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WO2001098472A1 - Novel glucose-6-phosphate dehydrogenase - Google Patents

Novel glucose-6-phosphate dehydrogenase Download PDF

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WO2001098472A1
WO2001098472A1 PCT/JP2001/005113 JP0105113W WO0198472A1 WO 2001098472 A1 WO2001098472 A1 WO 2001098472A1 JP 0105113 W JP0105113 W JP 0105113W WO 0198472 A1 WO0198472 A1 WO 0198472A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
amino acid
seq
polypeptide
transformant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2001/005113
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Haruhiko Yokoi
Seiko Ando
Keiko Ochiai
Yoshiyuki Yonetani
Shin-Ichi Hashimoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18686051&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2001098472(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to US10/312,007 priority Critical patent/US7078204B2/en
Priority to DK01941065.3T priority patent/DK1302537T3/da
Priority to JP2002504621A priority patent/JP4931320B2/ja
Priority to AU2001274537A priority patent/AU2001274537A1/en
Priority to EP01941065A priority patent/EP1302537B1/en
Priority to AT01941065T priority patent/ATE461997T1/de
Priority to DE60141633T priority patent/DE60141633D1/de
Publication of WO2001098472A1 publication Critical patent/WO2001098472A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01049—Glucose-6-phosphate dehydrogenase (1.1.1.49)

Definitions

  • the present invention relates to a novel darcos-6-phosphate dehydrogenase (hereinafter, abbreviated as G6PD) derived from a bacterium belonging to the genus Corynepterium (Comehtsnim), a DNA encoding the enzyme, and a set containing the DNA.
  • G6PD darcos-6-phosphate dehydrogenase
  • the present invention relates to a recombinant DNA, a transformant having the recombinant DNA, a transformant having the DNA on a chromosome, and a method for producing an L-amino acid, which comprises culturing these transformants.
  • NAD PH is required as a coenzyme during the reduction reaction for amino acid biosynthesis of many microorganisms.
  • one molecule of L-lysine biosynthesis requires four molecules of NADPH.
  • biosynthesis of most amino acids requires more than one NADPH per molecule, such as three molecules per molecule for threonine and five molecules per molecule for isoleucine. Therefore, the supply of NADPH is an important issue for the production of these amino acids using microorganisms.
  • NADPH pentosephosphate pathway
  • G6PD the first enzyme of HMP and a branch point enzyme with the Emden- Mayer-Hoff pathway (EMP)
  • EMP Emden- Mayer-Hoff pathway
  • An object of the present invention is to provide G6PD involved in the biosynthesis of L-amino acid, DNA encoding the enzyme, recombinant DNA obtained by incorporating the DNA into the DNA, or the recombinant DNA. It is an object of the present invention to produce L-amino acids industrially advantageously by using a transformant having a body DNA to further enhance L-amino acid productivity by a microorganism.
  • the present inventors have succeeded in isolating DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and have found that the DNA can be used for production of L-amino acid.
  • the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which the Ala at position 211 is substituted with another amino acid and having G6PD activity is an L-amino acid.
  • the inventors have found that the productivity is further improved, and have completed the present invention. That is, the present invention relates to the following (1) to (21).
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the 213th amino acid are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of the above (2), and which has G6PD activity. peptide.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the 213th amino acid are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and which has G6PD activity.
  • (11) has a nucleotide sequence which hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, wherein the nucleotide corresponding to the 637th nucleotide in SEQ ID NO: 1 is adenine; and 6 DNA encoding a polypeptide having PD activity.
  • a method for producing a polypeptide comprising collecting the polypeptide from an object.
  • the transformant of any one of the above (16) to (19) is cultured in a medium, and the L-amino acid biosynthesized using NADPH is produced and accumulated in the culture, and the culture is A method for producing an L-amino acid, comprising collecting the L-amino acid from an L-amino acid.
  • the L-amino acid biosynthesized using NADPH is L-lysine, L-threonine, L-isoleucine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-histidine, L-cystine
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a rotamer. It is a polypeptide having an amino acid sequence substituted with amino acids and having G6PD activity. Examples of the polypeptide include a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the above polypeptide is also included in the polypeptide of the present invention. Is done.
  • the polypeptide does not include a known G6PD (for example, a polypeptide in which the Thr at position 120 in SEQ ID NO: 2 has been substituted with Ala).
  • a site-directed mutagenesis method for example, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 12. It can be obtained by introducing a site-specific mutation into the encoding DNA.
  • a polypeptide having a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having G6PD activity for example, Corynebacterium A site-specific mutation was introduced into the DNA coding for G6PD derived from a microorganism closely related to P. It can also be obtained by substituting an amino acid corresponding to an amino acid with another amino acid.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a well-known method such as the above-described site-directed mutagenesis method, and preferably 1 to 10 The number is more preferably 1 to 5.
  • polypeptide of the present invention in order for the polypeptide of the present invention to have G6PD activity, SEQ ID NO: 2 or Calculated using BLAST [J. Mol. Biol., M, 403 (1990)], FAS TA (Methods in Enzymology, m, 63-98 (1990)), etc. It is preferable that they have homology of at least 60% or more, usually 80% or more, particularly 95% or more.
  • Examples of the DNA of the present invention encoding the polypeptide of the present invention include, for example, a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; A DNA having a base sequence in which the base sequence at position 639 has been replaced with a codon coding for an amino acid other than A1a (hereinafter abbreviated as SEQ ID NO: lsub), A DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11, which is a DNA having the nucleotide sequence of adenine, is mentioned ⁇
  • the DNA of the present invention also includes a DNA encoding a polypeptide having a nucleotide sequence corresponding to the above and having a nucleotide sequence substituted with a codon encoding an amino acid other than A1a and having G6PD activity. Is done. However, the DNA does not include a known DNA (eg, a DNA in which 358th adenine is replaced with guanine in SEQ ID NO: 1).
  • DNA that can hybridize with the DNA of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions refers to a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 11 as a probe, and colony 'hybridization Syrup method, plaque, hybridization method or DNA obtained by using the Southern plate hybridization method, specifically, DNA from colonies or black is fixed.
  • the hybrid was subjected to hydride at 65 ° C, and then to a concentration of 0.1 to 2 times. Wash the filter at 65 ° C using SSC solution (1x concentration of SSC solution is composed of 15 Ommo 1/1 sodium chloride and 15 mmo 1/1 sodium citrate).
  • DNA Hybridize The method is described in Molecular Cloning, 2nd Edition, Current Protocols, Molecular, No., DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995), etc. It can be performed according to the method that is used. Specifically, as a hybridizable DNA, a nucleotide sequence having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 11 when calculated using BLAST, FASTA, or the like described above. And preferably DNA having a base sequence having a homology of 80% or more, more preferably DNA having a base sequence having a homology of 95% or more.
  • the DNA of the present invention is obtained from the Corynebaoter! Mn glutamicum No. 58 (FERM BP-7134) strain or a mutant strain having high L-amino acid productivity after subjecting the strain to a normal mutation procedure. can do.
  • NTG N-methyl- ⁇ '-nitro-N-nitrosoguanidine
  • the DNA of the present invention can be isolated by the following method.
  • Chromosomal DNA is prepared according to Biophysica Acta, ⁇ , 619 (1963)], and the chromosomal DNA is cut with an appropriate restriction enzyme.
  • the obtained DNA fragment is ligated to a vector (for example, plasmid) capable of autonomous replication in bacteria, and the ligated DNA is introduced into a microorganism lacking G6PD activity.
  • a transformant is isolated from the obtained microorganism using G6PD activity as an index, and the enzyme gene is isolated from the transformant.
  • a strain of Escherichia coli lacking only glucose-6-phosphate isomerase can grow on a medium containing glucose as the sole carbon source, but also lacks G6PD.
  • the strain cannot grow on a medium containing glucose as the sole carbon source [Escherichia coli and Salmonella typhi dish rium, 192 (1996)]. Therefore, the DNA of the present invention can be isolated from the double-deficient strain by introducing DNA into the double-deficient strain and selecting a strain capable of growing on a medium using glucose as a sole carbon source. it can.
  • the microorganism into which the DNA of the present invention is introduced can be any bacterium as long as the DNA can be expressed.
  • the autonomously replicable vector may be any vector that can autonomously replicate in the bacterium.
  • the autonomously replicable cells in the case of microorganisms belonging to the genus Escherichia, especially Escherichia coli, pUC18 (manufactured by Takara Shuzo) and pBluescriptSK (-) (manufactured by Toyobo) are examples of such autonomously replicable cells.
  • pCE54 Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-105999
  • Ligation of the vector and the DNA of the present invention can be performed by a usual method using T4 DNA ligase or the like.
  • introduction into a host can be performed by the method of Hanahan et al. [Journal of Molecular Biology, Week, 557 (1983)].
  • oligomer based on the nucleotide sequence information of the G6PD gene [eg, in the case of Corynebacterium glutamicum, GenBank accession number E13655, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1] DNA is synthesized, the oligomer DNA is used as a primer, and the chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Corynebacterium is subjected to polymerase chain reaction (PCR) using the DNA as type III.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the gene can also be isolated by linking it to a vector having the same gene and introducing the gene into an appropriate host such as a bacterium belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium. In this case, it is not necessary to use a G6PD deficient strain.
  • nucleotide sequence of the gene for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, using a commonly used DNA synthesizer, for example, ABI3948 manufactured by PerkinElmer Inc.
  • the DNA of the present invention isolated by the above method is introduced into an expression vector capable of replicating and expressing in the host microorganism, and the resulting recombinant vector is used to transform the host microorganism. .
  • the recombinant DNA comprising the DNA encoding the polypeptide of the present invention is capable of autonomous replication in a microorganism, and at the same time, contains a promoter, a ribosome binding sequence, a DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. It is preferable that the vector is constituted by: Professional A gene that controls morphogenesis may be included.
  • vectors for this purpose include microorganisms belonging to the genus Escherichia, for example, pBTrp2, pBTacls pBTac2 (both are sold by Behringer Ringermannheim), PKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen) PGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pKYPIO (JP-A-58-110600), pKYP200 CAgric. Biol. Chem., ⁇ S, 669 (1984)], pLSAl CAgric Biol. Chem., SS, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the promoter may be any promoter that functions in the host cell.
  • trp promoter P trp
  • lac promoter Isseki one P L promoter Isseki one
  • P a professional mode Isseki one one such T7 promoter Isseki
  • Promo Isseki one derived from Escherichia coli or phage, etc.
  • the promoter Isseki one obtained by two series of P trp (P trp x 2) , tac pro mode Isseki one, lacT7 promoter Isseki one, the let I promoter Isseki one artificially designed and modified promoters like Etc. can also be used.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosomal binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is required for expression of the DNA of the present invention. Although not necessary, it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the host cell may be any cell capable of producing the following L-amino acid, and preferably a microorganism having the ability to produce the amino acid is used. More preferably, a microorganism belonging to the genus Escherichia or Corynepacterium, more preferably a microorganism belonging to the genus Corynepacterium, and particularly preferably, Corynenocterium glutamicum is used.
