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WO2001090310A1 - Procede de production de $g(g)-glutamylcysteine - Google Patents

Procede de production de $g(g)-glutamylcysteine Download PDF

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WO2001090310A1
WO2001090310A1 PCT/JP2001/004366 JP0104366W WO0190310A1 WO 2001090310 A1 WO2001090310 A1 WO 2001090310A1 JP 0104366 W JP0104366 W JP 0104366W WO 0190310 A1 WO0190310 A1 WO 0190310A1
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WO
WIPO (PCT)
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strain
medium
saccharomyces
synthase
glutathione
Prior art date
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PCT/JP2001/004366
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English (en)
French (fr)
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Hiroaki Nishiuchi
Kouichiro Sano
Reiko Sugimoto
Yoichi Ueda
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to DE60106711T priority patent/DE60106711T2/de
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • Item ⁇ one guru Tamil cis Tin preparation Technical Field
  • the present invention ⁇ Monteagle Tamil cis Tin high content of yeast and yeast extract, and a method for breeding the same yeast.
  • Aglutamylcysteine and cystine produced therefrom are useful in the food field.
  • Background surgery Sistine is used for the purpose of improving the flavor of food.
  • Proteolytic and semi-synthetic methods are known for the production of cysteine, but the currently used methods are proteolytic and semi-synthetic methods.
  • cysteine For the purpose of using cysteine to improve the flavor of foods, natural food materials with a high cysteine content have been demanded, but such natural food materials have been scarcely known.
  • gluyuthione a peptide in which glutamic acid and glycine are bound to cysteine
  • Guryu thione is synthesized from cysteine via ⁇ -glutamyl cysteine.
  • Alphamycin cysteine is synthesized from cysteine and glutamic acid by alpha myrcysteine synthase (GSH1).
  • GSH2 alpha myrcysteine synthase
  • glutathione is synthesized from amylacetin and glycine by glutathione synthase
  • Promoting 7-gluca myrcysteine synthase gene is a strong transcription promoter — Yeast Saccharomyces exchanged at ⁇ 8.
  • the S. cerevisiae strain YHT178 produces a large amount of ⁇ -gluca myrcysteine synthase in the cells.
  • Ohtake et al. Reported that glucaria thione was not detected in the Saccharomyces cerevisiae strain YL1 deficient in the glucurethione synthase gene.
  • Yamasuyuki Otake et al. Agricultural and Biochemical Chemistry, Vol. 12, No. 54, pp. 3145-3150, 1990.
  • strain No. 78 with enhanced expression of ⁇ -glutamylcysteine synthetase can accumulate up to 1.69% of ⁇ -glu-myrcysteine in the cells in the minimum synthetic medium (Otake et al., Supra). Bioscience and Industry.
  • the growth rate of yeast in this medium has not been reported and has been reported in YPD medium, which is richer in nutrients than the minimal synthetic medium, but it has reached the industrially required growth rate even in YPD medium. I can't say that.
  • the reported YL1 strain of the YL1 strain in which the glucan thione synthase gene is disrupted has a low content of 0.533% of myrcysteine, which is not enough for industrial-level practical use (Otake et al., Supra). Agric. Biol. Chem.). Chris et al. (Chris M. Grant et al., Molecular Biology of the Cell II, Vol. 8, pp. 1699-1707, 1997) Point out that the phenotype of the YL1 strain is not completely deficient in glutathione synthase, as it is consistent with a partial weakening of glutathione synthase.
  • the YL1 strain has a significantly different growth ability in the logarithmic growth phase between the medium containing and not containing glucanthiothion, and is therefore essentially different from the glucanthione synthase-attenuated strain of the present invention.
  • the present invention provides a natural food material that can be used practically for improving the flavor of foods, similarly to cysteine.
  • An object of the present invention is to provide a yeast which is applicable and has a large amount of accumulated alginate myrcysteine, and a yeast extract produced using the yeast.
  • the present inventors have found that cysteine is liberated when heating alginate myrcysteine, and that heating a natural food material containing alginate myrcysteine results in the same effect as heating a natural food material containing cysteine. It was thought that the natural food materials used could be manufactured. In an attempt to breed yeast containing high levels of argyrus myrcysteine, we attempted to disrupt the glutamic acid thione synthase gene, but did not obtain satisfactory results. Furthermore, as a result of diligent studies, the present inventors have succeeded in obtaining a strain containing high algae myrcysteine and having good growth, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the medium in which the growth of the glucanothione synthase-deficient strain is slower than that of the Saccharomyces cerevisiae wild-type strain is a medium that does not contain glucanthiothion, or a medium that does not contain glucanthiothion, or glucanthione, agarcinmilcystein, or L-cysteine.
  • cystine-free medium (1) Saccharomyces cerevisiae.
  • the glutathione synthase encoded by the glutathione synthase gene on the chromosome lacks the C-terminal region after the arginine residue at position 370. Saccaromyces' Celepiche.
  • a recombinant was prepared by modifying the S. calomyces cerevisiae glucan thione synthase gene by a genetic recombination method, and the growth of a glucan thione synthase-deficient strain was slower than that of a wild-type Saccharomyces cerevisiae strain.
  • a recombinant containing glutamate thione in the logarithmic growth phase in a range of 0.004% by weight to 0.1% by weight is selected. Breeding method of Calomyces cerevisiae.
  • the present invention will be described in detail.
  • cysteine can be obtained by heating ⁇ -glutamylcysteine.
  • ⁇ -glucan myrcysteine is heated for 3 to 300 minutes at 50 to 120 ° C in ⁇ ⁇ 1 to 7, ⁇ -glucan milcysteine is decomposed into cysteine and PCA (pyrrolidone carboxylic acid).
  • PCA pyrrolidone carboxylic acid
  • Saccharomyces cerevisiae of the present invention has been produced based on the above findings for the purpose of improving the flavor of foods and the like.
  • Saccharomyces cerevisiae of the present invention is cultured in a medium in which the growth of a glucan thione synthase deficient strain is slower than that of a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae, it occupies argyrum myrcystin as a solid component during its logarithmic growth phase. Contains at least 1% by weight.
  • the content of alpha myrcysteine or gluyothion is determined by the solid content of the bacterial cells, for example, the alpha myrcysteine relative to the weight of bacterial cells after heating at 105 ° C for 4 hours. Or it refers to the content (%) of glucan thione.
  • Saccharomyces 'cerevisiae of the present invention was cultured in a medium in which the growth of a glucan thione synthase deficient strain was slower than that of a wild strain of Saccharomyces' cerevisiae, during the logarithmic growth phase, 1 g of argyrum myrcysteine was added.
  • the Saccharomyces cerevisiae of the present invention produces a small amount of glutathione, and shows better growth than a glutathione synthase-deficient strain in a medium free of glutathione.
  • a strain having a weak glucanthione synthase activity that is weak enough to produce 0.004 to 0.1 wt% glucanthione in the medium is used.
  • a “gluythione synthase weakened strain” refers to a strain that substantially lacks gluethiothion synthase activity and cannot produce gluethiothion in a minimal medium.
