WO2001090195A1

WO2001090195A1 - Immunoassay method for x-type phospholipase a¿2?

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Publication number: WO2001090195A1
Application number: PCT/JP2000/008198
Authority: WO
Inventors: Kohji Hanasaki; Keiichi Imagawa; Keiichi Masuta
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2000-11-21
Publication date: 2001-11-29
Anticipated expiration: 2002-11-24
Also published as: AU2001214187A1; JP4726031B2

Description

明細書

X型ホスホリパーゼ A ₂の免疫測定方法

技術分野 .

本発明は、 X型ホスホリパ—ゼ A₂ (X型 sPLA₂) の一部を特異的に認識する抗体；該抗体を用いた活性型 X型 SPLA2の測定方法；該抗体を含む診断用キットに関する。景技術

ホスホリパーゼ ₂ (PLAj; EC 3.1.1.4) は、 3- s ホスホグリセリドの 2-ァシルエステル結合を加水分解するリン脂質分解酵素の総称である。 PLA₂は、食物中のリン脂質消化や生体膜リン脂質の新生と代謝などに関わるとともに、プロスタグランジン、ロイコトリエン、血小板活性化因子（PAF) 、リゾリン脂質などの脂質メデイエ一夕一産生にいたるァラキドン酸カスケ一ドの開始酵素として機能する哺乳動物では多様な PLA₂の存在が明らかになつており、その局在性、カルシウムイオン（Ca ) 要求性、基質特異性に基づいて、分泌型 PLA 細胞質型 PLA Ca^H 非依存型 PLA₂、ならびに PAF-ァセチルヒド口ラーゼの 4つのファミリーに分類されている（Balsindeら、 J. Biol. Chem. 272, 16069-16072 (1997)) 。このうち分泌型 PLA₂(sPLA₂)7ァミリ一は、細胞外に分泌される低分子量（13, 000 〜 15,000) の PLA2分子群であり、ヒトでは、 IB型、 ΠΑ型、 IID型、 IIE型、 V型、ならびに X型の 6種類が知られている。いずれの分子種も、その構造中に 12〜16 個の Cys残基を持ち、分子内ジスルフイド結合を形成しており、また His- Asp残基からなる活性中心部位が保存されている。さらに、共通の Ca²⁺結合領域を持ち、酵素活性の発現には mMオーダ一の Ca²⁺を要求する（Tischfieldら、 J. Biol. Chem, 272, 17247-17250 (1997)、 Cupillardら、 J. Biol. Chem.272, 15745-15752 (1997)、 Ishizakiら、 J. Biol. Chem.274, 24973-24979 (1999), および Suzukiら、 J. Biol. Chem. 275, 5785-5793 (2000)) 。ヒト X型 sPLA₂は、 DNAデータベースより sPLA!関連配列に基づき、胎児肺組織よりクロ一ニングされた（Cupillard,ら、 J. Biol. Chem., 272, 15745-15752 (1997))。ヒト X型 sPLA;の遺伝子は、他の sPLA₂と異なり第 1 6番染色体上に位置する。ヒト X型 sPLA^タンパクは、 sPLA₂ファミリーの中で最も酸性（pi = 5.3) で、 -結合型糖鎖結合可能な部位を含んでいる。本 sPLA₂は、分子内に 1 6システィン残基を有し、 IB型 sPLA₂と ΠΑ ID/IIE型 sPLA_¾のそれぞれに存在する特徴的な分子内ジスルフィド架橋をすベて含んでいる。さらに、 IIA ID/IIE型 sPLA₂に特有の力ルポキシル基末端延長構造を有する。ノザン解析により、 X型 sPLA^MA (1.5 キロベース）の発現は、ヒト脾臓、胸腺で検出された。したがって、 X型 sPLA₂ の生理学的、病理学的な機能に関して詳細は不明であるが、その発現部位の局在から、本酵素が免疫系や炎症病態の調節に関与している可能性が推定される。

X型 sPLA₂の cDNAクローニングにより、 1 2 3個のアミノ酸から成る成熟 X型 SPLA2とプレブロぺプチドの存在が想定された（配列番号 1； Cupillard，ら、 J. Biol. Chem., 272, 15745-15752 (1997)) 。しかしながら、 Cupillard らもその困難性を指摘しているように、プレブロぺプチド上のシグナルぺプチダーゼによる切断部位、すなわちシグナルぺプチドおよびプロぺプチドは特定されていなかった。発明の開示

本発明の目的は、 X型 sPLA₂の一部を特異的に認識する抗体；該抗体を用いた活性型 X型 sPLA₂の測定方法；該抗体を含む診断用キットを提供することにある。本発明者らは、ヒト X型 sPLA₂の生理機能の解明を目指して鋭意研鐯を重ねてきたが、その過程で、 X型 sPLA₂には、プロペプチド配列を N-末端に有する非活性型のプロ型と、そのプロぺプチド部分が切断されて生じる活性型の 2つの分子種が存在することを証明し、その活性化過程で切断されるプロべプチド部分のアミノ酸配列を特定した。更に、そのプロペプチド量、あるいは活性型の X型 sPLA^ それ自身の量を測定することにより、活性化状態の X型 sPLAr濃度を特異的に検出する測定方法を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、

( 1 ) 配列番号 3記載のァミノ酸配列中、 ― 1 1位の Gluから 1 23位の Aspまでのアミノ酸から成るポリぺプチドの一部を特異的に認識する抗体；

(2) 配列番号 3記載のアミノ酸配列中、一 1 1位の Gluから一 1位の Argまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する上記（ 1 ) に記載の抗体；

( 3 ) 配列番号 .3記載のァミノ酸配列中、 1位の Glyから 1 2 3位の Aspまでのァミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する上記（ 1 ) に記載の抗体； (4) ポリクロ一ナル抗体であることを特徴とする、上記（1) から (3) のいずれかに記載の抗体；

(5)上記（3) に記載の抗体を含むことを特徴とする PLA₂関連疾患の治療薬；

( 6 ) 配列番号 3記載のァミノ酸配列中、一 1 1位の Gluから一 1位の Argまでのアミノ酸から成るポリペプチド；

( 7 ) 配列番号 3記載のアミノ酸配列中、 1位の Glyから 1 2 3位の Aspまでのァミノ酸から成るポリぺプチド；

( 8 ) 上記（ 6 ) または（ 7 ) に記載のポリぺプチドから成る標準抗原； (9) 上記（ 1 ) から（4) のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする上記（ 6) または（7) に記載のポリペプチドの測定方法；

( 1 0 ) 活性型 X型 sPLA₂を測定することを特徴とする上記（ 9 ) に記載の測定方法； ( 1 1 ) 上記（ 1 ) から（4) のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする上記（6 ) または（7) に記載のポリペプチドの測定キット；

( 1 2) 活性型 X型 sPLA₂を測定することを特徴とする上記（ 1 1 ) に記載の測定キット；

( 1 3 ) 上記（ 6 ) または（ 7 ) に記載のポリぺプチドを検出しえる試薬を含むことを特徴とする癌診断用キット；

( 1 4) 試薬が上記（ 1 ) から（4) のいずれかに記載の抗体であることを特徴とする上記（ 1 3 ) に記載の癌診断用キット；

( 1 5) 癌が、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌または滕臓癌である上記（ 1 3 ) または（ 1 4) に記載の癌診断用キット；

( 1 6) 上記（6 ) または（7) に記載のポリぺプチドを検出しえる試薬を含むことを特徴とするアルツハイマー病診断用キット；

( 1 7) 試薬が上記（ 1 ) から（4) のいずれかに記載の抗体であることを特徴とする上記（ 1 6 ) に記載のアルヅハイマー病診断用キヅト；

( 1 8 ) 上記（ 6 ) または（ 7 ) に記載のポリぺプチドを検出しえる試薬を含むことを特徴とする肝硬変診断用キット；

( 1 9) 試薬が上記（ 1 ) から（4) のいずれかに記載の抗体であることを特徴とする請求項 1 8に記載の肝硬変診断用キット；

(2 0) 上記（6) または（ 7) に記載のポリぺプチドを検出することを特徴とする癌、アルツハイマー病または肝硬変のスクリーニング方法；および

(2 1 ) 癌が、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌または脬臓癌である上記（2 0 ) に記載のスクリーニング方法、に関する。