  • microorganisms examples include, for example, genus Seriratk, genus Corynehacterium, genus Arthrobacter, genus Microbacterium (Minrohantftrium) S. genus BillliS, and genus Escherichia ) Microorganisms belonging to the genus can be mentioned.
  • Escherichia coli Kl XLl-Blue Escherichia coli XL2-Blue
  • Escherichia coli plate 1 Escherichia coli 1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli K1485, Escherichia coli JM109, Escherichia Kori HB101, Escherichia Kori No.
  • any method for introducing DNA into the above host cells can be used.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA,, 2110 (1972)]
  • an electroporation method [Methods in Enzymology, _235, 375 (1994)] and the like are exemplified. be able to.
  • a protoplast method eg, Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-186492 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-18649
  • an electroporation method eg, [Journal of Bacteriology, 115, 4096 (1993)]]
  • any microorganism can be used as long as the DNA fragment has been artificially introduced into the chromosome by genetic recombination or mutation treatment. May be.
  • a strain containing a G6PD gene having an arbitrary sequence may be modified to a strain containing the DNA of the present invention by a mutation treatment, or a homologous recombination method [Bio / Technology,, 84 (1991); , 1, 1863 (1998)], a method using a phage ⁇ transposon [Escherichia coli and Salmonella typhimurium, 2325-2339 (1996)], etc., and a strain in which the DNA fragment is artificially inserted into the chromosome.
  • a strain in which the DNA is inserted into the chromosome by the homologous recombination method can be mentioned.
  • a strain obtained by mutation treatment in addition to gene recombination is also referred to as a transformant.
  • the transformant of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, the polypeptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide of the present invention is collected from the culture. Can be manufactured.
  • L-amino acids can be produced by culturing the transformant of the present invention in a medium, producing and accumulating L-amino acids in the culture, and collecting the L-amino acids from the culture.
  • the L-amino acid may be any amino acid that uses NADPH for biosynthesis.
  • L-lysine, L-threonine, L-isoleucine, L-trile Ptophan, L-pheniralanine, L-tyrosine, L-histidine, L-cysteine and the like may be used.
  • compounds other than amino acids having these amino acids as intermediates may be used.
  • L-lysine is used.
  • Fig. 1 shows the biosynthetic pathway of amino acids. In the figure, the reaction consuming NAD PH is shown with underlining.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like can be used.
  • the carbon source may be any as long as the transformant or microorganism of the present invention can be used.
  • Glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, acetic acid, propion Organic acids such as acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other inorganic or organic acid ammonium salts, and other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and cocoa. Examples include starch liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof.
  • potassium (I) phosphate potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like can be used.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culturing temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culturing time is usually 16 hours to 7 days. It is preferable that pH during culturing is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted by using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as apicicillin / tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium if necessary.
  • an inducer may be added to the medium if necessary.
  • lac promoter using lac promoter
  • isopropyl-1-D-thiogalactovyranoside or the like is used for the recombination using the trp promoter.
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • L-amino acids can be recovered from the culture solution by using an ion exchange method, a concentration method, a salting-out method or the like in combination.
  • a conventional method for isolating and purifying an enzyme can be used.
  • the polypeptide of the present invention when expressed in a dissolved state in cells, the cells are collected by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with a sonicator, French press, or the like. The cells are disrupted with a Manton Gaurin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation / purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, NOETHYL (DEAE)-anion exchange chromatography using a resin such as Sepharose and DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), and cation exchange using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Chromatography method, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenylsepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, isoelectric focusing
  • a purified sample can be obtained by using techniques such as electrophoresis such as electrophoresis alone or in combination.
  • the cells When the polypeptide is expressed in an insoluble form in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to collect the insoluble polypeptide as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble form of the polypeptide is soluble with a protein denaturant.
  • the polypeptide is returned to a normal tertiary structure by diluting or dialyzing the lysate and reducing the concentration of the protein denaturant in the lysate. After this operation, a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide of the present invention When the polypeptide of the present invention is secreted extracellularly, the polypeptide is added to the culture supernatant. Can be recovered. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purification standard is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. Goods can be obtained.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 12 can be mentioned.
  • polypeptide of the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • Chemical synthesis can also be carried out using a peptide synthesizer such as Advanced ChemTech, Perkin'Elma, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel Vega, PerSeptive, Shimadzu.
  • FIG. 1 is a diagram showing the biosynthetic pathway of 20 amino acids constituting a protein in a bacterium belonging to the genus Corynebacterium.
  • the underlined part indicates the reaction consuming NADPH.
  • the boxed box indicates the reaction producing NAD PH.
  • G6PD glucose-16-phosphate dehydrogenase
  • FIG. 2 is a diagram showing a process of forming PCS299P. ⁇
  • Corynebacterium glutamicum No. 58 strain (hereinafter abbreviated as No. 5.8 strain) is Corynebacterium glutamicum ATCC 1332 strain (hereinafter ATCC 1332 strain) L-lysine-producing bacteria obtained by performing a mutation treatment on
  • the strain is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary: Ibaraki, Japan No. 1, Tsukuba-Higashi 1-chome, No. 1 Chuo No. 6 (formerly: Research Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology: 1-3-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) on March 14, 2000 Issue: Deposited as FERM BP-7134.
  • the G6PD gene of ATCC 13032 strain and No. 58 strain was cloned as follows.
  • chromosomal DNA was prepared by the method of Saito et al. [Biochimica et Biophysica Acta, ⁇ , 619 (1963)].
  • this nucleotide sequence is targeted.
  • a primer for the PCR reaction was prepared by an ordinary method. SEQ ID NOs: 3 and 4 show the nucleotide sequences of the primers.
  • the PCR reaction was performed using a PerkinElmer Thermocycler (GeneAmp PCR System 9600), Pfuturbo DNA Polymerase (Stratagene), 100 ng of each chromosomal DNA, and the attached buffer. Twenty-five cycles were performed at ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 74 ° C for 2 minutes.
  • the amplified PCR product of about 2.2 kb was subjected to agarose gel electrophoresis and extracted and purified using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • LB agar medium containing 50 // g / ml kanamycin [5 g yeast extract (Difco), 10 g pactotripton (Difco), 10 g sodium chloride, 16 g agar (Difco) in 1 L water
  • the medium was adjusted to pH 7.2 and the transformant selected above was cultured overnight in an LB medium containing 50 mg / ml kanamycin, and an alkaline SDS method (molecular Plasmids were prepared by Cloning 2nd Edition).
  • a plasmid containing the G6PD gene derived from the ATCC 13032 strain was named pCRBzwf1
  • a plasmid containing the G6PD gene derived from the No. 58 strain was named pCRBzwf2.
  • nucleotide sequence of the G6PD gene on these plasmids was determined by a conventional method.
  • G6PD gene obtained from ATCC 13032 strain and No. 58 strain was found to be exactly the same.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1. That is, it was shown that the G6PD gene of L-lysine producing strain No. 58 was wild-type.
  • the No. 58 strain was subjected to mutation treatment with NTG (Microorganism Experiment Manual, 1986, p. 131, Kodansha Scientific), and then a minimal agar medium containing lmg / ml 6-azaperacil [glucose 10 g 4 g of salt, ammonium hydroxide, 2 g of urea, 1 g of dihydrogen phosphate monobasic, 1 g of dihydrogen phosphate monobasic, 3 g, ferrous sulfate heptahydrate 10 mg, magnesium sulfate heptahydrate 0 4 g, manganese sulfate heptahydrate 4m :, zinc chloride heptahydrate 40 g, ferric chloride hexahydrate 200 // g, copper chloride dihydrate 10 zg, manganese chloride tetrahydrate 10 g, sodium tetraborate decahydrate 10 // g, ammonium molybdate ammonium
  • the appearing colony was isolated and subjected to an L-lysine production test by the method shown in Example 2 (4) below, and a clone having higher productivity than No. 58 strain was selected.
  • Ml strain The G6PD gene of the Ml strain was isolated by the method described in (1) above, and the gene was inserted into a pCR-Blunt vector.
  • the obtained recombinant plasmid was named pCRBzwfM.
  • the 637th base in SEQ ID NO: 1 was guanine in the G6PD gene in the ATCC 13032 and No. 58 strains, but changed to adenine in the 06-0 gene in the ⁇ 1 strain.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 11.
  • a gene replacement vector for this was prepared as follows.
  • PHSG299 (Takara Shuzo) was cut with _Q_Q_RI and ⁇ Jll (both from Takara Shuzo), subjected to agarose gel electrophoresis, and extracted and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • the obtained PHSG299 fragment and the above-mentioned double-stranded DNA fragment were ligated using a Reigeshort kit ver2 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and Escherichia coli DH5 strain was transformed according to a conventional method.
  • the strain was cultured on an LB agar medium containing 50 g / ml kanamycin, and a transformant was selected.
  • One of the transformants was cultured overnight in an LB medium containing 50 mg / ml of kanamycin, and a plasmid was prepared from the resulting culture by the ADS method.
  • the resulting plasmid was named PHSG299L.
  • Shuttle plasmid PCS299P capable of autonomous replication in both Escherichia coli and coryneform bacteria was produced by the following method.
  • the restriction enzyme cleavage site of the pCS116-299Bgll DNA was confirmed according to a conventional method.
  • Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 strain was transformed using pCS116-299BgllDNA by electroporation [FEMS Microbiology Letters, £ S, 299, (1989)].
  • the strain was prepared by adding 10 g of CM agar medium [Polypeptone S (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.)] containing 20 ⁇ g Zml of kanamycin, 5 g of yeast extract S (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 g of Erri-Dish meat kiss (manufactured by Far East Pharmaceutical Co., Ltd.), 3 g of sodium salt and 30 g of biotin were added to 1 L of water, and the mixture was cultured on a medium adjusted to pH 7.2] to select a transformant.
  • a plasmid was extracted from the transgenic strain in a conventional manner, and the plasmid was digested with restriction enzymes to confirm that the plasmid was pCS116-299Bgll.
  • pCS116-299Bgll DNA was digested with Pst I (Takara Shuzo) and Ox_aJllHI and purified by ethanol precipitation.
  • a partially deleted plasmid was obtained from the obtained DNA using a delivery kit for kilosequencing (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method.
  • the strain was cultured on an LB agar medium containing 20 jg / ml kanamycin, and a transformant was selected.
  • the transformant was cultured overnight in an LB medium containing 20 mg / ml of kanamycin, and a plasmid was prepared from the resulting culture by an alkaline SDS method.
  • Restriction enzyme maps of the obtained plasmids were prepared according to a conventional method, and plasmids having different partial deletion lengths were selected.
