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WO2001081423A1 - Antikörper gegen natives gp96, deren herstellung und verwendung - Google Patents

Antikörper gegen natives gp96, deren herstellung und verwendung Download PDF

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Publication number
WO2001081423A1
WO2001081423A1 PCT/EP2001/004382 EP0104382W WO0181423A1 WO 2001081423 A1 WO2001081423 A1 WO 2001081423A1 EP 0104382 W EP0104382 W EP 0104382W WO 0181423 A1 WO0181423 A1 WO 0181423A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
antibodies
sequence
native
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2001/004382
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Terness
Christian Kleist
Gerhard Opelz
Martin Welschof
Danièle ARNOLD-SCHILD
Hansjörg Schild
Hans-Georg Rammensee
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DR FENNING BIOMED GmbH
Original Assignee
DR FENNING BIOMED GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DR FENNING BIOMED GmbH filed Critical DR FENNING BIOMED GmbH
Priority to AU2001273950A priority Critical patent/AU2001273950A1/en
Publication of WO2001081423A1 publication Critical patent/WO2001081423A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6043—Heat shock proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/622—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier non-covalent binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • Antibodies against native gp96 their production and use
  • the invention relates to recombinant antibodies against native gp96, processes for their preparation, their use, separating materials, devices and kits comprising the said antibodies, peptides bound to native gp96 and their isolation, nucleic acid sequences which code for the said recombinant antibodies and host cells which produce them contain the named DNA and enable the production of corresponding antibodies, as well as further aspects described below.
  • gp96 which belongs to the group of heat shock proteins, is a protein which is able to associate with peptides in the endoplasmic reticulum (ER) and thus to form an immunogenic context with them . If such gp96 / peptide complexes are injected into mice, strong immune responses can be induced. These immune responses are specific to the associated peptides, as evidenced by induction of specific responses by cytotoxic T lymphocytes.
  • the high effectiveness of gp96 in particular can possibly be explained by the fact that antigen-presenting cells (e.g. macrophages, dendritic cells) carry receptors that are specific for heat shock proteins and enable them to be absorbed efficiently. Based on these applications, heat shock proteins can be used for cancer immunotherapy in mice (see Tamura et al., Science 271, 117-120 (1994)). They also appear to be ideal adjuvants for immunotherapy protocols tailored to individual patients.
  • the antibodies previously produced by conventional immunization protocols are of very limited suitability because they react only weakly with the native gp96 - possibly because the native gp96 is present intracellularly in the ER in the animals used for immunization, that in the resulting B cell hybridoma
  • the antibody present is also present in the ER and there is interference with the normal gp96 function in the hybridoma cells by reaction of native gp96 with the antibody formed, which does not allow the corresponding hybridoma cells to perform their function.
  • the object of the present invention is to provide antibodies which enable the practically exclusive recognition of native gp96. This task could now be solved by using recombinant antibodies.
  • the present disclosure describes the construction of antigen-binding domains of gp96-specific antibodies starting from a semi-synthetic immunoglobulin gene library.
  • the resulting single chain antibodies (scFvAbs) are used for a rapid one-step chromatographic purification method for the isolation of gp96 molecules. These are still able to trigger specific immune responses, such as native gp96 molecules, which are obtained using more complex conventional protocols, in which ConA-Sepharose column chromatography and further purification steps are used.
  • the ConA-Sepharose treatment leads to contamination with ConA as a result of "column bleeding". Because ConA is a T cell mitogen, it can interfere with a person's immune system or interfere with an animal to be vaccinated.
  • proteases such as cathepsin E
  • gp96 preparations purified in a conventional manner All the potential risks that exist due to the contamination of gp96 can be avoided by using the affinity purification according to the invention by means of recombinant scFv antibodies. In addition, they accelerate the cleaning process and allow the processing of small tumor samples. These features make the recombinant anti-gp96 antibodies an ideal tool for the purification of gp96, which can then also be used in the treatment itself, for example of cancer and infectious diseases.
  • FIG. 1 shows the sequence analysis of the recombinant scFv antibodies.
  • the amino acid sequences of the V H and the V L chain sections are shown.
  • the V H segments of the B10C, G12D and H11B clones belong to the V H 1 gene family and are derivatized from the germline gene DP-3.
  • the V L gene segment sequences are identical in all clones and match the V ⁇ 3 gene segment IGLV3S1 / DPL16.
  • the determined V H and V L sequences were compared to sequences from the V Base (Medical Research Council, Cambrdige, supra), the GenBank and the EMBL sequence database.
  • the interruptions within the sequence representation in each case within the sequence of the heavy and the light chain should not mean missing binding, but only make it easier to recognize different sections (FR1, CDR1 etc.).
  • sections FR1 to FR4 of the heavy chain and FR1 'to FR4' of the light chain form a coherent chain.
  • Figure 2 This figure shows the DNA sequences underlying the amino acid sequences in Figure 1.
  • the start of the scaffolding and complementary deteming regions (FR1, CDR1 etc.) is indicated above the coding triplets.
  • CDR2 CTT GTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATA TAC GCA GAG AAG
  • TTC CAG GGC SEQ ID NO: 17;
  • CDR2 CTT GTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATA TAC GCA GAG AAG
  • TTC CAG GGC SEQ ID NO: 17;
  • CDR2 CTT GTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATA TAC GCA GAG AAG
  • Purified scFv Abs are examined for binding to mouse gp96, using a nitrocellulose membrane (1) under reducing conditions (SDS plus ß-mercaptoethanol), (2) denaturing conditions (SDS) and (3) native (PBS) conditions is examined.
  • the membrane is developed with mouse IgG anti-human c-myc monoclonal, polyclonal peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse IgG and substrate.
  • Fig. 4 Precipitation of native gp96 from mouse tumor cell lysates. Hypotonic lsyates of radiolabeled IGELa2 cells are incubated with the antibodies mentioned, followed by protein G-Sepharose precipitation and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The control lane shows precipitation only with protein G Sepharose alone as a control.
  • (1) control
  • (2) anti-BiP (SPA-847)
  • (3) anti-gp96 (SPA-850)
  • (4) scFv (clone H11B).
  • Fig. 6 Activation of CTL by scFv-purified gp96 molecules.
  • C57BL / 6 mice are i.p. with PBS (A), gp96 bound to anti-gp96-scFv-Sepharose (B), untreated (C), gp96, purified according to standard methods (D), pH 10, 5-eluted gp96 molecules (E) and 1.3 M NaCl eluted gp96 molecules immunized.
  • splenocytes are incubated with irradiated BALB.B cells for 5 days and the CTL activity is measured on C57BL / 6 (filled circles) and BALB.B (filled triangles) ConA blasts.
  • (9) % specific lysis
  • (10) E: T ratio.
  • the invention relates to recombinant antibodies which bind native gp96, in particular those which determine the third complement-determining region (CDR3) from a variable portion of a heavy chain of an antibody according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 (FIG. 1), in particular those which in FIG. 1 (a) contain the sections CDR3 derived from the variable part of a heavy chain of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3; CDR2 of the sequence SEQ ID NO: 4; and CDR
  • CDR3 third complement-determining region
  • the invention also relates to the use of the recombinant antibodies mentioned for the purification or labeling of gp96.
  • the invention also relates to the use of the above recombinant antibodies for the (rapid) purification of intact gp96 / peptide complexes from small amounts of tumor material or infected cells, which can then be used for autologous or heterologous immunotherapy.
  • the invention also relates to gp96 with bound peptides which can be obtained or has preferably been obtained by the purification method described above, in particular for use in a method for (preferably autologous) immunization, and pharmaceutical formulations which contain a product which can be obtained by the purification method described above. in particular obtained, gp96 / peptide complex and possibly further carrier materials.
  • the invention also relates to gp96 with bound peptides according to the last paragraph for use in a method for therapeutic treatment of the human or animal body, in particular for heterologous or, above all, autologous immunization; the use of the corresponding gp96 with bound peptides for the production of a medicament for (in particular autologous) immunization in patients suffering from a tumor disease or an infection, and the use of the corresponding gp96 with bound peptides for the immunization of these patients or methods for (in particular autologous ) Immunization of patients by administering gp96 according to the previous paragraph to a patient who has a tumor or an infection and needs such treatment.
  • the invention also relates to the isolation of peptides which are bound to native gp96 from warm-blooded cells, in particular in warm-blooded animals which suffer from a disease, for example ischemia (for example as a result of an infarction or from atherosclerosis), a tumor disease or an infection and the like Peptides as new and their use.
  • a disease for example ischemia (for example as a result of an infarction or from atherosclerosis), a tumor disease or an infection and the like Peptides as new and their use.
  • the invention also relates to separation materials (matrices) and devices for purifying native gp96, which comprise the recombinant antibodies according to the invention.
  • the invention also relates to kits for the purification or detection of native gp96, which comprise the recombinant antibodies according to the invention.
  • the invention also relates to nucleic acid sequences, in particular DNA sequences, which code for recombinant antibodies according to the invention.
  • the invention also relates to host cells, in particular prokaryotes such as E. coli, which comprise sequences coding for recombinant antibodies according to the invention.
  • a recombinant antibody that binds native gp96 is a protein made up of one or more non-covalently or covalently linked peptide chains that define the complementarity-determining regions that bind to native gp96
  • CDR comprises, whereby glycosylations or other derivatizations can also be present; these are in particular antibodies constructed in the usual way from a heavy and a light chain, which are covalently linked to one another, for example via disulfide bridges or in some other way, or preferably a fragment of such an antibody, in particular of the F (ab) 2 type, or in particular single chain antibodies (sc Abs) with all complementarity-determining regions on a polypeptide chain, which also have further sequences, such as framework sequences, linker sequences, marker sequences (for example c-myc) or sequences which allow a specific separation, for example for IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography), and / or can also be present as an aggregate of two or more such chains, as is frequently found (both the actual single chains and their aggregates are shown in - The following is meant when talking about scFv antibodies (Abs) - The minimum for such single chains consists of the so-called Fv fragments, which include the
  • Recombinant means that at least part of the sequence of the corresponding antibody is modified by methods of recombinant genetic engineering, the corresponding antibody also being able to be produced by enzymatic or chemical means or preferably by expression of suitable nucleic acid sequences in a host organism.
  • CDR Complementarity-determining regions
  • Antibodies are preferred which comprise the third complementarity-determining region (CDR3) of the heavy chain of an antibody according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 (FIG. 1), in particular those which in FIG. 1 (a), the parts derived from variable heavy chain sequences CDR3 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 4) and CDR 1 (SEQ ID NO: 5 or in particular SEQ ID NO: 6) and (b) those of CD 1 '(SEQ ID NO: 7), CDR2' (SEQ ID NO: 8) and CDR3 '(SEQ ID NO: 9).
  • Antibodies are also possible in which these CDR are separated from one another by framework regions other than those shown in FIG. 1 (FR).
  • the invention also relates to native gp96-binding antibodies which contain variants of the sequences identified as preferred, for example variants which result from a DNA which have been subjected to in vitro mutagenesis, the condition being that they still have the binding capacity mentioned , in particular in the case of conventional measurement methods for affinity determination, have at least twice, preferably at least 10 times stronger affinity for slightly denatured or, in particular, native gp96 than the antibody SPA-850, which recognizes a primary (sequence) structure of gp96, which is native as well is present in denatured gp96 and is therefore not selective for native gp96, see below).
  • modifications may consist in addition, substitution or deletion of amino acids, preferably up to 5, e.g.
  • an amino acid - particularly preferred are those recombinant antibodies which have an optimal affinity high enough for strong gp96 binding but still release again the same from gp96 / antibody complexes allowed to release the bound gp96 again, which is essential for the purification methods described below.
  • conservative exchanges are preferred, for example the replacement of one hydrophobic amino acid by another, one acidic by another, one basic by another, from Ser by Thr, an armatic by another or the like, or further addition a homologous amino acid so that an amino acid is replaced by two homologous amino acids, or deletion of an amino acid.
  • framework regions FR such as, for example, the FR1 to FR4 on the heavy chain, FR1 'to FR4' on the light chain, as shown in FIG. 1
  • framework regions FR such as, for example, the FR1 to FR4 on the heavy chain, FR1 'to FR4' on the light chain, as shown in FIG. 1
  • other amino acid sequences which impair the ability of the antibodies to bind to easily denatured or in particular have native gp96).
