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WO2001088163A1 - Verfahren zur herstellung von rekombinanten expansinen - Google Patents

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WO2001088163A1
WO2001088163A1 PCT/EP2001/005078 EP0105078W WO0188163A1 WO 2001088163 A1 WO2001088163 A1 WO 2001088163A1 EP 0105078 W EP0105078 W EP 0105078W WO 0188163 A1 WO0188163 A1 WO 0188163A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
expansins
vector
expression
host cell
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2001/005078
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English (en)
French (fr)
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WO2001088163A9 (de
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Frank Berendes
Hans-Georg Rast
Uwe Vogt
Christos Gouloudis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Priority claimed from DE10032630A external-priority patent/DE10032630A1/de
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Priority to AU2001263895A priority Critical patent/AU2001263895A1/en
Publication of WO2001088163A1 publication Critical patent/WO2001088163A1/de
Publication of WO2001088163A9 publication Critical patent/WO2001088163A9/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of recombinant expansins in microorganisms, the vectors required therefor, host cells containing them
  • Expansins are proteins that occur in plant cell walls and are able to catalyze the linear expansion of cell walls under tension without hydrolyzing the polysaccharides contained in the cell walls
  • expansins The special property of the expansins, the structure and thus the physical properties of polysaccharides, in particular of cellulose and hemicellulose, to change makes these proteins interesting for a variety of applications in the fiber processing industry. In order to use expansins for such applications, it is necessary to have them available in sufficient quantities.
  • expansins is understood to mean all proteins which show structure-changing activity towards polysaccharides without hydrolyzing them. They consist of a polypeptide chain with a molecular weight of 25 to 30 kDa, which has more than 60% sequence similarity at the amino acid level to the S1 expansine of the cucumber Cucumis sativus (SEQ ID NO: 1).
  • Nucleic acids coding for expansins are all those coding for proteins, which show structure-changing activity towards polysaccharides without hydrolyzing them and consist of a polypeptide chain with a molecular weight of 25 to 30 kDa, which are more than 60% sequence similarity at the amino acid level to the S1 expansine the cucumber has Cucumis sativus (SEQ JD NO: 1).
  • nucleic acids that code for expansins are those that code for a protein of the amino acid sequence according to SEQ LD NO: 1 -4.
  • the expansins produced by the process according to the invention can be in the form of "mature" proteins or as parts of larger proteins, for example as fusion proteins. Furthermore, they can have secretion or “leader” sequences, sequences that allow easy purification, such as multiple histidine residues or additional stabilizing amino acids, as long as they still show structure-changing activity against polysaccharides.
  • the proteins produced by the method according to the invention can also only be fragments of expansins, as long as they have a structure-changing activity towards polysaccharides.
  • the expansins produced by the process according to the invention can have deletions or amino acid substitutions compared to naturally occurring expansins, as long as they have at least one structure-changing activity against polysaccharides. Conservative substitutions are preferred.
  • Such conservative substitutions include variations in which one amino acid is replaced by another amino acid from the following group:
  • Aromatic residues Phe, Tyr and Tip.
  • the present invention also relates to vectors containing a nucleic acid coding for expansins and for proteins which have a sequence which is functionally linked to the nucleic acid and which enables the expression of the nucleic acid in microorganisms.
  • Nucleic acids coding for a protein of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1-4 are preferably used.
  • the nucleic acids encoding expansins (hereinafter referred to as nucleic acids) contained in the vectors according to the invention are in particular single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • DNA single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids
  • RNA ribonucleic acids
  • Preferred embodiments are fragments of genomic DNA, which may contain introns, and cDNAs.
  • a particularly preferred embodiment is cDNA.
  • sequences linked functionally to the nucleic acid are preferably regulatory sequences such as, for example, at least one promoter for constitutive or inducible expression or enhancers.
  • Vectors which ensure expression of the nucleic acid in bacteria and fungi are preferred.
  • Bacteria preferably Gram-negative bacteria.
  • Suitable promoters for the expression of the expansins which can be prepared by the process according to the invention in E. coli include natural hybrid or bacteriophage promoters. These are preferably promoters from the group of the ⁇ promoters, omp, lac, trp or synthetic promoters (see also WO 98/15625, DE-A-3 430 683, EP-A-173 149) , Suitable vectors are commercially available, for example the vectors of the pET series (for example pET3a, pET23a, pET28a with His tag or pET32a with His tag) or pGEX with glutathione synthetase fusion.
  • the vectors pProExHT (Gibco BRL) or pASK-IBA3 (Institute for Bioanalytics, Göttingen) are very particularly preferably used. These are vectors which allow inducible expression of the expansins in E. coli, the recombinant expansins at the N-terminus having a by pProExHT 6-histidine tag are fused and fused to a streptavidin tag by pASK-EBA3 at the C-terminus.
  • the vectors which enable expression of the nucleic acid in E. coli can then be transformed, for example, into DE3-lysogenic E. coli strains, for example BL21 (D ⁇ 3), HM S 174 (DE3) or AD494 (DE3). They are preferably transformed into BL21 (DE3).
  • DE3-lysogenic E. coli strains for example BL21 (D ⁇ 3), HM S 174 (DE3) or AD494 (DE3). They are preferably transformed into BL21 (DE3).
  • the vectors pProExHT and pASK-IBA3, which enable expression of the nucleic acid are very particularly preferably transformed into BL21 (DE3).
  • the present invention further relates to host cells of microorganisms containing a nucleic acid coding for expansins.
  • Host cells of microorganisms are preferred, containing a nucleic acid coding for a protein of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1-4.
  • nucleic acid contained in the host cell coding for expansins preferably coding for a protein of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1-4 (hereinafter referred to as nucleic acid) can be inserted into the genome of the host cell or can be present in a vector.
  • the nucleic acid is preferably present in a vector comprising this nucleic acid and a sequence which is functionally linked therewith and which enables the expression of the nucleic acid in the host cell.
  • the host cells are preferably a fungal or bacterial cell, such as cells of Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, yeast or filamentous fungi.
  • Preferred examples of bacteria are Streptomyces sp., B ⁇ cillus subtilis, S ⁇ lmonell ⁇ typhimurium, Serr ⁇ ti ⁇ m ⁇ rcescens or Pseudomon ⁇ s species.
  • E. coli is particularly preferred.
  • DE3-lysogenic E. coli strains are very particularly preferred, for example BL21 (DE3), HM S 174 (DE3) or AD494 (DE3).
  • Preferred examples of yeasts are Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe.
  • filamentous fungi are Aspergillus species.
  • the nucleic acid coding for expansins or a vector containing this nucleic acid can be introduced into the suitable host cell using methods which are known to the person skilled in the art.
  • the transformed host cells of microorganisms can be cultivated in complexes or mineral media at the temperatures suitable for the particular microorganism.
  • the respective microorganisms are preferably grown to high cell densities.
  • the transformed microorganisms are particularly preferably cultivated up to the late exponential / early stationary phase.
  • the induction is preferably carried out at temperatures between 1 and 30 ° C., particularly preferably between 4 and 28 ° C., very particularly preferably between 10 and 20 ° C.
  • the transformed microorganisms are cultivated up to the late exponential / early stationary phase and the induction of the expansin synthesis is preferably carried out at temperatures between 1 and 30 ° C.
  • the induction of the expansin synthesis is preferably carried out for a period of from 10 minutes to 48 hours, particularly preferably from 20 minutes to 16 hours, very particularly preferably from 30 minutes to 6 hours.
  • the cultivation of the transformed microorganisms up to the late exponential / early stationary phase and the induction of the expansin synthesis preferably take place at temperatures between 1 and 30 ° C. for a period of 10 minutes to 48 hours.