  • the selected plasmid was used to transform Corynebacterium ammonagenes ATCC 6872 by electroporation.
  • the resulting transformant was spread on a CM agar medium containing 20 zg / ml kanamycin, and cultured for 2 hours at 30.
  • Plasmids having autonomous replication ability in Corynebacterium 'ammoniagenes were selected based on the presence or absence of the cisine-resistant colonies 21 as an index.
  • a plasmid having the longest deletion region among plasmids capable of autonomous replication was selected, and this plasmid was designated as pCS299del6. '
  • the above 2.7 kb DNA fragment and the pBluescript SK (+) fragment were ligated using the Ligation kit ver. 1, and the ligated DNA was used to transform Escherichia coli NM522 according to a conventional method. .
  • the strain was transformed with 10 ⁇ g / ml of ampicillin, 5 OAdg / ml of X—Ga 1 (5-bromo-4-chloro-3-maoyl-5 , -D-gaiactoside), and 1 mm o 1/1 of IPTG. Transformants were selected by culturing on LB agar medium containing (isopropylthio-?-D-galactoside).
  • the transformant was cultured overnight in an LB medium containing 100 ⁇ g / ml of ambicilin, and a plasmid was prepared from the resulting culture by the alkaline SDS method. According to a conventional method, a restriction map of each of the obtained plasmids was prepared. A plasmid that yielded 3.4 kb and 2 kb DNA fragments by JL — 0_RI cleavage was designated PCSSK21.
  • DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 7 and 8 were synthesized. These DNAs were used as primers, pHSG299 DNA was used as type II, and Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) was used. A PCR reaction was performed according to the conditions. After ethanol precipitation of the reaction product according to a conventional method, it was cleaved with restriction enzymes: E_ ⁇ LI and iLQ_I (Takara Shuzo). The cleaved DNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis, and the obtained DNA fragment of about 1.3 kb was extracted and purified using DNA prep.
  • a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 10 was synthesized.These DNAs were used as a primer, pHSG299 DNA was used as a type II, Taq DNA polymerase was used, and PCR was performed according to the attached reaction conditions. went. The reaction product was precipitated in ethanol according to a conventional method, and then cleaved with restriction enzymes: II and B II. The cut DNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis, and the obtained DNA fragment of about 1.3 kb was extracted and purified using DNA prep.
  • Plasmid PCSSK21 obtained above was digested with HI (Takara Shuzo) and: BmiHI.
  • the cleaved DNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis, and the obtained DNA fragment of about 2.7 kb was extracted and purified using DNAprep. After mixing and extracting the above three kinds of extracted and purified DNA fragments, they were ligated using Ligation Kit ver.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method.
  • the strain was cultured on an LB agar medium containing 20 gZml of kanamycin, 50 / g / ml of X—Ga1, and 1 mmo 1/1 of IPTG to select a transformant.
  • the transformant was cultured overnight in an LB medium containing 2 Ozg / ml kanamycin, and a plasmid was prepared from the resulting culture by the alkaline SDS method.
  • a restriction map of each of the obtained plasmids was prepared according to a conventional method, and a plasmid having the structure shown in FIG. 1 was designated as PCS299P.
  • PCS299P and pHSG299L were cut with k ⁇ I and: E_ail (both from Takara Shuzo), and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • a 2.5 kb fragment and a pHSG299L fragment containing a replication initiation region (OriC) in a Corynebacterium bacterium derived from PCS299P were extracted and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), respectively.
  • the 2.5 kb DNA fragment and the PHSG299L fragment were ligated using a Reigesion Kit ver. 2 (Takara Shuzo) and transformed into Escherichia coli DH5 strain according to a conventional method.
  • a plasmid was prepared from the obtained transformant in the same manner as described above. The resulting plasmid was named PHSG2990C.
  • PM0B3 (ATCC77282) and PHSG2990C are cut with £ _s_LI (Takara Shuzo), agarose gel electrophoresis is performed, and Bacillus subtilis levan cyclase (SacB) derived from PM0B3
  • SacB Bacillus subtilis levan cyclase
  • the 2.6 kb DNA fragment and the pHSG2990C fragment were ligated using a ligation kit ver2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), and Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed according to a conventional method.
  • the strain was cultured on an LB agar medium containing 50 g / ml kanamycin, and a transformant was selected.
  • a plasmid was prepared from the obtained transformant in the same manner as described above.
  • the plasmid was named PHSG2990CSB.
  • a 5.1 kb DNA fragment obtained by cleaving PHSG2990CSB with _o_LI was subjected to agarose gel electrophoresis, followed by extraction and purification using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • the pCRBzwfM prepared in Example 1 was cut with _ILQ_LI, subjected to agarose gel electrophoresis, and then extracted and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • ligation kit ver2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), the j!
  • Lo I fragment containing the OriC and SacB genes was ligated to the ___Q_LI site of pCRBzwfM, and Escherichia coli DH5a strain was transformed according to a conventional method.
  • the strain was cultured on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin, and a transformant was selected. Plasmid was prepared from the obtained transformant in the same manner as described above.
  • the plasmid was designated as pCRBOSzwfM and used as a G6PD gene integration vector.
  • a strain in which the second homologous recombination was performed was selected by a selection method utilizing the fact that Bacillus subtilis levan euclase encoded by pCRBOSzwfM produces a suicide substrate [Journal of Bacteriology, 14, 5462 (1992)].
  • a strain in which the G6PD gene (wild type), which was previously possessed by No. 58 strain, was replaced with the mutant G6PD gene was isolated by the following method.
  • PCRBOSzwfM was introduced into No. 58 strain by electroporation [FEMS Microbiology Letters, fiS, 299 (1989)], and KM 163 agar medium containing 50 zg / m1 kanamycin was introduced.
  • KM 163 agar medium containing 50 zg / m1 kanamycin was introduced.
  • Tf 1 strain One of the transformants, Tf 1 strain, was selected, and the strain was cultured in a KM 163 medium containing 20 ⁇ g / ml kanamycin, followed by electroporation of pCGl 1 (Japanese Patent Publication No. 6-91827). Installation operation was performed. After the introduction operation, the strain was cultured on a KM 163 agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and 200 ⁇ g / ml spectinomycin at 30 ° C. for 2 days to obtain a transformant. The chromosome of one of these transformants was reported by Ikeda et al.
  • the transformed strain (one-time recombinant) was transformed into a Sue medium (sucrose 100 g, meat extract 7 g, peptone 10 g, sodium chloride 3 g, yeast extract (Difco) 5 g, Bactagaga (Difco) 18 g in 1 L of water and adjusted to pH 7.2), and cultured at 30 ° C. for 1 day to select colonies that grow.
  • the strain in which the SacB gene is present cannot grow on this medium because it converts sucrose to a suicide substrate.
  • a strain in which the SacB gene has been deleted by the second homologous recombination between the wild-type and mutant G6PD genes cannot grow a suicide substrate and can grow on this medium.
  • the chromosome DNA of the two-fold recombinant obtained in this way was obtained by the method of Saito et al.
  • the lysine productivity of the obtained G6PD gene-substituted strains (No. 58W and No. 58M) and the parent strain No. 58 was cultured and evaluated in a 5-liter jar amen.
  • a secondary seed medium 50 g of Darcos, 10 g of colony-striker, 0.5 g of magnesium sulfate heptahydrate: 5 mg of nicotinic acid, lmg of thiamine hydrochloride, 100 mg of biotin, 100 mg of pantothenic acid
  • 10 mg monopotassium dihydrogen phosphate 2 g, urea 3 g
  • ferrous sulfate heptahydrate 1 Omgs zinc sulfate heptahydrate lmg, ammonium sulfate 8 g, peptone 20 g, sodium hydrogencarbonate 2 g in water
  • the culture medium containing the primary seed was inoculated into 40 ml of 2000 ml of the primary seed culture, and cultured at 30 ° C.
  • the main culture medium [molasses 93 g (equivalent to sugar), monopotassium dihydrogen phosphate 0.5 g, ferrous sulfate heptahydrate 10 mg, thiamine hydrochloride 100 zg, soypeptone 2 g, magnesium sulfate 7 water 0.5 g of nicotinic acid 5 mg of nicotinic acid + 15 g of ammonium sulfate in 1 liter of water and adjusted to pH 7.4] Inoculate 230 m1 of the secondary seed culture into 1675 ml and 5 liter jar The cells were cultured at 35 ° C for 42 hours in the evening of Amen. L-lysine accumulated in the main culture medium was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Table 1 shows the measurement results of L-lysine fermentation production of No. 58 strain, No. 58W strain, and No. 58M strain. As a result, the new mutant G6PD Gin productivity was shown to be improved.
  • a modified G6PD and a DNA encoding the G6PDH are obtained, and the productivity of L-amino acid by a microorganism can be improved using the modified G6PD.
  • SEQ ID NO: 4 Description of artificial sequence—Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 7 Description of artificial sequence-Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 8 Description of artificial sequence-Synthetic DNA.
  • SEQ ID NO: 10 Description of artificial sequence—Synthetic DNA

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Description

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新規なグルコース— 6 -リン酸デヒドロゲナ一ゼ
本発明はコリネパクテリゥム（Comeh tsnim)属細菌由来の新規なダルコ一ス —6—リン酸デヒドロゲナ一ゼ（以下、 G6PDと略す）、 該酵素をコードする D NA、該 DNAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 D N Aを保有する形質転換 体、該 DN Aを染色体上に有する形質転換体、及びこれらの形質転換体を培養する ことを特徴とする L—アミノ酸の製造法に関する。 景枝術
アミノ酸を効率よく生産する菌株を得るためには、その細菌における該アミノ酸 の生合成に関わる遺伝子の性質およびそれらの発現 ·活性制御様式を知り、それに 基づく合理的な育種を行うことが重要である。 .