  • Particularly preferred recombinant antibodies are those which contain at least one of the sequences for the variable parts of the heavy chains according to FIG. 1 for one of the clones G12D, H11B or B1 OC (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; or SEQ ID NO 12), in particular the mutant with a CDR 1 of the sequence DYYMY (SEQ ID NO: 6), which could not be expected with the method described in the examples, that is to say the sequence for the variable section of a heavy chain of the clone H11B (SEQ ID NO: 12); and the sequence for the variable section of the light chain according to FIG. 1 (SEQ ID NO: 13), which are separated from one another if necessary by a suitable spacer section.
  • Native gp96 is one that essentially corresponds to the conformation of the cell normally present in the ER and is still able to bind the antigenic peptides bound under physiological conditions so that they can be isolated in complex with gp96 - with others Words that 3D
  • the purification of gp96 is accomplished by conventional methods, for example by precipitation of the gp96 from solutions such as cell lysates, provided that at least two binding sites per recombinant Antibodies for gp96 are present or aggregates of such recombinant antibodies are present, or if further anti-antibodies are used which have more than one binding site for sequences on the recombinant antibodies according to the invention (for example c-myc sequences) and are thus able to crosslink, in particular if the anti-antibodies are polyclonal; cleaning after binding an antibody according to the invention to a suitable particulate carrier material with an adequately large surface area, for example to a gel matrix based on carbohydrates or plastics, such as, in particular, Sepharose, is preferred.
  • a suitable particulate carrier material with an adequately large surface area, for example to a gel matrix based on carbohydrates or plastics, such as, in particular, Sepharose, is preferred.
  • the purification can then be carried out by binding in suspension or by applying the sample to be purified to a column which is filled with a matrix comprising a bound recombinant antibody. It is also possible to bind to membranes, for example nitrocellulose, which are coated with the corresponding recombinant antibody, or corresponding other carrier materials.
  • the gp96 bound in this way is eluted with suitable solutions, in particular with slightly basic (pH preferably between 7, 2 and 12, in particular between 7, 2 and 10.5; adjusted, for example, with the aid of organic bases, in particular nitrogen bases, such as triethanolamine) and / or saline eluents, in particular 0.3 to 4, preferably 0.5 to 1.5 M salt solutions, such as 0.7 to 1.5 M salt solution, preferably with common salt (NaCl) as the salt.
  • suitable solutions in particular with slightly basic (pH preferably between 7, 2 and 12, in particular between 7, 2 and 10.5; adjusted, for example, with the aid of organic bases, in particular nitrogen bases, such as triethanolamine) and / or saline eluents, in particular 0.3 to 4, preferably 0.5 to 1.5 M salt solutions, such as 0.7 to 1.5 M salt solution, preferably with common salt (NaCl) as the salt.
  • a pH in the range between 6 and 8 is preferably chosen and an increased salt concentration, in particular 0.7 to 1.5 M saline in the presence of a buffer such as phosphate buffer.
  • the labeling (ie, qualitative or quantitative determination) of gp96 can be carried out, for example, with conventional assays for the detection of antigens with antibodies. So they can recombinant antibodies according to the invention preferably themselves directly contain sequences which enable labeling (for example sequence sections which have an enzyme function and thus enable detection directly by reaction with appropriate substrates, or can be recognized by antibodies directed against them, which in turn can be detected by standard methods ), for example as phosphatase, e.g. alkaline phosphatase from E. coli or alkaline phosphatase from mammals (e.g. from beef), peroxidases, such as horseradish peroxidase (with e.g.
  • immunoassays in particular radio-immunoassays and especially immunofluorescence labeling, immunoblotting, enzyme immunoassays, in particular EIA or ELISA, or dot assays
  • EIA or ELISA enzyme immunoassays
  • dot assays can be carried out in order to gp96 to prove qualitatively and / or quantitatively.
  • the rapid purification is preferably achieved by separating a cell lysate (if necessary pre-clarified by ultracentrifugation) over a column which is loaded with a matrix which carries bound recombinant antibodies according to the invention (see above under Purification, where suitable elution conditions are also given), especially about appropriately modified Sepharose.
  • the immunotherapy uses the gp96 obtained in this way, which is essentially in its native form if appropriate elution conditions are selected (see above or in the examples), and bound peptides from the tumor cells or the infected cells are present, which are characteristic of disease states such as Ischemia, cancer or infection.
  • heterologous immunotherapy is also possible, for example if several patients are infected by the same pathogen or have the same tumor disease.
  • Tumor disease means a proliferative disease, for example solid tumors or blood cancer, including any metastases that may be present.
  • the cells used to isolate the gp96 should then in particular comprise tumor cells.
  • “Infected” means that the corresponding cells are infected by a microorganism, such as a virus, bacteria, mycoplasmas, a fungus or a parasite, such as protozoa.
  • the immunotherapy is carried out by enteral (eg nasal) or preferably parenteral, in particular intramuscular, subcutaneous or further intracranial or intralumbar administration of a gp96 / peptide complex purified as described above to a patient, preferably one in need of such treatment, in the absence or presence of further adjuvants, such as aluminum hydroxide, lysolecithin, Pluronic polyols, polyanions, peptides, muramyldi or tripeptides, squalene mixtures (SAF-1), saponin derivatives, cell wall preparations of mycobacteria, Quil A, subunit B from cholera emulsions , or combinations of two or more of them.
  • enteral eg nasal
  • parenteral in particular intramuscular, subcutaneous or further intracranial or intralumbar administration of a gp96 / peptide complex purified as described above
  • further adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, Plur
  • the invention thus also relates to the use of the recombinant antibodies according to the invention for the purification of gp96 from cells or tissue samples, in particular from a patient who suffering from a disease, such as ischemia (e.g. as a result of an infarction), a tumor or an infection, and (especially in the case of an infection or a tumor disease) the subsequent administration of the gp96 thus obtained to a patient, in particular one who has such Treatment is required for autologous or further heterologous immunization.
  • a disease such as ischemia (e.g. as a result of an infarction), a tumor or an infection, and (especially in the case of an infection or a tumor disease)
  • ischemia e.g. as a result of an infarction
  • a tumor or an infection e.g. as a result of an infarction
  • the subsequent administration of the gp96 thus obtained to a patient, in particular one who has such Treatment is required for autologous or further heterologous
  • the invention also relates to gp96 with bound peptides, which can be obtained or has preferably been obtained by the purification method described above, in particular for use in a method for (preferably autologous) immunization, and pharmaceutical formulations which can be obtained by the purification method described above. in particular obtained, include gp9 ⁇ / peptide complex and possibly further carrier materials.
  • Particularly suitable carrier materials are physiologically acceptable carrier materials, in particular physiological saline, phosphate-buffered physiological saline, sterile water and optionally adjuvants, as mentioned above. Other buffering and dispersing carrier materials can be used.
  • physiological saline physiological saline
  • phosphate-buffered physiological saline sterile water
  • optionally adjuvants as mentioned above.
  • Other buffering and dispersing carrier materials can be used.
  • the skilled person knows the possible compositions, examples can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R.
  • compositions are sterilized and packaged using conventional methods, e.g. in ampoules or jars, or administered directly.
  • concentration of gp96 / peptide complements can vary, for example from approximately 0.001 to 20% by weight, preferably from 0.01 to 0.5%.
  • a dose is administered during administration which is normally suitable for stimulating an immune response (in particular based on cytotoxic T lymphocytes).
  • the dose depends on the individual patient parameters such as size, age, gender and condition, but will normally preferably be in the range from 0.001 to 20,000 ⁇ g, preferably 0.005 to 4,000 ⁇ g gp96 / peptide complex per kg patient weight.
  • Isolation of peptides bound to native gp96 from warm-blooded cells, particularly warm-blooded animals suffering from a disease, e.g. Ischemia (e.g. as a result of an infarction), a tumor disease or an infection is possible by releasing native gp96, which has bound such peptides, according to the invention from corresponding gp96 / peptide complexes (for example by changing the ionic strength, increasing the basicity, for example by means of Separates nitrogen bases, such as triethanolamine, to a pH between 7.4 and 12, preferably between 9 and 11.5) and, if necessary, for example by gel filtration from the gp96.
  • the peptides can then be further investigated (e.g.
  • corresponding peptides are also the subject of the present invention, as well as their use, for example in immunization protocols.
  • Chromatographic columns which are filled with a matrix which comprises a recombinant antibody according to the invention are to be mentioned in particular as devices for cleaning.
  • Such basic atrices are found in particular for the production of the matrix with functional groups, such as hydroxyl, carboxy, amino, epoxy, diene or mercapto groups, which allow coupling with an antibody according to the invention, in particular those based on polymers, such as those based on polyacrylic or polyacrylic derivatives (in particular oxirane-modified, such as in the case of Eupergit (Röhm Phar a, Darmstadt) or in particular on the basis of activated polymeric carbohydrates, such as cyanogen bromide-activated Sepharose (especially Sepharose 4, 4B or 6MB), and the antibody-modified matrices according to the invention are based on this of polymers, such as polyacrylic or its derivatives (eg Eupergit), or based on polymeric carbohydrates, which carry antibodies according to the invention (preferably covalently bound) .
  • a matrix (carrier material), as described above - in particular Sepharose - which carries an antibody according to the invention, in particular if it is covalently bound, is itself the subject of the invention.
  • a corresponding device preferably also comprises a column which contains a matrix coated with a non-specific material, in particular serum albumin, such as bovine serum albumin (as described above, but with a ligand other than the recombinant antibody), which is suitable for precleaning (as a precolumn) and preferably directly upstream of the actual column occupied by the recombinant antibody.
  • Kits for the purification or detection of native gp9 ⁇ which comprise the recombinant antibodies according to the invention, are in particular those which have a chromatographic column as described in the last paragraph and required further components, such as a precolumn also described above and, if appropriate Buffer salts or buffer solutions, eluents, or the like, and if desired also detection systems for isolated native gp96 or peptides bound to it, such as components of corresponding immunoassays or the like, can contain, for example antibodies against c-myc, anti-antibodies against these antibodies, for example with a Enzyme as a component of an enzymatic detection system, such as a peroxidase, are marked, as well as corresponding reagent solutions and substrates for these enzymes.
  • the invention also relates to nucleic acid sequences, in particular DNA sequences, which code for recombinant antibodies according to the invention. Preference is given to those nucleic acid sequences which, as the nucleic acid sequence coding for the variable section of a heavy chain, are one of those in FIG. 2 and its legend for the CDR 3 from the clones B1 OC (SEQ ID NO: 23), G12D (SEQ ID NO: 24) or H11B (SEQ ID NO: 25), and / or as the nucleic acid sequence coding for the variable portion of a light chain include the one shown for the CDR3 'in Fig. 2 and its legend (SEQ ID NO: 22), as in parentheses each indicated above; as well as any sequences FR1 to FR4 and FR1 'to FR4' coding for framework regions.
  • nucleic acid sequences which, as the nucleic acid sequences coding for the variable section of a heavy chain for CDR1, comprise one of the sequences mentioned in FIG. 2 and its legend with SEQ ID NO: 18 or in particular SEQ ID NO: 19, for which CDR2 Sequence according to SEQ ID NO: 17 and for CDR3 one of the sequences according to SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, and / or as the nucleic acid sequence coding for the variable portion of a light chain that for CDR1 ' according to SEQ ID NO: 20, for the CDR2 'according to SEQ ID NO: 21 and for the CDR3' according to SEQ ID NO: 22 in FIG. 2 and their sequences; as well as any sequences FR1 coding for framework regions to FR4 and FR1 'to FR4', in particular those mentioned in FIG. 2 and its legend.
  • nucleic acid sequences which, as the coding sequence for the variable part of the heavy chain, that of clone S1 OC (SEQ ID NO: 23), clone G12D (SEQ ID NO: 24) or in particular the clone shown in FIG. 2 H11B (SEQ ID NO: 25) comprise and / or as the sequence coding for the variable part of the light chain that shown in FIG. 2 for all clones (SEQ ID NO: 26).
