 抗血清を調製した。
( 3 ) 被免疫マウス抗血清によるウエスタンプロッティング
実施例 8で得られた COS - 1/C- hsil3412株及び COS- l/C-kaia397株の細胞破砕 液 5 〃 1を C-hsil3412及び C- kaia397がコードする蛋白質のサンプルとして用 い、 実施例 1 4の記載に従い、 検出抗体として上記 （2 ) で得られた被免疫マ ウス抗血清 50( ilを用いたウエスタンブロヅティングを行った。
化合物 2及び化合物 3を免疫原として得られたマウス抗血清は、 それぞれ C-hsil3412 C- kaia397がコードする蛋白質を特異的に認識することができるこ とが確認された （第 10図） 。 実施例 1 3 C-hsil3412又は C- kaia397がコ一ドする蛋白質を認識するモノク ローナル抗体
( 1 ) 免疫原の調製
実施例 1 1で得られた化合物 1について、 実施例 1 2 ( 1 ) と同様の方法で KLHとのコンジュゲートを作製し、 免疫原とした。
( 2 ) 動物の免疫と抗体産生細胞の調製 .
上記（ 1 ) で調製した化合物 1の KLHコンジユゲート 100〃gをそれぞれ水酸 化アルミニウムアジュハ、ンド 〔Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p99、 1988〕 2 mg及び百日咳ワクチン （千葉県血清研究所 製） 1 x 10s細胞とともに 6-8週齢雌 BALB/cマウス各 3匹に投与した。 投与 2週 間後より、 各 KLHコンジュゲート を 1週間に 1回、 計 4回投与した。 該 マウスの頸動 より採血し、 その血清抗体価を以下に示す酸素免疫測定法で調 ベ、 十分な抗体価を示したマウスから最終免疫 3曰後に脾臓を摘出した。
摘出した脾臓を MEM (Minimum Essential Medium) 培地 （日水製薬社製） 中で 細断し、 ピンセヅトでほぐし、 遠心分離（250 xg、 5分間） した。得られた沈殿 画分にトリスー塩化アンモニゥム緩衝液（PH7.6) を添カ卩し、 1〜2分間処理する ことにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分 （細胞画分） を MEM培地で 3 回洗浄し、 細胞融合に用いた。
( 3 )酵素免疫測定法 （バインディング EUSA)
アツセィ用の抗原には実施例 1 1で得られた化合物 1をサイログロプリン
(以下「THY」 という） とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は、 架橋 剤に MBSの代わりに SMCC C4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexane-l-carboxylic acid N-hydroxysuccinimido ester；シグマ社製〕 を用いる以外は実施例 1 2と 同様に行った。 96ゥエルの EIAプレート （グライナ一社製） に、 上記のように 調製したコンジュゲート （10〃g/ml)を 50 /1/ゥエルで分注し、 4°Cで一晩放置 して吸着させた。該プレートを洗浄後、 1 %ゥシ血清アルブミン （以下、 「BSA」 という） ノダルべヅコリン酸緩衝液 （Phosphate buffered saline： PBS) を 100 ml/ゥヱルで加え、 室温で 1時間放置し、 残っている活性基をブロックした。
1時間放置後、 1%BSA/PBSを捨て、 該プレートに被免疫マウス抗血清、 モノク 口一ナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体を 50〃 1/ゥヱル分注 し、 2時間放置した。該プレートを 0.05%ポリオキシエチレン （20) ソルビ夕ン モノラウレート〔商品名：スパン 20 (ICI社商標 Tween 20相当品：和光純薬製）〕 /PBS (以下、 「Tween-PBS」 と略す） で洗浄後、 ABTS基質液 （2.2-アジノビス
(3-ェチルベンゾチアゾール -6-スルホン酸） アンモニゥム、 I mMABTS/O. lMク ェン酸バッファー （pH4.2) ) を添加し、 発色させて 0D415皿の吸光度をプレー トリーダ— 〔Efflax； Molecular Devices社製〕 を用いて測定した。
( 4 ) マウス骨髄腫細胞の調製
8—ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 P3X63Ag8U. l 〔P3-U1： ATCCより購 入〕 を正常培地 〔10% ゥシ胎児血清 （以下、 「FCS」 と略す） 添加 RPMI 培地〕 で培養することにより、 2 X 107個以上の細胞を取得し、細胞融合に親株として供 した。
( 5 ) ハイプリ ドーマの作製
上記 （2 ) で得られたマウス脾細胞と上記 （4 ) で得られた骨髄腫細胞とを 10:1 になるように混合し、 遠心分離 （250 xg、 5 分間） した。 得られた沈殿画 分の細胞群をよくほぐした後、 撹拌しながら、 37°Cで、 ポリエチレングリコ一 ル- 1000 (PEG- 1000) 2 g、 MEM培地 2 ml及びジメチルスルホキシド 0.7mlの混 合液を 1 0 8個のマウス脾細胞あたり 0.5 ml加え、 該懸濁液に 1〜2分毎に MEM 培地 1 mlを数回加えた後、 MEM培地を加えて全量が 50 mlになるようにした。 該懸濁液を遠心分離 （900 rpm、 5分間） し、 得られた沈殿画分の細胞をゆる やかにほぐした後、 該細胞を、 メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかに
HAT培地 10%FCS添加 RPMI培地に HAT/Media Supplement (ロシュ 'ダイァグノ スティックス社製） を加えた培地〕 100 ml中に懸濁した。 該懸濁液を 96ゥヱル 培養用プレートに 200〃 1/ゥエルずつ分注し、 5% C02インキュベータ一中、 37°C で 10〜； 14日間培養した。