アミノ酸生産に関わる遺伝子の機能を理解するための重要な方法の一つは、遺伝 学的な手法、例えばァミノ酸生産性の上昇あるいは減少と遺伝子変異との関係を明 らかにすることである。
アミノ酸生産菌の育種の多くは、アミノ酸アナログなどの薬剤に対する耐性変異 の付与により行われているが、多くの場合、生産性向上がどの遺伝子の変異によつ てもたらされているかは明らかでない。
多くの微生物のァミノ酸生合成には、還元反応時の補酵素として NAD P Hが必 要である。例えば、 1分子の Lーリジン生合成には 4分子の NADPHが必要とな る。同様に、 スレオニンでは 1分子あたり 3分子、 イソロイシンでは 1分子あたり 5分子の NADPHが必要となるなど、大部分のァミノ酸の生合成には分子あたり 複数の NAD PHを必要とする。従って、微生物を用いたこれらのアミノ酸の生産 にとつて、 NADPHの供給は重要な課題である。
多くの微生物では、 N AD P Hの供給酵素は限定される。該微生物の糖代謝の主 要経路上で NADPHを供給できるのは、主にペント一スリン酸経路（HMP)中 の G 6 P D [EC1.1.1.49]、 6—ホスホダルコン酸デヒドロゲナ一ゼ [EC1.1.1.4]、 および T C A回路中のイソクェン酸デヒドロゲナ一ゼ [EC1.1.1.41]と考えられて いる。
なかでも HMPの第一酵素であり、 エムデン 'マイヤ一ホフ経路（E MP ) との 分岐点酵素でもある G 6 P Dはェシエリヒァ（Escherichia)属ゃコリネバクテリウ ム属細菌による種々のアミノ酸の生産にとつて非常に重要な酵素と考えられ、生化 学的諸性質を中心に様々な解析が行われてきた。コリネバクテリゥム属細菌の該酵 素については、例えば、 Journal of Bacteriology, SS， 1151, (1969) ; Agricultural and Biological Chemistry, 51, 101, (1987)、 特閧平 9 - 2 2 4 6 6 1に報告さ れているが、該酵素を利用したアミノ酸の生産性向上に関する検討は報告されてい ない。
また、 大腸菌、 およびコリネバクテリウム 'グル夕ミクム（Corynebacterium gli]tamicum)¾どの細菌については、 該遺伝子の塩基配列が解明されている (Journal of Bacteriology, m, 968， (1991 )；特開平 9- 224661] が、 該遺伝子 を利用したアミノ酸の生産性向上に関する検討は報告されていない。 日 sの im '
本発明の目的は、 L—アミノ酸の生合成に関与する G 6 P D、該酵素をコードす る D NA、該 D NAをぺク夕一に組み込んで得られる組換え体 D N Aまたは該組換 え体 D N Aを保有する形質転換体を利用して、微生物による L—ァミノ酸生産性を より高め、 工業的に有利に L—アミノ酸を製造することにある。
本発明者は、配列番号 2で表されるァミノ酸配列を有するポリペプチドをコード する D N Aを単離することに成功し、 L一アミノ酸の製造に利用できることを見出 した。 また、鋭意検討を行った結果、配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 2 1 3番目の A l aが別のアミノ酸に置換され、かつ G 6 P D活性を有するポリべ プチドは、 L一アミノ酸の生産性をさらに向上させることを見出し、本発明を完成 させるに至った。 すなわち、 本発明は、 以下の （1 )〜（2 1 ) に関する。
( 1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するポリぺプチド。 (2) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 213番目の Al aが 別のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ G 6 PD活性を有するポリぺ プチド。
( 3 ) 配列番号 12で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプチド。
(4) 上記（2)のポリペプチドのアミノ酸配列において、 213番目以外 の 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からな り、 かつ G 6 PD活性を有するポリペプチド。
(5) 配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 213番目以外の 1 若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ G 6 PD活性を有するポリペプチド。
(6) 上記（ 1)〜（5)いずれか 1つのポリペプチドをコードする DNA。 ( 7 ) 配列番号 1で表される塩基配列を有する DNA。
(8) 配列番号 1で表される塩基配列において、 A l aをコードする第 63 7〜639番目の塩基配列が、 A 1 a以外のアミノ酸をコードするコドンに置換さ れた塩基配列を有する D N A。
(9) 配列番号 11で表される塩基配列を有する DNA。
( 10) 配列番号 1で表される塩基配列を有する DNAとストリンジェント な条件下でハイプリダイズし、配列番号 1で表される塩基配列において A 1 aをコ —ドする第 637〜639番目の塩基配列に相応する塩基配列が A la以外のァ ミノ酸をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつグルコース一 6 -リ ン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする D N A。
(11) 配列番号 1で表される塩基配列を有する DNAとストリンジェント な条件下でハイブリダィズし、配列番号 1において第 637番目の塩基に相応する 塩基がアデニンである塩基配列を有し、かつ G 6 P D活性を有するポリぺプチドを コードする DNA。
(12) 上記（6) 〜（11) いずれか 1つの DN Aをべクタ一に組み込ん で得られる組換え体 DNA。
(13) 組換え体 DNAが、 ェシエリヒア属またはコリネパクテリゥム属に 属する微生物で複製可能な組換え体 DNAである、上記（ 12)の組換え体 DNA。
(14) Escherichia QQ TOPIO (FERM BP- 7135)株が保有するプラスミ ド pCRBzwfMo
(15) 上記 （12)〜 （14)いずれか 1つの組換え体 DNAまたはブラ スミドを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
(16) 宿主細胞が、 L—アミノ酸を生産する能力を有する微生物である、 上記 （ 15 ) の形質転換体。
(17) 宿主細胞が、 ェシヱリヒア属またはコリネパクテリゥム属に属する 微生物である、 上記 （16) の形質転換体。
(18) 上記（6)〜 （11)いずれか 1つの DN Aを人為的に染色体上に 取り込んだ、 ェシエリヒア属またはコリネパクテリゥム属に属する形質転換体。
(19) コリネバクテリウム属に属する微生物が、 コリネバクテリウム -グ ル夕ミカムである、 上記 （17) または （18) の形質転換体。
(20) 上記（ 15 )〜（ 19 )いずれか 1つの形質転換体を培地に培養し、 培養物中に上記（1)〜 （5)いずれか 1つのポリペプチドを生成蓄積させ、 該培 養物から該ポリぺプチドを採取することを特徴とする、 ポリぺプチドの製造方法。
(21) 上記（ 16 )〜（ 19 )いずれか 1つの形質転換体を培地に培養し、 培養物中に NAD PHを利用して生合成される L—アミノ酸を生成蓄積させ、該培 養物から該 L一アミノ酸を採取することを特徴とする、 L—アミノ酸の製造方法。
(22) NADPHを利用して生合成される L一アミノ酸が、 L—リジン、 L—スレオニン、 L—イソロイシン、 L—トリプトフアン、 L—フエ二ルァラニン、 L—チロシン、 L—ヒスチジン、 L—システィンから選ばれる L—アミノ酸である、 上記 （21) の L—アミノ酸の製造方法。
(23) L—アミノ酸が L—リジンである、 上記（21)の L—アミノ酸の 製造方法。
以下、 本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のポリぺプチドは、配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するポリぺプ チドまたは酉 S列番号 2で表されるァミノ酸配列の 213番目の A 1 aが別のアミ ノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ G 6 P D活性を有するポリぺプチドで ある。該ポリペプチドとしては、例えば配列番号 1 2で表されるアミノ酸配列を有 するポリぺプチドがあげられる。
G 6 P D活性を有していれば、上記ポリべプチドが有するアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する ポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含される。ただし、該ポリペプチドは公 知の G 6 P D (例えば、配列番号 2において、 1 2 0番目の T h rが A l aに置換 されたポリペプチド） を含まない。
該 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換または付加されたァミノ酸配列からな り、かつ G 6 P D活性を有する蛋白質は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laooratory Press (1989) (以下、 モレキュ ラ—.クロ—ニング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997) (以下、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキユラ —'バイオロジーと略す)、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ΊΆ, 6409(1982)、 Gene, M， 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, l^, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Z, 488 (1985)等に記載の部位 特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 2または 1 2で示されるアミノ酸配列 を有するポリペプチドをコードする D N Aに部位特異的変異を導入することによ り、取得することができる。 また、配列番号 2で表されるアミノ酸配列から 1若し くは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列をもともと有し、かつ G 6 P D活性を有するポリぺプチド（例えばコリネバクテリゥム ·グル夕ミクムと近縁 の微生物由来の G 6 P D )をコ一ドする D N Aに上記方法により部位特異的変異を 導入し、配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 2 1 3番目のアミノ酸に相応するァ ミノ酸を別のアミノ酸に置換することによつても取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位 特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、 好ましくは 1〜 1 0個、 さらに好ましくは 1〜 5個である。
また、本発明のポリペプチドが G 6 P D活性を有するためには、配列番号 2また は 12記載のアミノ酸配列と、 BLAST 〔J. Mol. Biol., m, 403 (1990)〕 や FAS TA (Methods in Enzymology, m, 63-98 (1990)〕等を用いて計算したと きに少なくとも 60%以上、通常は 80%以上、特に 95%以上の相同性を有して いることが好ましい。
本発明のポリペプチドをコードする本発明の DNAとしては、例えば、配列番号 1で表される塩基配列を有する D NA、配列番号 1で表される塩基配列において A 1 aをコードする第 637〜639番目の塩基配列が A 1 a以外のアミノ酸をコ —ドするコドンに置換された塩基配列 （以下、 配列番号 lsubと略す） を有する D NA、 または配列番号 1において、第 637番目の塩基がアデニンである塩基配列 を有する DN Aである配列番号 11で表される塩基配列を有する DN Aがあげら れる ο
配列番号 1で表される塩基配列を有する DN Aとストリンジェントな条件下で ハイプリダイズし、配列番号 1で表される塩基配列において A 1 aをコ一ドする第 637〜639番目の塩基配列に相応する塩基配列が A 1 a以外のアミノ酸をコ —ドするコドンに置換された塩基配列を有し、かつ G 6 P D活性を有するポリぺプ チドをコードする DNAも本発明の DNAに包含される。ただし、該 DNAには公 知の DNA (例えば、配列番号 1において、 358番目のアデニンがグァニンに置 換された DNA) は含まれない。