  • nucleic acid sequences are particularly preferred, in which the sequences coding for the variable sections of the heavy and light chain are contained in one and the same nucleic acid strand (coding for single-chain antibodies).
  • nucleic acid sequences which are also suitable for further sequences, such as Gerüs sequences, linker sequences, marker sequences (e.g. c-myc) or sequences which allow specific separation, e.g. for IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) encoding sequence sections.
  • marker sequences e.g. c-myc
  • IMAC Immobilized Metal Affinity Chromatography
  • nucleic acid sequences according to the invention also include those which code for the amino acid deletions, insertions or substitutions mentioned above for antibodies which contain variants of the sequences designated as preferred, thus itself contain corresponding deletions, insertions or substitutions of nucleic acids.
  • nucleic acids are varied (deleted, inserted or substituted).
  • vectors such as plasmids, cosmids or the like, which comprise one of the sequences mentioned and which can be expressed in suitable host cells.
  • a preferred vector is based on the pHEN1 or pHOG 21 vector (see examples).
  • Suitable host cells are those which can be cultivated in vitro.
  • Eukaryotic or in particular prokaryotic cells e.g. Yeasts, such as Saccharomyces cerevisiae, mammalian cells, hybridomas or in particular bacteria, such as E. coli, which are transformed by suitable vectors.
  • Eukaryotic host cells are required for the production of glycosylated antibodies, and bacteria are particularly suitable for the production of single-stranded antibodies. Examples of bacteria are especially those that are low in restriction or modification enzymes, such as E. coli, e.g. E. coli X776, E.coli TG1 or in particular E.coli XL1 -Blue (Stratagene).
  • the antibodies, host cells (including cultivation and transformation), labeled antibodies, devices, etc. are produced by methods known per se, for example analogously to the methods mentioned in the examples.
  • slightly denatured or native GP96-binding antibodies, methods, vectors and devices mentioned in the examples are particularly preferred.
  • mice are from Charles River WIGA
  • mice are from Harlan Winkelmann
  • the monoclonal antibodies against gp96 (anti-Grp94, SPA-850, clone 9G10) and against BiP (SPA-827, clone 10C3) are from StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Canada.
  • Cell culture and CTL assay The mouse cell line IGELa2 and the human C1 cell lines are from ATCC, Rockville, MD, USA; they are cultured in RPMI 1640 containing 10% fetal calf serum and supplemented with 0.3 mg / ml L-glutamine, penicillin / streptomycin (100 units / ml) and 2-mercaptoethanol (2 ⁇ l / l).
  • CTL lines are obtained by weekly stimulation with irradiated spleen cells from BALB.B mice (using a cesium ⁇ radiation source).
  • CTL assays are carried out as described in the literature (Arnold et al., J. Exp. Med. 182, 885-889 (1995)) using ConA blasts (concanavalin A-activated T cells) from spleen cells as target cells. Con A blasts are also produced as described in the last-mentioned publication.
  • the standard method for purifying gp96 is described in PK Srivastava, METHODS: A Co panion to Methods Enzymol. 12, 165-71 (1997) and includes purification using ConA-Sepharose and MonoQ anion exchange chromatography.
  • a semisynthetic phage display library which consists of 50 different human germline genes for heavy chains with CDR3 loops randomized in sequence and a constant human V ⁇ 3 gene of a light chain and has a complexity of more than 10 8 clones (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1997), is used for the selection of single-chain Fv (scFv) antibodies (Abs).
  • synthetic CDR3 loops are used, which randomized sequences of 4-12 amino acids have inserted into 50 variable sections of heavy chains, then the repertoire of sections of heavy chains obtained is inserted into the phagemid vector pHEN1 (see Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res.
  • coli TG1 are 5 x 10 12 colony-forming units (cfu) in phosphate-buffered saline (PBS; 150 mM NaCl, 150 mM sodium phosphate, pH 7.2 with 2% skimmed milk powder (MPBS) in Nunc Maxisorb immune tubes (Nunc, Roskilde, Denmark) coated with 80 ⁇ g mouse gp96 (mgp96), for panning. Unspecifically bound phages are removed by intensive washing. Specific phages are eluted with 100 mM triethylamine (pH12) and expanded after neutralization and used for further selection steps until a total of four have been carried out.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • MPBS skimmed milk powder
  • the binding specificity is determined by ELISA: microtiter plates are coated with mgp96 (0.5 ⁇ g / well), blocked with 2% skim milk powder solution and then mixed with phage particles (10 10 cfu).
  • Commercially available polyclonal chicken anti-gp96 serum (1: 500) serves as a positive and PBS as a negative control.
  • the gene segments of the three specific scFv-Abs (B10C, G12D and H11B) are obtained by Ncol-Notl digestion into the plasmid pHOG21 (see Kipryanov et al., J. Immunol. Meth. 200, 60-77 (1997)) ligated and expressed in E. coli XL1-Blue (Stratagene).
  • the soluble fraction of the periplasmic extract and the culture supernatant are combined, concentrated and dialyzed against 50 mM Tris-HCl, 1M NaCl, pH 7.0.
  • the samples are applied to a "Chelating Sepharose Fast Flow Column” (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden), which has been previously loaded with Ni 2+ ions and equilibrated with dialysis buffer. After extensive washing, the bound material is eluted with 250 nM imidazole and dialyzed against PBS. The purity is checked by means of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (not shown).
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • 500 ng mgp96 are applied to nitrocellulose membranes under native (PBS), denaturing (2% SDS) or reducing (100 mM ⁇ -mercaptoethanol) conditions. Both the western and dot blot membranes are blocked with 2% MPBS.
  • the mgp96 is detected using rat IgG anti-Grp94 (SPA-850, StressGen Biotechnologies) and peroxidase conjugated rabbit anti-rat IgG (DAKO, Glostrup, Denmark) or with the scFv antibodies.
  • All scFv Abs carry a c-myc marker, which allows labeling with mouse IgG anti-human myc (Genosys, The Woodlands, USA) and peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse antibody (DAKO).
  • the detection of soluble scFv Abs can be determined with a range of concentrations (1/1 to 1/8192). 3 shows the results of the dot blot analysis.
  • scFv Abs show only binding to the native protein when analyzed on the nitrocellulose membranes labeled with reduced, denatured or native mgp96 (FIG. 3). Western blot analysis data (not shown) confirm this finding.
  • Example 4 scFv antibodies precipitate native gp96 molecules If the recombinant scFv Abs are tested in an ELISA, they only recognize gp96 in its native form, while the commercially available monoclonal antibody SPA-850 (StressGen Biotechnologies) hardly does this , which severely limits its usefulness for affinity purification of gp96.
  • Mouse tumor cell lysates from IGELa2 cells are used for this. 10 7 cells are metabolically labeled in the presence of 35 S-methionine (150 ⁇ Ci) in 10 ml of methionine-free RPMI medium for 16 hours. After lysis of the cells in hypotonic buffer (30 mM NaHC0 3 pH 7.1), the lysates are pre-adsorbed overnight on protein G-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech). Specific monoclonal antibodies or scFv-Anti-gp96 Abs and anti-c-myc Abs become clear lysates in an amount of
  • the immunocomplexes are washed repeatedly and washed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the fixed gels are dried and exposed on a phosphoimager screen.
  • SPA-850 FIG. 4, lane (3)
  • the bands with scFv Abs according to the invention show strong precipitation of the gp96 molecules (FIG. 4, lane (4)).
  • the recombinant antibodies according to the invention thus recognize native gp96- Molecules much better than a monoclonal antibody can do.
  • Clones B1 OC and G12D show comparable results (not shown).
  • the scFv-anti-gp96 Abs are also more efficient in the preparation of gp96 than a monoclonal antibody against the chaperone BiP present in the endoplasmic reticulum, which is known to cross-react with an unknown 40kDa protein and also with gp96 (Fig. 4 , Track (2)).
  • Antibody H11B coupled to Sepharose beads 5 mg thereof or
  • a strongly radioactive labeled band of the protein which runs close to the 94 kDa marker band, shows that the immobilized recombinant ⁇ CFVH11B is able to specifically bind gp96 (Fig. 5, (8)).
  • This band is missing in the control lane (7), in which only BSA-Sepharose beads are used for immunoprecipitation.
  • the recombinant scFv antibody should also be able to recognize human gp96. To test whether this is possible, the immunoprecipitation experiments are carried out with hypotonic lysates from human C1R cells.
  • immobilized scFv-H11B antibody is able to bind human gp96 molecules (6).
  • the difference in the intensities between the mouse and the human band in FIG. 5 can be explained by the higher expression levels (concentrations) of gp96 in IGELa2 cells compared to C1R cells (not shown).
  • Immobilized B1 OC or G12D scFv antibodies also precipitate mouse and human gp96 in the same way.
  • mice Since native gp96 molecules are recognized by the immobilized scFv-Abs, it is examined whether they are still associated with antigenic peptides and are able to induce specific immune responses. 8 to 10 week old C57BL / 6 mice are treated with 30 ⁇ g from IGELa2 cells using gp96 purified in accordance with the standard method or with the scFv-anti-gp96 method in 300 ⁇ l PBS, or with 80 ⁇ l Sepharose beads (based on the volume of beads) coupled to BSA or to scFv, which is complexed to gp96, immunized in 300 ⁇ l PBS.
  • the spleens are removed and the splenocytes are stimulated with irradiated (33Gy) spleen cells from BALB.B mice for 5 days.
  • irradiated (33Gy) spleen cells from BALB.B mice for 5 days.
  • Sepharose columns which are coupled with recombinant scFv antibody, are loaded with the hypotonic lysates from IGELa2 cells (which come from BALB / c mice and express H2 d ) and the gp96 / scFv-Sepharose beads in C57BL / 6 -Mice injected 10 days after immunization, the recipient splenocytes are stimulated with irradiated BALB.B spleen cells (of the H2 b haplotype).
  • SEQ ID NO: 1 Randomized CDR3 loop as part of an antibody heavy chain, see Nissim et al, EMBO J. 11 (3), 692-98 (1994);
  • SEQ ID NO: 2 and 3 Random sequence for CDR3 of an antibody heavy chain, produced according to Nissim et al., 1994.
  • SEQ ID NO: 10 to 12 Recombinant sequence for variable part of the heavy chain of antibodies with a random sequence for CDR3 (Nissim , 1994);
  • SEQ ID NO 14 to 16 random sequence, encoded for CDR3 of a heavy chain of an antibody, production see Nissim et al. , 1994;
  • SEQ ID NO: 23 to 25 recomb. Sequence encoded for variable part of the antibody heavy chain with random sequence for CDR 3 (Nissim, 1994).

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Abstract

Die Erfindung betrifft rekombinante Antikörper gegen natives gp96, Verfahren zu deren Herstellung, ihre Verwendung, Trennmaterialien, Vorrichtungen und Kits, die die genannten Antikörper umfassen, an natives gp96 gebundene Peptide und deren Isolierung, Nucleinsäuresequenzen, die die genannten rekombinanten Antikörper codieren, und Wirtszellen, die die genannte DNA beinhalten und die Herstellung entsprechender Antikörper ermöglichen.

Description

Antikörper gegen natives gp96, deren Herstellung und Verwendung
Die Erfindungbetrifft rekombinanteAntikörper gegennatives gp96 , Verfahren zu deren Herstellung, ihre Verwendung, Trennmaterialien, Vorrichtungen und Kits, die die genannten Antikörper umfassen, an natives gp96 gebundene Peptide und deren Isolierung, Nucleinsäuresequenzen, die die genannten reko binanten Antikörper codieren, und Wirtszellen, die die genannte DNA beinhalten und die Herstellung entsprechender Antikörper ermöglichen, sowie weitere unten beschriebene Aspekte.