X型 sPLA;には、成熟の度合いにより、プレブ口型 X型 sPLA プロ型 X型 sPLA₂ 及び活性型 X型 sPLA₂ (成熟型 X型 sPLA₂とも呼ぶ）の 3種類が存在する。

mRNAから翻訳された直後は、 X型 sPLA;はシグナルペプチドを有するプレプロ型として産生される。プレブ口型 X型 sPLA₂ とは、配列番号 3に記載のアミノ酸配列中、一 3 2位の Metから 1 2 3位の Aspまでのァミノ酸からなるポリぺプチドを意味する。そのうち、シグナルペプチドは、配列番号 3に記載のアミノ酸配列中、一 3 2位の Metから一 1 2位の Glyまでのァミノ酸からなるポリペプチドである。

プロ型 X型 _SPLA₂は、プレブ口型よりシグナルペプチドが切断されることによつて生じる。プロ型 X型 sPLAi とは、配列番号 3に記載のアミノ酸配列中、 ― 1 1位の Gluから 1 2 3位の Aspまでのアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。更に、プロ型 X型 sPLA!は、配列番号 3に記載のアミノ酸配列中、 — 1位の Arg と 1位の Glyの間で開裂され、プロペプチド（配列番号 3に記載のアミノ酸配列中、一 1 1位の Gluから一 1位の Argまでの 1 1ァミノ酸からなるポリぺプチド）と、活性型 X型 sPLA₂ (配列番号 3に記載のアミノ酸配列中、 1位の Glyから 1 2 3位の Aspまでのアミノ酸からなるポリペプチド）に分断される。生体内では、この活性型 X型 sPLA₂がホスホリパーゼとしての機能を有するものと考えられる。

なお、本発明においては、シグナルペプチドおよびプロペプチドからなる断片をプレプロペプチドと称する'場合もある。プレプロペプチドとは、配列番号 3に記載のァミノ酸配列中、一 3 2位の Metから一 1位の Argまでのァミノ酸からなるポリペプチドを意味する（図 1 ) 。

本発明において、「配列番号 3に記載のアミノ酸配列中、ー 1 1位の&1ひから 1 2 3位の Aspまでのアミノ酸配列から成るポリべプチドの一部」とは、プロ型 X型 sPLA^の一部を意味する。好ましくは、プロペプチド又は活性型 X型 sPLAiを意味する。また、「上記（ 6 ) または（ 7 ) に記載のポリペプチド j とは、プロぺプチド又は活性型 X型 sPLA₂を意味する。本発明は、活性型 X型 sPLA₂ を免疫学的手段により測定することを目的とするものである。

活性化の過程で、プロ型 X型 sPLA^から、活性型 X型 sPLA;とともにプロぺプチドが対として産生される。本発明者らは、活性型 X型 sPLAi または活性化の過程で活性型 X型 sPLA₂ と等モル量産生されるプロぺプチドを特異的に測定することで、活性型 X型 sPLA₂の測定方法を完成させた。

本発明において、「配列番号 3記載のアミノ酸配列中、 — 1 1位の Gluから— 1位の Argまでのアミノ酸から成るポリぺプチドを特異的に認識する抗体」とは、プロぺプチドを特異的に認識する抗体を意味する。「プロべプチドを特異的に認識する」とは、プロペプチドとは反応するものの、活性型 X型 sPLA!やプロぺプチド断片を有するプロ型 X型 sPLA; とは反応しないことを意味する。また、「配列番号 3記載のアミノ酸配列中、 1位の Gl yから 1 2 3位の Aspまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体」とは、活性型 X型 sPLA₂ を特異的に認識する抗体を意味する。 '「活性型 X型 sPLA₂ を特異的に認識する」とは、活性型 X型 sPLAsとは反応するものの、プロぺプチドゃプロ型 X型 sPLA₂とは反応しないことを意味する。「反応しない」とは、 ELI SA 法において、「抗原と抗体が結合しない」ことを意味する。また、これら抗体を調製するために用いたプロペプチドまたは活性型 X型 sPLA₂は、標準曲線を作製するための「標準抗原」として用いることができる。本発明の抗体を用いることにより、活性型 X型 sPLA₂のみを測定することが可能となる。

分祕型は、細胞膜やリポタンパク質などに存在するリン脂質からの脂肪酸 (例えば、ァラキドン酸）の放出に関与している。過剰な脂肪酸の放出ならびにその代謝による種々の脂質メデイエ一夕一の産生は、敗血症ショック、成人呼吸困難症候群、脬炎、外傷、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、慢性関節リウマチ等の疾病の原因となる。本発明の「PLA²関連疾患」とは、これら疾患を意味する。本発明の活性型 X型 sPLA₂に対する抗体は、これら疾患の治療に有用である。また、本発明の測定方法を用いることにより、活性型 X型 sPLA^ に起因するこれら疾患の診断が可能になるものと考えられる。従って、本発明は、「活性型 X型 sPLA₂ の測定方法」を提供する。さらに、本発明者らは、免疫組織化学的解析により、大腸癌患者の大腸癌組織、肺癌患者の肺癌組織、肝臓癌患者の肝臓組織、胃癌患者の胃組織、腎臓癌患者の臂臓組織、胆嚢癌患者の胆嚢組織、前立腺癌患者の前立腺組織、脬臓癌患者の滕臓組織、アルツハイマー病患者の大脳組織及び肝硬変患者の肝臓組織において、正常人のそれら組織に比べて X型 sPLAzが顕著に高発現していることを確認した。従って、 sPLA₂の基質であるリン脂質または本発明の抗体を「試薬」として用いて、 X型 sPLA₂ の活性又は発現を確認することにより、癌、アルツハイマー病または肝硬変の診断が可能となる。本発明は、「癌診断用キット」、「アルツハイマー病診断用キット」または「肝硬変診断用キット」を提供するものである。各診断用キットは、少なくとも本発明のポリペプチドを検出しうる試薬を含む。試薬としては、 SPLA2 の基質であるリン脂質または本発明の抗体などが例示される。検出方法としては、沈降反応法、 E L I S A法、 R I A法、ウェスタンブロヅティング法等が挙げられる。例えば、適当に希釈された患者血清と抗体とを反応させ、洗浄後、 2次抗体であるペルォキシダ一ゼで標識した抗ゥサギ I g G抗体などを加えて反応させ、その後、ペルォキシダーゼ基質を加えて発色させ、 4 5 0 n m の吸光度を測定することにより、本発明のポリぺプチドが検出され得る。

検出試薬が抗体である場合には、本発明のキットには、本発明の抗体の他に、必要により発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬等の各種試薬から測定方法に応じた適切な試薬が適宜選択され得、本発明のキットに添付しえる。

また、本発明の診断用キットを用いることにより、癌、特に大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、瞀臓癌、胆嚢癌、前立腺癌もしくは滕臓癌、アルヅハイマー病または肝硬変の早期発見を目的とした集団検診などが可能となる。具体的には、被験者の生体試料、例えば、血液を試料として、本発明の診断用キットなどを用いることにより、活性型 X型 sPLA₂が閧与する癌、アルツハイマー病または肝硬変の発症前診断のための「スクリーニング方法」をも本発明は提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、プレブ口型 X型 sPLA プ D型 X型 sPLA^及び活性型 X型 sPLA₂の関係を示す図である。