  • the “logarithmic growth phase” refers to a time when the number of Saccharomyces cerevisiae cells in the culture increases logarithmically with respect to the culture time. It is not necessary that the content of the algae myrcysteine be 1% by weight or more throughout the logarithmic growth phase, and at least at any time during the logarithmic growth phase, preferably in the state described next to the logarithmic growth phase.
  • the above-mentioned state is a logarithmic growth phase having an absorbance of 1/2 or more of the absorbance of the culture solution at the time of transition from the logarithmic growth phase to the steady state.
  • the Saccharomyces * cerevisiae of the present invention produces at least a certain amount of ⁇ -glucan cysteine and has good growth on an industrially used medium in the absence of glucan thione. It has an excellent ability to produce milky cysteine per unit time and is suitable for the efficient production of yeast milk containing milky cysteine. By heating the obtained yeast extract, a cysteine-rich yeast extract can be produced.
  • Examples of a culture medium in which the growth of a glucanothione synthase-deficient strain is slower than that of a wild-type strain of Saccharomyces cerepiche, i.e., a strain that has glucanothione synthase activity and produces glucanothione include, for example, glucanothione.
  • Medium without gluten, or medium without gluten-thione, argyrus-milcysteine, L-cysteine and cystine Earth are exemplified.
  • the medium requires nutrients corresponding to the auxotrophy, for example, various amino acids, nucleotides, vitamins, etc. other than cysteine. Include accordingly.
  • Saccharomyces cerevisiae of the present invention the glutathione synthase encoded by the glutathione synthase gene on the chromosome binds to the C-terminal region after the arginine residue at position 370.
  • Saccharomyces * cerevisiae which is deleted that is, Saccharomyces cerevisiae which produces glucanthione synthase deleted at the 370 or lower position.
  • the gene-substituted strain prepared using the glutathione synthase gene in which the codon at the 370th was replaced with a stop codon produced a small amount of glutathione.
  • the Saccharomyces cerevisiae of the present invention can be obtained by attenuating the glutathione synthase activity of the cells according to the above findings.
  • the promoter of the glutathione synthase gene is replaced with a weak promoter derived from another gene instead of the promoter of the glutathione synthase gene.
  • the coding region may be modified to reduce expression and / or activity, or the transcription factor activity of the gene may be reduced.
  • Modification of the glutathione synthase gene sequence can be performed by the usual mutation treatment, for example, by UV irradiation or N-methyl-1-N-nitrosoguanidine (NTG), ethyl methanesulfonate (EMS), nitrite, acridine, etc. It can be performed by treatment with a mutagen or by gene replacement using gene recombination technology. Gene replacement can be performed as follows (see FIG. 4).
  • a glutathione synthase gene modified to encode a glutathione synthase having weak activity for example, a glutathione synthase gene in which the codon at position 370 is changed to a stop codon (weakened Transforming Saccharomyces cerevisiae with recombinant DNA containing the glutathione synthase gene) and causing recombination between the weakened glutathione synthase gene and the glutathione synthase gene on the chromosome .
  • the plasmid contains a marker gene according to the traits such as auxotrophy of the host, the operation is easy.
  • the recombinant DNA is made into a linear form by cutting with a restriction enzyme after being prepared using a plasmid, and further excluding the replication control region that functions in Saccharomyces cerevisiae. A strain into which DNA has been incorporated can be efficiently obtained.
  • the strain in which the recombinant DNA has been integrated into the chromosome as described above undergoes recombination with the glutathione synthase gene sequence originally present on the chromosome, and the normal glutathione synthase gene and the weakened Two fusion genes with the thione synthase gene are inserted into the chromosome with the other part of the recombinant DNA (vector part and marker gene) interposed. Therefore, in this state, the normal glutathione synthase gene functions.
  • glutathione synthase gene was recombined by recombination of the two glutathione synthase genes into Along with the keratin gene).
  • the normal glutathione synthase gene is left on the chromosomal DNA and the weakened glutathione synthase gene is cut out, and in contrast, the weakened glutathione synthase gene is left on the chromosomal DNA and In some cases, the gene for the glucan thione synthase is cut out.
  • the target gene-disrupted strain can be selected by amplifying the glutathione synthase gene by PCR and examining its structure.
  • Saccharomyces cerevisiae The transformation of Saccharomyces cerevisiae is performed by the protoplast method, the KU method, and the K method. Methods usually used for yeast transformation, such as the UR method and the electoral poration method, can be employed.
  • the expression control sequence such as the promoter can be modified.
  • the Saccharomyces cerevisiae of the present invention may have weak glutensylthione synthase activity, and may also have enhanced alphaglutamic acid synthase activity.
  • Saccharomyces' cerepiche of the present invention or the parent strain used for its production may be haploid, diploid, or more polyploid.
  • Saccharomyces cerevisiae modified as described above is cultured in a medium in which the growth of a glucanothione synthetase-deficient strain is slower than that of a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae, glucadathione is added at 0.0 during its logarithmic growth phase.
  • the Saccharomyces cerevisiae of the present invention can be obtained by selecting a recombinant containing from 0.4% by weight to 0.1% by weight.
  • the Saccharomyces cerevisiae of the present invention is cultured in a suitable medium, and a yeast extract containing alginate myrcysteine can be produced using the obtained cells. Further, by heating the obtained yeast extract, a yeast extract having a high cysteine content can be produced.
  • the medium used for producing the yeast extract is not particularly limited as long as the Saccharomyces cerevisiae of the present invention can grow well and efficiently produce ⁇ -glutamylcystin.
  • the Saccharomyces cerevisiae of the present invention can grow well even on a medium containing no glutathione, and therefore, an industrially used medium can be used. If necessary, add necessary nutrients to the medium according to the characteristics of the strain to be used.
  • FIG. 1 is a diagram showing release of cystine from ⁇ -glutamylcysteine by heat treatment at pH 3.
  • PCA indicates pyrrolidone carboxylic acid
  • Total Cysteine indicates total cysteine amount
  • ⁇ -Glu-Cys indicates ⁇ -glutamyl cysteine (the same applies to FIG. 2).
  • FIG. 2 is a diagram showing release of cystine from alginate myrcysteine by heat treatment at pH 5.
  • FIG. 3 is a diagram showing the construction of a plasmid GSH2Mdash / pYES2dash containing a cassette (cassette 2) for replacing the weakened glutathione synthase gene.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing gene replacement of the glutathione synthase gene using cassette 2.
  • N o shows growing (0D 6 6.) In SD medium containing Guru evening thione SD medium or lmM three strains (including ⁇ La sill required amount).
  • FIG. 6 is a diagram showing the growth of two strains of N and three strains of N in SD medium (containing the required amount of peracil).
  • N strains From N strains, SDF0A plate containing Peracil (2% purified agar, SD medium containing a final concentration of 50 mg / L peracil and lg / L 5-fluorofluorotinic acid hydrate) was used to obtain one peracil-requiring strain N per strain. As will be described later, since the strain of N strain was required to be complemented by the URA3 gene, it is considered to be a mutant strain of the URA3 gene.