ここで、配列番号 1の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能 な DNAとは、配列番号 1または配列番号 11で表される塩基配列を有する DN A をプロ一ブとして、 コロニー 'ハイブリダィゼ一シヨン法、 プラーク .ハイブリダ ィゼーション法ぁるいはサザンプロヅトハイブリダイゼ一ション法等を用いるこ とにより得られる DNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはブラ一ク由来の DNAを固定ィ匕したフィル夕一を用いて、 0. 7〜： L. 0mo 1/1の塩ィ匕ナトリ ゥム存在下、 65 °Cでハイプリダイゼ一ションを行った後、 0. 1〜 2倍濃度の S SC溶液 （1倍濃度の S SC溶液の組成は、 15 Ommo 1/1塩化ナトリウム、 15mmo 1/1クェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65 °C条件下でフィル夕 一を洗浄することにより同定できる DN Aをあげることができる。ハイブリダィゼ ーシヨンは、 モレキュラー ·クローニング第 2版、 カレント 'プロトコ一ルズ ·ィ ン ·モレキュラー ·ノ、、ィォロジ一、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に 準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能な D N Aとして具体的には、前述の B L A S Tや F A S T A等を用いて計算したときに、配列番号 1または 1 1で表さ れる塩基配列と少なくとも 6 0 %以上の相同性を有する塩基配列を有する D N A、 好ましくは 8 0 %以上の相同性を有する塩基配列を有する D NA、さらに好ましく は 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を有する D N Aをあげることができる。 上記本発明の D N Aは、 Corynebaoter!mn glutamicum No.58(FERM BP-7134)株あ るいは該株に通常の変異操作を施した後、 L—アミノ酸生産性が高まつた変異株か ら取得することができる。
変異操作としては、 例えば、 N-メチル -Ν' -ニトロ- N-ニトロソグァ二ジン （N T G) を用いた常法；微生物実験マニュアル， 1986年， 131頁， 講談社サイェンティ フィック社） をあげることができる。
上記本発明の； D N Aの単離は、 以下の方法により行うことができる。
すなわち、 該 D NAを含む株より、 例えば斎藤らの方法 [Biochimica et
Biophysica Acta, ΊΖ, 619 (1963)]により染色体 D NAを調製し、 該染色体 D NA を適当な制限酵素で切断する。得られた D N A断片を細菌内で自立複製可能なべク 夕一（例えばプラスミ ド） に連結し、 該連結された D N Aを G 6 P D活性が欠損す る微生物に導入する。得られた微生物より、 G 6 P D活性を指標に形質転換株を単 離し、 該形質転換株より該酵素遺伝子を単離する。
例えば、 大腸菌 [ェシエリヒア · J Ή Escherichia cali)のグルコース— 6—リ ン酸イソメラ一ゼのみを欠損する株はグルコースを唯一の炭素源とする培地で生 育できるが、さらに G 6 P Dを欠損する株はグルコースを唯一の炭素源とした培地 で生育できない [Escherichia coli and Salmonella typhi皿 rium， 192 (1996)]。 従って、該 2重欠損株に D NAを導入し、 グルコースを唯一の炭素源とした培地で 生育できるようになつた株を選択することにより、該株より本発明の D N Aを単離 することができる。 本発明の D N Aを導入する微生物は、該 D NAが発現可能なものならば、いかな る属の細菌でも使用できる。 また、 自立複製可能なベクターとは、 該細菌内で自立 複製できるものならばいかなるものでもよい。例えば、ェシエリヒア属に属する微 生物、 なかでも大腸菌の場合、 該自立複製可能なぺク夕一としては、 pUC18 (宝酒 造社製） や pBluescriptSK (-) (東洋紡社製） が挙げられる。 また、 pCE54 (特開昭 58-105999) のような大腸菌とコリネパクテリゥム属細菌の両方で自立複製可能な シャトルべクタ一でもよい。
該ベクタ一と本発明の D NAとの連結は、 T4D NAリガ一ゼ等を用いる通常の方 法で行なうことができる。宿主への導入は、例えば大腸菌の場合、 ハナハンらの方 法 [Journal of Molecular Biology, 週, 557 (1983)]等により行なうことがで きる。
あるいは、 G 6 P D遺伝子の塩基配列情報 [例えば、 コリネバクテリウム -グル タミカムの場合、 ジェンバンク （GenBank) ァクセッション 'ナンバー E13655、 あるいは配列番号 1で表される塩基配列]をもとにオリゴマー D NAを合成し、該 オリゴマー D N Aをプライマ一、コリネバクテリウム属に属する微生物の染色体 D N Aを鎢型としてポリメラ一ゼ 'チェイン 'リアクション （P C R) を行い、 得ら れた D NA断片を選択マ一力一遺伝子を有するぺク夕一に連結してェシエリヒア 属、 コリネパクテリゥム属細菌等の適当な宿主に導入し、該遺伝子を単離すること もできる。 この場合は G 6 P D欠損株を用いる必要はない。
さらには、該遺伝子の塩基配列、例えば配列番号 1で表される塩基配列をもとに、 通常用いられる D N A合成装置、 例えばパーキンエルマ一社製 ABI3948を用いて合 成することもできる。
上記方法により単離された本発明の D N Aを、宿主微生物で複製および発現が可 能な発現べク夕一に導入し、得られた組換え体べク夕一により宿主微生物を形質転 換する。
本発明のポリペプチドをコードする D N Aを含有してなる組換え体 D N Aは微 生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモ一夕一、 リボソーム結合配列、本発 明の D NA、転写終結配列、 より構成されたべクタ一であることが好ましい。プロ モー夕一を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
この目的のためのベクターとしては、ェシエリヒア属に属する微生物の場合、例 えば、 pBTrp2、 pBTacls pBTac2 (いずれもべ一リンガーマンハイム社より巿販） 、 PKK233-2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 pGEMEX-1 (Promega社製）、 pQE-8 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58-110600)、 pKYP200 CAgric. Biol. Chem. , ^S, 669 (1984)〕、 pLSAl CAgric. Biol. Chem. , SS, 277 (1989)〕、 pGELl 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, S2, 4306 (1985)〕、 pBluescript II SK (-) (Stratagene 社製）、 Trs30〔ェシヱリヒア 'コ >j JM109/pTrS30 (FEMBP-5407) より調製〕、 pTrs32〔ェシヱリヒア'コ U JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) より調製〕、 pGHA2〔ェ シエリヒア .コリ IGHA2 (FERM B-400) より調製、 特開昭 60-221091〕、 GKA2 〔ェ シエリヒア .コリ IGKA2 (FERM BP-6798) より調製、 特開昭 60-221091〕、 Term2 (讓 86191、 US4939094, US5160735) 、 pSupexヽ ρΐΜΙΟヽ pTP5、 pC194、 pEG400 〔J. Bacteriol. , 112, 2392 (1990)〕、 pGEX(Phannacia社製）、 pETシステム（Novagen 社製）等をあげることができる。 また、 コリネパクテリゥム属に属する微生物の場 合、 pCGl (特開昭 57- 134500)、 pCG2 (特開昭 58-35197)、 pCG4 (特開昭 57-183799)、 pCGll (特閧昭 57- 134500)、 pCG116、 pCE54、 pCBlOl (いずれも特開昭 58- 105999)、 pCE51、 pCE52、 pCE53 [いずれも Molecular and General Genetics, 1 , 175 (1984)] 、 および本明細書実施例に示す pCS299P等が挙げられる。
プロモ一夕一としては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよ い。例えば、 trpプロモーター（Ptrp)、 lacプロモ一夕一、 PLプロモ一夕一、 Paプロ モ一夕一、 T7プロモ一夕一等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモ一夕一をあ げることができる。 また Ptrpを 2つ直列させたプロモ一夕一 （Ptrp x 2 ) 、 tacプロ モ一夕一、 lacT7プロモ一夕一、 let Iプロモ一夕一のように人為的に設計改変され たプロモーター等も用いることができる。
リボソ一ム結合配列であるシャインーダルガノ （Shine- Dalgarno)配列と開始コ ドンとの間を適当な距離（例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いること が好ましい。
本発明の組換えべクタ一においては、本発明の D N Aの発現には転写終結配列は 必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ま しい。
宿主細胞としては、下記に示した L—ァミノ酸を生産することのできる細胞であ ればいずれでもよいが、好ましくは該ァミノ酸を生産する能力を有する微生物が用 いられる。より好ましくは、ェシエリヒア属またはコリネパクテリゥム属に属する 微生物が、 さらに好ましくはコリネパクテリゥム属に属する微生物が、 とくに好ま しくは、 コリネノ クテリゥム ·グルタミクムが用いられる。
該微生物の例として、 例えば、 セラチア (Seiratk)属、 コリネバクテリゥム (Corynehacterium)属、 アースロバクタ一（Arthrobacter)属、 ミクロバクテリゥム (Mi nrohantftrium)S. バチルス（B illliS)属、 ェシエリヒア（Escherichia)属に属 する微生物をあげることができる。 具体的な例としては、 ェシエリヒア 'コリ XLl-Blue, ェシエリヒア 'コリ XL2-Blue、 ェシエリヒア 'コリ 皿1、 ェシエリヒ ァ 'コリ MC1000、 ェシエリヒア 'コリ KY3276、 ェシエリヒア 'コリ W1485、 ェシ エリヒア ·コリ JM109、 ェシエリ tァ 'コリ HB101、 ェシエリヒア 'コリ No.49、 ェシエリヒア 'コリ W3110、 ェシエリヒア'コリ NY49、 ェシェリヒア 'コリ GI698 、 ェシエリヒア 'コリ TB1、 ェシエリヒア ·コリ ATCC 9637、 ェシエリヒア ·コ リ FERM BP-5985、 セラチア ·フイカリア（Senatk fkank)、 セラチア 'フォン ティコラ（Serratia fonti cola), セラチア ' リケファシエンス (Seiratk
T i uefaciens), セラチア ·マルセッセンス（Serratia marcescens) バチルス 'ズ フチリス（Bacillus subtil is), バチルス ·アミロリケファシエンス ( dllns amyl ol iqiiefacines). コリネバクテリゥム ·アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6872、 ブレビバクテリゥム 'インマリオフィルム
(Brfivibactfirium immariophilium) ATCC14068、 プレビバクテリウム ·サヅカロリ. チイクム（Rrevibacterimn saonharolvticiim) ATCC 14066, プレビパクテリゥム ·口 ゼゥム（Brevibacterh roseum)ATGC 13825, ブレビパクテリゥム ·チォゲ二夕リス (Brevibacterium thiogenitalis)ATCC1924Q, コリネパクテリゥム ·グル夕ミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC14067、 コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869、 コリネバクテリウム 'グル夕ミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, コリネバクテリウム .グル夕ミカム ATCC13869, コリネパクテリゥム ·グル夕ミカム（Corvnebacte mn glutami cum) ATCC13870、 コリネバクテリゥム ·カルナェ（ Corynebacterium c.al 1 i]nae)ATCC15991 、 コリネバクテリゥム 'ァセトグルタミカム（tene aitoiM
aoet.og1iita.inicmn)ATCC1 R0fi, ミクロバクテリゥム 'アンモニアフィラム