図 2は、マウス活性型 X型 sPLA₂、マウスプロ型 X型 sPLA₂およびトリプシン消化したプロ型 X型 sPLA^の酵素活性を示す図である。図中、 M、 Pおよび P + Tは、それそれ活性型、プロ型およびトリプシンにて消化されたプロ型 X型 sPLA₂ を意味する。

図 3は、本発明の抗 X型 sPLA^ プロぺプチド抗体を用いた E L I S A法における標準曲線を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明は、おもにプロペプチドを用いた活性型 X型 sPLA₂の測定に関する。

以下にプロペプチドの調製工程、抗体の調製工程、抗体を用いた免疫測定方法を説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、発現したタンパク質の分離精製法、分析法および免疫学的手法が採用される。 X型 sPLA,をコードする DNAの調製

X型 sPLA₂をコードする DNAは本発明により教示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造 · 取得することができる（Mol ecular C l oning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press ( 1989)等参照）。具体的には X 型 sPLA₂が発現される適当な起源より、常法に従って cDNAライブラリ一を調製し、該ライブラリ一から X型 sPLA₂の塩基配列に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望のクローンを選択することにより実施できる（Pro atl . Acad. Sci .， USA. , 78, 6613 ( 1981 ) ; Science, 22, 778 ( 1983)等参照）。 cMAの起源としては、 X型 sPLA₂を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等が例示される。これらからの全 MAの分離、 mRNAの分離 '精製、 cMAの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施できる。また、 cDNAライブラリ一は市販されており、本発明においてはそれら cDNAライブラリー、例えば Clontech社より市販の各種 cMAライブラリ一等を用いることもできる。

X型 sPLA^の DNAを cMAライブラリ一からスクリ一二ングする方法も、特に限定されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えば cDNAによって産生されるタンパク質に対して、該タンパク質特異的抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応する cDNAクローンを選択する方法、目的の MA配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイプリダイゼーション、コロニーハイプリダィゼーション等ゃこれらの組み合わせ等を例示できる。ここで用いられるプロ一ブとしては、 X型 sPLA^の塩基配列に関する情報をもとに化学合成された MA等が一般的に例示できるが、勿論既に取得された本発明 DNAそのものや断片も良好に利用できる。また、本発明 MAの塩基配列情報に基づき設定したセンス ·プライマー、アンチセンス · プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。また、 X型 sPLA₂をコードする DNAは、慣用の化学的方法、例えばリン酸三ェステル法（Narang et al., Met . Enzymol., 68, 90-108 (1979)) またはリン酸ニエステル法（Brown et al., Meth. Enzymol., 68, 109-151 (1979)) により合成され得る。

X型 3?1^^タンパク質の調製

( 1 ) 組換え型 X型 sPLA^タンパク質の発現

X型 sPLA^タンパク質は、 X型 sPLA₂の塩基配列情報に従って、遺伝子工学的手法（Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm. , 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)等）により、組換えタンパク質として得ることができる。より詳細には、所望のタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込む。このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作成する。該形質転換体を培養することにより組換えタンパク質を得ることができる。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞である COS細胞（Cell, 23, 175 (1981 ))やチヤィニーズ ·ハムスター卵巣細胞等がよく利用される。

発現ベクターとしては、通常発現しょうとする遺伝子の上流に位置するプロモ —ター、 MAのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していても良い。該発現ベクターの例としては、例えば、 SV40 の初期プロモーターを保有する _PSV2dhfr(Mol. Cell. Biol., 1， 854 (1981))等を例示できる。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を利用できる。該酵母の発現ベクターとしては、例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを有する pAM82(Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 1 (1983))等を利用できる。原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく利用される。これらを宿主とする場合、例えば該宿.主菌中で複製が可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に所望の遗伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモータ一及び SD配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドンを付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としては、 E . co l i K12 株等が利用される。ベクターとしては一般に PBR322及びその改良べクタ一がよく利用されるが、これらに限定されず公知の各種の菌株及びべクタ一も利用できる。プロモーターとしては、例えば trpプロモーター、 l ppプロモーター、 l acプロモータ一、 PL/PRプ口モーター等を使用できる。

所望の組換え MAの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のタンパク質が産生される。該培養に用いられる培地としては、宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞に適した条件下で実施できる。例えば、 pSVL SV40 後期プロモータ一の下流に本発明のヒト X型 sPLAi遺伝子を含むベクターを、サル由来細胞 COS - 7に導入することによって形質転換体を作成し、この形質転換体を 5% C02存在下、 37°Cで 3 日間培養することにより、組換えヒト X型 sPLA₂夕ンパク質が産生され得る。

蛋白質は、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作 (Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)等）により分離 '精製できる。該方法としては、塩析法、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破碎、限外濾過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組み合わせ等を例示できる。精製された X型 sPLA₂は、プロ型 X型 sPLAiを含むため、適切なプロテアーゼ（例えば、スブチリシン様ェンドプロテア一ゼ、トリプシンなど）により切断することで、活性型 X型 sPLA^を得ることが出来る。

また、 X型 sPLA^蛋白質、あるいは X型 sPLA₂蛋白質の断片（例えばプロぺプチド）は、本発明により教示されたアミノ酸配列情報に基づいて、ペプチド合成機により合成することもできる。本発明夕ンパク質に対する抗体の調製

本発明のタンパク質に対する抗体は、以下の方法により作製される。

( 1 ) ポリクローナル抗体の作製

X型 sPLA₂のアミノ酸配列に基づいて、通常のぺプチド合成機で合成した合成ペプチドや、 X型 sPLA₂を発現するベクターで形質転換した細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などにより産生されたタンパク質を通常のタンパク化学的方法で精製し、これらを免疫原とする。この免疫原を用いて、 Antibodi es ; A Laboratory Manual , Lane , H. D .ら編、 Col d Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989 年などに記載の方法に従って、適切な方法で動物を免疫することにより、抗原となるタンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体を容易に作製し、精製することができる。マウス、ラヅト、ハムスター、ゥサギなどの動物を免疫し、その血清由来のポリクロ一ナル抗体を作製すればよい。

( 2 ) モノクローナル抗体 '

前述の免疫原で免疫したマウスゃラットの脾臓またはリンパ節からリンパ球を取りだし、ミエロ一マ細胞と融合させて Kohl er と Mi l ste inの方法（Nature , 256 , 495-497( 1975 ) )

に従ってハイプリドーマを作製した後、該ハイプリドーマから単クローン抗体を産生させ得る。例えば以下の工程によりプロぺプチド又は活性型 X型 sPLA₂に対するモノクローナル抗体を得ることができる：

( a ) タンパク質によるマウスの免疫、

( b ) 免疫マウスからの脾臓の除去および脾臓細胞の分離、

( c ) 分離された脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合促進剤（例えばポリエチレングリコール）の存在下での上記の Kohler らに記載の方法による融合、

( d ) 未融合ミエローマ細胞が成長しない選択培地で得られたハイプリドーマ細胞の培養、

( e ) 酵素結合免疫吸着検定（ELISA)、ゥヱスタンプロットなどの方法による所望の抗体を生産するハイプリドーマ細胞の選択および限定希釈法等によるクローニング、

( f ) モノクローナル抗体を生産するハイブリド一マ細胞を培養し、モノクローナル抗体を収穫する。活性型 X型 sPLA;の測定方法

本発明においては、プロぺプチド又は活性型 X型 sPLA₂に対する抗体を用いて、活性型 X型 sPLA₂ タンパク質の測定を行なうことができる。本発明の測定法は、被測定液中の抗原量（プロペプチド又は活性型 X型 sPLA₂) に対応した抗体、抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作成した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、ィムノメトリック法およびサンドイッチ法を用いることができる。