  • Peracil 2% purified agar, SD medium containing a final concentration of 50 mg / L peracil and lg / L 5-fluorofluorotinic acid hydrate
  • the glucan thione synthase gene-disrupted strain was constructed using the N strain as a parent strain.
  • the chromosome DNA of the N strain was used as type III, and the region from the upstream region to the terminal region of the glutathione synthase (GSH2) gene was amplified by PCR.
  • the PCR reaction was carried out using a reaction solution of the composition shown below, after 94 ° C for 1 minute, by repeating 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 40 seconds, and 74 ° C for 1 minute and 30 seconds.
  • the URA3 gene was obtained by PCR using a plasmid PYES2 (Invitrogen) containing the gene as type III.
  • the PCR reaction was carried out by using a reaction solution having the composition shown below and repeating 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 94 ° C for 30 seconds, 52 ° C for 30 seconds and 74 ° C for 40 seconds after 1 minute at 94 ° C.
  • GSH2 / pGEM was digested with the restriction enzyme Muni to blunt the ends.
  • a URA3 gene fragment whose end was blunt-ended with the restriction enzyme Smal was ligated to the cleaved end to prepare plasmid and A3-GSH2 / pGEM.
  • PCR was carried out using primers having sequences corresponding to both ends of the GSH2 gene to prepare cassette 1.
  • the PCR reaction was carried out by using a reaction solution having the composition shown below and repeating 30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 1 minute.
  • the glucan thione synthase gene of the strain A1 was disrupted.
  • the culture was subcultured in 50 ml of YPD medium and cultured until logarithmic growth.
  • the cultured bacterial cells were suspended in 1 M sorbitol, cassette 1 was mixed, and the cells were transformed by electroporation.
  • the transformed strain was cultured on an SD plate containing ImM glutathione, and a growing strain was selected.
  • the strain in which the glutathione synthase gene was replaced by cassette 1 was selected by PCR and measuring the glutathione content of the cells as described below, and two N strains were obtained.
  • the two strains of N strain prepared as described above have a URA3 gene fragment-derived sequence added after the first codon in the coding region of the glutathione synthase gene. The synthase gene is translated correctly only to the first amino acid residue.
  • the glucan thione synthase gene fragment of N strain 1 was amplified by the PCR method.
  • the PCR reaction was carried out by using a reaction solution having the composition shown below and repeating 98 ° C for 10 seconds, then 30 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute.
  • the gene fragment amplified as described above was purified and subjected to an enzymatic reaction at 72 ° C. for 10 minutes under the following conditions to add A to the terminal.
  • Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) 0.5 1
  • This reaction product was ligated to plasmid pGEM-T Easy (Promega) according to the manufacturer's instructions to obtain plasmid GSH2dash / pGEM.
  • GSH2M-F1 SEQ ID NO: 8
  • GSH2-R1 SEQ ID NO: 9
  • a plasmid was prepared by removing 2 ori from the plasmid pYES2 (Invitrogen).
  • PYES2 was digested with restriction enzymes Sspl and Nhel, and the cut ends were blunt-ended and ligated to obtain plasmid pYES2dash.
  • Both pYES2dash and GSH2Mdash / pGEM are cleaved with restriction enzymes Sacl and Sphl, a fragment containing the URA3 gene is cut out from pYES2dash, and a glutathione synthase gene fragment having a mutation is cut out from GSH2Mdash / pGEM, and these are ligated. did.
  • the gene for the glutathione synthase gene of one strain N was replaced (FIG. 4).
  • the culture was subcultured in 50 ml of YPD medium and cultured until logarithmic growth.
  • the cultured bacterial cells were suspended in 1 M sorbitol, cassette 2 was mixed, and the cells were transformed by electoral portation.
  • the transformed strain was cultured on an SD plate containing lmM glutathione, and a growing strain was selected. It was confirmed by PCR that cassette 2 had been integrated at the desired position on the chromosome, and the obtained strain was used as an intermediate for N-th3.
  • the following operation was performed to leave only the weakened glutathione synthase gene on the chromosome.
  • the N-three intermediate was cultured in YPD medium, and the culture product was plated on SDF0A plate containing lmM glutathione.
  • the sequence of the glutathione synthase gene of the strain grown on the plate was determined, and it was confirmed that the sequence at the target site was correctly replaced. Thus, N strains were obtained.
  • the growth ability of the two strains of N and three strains of N obtained in the above manner in the logarithmic growth phase was examined.
  • the culture was cultured in 50 ml of SD medium (containing 50 mg / L peracil) or SD medium containing ImM glucanthione (50 mg / L). (Including Rasil)), and cultured with shaking at 30 ° C.
  • FIGS. As shown in FIG. 5, the three strains N did not show much difference from the growth ability in the medium containing glutathione even in the medium containing no glutathione.
  • growth in the logarithmic growth phase of the medium containing no glucan thione was better in the N strains than in the N strains (Fig. 6).
  • the production of argyrus myrcysteine and guryuthion was measured as follows. Obtain the cells by centrifuging the culture, and wash the cells twice with distilled water After that, the cells were subjected to a hot water extraction treatment at 70 ° C. for 10 minutes to obtain cell contents. This was centrifuged, and the contents of ⁇ -glutamylcysteine and glutamate thione in the obtained supernatant were measured. The yeast cells contained in the fixed medium were collected on a filter paper, heated at 105 ° C for 4 hours, and the weight of the remaining cells was measured to obtain the dry cell weight. Table 1 shows the content of ⁇ -gluca myrcysteine and glugi-thione per dried bacterial body weight. Table 1 ** 7-k, rutamylcystin glutathione incubation time until measurement Incubation time (%) (%)
  • Saccharomyces cerevisiae of the present invention produces at least a certain amount of alginate myrcysteine, and has good growth on an industrially used medium in which there is no alginate thione. Suitable for efficient production of yeast extract containing glutamyl cysteine.