培養後、 培養上清を上記 （3 ) に記載した酵素免疫測定法で調べ、 抗原ぺプ チドに反応してコントロールペプチドに反応しないゥエルを選び、 そこに含ま れる細胞から限界希釈法によるクロ一ニングを 2回繰り返し、 抗 C- hsil3412/ C- kaia397モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを確立した。その結果、化合 物 1を抗原に用いて、 2種類の抗 C-hsilS ZZC-kaiaSg?モノクローナル抗体 K 2961及び KM2962を取得した。 KM2961及び KM2962は、 抗原べプチドである化 合物 1に特異的に反応した （第 14図)。
抗 C-hsil3412/C- kaia397モノクローナル抗体 KM2961及び KM2962を産生する ハイプリドーマ細胞株は、平成 13年 5月 24日付けで独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託セン夕ー（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央 第 6 ：郵便番号 305-8566) にそれぞれ FERM BP- 7603、 および FERM BP- 7604と して寄託されている。
( 6 ) モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 8週齢ヌード雌マウス （BALB/c) に上記 （5 ) で得られ たハイプリドーマ株を 5〜20 x l06細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。 10〜21日後、 ハイプリド一マが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、 腹水を 採取（1〜8 ml/匹） した。
該腹水を遠心分離 （1200 xg、 5分間） し、 固形分を除去した。精製 IgGモノ クローナル抗体は、 力プリル酸沈殿法（Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) により精製することにより取得した。 モノ クローナル抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキットを用いた ELISA法 により画 61は IgGlヽ K 2962は IgG3と決定された。
実施例 1 4 KM2961及び KM2962を用いた C-hsil3412または C-kaia397がコ一 ドする蛋白質のウエスタンプロヅティングによる検出 実施例 8で調製した COS-l/mock株、 C0S-l/C-hsil3412株、 C0S-1/C- kaia397 株の細胞破砕液を 2.5〃1 /レーン、 培養上清を 10 zl/レーンで 15% SDS-ポリア クリルアミドゲル電気泳動 (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) にて分画後、 常法に従い PVDF膜 （ミリポア社製） にプロヅティングした。 該膜を 5% skim milk- PBS (以下、 「プロヅキング液」 という） でブロッキング後、 該膜に抗 C- hsil3412ZC-kaia397モノクローナル 抗体 KM2961, あるいは KM2962を 2 /011の濃度になるように添加し、室温で 1 時間放置した。 該膜を Tween-TBSでよく洗浄した後、 二次抗体として 2, 000倍 希釈したペルォキシダ一ゼ標識ゥサギ抗マウスィムノグロプリン （DAK0社製） を用いて検出した。
抗 C-hsilS ZZC-kaiaSg?モノクロ一ナル抗体 KM2961及び KM2962は、実施例 8に記載した C0S-1細胞で発現させた C- hsil3412または C- kaia397がコ一ドす る蛋白質を特異的に認識することが分かった （第 Π図） 。
実施例 1 5 C-hsil3412又は C- kaia397がコ一ドする蛋白質と IGFとの結合
C-hsil3412及び C-kaia397がコードする蛋白質の IGFとの結合性を調べるた め、 実施例 8で取得した C0S-l/C-hsil3412株、 C0S-l/C-kaia397N 及びコント ロールとして COS-1/mock株の細胞破砕液を用い、ファーウエスタン（Molecular Cloning A Laboratory Manual Third Edition Cold Spring Harbor Laboratoryヽ タンパク実験プロトコル 1 秀潤社） による検討を行った。
COS- l/mock株、 COS- l/C-hsil3412株、 COS- l/C-kaia397株の細胞破碎液をそ れぞれ 5 / 1/レ一ンで実施例 1 4の記述に従い SDS- PAGEを行い、 PVDF膜に転写 してブロッキングした。 その後、 ブロ ヅキング液で希釈したヒト IGF - 1
(Peprotech社製） Ζ Ι, ヒト IGF-II (Peprotech社製) 2〃g/ml、 あるいは ヒト インシュリン （シグマ社製） 2 zg/ml を該膜とともに封入し、 室温で一晚 反応させた。ついで、該膜にそれぞれ抗ヒト IGF-Iモノクローナル抗体（Upstate
Biotechnology 社製） 、 抗ヒ ト IGF-II モノクローナル抗体 （Upstate Biotechnology社製)、又は抗ヒト インシュリンポリク口一ナル抗体 (Santa C z 社製）を 2〃g/mlになるように添加し、室温で 1時間放置した。該膜を Tween- TBS でよく洗浄した後、 二次抗体として 2, 000倍希釈したペルォキシダーゼ標識ゥ サギ抗マウスィムノグロプリン （DAK0社製） を用いて検出した。
抗 IGF- 1抗体および抗 IGF- II抗体では C- hsil3412, C-kaia397がコ一ドする 蛋白質由来のそれぞれ分子量約 33 kDa、 約 22 kDaのバンドが検出されたが、 抗 ィンシュリン抗体を用いた場合はこれらのバンドは検出されなかった。従って、 C-hsil3412又は C-kaia397がコードする蛋白質は、 及び IGF- IIとは結合 するが、 インシュリンとは結合しない可能性が示された （第 12'図） 。