  • the host cells are preferably disrupted at temperatures from 0 to 30 ° C., preferably at 1 to 25 ° C., particularly preferably at 4 to 20 ° C.
  • a protease inhibitor is preferably added.
  • a method for producing expansins which is characterized in that
  • a protease inhibitor is preferably added when the expansins are obtained by disrupting the cells.
  • the analysis of the expansins obtained by the method according to the invention can be carried out, for example, by Western emblot.
  • the recombinant expansins can be detected, for example, via fused tags.
  • the crude extracts or supernatants which can be obtained by centrifuging the crude extracts, can be separated electrophoretically in SDS-PAGE.
  • expansins obtained in the process according to the invention are fusion proteins, they can be affinity-purified, for example.
  • the activity can be detected by all methods and techniques with which a structure-changing effect on polysaccharides can be measured.
  • Particularly suitable are methods for determining the strength of paper, cotton thread or other cellulose-containing or hemicellulose-containing materials, or methods for determining the mechanical properties required for tearing paper, cotton fibers or other cellulose-containing or hemicellulose-containing materials
  • fragments in relation to proteins and DNA describes parts of expansins or parts of those under SEQ ID NO. 1-4 described nucleic acid or amino acid sequence which have at least one structure-changing activity towards polysaccharides.
  • vector describes a DNA element that is used to introduce exogenous nucleic acids into host cells.
  • a vector contains a nucleic acid sequence that codes for one or more polypeptides.
  • Vectors that are capable of directing the expression of the genes that contain them are also referred to as "expression vectors”.
  • nucleic acid refers to polynucleotides such as deoxyribonucleic acids (DNA) or, if appropriate, to ribonucleic acids (RNA).
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • RNA ribonucleic acids
  • the term also includes, in an equivalent manner, analogs of RNA or DNA which are produced from nucleotide analogs, and, if appropriate, single-stranded (“sense” or “antisense”) and double-stranded polynucleotides.
  • promoter refers to DNA sequences that regulate the expression of a particular DNA that are functionally linked to the promoter.
  • the term also includes "tissue-specific” promoters, i.e. Promoters that control the expression of the specific DNA only in certain cells (for example cells of a certain tissue). Also included are “non-tissue-specific"
  • Promoters and promoters that lead to constitutive expression or are inducible are inducible.
  • a “fusion protein” is a fusion of a first amino acid sequence coding for one of the above-described expansins with a second amino acid sequence which has no commonality or basic homology to the expansin sequences.
  • the second amino acid sequence can originate from the same organism as the first, or alternatively originate from another organism (intergenic).
  • a fusion protein can be represented using the formula X-Expansin-Y.
  • X and Y stand for a polypeptide that is not linked together. with an expansin amino acid sequence.
  • X or Y can each be absent independently.
  • cell or “host cell” can be used in the same sense in the context of the present disclosure. It is understood that these terms refer not only to a single cell, but also to the descendants of such a cell. Due to certain modifications in the course of subsequent generations (e.g. mutations), such offspring may not be identical to the stem cell, but are included in the present invention.
  • Tntron describes such sequences of the described, preferably genomic DNA, which are transcribed, but then removed from the transcript by so-called “splicing", the adjacent sequences (exons) being linked.
  • Nucleic acids coding for expansins can be obtained starting from mRNA which is present in plant cells. It is also possible to obtain the DNA according to the invention from genomic DNA from the relevant plant cells.
  • a gene coding for an expansin can be obtained, for example, from a cDNA or a genomic DNA library.
  • cDNA can be obtained by isolating the entire mRNA of a cell. Starting from the mRNA, double-stranded cDNA can then be produced and inserted into a suitable expression construct or a suitable vector.
  • the DNA necessary for the method according to the invention can also be obtained by amplification using the known polymerase chain reaction (PCR) or else by de novo DNA synthesis (see also J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Edition, chap. 14).
  • the present invention also includes vectors which contain a nucleic acid coding for expansins, preferably coding for a protein of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1-4, which are functionally linked to a regulatory sequence.
  • “Functions linked” means that the nucleic acid sequence is linked to the regulatory sequence in such a way that the expression of the protein encoded by the nucleic acid sequence can be controlled.
  • "Regulatory sequences” include, for example, promoters, enhancers and other control elements.
  • the vectors contain, for example, a gene coding for an expansin or fragments thereof. These vectors can be used to be introduced into cells, where the corresponding expansins or fusion proteins thereof then arise. The transformation can be carried out using methods known to those skilled in the art, such as ion-mediated transformation, electrotransformation or transfection.
  • the present invention also encompasses host cells of microorganisms which have a nucleic acid coding for expansins, preferably coding for a protein of the
  • Amino acid sequence according to SEQ LD NO: 1-4 contained (e.g. in a vector, an expression construct or inserted into the genome).
  • Suitable microorganisms are, for example, bacteria, yeast or filamentous fungi.
  • vectors containing a nucleic acid encoding expansins in ⁇ DE3-lysogenic E. co / z strains e.g. BL21 (DE3), HM S174 (DE3) or
  • AD494 (DE3) can be transformed. After the cells have grown, expression is induced with IPTG. After a incubation period, the cells are disrupted, the expressed protein purified by chromatographic methods, in the case of protein expressed with His tag by FPLC on a Ni-NTA column, in the case of protein expressed with streptavidin tag on a biotin column, as well as by ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, ultrafiltration, electrophoresis or else immunoaffinity purification, which are specific for the expansins.
  • Expansins can be generated by mutagenesis, such as directed (point) mutagenesis, or by deletions.
  • the expansins When expressing the expansins according to the present invention, it may be advantageous to change certain codons in order to enable optimal expression. This applies if the use of certain codons ("Codon usage ”) is different in the heterologous expression system than in plants. Furthermore, the deletion of the 5'- or 3'-untranslated region is possible, for example if there are several destabilizing sequence motifs (eg ATTTA) in the 3 'region of the cDNA.
  • ATTTA destabilizing sequence motifs
  • the expansins produced in the process according to the invention can also be present as part of a fusion protein.
  • Such fusion proteins are fully encompassed by the present invention. Fusion proteins facilitate expression of a protein under certain circumstances.
  • the expansins can be made as glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins.
  • GST fusion proteins allow easy protein purification (see e.g. Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons, N.Y. 1991). Fusion proteins can contain, for example, a "leader" sequence that corresponds to the
  • Purification serves, for example, a poly-histidine sequence at the N-terminus (but also at the C-terminus) of the protein allows it to be purified by chromatography on a Ni 2+ NTA column (see, for example, Hachuli et al. (1987) J. Chromatography 411, 177).
  • the recombinant expansins which can be prepared by the process according to the invention can be used in the recycling of paper due to their structure-changing activity towards polysaccharides, in particular towards cellulose and hemicellulose. In addition, they can be used to produce pulp from vegetable tissue and thus to substitute aggressive chemicals in paper production.
  • the recombinant expansins which can be prepared by the process according to the invention can, owing to their stoic-altering activity towards polysaccharides, in particular with respect to cellulose and hemicellulose, also in the production, treatment and finishing of textiles based on cellulose, such as cotton.
  • the poly (A) + RNA was isolated from the total RNA using the “mRNA direct kit” (Dynal, Hamburg). Using the “superscript preamplification
  • the mixtures were 0.2 mM dNTPs (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg), 1 mM MgSO 4 , 0.2 uM primer forw / rev (sequence see below), another 0.5 ul high
  • the PCR products were analyzed using the "TOPO TA Cloning Kit” (frivitrogen,
  • the expansion genes inserted in the pCR2.1-TOPO vector were sequenced using the primers recommended by the manufacturer and compared with the literature data.