抗原または抗体の固相化に当たっては、また通常、タンパク質あるいは酵素等の固相化するのに用いられる化学的結合を用いることができる。担体としては、ァガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質が用いられる。放射性同位元素としては、 ^{1 2 5} I、 ³H、 ^HG などが用いられる。酵素としては、ペルォキシダーゼ、 5—ガラクトシダ一ゼ、 /3—ダルコシダ一ゼ、アルカリフォスファターゼなどが用いられる。実施例

本発明を以下の実施例によりさらに説明する。

実施例 1 ヒト X型 sPLA₂発現ベクターの調製

ヒト X型 sPLA₂をコードする cMAは、ヒト胎盤 cMAを錶型として、 PCR法により得た。 PCRには、以下のプライマーを用いた。

hGX-S : 5' -ctgtgtacgcgtccatgctgctcctgctactgccgtc-3' (配列番号 5 )

GX-AS : 5' -tcaagtgcggccgctcagtcacacttgggcgcgtcc-3' (配歹 ϋ番号 6 ) h GGX_Sは、コザヅク配列および Mlul認識部位を有する。また、 hGX- ASは、 Notl 認識部位を有する。

PCR は、 9 4度で 3 0秒、 5 0度で 5 ◦秒、 7 2度で 2分の条件で 3 5サイクル行った。 PCR増幅断片は、 Mlul及び Notlで切断し、 p BS-SK ( - )に揷入した。配列を確認後、カルボキシル基末端に 6個の His 残基を付加した X型 sPLA「 Hi sTa 体は、 hGX- S プライマ一及び hGX- H6AS プライマー（ 5， - tcaagtgcggccgctcaatggtgatggtgatgatggtcacacttgggcgagtccggct-3' ：配列番号 7 ) を用い、 PCRにより構築した。 PCR増幅断片は、 Notl及び Xholで切断し、 X 型 sPLA₂プラスミドの対応する部位で置換した。 PCRで增幅した領域の配列を確認した後、その cDNAを哺乳類細胞用発現ベクターの SR- αプロモーター下流に揷入した。実施例 2 ヒト X型 sPLA₈- HisTag組換え蛋白質の発現、精製及び性状解析

X型 sPLA₂-Hi sTag cDNA を含んだプラスミド 20 〃 g とともに、 0.5 g の hygromycin B抵抗遺伝子を SV- 40で形質転換したヒト胎児腎臓由来 293細胞（293T 細胞）に LipofectAMINE試薬（Li fe Technologies, Inc . ) によりトランスフエクトした。 X型 sPLA₂- Hi sTagを安定的に発現する 293Tクローンを hygromycin Bに対する抵抗性を基に選択することにより得た。組換え蛋白質の発現は、発色性 PLAi 活性測定法により検出した。本 293Tクローンを 1 0 %仔ゥシ胎児血清含有培地で培養し、 X型 sPLA^-HisTag発現夕ンパクを含んだ培養上清を調製した。本培養上清を、 10 nimol /Lイミダゾール、 0. 5mol/L塩化ナトリウムを含む 20 mmol/L リン酸ナトリゥム緩衝液（pH 7.4) で平衡化した Ni ^{2 +}-charged chelating Sepharose fast f l ow カラム（Amersham Pharmacia B i otech) に添加した。その後、本カラムに結合した； X型 sPLA₂- HisTagタンパクを、 500 mmol/Lイミダゾール、 0. 5 mol /L 塩化ナトリゥムを含む 20 mmol/L リン酸ナトリゥム緩衝液（pH 7.4) により溶出した。得られた X型 sPLA₂-Hi sTag夕ンパクを含む画分を、 1 mmol/Lフヅ化フエニルメチルスルホン酸を含む 20 腿 ol/L Tri s-HC l 緩衝液にて透析し、 HiTrap Q カラム (Amersham Pharmacia Biotech)に添加した。結合した夕ンパクを、 0から 0. 5 mol/L までの塩化ナトリゥムの濃度勾配で溶出し、 X型 sPLA₂ -HisTag夕ンパクを含む画分を、次に逆相 HPLGカラム（Cosmosi l、 5C18 300AR、 4.6 x 150mm, ナカライテスク社）に添加した。 0.05%トリフルォロ酢酸中で、 20から 95%までのァセトニトリルの濃度勾配で溶出し、得られた画分について発色性 PLA₂活性測定を行った結果、 X型 sPLA₂- Hi sTagは 43%のァセトニトリルで溶出されていた。溶出された各画分について、 15- 25%のアクリルアミド濃度句配ゲル（第一化学）を用いて、 SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS- PAGE) により解析した。別の実験として、精製した X型 sPLA「Hi sTagタンパクを、 0.2ユニットの -グリコシダーゼ F (E- 5003 ; Oxford iycoSystem) 、 5% 2-メルカプトエタノール、 3% ノニデヅト P- 40を含む 0.5% SDS中にて 3 7 ° 1 8時間処理した後、 SDS-PAGEを行い、既報に従って Immobi l in- P膜（Mi l l ipore Co. , ) へ電気的にブロヅ卜した（Hanasaki , K. et al . , J. Biol . Chem. , 270 , 7543-7550 ( 1995 ) ) 。プロットされたタンパクをク一マシ一ブリリアントブルーで染色した後、 X型 sPLA₂- HisTagタンパクに相当するバンドを切り取り、その N末端のァミノ酸配列を、 Appl ied Bi osystems Proci se Sequencerにより解析した。以上より得られた C末端に Hi s残基を付加した X型 sPLA₂の精製夕ンパク標品は、 PLA₂活性を有していた。 SDS-PAGE解析の結果、ほとんどが 16- kDaの分子量を持つ分子種であつたが、一部が 14- kDaの分子量を示した。 -グリコシダ一ゼ F (糖タンパク質から ^結合型糖鎖を遊離させる酵素）で処理した結果、 16- kDa の分子種が消失し、すべて 14-kDaの単一の分子種に集約した。この 14- kDaタンパク質の N末端ァミノ酸配列の解析を行なった結果、ヒト X型 sPLA₂の成熟型の配列（配列番号 3記載のアミノ酸配列中、 1位の Glyから 8位の Thrまでのアミノ酸配列）と一致した。 X型 sPLA₂の配列中には、 7 1位に N-結合型糖鎖付加可能な部位が存在する。従って、これらの知見は、 293T細胞において、 C末端に Hi s 残基を付加した X型 sPLAs のほとんどは、 N -結合型糖鎖が付加された成熟型の糖夕ンパク質として発現していることを示している。実施例 3 抗 X型 sPLA₂抗体の調製ならびにその性状解析

精製したヒト X型 sPLA₂- Hi sTag夕ンハ'クでゥサギを免疫した後、抗血清を調製し、その IgG画分を HiTrapプロテイン G-カラム（Amersham Pharmacia Biotech) を用いて精製した。抗血清及び精製した抗体の特異性と力価は、以下の ELISA法により測定した。精製したヒト IB型、 I IA型ならびに X型 sPLA₂- HisTagタンパク (各 100 ng) をコートした 9 6ゥエルプレート（Nunc、 Imurnno MaxiSorpプレート）を調製し、ブロック · エース溶液（大日本製薬）で非特異的吸着をブロック後、抗ヒト X型 sPLA₂- Hi sTag抗体、抗ヒト IB型 sPLA;抗体（生化学）及び抗ヒト I IA型 sPLA₂血清（Cayman Chemical Co . )を加えて 2時間反応させた。 0.05% Tween20 を含む PBS (Phosphate-buffered sal ine, pH 7.4) で洗浄後、さらにぺロキシダ ―ゼ結合型ヒヅジ抗ゥサギ IgG抗体（ Immunotech)と反応させ、最終的に 0. 5 mg/mL の 0-フヱニレンジァミンと 0. 01% (v/v) のを含む 50 mmol /Lクェン酸ナトリゥム緩衝液（pH 5.3) を添加して発色させた。発色反応を 2 mol/L硫酸を添加して終了させ、発色強度を 492 nmの波長で測定した。別の試験では、プレートを X 型 sPLA厂 HisTag あるいは Axl-Hi sTag蛋白質でコートし、前述の方法で解析した。