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Description

明細 : ァ一グルタミルシスティンの製造法 技術分野 本発明は、 ァーグルタミルシスティン含量の高い酵母及び酵母エキス、 並びに 同酵母を育種する方法に関する。 ァーグルタミルシスティン、 及びそれから製造 されるシスティ ンは、 食品分野で有用である。 背景†¾術 システィンは、 食品の風味改善などを目的に用いられている。 システィンの製 法については蛋白分解法や半合成法などが知られているが、 現在主に用いられて いる方法は蛋白分解法と半合成法である。 システィンを食品の風味改善に用いる ことを目的として、 システィン含量の高い天然食品素材が求められているが、 そ のような天然食品素材は従来ほとんど知られていなかった。
一方、 システィンにグル夕ミン酸及びグリシンが結合したトリぺプチドである グル夕チオンも、 食品の風味改善に用いることが知られている。 グル夕チオンは、 システィンから、 ァ一グルタミルシスティンを介して合成される。 しかし、 ァ一 グル夕ミルシスティンを食品の風味改善に用いることはほとんど行われていない。 ァ一グル夕ミルシスティンは、 ァ一グル夕ミルシスティン合成酵素 （GSH1 ) に より、 システィンとグルタミン酸から合成される。 そして、 グル夕チオンは、 ァ 一グル夕ミルシスティンとグリシンから、 グル夕チオン合成酵素 （GSH2 ) により 合成される。
7 -グル夕ミルシスティン合成酵素遺伝子のプロモー夕一が強転写プロモー夕 — Δ Ρ8で交換された酵母サヅカロマイセス . セレピシェ YHT178株は、 菌体内でァ 一グル夕ミルシスティン合成酵素を大量に生産することが報告されている （大竹 康之ら、 バイオサイエンスとインダス トリ一、 第 50卷第 10号、 第 989〜994頁、 19 92年） 。 また、 大竹らは、 別の報告で、 サヅカロマイセス 'セレピシェのグル夕 チオン合成酵素遺伝子欠損株 YL 1株では、 グル夕チオンが検出されなかったと報 告している （大竹康之ら、 Agri cul tural and Biologi cal Chemistry 、 第 12卷、 第 54号、 第 3145〜3150頁、 1990年) 。
井上らは、 染色体上のグルタチオン合成酵素遺伝子の遺伝子破壊について報告 してレヽる ( Yoshiharu Inoueら、 Biochimica et Biophysi ca Acta、 第 1395号、 第 315〜320頁、 1998年） 。 この破壊遺伝子は、 3 9 6位のアミノ酸残基までは正確 に翻訳され、 3 9 7位以降の C末端側領域を欠失したグル夕チオン合成酵素をコ ードしていると考えられる。 井上らは、 遺伝子破壊株のグル夕チオン含量を測定 したがグル夕チオンは検出されなかったと報告している。
ところで、 ァーグル夕ミルシスティンに糖類を添加して加熱することによりフ レーバー組成物が得られることが知られている （特開平 4— 9 1 7 6 2号公報） が、 ァ一グルタミルシスティンを加熱するとシスティンが遊離することは知られ ていない。 発明の開示 上記のように、 ァーグル夕ミルシスティン合成酵素の発現の増強、 及び、 グル 夕チオン合成酵素遺伝子の破壊に関する報告がある。 しかし、 いずれの場合にも、 取得されたサヅカロマイセス · セレピシェは、 ァ一グル夕 ミルシスティ ン含量が 低いか、 あるいは生育がよくないものであり、 工業生産に必要な条件を十分に満 足するものとはいえない。
ァーグルタミルシスティン合成酵素の発現が増強された ΥΗΠ78株は、 最小合成 培地において最大 1.69%のァ—グル夕ミルシスティンを菌体内に蓄積し得ると報 告されている （前出、 大竹ら、 バイオサイエンスとインダス トリ一） 。 この培地 における酵母の増殖速度は報告されておらず、 最小合成培地よりも栄養源に富ん だ YPD培地での増殖速度が報告されているが、 YPD培地においてさえ工業レベルで 必要な增殖速度に達しているとはいえない。
また、 グル夕チオン合成酵素遺伝子が破壊された YL1株の報告されているァ一 グル夕 ミルシスティン含有量は 0.533%と少なく、 工業レベルの実用に耐え得るも のでもない （前出、 大竹ら、 Agri c . Biol . Chem. ) 。 なお、 クリスら （Chri s M. Grantら、 Mol ecular Biology of the Cel lヽ 第 8卷、 第 1699〜1707頁、 1997年） は、 YL 1株の表現型がグル夕チオン合成酵素を部分的に弱めたものと一致するの で、 グルタチオン合成酵素を完全に欠落させたものではないと指摘している。 し かし、 YL 1株は、 グル夕チオンを含む培地と含まない培地における対数増殖期の 増殖能が大きく異なっているので、 本件発明のグル夕チオン合成酵素弱化株とは 本質的に異なる。
また、 井上ら （前出） が作製したグル夕チオン合成酵素遺伝子破壊株について グル夕チオン含有量を測定した結果、 グル夕チオンは検出されなかったと報告さ れている。
このような技術背景の下に、 本発明は、 システィンと同様に食品の風味改善に 実用的に用いることができる天然食品素材を提供すること、 具体的には、 工業レ ベルでの生産にも適用可能であり、 かつ、 ァーグル夕ミルシスティンの蓄積量の 多い酵母及びその酵母を用いて製造される酵母エキスを提供することを課題とす る。
本発明者らは、 ァ—グル夕ミルシスティンを加熱するとシスティンが遊離する ことを見出し、 ァ一グル夕ミルシスティンを含有する天然食品素材を加熱すれば、 システィンを含有する天然食品素材と同様に用いられる天然食品素材を製造する ことができると考えた。 そこで、 ァーグル夕ミルシスティンを高含有する酵母を 育種することを目指し、 グル夕チオン合成酵素遺伝子の破壊を試みたが、 満足で きる結果は得られなかった。 さらに、 鋭意検討を行った結果、 ァーグル夕ミルシ スティンを高含有し、 かつ、 生育の良好な菌株を得ることに成功し、 本発明を完 成するに至った。
すなわち本発明は、 以下のとおりである。
( 1 ) サッカロマイセス 'セレピシェの野生株よりもグル夕チオン合成酵素欠損 株の生育が遅い培地で培養したとき、 その対数増殖期に、 ァ—グルタミルシステ インを 1重量％以上含有することができ、 かつ、 グル夕チオンを 0 . 0 0 4重量 %〜 0 . 1重量％の範囲で含有するサヅカロマイセス · セレピシェ。
( 2 ) 前記サッカロマイセス ' セレピシェの野生株よりもグル夕チオン合成酵素 欠損株の生育が遅い培地が、 グル夕チオンを含まない培地、 又は、 グル夕チオン、 ァ一グル夕ミルシスティン、 L—システィン及びシスチンを含まない培地である ( 1 ) のサッカロマイセス .セレピシェ。
( 3 ) 前記培地が最小培地である （ 2 ) のサヅカロマイセス .セレピシェ。