  • the sequence analysis revealed the identical sequence for the tomato expansin (leexp3, SEQ ID NO: 3) and for the cucumber expansin (csexpla, SEQ ID NO: 2) a sequence which had three silent mutations but no change in the amino acid sequence compared to the published sequence .
  • Täbakexpansins ntexp4a, SEQ ID NO: 4
  • a gene was identified which has 14 mutations and 2 amino acid changes compared to the published sequence.
  • the amplified expansion genes were cut out from the pCR2.1-TOPO vectors by restriction digestion, separated into agarose gel and isolated from the agarose gel with the aid of the “QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit” (Qiagen, Hilden). In another Ligation reaction, they were inserted as EcoRI-N ⁇ tl fragments in the pPro ⁇ xHTaS vector (Gibco LifeTechnologies, self-modified) and as EcoRMTzoI fragments in the pASK-IB A3 vector (Institute for Bioanalytics, Göttingen).
  • the ⁇ xpansine genes were cloned from the pPro ⁇ xHTaS vector as EcoRI-Notl fragments, cloned into the pPro ⁇ XHt ⁇ Xb vector (Gibco BRL LifeTechnologies) and as EcoRI- ⁇ ⁇ zoI before they were cloned into the pASK-LB A3 vector
  • the pPro ⁇ xHTaS vector differs from the pPro ⁇ xHTa vector in that from position 396 to 401 there are two additional stop codons The original sequence -tcgaat- was changed to -gactga-.
  • lysis buffer 100 mM TrisHCl pH 8, 1 mM EDTA
  • the cells were disrupted by ultrasound treatment at 4 ° C.
  • 0.4 mg / ml of the protease inhibitor was added to the lysis buffer
  • the crude extracts and their clear supernatants were separated electrophoretically in SDS-PAGE.
  • the clear supernatants were prepared by centrifuging the crude extracts for 30 min at 16,000 x g and 4 ° C.
  • the recombinant expansins were detected in the Westerblot via their fusion components.
  • the 6-His-Tag-coupled proteins were detected using a monoclonal ANTI-polyHISTIDINE Clone His-1 antibody
  • strep-tag-coupled proteins were detected using a "streptavidin alkaline phosphatase conjugate" (Institute for Bioanalytics, Göttingen). The detection was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • the gene of tomato expansin cloned into the pASK-IBA 3 expression vector was, as described in Example 3, expressed in E. coli BL21 (DE3).
  • the cells were sedimented and resuspended in 1/100 vol. Lysis buffer.
  • the strain E. coli BL21 (DE3) with the expression vector pASK-IBA3: leexp3 was grown at 37 ° C. in 2.4 liter LB medium in the presence of 100 ⁇ g / ml ampicillin. After an OD 600 of 5 had been reached, the incubation temperature was lowered to 20 ° C. and the synthesis of the recombinant tomato expansin was induced by adding 2 mg / 1 anhydrotetracycline (AHT). After a further 4 h, the cells were sedimented by centrifugation, resuspended in 1/100 volume of lysis buffer and disrupted by means of ultrasound treatment.
  • AHT anhydrotetracycline
  • the stress-strain profile was recorded with a type 1455 universal testing machine (Zwick GmbH, Ulm).
  • the paper strips were stretched over a distance of 7.5 cm at a speed of 0.5 mm / min, the applied tension ⁇ in N / mm 2 and the elongation ⁇ being measured in% of the strip length.
  • the mechanical energy related to the area was used (ME [mm * MPa]), which had to be used to tear the paper. This size characterizes the strength of the paper and is calculated from the integral of the stress-strain function.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen in Mikroorganismen, die dafür benötigten Vektoren, Wirtszellen, enthaltend diese Vektoren, sowie die Verwendung von rekombinanten Expansinen.

Description

Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen in Mikroorganismen, die dafür benötigten Vektoren, Wirtszellen, enthaltend diese
Vektoren, sowie die Verwendung von rekombinanten Expansinen.
Expansine sind Proteine, die in pflanzlichen Zellwänden vorkommen und in der Lage sind, die Längenausdehnung unter Zugspannung stehender Zellwände zu katalysie- ren, ohne dabei die in den Zellwänden enthaltenen Polysaccharide zu hydrolysieren
(McQueen-Mason et al., PNAS USA 91, 1994, 6574-6578).
Die besondere Eigenschaft der Expansine, die Struktur und damit die physikalischen Eigenschaften von Polysacchariden, insbesondere von Cellulose und Hemicellulose, zu verändern, macht diese Proteine für vielfältige Anwendungen in der faserverarbeitenden Industrie interessant. Um Expansine für solche Anwendungen nutzen zu können, ist es notwendig, sie in hinreichender Menge verfügbar zu haben.
In US-A-5 959 082 wird die Isolierung von Expansinen aus pflanzlichem Roh- material beschrieben. Nachteiüg an diesem Verfahren ist, dass die Expansine nur in geringen Mengen isoliert werden können. Weiterhin umfasst das Verfahren eine Vielzahl von Arbeits- und Aufireinigungsschritte. Daher ist das Verfahren für eine großtechnische Nutzung unwirtschaftlich.
Die oben genannten Probleme können mit der Herstellung von rekombinanten
Expansinen gelöst werden. Bisherige Versuche, aktive Expansine in Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilzen zu exprimieren, schlugen fehl (Cosgrove et al., PNAS USA 94, 1997, 6559-6564; Grobe et al., Eur. J. Biochem. 263, 1999, 33-40). Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein Verfahren bereitzustellen, welches die Herstellung aktiver rekombinanter Expansine in Mikroorganismen erlaubt.
Überraschenderweise wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Expansinen gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es
a) das Kultivieren einer Wirtszelle, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine oder einen Vektor, umfassend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine sowie eine damit funktioneil verknüpfte Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle gewährleistet, unter Bedingungen, die diese Expression gewährleisten und
b) die Gewinnung der Expansine aus der Zelle oder dem Kulturmedium
umfasst.
Unter dem Begriff Expansine sind gemäß der vorliegenden Erfindung alle Proteine zu verstehen, die strukturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden zeigen ohne diese zu hydrolysieren. Sie bestehen aus einer Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 25 bis 30 kDä, die mehr als 60 % Sequenzähnlichkeit auf Amino- säureebene zum Sl -Expansine der Gurke Cucumis sativus (SEQ ID NO: 1) besitzt.
Nukleinsäuren, die für Expansine kodieren sind alle, die für Proteine kodieren, die strukturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden zeigen ohne diese zu hydrolysieren und aus einer Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 25 bis 30 kDa bestehen, die mehr als 60 % Sequenzähnlichkeit auf Aminosäureebene zum Sl -Expansine der Gurke Cucumis sativus (SEQ JD NO: 1) besitzt. Vorzugsweise sind Nukleinsäuren, die für Expansine kodieren, diejenigen, die für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ LD NO: 1 -4 kodieren. Die nach dem erflndungsgemäßen Verfahren hergestellten Expansine können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z.B. als Fusionsproteine vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen- ProSequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidinreste oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen, solange sie noch eine strukturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden zeigen.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteine können auch nur Fragmente von Expansinen sein, solange sie eine strakturverändernde Aktivität ge- genüber Polysacchariden aufweisen.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Expansine können im Vergleich zu natürlich vorkommenden Expansinen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest eine strukturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden aufweisen. Konservative Substitutionen sind bevorzugt.
Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, bei denen eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
1. kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
2. polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gin;
3. polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. aromatische Reste: Phe, Tyr und Tip.
Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:
Figure imgf000005_0001
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Vektoren, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine, sowie für Proteine, die eine funktionell mit der Nukleinsäure verknüpfte Sequenz aufweisen, welche die Expression der Nukleinsäure in Mikroorganismen ermöglicht. Vorzugsweise werden Nukleinsäuren, kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 eingesetzt. Bei den in den erfindungsgemäßen Vektoren enthaltenen Nukleinsäuren kodierend für Expansine (im folgenden Nukleinsäure genannt) handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsfoπnen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist cDNA.
Bei den funktioneil mit der Nukleinsäure verknüpften Sequenzen handelt es sich vorzugsweise regulatorische Sequenzen wie beispielsweise mindestens ein Promotor zur konsti utiven oder induzierbaren Expression oder auch Enhancer.
Bevorzugt sind Vektoren, die eine Expression der Nukleinsäure in Bakterien und Pilzen gewährleisten.
Besonders bevorzugt sind Vektoren, die eine Expression der Nukleinsäure in
Bakterien, vorzugsweise Gram-negativen Bakterien ermöglicht.
Ganz besonders bevorzugt sind Vektoren, die eine Expression der Nukleinsäure in E. coli ermöglichen. Passende Promotoren zur Expression der nach dem erfindungs- gemäßen Verfahren herstellbaren Expansine in E. coli umfassen natürliche Hybridoder Bakteriophagenpromotoren. Bevorzugt handelt es sich dabei um Promotoren aus der Gruppe der λ-Promotoren, um omp-, lac-, trp- oder synthetische Promotoren (siehe auch WO 98/15625, DE-A-3 430 683, EP-A- 173 149). Geeignete Vektoren sind kommerziell erhältlich, beispielsweise die Vektoren der pET-Serie (beispiels- weise pET3a, pET23a, pET28a mit His-Tag oder pET32a mit His-Tag) oder pGEX mit Glutathionsynthetase-Fusion.
Ganz besonders bevorzugt werden die Vektoren pProExHT (Gibco BRL) oder pASK-IBA3 (Institut für Bioanalytik, Göttingen) eingesetzt. Dabei handelt es sich um Vektoren, die eine induzierbare Expression der Expansine in E. coli erlauben, wobei durch pProExHT die rekombinanten Expansine am N-Terminus mit einem 6-Histidin-Tag fusioniert werden und durch pASK-EBA3 am C-Terminus mit einem Streptavidin-Tag fusioniert werden.
Die Vektoren, die eine Expression der Nukleinsäure in E. coli ermöglichen, können dann beispielsweise in DE3-lysogene E. coli-Stäm e, beispielsweise BL21(DΕ3), HM S 174(DE3) oder AD494(DE3) transformiert werden. Vorzugsweise werden sie in BL21(DE3) transformiert. Ganz besonders bevorzugt werden die Vektoren pProExHT und pASK-IBA3, die eine Expression der Nukleinsäure ermöglichen, in BL21(DE3) transformiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Wirtszellen von Mikroorganismen, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine. Bevorzugt sind Wirtszellen von Mikroorganismen, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4.
Die in der Wirtszelle enthaltene Nukleinsäure kodierend für Expansine, vorzugsweise kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 (im folgenden Nukleinsäure genannt) kann in das Genom der Wirtszelle insertiert sein oder in einem Vektor vorliegen. Vorzugsweise liegt die Nukleinsäure in einem Vektor, umfassend diese Nukleinsäure sowie damit funktionell verknüpfte Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle ermöglicht, vor.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Wirtszellen um eine Pilz- oder Bakterienzelle, wie beispielsweise Zellen von Gram-negativen Bakterien, Gram-positiven Bakterien, Hefen oder filamentösen Pilzen.
Bevorzugte Beispiele für Bakterien sind Streptomyces sp., Bαcillus subtilis, Sαlmonellα typhimurium, Serrαtiα mαrcescens oder Pseudomonαs Species. Besonders bevorzugt ist E. coli. Ganz besonders bevorzugt sind DE3-lysogene E. coli-Stämme, beispielsweise BL21(DE3), HM S 174(DE3) oder AD494(DE3). Bevorzugte Beispiele für Hefen sind Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe.
Bevorzugte Beispiele für filamentöse Pilze sind Aspergillus Species.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Expansinen kann die Nukleinsäure kodierend für Expansine oder ein Vektor, enthaltend diese Nukleinsäure mit Hilfe von Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, in die geeignete Wirtszelle eingeschleust werden.
Die Kultivierung der transformierten Wirtszellen von Mikroorganismen kann in Komplexen oder mineralischen Medien bei den für den jeweiligen Mikroorganismus geeigneten Temperaturen erfolgen. Dabei werden die jeweiligen Mikroorganismen vorzugsweise zu hohen Zelldichten angezüchtet. Besonders bevorzugt erfolgt die Kultivierung der transformierten Mikroorganismen bis zur späten exponentiellen/ frühen stationären Phase.
Werden im erfindungsgemäßen Verfahren Vektoren verwendet, die eine Induktion der Expansinsynthese erfordern, so erfolgt die Induktion vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 1 und 30°C, besonders bevorzugt zwischen 4 und 28°C, ganz besonders bevorzugt zwischen 10 und 20°C.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Kultivierung der transformierten Mikroorganismen bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase und die Induktion der Expansinsynthese wird vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 1 und 30°C durchgeführt.
Vorzugsweise erfolgt die Induktion der Expansinsynthese für einen Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden, besonders bevorzugt von 20 Minuten bis 16 Stunden, ganz besonders bevorzugt von 30 Minuten bis 6 Stunden. In einer ganz besonders bevorzugten Aus___ührungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Kultivierung der transformierten Mikroorganismen bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase und die Induktion der Expansinsynthese vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 1 und 30°C für einen Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden.
Der Aufschluss der Wirtszellen findet vorzugsweise bei Temperaturen von 0 bis 30°C, bevorzugt bei 1 bis 25°C, besonders bevorzugt bei 4 bis 20°C statt. Dabei wird zum Schutz der rekombinanten Expansine vor proteolytischer Spaltung vorzugsweise ein Proteaseinhibitor zugesetzt.
Ganz besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung von Expansinen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass
a) die Kultivierung von E. coli-Zellen enthaltend einen Vektor umfassend eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 sowie eine damit ft ktionell verknüpfte regulatorische Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in E. coli gewährleistet, bis zur späten exponentiellen frühen stationären Phase er- folgt,
b) die Induktion der Expansinsynthese bei Temperaturen von 1 bis 30°C in einem Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden erfolgt und
c) die Gewinnung der Expansine durch Aufschluss der Zellen bei
Temperaturen von 0 bis 30°C, vorzugsweise bei 1 bis 25°C, besonders bevorzugt bei 4 bis 20°C erfolgt.
Zum Schutz der rekombinanten Expansine vor proteolytischer Spaltung wird bei der Gewinnung der Expansine durch Aufschluss der Zellen vorzugsweise ein Proteaseinhibitor zugesetzt. Die Analyse der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Expansine kann beispielsweise durch Westemblot erfolgen. Dabei können die rekombinanten Expansine beispielsweise über fusionierte Tags nachgewiesen werden.
Um die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Expansine auf ihre Löslichkeit zu überprüfen können die Rohextrakte oder Überstände, die durch Zentrifu- gation der Rohextrakte erhalten werden können, im SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt werden.
Handelt es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Expansine um Fusionsproteine, so können diese beispielsweise affinitätsgereinigt werden.