PLA₂活性に対する抗 X型 sPLA₂抗体の阻害作用は、発光性ァヅセィにより行つた。すなわち、精製した各 sPLA₂蛋白質（50 n_g)、あるいは I ID型、 V型 sPLA₂を発現する CH0細胞の培養上清を抗 X型 sP ₂ t¾体とともに 2時間反応させ、その後 PLA₂活性を前述のとおり測定した。抗 X型 sPLA₂抗体の阻害作用は、それそれの sPLA₂反応が 3 7 °Cでほぼ最大に到達する条件下で試験した。このようにして得た抗 X型 sPLA₂抗体は、 HisTag付加したヒト X型 sPLAiは認識するものの、 IB型や I IA型 sPLA₂とは反応しなかった。また、調製した抗体は、 X型 sPLA^とは関係のない Hi sTag付加夕ンパク質とは反応しなかった。このことから、 Hi sTag付加部分は、抗 X型 sPLA₂抗体のェピト一プではないことが明らかとなった。さらに、抗 X型 sPLA₂抗体による前処理によって、 HisTag付加したヒト X型 sPLA!の酵素活性が濃度依存的に抑制され、 100 〃 g/niLの濃度では、他の 5種類の sPLAi活性には影響は認められず、 X型 sPLA₂の酵素活性のみが約 90%阻害された。以上の結果から、調製した抗 X型 sPLA^抗体は、ヒト X型 sPLA₂のタンパク部分に対し特異的であることが証明された。実施例 4 組換え X型 sPLA_g蛋白質の発現、精製および性状解析

X型 sPLA₂発現プラスミドを用いて、本酵素を安定発現させた CH0細胞を前述のとおり作製した。この CH0細胞を、 10% 仔ゥシ胎児血清含有ダルベッコ修飾ィーグル培地で培養し、細胞がコンフェントになった段階で、血清を含まない PM - 1000培地（栄研、日本）に変え、細胞をさらに 3 日間培養した。得られた培養上清を、抗 X型 sPLA₂抗体を結合させたァフィ二ティーカラムに添加した。本カラムは、抗 X型 sPLA₂ I gG ( 30 mg) を、常法に従って HiTrap N-ヒドロキシサクシンイミド活性化カラム（5 mL ; Amersham Pharmaci a B i otech) に結合させて調製した。カラムをリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4) で洗浄した後、結合した蛋白質を 0. 1 mol /Lグリシン- HC 1 ( pH 1. 7) で溶出した。この溶出画分を、前述の逆相 HPLCカラムに添加し、 0. 1%トリフルォロ酢酸中、 20から 40%までのァセトニトリルの濃度勾配で分離した。 3つの大きな画分を得たので、回収し、乾燥させ、 0. 3 mol /L塩化ナトリウムを含む 50 mmol/L Tri s-HC l ( pH 7. 4) に溶解した。以上の方法により、ヒト X型 sPLA₂の組換え夕ンパク質を精製した。抗体カラムにて得られた酸溶出画分の SDS- PAGE解析の結果、 15~ 18_kDaにわたる幅広い分子量を示す分子種と、' 14-kDa及び 13-kDa に単一のバンドを示す 2種の分子種の存在が認められた。 N-グリコシダーゼ F処置により、 2つの分子種（14- kDaと 13-kDa) に集約し、それらの N 末端アミノ酸配列解析の結果、過半数を占める 13 - kDaの蛋白質（GI LELAGT：配列番号 8 ) はヒト X型 sPLA_¾の推定成熟体（配列番号 3に記載のアミノ酸配列中、 1位の Glyから 1 2 3位の Aspからなるポリぺプチド）であり、一方、少数の 14-kDaの蛋白質は、成熟 X型 sPLA₂の N末端に 11 残基からなるペプチド（EASRILRVHRR：配列番号 9 ) が付加したプロ型（配列番号 3に記載のアミノ酸配列中、 ― 1 1位の Gluから 1 2 3位の Aspからなるポリぺプチド）であることが判明した。したがって、 15〜18- kDaにわたつて幅広い分子量を示す分子種は、これらプロ型と成熟型 X型 sPLA₂に N-結合型糖鎖が付加された X型 sPLA₂と考えられた。

逆相 HPLC によりさらに分離された 3つの画分についても N-グリコシダーゼ F 処理後に SDS-PAGEで解析した結果、画分 1は糖鎖非結合型の 13- kDa成熟型の X 型 sPLA₂と N-結合型糖鎖が付加されたプロ型と成熟型 X型 sPLA^の混合物であり、画分 2は N-結合型糖鎖付加された成熟型の X型 sPLA^蛋白質であり、画分 3は糖鎖非結合型の 13-kDaの成熟型蛋白質であることが明らかとなった。実施例 5 ヒト X型 sPLA₂の基質特異性の解析

精製したヒト X型 sPLA₂各精製標品の基質特異性について、 1位にパルミチン酸を有し、 2位に種々の異なる脂肪酸を持つ極性基の異なる 12種類のリン脂質を市販購入し、それらを基質として試験した。各 sPLA₂タンパク質（IB型、 I IA型 sPLA₂及びヒト X型 sPLA₂の HPLC 3画分）の酵素活性について、 1 mmo l /L の各リン脂質と 3 mmol /L のデォキシコール酸から成る混合ミセル条件下で測定した。その結果、 HPLC画分 1 (プロ型と成熟型 X型 sPLA₂の混合物）は、成熟型のみから成る画分 2又は画分 3に比べて 30〜40%の PLA₂活性しか示さなかった。この減少は、画分 1に含まれる 14-kDaのプロ型酵素の存在に起因するものと考えられ、プロ型 X型 sPLA₂が成熟型に比べて酵素活性が弱いことを示唆している。一方、糖鎖非結合型の成熟型から成る画分 3の活性は、 N-結合型糖鎖を持つ成熟型酵素である画分 2の活性とほぼ同じ活性を示したことから、 X型 sPLA₂ に結合する N-結合型糖鎖は PLA₂活性の発現には本質的に影響していないと考えられた。用いた 12種類のリン脂質基質の中で、 X型 sPLA^の成熟型（画分 2及び 3 ) は、 sn-2 位にァラキドン酸を保持するホスファチジルコリンに対して最も高い活性を示した。これに対して、 IB型ならびに I IA型 sPLA₂は、 2位にォレイン酸を保持するホスファチジルグリセロールに対して最も高い活性を示した。本発明者らは、組換えヒト X型 sPLA₂ タンパク質の精製の過程で、成熟型 X型 sPLA₂蛋白質の N末端に 11個のアミノ酸からなるプロぺプチドが付加されたプロ型 X型 sPLA₂の存在を明らかにし、さらに基質特異性解析により、プロ型酵素が成熟型に比べて酵素活性が非常に低い可能性を示した。さらに、シグナル配列の切断部位を予測するための SignalPコンピュータ一解析（Nielsenら、Protein Eng.， 12, 3-9 (1999)) を用いて、シグナルぺプチダ一ゼにより最も切断されやすい部位が成熟蛋白質の N末端より前の一 1 1 と一 1 2番目の間であることを示すことにより、 1 1アミノ酸残基がプロペプチドであることを証明した。したがって、 X型 sPLA^ の最大酵素活性の発現には、サブチリジン様あるいはトリプシン様のプロテア一ゼによるプロ型からのプロぺプチドの切断が必須であることが示されるとともに、本プロペプチドの産生量を測定することにより、対として生じる活性型 X型 sPLA₂の産生量を予測することが可能となった。実施例 6 抗 X型 sPLA₂抗体を用いたヒト大腸癌組織の免疫組織化学的解析