(Mi crobacterium ajiimoniaphi 1iim)ATCG15354, コリネバクテリゥム ·サ一モアミノ ゲネス（Corvnebacte nm thermoaminQ£en£s)AJ12340等をあげることができる。 好 適には、下記の菌株ぁるいは下記菌株から誘導された Lーァミノ酸生産変異株が用 いられる。 コリネバクテリゥム，グルタミカム ATCC13032
コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム ATCC13869
コリネバクテリウム ·グル夕ミカム ATCC13870
組換えぺク夕一の導入方法としては、上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができる。例えば、ェシエリヒア属に属する微生物の場合、 カルシウムイオンを用いる方法 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, , 2110 (1972)〕 や電気穿孔法 [Methods in Enzymology，_235、 375 (1994)]等をあげることができ る。 コリネパクテリゥム属に属する微生物の場合、 プロトプラスト法（例えば、 特 開昭 57-186492および特開昭 57-18649) や、 電気穿孔法 [例えば、 [Journal of Bacteriology, 115, 4096 (1993)] を挙げることができる。
本発明の D N Aを染色体上に有するェシエリヒア属またはコリネパクテリゥム 属に属する微生物としては、該 D NA断片が遺伝子組換えあるいは変異処理により 染色体上に人為的に導入されたものであればいかなるものでもよい。例えば任意の 配列の G 6 P D遺伝子を含む株から変異処理によって本発明の D N Aを含む株に 改変された株でもよいし、 あるいは、 相同組換え法 [Bio/Technology, ， 84 (1991)； Microbiology, 1 , 1863 (1998)]、 ファージゃトランスポゾンを用いる 方法 [Escherichia coli and Salmonella typhimurium, 2325-2339 (1996)] など で該 D NA断片が染色体内に人為的に挿入された株でもよい。好適には、相同組み 換え法により該 D N Aが染色体中に挿入された株があげられる。
本発明においては、 遺伝子組換えに加え、 変異処理により得られた株も形質転換 体と呼ぶ。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発 明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポ リぺプチドを製造することができる。
また、本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に L—アミノ酸を生成蓄積 させ、 該培養物から採取することにより、 L—アミノ酸を製造することができる。 該 L—アミノ酸としては、生合成に NAD P Hを使用するアミノ酸であればいず れでもよい。例えば、 L—リジン、 L—スレオニン、 L一イソロイシン、 L—トリ プトファン、 L—フエ二ルァラニン、 L—チロシン、 L—ヒスチジン、 L—システ インなどが挙げられる。あるいは、 これらアミノ酸を中間体とするアミノ酸以外の 化合物でもよい。好適には L—リジンが挙げられる。第 1図にアミノ酸の生合成経 路を示した。 図中、 NAD P Hを消費する反応を下線とともに示した。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方 法に従って行うことができる。
培養に使用する培地は、炭素源、 窒素源、 無機塩類などを含む通常の栄養培地を 用いることができる。
炭素源としては、本発明の形質転換体もしくは微生物が資化し得るものであれば よく、 グルコース、 フラクト一ス、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプン あるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エダ ノ一ル、 プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アン モニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その 他の含窒素化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コ一ンスチープ リカー、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体およ びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシゥ ム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭 酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度 は 1 5〜4 0 °Cがよく、培養時間は、通常 1 6時間〜 7日間である。培養中の p H は 3 . 0〜9 . 0に保持することが好ましい。 p Hの調整は、無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、 ァシピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培 地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモ一夕一を用いた組換えべクタ一で形質転換 した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても よい。 例えば、 lacプロモ一夕一を用いた組換えぺク夕一で形質転換した微生物を 培養するときにはイソプロピル一^— D—チォガラクトビラノシド等を、 trpプロ モー夕一を用いた組換えべクタ一で形質転換した微生物を培養するときにはィン ドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、 塩析法などを併用することにより、培養液から L—アミノ酸を回収することができ る。
本発明の形質転換体により製造されたポリぺプチドを単離精製するためには、通 常の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば本発明のポリぺプチドが、細 胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲ ナイザ一、 ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出 液を遠心分離することにより得られる上清から、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミ ノエチル （DEAE) —セファロ一ス、 DIAION HPA-75 (三菱化成社製） 等のレジンを 用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (Pharmacia社製） 等 のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 プチルセファロース、 フエ 二ルセファロ一ス等のレジンを用いた疎水性ク口マトグラフィ一法、分子篩を用い たゲルろ過法、ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標 品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞 を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不 溶体を回収する。回収したポリぺプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。該 可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることに より、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精 製法により該ポリぺプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリぺプチドが細胞外に.分泌された場合には、培養上清に該ポリぺプチ ドを回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法によ り処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製 法を用いることにより、 精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、例えば、配列番号 2または 1 2 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができる。
また、本発明のポリペプチドは、 F m o c法（フルォレニルメチルォキシカルボ ニル法）、 t B o c法（t—プチルォキシカルボニル法）等の化学合成法によって も製造することができる。 また、 Advanced ChemTech社、 パーキン 'エルマ一社、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument社、 Synthecelト Vega社、 PerSeptive 社、 島津製作所等のぺプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは ない。 の な^日
第 1図は、蛋白質を構成する 2 0種アミノ酸のコリネバクテリゥム属細菌における 生合成経路を示した図である。下線を記した箇所は NAD P Hを消費する反応を示 す。枠囲みの箇所は NAD P Hを生産する反応を示す。
各反応を司る酵素に対応する遺伝子名は、基本的に大腸菌の命名法によった。図中、 グルコース一 6 -リン酸デヒドロゲナ一ゼは G6PD(zwf)と表した。
第 2図は、 PCS299Pの造成過程を示した図である。 雜昍》 施する めの慕 の形熊
実施例 1 新規 G 6 P D遺伝子の取得
( 1 ) G 6 P D遺伝子の塩基配列決定
コリネバクテリウム ·グル夕ミカム N o . 5 8株 （以下、 N o . 5 8株と略す） は、 コリネバクテリゥム ·グルタミカム A T C C 1 3 0 3 2株（以下、 A T C C 1 3 0 3 2株と略す） に変異処理を施して得られた L—リジン生産菌である。
該菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター：日本国茨城 県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (旧：工業技術院生命工学工業技術研究所： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に平成 12年 4月 14日付けで受託番 号： FERM BP- 7134として寄託されている。 AT CC 13032株およ び No. 58株の G 6 PD遺伝子を以下のようにクロ一ニングした。
それぞれの株より、 斎藤らの方法 [Biochimica et Biophysica Acta, ΊΖ, 619 (1963)]により染色体 DN Aを調製した。 また、 コリネパクテリゥム .グル夕ミカ ム MJ233株において既知となっている G6PD遺伝子の塩基配列 [ジェンバンク (GenBank)ァクセッション 'ナンバー E13655]をもとにして、 該塩基配列を標的 とする PCR反応のためのプライマ一を常法により作成した。配列番号 3、 4に該 プライマーの塩基配列を示す。 P CR反応はパーキンエルマ一社製サ一マルサイク ラ一 （ジーンアンプ PCRシステム 9600)、 Pfuturbo DNAポリメラ一ゼ （スト ラタジーン社製） 、 各染色体 DNA 100 ng、 及び添付のバッファ一を用いて、 94°C— 1分間、 60°C— 1分間、 74°C— 2分間のサイクルを 25回行った。増 幅した約 2. 2 kbの P CR産物をァガロースゲル電気泳動し、 QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社製） を用いて抽出精製した。
G 6 PD遺伝子を含む上記 2.2¾:13の0 八断片と 01-8111111:べク夕一 （イン ヴィ トロジェン社製）とを T4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結した後、 常法に従って大腸菌 One Shot T0P10 competent cells (インヴィ トロジェン社製） に形質転換した。 50//g/mlのカナマイシンを含む L B寒天培地 [酵母エキス (ディフコ社製） 5g、 パクトトリプトン （ディフコ社製） 10 g、 塩化ナトリウ ム 10g、 ァガー（ディフコ社製） 16gを水 1Lに含み pH7. 2に調整された 培地]上にて選択した形質転換株を、 50〃g/mlのカナマイシンを含む LB培 地中で終夜培養し、得られた培養液からアルカリ SDS法（モレキュラー ·クロー ニング第 2版） にてプラスミドを調製した。
ATCC 13032株由来の G 6 PD遺伝子を含むプラスミドを pCRBzwf 1、 N o . 58株由来の G 6 PD遺伝子を含むプラスミドを pCRBzwf2と命名した。