Bei den im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Expansine kann ein Nachweis der Aktivität durch alle Methoden und Techniken erfolgen, mit denen man eine strukturverändernde Wirkung an Polysacchariden messen kann. Geeignet sind insbesondere Verfahren zur Bestimmung der Festigkeit von Papieren, Baumwollfaden oder anderen cellulosehaltigen oder hemicellulosehaltigen Materialien, oder Verfahren zur Bestimmung der zum Zerreißen von Papier, Baumwollf den oder anderen cellulosehaltigen oder hemicellulosehaltigen Materialien nötigen mechanischen
Energie. Auch die in McQueen-Mason and Cosgrove, PNAS USA 91, 1994, 6574- 6578 und McQueen-Mason et al, Planta 4, 1992, 1425-1433 beschrieben Verfahren eignen sich zum Nachweis der Aktivität.
Zum besseren Verständnis soll die Bedeutung bestimmter Wörter und Begriffe, die in der Beschreibung, den Beispielen und angefügten Ansprüchen verwendet werden, im folgenden näher erläutert werden.
Der Begriff "Fragmente" in Bezug auf Proteine und DNA beschreibt Teile von Expansinen oder Teile der unter der SEQ ID NO. 1-4 beschriebenen Nukleinsäure bzw. Aminosäuresequenz, welche zumindest eine strukturverändemde Aktivität gegenüber Polysacchariden aufweisen.
Der Begriff "Vektor" beschreibt ein DNA-Element, das zum Einbringen exogener Nukleinsäuren in Wirtszellen verwendet wird. Ein Vektor enthält eine Nukleinsäure- sequenz, die für ein oder mehrere Polypeptide kodiert. Vektoren, die in der Lage sind, die Expression der Gene zu steuern, die sie enthalten, werden auch als "Expressionsvektoren" bezeichnet.
Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf Polynukleotide wie Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder, falls angebracht, auf Ribonukleinsäuren (RNA). Der Begriff um- fasst auch in äquivalenter Weise Analoga von RNA oder DNA, die aus Nukleotidanaloga hergestellt werden, sowie im zutreffenden Fall einzelsträngige ("Sense" oder "Antisense") und doppelsträngige Polynukleotide.
Der Begriff "Promotor" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, welche die Expression einer bestimmten DNA regulieren, die funktioneil mit dem Promotor verknüpft sind. Der Begriff umfasst auch "gewebsspezifische" Promotoren, d.h. Promotoren, die die Expression der spezifischen DNA nur in bestimmten Zellen (beispielsweise Zellen eines bestimmten Gewebes) steuern. Ebenso umfasst sind "gewebsunspezifische"
Promotoren und Promotoren, die zu einer konstitutiven Expression führen oder induzierbar sind.
Ein "Fusionsprotein" ist eine Fusion einer ersten Aminosäuresequenz kodierend für eines der vorstehend beschriebenen Expansine mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die keine Gemeinsamkeit oder grundlegende Homologie zur Expansin-Se- quenzen hat. Die zweite Aminosäuresequenz kann dabei aus demselben Organismus stammen wie die erste, oder alternativ aus einem anderen Organismus stammen (in- tergenisch). Im allgemeinen kann ein Fusionsprotein anhand der Formel X-Expansin- Y wiedergegeben werden. X und Y stehen für ein Polypeptid, das nicht in Zusam- menhang mit einer Expansin-Aminosäuresequenz steht. X oder Y können jeweils unabhängig voneinander abwesend sein.
Die Begriffe "Zelle" oder "Wirtszelle" können im Rahmen der hier vorliegenden An- meidung im gleichen Sinne verwendet werden. Es versteht sich, dass diese Begriffe sich nicht nur auf eine einzelne Zelle, sondern auch auf die Nachkommen einer solchen Zelle beziehen. Aufgrund bestimmter Modifikationen im Verlauf folgender Generationen (z.B. Mutationen), sind solche Nachkommen möglicherweise nicht mit der Stammzelle identisch, sind allerdings von der vorliegenden Erfindung mit um- fasst.
Der Begriff 'Tntron" beschreibt solche Sequenzen der beschriebenen, vorzugsweise genomischen DNA, die transkribiert, dann aber aus dem Transkript durch sogenanntes "Splicing" entfernt werden, wobei die angrenzenden Sequenzen (Exons) ver- knüpft werden.
Nukleinsäuren
Für Expansine kodierende Nukleinsäuren, wie vorstehend beschrieben, können aus- gehend von mRNA gewonnen werden, die in Pflanzenzellen vorliegt. Es ist auch möglich, die erfindungsgemäße DNA ausgehend von genomischer DNA aus den betreffenden Pflanzenzellen zu erhalten. Ein für ein Expansin kodierendes Gen kann beispielsweise aus einer cDNA- oder einer genomischen DNA-Bibliothek gewonnen werden. cDNA kann erhalten werden, indem man die gesamte mRNA einer Zelle isoliert. Ausgehend von der mRNA kann dann doppelsträngige cDNA hergestellt werden und in ein passendes Expressionskonstrukt oder einen passenden Vektor insertiert werden. Die für das erfindungsgemäße Verfahren notwendige DNA kann auch erhalten werden durch Amplifikation mit Hilfe der bekannten Polymerase- Kettenreaktion (PCR) oder auch durch de novo-DNA-S nthese (siehe auch J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Auflage, Kap. 14). Vektoren
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Vektoren, die eine Nukleinsäure kodierend für Expansine, vorzugsweise kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz ge- maß SEQ ID NO: 1-4, enthalten, die ftmktionell mit einer regulatorischen Seqzenz verknüpft sind. "Funktionen verknüpft" bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenz in einer Weise mit der regulatorischen Sequenz verknüpft ist, dass die Expression des von der Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins gesteuert werden kann. "Regulatorische Sequenzen" umfassen beispielsweise Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente. Die Vektoren enthalten beispielsweise ein Gen kodierend für ein Expansin oder Fragmente davon. Diese Vektoren können verwendet werden, um in Zellen eingebracht zu werden, wo dann die entsprechenden Expansine oder auch Fusionsproteine davon entstehen. Die Transformation kann mit dem Fachmann bekannten Methoden wie lonen-vermittelte Transformation, Elektrotransformation oder Transfektion durchgeführt werden.
Expression der Expansine
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Wirtszellen von Mikroorganismen, die eine Nukleinsäure kodierend für Expansine, vorzugsweise kodierend für ein Protein der
Aminosäuresequenz gemäß SEQ LD NO: 1-4, enthalten (z.B. in einem Vektor, einem Expressionskonstrukt oder in das Genom insertiert). Geeignete Mikroorganismen sind beispielsweise Bakterien, Hefen oder filamentöse Pilze.
Die grundlegenden Schritte zur Herstellung rekombinanter Expansine sind:
1. Gewinnung einer natürlichen, synthetischen oder semi-synthetischen DNA, die für Expansine im Sinne der Erfindung kodiert. 2. Einbringen dieser DNA in ein Expressionskonstrukt oder einen Vektor, der geeignet ist, Expansine zu exprimieren, entweder alleine oder als Fusionsproteine.