Hintergrund der Erfindung Das zur Gruppe der Hitzeschock-Proteine ("heat shock proteins") gehörende gp96 ist ein Protein, welches in der Lage ist, im Endo- plasmatischen Retikulum (ER) mit Peptiden zu assoziieren und so mit diesen einen immunogenen Kontext zu bilden. Werden solche gp96/Peptid-Komplexe in Mäuse injiziert, können starke Immunant- worten induziert werden. Diese Immunantworten sind spezifisch für die assoziierten Peptide, wie durch Induktion spezifischer Antworten durch cytotoxische T-Lymphozyten belegt werden kann. Die hohe Effektivität insbesondere von gp96 ist möglicherweise durch die Tatsache erklärbar, dass antigenpräsentierende Zellen (z.B. Makrophagen, dendritische Zellen) Rezeptoren tragen, die spezifisch sind für Hitzeschock-Proteine und ihre effiziente Aufnahme ermöglichen. Basierend auf diesen Anwendungen können Hitzeschockproteine zur Krebs-Immuntherapie in Mäusen verwendet werden (siehe Tamura et al., Science 271, 117-120 (1994)). Weiter erscheinen sie als ideale Adjuvantien für auf individuelle Patienten massgeschneiderte Immunotherapie-Protokolle.
Um diese vielversprechenden Anwendungen zu ermöglichen, ist es jedoch erforderlich, das entsprechende Hitzeschock-Protein aus einer begrenzten Menge von Probenmaterial in sehr hoher Reinheit und in nativer Form zu erhalten. Hochspezifische monoklonale Antikörper (mAb) , im Falle von gp96 gegen dieses Molekül, wären hierfür das ideale Hilfsmittel. Die bisher durch herkömmliche Immunisierungsrotokolle hergestellten Antikörper sind j edoch von sehr begrenzter Eignung, da sie nur schwach mit dem nativen gp96 reagieren - möglicherweise, weil das native gp96 in den zur Immunisierung verwendeten Tieren intrazellulär im ER vorliegt, die im resultierenden B-Zell-Hybridom vorliegenden Antikörper jedoch ebenfalls im ER vorliegen und so eine Interferenz mit der normalen gp96-Funktion in den Hybridomzellen durch Reaktion von nativem gp96 mit dem gebildeten Antikörper vorliegt, die die entsprechenden Hybridomzellen nicht ihre Funktion wahrnehmen lässt .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Antikörper zur Verfügung zu stellen, welche die praktisch ausschließliche Erkennung von nativem gp96 ermöglichen. Durch Verwendung rekombi- nanter Antikörper konnte nun diese Aufgabe gelöst werden.
Überblick über die Erfindung
Die vorliegende Offenlegung beschreibt die Konstruktion antigen- bindender Domänen von gp96-spezifischen Antikörpern ausgehend von einer semi-synthetischen Immunglobulingen-Bibliothek. Die resultierendenEinzelketten-Antikörper (scFvAbs) werden für eine rasche Ein-Schritt-Methode zur chromatographischen Reinigung für die Isolierung von gp96-Molekülen verwendet. Diese sind immer noch in der Lage, spezifische Immunantworten auszulösen, wie native gp96-Moleküle, die mittels aufwendigerer konventioneller Protokolle gewonnen werden, bei denen ConA-Sepharose-Säulen- chromatographie und weitere Reinigungsschritte Einsatz finden. Die ConA-Sepharose-Behandlung führt zu einer Kontaminierung mit ConA infolge von "Säulenbluten" . Da ConA ein T-Zell-Mitogen ist, kann es störend mit dem Immunsystem einer zu impfenden Person oder eines zu impfenden Tieres interferieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß Proteasen, wie Cathepsin E, in auf konventionelle Weise gereinigten gp96-Präparationen enthalten sind. All die potentiellen Risiken, die wegen der Kontaminationen von gp96 vorliegen, können vermieden werden durch Verwendung der erfindungsgemässen Affinitätsreinigung mittels reko binanter scFv- Antikörper. Ausserdem beschleunigen diese den Reinigungprozess und erlauben die Prozessierung kleiner Tumorproben. Diese Merkmale machen die rekombinanten anti-gp96-Antikörper zu einem idealen Werkzeug für die Reinigung von gp96, das dann auch selbst in der Behandlung eingesetzt werden kann, beispielsweise von Krebs und Infektionserkrankungen.
Abbildungen (für weitere Details siehe auch Beispiele) Fig.1 zeigt die Sequenzanalyse der recombinanten scFv-Antikörper . Es werden die Aminosäuresequenzen der VH- und der VL-Ketten- abschnitte gezeigt. Die VH-Segmente der B10C-, G12D- und H11B- Klone gehören zur VH1 -Genfamilie und sind vom Keimbahngen DP-3 derivatisiert . Die VL-Gensegmentsequenzen sind identisch in allen Klonen undpassen zumVλ3-Gensegment IGLV3S1 /DPL16. Diebestimmten VH- und VL-Sequenzen wurden verglichen mit Sequenzen aus der V Base (Medical Research Council, Cambrdige, ü.H.) , der GenBank und der EMBL-Sequenzdatenbank. Gezeigt werden jeweils die variablen VH und VL-Regionen der schweren und leichten Kettenabschnitte; FR = Gerüstregion; CDR = Komplementaritätsdeterminierende Region) . Die Unterbrechungen innerhalb der Sequenzdarstellung jeweils innerhalb der Sequenz der schweren und der leichten Kette sollen nicht fehlende Bindung bedeuten, sondern nur ermöglichen, unterschiedliche Abschnitte (FR1 , CDR1 etc.) leichter zu erkennen. Tatsächlich bilden jeweils die Abschnitte FR1 bis FR4 der schweren und FR1 ' bis FR4 ' der leichten Kette eine zusammenhängende Kette. Es bedeuten (im Einbuchstabencode für Aminosäuren) : Schwere Kette: Bei Klon B10C: CDR3 = MPVSQMPH = SEQ ID NO: 1 ; CDR2 = LVDPEDGE- TIYAEKFQG = SEQ ID NO: 4; CDR1 = DYYMH = SEQ ID NO: 5. Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 10. Bei Klon G12D: CDR3 = IPLFGRDH = SEQ ID NO: 2; CDR2 = LVDPEDGE- TIYAEKFQG = SEQ ID NO: 4; CDR1 = DYYMH = SEQ ID NO: 5. Gesamtse- quenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 11.
Bei Klon H11 B: CDR3 = LAAGN = SEQ ID NO: 3 ; CDR2 = LVDPEDGETIYA- EKFQG = SEQ ID NO: 4; CDR1 = DYYMY == SEQ ID NO: 6. Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 12. Leichte Kette: Bei allen drei Klonen: CDR1 ' = QGDSLRSYYAS = SEQ ID NO: 7; CD 2 ' = GKNNRPS = SEQ ID NO: 8; CDR3 ' = NSRDSSGNHW = SEQ ID NO : 9. Gesamtsequenz von Anfang FR1 ' bis Ende FR4 ' = SEQ ID NO: 13.
Fig. 2: Diese Abbildung zeigt die den Aminosäuresequenzen in Fig. 1 zugrundeliegendenDNA-Sequenzen. Über den codierenden Tripletts ist jeweils der Beginn der Gerüst- und komplementär!tat detemanierenden Regionen (FR1 , CDR1 etc.) angegeben.
Codierender Abschnitt für Schwere Kette:
Bei Klon B10C: CDR3 = ATG CCG GTT AGT CAG ATG CCT CAT = SEQ ID NO: 14;
CDR2 = CTT GTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATA TAC GCA GAG AAG
TTC CAG GGC = SEQ ID NO : 17;
CDR1 = GAC TAC TAC ATG CAC = SEQ ID NO: 18.
Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 23. Bei Klon G12D:
CDR3 = ATT CCG TTG TTT GGG CGG GAT CAT= SEQ ID NO: 15;
CDR2 = CTT GTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATA TAC GCA GAG AAG
TTC CAG GGC = SEQ ID NO : 17;
CDR1 = GAC TAC TAC ATG CAC = SEQ ID NO : 18. Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 24.
Bei Klon H11B:
CDR3 = CTT GCT GCT GGT AAT = SEQ ID NO: 16;
CDR2 = CTT GTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATA TAC GCA GAG AAG
TTC CAG GGC = SEQ ID NO: 17; CDR1 = GAC TAC TAC ATG TAC = SEQ ID NO : 19.
Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 25.
Leichte Kette: Bei allen drei Klonen:
CDR1 '= CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC =SEQ ID NO:
20;
CDR2'= GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA = SEQ ID NO : 21 ;
CDR3'= AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG GTA =SEQ ID NO:
22.
Gesamtsequenz von Anfang FR1 ' bis Ende FR4 ' = SEQ ID NO: 26.
Fig. 3: Bindungsaktivität der rekombinanten Einzelketten (= Single Chain) -Fv-anti-gp96-Antikörper. Gereinigte scFv Abs werden auf die Bindung an Maus-gp96 untersucht, wobei auf einer Nitrocellulo- semembran (1) unter reduzierenden Bedingungen (SDS plus ß- Merkaptoethanol) , (2) denaturierenden Bedingungen (SDS) und (3) nativen (PBS) Bedingungen untersucht wird. Die Membran wird mit monoklonalem Maus-IgG-Anti-Human-c-myc, polyklonalem Peroxidase- konjugiertem Kaninchen-Anti-Maus-IgG und Substrat entwickelt. Der monoklonale Ratten-IgG-Anti-gp96-Antikörper (SPA-850) dient als positive, ein scFv-Oestradiol-Antikδrper als negative Kontrolle. Alle rekombinanten scFv-Antikörper binden nur an das native Antigen. neg. ctr. = negative Kontrolle, pos.ctr. = positive Kontrolle.
Fig.4 : Prazipitation von nativem gp96 von Maus-Tu orzelllysaten. Hypotone Lsyate radioaktiv markierter IGELa2-Zellen werden mit den genannten Antikörpern inkubiert, gefolgt von Protein-G- Sepharose-Präzipitation und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die Kontrollbahn zeigt Prazipitation nur mit Protein-G-Sepharose alleine als Kontrolle. (1) = Kontrolle, (2) = Anti-BiP (SPA-847) , (3) = Anti-gp96 (SPA-850) , (4) = scFv (Klon H11B).
Fig. 5: Chromatographische Reinigung von nativen gp96-Molekülen. Hypotone Lysate von radiomarkierten IGELa2- und humanen C1R-Zellen werden mit rekombinanten anti-gp96-scFv-Antikδrpern oder BSA als Negativkontrolle, jeweils immobilisiert auf Sepharose-Beads, inkubiert. Die Immunko plexe werden durch SDS-Polyacrylamidgel- elektrophorese getrennt. (5) = BSA-Sepharose, (6) = Anti-gp96scFv- Sepharose, (7) = BSA-Sepharose, (8) = Anti-gp96scFv-Sepharose.
Fig. 6: Aktivierung von CTL durch scFv-gereinigte gp96-Moleküle. C57BL/6-Mäuse werden i.p. mit PBS (A) , gp96 gebunden an anti-gp96- scFv-Sepharose (B) , unbehandelte (C) , gp96, gereinigt nach Standardmethoden (D) , pH 10 , 5-eluierten gp96-Molekülen (E) und 1,3 M NaCl eluierten gp96-Molekülen immunisiert. Nach 9 Tagen werden Splenocyten mit bestrahlten BALB.B-Zellen während 5 Tagen inkubiert und die CTL-Aktivität auf C57BL/6 (gefüllte Kreise) und BALB.B (gefüllte Dreiecke) ConA-Blasts gemessen. (9) = % spezifische Lyse, (10) = E:T-Verhältnis .
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft rekombinante Antikörper, die natives gp96 binden, insbesondere solche, welche die dritte Komplementär!tat determinierende Region (CDR3) aus einem variablen Anteil einer schweren Kette eines Antikörpers ge äss SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfassen (Fig. 1), insbesondere solche, welche in Fig 1 (a) die vom variablen Teil einer schweren Kette abgeleiteten Abschnitte CDR3 der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3; CDR2 der Sequenz SEQ ID NO: 4; und CDR
1 der Sequenz SEQ ID NO: 5 oder insbesondere SEQ ID NO: 6) und
(b) die vom variablen Teil einer leichten Kette abgeleiteten
Abschnitte CDR1 ' der Sequenz SEQ ID NO: 7, CD 2 ' der Sequenz SEQ
ID NO: 8 und CDR3 ' der Sequenz SEQ ID NO: 9 umfassen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der genannten rekombinanten Antikörper zur Reinigung oder Markierung von gp96.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der genannten rekombinanten Antikörper zur (raschen) Reinigung von intakten gp96/Peptid-Komplexen aus kleinen Mengen von Tumormaterial oder infizierten Zellen, die anschliessend zur autologen oder ferner heterologen Immunotherapie verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft auch gp96 mit gebundenen Peptiden, welches durch die oben beschriebene Reinigungsmethode gewinhbar ist bzw. vorzugsweise gewonnen worden ist , insbesondere zur Anwendung in einem Verfahren zur (vorzugsweise autologen) Immunisierung, sowie pharmazeutische Formulierungen, die einen nach der oben beschriebenen Reinigungsmethode gewinnbaren, insbesondere gewonnenen, gp96/Peptid-Komplex und ggf. weitere Trägermaterialien umfassen.