実施例 1 6 C-hsil341 又は C- kaia397がコ一ドする蛋白質の癌細胞に及ぼす 効果
C-hsil3412及び C- kaia397の癌細胞増殖への作用を調べるため、 実施例 8で 取得した COS- 1/mock株、 COS- 1/C- hsil3412株、 COS- 1/C- kaia397株の培養上清 を用い、 ヒト大腸癌細胞株 HT-29 (ATCC HTB-38) の IGF依存的な増殖に与える 影響を以下のように検討した。
ゥシ血清アルブミン （ギブコ社製） 200〃g/ml、 ヒトトランスフェリン （ギブ コ社製） 10 /g/ml、 ペニシリン （ギブコ社製） 50 unit/ml、 ストレブトマイシ ン （ギブコ社製） 50 g/mlを添加した D- MEM/F- 12培地（ギブコ社製） 中に l x 105 cells/mlで調製した HT- 29細胞を、 96ゥエルプレートに 50〃l/wellで播種 し、 37°Cの C02インキュベータ一中で 3時間培養した。 次に、 ヒト IGF- I (Peprotech社製） 、 又はヒト IGF- II (Peprotech社製） をそれぞれ終濃度 0.1 ng/mlとなるように添加した。続いて COS- 1/mock株、 COS- l/C-hsil3412株、 又 は COS- 1/C- kaia397株の培養上清を 5〃l/well となるように添加して、 さらに 37°Cの C02インキュベータ一中で 3日間培養した後、 生細胞数を Cell Proliferation Reagent WST-1 (ロシュ ·ダイァグノスティックス社製） により 測定した。 COS- l/C-hsil3412株および COS-l/C- kaia397株の培養上清は、 IGF依存的な ヒト大腸癌細胞株 HT- 29細胞の増殖を阻害することが示された （第 13図） 。 纏卜の刺用可能件
本発明によれば、 新規インスリン様増殖因子結合蛋白質、 該蛋白質をコード する D N A、 該蛋白質を認識する抗体、 および該蛋白質が関与する疾患の判定 法、 診断薬、 予防薬および治療薬が提供できる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号 5—人工配列の説明：合成 R NA
配列番号 6一人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 7—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 8—人工配列の説明：合成 D NA
配列番号 9一人工配列の説明：合成 D NA
配列番号 1 0—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 1 1—人工配列の説明：合成 D NA
配列番号 1 2—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 1 3一人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 1 4—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 1 5—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 1 6一人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 1 7—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 1 8—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 1 9一人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 2 0—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 2 1一人工配列の説明：合成 D NA
配列番号 2 2一人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 2 3一人工配列の説明：合成べプチド 配列番号 2 一人工配列の説明：合成べプチド 配列番号 2 5—人工配列の説明：合成べプチド

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるィンスリン様増殖因子結 合蛋白質。
2. 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるインスリン様増殖因子結 合蛋白質。
3. 以下の （A) または （B ) に記載の蛋白質。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ請求項 1に記載の蛋白 質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
( B ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ請求項 2に記載の蛋白 質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
4. 以下の （A) または （B ) に記載の蛋白質。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列からなり、 かつ請求項 1に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有 する蛋白質
( B ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列からなり、 かつ請求項 2に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を有 する蛋白質