3. Transformation einer passenden Wirtszelle eines Mikroorganismus mit diesem Expressionskonstrukt oder Vektor.
4. Anzucht dieser transformierten Wirtszelle in einer Weise, die geeignet ist, Expansine zu exprimieren.
5. Aufreinigung der aus den Zellen oder aus dem Kulturmedium gewonnenen Expansine durch geeignete, bekannte Methoden.
Zum Beispiel können Vektoren, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Ex- pansine in λDE3-lysogene E. co/z-Stämme, z.B. BL21(DE3), HM S174(DE3) oder
AD494(DE3) transformiert werden. Nach dem Anwachsen der Zellen wird die Expression mit IPTG induziert. Nach einer hikubationszeit werden die Zellen aufgeschlossen, das exprimierte Protein über chromatographische Methoden gereinigt, im Fall von mit His-Tag exprimiertem Protein durch FPLC an einer Ni-NTA-Säule, im Fall von mit Streptavidin-Tag exprimiertem Protein an einer Biotin-Säule, sowie durch Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese oder auch Immunoaffinitäts- Aufreinigung, die für die Expansine spezifisch sind.
Homologe oder Fragmente der im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
Expansine können durch Mutagenese generiert werden, wie beispielsweise durch gerichtete (Punkt-)Mutagenese, oder durch Deletionen.
Bei der Expression der Expansine gemäß der vorliegenden Erfindung kann es von Vorteil sein, bestimmte Kodons zu verändern, um eine optimale Expression zu ermöglichen. Dies gilt dann, wenn die Verwendung bestimmter Kodons ("Codon usage") im heterologen Expressionssystem anders ist als in Pflanzen. Weiterhin ist die Deletion der 5'- oder 3'-untranslatierten Region möglich, beispielsweise wenn mehrere destabilisierende Sequenzmotive (z.B. ATTTA) in der 3 '-Region der cDNA vorliegen.
Fusionsproteine
Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Expansine können auch als Teil eines Fusionsproteins vorliegen. Solche Fusionsproteine werden von der vor- liegenden Erfindung voll umfasst. Fusionsproteine erleichtern unter bestimmten Umständen die Expression eines Proteins. Zum Beispiel können die Expansine als Glutathione-S-Transferase (GST-) Fusions-Proteine hergestellt werden. Solche GST- Fusions-Proteine ermöglichen eine leichte Aufreinigung des Proteins (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons, N.Y. 1991). Fusionsproteine können z.B. eine "Leader" -Sequenz enthalten, die der
Aufreinigung dient, z.B. erlaubt eine Poly-Histidin-Sequenz am N-Terminus (aber auch am C-Terminus) des Proteins dessen Aufreimgung mittels Chromatographie an einer Ni2+-NTA-Säule (siehe z.B. Hachuli et al. (1987) J. Chromatography 411, 177).
Techniken zum Herstellen solcher Fusionsproteine sind dem Fachmann geläufig.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren rekombinanten Expansine können aufgrund ihrer strukturverändernden Aktivität gegenüber Polysacchariden, insbesondere gegenüber Cellulose und Hemicellulose, beim Recyclen von Papier eingesetzt werden. Darüber hinaus können sie zur Herstellung von Pulpe aus pflanzlichem Gewebe eingesetzt werden und so zur Substitution von aggressiven Chemikalien bei der Papierherstellung dienen.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren rekombinanten Expansine können aufgrund ihrer stoikturverändernden Aktivität gegenüber Polysacchariden, insbesondere gegenüber Cellulose und Hemicellulose, auch bei der Herstellung, Behandlung und Veredelung von auf Cellulose basierenden Textilien, wie beispielsweise Baumwolle, eingesetzt werden.
Beispiele
Beispiel 1
PCR-Klonierung von Expansingenen
Alle Expansingene wurden unter Verwendung der PCR-Methode entweder aus selbst angefertigten oder aus kommerziell erworbenen cDNA-Banken amplifiziert. Die publizierten Originalsequenzen, die zur Amplifikation verwendeten Primer und die amplifizierten Expansingene sind in Tabelle 1 aufgefiihrt.
Tabelle 1
Figure imgf000017_0001
1.1 Anlegen einer cDNA Bank aus Gurkenkeimlingen
Samen der Gurkensorte Cucumis sativus Sorte euphya (Enza Zaden, Niederlande) wurden in Glasschalen auf befeuchtetem Filterpapier bei 25°C dunkel inkubiert. Nachdem die Wurzelen der Keimlinge eine Länge zwischen 2 bis 6 cm erreicht hatten, wurden sie abgetrennt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C ge- lagert. Die gesamte RNA wurde nach der Phenol/SDS-Methode zur Isolierung von pflanzlicher RNA (Ausubel et al., 1994) aus 3 g der eingefroren Keimlingswurzeln isoliert.
Aus der Gesamt-RNA wurde die Poly(A)+ RNA unter Verwendung des "mRNA direct kit" (Dynal, Hamburg) isoliert. Mithilfe des "superscript preamplification
Systems" (Gibco BRL Life Technologies, Heidelberg) erfolgte die Erststrang- Synthese der cDNA auf Basis der an magnetischen "Beads" gebundenen Poly(A)+ RNA ebenfalls nach Vorschrift der Hersteller.
1.2 Amplifikation der Expansingene
Aus den kommerziell erworbenen cDNA-Banken wurden 106 pfu (plaques forming units) zu 5 μl High-Fidelity-Puffer (Gibco BRL LifeTechnologies, Heidelberg) pipettiert und für 30 min bei 70°C inkubiert, um die in Phagen verpackte c-DNA als Template für die PCR freizusetzen. Im Fall der Gurken-cDNA-Bank wurden 80 μg der an den Beads gebundenen cDNA mit 5 μ 1 High-Fidelity-'P-Ser (Gibco BRL
LifeTechnologies, Heidelberg) vermischt und ohne vorherige Inkubation bei 70°C als Template verwendet.
Den Ansätzen wurden 0,2 mM dNTPs (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg), 1 mM MgSO4, 0,2 μM Primer forw/rev (Sequenz siehe unten), weitere 0,5 μl High-
Fidelity-Volymeτase (Gibco BRL LifeTechnologies, Heidelberg) und H2O αd 50 μl zugesetzt. In einem T3 Thermocycler der Firma Biometra, Göttingen erfolgte die Amplifikation nach folgendem Temperaturprograrnm:
Figure imgf000018_0001
Verwendete Primer
No.2: forward primer csexpOl
5 '-ttcttctttgtcttcaccgaattcgactacggtggctggcag-3 '
No.3 : reverse primer csexpOl
5 '-gcagtgtggctgatgcggccgcgaattgagggccttcatagg-3 '
No.4: forward primer leexp03 5 '-ttactaacactcacactggaattcacattctcactagctcac-3 '
No.5: reverse primer leexp03
5 '-tcaaggaaggtccagagcggccgccgattcgaactgcttacc-3 '
No.6: forward primer ntexp04 5 ' -gcaatggtctcatcagttgaattctatggtggaggaggttgg-3 '
No.7: reverse primer ntexp04
5 '-atattaaatgcttgagcaggcggccgcctgcaggtggaattgagctccagtata-3 '
Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe des „TOPO TA Cloning Kits" (Fa. frivitrogen,
Leek, Niederlande) in den pCR2.1 -TOPO- Vektor kloniert und in kompetente E. coli DH12S-Zellen (Gibco BRL LifeTechnologies, Heidelberg) elektrotransformiert. Im Anschluß wurden die Hybridplasmide mitbilfe des „QIAprep Spin Miniprep Kits" (Qiagen, Hilden) aus den entsprechenden E. coli DH12S-Klonen isoliert.