次に、 これらプラスミド上の G 6 PD遺伝子の塩基配列を常法により決定した。 その結果、 ATCC 13032株および No. 58株から得られた G 6 PD遺伝子 の塩基配列は全く同じであることが判明した。該塩基配列を配列番号 1に示す。す なわち、 L—リジン生産菌 No. 58株の G 6 PD遺伝子は野生型であることが示 された。
(2)新規 G 6 PD遺伝子の取得
No. 58株に NT Gによる変異処理（微生物実験マニュアル， 1986年， 131頁、 講談社サイェンティフィヅク社）を施した後、 lmg/mlの 6—ァザゥラシルを 含む最少寒天培地 [グルコース 10 g、塩ィ匕アンモニゥム 4 g、 尿素 2 g、 リン酸 二水素一力リウム 1 g、 リン酸一水素二力リウム 3 g、硫酸第一鉄 7水和物 10 m g、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 4g、硫酸マンガン 7水和物 4m ：、 塩化亜鉛 7水和物 40 g、塩化第二鉄 6水和物 200 // g、塩化銅 2水和物 10 z g、塩 化マンガン 4水和物 10 g、四ほう酸ナトリウム 10水和物 10 // g、モリブデ ン酸アンモニゥム 4水和物 10 j g、 ピオチン 5 O j g ニコチン酸 5mg、 ァガ — (ディフコ社製） 16gを水 1Lに含み、 pH7. 2に調整された培地] に播種 し、 30°Cで 2日間培養した。 出現したコロニーを単離し、 下記実施例 2 (4)で 示した方法で L—リジンの生産試験を行い、 No. 58株に比べて生産性の高いク ローンを選定した。そのうちの 1株を Ml株と命名した。 Ml株の G6PD遺伝子 を上記 （1) の方法により単離し、 該遺伝子を pCR-Bluntベクタ一に組み込んだ。 得られた組み換えプラスミドを pCRBzwfMと命名した。その塩基配列決定を行ったと ころ、 AT CC 13032株および No. 58株中の G 6 P D遺伝子では配列番号 1の 637番目の塩基がグァニンだが、 ^ 1株中の06?0遺伝子ではァデニン に変化していた。 該塩基配列を配列番号 11に示した。
該変異により、 ATCC 13032株および No. 58株中の G 6 P Dのアミ ノ端末側より 213番目の Ala (コドン GCT) が、 M 1株の G 6 PDでは T h r
(コドン ACT) に変化していた。 該アミノ酸配列を配列番号 12に示した。
即ち、 M 1株の G 6 PDには Ala213Thrのアミノ酸置換変異が存在することが示 された。 pCRBzwfMを保有する大腸菌 TOP 10株は、 独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6
(旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3 号）に平成 12年 4月 14日付けで受託番号： FERM BP-7135として寄 託されている。
実施例 2 新規 G 6 P D遺伝子の L—リジン生産に与える効果
(1)遺伝子置換用べクタ一の作成
実施例 1で示された G 6 PDのアミノ酸置換変異の効果を調べるため、 No. 5 8株の G 6 P D遺伝子を変異型に置き換えることを試みた。
そのための遺伝子置換用ベクターを以下のように作製した。
配列番号 5と 6で表される塩基配列を有するそれぞれ 37mer、 29merの 一本鎖 DNAを常法に従い合成した。 0. 1M NaCl 50〃1中にそれぞれ 1 Opmo 1 e/zlとなるように混合し、 95 °Cで 2分間保持した後、 65°Cで 15分間保持した。 3時間かけて 30°Cまで冷却し、両一本鎖 DNAを対合させて 2本鎖 DN Aを得た。
PHSG299 (宝酒造社製） を _Q_Q_RI及び^ Jll (いずれも宝酒造社製） で切 断し、 ァガロースゲル電気泳動を行った後、 QIAquick Gel Extraction Kit (キア ゲン社製)を用いて抽出精製した。得られた PHSG299断片と上記 2本鎖 DNA断片を ライゲ一シヨンキヅト ver2 (宝酒造社製） を用いて連結し、常法に従い大腸菌 DH 5ひ株を形質転換した。該菌株を 50 g/m 1のカナマイシンを含む L B寒天培 地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株のうちの 1株を 50〃 g/m 1のカナマイシンを含む LB培地を用いて終夜培養し、得られた培養液からアル力 リ SDS法にてプラスミドを調製した。得られたプラスミドを PHSG299Lと命名した。
(2) プラスミ ド pCS299Pの造成
大腸菌とコリネ型細菌双方で自立複製可能なシャトルプラスミド PCS299Pを以下 の方法で作製した。
PCG116 [Bio/Technology, 11， 921 (1993)] »"Rgl I I (宝酒造社製） で切断 し、 I切断断片を取得した。
PHSG299 (宝酒造社製） を _E mHI (宝酒造社製） で切断後、 得られか Bam H I切断断片を常法にしたがってェ夕ノール沈殿法により濃縮し、該断片をアル力 リフォスファタ一ゼで処理した。得られた上記 2種類の断片を混合し、 ライゲ一シ ヨンキット ver.1 (宝酒造社製）を用い、リガ一ゼ反応を行った。反応産物を用い、 常法 （モレキュラー ·クロ一ニング第 2版)に従って大腸菌 NM522株を形質転 換した。該菌株を、 20〃g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培地上で培養し、 形質転換株を選択した。該形質転換株を 20 g/m 1のカナマイシンを含む L B 培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリ S D S法によりプラスミドを 調製し、 pCS116- 299Bgll DN Aを取得した。
該 pCS116-299BgllDNAの制限酵素切断部位を常法に従って確認した。
pCS116-299BgllDN Aを用いて電気穿孔法 [FEMS Microbiology Letters, £S, 299， (1989)] によりコリネパクテリゥム ·アンモニアゲネス ATCC 6872株を形 質転換した。
該菌株を 20〃gZmlのカナマイシンを含む CM寒天培地 [ポリペプトン S (日本製薬社製） ] 10g、 酵母エキス S (日本製薬社製） 5g、 エルリヅヒ肉ェ キス （極東製薬工業社製） 10 g、 塩ィ匕ナトリウム 3 g、 ピオチン 30〃 gを水 1Lに含み、 pH7. 2に調整された培地]上で培養し、 形質転換株を選択した。 該形質乾換株より常法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素で切 断することにより、 該プラスミドが pCS116-299Bgllであることを確認した。
pCS116-299Bgll DNAを、 Ps t I (宝酒造社製） および丑 _aJllH Iで切断し た後、エタノール沈殿法により精製した。得られた DNAからキロシ一ケンシング 用デリ一シヨンキヅト （宝酒造社製）を用いて部分欠失プラスミドを取得した。該 プラスミドを用い、常法に従って大腸菌 NM 522株を形質転換した。該菌株を 2 0 j g/m 1のカナマイシンを含む L B寒天培地上で培養し、形質転換株を選択し た。該形質転換株を 20〃 g/m 1のカナマイシンを含む L B培地を用い終夜培養 し、得られた培養液からアルカリ SDS法にてプラスミドを調製した。常法に従つ て、得られた各プラスミドの制限酵素地図を作成し、部分欠失長の異なるプラスミ ドを選択した。
選択したプラスミドを用いて、電気穿孔法によりコリネバクテリウム ·アンモニ ァゲネス ATCC 6872株を形質転換した。得られた形質転換株を 20 zg/ m 1のカナマイシンを含む CM寒天培地上に塗布後、 30 で 2曰間培養し、力ナマ ィシン耐性コ口二一の出現の有無を指標としてコリネバクテリゥム'アンモニアゲ ネス中で自立複製能を有するプラスミドを選択した。
自立複製能を有するプラスミドの中で最も長い欠失領域を有するプラスミドを 選択し、 このプラスミドを pCS299del6とした。 '
PCS299del6 DNAを常法に従って形質転換株より調製した後、 制服酵素！) r a Iおよび丑 ml I (いずれも宝酒造社製） を用いて切断した。該切断 DN A断片 をァガロースゲル電気泳動により分画後、 pCG116由来の DNAを有する約 2. 7 k bの DNA断片を分離し、 DNA prep (旭硝子社製） を用いて抽出精製した。 pBluescript SK (+) (東洋紡績社製） DNAを、 常法に従って: ELo R V (宝酒 造社製） で切断した。 得られた切断 DNA断片をエタノール沈殿法により濃縮後、 アルカリフォスファターゼ処理した。該処理 DNA断片をァガ口一スゲル電気泳動 により分画後、 DNA prepを用いて抽出精製した。
上記 2. 7 kbの DN A断片と pBluescript SK(+)断片をライゲ一シヨンキヅト ver..1を用いて連結した後、該連結 DNAを用いて、常法に従って大腸菌 NM 52 2株を形質転換した。該菌株を 10 Ο zg/mlのアンピシリン、 5 OAdg/ml の X— G a 1 (5-bromo-4-chloro-3-maoyl-5,-D-gaiactoside)、 1 mm o 1/1 の I P T G (isopropylthio-?- D-galactoside)を含む L B寒天培地上で培養し、 形質転換株を選択した。該形質転換株を 100〃g/mlのアンビシリンを含む L B培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリ SDS法によりプラスミド を調製した。常法に従って、得られた各プラスミドの制限酵素地図を作成した。 JL _0_ R I切断によって 3. 4kbと 2kbの DNA断片を生じるプラスミドを PCSSK21とした。
配列番号 7、 8で表される塩基配列を有する DNAを合成し、 これらの DNAを プライマ一として、 pHSG299DNAを鎵型として、 Taq DNAポリメラ一ゼ （宝酒 造社製） を用い、添付の反応条件に従って、 PCR反応を行った。反応産物を常法 に従ってエタノール沈殿した後、 制限酵素: E_^LIおよび iLQ_I (宝酒造社製） を用いて切断した。該切断 DNA断片をァガロースゲル電気泳動により分画し、得 られた約 1. 3kbの DNA断片を DNA prepを用いて抽出精製した。 配列番号 9、 10で表される塩基配列を有する DN Aを合成し、 これらの DNA をプライマ一として、 pHSG299DNAを錡型として、 Taq DNAポリメラ一ゼを用 い、添付の反応条件に従って、 PCRを行った。反応産物を常法に従ってェ夕ノー ル沈殿した後、制限酵素: 丄 Iおよび: B 丄 I Iを用いて切断した。該切断 DN A断片をァガロースゲル電気泳動により分画し、得られた約 1. 3 kbの DNA断 片を DNA prepを用いて抽出精製した。
上記で取得したプラスミド PCSSK21を H I (宝酒造社製） および: BmiHI を用いて切断した。該切断 DNA断片をァガロースゲル電気泳動により分画し、得 られた約 2. 7kbの DNA断片を DNAprepを用いて抽出精製した。抽出精製され た上記の 3種類の DNA断片を混合した後、ライゲーシヨンキヅト ver.1を用いて 連結した。
該連結 DN A断片を用いて常法に従って大腸菌 NM522株を形質転換した。 該菌株 を 20 gZmlのカナマイシン、 50 /g/mlの X— Ga 1、 1 mmo 1/1 の I P T Gを含む L B寒天培地上で培養し形質転換株を選択した。
該形質転換株を、 2 O zg/mlのカナマイシンを含む LB培地を用い終夜培養 し、得られた培養液からアルカリ SDS法によりプラスミドを調製した。常法に従 つて、得られた各プラスミドの制限酵素地図を作成し、第 1図に記載された構造を 有するプラスミドを PCS299Pとした。
PCS299P及び pHSG299Lを k^I及び: E_ail (いずれも宝酒造社製）で切断し、 ァガロースゲル電気泳動を行った。 PCS299Pに由来するコリネバクテリウム属細菌 における複製開始領域（OriC)を含む 2. 5kbの断片及び pHSG299L断片をそれぞ れ QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社製）を用いて抽出精製した。 該 2. 5 kbの DNA断片と PHSG299L断片とをライゲ一シヨンキヅト ver.2 (宝酒造社製） を用いて連結し、常法に従い大腸菌 DH 5ひ株に形質転換した。得られた形質転換 体から上記方法と同様にプラスミドを調製した。 得られたプラスミドを PHSG2990C と命名した。
PM0B3 (ATCC77282)及び PHSG2990Cを £_s_LI (宝酒造社製） で切断し、 ァガロ ースゲル電気泳動を行い、 PM0B3に由来する枯草菌レバンシユークラーゼ （SacB) 遺伝子を含む 2. 6kbの DNA断片と PHSG2990C断片をそれぞれ QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社製）を用いて抽出精製した。
該 2. 6 kbの D N A断片と pHSG2990C断片とをライゲ一シヨンキット ver2 (宝酒 造社製）を用いて連結し、 常法に従い大腸菌 DH 5 α株を形質転換した。該菌株を 50 g/m 1のカナマイシンを含む L B寒天培地上にて培養し、形質転換体を選 択した。得られた形質転換体から上記方法と同様にプラスミドを調製した。該プラ スミドを PHSG2990CSBと命名した。