Die Erfindung betrifft auch gp96 mit gebundenen Peptiden nach dem letzten Absatz zur Anwendung in einem Verfahren zu therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere zur heterologen oder vor allem autologen Immunisierung; die Verwendung des entsprechenden gp96 mit gebundenen Peptiden zur Herstellung eines Arzneimittels zur (insbesondere autologen) Immunisierung bei Patienten, die an einer Tumorerkrankung oder einer Infektion leiden, sowie die Verwendung des entsprechenden gp96 mit gebundenen Peptiden zur Immunisierung dieser Patienten bzw. Methoden zur (insbesondere autologen) Immunisierung von Patienten mittels Verabreichung von gp96 gemäss dem vorausgehenden Absatz an einen Patienten, der an einer Tumorerkrankung oder einer Infektion leidet und einer derartigen Behandlung bedarf.
Die Erfindung betrifft auch die Isolierung von Peptiden, welche an natives gp96 aus Warmblüterzellen gebunden sind, insbesondere bei Warmblütern, die an einer Erkrankung leiden, z.B. einer Ischämie (etwa infolge eines Infarktes oder von Atherosklerose) , einer Tumorerkrankung oder einer Infektion, sowie entsprechende Peptide, soweit sie neu sind, und deren Verwendung.
Die Erfindung betrifft auch Trennmaterialien (Matrices) und Vorrichtungen zur Reinigung von nativem gp96, die die erfindungs- ge ässen rekombinanten Antikörper umfassen.
Die Erfindung betrifft auch Kits zur Reinigung oder zum Nachweis von nativem gp96, welche die erfindungsgemässen rekombinanten Antikörper umfassen.
Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper kodieren.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, insbesondere Prokary- onten, wie E.coli, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper codierende Sequenzen umfassen.
Die vor- und nachstehend genannten allgemeinen Ausdrücke haben vorzugsweise die folgenden Bedeutungen, wenn nicht anders angegeben, wobei allgemeine Begriffe stets durch entsprechende speziellere Begriffe oder Beschreibungen ersetzt werden können, was zu bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung führt:
Ein rekombinanter Antikörper, der natives gp96 bindet, ist ein aus einer oder mehreren nichtkovalent oder kovalent miteinander verbundenen Peptidketten aufgebautes Protein, welches die an natives gp96 bindenden komplementaritätsbestimmenden Regionen
(CDR) umfasst, wobei auch Glykosylierungen oder andere Deri- vatisierungen vorliegen können; es handelt sich insbesondere um in üblicher Weise aus einer schweren und einer leichten Kette, die beispielsweise über Disulfidbrücken oder auf andere Weise kovalent miteinander verbunden sind, aufgebaute Antikörper, oder vorzugsweise ein Fragment eines derartigen Antikörpers, insbesondere des F(ab)2-Typs, oder insbesondere Einzelketten- Antikörper (sc Abs) mit allen komplementaritätsdeterminierenden Regionen auf einer Polypeptidkette, die noch weitere Sequenzen, wie Gerüstsequenzen, Linker-Sequenzen, Marker-Sequenzen (z.B. c-myc) oder Sequenzen, die eine spezifische Trennung erlauben, z.B. für IMAC (Immobilisertes Metall-Affinitätschromatographie), umfassen kann und/oder auch als Aggregat von zwei oder mehr derartigen Ketten vorliegen kann, wie es häufig gefunden wird (sowohl die tatsächlichen Einzelketten als auch deren Aggregate sind nach- folgend gemeint, wenn von scFv-Antikörpern (Abs) die Rede ist) - das Minimum für derartige Einzelketten besteht aus den sogenannten Fv-Fragmenten, welches die hypervariablen Regionen der schweren und der leichten Antikörperkette umfassen (derartige Fv-Fragmente sind schwer durch proteolytische Techniken herzustellen, da die entsprechendenvariablenDomänen nach Verdünnung zur Dissoziation tendieren) . Auch Gemische solcher Antikörper sind möglich. Rekom- binant bedeutet, daß mindestens ein Teil der Sequenz des entsprechenden Antikörpers durch Methoden der rekombinanten Gentechnologie modifiziert ist, wobei der entsprechende Antikörper auch auf enzymatischem oder chemischem Wege hergestellt werden kann oder vorzugsweise durch Expression geeigneter Nucleinsäuresequen- zen in einem Wirtsorganismus.
Komplementaritätsdeterminierende Regionen (CDR) (auch hyper- variable Regionen genannt) sind solche, die für die spezifische Bindung des jewiligen rekombinanten Antikörpers an gp9β verantwortlich sind (die also den Idiotyp ausmachen) .
Bevorzugt sind solche Antikörper, welche die dritte Kom- plementarität determinierende Region (CDR3) der schweren Kette eines Antikörpers gemäss SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfassen (Fig. 1 ) , insbesondere solche, welche in Fig 1 (a) die aus variablen Schwerketten-Sequenzen abgeleiteten Teile CDR3 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 4) und CDR 1 (SEQ ID NO: 5 oder insbesondere SEQ ID NO: 6) und (b) die aus variablen Leichtketten-Sequenzen abgeleiteten der CD 1 ' (SEQ ID NO: 7), CDR2 ' (SEQ ID NO: 8) und CDR3 ' (SEQ ID NO: 9) umfassen. Möglich sind auch solche Antikörper, bei denen diese CDR durch andere als die in Fig. 1 gezeigten Gerüstregionen (FR) voneinander separiert sind.
Die Erfindung betrifft auch natives gp96 bindende Antikörper, die Varianten der als bevorzugt gekennzeichneten Sequenzen beinhalten, z.B. Varianten, die aus einer DNA resultieren, die einer in-vitro-Mutagenese unterworfen worden sind, wobei die Bedingung ist, dass diese noch die genannte Bindungsfähigkeit besitzen, insbesondere bei üblichen Messmethoden zur Affinitätsbestimmung mindestens zweimal, vorzugsweise mindestens 10-mal stärkere Affinität zu leicht denaturiertem oder insbesondere nativem gp96 haben als der Antikörper SPA-850, der eine primäre (Sequenz-) Struktur des gp96 erkennt, die sowohl in nativem als auch in denaturiertem gp96 vorhanden ist und so nicht selektiv ist für natives gp96, s.u.) . Solche Modifikationen können in einer Addition, SubstitutionoderDeletionvonAminosäuren, vorzugsweise von bis zu 5, beispielsweise von einer Aminosäure, bestehen - besonders bevorzugt sind solche rekombinanten Antikörper, die eine optimale Affinität haben, die hoch genug ist für starke gp96- Bindung, aber dennoch wieder die Freisetzung desselben aus gp96/Antikörperkomplexen erlaubt, um so das gebundene gp96 wieder freisetzen zu können, was z.B. für die unten beschriebenen Reinigungsmethoden essentiell ist. Soweit die Modifikationen die CDR betreffen, sind konservative Austausche bevorzugt, z.B. der Austausch einer hydrophoben Aminosäure durch eine andere, einer sauren durch eine andere, einer basischen durch eine andere, von Ser durch Thr, einer armatischen durch eine andere oder dergleichen, oder ferner Addition einer homologen Aminosäure, so dass eine Aminosäure durch zwei homologe Aminosäuren ersetzt wird, oder Deletion einer Aminosäure. Daneben können vorzugsweise noch Gerüstregionen FR (wie z.B. die in Fig. 1 gezeigten FR1 bis FR4 auf der schweren Kette, FR1 ' bis FR4 ' auf der leichten Kette, oder andere Aminosäuresequenzen, die die Fähigkeit der Antikörper zur Bindung an leicht denaturier- tes oder insbesondere natives gp96 haben) vorliegen.
Besonders bevorzugte rekombinante Antikörper sind solche, die mindestens eine der Sequenzen für die variablen Teile der schweren Ketten gemäss Fig. 1 für einen der Klone G12D, H11B oder B1 OC (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; oder SEQ ID NO 12), insbesondere die Mutante mit einer CDR 1 der Sequenz DYYMY (SEQ ID NO: 6) , welche bei der in den Beispielen beschriebenen Methode nicht erwartet werden konnte, also die Sequenz für den variablen Abschnitt einer schweren Kette des Klons H11B (SEQ ID NO: 12); und die Sequenz für den variablen Abschnitt der leichten Kette gemäss Fig. 1 (SEQ ID NO: 13) umfassen, welche erforderlichenfalls durch einen geeigneten Spacerabschnitt voneinander getrennt sind.
Natives gp96 ist solches, das dem in der Zelle normalerweise im ER vorliegenden in der Konformation im wesentlichen entspricht und noch in der Lage ist, die unter physiologischen Bedingungen gebundenen antigenen Peptide zu binden, so dass diese im Komplex mit gp96 isoliert werden können - mit anderen Worten, die 3D-
Faltung ist soweit erhalten (oder sogar unverändert) , daß die Beladung mit den antigenen Peptiden noch möglich ist, auch bei
Reinigung des gp96 wie unten als Teil der Erfindung beschrieben - im Gegensatz hierzu scheint die klassische Methode nach
Srivastava, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 12 ,
165-171 (1997) mindestens auch beträchtliche denaturierte Anteile zu enthalten.
Die Reinigung von gp96 gelingt nach üblichen Methoden, beispielsweise durch Prazipitation des gp96 aus Lösungen, wie Zelllysaten, sofern mindestens zwei Bindungsstellen pro rekombinantem Antikörper für gp96 vorliegen oder Aggregate von solchen rekombinanten Antikörpern vorliegen, oder wenn weiter AntiAntikörper eingesetzt werden, die mehr als eine Bindungsstelle für Sequenzen auf den erfindungsgemässen rekombinanten Antikörpern (beispielsweise c-myc-Sequenzen) haben und so zur Vernetzung in der Lage sind, insbesondere, wenn die Anti-Antikörper polyklonal sind; bevorzugt ist die Reinigung nach Bindung eines erfindungsgemässen Antikörpers an ein geeignetes partikuläres Trägermaterial mit aureichend grosser Oberfläche, z.B. an eine auf Kohlenhydraten oder Kunststoffen basierende Gelmatrix, wie insbesondere Sepharose. Die Reinigung kann dann durch Bindung in Suspension oder durch Auftragen der zu reinigenden Probe auf eine Säule, die mit einer gebundenen rekombinanten Antikörper umfassenden Matrix gefüllt ist, erfolgen. Möglich ist auch die Bindung an Membranen, z.B. Nitrozellulose, die mit dem entsprechenden rekombinanten Antikörper belegt sind, oder entsprechende andere Trägermaterialien. Die Elution des so gebundenen gp96 erfolgt mit geeigneten Lösungen, insbesondere mit leicht basischen (pH vorzugsweise zwischen 7 , 2 und 12 , insbesondere zwischen 7 , 2 und 10,5; eingestellt beispielsweise mit Hilfe organischer Basen, insbesondere Stickstoffbasen, wie Triethanolamin) und/ oder salzhaltigen Eluenten, insbesondere 0,3 bis 4, vorzugsweise 0,5 bis 1,5 M Salzlösungen, wie 0,7 bis 1,5 M Salzlösung, vorzugsweise mit Kochsalz (NaCl) als Salz. Sollen native Komplexe aus gp96 und daran gebundenen Peptiden (z.B. aus geschädigten Geweben, wie ischämischen Geweben oder Geweben mit Krankheitserregern oder Krebsmarkern) isoliert werden, so wird vorzugsweise ein pH im Bereich zwischen 6 und 8 gewählt und eine erhöhte Salzkonzentration, insbesondere 0,7 bis 1,5 M Kochsalzlösung in Gegenwart von Puffer, wie Phosphatpuffer.