5. 以下の （A) または （B ) に記載の蛋白質。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 7 5〜8 2番のァミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、 かつ請求項 1に記載の蛋白 質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
( B ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 7 5〜8
2番のァミノ酸配列を含むァミノ酸配列からなり、 かつ請求項 2に記載の蛋白 質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
6. 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) 請求項 5 (A) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ請求項 1に記載の蛋 白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(B) 請求項 5 (B) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ請求項 2に記載の蛋 白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
7. 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) 請求項 5 (A) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、 かつ請求項 1に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を 有する蛋白質
(B) 請求項 5 (B) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、 かつ請求項 2に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を 有する蛋白質
8. 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 171〜 304番のァミノ酸配列を含む部分ァミノ酸配列からなり、 かつ請求項 1に記 載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する請求項 5の （A) に記載の蛋白質
(B) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 アミノ酸番号 171〜 197番のアミノ酸配列を含む部分アミノ酸配列からなり、 かつ請求項 2に記 載の蛋白質と実質的に同一の活性を有する請求項 5の （B) に記載の蛋白質
9. 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) 請求項 8 (A) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ請求項 1に記載の蛋 白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
(B) 請求項 8 (B) に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ請求項 2に記載の蛋 白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
10. 以下の （A) または （B) に記載の蛋白質。
(A) 請求項 8 (A) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有す るアミノ酸配列からなり、 かつ請求項 1に記載の蛋白質と実質的に同一の活性 を有する蛋白質
(B) 請求項 8 (B) に記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、 かつ請求項 2に記載の蛋白質と実質的に同一の活性を 有する蛋白質
11. 以下の （A) または （B) に言 3載のポリペプチド。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 少なくとも連続した 5 ァミノ酸以上のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
(B) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 少なくとも連続した 5 ァミノ酸以上のァミノ酸配列からなるポリぺプチド
12. 以下の （A) または （B) に記載のポリペプチド。
(A) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号 1 Ί 1〜304 番において、 少なくとも連続した 5アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるポリ ぺプチド
( B ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列中のアミノ酸番号 171〜 197 番において、 少なくとも連続した 5ァミノ酸以上のァミノ酸配列からなるポリ ぺプチド
13. 請求項 1〜 12のいずれか 1項に記載の蛋白質またはポリべプチド をコードする DNA。
14. 配列番号 3で表される塩基配列のコード領域を含む DNA。
15. 配列番号 4で表される塩基配列のコード領域を含む DNA。
16. 以下の （A) または （B) に記載の DNA。 (A) 請求項 1に記載の蛋白質をコードする DNA、 請求項 3〜12のいず れかの （A) に記載の蛋白質またはポリペプチドをコードする DNA、 または 配列番号 3で表される塩基配列のコード領域を含む DNAとストリンジェント な条件下でハイプリダイズし、 かつ請求項 1に記載の蛋白質と実質的に同一の 活性を有する蛋白質をコードする DN A