健常成人大腸組織ならびに大腸癌患者由来大腸癌組織の標本は、 Biochain ln (Sa Leandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、 0.3%H₂0₂を含むメ夕ノールに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシ夕ーゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルブミンを含む PBS中で、抗 X型 sPLA₂抗体（6 β g/mL) と 14時間、 4°Cで反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダーゼ含有アビジン— ピオチン複合体試薬（ Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 JUL g/mLのジァミノベンジジンと 0.006% H₂0_¾を含む 50 nmol/L Tris- HC1 (pH 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し組織標本中の X型 sPLA₂ を可視化した。また、 0.4% へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA₂ 陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLA_¾シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA₂ 蛋白質（60 pi g/mL) と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLA₂の陽性シグナルは、正常大腸組織にはほとんど検出されず、大腸腺癌組織中の癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、 X型 sPLA₂ 蛋白質の添加で消失したことから X型 sPLA₂ に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、大腸癌では X型 sPLA₂蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。

実施例 7 抗 X型 sPLA^抗体を用いたヒト肺組織の免疫組織化学的解析

健常成人肺組織ならびに肺癌患者由来肺組織の標本は、 Biochain Inc. (San Leandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフインヮックスを取り除き、 0.3%H₂0₂を含むメタノールに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシターゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルブミンを含む PBS中で、抗 X型 sPLA₂抗体（6 JUL g/mL) と 14時間、 4°Cで反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダーゼ含有アビジン一ピオチン複合体試薬（Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 μ g/mL のジァミノべンジジンと 0.006% H₂0₂ を含む 50 mmol/L Tris-HCl ( H 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し組織標本中の X型 _SPL を可視化した。また、 o.4% へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 SPLA2陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLA₂ シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA,蛋白質（ 0 j g/mL) と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLA₂の陽性シグナルは、正常肺組織では I I型肺胞上皮細胞において低レベルながら検出されたが、肺癌患者由来肺組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、 X型 sPLA₂蛋白質の添加で消失したことから X型 sPL に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、肺癌では X型 sPLAi蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。実施例 8 抗 X型 sPIJ^抗体を用いたヒト肝臓組織の免疫組織化学的解析

健常成人肝臓組織ならびに肝臓癌患者由来肺組織の標本は、 B i ochain Inc. ( San Leandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、 0.3% 02を含むメタノールに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシターゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0. 牛血清アルブミンを含む PBS中で、杭 X型 sPLA_¾抗体（6 JUL g/mL) と 14時間、 4°Cで反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダーゼ含有アビジン—ピオチン複合体試薬（Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 ju g/mL のジァミノべンジジンと 0.006% H₂0₂ を含む 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し組織標本中の X型 sPLA₂を可視化した。また、 0.4% へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA₂陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLA₂ シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA!蛋白質（60 i g/mL) と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLA^ の陽性シグナルは、正常肝臓組織では肝小葉および Kupffer 星細胞において低レベルながら検出されたが、肝臓癌患者由来肝臓組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、 X型 sPLA₂蛋白質の添加で消失したことから X型 sPLA₂ に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、肝臓癌では X型 sPLA₂蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。実施例 9 抗 X型 sPLA 抗体を用いたヒト胃組織の免疫組織化学的解析

健常成人胃組織ならびに胃癌患者由来肺組織の標本は、 Biochain Inc. (San Leandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、 0.3%H₂0₂を含むメタノ一ルに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシターゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルプミンを含む PBS中で、抗 X型 sPLA₂抗体（6 JUL g/mL) と 14時間、 4°Cで反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダ一ゼ含有アビジン一ピオチン複合体試薬（Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 JUL g/m のジァミノべンジジンと 0.006% H₂0₂を含む 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し組織標本中の X型 sPLA!を可視化した。また、 0.4% へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA₂ 陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLA₂ シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA₂蛋白質（60 g/mL) と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLA₂の陽性シグナルは、正常胃組織ではほとんど検出されず、胃癌患者由来胃組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、 X型 sPLA₂蛋白質の添加で消失したことから X型 sPLA₂ に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、胃癌では X型 sPLA₂蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。実施例 1 0 抗 X型 sPLA₂抗体を用いたヒト腎臓組織の免疫組織化学的解析

健常成人腎臓組織ならびに腎臓癌患者由来肺組織の標本は、 Biochain lnc. (San Leandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンヮヅクスを取り除き、 0.3% 0₂を含むメタノールに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシ夕ーゼを除去した後、 5 の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルブミンを含む PBS中で、抗 X型 sPLA₂抗体（6 g/mL) と 14時間、 4°Cで反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダーゼ含有アビジン—ピオチン複合体試薬（Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 j g/mL のジァミノべンジジンと 0.006% を含む 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し組織標本中の X型 sPLA₂を可視化した。また、 0.4% へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA^陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLA₂ シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA!蛋白質（60 g/mL) と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLAs の陽性シグナルは、正常腎臓組織では糸球体メサンギゥム細胞において低レベルながら検出されたが、腎臓癌患者由来腎臓組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、 X型 sPLA₂蛋白質の添加で消失したことから X型 sPLA₂ に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、腎臓癌では X型 sPLA^蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。実施例 1 1 抗 X型 sPLA₂抗体を用いたヒト胆囊組織の免疫組織化学的解析

健常成人胆嚢組織ならびに胆嚢癌患者由来肺組織の標本は、 Biochain Inc. (San Leandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、 0.3%H₂O₂を含むメタノールに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシターゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルプミンを含む PBS中で、抗 X型 sPLA₂抗体（6 ju g/mL) と 14時間、 4°Cで反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダ一ゼ含有アビジン—ピオチン複合体試薬（Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 g/mL のジァミノべンジジンと 0.006% E_l0₁ を含む 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し組織標本中の X型 sPLA^を可視化した。また、 0.4% へマトキシリン氷溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA₂陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLA_¾ シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA_¾蛋白質（60 u g/mL) と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLA₂ の陽性シグナルは、正常胆嚢組織ではほとんど検出されず、胆嚢癌患者由来胆嚢組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、 X型 sPLA₂蛋白質の添加で消失したことから X型 sPLA₂に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、胆嚢癌では X型 sPLA₂蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。実施例 1 2 抗 X型 sPLA;抗体を用いたヒト前立腺組織の免疫組織化学的解析

健常成人前立腺組織ならびに前立腺癌患者由来前立腺組織の標本は、 Biochain Inc. (SanLeandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンヮックスを取り除き、 OJXHsOiを含むメタノールに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシ夕ーゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルブミンを含む PBS中で、抗 X型 sPLAs抗体（6 ju g/mL) と時間、 4°C で反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダーゼ含有アビジン一ピオチン複合体試薬（Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 μ. g/mLのジアミノベンジジンと 0.006% を含む 50 mmol/L Tris- HC1 (pH 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し組織標本中の X型 sPLAi を可視化した。また、 0.4% へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA; 陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLA₂シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA₂ 蛋白質（60 JLL g/mD と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLA^の陽性シグナルは、正常前立腺組織ではほとんど検出されず、前立腺癌患者由来前立腺組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、 X型 sPLA_¾蛋白質の添加で消失したことから X型 sPLA₂に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、前立腺癌では X型 sPLA₂蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。実施例 1 3 抗 X型 sPLA,抗体を用いたヒト脾臓組織の免疫組織化学的解析

健常成人滕臓組織ならびに滕臓癌患者由来膊臓組織の標本は、 Biochain Inc. (SanLeandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、 0.3%¾0₂を含むメタノールに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシ夕ーゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルブミンを含む PBS中で、抗 X型 sPLA_¾抗体（6 ju g/mL) と 14時間、 4°Cで反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダーゼ含有アビジン一ピオチン複合体試薬（ Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 μ. g/mLのジアミノベンジジンと 0.006% HAを含む 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダ一ゼ活性を呈色し組織標本中の X型 sPLA₂ を可視化した。また、 0.4% へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA₂ 陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLAjシグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA₂ 蛋白質（60 μ. g/mL) と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLA₂の陽性シグナルは、正常滕臓組織ではほとんど検出されず、滕臓癌患者由来滕臓組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、 X型 sPLA^蛋白質の添加で消失したことから X型 sPLA₂に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、滕臓癌では X型 sPLA₂蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。実施例 1 4 抗 X型 sPLA₂抗体を用いたヒト大脳組織の免疫組織化学的解析