Die im pCR2.1-TOPO-Vektor inserierten Expansingene wurden unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Primer sequenziert und mit den Literaturdaten verglichen. Die Sequenz-Analyse ergab für das Tomatenexpansin die identische Sequenz (leexp3, SEQ ID NO: 3) und für das Gurkenexpansin (csexpla, SEQ ID NO: 2) eine Sequenz, die gegenüber der publizierten Sequenz drei stille Mutationen aber keine Änderung der Aminosäuresequenz aufwies. Im Fall des Täbakexpansins (ntexp4a, SEQ ID NO: 4) wurde ein Gen identifiziert, das gegenüber der publizierten Sequenz 14 Mutationen und 2 Aminosäureaustausche besitzt.
Beispiel 2
Klonierung der Expansingene in Expressionsvektoren
Zur Überführung in die Expressionsvektoren wurden die amplifizierten Expansingene durch Restriktionsverdau aus den pCR2.1-TOPO-Vektoren ausgeschnitten, in Agarosegel aufgetrennt und mit Hilfe des „QIAEX II Agarose Gel Extraktion Kits" (Qiagen, Hilden) aus dem Agarosegel isoliert. In einer weiteren Ligationsreaktion wurden sie als EcoRI-Nσtl-Fragmente in den pProΕxHTaS-Vektor (Gibco LifeTechnologies, selbst modifiziert) und als EcoRMTzoI-Fragmente in den pASK-IB A3 -Vektor (Institut für Bioanalytik, Göttingen) inseriert. Da der Zielvektor pASK-IBA3 keine Not/-Schnittstelle enthält, wurden die Εxpansinegene vor ihrer Klonierung in den pASK-LB A3 -Vektor als EcoRI-Notl-Fragmente aus dem pProΕxHTaS-Vektor ausgeschnitten, in den pProΕXHtΕXb-Vektor (Gibco BRL LifeTechnologies) subkloniert und als EcoRI-^ÖzoI-Fragmente erneut ausgeschnitten. Der pProΕxHTaS-Vektor unterscheidet sich von pProΕxHTa- Vektor dadurch, dass von Position 396 bis 401 zwei zusätzliche Stop-Codons eingebaut wurden. Die Originalsequenz -tcgaat- wurde zu -gactga- geändert.
Alle Εxpressionsvektoren wurden in kompetente E. coli BL21(DΕ3)-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA, USA) transformiert. Durch Klonierung in den pProExHT-
Vektor wurden die rekombinanten Proteinen am Ν-Terminus mit einem 6-Histidin- Tag und durch Klonierung in den pASK-IB A3 -Vektor am C-Terminus mit einem Streptavidin-Tag fusioniert (siehe Skripten der Hersteller). Beispiel 3
Expression der Expansine in E. coli
Zur Expression der Expansine wurden die rekombinanten E. coli-Stämme in LB-
Medium mit 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C angezogen. Das Wachstum der Kulturen wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm (ODÖOO) verfolgt. Nach erreichen einer OD600 von 5 erfolgte die Induktion der Expansinsynthese durch Zugabe von 1 mM LPTG (pProExHT- Vektor) bzw. 2 mg/1 Anhydrotetracyclin (pASK-LBA3-Vektor). Die Expressionskulturen wurden für 4 h bei 20°C inkubiert und anschließend durch Zentrifugation bei 6000 x g und 4°C für 15 min sedimentiert. Nach Aufnahme des Pellets in 1/100 Volumen Lysispuffer (100 mM TrisHCl pH 8, 1 mM EDTA) erfolgte der Zellaufschluss durch eine Ultraschallbehandlung bei 4°C. Zum Schutz vor proteolytischer Spaltung der re- kombinanten Expansine wurde dem Lysispuffer 0,4 mg/ml des Proteaseinhibitors
Pefabloc SC (Fa. Boehringer, Mannheim) zugesetzt.
Um die rekombinanten Proteine auf ihre Löslichkeit zu überprüfen wurden die Rohextrakte und ihre klaren Überstände im SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt. Die klaren Überstände wurde durch eine Zentrifugation der Rohextrakte für 30 min bei 16.000 x g und 4°C hergestellt.
Im Westerblot wurden die rekombinanten Expansine über ihre Fusionanteile nachgewiesen. Die Detektion der 6-His-Tag-gekoppelten Proteine erfolgte unter Ver- wendung eines monoklonalen ANTI-polyHISTIDINE Clone His-1 Antikörpers
(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) und eines mit einer Alkalischen Phosphatase gekoppelten ANTI-MOUSE IgG Antikörpers (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). Die Strep-tag-gekoppelten Proteine wurden über ein „streptavidin alkaline phosphatase conjugate"(Institut für Bioanalytik, Göttingen) detektiert. Die Detektion erfolgte nach den Angaben der Hersteller. Alle drei Gene konnten unter den beschriebene Bedingungen zu löslichen rekombinanten Proteinen exprimiert werden, die sich im Westemblot aufgrund eindeutiger Signale auf Höhe der erwarteten Molekulargewichte identifizieren ließen (CsexpOla: 27,5 kDa; Leexp03: 30,5 kDA, Ntexo04a: 27,5 kDA).
Beispiel 4
Änderung der Festigkeit von Papier durch rekombinantes Tomatenexpansin
Das in den pASK-IBA 3-Expressionsvektor klonierte Gen des Tomatenexpansins wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, in E. coli BL21(DE3) exprimiert. Die Zellen wurden sedimentiert und im 1/100 Vol. Lysispuffer resuspendiert.
Nach Ultraschall-Lyse wurden die unlöslichen Bestandteile des Rohextraktes durch
Zentrifugation (16.000 x g, 30 min, 4°C) abgetrennt und der lösliche Überstand mit einer Celluloseester-Membran (Spectra/Por CE, MWCO: 10.000, Spectrum Medical Industries Inc., Houston, Texas, USA) 4 h bei 4 °C gegen 50 mM Natrium-Acetat- Puffer pH 4,5 dialysiert.
Vier 1,5 x 4 cm messende Papierstreifen (Whatman No. 3, Whatman International Ltd., Maidstone, England) wurden jeweils zwischen zwei Edelstahlklammem gespannt, mit einem 100-g-Gewicht beschwert und in mit 50 mM Natrium-Acetat- Puffer pH 4,5 gefüllte 50-ml-Meßzylindern gehangen. Nachdem die Streifen 2 h ge- hangen hatten, wurde in zwei Ansätze 5 ml des dialysierten löslichen Rohextraktes zugegeben. Zur Kontrolle wurde den anderen beiden Ansätzen die gleiche Menge Natrium-Acetat-Puffer pH 4,5 zugesetzt. Der Einfluss des Proteinzusatzes auf die Festigkeit der Papierstreifen wurde 3 h lang beobachtet. In den beiden mit dialysier- tem löslichen Rohextrakt beschickten Ansätzen rissen die Papierstreifen nach 58 bzw. 65 Minuten ab, während sie in den Kontrollansätzen noch länger als 3 h stabil hängen blieben. Der Einsatz von löslichen Rohextrakten aus Kulturen, in denen für den Vektor pProExHt-CAT (Gibco BRL LifeTechnologies, Heidelberg) eine Chlor- amphenicol Acetyltransferase (CAT) exprimiert worden war (Kontroll-experiment), zeigte ebenfalls keine Verringerung der Papierfestigkeit.
Beispiel 5
Affinitätsreinigung des rekombinanten Tomatenexpansins
Der Stamm E. coli BL21(DE3) mit dem Expressionsvektor pASK-IBA3:leexp3 wurde bei 37°C in 2,4 Liter LB Medium in Gegenwart von 100 μg/ml Ampicillin angezogen. Nach Erreichen einer OD600 von 5 wurde die Inkubationstemperatur auf 20°C gesenkt und die Synthese des rekombinanten Tomatenexpansins durch Zugabe von 2 mg/1 Anhydrotetrazyklin (AHT) induziert. Nach weiteren 4 h wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, in 1/100 Volumen Lysispuffer resuspendiert und mittels Ultraschallbehandlung aufgeschlossen.