(B) 請求項 2に記載の蛋白質をコードする: DNA、 請求項 3〜12のいず れかの （B) に記載の蛋白質またはポリペプチドをコードする DNA、 または 配列番号 4で表される塩基配列のコード領域を含む DN Aとストリンジェント な条件下でハイブリダイズし、 かつ請求項 2に記載の蛋白質と実質的に同一の 活性を有する蛋白質をコードする DN A
17. 請求項 13〜16のいずれか 1項に記載の DN Aをべクタ一に組込 んで得られる組換え体 DNA。
18. '請求項 13に記載の,組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる 形質転換体。
19. 宿主細胞が、 細菌、 酵母、 昆虫細胞、 植物細胞または動物細胞から なる群から選ばれる細胞である請求項 18に記載の形質転換体。
20. 請求項 14に記載の DNAを含有する形質転換体 FERM BP—
21. 請求項 15に記載の DNAを含有する形質転換体 FERM BP—
22. 請求項 18〜21のいずれか 1項に記載の形質転換体から選ばれる 形質転換体を培地に培養し、 培養物中に請求項 1〜12のいずれか 1項に記載 の蛋白質またはポリペプチドを生成蓄積させ、 該培養物から該蛋白質またはポ リぺプチドを採取することを特徴とする、 請求項 1〜 12のいずれか 1項に記 載の蛋白質またはポリべプチドの製造方法。
23. 請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の蛋白質を認識する抗体。
24. 請求項 1または請求項 3〜10のいずれかの （A) に記載の蛋白質 を認識する抗体であり、 かつ請求項 2または請求項 3〜10のいずれかの （B) に記載の蛋白質を認識しない抗体。
25. 請求項 2または請求項 3〜10のいずれかの （B) に記載の蛋白質 を認識する抗体であり、 かつ （1) または （3) 〜 （10)のいずれかの （A) に記載の蛋白質を認識しない抗体。
26. 請求項 11 (A) または請求項 12 (A) に記載のポリペプチドを 免疫原として用いる請求項 1または請求項 3〜10のいずれかの （A) に記載 の蛋白質を特異的に認識する抗体の作製方法。
27. 請求項 11 (B) または請求項 12 (B) に記載のポリペプチドを 免疫原として用いる請求項 2または請求項 3〜10のいずれかの （B) に記載 の蛋白質を特異的に認識する抗体の作製方法。
28. 請求項 26に記載の方法により得られる請求項 1または請求項 3〜 10のいずれかの （A) に記載の蛋白質を特異的に認識する抗体。
29. 請求項 27に記載の方法により得られる請求項 2または請求項 3〜 10のいずれかの （B) に記載の蛋白質を特異的に認識する抗体。
30. 寄託番号が FERM BP— 7603であるハイプリドーマが産生 するモノクローナル抗体。
31. 寄託番号が FERM BP— 7604であるハイブリド一マが産生 するモノクローナル抗体。
32. 請求項 23〜25および 28〜31のいずれか 1項に記載の抗体を 用いる請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の蛋白質を免疫学的に検出または 定量する方法。
33. 請求項 13〜16のいずれか 1項に記載の DN Aの塩基配列中の連 続した 5〜60塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド、 該オリゴヌク レオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、 またはそれらオリゴヌ クレオチドの誘導体。
34. 請求項 1 3〜1 6のいずれか 1項に記載の D NA、 または請求項 3 3に記載のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体をプローブと して用いてハイブリダイゼ一ションを行うことを含む、 請求項 1〜 1 0のいず れか 1項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出または定量する方法
35. 請求項 3 3に記載のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド 誘導体をプライマーとして用いてポリメラ一ゼ ·チヱイン · リアクションを行 うことを含む、 請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質をコ一ドする遺 伝子の発現を検出または定量する方法。
36. 請求項 1 3〜1 6のいずれか 1項に記載の D NA、 または請求項 3 3に記載のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体を用いてハイ ブリダイゼ一シヨンを行うことを含む、 請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載 の蛋白質をコ一ドする遺伝子の変異を検出する方法。
37. 請求項 3 3に記載のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド 誘導体を用いてポリメラ一ゼ ·チェイン · リアクションを行うことを含む、 請 求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする遺伝子の変異を検出 する方法。
38. 以下の （A) または （B ) に記載の疾患の判定方法。
(A) 請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする D N Aの 変異を検出または発現量を測定し、 健常人と比較することを特徴とする疾患の 判定方法
( B ) 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質の変異を検出または発 現量を測定し、 健常人と比較することを特徴とする疾患の判定方法
39. 以下の （A) または （B ) に記載の疾患の判定方法。