健常成人大脳組織ならびにアルッハーマ患者由来大脳組織の標本は、 Biochain Inc. (SanLeandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンヮヅクスを取り除き、 0·3%Η₂0₂を含むメタノールに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシ夕ーゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルブミンを含む PBS中で、抗 X型 sPLA₂抗体（6 n g/mL) と 14時間、 4 で反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダーゼ含有アビジン—ピオチン複合体試薬（Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 μ. g/mlのジァミノべンジジンと 0.006% 0₂を含む 50腿 ol/L Tris- HC1 (pH 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し組織標本中の X型 sPLA; を可視化した。また、 0.4% へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA₂ 陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLA₂シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA₂ 蛋白質（60 n g/mL) と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLA^の陽性シグナルは、正常大脳組織にはほとんど検出されず、アルツハイマー患者由来大脳組織中の神経細胞群の一部、特に老人班（senile plaque) や神経原繊維変化部位 (neurofibrillary tangle regions) に強く検出された。これらのシグナルは、 X型 sPLA₂蛋白質の添加で消失したことから X型 sPLA₂に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、アルヅハイマ一患者大脳では X型 sPLA₂蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。実施例 1 5 抗 X型 sPLA_;抗体を用いたヒト肝硬変組織の免疫組織化学的解析

健常成人肝臓組織ならびに肝硬変患者由来肝臓組織の標本は、 Biochain Inc. (SanLeandro, CA) より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、 0.3% 02を含むメタノールに 3 0分間反応させ内因性ペルォキシ夕ーゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルブミンを含む PBS中で、抗 X型 sPLA₂抗体（6 J g/mL) と 14時間、 4°Cで反応させた。 PBSで洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ペルォキシダーゼ含有アビジン一ピオチン複合体試薬（ Vector Laboratories) で処置した。洗浄後、 200 g/ml のジアミノベンジジンと 0.006% H₂0₂を含む 50匪 ol/L Tris-HCl (_PH 7.6) 緩衝液中で 10分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し組織標本中の X型 sPLA₂ を可視化した。また、 0.4¾ へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA₂ 陽性シグナルは、濃い茶色のジァミノベンジデンの沈着として検出した。 X型 sPLA₂シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製した X型 sPLA₂ 蛋白質（60 j g/mL) と 2時間反応させることにより行なった。

その結果、 X型 sPLA₂ の陽性シグナルは、正常肝臓組織では肝小葉および Kupffer 星細胞において低レベルながら検出されたが、肝硬変患者'由来肝臓組織では、偽小葉において顕著な発現増強が認められた。これらのシグナルは、 X型 sPLA₂蛋白質の添加で消失したことから X型 sPLA₂に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。以上の結果から、肝硬変組織では X型 sPLAi蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。実施例 1 6 マウス X型 sPLA;をコードする遺伝子のクローニング X型 sPLA;のマウスホモローグを単離するために、ヒト X型 sPU^配列に基づき 2種類のプライマーを設計し、マウス胸腺 cDNAを錶型として PCRを行なった。

5， -atcatgctgctcctgctac-3' (配列番号 1 0 )

5， -cagcaccagtcaatggcatc-3' (配歹 (I番号 1 1 )

PCR は、 9 2 °(：で 1分、 5 8 °0で 1分、 7 2 °Cで 1分の条件で 4 0サイクル行なった。

次に、マウス脾臓 marathon-ready cDNA ( Clontech ) を用いて、 rapi d ampl i fication of the cDNA ends (RACE) 法により 3'-、 5'-末端のクローニングを行い、最終的に以下のプライマーを用いて、マウス X型 sPLA₂ cDNAのコード領域を、マウス脾臓 cMAを錶型として PCRにより得た。

5' -agtagttgatgcggccgccaccatgctgctgctactgctgctgttgc-3' (配歹 U番号 1 2 ) 5' -actctctatgtctagatcagtcgcacttgggtgagtctttct-3' (配歹 !J番号 1 3 ) マウス X型 sPLA₂は、 Valentinら（J. Biol . Chem. , 274, 44, 31195-31202 ( 1999 ) ) が報告するように、 1 5 1個のアミノ酸から成り（配列番号 1 4 )、ヒト X型 sPLA₂ に対して 7 0 . 9 %の相同性を有することが推定された。マウス X型 sPLA^は、ヒト X型 sPLA^と同様に N末端に 2 8アミノ酸から成るプレプロぺプチドを有し、

C末端に延長構造を有する。しかしながら、マウス X型 sPLA₂は、ヒト X型 sPLA₂ とは異なり、 N -結合型糖鎖付加部位は有していなかった。

実施例 1 7 マウスプロ型及び成熟型 X型 sPLA;の酵素活性

マウス X型 sPLA₂の発現及び精製は、実施例 4に記載の方法と同様にして行なつた o

精製したプロ型及び成熟型 X 型 sPLA_! の酵素活性は、 l-palmitoyl - 2- l inoleoyl - phosphatidylchol ine (PLPC)を基質として測定した。図 2に示すよう' に、プロ型 X型 sPLA₂は、成熟型に比べてわずか 8 %の活性しか有していなかつた。プロペプチドの C末端には Argが存在していることから、トリプシン様ェンドプロテアーゼが切断に関与している可能性が推察された。そこで、プロ型 X型 sPLAj をトリプシンで消化後、 SDS-PAGE にて解析した結果、トリプシン処理によつて成熟型への変換が確認され、それに対応して、 PLA_¾活性が約 5倍にまで上昇した（図 2 ) 。以上の解析から、エンドプロテアーゼによるプロ型からのプロぺプチド部分の切断除去が、 X型 sPLA₂の最大活性発現には不可欠であることが示唆された。実施例 1 8 抗 X型 sPLA_;プロぺプチド抗体の調製ならびにその測定系

X型 sPLAiプロぺプチドは本発明により教示されたアミノ酸配列情報に基づいてぺプチド合成機により合成した。得られたプロぺプチドは牛サイログ口プリンと結合させ免疫原とし、ゥサギを免疫し抗血清を調製した。 IgG画分は HiTrapプ口ティン G-カラム（Amersham Pharmacia Biotech) を用いて精製した。抗血清及び精製した抗体の特異性と力価は、以下の ELISA法により測定した。牛血清アルブミンと結合させた X型 sPLA_¾ プロペプチドをコートした 9 6 ゥエルプレート (Nunc, Immtmo Maxi Sorpプレート）を調製し、 1 %牛血清アルブミン溶液で非特異的吸着をプロヅク後、抗ヒト X型 sPLA₂プロぺプチド抗体を加えて反応させた。 0.05% Tween20を含む PBS (Phosphate-buffered sal ine, pH 7.4) で洗浄後、さらにペルォキシダーゼ結合型ャギ抗ゥサギ IgG 抗体（Cappel ) と反応させ、 TBMplus(DAKO)を添加して発色させた。発色反応を 0.5 mol/L硫酸を添加して終了させ、発色強度を 450nmの波長で測定した。