( 4 ) 染色体上のグル夕チオン合成酵素遺伝子によってコ一ドされるグル夕チォ ン合成酵素が、 3 7 0位のアルギニン残基以降の C末端側の領域を欠失している ことを特徴とするサヅカロマイセス 'セレピシェ。
( 5 ) ( 1 ) 〜 （ 4 ) のいずれかのサッカロマイセス 'セレピシェを好適な培地 で培養し、 得られた菌体を用いて製造された酵母エキス。
( 6 ) サヅカロマイセス · セレピシェのグル夕チオン合成酵素遺伝子を遺伝子組 換え法によって改変した組換え体を作製し、 サッカロマイセス · セレピシェの野 生株よりもグル夕チオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地で培養したとき、 その 対数増殖期にグル夕チオンを 0 . 0 0 4重量％〜 0 . 1重量％の範囲で含有する 組換え体を選択することを特徴とするァ一グルタミルシスティンを含有するサッ カロマイセス ·セレピシェの育種方法。 以下、 本発明を詳細に説明する。
前記したように、 本発明は第一に、 ァ一グルタミルシスティンを加熱するとシ スティンが得られるという知見に基づいている。 γ一グル夕ミルシスティンを ρ Η 1〜 7において 50〜120°Cで 3〜300分加熱すると、 ァ一グル夕ミルシスティンは システィンと PCA (ピロリ ドンカルボン酸） に分解するため、 システィンが全体 として高収率で得られる。 尚、 以降、 「システィン」 というときは、 L—システ ィンとその酸化型ジスルフィ ドであるシスチンの両者をいうことがある。
本発明のサッカロマイセス ·セレビシェは、 上記知見に基づき、 食品の風味改 善用等を目的として作製されたものである。 本発明のサッカロマイセス · セレビ シェは、 サヅカロマイセス · セレピシェの野生株よりもグル夕チオン合成酵素欠 損株の生育が遅い培地で培養したとき、 その対数増殖期に、 ァーグル夕ミルシス ティンを固形成分に占める割合で 1重量％以上含有する。 尚、 本発明において、 ァ—グル夕ミルシスティン又はグル夕チオンの含有量は、 菌体の固形成分、 例え ば、 105°Cで 4時間加熱した後の菌体重量に対するァ—グル夕ミルシスティン又 はグル夕チオンの含有量 （％) をいう。 また、 本発明のサッカロマイセス 'セレビシェは、 サヅカロマイセス 'セレビ シェの野生株よりもグル夕チオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地で培養したと き、 その対数増殖期に、 ァーグル夕ミルシスティンを 1重量％以上、 好ましくは 1 . 7重量％以上含有することができ、 かつ、 グル夕チオンを 0 . 0 0 4重量％ 〜 0 . 1重量％の範囲、 好ましくは 0 . 0 0 4重量％〜 0 . 0 1重量％の範囲で 含有する。 後記実施例に示すように、 本発明のサヅカロマイセス ·セレビシェは、 グル夕チオンを微量産生し、 グル夕チオンを含まない培地においてグル夕チオン 合成酵素欠損株よりも良好な生育を示す。 ここで、 本発明のサッカロマイセス - セレピシェのごとく、 前記培地で 0 . 0 0 4重量％〜 0 . 1重量％のグル夕チォ ンを産生する程度の微弱なグル夕チオン合成酵素活性を有する株を、 「グル夕チ オン合成酵素弱化株」 ということがある。 これに対し、 「グル夕チオン合成酵素 欠損株」 とは、 グル夕チオン合成酵素活性を実質的に欠損し、 最小培地でグル夕 チオンを産生できない株をいう。 また、 本発明において、 「対数増殖期」 とは、 培養中におけるサッカロマイセス ·セレビシェの細胞数が培養時間に対して対数 的に増加する時期をいう。 尚、 ァーグル夕ミルシスティン含有量は、 対数増殖期 のすべてにわたって 1重量％以上である必要はなく、 少なくとも対数増殖期の任 意の時点において、 好ましくは、 対数増殖期の次に述べる状態で 1重量％以上で あればよい。 即ち、 前記状態とは、 対数増殖期から定常状態になったときの培養 液の吸光度の 1 / 2以上の吸光度を有する対数増殖期である。
上述したように、 本発明のサッカロマイセス *セレビシェは、 ァ一グル夕ミル システィンを一定量以上産生し、 かつ、 グル夕チオンが存在しないような工業的 に用いられる培地における生育も良好であるので、 単位時間あたりのァ一グル夕 ミルシスティンの生産能に優れ、 ァ一グル夕ミルシスティンを含有する酵母ェキ スの効率的な製造に適している。 また、 得られた酵母エキスを加熱することによ つて、 システィン高含有酵母エキスを製造することができる。
サッカロマイセス ·セレピシェの野生株、 すなわちグル夕チオン合成酵素活性 を有し、 グル夕チオンを産生する株よりも、 グル夕チオン合成酵素欠損株の生育 が遅い培地としては、 例えば、 グル夕チオンを含まない培地、 あるいは、 グル夕 チオン、 ァーグル夕ミルシスティン、 L一システィン及びシスチンを含まない培 地が挙げられる。 具体的には、 S D培地等の各種の最小培地が挙げられる。 本発 明のサッカロマイセス ·セレピシェが上記の性質以外の栄養要求性を有する場合 は、 前記培地は、 栄養要求性に応じた栄養成分、 例えばシスティン以外の各種ァ ミノ酸、 ヌクレオチド、 ビタミン等を必要に応じて含む。
本発明のサヅカロマイセス ·セレピシェとして具体的には、 染色体上のグル夕 チオン合成酵素遺伝子によってコ一ドされるグル夕チオン合成酵素が、 3 7 0位 のアルギニン残基以降の C末端側の領域を欠失したサヅカロマイセス *セレビシ ェ、 つまり、 3 7 0位以下を欠失したグル夕チオン合成酵素を産生するサッカロ マイセス · セレピシェが挙げられる。
HU出の井上らの報告 ( Yoshiharu Inoueら、 Biochimi ca et Biophysi ca Acta、 第 1395号、 第 315〜320頁、 1998年） からは、 3 9 6番目のアミノ酸残基までを含 み、 3 9 7番目のアミノ酸残基以降を欠失したグル夕チオン合成酵素は、 活性を 欠損していると考えられた。 したがって、 グル夕チオン合成酵素構造遺伝子の 3 9 6番目のコ ドンよりも上流のコ ドンを終始コ ドンに置換した場合は、 発現産物 はグル夕チオン合成酵素活性を示さないと予想された。 しかしながら、 後記実施 例に示すように、 3 7 0番目のコ ドンを終始コ ドンに置換したグル夕チオン合成 酵素遺伝子を用いて作製した遺伝子置換株は、 微量のグル夕チオンを産生したこ とから、 微弱なグル夕チオン合成酵素活性を有していることが示唆された。
本発明のサヅカロマイセス 'セレピシェは、 上記知見にしたがって、 菌体のグ ル夕チオン合成酵素活性を弱化させることによって取得することができる。 グル 夕チオン合成酵素活性を弱化させるには、 例えば、 グル夕チオン合成酵素遺伝子 のプロモーターを、 同遺伝子固有のプロモーターから他の遺伝子由来の弱いプロ モーターに置換する、 グル夕チオン合成酵素遺伝子のプロモーター又はコ一ド領 域を改変して発現もしくは活性又はその両方を弱める、 あるいは、 同遺伝子の転 写因子活性を弱める、 等の方法が挙げられる。