(A) 請求項 1または請求項 3〜1 0のいずれかの （A) に記載の蛋白質を コードする D N Aの変異または発現量と、 請求項 2または請求項 3〜 1 0のい ずれかの （B ) に記載の蛋白質をコードする D NAの変異または発現量とを比 較することを特徴とする疾患の判定方法
(B ) 請求項 1 ~ 1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質の変異を検出または発 現量を測定し、 請求項 1または請求項 3〜1 0のいずれかの （A) に記載の蛋 白質の変異または発現量と、 請求項 2または請求項 3〜1 0のいずれかの （B ) に記載の蛋白質の変異または発現量とを比較することを特徴とする疾患の判定 方法
40. 疾患が、 異常な細胞増殖を伴う疾患、 血管障害を伴う疾患、 骨代謝 の異常を伴う疾患、 ィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾 患、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 異常な骨格筋細胞の分化増殖を 伴う疾患、 胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性 の疾患である、 請求項 3 8または 3 9に記載の判定方法。
41. 異常な細胞増殖を伴う疾患が、急性骨髄性白血病、乳癌、前立腺癌、 大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋腫、 悪性腫瘍または固形腫瘍であり、 血 管障害を伴う疾患が心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高 脂血症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒 症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、 うつ血または脈絡膜循環障害であり、 骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であ り、 インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、 末 端肥大症または小児慢性腎不全であり、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾 患が動脈硬化、 気管支疾患または再狭窄であり、 異常な骨格筋細胞の分化増殖 を伴う疾患が重症筋無力症であり、 胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、 異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、 慢性 B型肝炎、 慢性関 節リウマチ、 敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過 敏または自己免疫疾患である、 請求項 4 0に記載の判定方法。
42. 判定方法が、 以下の （A) または （B ) に記載の方法によるもので ある、 請求項 3 8〜4 1のいずれか 1項に記載の判定方法。
(A) 請求項 3 6または 3 7に記載の検出方法
( B ) 請求項 3 2、 3 4または 3 5に記載の検出または定量方法
43. 請求項 1〜 1 2のいずれか 1項に記載の蛋白質またはポリぺプチド を含有する医薬。
44. 請求項 1 3〜1 6のいずれか 1項に記載の D N A、 または請求項 3 3に記載のォリゴヌクレオチド若しくはォリゴヌクレオチド誘導体を含有する
45. 医薬が、遺伝子予防用ベクターまたは遺伝子治療用べクタ一である、 請求項 44に記載の医薬。
46. 請求項 2 3〜 2 5および 2 8〜 3 1のいずれか 1項に記載の抗体を 含有する医薬。
47. 医薬が、 異常な細胞増殖を伴う疾患、 血管障害を伴う疾患、 骨代謝 の異常を伴う疾患、 ィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾 患、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 異常な骨格筋細胞の分化増殖を 伴う疾患、 胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性 の疾患に対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 請求項 4 3〜4 6に記載 の医薬。
48. 異常な細胞増殖を伴う疾患が急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋腫、 悪性腫瘍または固形腫瘍であり、 血 管障害を伴う疾患が心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高 脂血症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒 症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、 うつ血または脈絡膜循環障害であり、 骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であ り、 インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、 末 端肥大症または小児慢性腎不全であり、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾 患が動脈硬化、 気管支疾患または再狭窄であり、 異常な骨格筋細胞の分化増殖 を伴う疾患が重症筋無力症であり、 胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、 異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、 慢性 B型肝炎、 慢性関 節リウマチ、 敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過 敏または自己免疫疾患である、 請求項 4 7に記載の医薬。