このようにして得た抗 X型 sPLA₂プロぺプチド抗体は、実施例 3に示した EL I SA 系においてプロ型 X型 sPLA₂や活性型 X型 sPLA₃とは反応せず、プロべプチドのみを認識するものであった。この抗血清を用い、以下の ELI SA系第 1法によりプロぺプチドを測定した。プロぺプチドを EZ- Link Sulf o-NHS-LC-LC-Biotin(Pierce ) を反応させ、逆相 HPLCにより分離し、ピオチン化プロぺプチドを調製した。アビジンをコートした 9 6ゥエルプレートを調製し、 1 %牛血清アルブミン溶液で非特異的吸着をブロック後、ピオチン化プロペプチドを加えて 2時間反応させた。 0. 05% Tween20を含む PBS (Phosphate-buffered sal ine, pH 7.4) で洗浄後、抗 X型 sPLA₂プロぺプチド抗体と測定するべき検体または標準溶液を同時に添加し、 1 8時間反応させた。洗浄後、さらにペルォキシダ一ゼ結合型ャギ抗ゥサギ IgG 抗体（Cappel ) と反応させ、洗浄後 TBMplus(DAKO)を添加して発色させた。発色反応を 1N硫酸を添加して終了させ、発色強度を 450nmの波長で測定した。 O ng/mL の標準溶液で得られる吸光度 B "こ対する各濃度の標準溶液で得られる吸光度 Bの百分率を求めて標準曲線（図 3 ) を作成し、それを用いて未知検体で得られる吸光度から求めた B/B„%から未知検体中に含まれるプロぺプチド濃度を算出した。また、以下の EL I SA系第 2法によってもプロペプチドを測定した。牛血清アルブミンと結合させた X型 sPLA₂ プロペプチドをコートした 9 6ゥエルプレートを調製し、 1 %牛血清アルブミン溶液で非特異的吸着をプロヅク後、抗 X型 sPLA₂ プロペプチド抗体と測定するべき検体または標準溶液を同時に添加し、 1 8時間反応させた。洗浄後、第 1法と同様に発色反応を行い、未知検体中に含まれるプロぺプチド濃度を算出した。実施例 1 9 抗 X型 sPLA プロペプチド抗体を用いたヒト大腸癌組織の免疫組織化学的解析

本試験には、抗ヒト X型 sPLA2プロぺプチド抗体を用いた。健常成人の大腸組織ならびに大腸癌患者由来大腸癌組織の標本は、 Biochaiii Inc. ( San Leandro, CA)より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンヮヅクスを取り除き、 0.3% H₂0₂を含むメタノールに 30分間反応させ内因性ペルォキシ夕一ゼを除去した後、 5%の正常ャギ血清で 20 分間処置した。その後、 0.1% 牛血清アルブミンを含む PBS水溶液中で、抗ヒト X型 sPLA₂ (ゥサギ）プロペプチド抗体（24 g/mL) と 14時間、 4°Cで反応させた。 0. l % Polyoxyethyleiie (20)sorlDitan monolaurate ( Tween20； Wako Pure Chemical Industries , Ltd . O saka) 含有の PBS水溶液で洗浄後、ピオチンを結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体と 30分間反応させ、ぺルォキシダ一ゼ含有のストレプトアビジン試薬（ DAKO Corporation, Carpinteria, CA) を 1 5分間処置した。 PBS 水溶液で洗浄した後、ピオチン標識タイラマイド溶液（DAKO Corporation, Carpinteria, CA) を 1 5分間反応させ、引き続き 0. l % Tween20含有の PBS水溶液で充分洗浄した。さらにペルォキシタ一ゼ標識ストレプトアビジン溶液を 1 5分間処理し、同様に 0 . 1 % Tween20含有の PBS水溶液で充分に洗浄した。洗浄後、 200〃 g/mLのジァミノベンジジンと 0.006% H2O2を含む 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 緩衝液中で 10 分間反応させることによりペルォキシダーゼ活性を呈色し、組織標本中の X型 sPLA₂プロペプチドを可視化した。また、 0 . 4 %へマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。 X型 sPLA₂プロペプチド陽性シグナルは、ジァミノベンジデンの茶褐色の沈着として検出した。プロペプチド陽性シグナルの吸収中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、プロペプチド結合型牛血清ァルブミン（300〃 g/:mL) と 2時間反応させることにより行った。

その結果、 X型 sPLA₂プロペプチド陽性シグナルは、正常大腸組織にはほとんど検出されず、大腸腺癌組織中の癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、組織への抗体処理前のプロぺプチド結合型牛血清アルブミンの添加で消失したことから X型 sPLA₂プロペプチドに特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のゥサギから調製した IgGでは認められなかった。 '以上の結果から、大腸癌ではプロ型 X型 sPLA₂から活性化に伴つ T遊離されたプロべプチド量が顕著に增加していることが示唆された。産業上の利用可能性

本発明によれば、 X型 sPLA₂の一部を特異的に認識する抗体；該抗体を用いた活性型 X型 _SPLA₂の測定方法；該抗体を含む診断用キットなどが提供される。

本発明の測定方法を用いることで、 X型 sPLA₂が特異的に関与する疾病の特定が可能となるとともに、 X型 sPLA₂ に起因する特定疾患、特に大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、滕臓癌、アルツハイマー病、肝硬変の診断用キットなどが提供される

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 3記載のアミノ酸配列中、 ― 1 1位の Gluから 1 2 3位の Aspまでのアミノ酸から成るポリぺプチドの一部を特異的に認識する抗体。

2 . 配列番号 3記載のアミノ酸配列中、一 1 1位の Gluから一 1位の Argまでのアミノ酸から成るポリぺプチドを特異的に認識する請求項 1に記載の抗体。

3 . 配列番号 3記載のアミノ酸配列中、 1位の Glyから 1 2 3位の Aspまでのァミノ酸から成るポリべプチドを特異的に認識する請求項 1に記載の抗体。

4 . ポリクロ一ナル抗体であることを特徴とする、請求項 1から 3のいずれかに記載の抗体。

5 . 請求項 3に記載の抗体を含むことを特徴とする ΡΙ 関連疾患の治療薬。

6 . 配列番号 3記載のアミノ酸配列中、一 1 1位の Gluから— 1位の Argまでのアミノ酸から成るポリペプチド。

7 . 配列番号 3記載のアミノ酸配列中、 1位の Glyから 1 2 3位の Aspまでのァミノ酸から成るポリペプチド。

8 . 請求項 6または 7に記載のポリぺプチドから成る標準抗原。

9 . 請求項 1から 4のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 6または 7に記載のポリぺプチドの測定方法。

1 0 . 活性型 X型 sPLAiを測定することを特徴とする請求項 9に記載の測定方法。

1 1 . 請求項 1から 4のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする請求項

6または 7に記載のポリぺプチドの測定キット。

1 2 . 活性型 X型 sPLA!を測定することを特徴とする請求項 1 1に記載の測定キヅ卜。

1 3 . 請求項 6または 7に記載のポリぺプチドを検出しえる試薬を含むことを特徴とする癌診断用キット。

1 4 . 試薬が請求項 1から 4のいずれかに記載の抗体であることを特徴とする請求項 1 3に記載の癌診断用キット。

1 5 . 癌が、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌または滕臓癌である請求項 1 3または 1 4に記載の癌診断用キット。

1 6 . 請求項 6または 7に記載のポリぺプチドを検出しえる試薬を含むことを特徴とするアルヅハイマー病診断用キット。

1 7 . 試薬が請求項 1から 4のいずれかに記載の抗体であることを特徴とする請求項 1 6に記載のァルツハイマー病診断用キット。

1 8 . 請求項 6または 7に記載のポリぺプチドを検出しえる試薬を含むことを特徴とする肝硬変診断用キット。

1 9 . 試薬が請求項 1から 4のいずれかに記載の抗体であることを特徴とする請求項 1 8に記載の肝硬変診断用キット。

2 0 .請求項 6または 7に記載のポリぺプチドを検出することを特徴とする癌、アルヅハイマー病または肝硬変のスクリ一二ング方法。

2 1 . 癌が、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌または滕臓癌である請求項 2 0に記載のスクリーニング方法。