グル夕チオン合成酵素遺伝子配列の改変は、 通常の変異処理、 例えば UV照射、 あるいは N—メチル一N—ニトロソグァ二ジン （NTG) 、 ェチルメタンスルホネー ト （EMS) 、 亜硝酸、 ァクリジン等の変異剤による処理によって、 又は、 遺伝子 組換え技術を利用した遺伝子置換によって、 行うことができる。 遺伝子置換は、 以下のようにして行うことができる （図 4参照） 。 微弱な活性 を有するグル夕チオン合成酵素をコ一ドするように改変したグル夕チオン合成酵 素遺伝子、 例えば 3 7 0番目のコ ドンを終始コ ドンに改変したグル夕チオン合成 酵素遺伝子 （弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子） を含む組換え D N Aでサッカ ロマイセス ·セレピシェを形質転換し、 弱化型グル夕チオン合成酵素遺伝子と染 色体上のグル夕チオン合成酵素遺伝子との間で組換えを起こさせる。 その際、 プ ラスミ ドには、 宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、 マーカ一遺伝子を含ま せておくと操作がしゃすい。 また、 前記組換え D N Aは、 プラスミ ドを用いて作 製した後に制限酵素で切断して直鎖状にし、 さらに、 サヅカロマイセス .セレビ シェで機能する複製制御領域を除いておくと、 染色体に組換え D N Aが組み込ま れた株を効率よく取得することができる。
上記のようにして染色体に組換え D N Aが組み込まれた株は、 染色体上にもと もと存在するグルタチオン合成酵素遺伝子配列との組換えを起こし、 正常なグル タチオン合成酵素遺伝子と弱化型グル夕チオン合成酵素遺伝子との融合遺伝子 2 個が組換え D N Aの他の部分 （ベクター部分及びマーカー遺伝子） を挟んだ状態 で染色体に挿入されている。 したがって、 この状態では正常なグル夕チオン合成 酵素遺伝子が機能する。
次に、 染色体 D N A上に欠失型グル夕チオン合成酵素遺伝子のみを残すために、 2個のグル夕チオン合成酵素遺伝子の組換えにより 1コピーのグル夕チオン合成 酵素遺伝子を、 ベクター部分 （マ一カー遺伝子を含む） とともに染色体 D N Aか ら脱落させる。 その際、 正常なグルタチオン合成酵素遺伝子が染色体 D N A上に 残され、 弱化型グル夕チオン合成酵素遺伝子が切り出される場合と、 反対に弱化 型グル夕チオン合成酵素遺伝子が染色体 D N A上に残され、 正常なグル夕チオン 合成酵素遺伝子が切り出される場合がある。 いずれの場合もマーカー遺伝子が脱 落するので、 2回目の組換えが生じたことは、 マーカ一遺伝子に対応する表現形 質によって確認することができる。 また、 目的とする遺伝子破壊株は、 PCRによ りグル夕チオン合成酵素遺伝子を増幅し、 その構造を調べることによって、 選択 することができる。
サヅカロマイセス ' セレピシェの形質転換は、 プロ トプラス ト法、 K U法、 K U R法、 エレク ト口ポレーシヨン法等、 通常酵母の形質転換に用いられる方法を 採用することができる。
上記と同様にして、 プロモータ一などの発現調節配列を改変することもできる。 また、 本発明のサッカロマイセス .セレピシェは、 微弱なグル夕チオン合成酵素 活性を有することに加えて、 ァーグル夕ミルシスティン合成酵素活性が増強され ていてもよい。
本発明のサヅカロマイセス 'セレピシェ又はその作製に用いる親株は、 1倍体 でも 2倍体でも、 それ以上の倍数体でもよい。
上記のようにして改変したサヅカロマイセス ' セレビシェについて、 サッカロ マイセス . セレピシェの野生株よりもグル夕チオン合成酵素欠損株の生育が遅い 培地で培養したとき、 その対数増殖期にグル夕チオンを 0 . 0 0 4重量％〜 0 . 1重量％の範囲で含有する組換え体を選択することにより、 本発明のサッカロマ イセス ·セレピシェを取得することができる。
本発明のサッカロマイセス ·セレピシェを好適な培地で培養し、 得られた菌体 を用いて、 ァ一グル夕ミルシスティンを含有する酵母エキスを製造することがで きる。 また、 得られた酵母エキスを加熱することにより、 システィン含量の高い 酵母エキスを製造することができる。
酵母エキスの製造に用いる培地は、 本発明のサッカロマイセス ·セレピシェが 良好に生育し、 かつ、 ァ一グルタミルシスティンを効率よく産生するものであれ ば特に制限されない。 特に、 本発明のサッカロマイセス · セレピシェは、 グル夕 チオンを含まない培地でも良好に生育することができるので、 通常、 工業的に用 いられる培地を用いることができる。 尚、 必要に応じて、 用いる菌株の形質にし たがって必要な栄養素を培地に添加する。
培養条件及び酵母エキスの調製は、 通常のサッカロマイセス 'セレピシェの培 養、 及び酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。 酵母エキスは、 酵母菌体を 熱水抽出したものを処理したものでもよいし、 酵母菌体を消化したものを処理し たものでもよい。 図而の簡単な説明 図 1は、 p H 3における加熱処理によるァ一グルタミルシスティンからのシス ティンの遊離を示す図である。 PCAはピロリ ドンカルボン酸を、 Total Cyste ine は総システィン量を、 ァ- Glu-Cysはァ—グルタミルシスティンを、 各々示す （図 2も同様） 。
図 2は、 p H 5における加熱処理によるァ一グル夕ミルシスティンからのシス ティンの遊離を示す図である。
図 3は、 弱化型グル夕チオン合成酵素遺伝子置換用カセッ ト （カセッ ト 2 ) を 含むプラスミ ド GSH2Mdash/pYES2dashの構築を示す図である。
図 4は、 カセッ ト 2を用いたグル夕チオン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を模式 的に示す図である。
図 5は、 N o: 3株の SD培地又は lmMのグル夕チオンを含む SD培地 （必要量のゥラ シルを含む） での生育 （0D 6 6。） を示す図である。
図 6は、 Nひ 2株及び Nひ 3株の SD培地 （必要量のゥラシルを含む） における生 育を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
< 1 >加熱処理によるァ一グル夕ミルシスティンからのシスティンの遊離
還元型ァ -グル夕ミルシスティンの lmmol濃度の水溶液 （pHは 3又は 5に調整 した） を 98°Cで加熱し、 生成物を経時的に調べた。 その結果、 図 1、 2に示すよ うに、 加熱によりァーグル夕ミルシスティンがシスティンとピロリ ドンカルボン 酸 （図 1及び図 2中、 「PCA」 と示す） に分解し、 システィンが高収率で得られ ることが判明した。
< 2 >グル夕チオン合成酵素遺伝子破壊株の構築
次に、 グル夕チオン合成酵素遺伝子破壊株の構築を行った。
( 1 ) ゥラシル要求性のサヅカロマイセス ·セレピシェの単離