Die Markierung (d.h., qualitative oder quantitative Bestimmung) von gp96 kann beispielsweise mit üblichen Assays zum Nachweis von Antigenen mit Antikörpern durchgeführt werden. So können die erfindungsgemässen rekombinanten Antikörper vorzugsweise selbst direkt Sequenzen enthalten, die eine Markierung ermöglichen (beispielsweise Sequenzabschnitte, die Enzymfunktion haben und so direkt durch Umsetzung mit entsprechenden Substraten die De- tektion ermöglichen, oder durch dagegen gerichtete Antikörper erkannt werden können, die ihrerseits durch Standardmethoden nachgewiesen werden können), beispielsweise als Phosphatase, z.B. alkalische Phosphatase aus E. coli oder alkalische Phosphatase aus Säugetieren (z.B. aus Rind), Peroxidasen, wie Meerettichper- oxidase (mit z.B.4-Chlor-1 -naphthol oder 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -Tetra ethyl- benzidin als Substrat) , ß-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucoamylase, Carboanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphatase; ein Molekül mit spezifischen Bindungseingenschaften, wie Streptavidin, das an Biotinbindet , oder andere charakteristische antigene Abschnitte, wie c-myc-Sequenzen oder -teilsequenzen, die insbesondere immunologisch nachgewiesen werden können.
Auf diese Weise können die mit Antikörpern üblichen Nachweis- methoden für Antigene ("Immunoassays") , insbesondere Radio- immunoassays und vor allem Immunfluoreszenzmarkierung, Immunoblot- ting, Enzym-Immunoassays, insbesondere EIA oder ELISA, oder Dot- Assays durchgeführt werden, um gp96 qualitativ und/oder quantitativ nachzuweisen.
Die rasche Reinigung gelingt vorzugsweise durch Auftrennung eines (erforderlichenfalls durch Ultrazentrifugation vorgeklärten) Zell- lysates über eine Säule, die mit einer Matrix beladen ist, die gebundene rekombinante Antikörper gemäss der Erfindung trägt (siehe oben unter Reinigung, dort werden auch geeignete Elutionsbedingungen angegeben) , insbesondere über entsprechend modifizierte Sepharose. Zunächst wird aufgetragen, dann Verunreinigungen ausgewaschen, und zuletzt eluiert, wie oben für die Reinigung von gp96 beschrieben. Die Immunotherapie bedient sich des so gewonnenen gp96, das im wesentlichen in nativer Form vorliegt, wenn entsprechende Elutionsbedingungen gewählt werden (siehe oben oder in den Beispielen) , und noch gebundene Peptide aus den Tumorzellen oder den infizierten Zellen vorliegen, die charakteristisch für Krankheitszustände, wie Ischämien, Krebs oder Infektionen sind. Im Prinzip ist auch heterologe Immuntherapie möglich, beispielsweise, wenn mehrere Patienten durch das gleiche Pathogen infiziert sind oder die gleiche Tumorerkrankung haben.
"Tumorerkrankung" bedeutet eine proliferative Erkrankung, beispielsweise solide Tumoren oder Blutkrebs, einschliesslich ggf. vorliegender Metastasen. Die zur Isolierung des gp96 verwendeten Zellen sollten dann insbesondere Tumorzellen umfassen. "Infiziert" bedeutet, dass die entsprechenden Zellen durch einen Mikroorganismus, wie ein Virus, Bakterien, Mycoplasmen, einen Pilz oder einen Parasiten, wie Protozoen, infiziert sind.
Die Immuntherapie erfolgt durch enterale (z.B. nasale) oder vorzugsweise durch parenterale, insbesondere intramuskuläre, subkutane oder ferner intrakraniale oder intralumbale Verabreichung eines wie oben beschrieben gereinigten gp96/Peptid- Komplexes an einen Patienten, vorzugsweise einen solchen, der einer solchen Behandlung bedarf, in Abwesenheit oder Gegenwart von weiteren Adjuvantien, wie Alu iniunhydroxid, Lysolecithin, Pluronic-Polyolen, Polyanionen, Peptiden, Muramyldi- oder - tripeptiden, Squalenmischungen (SAF-1 ) , Saponinderivaten, Zeilwandpräparationen von Mycobakterien, Quil A, Untereinheit B aus Choleratoxin, Proteine oder Ölemulsionen, oder Kombinationen von zwei oder mehr davon.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung der erfindungsgemässen rekombinanten Antikörper zur Reinigung von gp96 aus Zellen oder Gewebsproben insbesondere aus einem Patienten, der an einer Erkrankung, wie einer Ischämie (z.B. infolge eines Infarktes), einem Tumor oder einer Infektion leidet, und (vor allem im Falle einer Infektion oder einer Tumorerkrankung) die nachfolgende Verabreichung des so gewonnenen gp96 an einen Patienten, insbesondere einen, der einer derartigen Behandlung bedarf, zur autologen oder ferner heterologen Immunisierung.
Die Erfindung betrifft auch gp96 mit gebundenen Peptiden, welches durch die oben beschriebene Reinigungsmethode gewinnbar ist bzw. vorzugsweise gewonnen worden ist, insbesondere zur Anwendung in einem Verfahren zur (vorzugsweise autologen) Immunisierung, sowie pharmazeutische Formulierungen, die ein nach der oben beschriebenen Reinigungsmethode gewinnbaren, insbesondere gewonnenen, gp9β/Peptid-Komplex und ggf. weitere Trägermaterialien umfassen. Als Trägermaterialienkommeninsbesonderephysiologisch annehmbare Trägermaterialien in Frage, insbesondere physiologische Kochsalzlösung, Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, steriles Wasser und ggf. Adjuvantien, wie oben genannt, in Frage. Andere Pufferungs- und dispergierend wirksame Trägermaterialien können verwendet werden. Der Fachmann kennt die möglichen Zusammensetzungen, Beispiele finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro, Hrg. , 18th Edition, 1990), hiermit durch Bezugnahme inkorporiert. Die Zusammensetzungen werden nach üblichen Methoden sterilisiert und verpackt, z.B. in Ampullen oder Gläschen, oder direkt verabreicht. Die Konzentration an gp96/Peptidkomples kann variieren, beispielsweise von ca. 0,001 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise von 0,01 bis 0,5%.
Als "Patienten" kommen vor allem Warmblüter, in erster Linie Säuger, vor allem der Mensch, in Betracht.
Bei der Administration wird eine Dosis verabreicht, die normalerweise zum Stimulieren einer Immunantwort (insbesondere basierend auf cytotoxischen T-Lymphozyten) geeignet ist. Die Dosis ist abhängig von den individuellen Patientenparametern wie Grosse, Alter, Geschlecht und Zustand, wird sich aber normalerweise vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 20000 μg, vorzugsweise 0,005 bis 4000 μg gp96/Peptidkomplex pro kg Patientengewicht bewegen.
Es ist auch möglich, mit erfindungsgemässen rekombinanten Antikörpern Warmblüter zu immunisieren, um so Anti-Idiotyp- Antikörper, die antigene Bereiche von gp96 imitieren, herzustellen. Die Immunisierung erfolgt analog wie oben für gp96/PEptidkomplexe beschrieben.
Die Isolierung von Peptiden, welche an natives gp96 aus Warmblüterzellen gebunden sind, insbesondere bei Warmblütern, die an einer Erkrankung leiden, z.B. einer Ischämie (etwa infolge eines Infarktes) , einer Tumorerkrankung oder einer Infektion, ist möglich, indem man erfindungsgemäss isoliertes natives gp96, das solche Peptide gebunden hat, aus entsprechenden gp96/Peptidekomplexen freisetzt (z.B. durch Änderung der Ionenstärke, Erhöhung der Basizität, beispielsweise mittels Stickstoffbasen, wie Triethanolamin, auf einen pH-Wert zwischen 7,4 und 12, vorzugsweise zwischen 9 und 11,5), und erforderlichenfalls beispielsweise durch Gelfiltration vom gp96 trennt. Die Peptide können dann weiter untersucht (z.B. sequenziert) werden und auf ihre biologischen Wirkungen untersucht werden (z.B. Immunogenität) und so auch das Erkennen pathogener Mechanismen, beispielsweise bei Ischämie, ermöglichen. Soweit sie neu sind, sind auch entsprechende Peptide Gegenstand der vorliegenden Erfindung, sowie deren Verwendung, beispielsweise in Immunisierungsprotokollen.
Als Vorrichtung zur Reinigung sind insbesondere chromatographische Säulen zu nennen, die mit einer Matrix gefüllt sind, welche einen erfindungsgemässen rekombinanten Antikörper umfasst . Für die Herstellung der Matrix finden insbesondere solche Grund atrices mit funktionellen Gruppen, wie Hydroxy-, Carboxy-, Amino-, Epoxy-, Dien- oder Mercaptogruppen, die eine Kopplung mit einem erfindungsgemässen Antikörper erlauben, insbesondere solche auf Polymerbasis, wie auf Basis von Polyacryl oder Polyacrylderivaten (insbesondere Oxiran-modifiziert , wie im Falle von Eupergit (Röhm Phar a, Darmstadt) oder insbesondere auf Basis aktivierter polymerer Kohlenhydrate, wie cyanogenbromid-aktivierter Sepharose (vor allem Sepharose 4, 4B oder 6MB), Verwendung. Entsprechend sind die antikörper-modifizierten Matrices gemäss der Erfindung auf der Basis von Polymeren, wie Polyacryl oder dessen Derivaten (z.B. Eupergit), oder auf der Basis polymerer Kohlenhydrate aufgebaut, welche erfindungsgemässe Antikörper (vorzugsweise kovalent gebunden) tragen. Eine geeignete Säule hat insbesondere ein inneres Volumen (inklusive Säulenmaterial) von 0,01 bis 10 ml, z.B. von 0,05 bis 5 ml, beispielsweise von 0,05 bis 0,1 ml. Weitere zur Vorrichtung gehörige Komponenten können z.B. Schläuche, Vorratsgefässe für Eluenten und Waschlδsungen und dergleichen sein. Eine Matrix (Trägermaterial) , wie oben beschrieben - insbesondere Sepharose - die einen erfin- dungsgemässenAntikörperträgt , insbesondere, wenndieserkovalent gebunden ist, ist selbst Gegenstand der Erfindung. Vorzugsweise umfasst eine entsprechende Vorrichtung auch eine Säule, die eine mit einem unspezifischen Material, insbesondere Serumalbumin, wie Rinderserumalbumin, belegte Matrix (wie oben beschrieben, jedoch mit einem anderen Liganden als dem rekombinanten Antikörper) , die zur Vorreinigung geeignet ist (als Vorsäule) und vorzugsweise direkt der eigentlichen, mit dem rekombinanten Antikörper belegten Säule vorgeschaltet ist.
Kits zur Reinigung oder zum Nachweis von nativem gp9β, welche die erfindungsgemässen rekombinanten Antikörper umfassen, sind insbesondere solche, die eine wie im letzten Absatz beschriebene chromatographische Säule und erforderliche weitere Komponenten, wie eine ebenfalls vorstehend beschriebene Vorsäule und ggf. Puffersalze oder Pufferlösungen, Eluenten, oder dergleichen, und gewünschtenfalls auch Nachweissysteme für isoliertes natives gp96 oder daran gebundene Peptide, wie Komponenten entsprechender Immunoassays oder dergleichen, enthalten können, z.B. Antikörper gegen c-myc, Anti-Antikörper gegen diese Antikörper, die z.B. mit einem Enzym als Komponente eines enzymatischen Nachweissystems, wie einer Peroxidase, markiert sind, sowie entsprechende Reagenzlösungen und Substrate für diese Enzyme.
Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper kodieren. Bevorzugt sind solche Nukleinsäuresequenzen, die als für den variablen Abschnitt einer schweren Kette codierende Nucleinsäuresequenz eine der in Fig. 2 und deren Legende für die CDR 3 aus den Klonen B1 OC (SEQ ID NO: 23) , G12D (SEQ ID NO: 24) oder H11B (SEQ ID NO: 25) genannten umfassen, und/oder als für den variablen Abschnitt einer leichten Kette codierende Nucleinsäuresequenz die für die CDR3'in Fig. 2 und deren Legende gezeigte (SEQ ID NO: 22) umfassen, wie in Klammer jeweils vorstehend angegeben; sowie jeweils beliebige für Gerüstregionen codierende Sequenzen FR1 bis FR4 und FR1 ' bis FR4 ' .