49. ( i ) 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質を発現する細 胞での該蛋白質の発現量と、 （ii) 該蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触 させた場合の該蛋白質の発現量とを比較し、 被験試料より請求項 1〜1 0のい ずれか 1項に記載の蛋白質の発現量を制御する化合物を選択することを特徴と する、 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質の発現量を制御する化合 物のスクリーニング方法。
50. ( i ) 請求項 1 ~ 1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質を発現する該 細胞の機能と （ii) 該蛋白質を発現する細胞と被検試料を接触させた場合の該 細胞の機能とを比較し、 被験試料より請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載の 蛋白質の機能を制御する化合物を選択することを特徴とする、 請求項 1〜1 0 のいずれか 1項に記載の蛋白質の機能を制御する化合物のスクリーニング方法。
51. 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする遺伝子 の転写を制御する領域の下流にレポ一夕一遺伝子の連結された D N Aを含むプ ラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させ、 被験試料より 請求項 1〜 1 0に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御する化合物を 選択することを特徴とする、 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質を コ一ドする遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニング方法。
52. 請求項 1〜1 0のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞を用い、 該蛋白質を発現する細胞と被検試料を接触させた場合の、 （i ) 該細胞での請 求項 1または請求項 3〜1 0のいずれかの （A) に記載の蛋白質の発現量と、 (ii) 該細胞での請求項 2または請求項 3〜1 0のいずれかの （B ) に記載の 蛋白質の発現量とを比較し、 被検試料より請求項 1 ~ 1 0のいずれか 1項に記 載の蛋白質をコードする遺伝子のスプライシングを制御する化合物のスクリ一 ニング方法。
53. 請求項 4 9〜5 2のいずれか 1項に記載のスクリーニング方法によ り得られる化合物またはその薬理学的に許容される塩。
54. 請求項 5 3に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含 有する医薬。
55. 医薬が、 異常な細胞増殖を伴う疾患、 血管障害を伴う疾患、 骨代謝 の異常を伴う疾患、 ィンスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾 患、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾患、 異常な骨格筋細胞の分化増殖を 伴う疾患、 胃酸分泌の異常を伴う疾患または異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性 の疾患に対する予防薬または治療薬である、 請求項 5 4に記載の医薬。
56. 異常な細胞増殖を伴う疾患が急性骨髄性白血病、 乳癌、 前立腺癌、 大腸癌、 肝臓癌、 骨髄腫、 子宮平滑筋腫、 悪性腫瘍または固形腫瘍であり、 血 管障害を伴う疾患が心筋梗塞、 脳梗塞、 末梢血管閉鎖症、 狭心症、 高血圧、 高 脂血症、 糖尿病、 糖尿病性網膜症、 糸球体腎炎、 動脈硬化、 血栓、 溶血性尿毒 症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、心不全、 うつ血または脈絡膜循環障害であり、 骨代謝の異常を伴う疾患が骨粗鬆症であ り、 インスリン様増殖因子や成長ホルモン作用の障害を伴う疾患が小人症、 末 端肥大症または小児慢性腎不全であり、 異常な平滑筋細胞の分化増殖を伴う疾 患が動脈硬化、 気管支疾患または再狭窄であり、 異常な骨格筋細胞の分化増殖 を伴う疾患が重症筋無力症であり、 胃酸分泌の異常を伴う疾患が胃潰瘍であり、 異常なリンパ球浸潤を伴う炎症性の疾患が微生物感染、 慢性 B型肝炎、 慢性閧 節リウマチ、 敗血症、 移植片-対-宿主疾患、 インスリン依存性糖尿病、 腎炎、 外傷性悩損傷、 炎症性腸疾患、 アレルギー、 アトピー、 喘息、 花粉症、 気道過 敏または自己免疫疾患である、 請求項 5 5に記載の医薬。
57. 請求項 1〜1 2のいずれか 1項に記載の蛋白質またはポリペプチド と被検試料を接触させ、 被検試料より該蛋白質またはポリべプチドと特異的に 結合する蛋白質を選択することを特徴とする、 請求項 1〜1 2のいずれか 1項 に記載の蛋白質またはポリべプチドと特異的に結合する物質のスクリーニング 方法。
58. 請求項 5 5に記載のスクリ一ニング法により得られる請求項 1〜 1 2のいずれか 1項に記載の蛋白質またはポリぺプチドと特異的に結合する物質 c
59. 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質をコードする遺伝子 の発現が低下または完全に抑制されたノックァゥト非ヒト動物。
60. 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載の蛋白質の有する機能が低下 または完全に抑制されたノックァゥト非ヒト動物。
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