Nicht lösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation für 30 min bei 4°C und 16.000 x g abgetrennt. Aus dem löslichen Überstand des Rohextrakts wurde das re- kombinante Protein mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Dazu wurde das
„Strep-tag Ü-System" (Institut für Bioanalytik, Göttingen) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach den Protokoll des Herstellers. Der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen wurde mit dem BIO-RAD PROTEIN ASSAY, (BIO-RAD Laboratories, München) gemessen.
Nach SDS-PAGE- und Westemblot-Analyse wurden in 4 Fraktionen Signale identifiziert, die dem erwarteten Molekulargewicht des Tomatenexpansins von 30,5 kDa zuzuordnen waren. Beispiel 6
Einfluß des rekombinanten affinitätsaufgereinigten Tomatenexpansins auf die Festigkeit von Papier
Um den Einfluss des rekombinanten und mittels Affinitätschromatographie gereinigten Tomatenexpansins (siehe Beispiel 5) messen zu können, wurde das Spannungs-Dehnung-Profil von Papier (Whatman No. 3, Whatman International Ltd., Maidstone, England) nach der modifizierten DIN 53455 aufgenommen. Ab- weichend von der DIN 53455 wurde in Flüssigkeit getränktes Papier verwendet. Das
Papier wurde in Streifen des Formats "Probekörper 3" ausgestanzt.
Das Spannungs-Dehnungs-Profil wurde mit einer Universal Prüfmaschine Typ 1455 (Zwick GmbH, Ulm) aufgenommen. Die Papierstreifen wurden mit einer Ge- schwindigkeit von 0,5 mm/min über eine Stecke von 7,5 cm gedehnt, wobei die angelegte Spannung σ in N/mm2 und die Dehnung ε in % der Streifenlänge gemessen wurden. Zur Auswertung wurde die auf die Fläche bezogene mechanische Energie herangezogen (ME [mm*MPa]), die aufgewendet werden musste, um das Papier zu zerreißen. Diese Größe charakterisiert die Festigkeit des Papiers und errechnet sich aus dem Integral der Spannungs-Dehnungs-Funktion.
Vier Ansätze mit je vier Papierstreifen wurden in Glasschalen gelegt. Bezogen auf je einen Streifen wurde das Papier mit den nachfolgend aufgeführten Lösungen befeuchtet, bevor die Ansätze mit 80 ml 50 mM Natrium-Acetat-Puffer pH 4,5 aufge- füllt und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Im Anschluss daran wurde das Spannungs-Dehnungs-Profils aufgenommen. Neben dem affinitätsge- reinigten und in Elutionspuffer (Skript zum Strep-tag Il-System, Institut für Bioanalytik, Göttingen) gelösten Tomatenexpansin wurde als Kontrolle ebenfalls in Elutionspuffer gelöstes Rinderserumalbumin (BSA; Boehringer, Mannheim) sowie reiner Elutionspuffer eingesetzt. Ansatz 1 (erfindungsgemäß): 650 μl (0,4 ml 500 mM Natriumacetat pH 4,5 + 1,0 ml
Elutionspuffer + rekombinates, affimtätsgereinigtes Tomatenexpansin, Gesamtproteingehalt 1,5 mg)
Ansatz 2 (Kontrolle) 650 μl (0,4 ml 500 mM Natiumacetat pH 4,5 + 1,0 ml Elutionspuffer) Ansatz 3 (Kontrolle) 650 μl (0,4 ml 500 mM Natiumacetat pH 4,5 + 1,0 ml Elutionspuffer + Rinderserumalbumin, Gesamtproteingehalt 2,0 mg))
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt
Tabelle 2: Einfluss von affinitätsgereinigtem rekombinantem Tomatenexpansin auf die Festigkeit von Papier
Figure imgf000025_0001
Die Ergebnisse der beiden Versuche zeigen, dass rekombinantes Tomatenexpansin die Festigkeit des Papier beeinflusst, während BSA selbst in hohen Konzentrationen keine signifikante Wirkung ausübt.
Literatur:
Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New York
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Claims

Patentansprflche
1. Vektoren, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine sowie eine funktionell damit verknüpfte Sequenz, welche die Expression der Nuklein- säure in Mikroorganismen ermöglicht.
2. Vektoren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 kodiert.
3. Vektor gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mit der
Nukleinsäure _-unktionell verknüpfte Sequenz eine regulatorische Sequenz ist.
4. Vektor gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass er die Expression der Nukleinsäure in Bakterien oder Pilzen ermöglicht.
5. Vektor gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass er die Expression der Nukleinsäure in E. coli ermöglicht.
6. Vektor gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um pProExHT oder pASK-LBA3 handelt.
7. Wirtszelle eines Mikroorganismus, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine oder einen Vektor gemäß Anspruch 1.
8. Wirtszelle gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ LD NO: 1-4 oder einen Vektor gemäß Anspruch 2 enthält.
9. Wirtszelle nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um einen Mikroorganismus aus der Reihe Bakterien und Pilze handelt.
10. Wirtszelle nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 7 bis
9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um E. coli handelt.
11. Wirtszelle gemäß Anspruch 10 enthaltend einen Vektor aus der Reihe pProExHT und pASK-IBA3, umfassend eine Nukleinsäure kodierend für ein
Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 sowie eine funktionell damit verknüpfte regulatorische Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in E. coli-Zellen ermöglicht.
12. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen, dadurch gekennzeichnet, dass es
a) das Kultivieren einer Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure kodierend Expansine oder einen Vektor, umfassend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine sowie eine damit funktionell verknüpfte
Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle gewährleistet, unter Bedingungen, die diese Expression gewährleisten und
b) die Gewinnung des Expansines aus der Zelle oder dem Kulturmedium
umfasst.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklein- säure eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass Vektoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 eingesetzt werden.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 12 bis
14, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine Wirtszelle gemäß den Ansprüchen 7 bis 9 ist.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirtszellen E. coli-Zeϊen eingesetzt werden.
17. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorangegangenen Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der Wirtszellen bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase erfolgt.
18. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorangegangenen Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein induzierbarer Vektor eingesetzt wird und die Induktion der Expansinsynthese bei Temperaturen von 1 bis 30°C er- folgt.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der Wirtszellen bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase erfolgt.
20. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorangegangenen Ansprüche 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Induktion in einem Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden erfolgt.
21. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorangegangenen Ansprüche 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewinnung der rekombinanten Expansine durch Aufschluss der Wirtszellen erfolgt.
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufschluss der Wirtszellen bei einer Temperatur von 0 bis 30°C erfolgt.
23. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen, dadurch gekennzeichnet , dass
a) die Kultivierung von E. coli-Zellen enthaltend einen induzierbaren Vektor umfassend eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SΕQ ID NO: 1-4 sowie eine damit funktionell verknüpfte regulatorische Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in E. coli gewährleistet, bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase erfolgt,
b) die Induktion der Expansinsynthese bei Temperaturen von 1 bis 30°C in einem Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden erfolgt und
c) die Gewinnung der Expansine durch Aufschluss der Zellen bei Temperaturen von 0 bis 30°C erfolgt.
24. Rekombinante Expansine, herstellbar nach einem Verfahren gemäß den An- Sprüchen 12 bis 23.
25. Verwendung von rekombinanten Expansinen bei der Herstellung, Behandlung und Veredelung von auf Cellulose basierenden Textilien.
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