Bevorzugt sind insbesondere solche Nukleinsäuresequenzen, die als für den variablen Abschnitt einer schweren Kette codierende Nucleinsäuresequenzen für die CDR1 eine der in Fig. 2 und deren Legende mit SEQ ID NO: 18 oder insbesondere SEQ ID NO: 19 genannten Sequenzen umfassen, für die CDR2 die Sequenz gemäss SEQ ID NO: 17 und für die CDR3 eine der Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16, und/oder als für den variablenAbschnitt einer leichten Kette codierende Nucleinsäuresequenz die für die CDR1 ' gemäss SEQ ID NO: 20, für die CDR2 ' gemäss SEQ ID NO: 21 und für die CDR3' gemäss SEQ ID NO: 22 in Fig. 2 und deren Legende gezeigten Sequenzen umfassen; sowie jeweils beliebige für Gerüstregionen codierende Sequenzen FR1 bis FR4 und FR1 ' bis FR4 ' , insbesondere die in Fig. 2 und deren Legende genannten.
Am stärksten bevorzugt sind solche Nukleinsäuresequenzen, welche als für den variablen Teil der schweren Kette codierende Sequenz die in Fig. 2 gezeigte des Klons S1 OC (SEQ ID NO: 23) , des Klons G12D (SEQ ID NO: 24) oder insbesondere des Klons H11B (SEQ ID NO: 25) umfassen und/oder als für den variablen Teil der leichten Kette codierende Sequenz die in Fig. 2 für alle alle Klone gezeigte (SEQ ID NO: 26).
Bei allen Ausführungsformen sind solche der oben genannten Nucleinsäuresequenzen besonders bevorzugt, bei denen die für die variablen Abschnitte der schweren und der leichten Kette codierenden Sequenzen in ein und demselben Nucleinsäurestrang umfasst sind (Codierung für Einzelketten-Antikörper) .
Besonders bevorzugt sind jeweils solche Nucleinsäuresequenzen, die ferner für noch weitere Sequenzen, wie Gerüs Sequenzen, Linker-Sequenzen, Marker-Sequenzen (z.B. c-myc) oder Sequenzen, die eine spezifische Trennung erlauben, z.B. für IMAC (Immobili- sertes Metall-Affinitätschromatographie) , codierende Sequenzabschnitte umfassen. Neben den gezeigten Nucleinsäuresequenzen können auch alle Varianten vorliegen, die durch Ersetzung von Nucleinsäuren im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes oder des wobbling für dieselben Aminosäuren codieren, sowie ferner solche Sequenzen, die für die oben beschriebenen möglichen Abweichungen der Aminosäuren codieren.
Zu den erfindungsgemässen Nucleinsäuresequenzen zählen auch solche, die für die oben für Antikörper, die Varianten der als bevorzugt gekennzeichneten Sequenzen beinhalten, genannten Aminosäuredeletionen, -insertionen oder -Substitutionen codieren, also selbst entsprechende Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Nucleinsäuren enthalten. Insbesondere sind bis zu 15, vorzugsweise bis zu 3 Nucleinsäuren variiert (deletiert, inseriert oder substituiert) .
Ebenfalls bevorzugt sind Vektoren, wie Plasmide, Cosmide oder dergleichen, die eine der genannten Sequenzen umfassen und in geeigneten Wirtszellen zur Expression bringen können. Ein bevorzugter Vektor basiert auf dem Vektor pHEN1 oder pHOG 21 (siehe Beispiele).
Als Wirtszellen kommen solche in Betracht, welche in vitro kultivierbar sind. Geeignet sind eukaryotische oder insbesondere prokaryotische Zellen, z.B. Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, Säugetierzellen, Hybridome oder insbesondere Bakterien, wie E.coli, welche durch geeignete Vektoren transformiert sind. Für die Herstellung glykosylierter Antikörper sind eukaryotische Wirtszellen erforderlich, für die Herstellung von Einstrang- Antikörpern sind besonders Bakterien gut geeignet. Beispiele für Bakterien sind insbesondere solche, die arm an Restriktions- oder Modifikationsenzymen sind, wie E. coli, z.B. E. coli X776, E.coli TG1 oder insbesondere E.coli XL1 -Blue (Stratagene) .
Besonders bevorzugt als solche oder zum Einsatz bei allen vorstehend genannten Aspekten der Erfindung sind: Leicht denaturiertes oder insbesondere natives gp96 bindende sc (Einzelketten) -Fv-Antikörper oder Aggregate von zwei oder mehr davon, bei denen je der variable Teil einer leichten Kette und der einer schweren Kette innerhalb ein und derselben Peptidsequenz vorliegen, insbesondere in der Reihenfolge (variabler Teil der schweren Kette, z.B. Sequenz Anfang FR1 bis Ende FR4 in Fig. 1) - (Peptidlinker, z.B. Gly-Ser-Peptidlinker) - (variabler Teil der leichten Kette, z.B. Sequenz Anfang FR1 ' bis Ende FR4 ' in Fig. 1) - (c-myc-Marker-Sequenz) - (His-Marker mit mehreren Histidinre- sten in Folge, z.B. 6 x His) .
Die Herstellung der Antikörper, Wirtszellen (inkl. Kultivierung und Transformation) , markierten Antikörper, Vorrichtungen, etc. erfolgt nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise analog zu den in den Beispielen genannten Verfahren.
Besonders bevorzugt sind die in den Beispielen genannten leicht denaturiertes oder natives GP96 bindenden Antikörper, Verfahren, Vektoren und Vorrichtungen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung, ohne ihren Umfang einschränken zu sollen:
Mäuse und Antikörper: C57BL/6-Mäuse sind von Charles River WIGA
(Sulzfeld, Deutschland) . BALB.B-Mäuse sind von Harlan Winkelmann
(Borchen, Deutschland) . Beide Maustypen werden in den Tieranlagen des Instituts für Zellbiologie, Tübingen, Deutschland, gehalten.
Die Monoklonalen Antikörper gegen gp96 (anti-Grp94, SPA-850, Klon 9G10) und gegen BiP (SPA-827, Klon 10C3) sind von StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Canada. Zellkultur und CTL- Assay: Die Mauszelllinie IGELa2 und die humanen C1 -Zelllinien sind von ATCC, Rockville, MD, USA; sie werden in RPMI 1640, enthaltend 10 % Fötales Kälberserum und supplementiert mit 0,3 mg/ml L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten/ml) und 2-Mercaptoethanol (2 μl/ l) kultiviert. CTL-Linien werden erhalten durch wöchentliche Stimulationen mit (mittels einer Cäsium-γ-Strahlenquelle) bestrahlten Milz-Zellen aus BALB.B- Mäusen. CTL-Assays werden wie in der Literatur beschrieben durchgeführt (Arnold et al., J. Exp. Med. 182, 885-889 (1995)) unter Verwendung von ConA Blasts (Concanavalin A-aktivierte T- Zellen) aus Milzzellen als Zielzellen. Auch Con A Blasts werden ebenfalls wie in der zuletzt genannten Publikation beschrieben hergestellt . Die Standard-Methode zur Reinigung von gp96 wird beschrieben in P.K. Srivastava, METHODS: A Co panion to Methods Enzymol . 12, 165-71 (1997) und umfasst die Reinigung mittels ConA-Sepharose- und MonoQ-Anionenaustausch-Chromatographie .
Beispiel 1 : Herstellung rekombinanter Einzelketten-Fv (scFv) -Anti- gp96-Antikörper
Eine semisynthetische Phagendisplay-Bibliothek, welche aus 50 verschiedenen humanen Keimbahngenen für schwere Ketten mit in der Sequenz randomisierten CDR3-Schleifen und einem konstanten humanen Vλ3-Gen einer leichten Kette besteht und eine Kom- plexizität von mehr als 108 Klonen hat (Nissim et al., EMBO J. 13 , 692-698 (1997), findet Verwendung zur Selektion von Einzelketten-Fv(scFv) -Antikörpern (Abs) . Für die Herstellung der BibliothekwerdensynthetischeCDR3-Schleifen,welcherandomisier- te Sequenzen von 4-12 Aminosäuren haben, in 50 variable Abschnitte aus schweren Ketten eingefügt. Anschliessend wird das erhaltene Repertoir an Abschnitten aus schweren Ketten in den Phagemid- Vektor pHEN1 (siehe Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19 , 4133-4137 (1991)) mit dem unmutierten, umgeordneten Vλ3- Leichtkettengen IGLV3S1 /DPL16 (siehe Frippat et al., Nucl. Acids Res. 18, 7134 (1990) und Williams et al., Eur. J. Immunol. 23, 1456-1461 (1993)) eingebaut. Nach Herstellung scFv-exprimierender Phagenpartikel in E. coli TG1 werden 5 x 1012 koloniebildende Einheiten (c.f.u.) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 150 mM NaCl, 150 mM Natriumphosphat, pH 7,2) mit 2 % Magermilchpulver (MPBS) in Nunc Maxisorb-Immunröhrchen (Nunc, Roskilde, Dänemark) , die mit 80 μg gp96 aus Maus (mgp96) beschichtet sind, zum Panning eingeführt. Unspezifisch gebundene Phagen werden durch intensives Waschen entfernt. Spezifische Phagen werden mit 100 mM Triethylamin (pH12) eluiert und nach Neutralisation expandiert und für weitere Selektionsschritte, bis insgesamt vier davon durchgeführt sind, verwendet. Die Bindungsspezifität wird durch ELISA ermittelt: Mikrotiterplatten werden mit mgp96 beschichtet (0,5 μg/Bohrung) , mit 2 % Magermilchpulver-Lösung blockiert und dann mit Phagenpartikeln (1010 c.f.u.) versetzt. Kommerziell erhältliches polyklonales Hühnchen-anti-gp96-Serum (1:500) dient als positive und PBS als negative Kontrolle. Das System wird durch Zugabe von Kaninchen-anti-M13-Phagen-Antikörper (Stratagene) , PO-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Immunglobulin und Substrat (3 , 3 ' , 5, 5 ' -Tetramethylbenzidin) entwickelt. Die Absorbanz wird bei 620 nm gemessen (Selektierte Phagen nach der vierten Selektion: A620nm = 1 ,406; negative Kontrolle AS20 = 0,065) . Mit jedem Selektionsschritt wird erhöhte Bindungsaktivität festgestellt. Nach der vierten Selektionsrunde werden Einzelkolonien (n = 77) hergestellt und die Antikörperdiversität durch Verdauung von Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BstN1 ermittelt. Drei Restriktionsmuster werden identifiziert und deren Nucleinsäurese- quenzen ermittelt (377 DNA Sequencer, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) (Fig. 2) . Drei Antikörperklone mit drei unterschiedlichen CDR3-Regionen (B10C mit Sequenz der CDR3-Region der SEQ ID NO 1 ; G12D mit Sequenz der CDR3-Region der SEQ ID NO 2; und H11B mit Sequenz der CDR3-Region der SEQ ID NO 3) werden gefunden, siehe Fig. 1. Im ELISA werden die Absorptionen bei 620 nm für Klon B10C zu 1,297, für Klon G12D zu 0,651 und für Klon H11B zu 0,557, für die positive Kontrolle zu 0,557, für die negative Kontrolle zu 0,003 A620nπι ermittelt.