自然界より単離したサッカロマイセス · セレピシェから、 常法に従って 1倍体
Nひ株を取得した。 Nひ株から、 ゥラシルを含む SDF0Aプレート （ 2 %精製寒天、 最終濃度で 50mg/Lのゥラシル及び lg/Lの 5—フルォロォロチン酸—水和物を含む SD培地） を用いて、 ゥラシル要求性株 Nひ 1株を取得した。 後述するように、 Nひ 1株のゥラシル要求性は URA3遺伝子で相補されたことから、 URA3遺伝子の変異株 であると考えられる。
( SD培地組成）
グルコース 2 %
Nitrogen Base 1倍濃度
( 10倍濃度 Ni trogen Baseは、 1.7g©Bacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino A cids and Ammonium Sulfate (Dif co社）と 5gの硫酸アンモニゥムを混合したもの を 100mlの滅菌水に溶解し、 pHを 5.2程度に調整し、 フィルター濾過滅菌したもの）
( 2 ) グル夕チオン合成酵素欠損用カセッ トの作製
Nひ 1株を親株として、 グル夕チオン合成酵素遺伝子破壊株を構築した。
まず、 Nひ 1株の染色体 D N Aを踌型として、 グル夕チオン合成酵素 （GSH2) 遺伝子の上流領域から末端領域までを PCR法により増幅した。 PCR反応は、 下記に 示す組成の反応液を用いて、 94°C 1分の後、 94°C 30秒、 60°C 40秒、 74°C 1分 3 0秒を 30サイクル繰り返すことにより行った。
(PCR反応液組成）
染色体 DNA溶液 1 1
10X PCR緩衝液 10〃 1
lOmM dNTPs 10 1
I0pmol/ 1GAL11F (配列番号 1 ) 1〃 1
10pmol/〃lGSH2R3 (配列番号 2 ) \ μ. 1
精製水 76/ 1
K0D Dash (T0Y0B0社） * \ /UL 1
合計 100〃 1
( * ： PCR用ポリメラーゼ） 上記のようにして増幅した GSH2遺伝子断片を、 製造者の指示に従ってプラスミ pGEM-T Easy (Promega社）に連結し、 GSH2/pGEMを得た。
一方、 選択遺伝子マーカーとして、 URA3遺伝子を、 同遺伝子を含むプラスミ ド PYES2 (Invitrogen社） を錶型とする PCRによって取得した。 PCR反応は、 下記に 示す組成の反応液を用いて、 94°C 1分の後、 94°C 30秒、 52°C 30秒、 74°C 40秒 を 30サイクル繰り返すことにより行った。
(PCR反応液組成）
Figure imgf000013_0001
10X PCR緩衝液 10〃 1
lOmM dNTPs 10 1
lOpmol/// 1 URA3F2 (配列番号 3 ) \μ.1
10pmol/〃 1URA3R2 (配列番号 4 ) lj 1
精製水 76 1
K0D Dash \μ. 1
合計 100〃 1 続いて、 GSH2/pGEMを制限酵素 Muniで切断し、 末端を平滑化した。 その切断末 端に、 制限酵素 Smalで末端を平滑化した URA3遺伝子断片を連結し、 プラスミ ドお A3-GSH2/pGEMを作製した。 この URA3- GSH2/pGEMを铸型として、 GSH2遺伝子の両端 に相当する配列を有するプライマーを用いて PCRを行い、 カセッ ト 1を調製した。 PCR反応は、 下記に示す組成の反応液を用いて、 94°C 1分の後、 94°C 30秒、 56 °C 30秒、 74°C 1分を 30サイクル繰り返すことにより行った。
(PCR反応液組成)
iOng/ju 1 URA3-GSH2/pGEM lju 1
10X PCR緩衝液 10 1
lOmMdNTPs 10 z 1
lOpmol/ / 1 GAL11F (配列番号 1 ) 1〃 1
10pmol/〃 1 GSH2R (配列番号 5 ) \ 1
精製水 76 1 函 Dash ί μ, 1
合計 100 / 1
( 3 ) グル夕チオン合成酵素遺伝子欠損株の取得
以上の方法で作製したカセヅ ト 1を用いて、 Νひ 1株のグル夕チオン合成酵素 遺伝子の破壊を行った。 Ν α 1株を前培養した後に、 培養物を 50mlの YPD培地に植 え継き、 対数増殖期まで培養した。 培養菌体を 1 Mソルビトールに懸濁し、 カセ ッ ト 1を混和して、 エレク トロポレーシヨンにより形質転換を行った。 形質転換 株を ImMのグルタチオンを含む SDプレートで培養し、 生育する株を選択した。 PCR、 及び後述するように菌体のグル夕チオン含量を測定することによって、 グル夕チ オン合成酵素遺伝子がカセッ ト 1で置換された株を選択し、 Nひ 2株を得た。 上記のようにして作製された Nひ 2株は、 グル夕チオン合成酵素遺伝子のコー ド領域の 1 1番目のコ ドン以降に URA3遺伝子断片由来の配列が付加されているた め、 グル夕チオン合成酵素遺伝子は 1 1番目のアミノ酸残基までしか正確に翻訳 されない。
< 3 >グル夕チオン合成酵素弱化株の構築
次に、 弱化型グル夕チオン合成酵素遺伝子置換株の作製を行った。
( 1 ) 弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換用カセッ 卜の作製
Nひ 1株のグル夕チオン合成酵素遺伝子断片を、 PCR法により増幅した。 PCR反 応は、 下記に示す組成の反応液を用いて、 98°C 10秒の後、 98°C 10秒、 60°C 30 秒、 72°C 1分を 30サイクル繰り返すことにより行った。
(PCR反応液組成)
酵母染色体
Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造) 0. 5〃 1
10X PCR 緩衝液 10〃 1
lOmM dNTPs 8j 1
20pmol/ / 1 GSH2F7 (配列番号 6 ) Zju 1
20pmol / j 1 GSH2R7 (配列番号 7 ) 2/ι 1 精製水 76.5/z 1
合計 100/ 1 上記のようにして増幅した遺伝子断片を精製し、 以下の条件で 72°Cで 10分間酵 素反応を行うことにより、 末端に Aを付加した。
(反応液組成）
遺伝子断片溶液 5 / 1
10X PCR緩衝液（MgCl2フ リー） 10/ 1
25mM MgCl2 3 1
Figure imgf000015_0001
Taq DNA polymerase (宝酒造) 0.5 1
精製水 31.5 1
A
1=1きロ+1 Oju 1 この反応産物を、 製造者の指示に従ってプラスミ ド pGEM-T Easy (Promega社） のに連結し、 プラスミ ド GSH2dash/pGEMを得た。
次に、 部位特異的変異法によって、 GSH2dash/pGEMに含まれるグル夕チオン合 成酵素遺伝子の 370番目のアミノ酸に対応するコ ドンを終止コ ドンに置換した。 この操作は、 QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社） を 用い、 製造者のプロ トコルに従って行った。 プライマーは、 GSH2M-F1 (配列番号 8 ) 、 GSH2 -R1 (配列番号 9 ) を用いた。 このようにしてブラスミ ド GSH2Mdash/ pGEMを作製した。