PHSG2990CSBを _ o_LIで切断して得られる 5. 1 kbの DNA断片をァガロー スゲル電気泳動後、 QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社製）を用いて抽出精 製した。実施例 1で作成した pCRBzwfMを _ILQ_LIで切断し、 ァガロースゲル電気泳 動後、 QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社製）を用いて抽出精製した。 ライ ゲーシヨンキヅト ver2 (宝酒造社製）を用いて pCRBzwfMの _ _Q_LI部位に OriCおよ び SacB遺伝子を含む j!Lo上 I断片を連結し、常法に従い大腸菌 D H 5 a株を形質転 換した。該菌株を 50〃g/mlのカナマイシンを含む LB寒天培地で培養し、形 質転換株を選択した。得られた形質転換体から上記方法と同様にプラスミ ドを調製 した。該プラスミドを pCRBOSzwfMと命名しこれを G 6 PD遺伝子組み込みベクタ一 とした。
(3) No. 58株の G 6 PD遺伝子の置換
No. 58株に変異型 G 6 PD遺伝子を含む pCRBOSzwfMを導入後、池田らの方法 [Microbiology, , 1863 (1998)] を用いてこれを相同組み換えで染色体 D N A 中に組み込んだ。
pCRBOSzwfMにコードされる枯草菌レバンシユークラ一ゼが自殺基質を生産する ことを利用した選択法 [Journal of Bacteriology, 14, 5462 (1992)] により 2 度目の相同組み換えが行われた株を選択し、該選択株の中から No. 58株が従来 保有していた G 6 PD遺伝子（野生型）が変異型 G 6 PD遺伝子に置換された株を 以下の方法で単離した。
No. 58株に pCRBOSzwfMを電気穿孔法 [FEMS Microbiology Letters, fiS, 299 (1989)]により導入し、 50 z g/m 1のカナマイシンを含む KM 163寒天培地 〔グルコース 1 O g、ペプトン（極東製薬工業社製） 10 g、硫酸マグネシウム 0. 5 g エールリヅヒ肉エキス （極東製桀工業社製） 5 g、尿素 2 g、 塩化ナトリウ ム 2. 5 g、 パクトァガー（ディフコ社製） 18 gを水 1Lに含み ρΗ7· 2に調 整された培地〕上にて 30°Cで 2日間培養し、形質転換株を得た。該形質転換株の 1株である Tf 1株を選択し、該菌株を 20〃g/mlのカナマイシンを含む KM 163培地中で培養し、 電気穿孔法により pCGl 1 (特公平 6-91827) の導入操 作を行った。 導入操作後、 該菌株を 50〃g/mlのカナマイシンおよび 200〃g/ mlのスぺクチノマイシンを含む KM 163寒天培地上にて 30°Cで 2日間培養 し、 形質転換体を得た。 これらの形質転換株の 1株の染色体を、 池田らの報告
[Microbiology, 144, 1863 (1998)] に従ってサザンブロヅトハイブリダィゼ一シ ヨンにより調べた。 その結果、 Campbellタイプの相同組み換えにより pCRBOSzwfM が染色体に組み込まれていることが確かめられた。このような株では、野生型およ び変異型の G 6 PD遺伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で 2回目の 相同組み換えが起こりやすくなつている。
該形質転換株 （一回組換え体） を Sue培地 （ショ糖 100 g、 肉エキス 7 g、 ペプトン 10 g、 塩化ナトリウム 3 g、 酵母エキス （ディフコ社製） 5 g、 バクト ァガ一（ディフコ社製） 18gを水 1 Lに含み pH7. 2に調整された培地）上に 塗布し、 30°Cで 1日間培養して生育するコロニーを選択した。 SacB遺伝子が存在' する株は、 ショ糖を自殺基質に転換するのでこの培地では生育できない。これに対 し、野生型と変異型の G 6 P D遺伝子間での 2回目の相同組み換えにより SacB遺伝 子が欠失した株では、 自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この相 同組み換えの際には、野生型もしくは変異型の G 6 P D遺伝子のいずれかが、 SacB とともに欠失する。このとき野生型の G 6 P D遺伝子が SacBとともに欠失した株で は、 変異型の G 6 PD遺伝子への遺伝子置換が起こったことになる。
このようにして得られた 2回組換え体の染色体 D N Aを斎藤らの方法
[Biochimica et Biophysica Acta, ΊΖ, 619 (1963)] により調製し、 配列番号 3 と 4で表される塩基配列を有する DNAをプライマーとして Pfu turbo D N Aポリ メラ一ゼ（ストラタジーン社製） と添付のバッファ一を用いて P CRを行った。 こ れらの P CR産物の塩基配列を常法により決定し、 2回組み換え体の G 6 PD遺伝 子が野生型か変異型かを判定した。その結果、野生型の G 6 PD遺伝子のみを有す る株（例として、 No. 58W株）、 および変異型の G 6 PD遺伝子のみを有する 株 （例として、 No. 58M株） とが得られたことが確認された。
(4) L一リジン生産試験
取得した G 6 PD遺伝子置換株（No. 58W及び No. 58M)及び親株であ る No. 58株のリジン生産性を 5リットルジャーフアーメン夕一にて培養、 評価 した。
一次種培地〔グルコース 50 g、 酵母エキス （日本製薬社製） 10 g、 ペプトン
(極東製薬工業社製） 10 g、コ一ンスティ一プトリ力一 5 g、塩化ナトリウム 2. 5 g、尿素 3 g、 ピオチン 50 zgを水 1リヅトルに含み pH 7. 2に調整し、 炭 酸カルシウムを 10 g加えた培地〕 100mlに各菌株を植菌し、 1リットルバヅ フル付き三角フラスコにて 30°Cで 24時間培養した。次に二次種培地（ダルコ一 ス 50 g、コ一ンスティーブトリカー 10 g、硫酸マグネシウム 7水和物 0.5 g：、 ニコチン酸 5mg、 チアミン塩酸塩 lmg、 ピオチン 100〃g、 パントテン酸力 ルシゥム 10mg、 リン酸二水素一カリウム 2 g、尿素 3g、硫酸第一鉄 7水和物 1 Omgs硫酸亜鉛 7水和物 lmg、硫酸アンモニゥム 8 g、 ペプトン 20 g、 炭 酸水素ナトリウム 2 gを水 1 Lに含む培地） 2000mlに一次種培養液を 40m 1植菌し、 5リ ヅトルジャ一フアーメンターにて 30°Cで 12時間培養した。次に 本培養培地 [廃糖蜜 93 g (糖換算量)、 リン酸二水素一カリウム 0. 5g、 硫酸第 一鉄 7水和物 10mg、チアミン塩酸塩 100 zg、 ソィペプトン 2g、硫酸マグ ネシゥム 7水和物 0. 5 g ニコチン酸 5mg\硫酸アンモニゥム 15 gを水 1リ ヅトルに含み p H 7. 4に調整した培地] 1675mlに二次種培養液を 230m 1植菌し、 5リヅトルジャーフアーメン夕一にて 35°Cで 42時間培養した。 本培養培地中に蓄積した L一リジンの定量は、高速液体クロマトグラフィー（H PLC) により行なった。
第 1表は、 No. 58株、 No. 58W株、 および No. 58 M株の L—リジン 発酵生産量の測定結果である。 これにより、新規の変異型 G 6 PDにより、 L—リ ジン生産性が向上することが示された。
【表 1】
第 1表
菌株 L—リジン生産性 (g/l)
No.58 49.7
No.58W 53.5
No.5BM 63.3 纏卜の禾 il用可能' I'牛
本発明により、改変された G6PDおよび該 G6PDHをコードする DNAが得 られ、該改変された G 6 PDを用いて、微生物による L一アミノ酸の生産性を向上 させることができる。
【配列表フリ テキスト】
配列番号 3 人工配列の説明—合成 D N A
配列番号 4 人工配列の説明—合成 D N A
配列番号 5 人工配列の説明一合成 D N A
配列番号 6 人工配列の説明一合成 DNA
配列番号 7 人工配列の説明一合成 D N A
配列番号 8 人工配列の説明一合成 DNA .
配列番号 9 人工配列の説明—合成 D N A
配列番号 10 ：人工配列の説明—合成 DNA

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 2で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプチド。
2. 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 2 1 3番目の A l aが別 のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつグルコース— 6—リン酸デヒド ロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
3. 配列番号 1 2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
4. 請求項 2記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、 2 1 3番目以外 の 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな り、 かつグルコース一 6—リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチド。
5. 配列番号 1 2で表されるアミノ酸配列において、 2 1 3番目以外の 1若 しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か つグルコース一 6―リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリべプチド。
6. 請求項 1〜 5いずれか 1項に記載のポリペプチドをコードする D N A。
7. 配列番号 1で表される塩基配列を有する D NA。
8. 配列番号:！で表される塩基配列において、 A l aをコードする第 6 3 7 〜 6 3 9番目の塩基配列が、 A l a以外のアミノ酸をコードするコドンに置換され た塩基配列を有する D NA。
9. 配列番号 1 1で表される塩基配列を有する D NA。
10. 配列番号 1で表される塩基配列を有する D N Aとスドリンジェントな条 件下でハイプリダイズし、配列番号 1で表される塩基配列において A 1 aをコード する第 6 3 7〜6 3 9番目の塩基配列に相応する塩基配列が A 1 a以外のァミノ 酸をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつグルコース— 6—リン酸 デヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチドをコードする D NA。
11. 配列番号 1で表される塩基配列を有する D N Aとストリンジェントな条 件下でハイブリダィズし、配列番号 1において第 6 3 7番目の塩基に相応する塩基 がアデニンである塩基配列を有し、かつグルコース一 6—リン酸デヒドロゲナ一ゼ 活性を有するポリペプチドをコードする D NA。
12. 請求項 6〜1 1いずれか 1項に記載の D N Aをベクターに組み込んで得 られる組換え体 D NA。
13. 組換え体 D NAが、ェシエリヒア属またはコリネバクテリウム属に属す る微生物で複製可能な組換え体 D NAである、 請求項 1 2記載の組換え体 D NA。
14. Escherichia, coli T0P10 (FERM BP- 7135)株が保有するプラスミド pCRBzwfM。 '
15. 請求項 1 2〜1 4いずれか 1項に記載の組換え体 D NAまたはプラスミ ドを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
16. 宿主細胞が、 L—アミノ酸を生産する能力を有する微生物である請求項 1 5記載の形質転換体。
17. 宿主細胞が、ェシヱリヒア属またはコリネパクテリゥム属に属する微生 物である、 請求項 1 6記載の形質転換体。
18. 請求項 6〜1 1いずれか 1項に記載の D NAを人為的に染色体上に取り 込んだ、 ェシエリヒア属またはコリネパクテリゥム属に属する形質転換体。
19. コリネバクテリウム属に属する微生物が、 コリネバクテリウム ·グル夕 ミカムである、 請求項 1 7または 1 8記載の形質転換体。
20. 請求項 1 5〜 1 9いずれか 1項に記載の形質転換体を培地に培養し、培 養物中に請求項 1〜 5いずれか 1項に記載のポリぺプチドを生成蓄積させ、該培養 物から該ポリべプチドを採取することを特徴とする、 ポリペプチドの製造方法。
21. 請求項 1 6〜： 1 9いずれか 1項に記載の形質転換体を培地に培養し、培 養物中に N A D P Hを利用して生合成される L—ァミノ酸を生成蓄積させ、該培養 物から該 L—アミノ酸を採取することを特徴とする、 L一アミノ酸の製造方法。
22. NAD P Hを利用して生合成される L—アミノ酸が、 L—リジン、 L一 スレオニン、 L—イソロイシン、 L—トリプトファン、 L—フエ二ルァラニン、 L —チロシン、 L—ヒスチジン、 L—システィンからなる群より選ばれる L—ァミノ 酸である、 請求項 2 1記載の L—アミノ酸の製造方法。
23. L—アミノ酸が L一リジンである、請求項 2 1記載の L—アミノ酸の製 造方法。
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