一方、 プラスミ ド pYES2 (Invitrogen社） から 2〃 oriを除去したプラスミ ドを 作製した。 PYES2を制限酵素 Sspl、 Nhelで切断し、 切断末端を平滑化した後、 連 結させ、 プラスミ ド pYES2dashを得た。 pYES2dash及び GSH2Mdash/pGEMを、 いずれ も制限酵素 Sacl及び Sphlで切断し、 pYES2dashからは URA3遺伝子を含む断片を、 G SH2Mdash/pGEMからは変異を有するグル夕チオン合成酵素遺伝子断片を切り出し、 これらを連結した。 このようにしてプラスミ ド GSH2Mdash/pYES2dashを作製した。 GSH2Mdash/pYES2dashを制限酵素 Muniで切断し、 カセッ ト 2を得た （図 3 ) 。 ( 2 ) 弱化型グル夕チオン合成酵素遺伝子置換株の構築
上記のようにして作製したカセヅ ト 2を用いて、 Nひ 1株のグル夕チオン合成 酵素遺伝子の遺伝子置換を行った （図 4 ) 。 Nひ 1株を前培養した後に、 培養物 を 50mlの YPD培地に植え継ぎ、 対数増殖期まで培養した。 培養菌体を 1 Mソルビト ールに懸濁し、 カセッ ト 2を混和して、 エレク ト口ポレーシヨンにより形質転換 を行った。 形質転換株を lmMのグル夕チオンを含む SDプレートで培養し、 生育す る株を選択した。 カセッ ト 2が染色体上の目的の位置に組み込まれたことを PCR によって確認し、 得られた株を Nひ 3中間体とした。
次に、 図 4に示すとおり、 弱化型グル夕チオン合成酵素遺伝子のみを染色体に 残すため、 以下の操作を行った。 Nひ 3中間体を YPD培地で培養し、 培養産物を lm Mのグル夕チオンを含む SDF0Aブレートに蒔いた。 プレート上に生育してきた株の グルタチオン合成酵素遺伝子の配列を決定し、 目的の部位の配列が正しく置換さ れていることを確認し、 Nひ 3株を得た。
< 4〉Nひ 2株及び Nひ 3株の生育及びァ —グル夕ミルシスティンの産生
上記のようにして取得した Nひ 2株及び Nひ 3株の対数増殖期における増殖能を 調べた。 Nひ 2株及び Nひ 3株を YPD培地で前培養した後、 培養物を 50mlの SD培地 ( 50mg/Lのゥラシルを含む） 又は ImMのグル夕チオンを含む SD培地 （50mg/Lのゥ ラシルを含む） 培地に植え継ぎ、 30°Cで振とう培養した。 結果を図 5及び 6に示 す。 図 5に示されるように、 Nひ 3株は、 グル夕チオンを含まない培地において もグル夕チオンを含む培地における増殖能とあまり差違がみられなかった。 また、 グル夕チオンを含まない培地における対数増殖期における生育は、 Nひ 2株より も Nひ 3株の方が良好であった （図 6 ) 。
次に、 Nひ 2株と Nひ 3株の対数増殖期における単位時間あたりのァ —グル夕ミル システィン及びグル夕チオンの生産量を調べた。 N « 2株及び Nひ 3株を YPD培地で 前培養した後、 培養物を 50mlの SD (必要量のゥラシルを含む） 培地に植え継ぎ、 30°Cで振とう培養した。
ァ ーグル夕ミルシスティン及びグル夕チオンの生産量は、 次のようにして測定 した。 培養物を遠心することにより菌体を取得し、 この菌体を蒸留水で 2回洗浄 した後、 70°Cで 10分間の熱水抽出処理に付し、 細胞内容物を得た。 これを遠心処 理し、 得られた上清中のァ一グルタミルシスティン及びグル夕チオン含量を測定 した。 また、 一定培地中に含まれる酵母菌体を濾紙上に取り、 105°Cで 4時間加 熱した後に残った菌体重量を測定し、 乾燥菌体重量とした。 表 1に、 乾燥菌体重 量当たりのァ一グル夕ミルシスティン及びグル夕チオンの含有量を示す。 表 1 測定までの ** 7 -ク、、ルタミルシスティン グルタチオン 培養時間 （％) (%)
Nひ 2株 No.l 約 2.6時間 1.752 0
Nひ 2株 No.2 約 5.3時間 1.748 0
Nひ 3株 No.l 約 1.5時間 1.101 0.0043
Nひ 3株 No.2 約 3.8時間 1.117 0.0045
これらの結果から、 各々の株の単位時間あたりのァ一グルタミルシスティン生 産量を測定した。 Nひ 2株に対する Nひ 3株の優位性を示すため、 Nひ 2株におい てはァ—グル夕ミルシスティンの含有量が高い方 （Nひ 2株 No.l) を、 Να 3株に おいてはァ一グルタミルシスティンの含有量が低い方 （Νひ 3株 No.l) を用いて計 算した。 すなわち、 Nひ 2株においては最大値、 Nひ 3株においては最小値が算出 される。 その結果、 Να2株は 0.116mg/時間であり、 Nひ 3株は 0.124mg/時間であつ た。 産業上の利用可能性 本発明のサヅカロマイセス ·セレビシェは、 ァ一グル夕ミルシスティンを一定 量以上産生し、 かつ、 グル夕チオンが存在しないような工業的に用いられる培地 における生育も良好であり、 ァ一グルタミルシスティンを含有する酵母エキスの 効率的な製造に適している。

Claims

請求の範囲
1 . サッカロマイセス * セレピシェの野生株よりもグル夕チオン合成酵素欠 損株の生育が遅い培地で培養したとき、 その対数増殖期に、 ァーグルタミルシス ティンを 1重量％以上含有することができ、 かつ、 グル夕チオンを 0 . 0 0 4重 量％〜 0 . 1重量％の範囲で含有するサヅカロマイセス 'セレピシェ。
2 . 前記サヅカロマイセス ·セレピシェの野生株よりもグル夕チオン合成酵 素欠損株の生育が遅い培地が、 グル夕チオンを含まない培地、 又は、 グル夕チォ ン、 ァ一グル夕ミルシスティン、 L—システィン及びシスチンを含まない培地で ある請求項 1記載のサヅカロマイセス 'セレピシェ。
3 . 前記培地が最小培地である請求項 2記載のサッカロマイセス 'セレビシ ェ。
4 . 染色体上のグル夕チオン合成酵素遺伝子によってコードされるグル夕チ オン合成酵素が、 3 7 0位のアルギニン残基以降の C末端側の領域を欠失してい ることを特徴とするサッカロマイセス 'セレピシェ。
5 . 請求項 1〜 4のいずれか一項に記載のサッカロマイセス ' セレピシェを 好適な培地で培養し、 得られた菌体を用いて製造された酵母エキス。
6 . サッカロマイセス · セレピシェのグル夕チオン合成酵素遺伝子を遺伝子 組換え法によって改変した組換え体を作製し、 サッカロマイセス ' セレピシェの 野生株よりもグル夕チオン合成酵素欠損株の生育が遅い培地で培養したとき、 そ の対数増殖期にグル夕チオンを 0 . 0 0 4重量％〜0 . 1重量％の範囲で含有す る組換え体を選択することを特徴とするァ一グル夕ミルシスティンを含有するサ ヅカロマイセス · セレピシェの育種方法。
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