Beispiel 2: Herstellung von löslichen, für natives gp96 spezifischen scFv-Antikörpern:
Die Gensegmente der drei spezifischen scFv-Abs (B10C, G12D und H11B) werden durch Ncol-Notl-Verdau erhalten, in das Plasmid pHOG21 (siehe Kipryanov et al . , J. Immunol. Meth. 200 , 60-77 (1997)) einligiert und in E. coli XL1 -Blue (Stratagene) exprimiert. Die lösliche Fraktion des periplasmatischen Extrakts und der Kulturüberstand werden kombiniert, konzentriert und gegen 50 mM Tris-HCl, 1M NaCl, pH 7,0, dialysiert. Alle der hergestellten scFv Abs enthalten poly-His-Markierungen, welche die Reinigung durch IMAC (Immobilized Metall Affinity Chromatography = Affinitätschromatographie an immobilisierten Metallen) erlauben. Die Proben werden auf eine Säule des Typs "Chelating Sepharose Fast Flow Column" (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Schweden) aufgetragen, die zuvor mit Ni2+-Ionen beladen undmit Dialysepuffer äquilibriert worden ist. Nach ausgiebigem Waschen wird das gebundene Material mit 250 nM Imidazol eluiert und gegen PBS dialysiert. Die Reinheit wird mittels Polyacrylamidgelelek- trophorese (PAGE) überprüft (nicht gezeigt) .
Beispiel 3: Western-Blot- und Dot-Blot (=Punktautoradiogramm) - Analyse löslicher scFv-Antikörper
Maus-gp96 (mgp96) wird durch SDS-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen (100 mM ß-Merkaptoethanol + 2 % Natriumdodecylsulfat = SDS) getrennt und auf Nitrocellulose transferiert. Für die Dot-Blot-Analyse werden 500 ng mgp96 auf Nitrocellulosemembranen unter nativen (PBS) , denaturierenden (2 % SDS) oder reduzierenden (100 mM ß-Mercaptoethanol) Bedingungen aufgetragen. Sowohl die Western- als auch die Dot-Blotmembranen werden mit 2% MPBS blockiert. Das mgp96 wird mittels Ratten-IgG- anti-Grp94 (SPA-850, StressGen Biotechnologies) und Peroxidase- konjugiertem Kaninchen-Anti-Ratten-IgG (DAKO, Glostrup, Dänemark) oder mit den scFv-Antikörpern detektiert. Alle scFv Abs tragen einen c-myc-Marker, der die Markierung mit Maus-IgG-Anti-Human-myc (Genosys, The Woodlands, USA) und Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (DAKO) erlaubt. Die Detektion löslicher scFv Abs kann mit einer Reihe von Konzentrationen ermittelt werden (1/1 bis 1/8192). Fig. 3 zeigt die Resultate der Dot-Blot-Analyse. Die gereinigten scFv Abs zeigen bei Analyse auf den mit reduziertem, denaturiertem oder nativen mgp96 markierten Nitrozellulosemembranen nur Bindung an das native Protein (Fig. 3) . Die Daten der Western-Blot-Analyse (nicht gezeigt) bestätigen diesen Fund. Beispiel 4: scFv-Antikörper präzipitieren native gp96-Moleküle Testet man die rekombinanten scFv Abs in einem ELISA, so erkennen sie nur gp96 in seiner nativen Form, während der kommerziell erhältliche Monoklonale Antikörper SPA-850 (StressGen Bio- technologies) dies nur kaum tut, was seine Nützlichkeit für die Affinitätsreinigung von gp96 stark einschränkt. Zur Untersuchung der Fähigkeit der rekombinanten scFv Abs, mit nativem gp96 zu interagieren, werden Immunopräzipitationsexperimente nach Lysierung von radioaktiv markierten Zellen in einem hypotonischen Puffer durchgeführt, der es ermöglicht, dass die Proteine in ihrer nativen Konformation verbleiben.
Hierfür werden Maus-Tumorzelllysate aus IGELa2-Zellen verwendet. 107 Zellen werden metabolisch markiert in Gegenwart von 35S- Methionin (150 μCi) in 10 ml Methionin-freiem RPMI-Medium für 16 Stunden inkubiert . Nach Lyse der Zellen in hypotonischem Puffer (30 mM NaHC03 pH 7,1) werden die Lysate über Nacht an Protein G-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) vor-adsorbiert . Spezifische Monoklonale Antikörper oder scFv-Anti-gp96 Abs und anti-c-myc Abs werden zu den klaren Lysaten in einer Menge von
10 μg/ml zugegeben. Nach 90 min werden die Komplexe mit Protein-G- Sepharose isoliert. In einigen Fällen werden die Lysate mit an
Sepharose-Beads gekoppeltem Rinderserumalbumin (BSA) vorgeklärt und die Kopplung direkt mit BSA-Sepharose als Kontrolle oder mit scFv-anti-gp96 Abs gekoppelt an Sepharose-Beads durchgeführt. Die Immunokomplexe werden wiederholt gewaschen und durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese gewaschen. Die fixierten Gele werden getrocknet und auf einem Phosphoimager-Bildschirm exponiert. Wie nach den vorherigen Ergebnissen zu erwarten, wird von SPA-850 nur eine schwache Bande, die der Molekülgrösse von gp96 entspricht, ausgefällt (Fig. 4, Bahn (3)). Im Gegensatz hierzu zeigen die Banden mit erfindungsgemässen scFv Abs starke Ausfällung der gp96-Moleküle (Fig. 4, Bahn (4)) . Somit erkennen die rekombinanten erfindungsgemässen Antikörper native gp96- Moleküle viel besser als es ein monoklonaler Antikörper zu tun vermag. Die Klone B1 OC und G12D zeigen vergleichbare Ergebnisse (nicht gezeigt) . Die scFv-anti-gp96 Abs sind auch effizienter bei der Prazipitation von gp96 als ein monoklonaler Antikörper gegen das in Endoplasmatischen Retikulum vorliegende Chaperon BiP, von dem bekannt ist, dass es mit einem unbekannten 40kDa- Protein und auch mit gp96 kreuzreagiert (Fig. 4, Bahn (2)).
Beispiel 5: Reinigung von gp96 unter Verwendung von scFv- Antikörpern:
Um gp96 in einem Schritt isolieren zu können, wird der scFv-
Antikörper H11B an Sepharose-Beads gekoppelt. 5 mg davon oder
BSA wird an 0,5 mg Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose
(Pharmacia) gekoppelt. Das BSA-gekoppelte Material dient als Vorsäule, um unspezifisch bindende Materialien zu entfernen. Vorgeklärte hypotonische Lysate der radioaktiv markierten Maus- Zelllinie IGELa2 werden direkt mit den scFv-Sepharose-Beads inkubiert. 1 ml IGELa2-Zellpellets werden bei 4 °C im Dounce- Homogenisator (15-20 Auf- und Abbewegungen) in 20 ml hypotonischem Puffer homogenisiert (siehe Arnold et al . , J. Exp. Med. 182 , 885- 889 (1995) . Die Homogenate werden während 60 min bei 100 000 x g zentrifugiert und die Überstände auf eine Kontroll-BSA- Sepharose-Säule aufgetragen, die direkt mit der scFv-Anti-gp96- Säule verbunden ist. Beide Säulen sind mit PBS voräquilibriert . Nach ausgiebigem Waschen mit PBS, das 0,5% NaCl enthält, wird gp96 mit 100 mM Natriumacetat (pH 4,5), das 0,15 % NaCl enthält; oder 100 mM Diethanolamin (pH 10,5) mit 0,15 M NaCl; oder PBS (pH 7,4) mit 1,3 M NaCl eluiert. Die Fraktionen werden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blot unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers SPA-850 (StressGen Biotechnologies) untersucht. Um die ungefähre Konzentration an gp96 zu ermitteln, wird die optische Dichte (OD) bei 280 nm unter Verwendung eines Exktinktionskoeffizienten von 1 gemessen. Eine stark radioaktiv markierte Bande des Proteins, das nahe an der 94-kDa-Markerbande läuft, zeigt, daß der immobilisierte rekombinante ΞCFVH11B in der Lage ist, gp96 spezifisch zu binden (Fig. 5, (8)). Diese Bande fehlt in der Kontroll-Bahn (7), in der lediglich BSA-Sepharose-Beads zur Immunpräzipitation verwendet werden. Zur Anwendung in einem klinisch anwendbaren gp96- Reinigungsverfahren sollte der rekombinante scFv-Antikörper auch in der Lage sein, humanes gp96 zu erkennen. Um zu testen, ob dies möglich ist, werden die Immunpräzipitierungsexperimente mit hypotonen Lysaten menschlicher C1R-Zellen durchgeführt. Im Gegensatz zu immobilisiertem BSA (5) ist immobilisierter scFv- H11B-Antikörper fähig, humane gp96-Moleküle zu binden (6). Der Unterschied in den Intensitäten zwischen der Maus- und der Human- Bande in Fig. 5 kann durch die höheren Expressionsspiegel (Konzentrationen) von gp96 in IGELa2-Zellen im Vergleich zu C1R- Zellen erklärt werden (nicht gezeigt) .
Auch immobilisierte B1 OC- oder G12D-scFv-Antikörper fällen Mausund Human-gp96 in der gleichen Weise.
Beispiel 6: Aktivierung von CTLs (Cytotoxische T-Lvmphozvten durch scFv-gereinigtes gp96 in vivo:
Da native gp96-Moleküle durch die immobilisierten scFv- Abs erkannt werden, wird untersucht, ob sie immer noch mit antigenen Peptiden assoziiert sind und in der Lage sind, spezifische Immunantworten zu induzieren. 8 bis 10 Wochen alte C57BL/6-Mäuse werden mit 30 μg aus IGELa2-Zellen unter Verwendung von nach der Standard-Methode oder mittels der scFv-anti-gp96-Methode gereinigtem gp96 in 300 μl PBS, oder mit 80 μl Sepharose-Beads (bezogen auf das Beads-Volumen) gekoppelt an BSA oder an scFv, welches an gp96 komplexiert ist, in 300 μl PBS immunisiert. 10 Tage später werden die Milzen entfernt und die Splenocyten mit bestrahlten (33Gy) Milzzellen aus BALB.B-Mäusen während 5 Tagen stimuliert. Beispielsweise werden Sepharose-Säulen, die mit rekombinantem scFv Antikörper gekoppelt sind, mit den hypotonen Lysaten aus IGELa2-Zellen (die aus BALB/c-Mäusen stammen und H2d exprimieren) beladen und die gp96/scFv-Sepharose-Beads in C57BL/6-Mäuse injiziert.10 Tage nach der Immunisierungwerden die rezipierenden Splenocyten mit bestrahlten BALB.B-Milzzellen (des H2b-Haplotyps) stimuliert. Da Mäuse mit BALB-Herkunft sich von C57BL/6-Mäusen an mehreren Minor-H-Genen unterscheiden und gp96 in der Lage ist, ein Cross-Priming zu induzieren (siehe Arnold et al., J. Exp. Med. 182, 885-889 (1995) , und J. Exp. Med. 186, 461-466 (1997) ) , sollte eine Immunisierung der C57BL/6-ZMäuse mit BALB/c- deriviertem gp96 die BALB.B-reaktiven CTLs in den Rezipienten aktivieren. Wie in Fig. 6B zu sehen, komplexiert die aus der mit den gp96/scFV-Sepharose-Beads immunisierten Maus erhaltene Kultur solche CTLs, die Minor-H-Antigene zeigen, welche auf BALB.B vorliegen, aber nicht auf C57BL/6-Blasten. Im Kontrollexperiment wird keine CTL-Aktivität gefunden (Fig. 6A) . Diese Resultate zeigen, dass affinitätsgereinigtes gp96 immer noch mit antigenen Peptiden assoziiert ist, in diesem Falle mit Minor-H-Antigenen, und dass es in der Lag ist, eine spezifische Immunantwort hervorzurufen.
Um die Verwendbarkeit für klinische Anwendungen zu überprüfen, wird versucht, gp96-Moleküle aus den Sepharose-Beads unter Aufrechterhaltung ihrer Immunogenität zu eluieren. Mehrere Bedingungen zur Elution der gp96-Moleküle von den Affinitätssäulen werden untersucht . Nur der Diethanolamin-Puffer mit einem pH von 10,5 oder ein Puffer mit hoher Salzkonzentration (1,3 M NaCl) sind in der Lage, gp96-Moleküle erfolgreich freiszusetzen, wie durch Dot-Blot-Analyse gezeigt werden kann (nicht gezeigt) . Ein Puffer mit pH 4,5 kann gp96 nicht von der H11B-Säule eluieren.
Um zu testen, ob die eluierten gp96-Moleküle immer noch immunogen sind, werden Cross-Priming-Experimente durch Immunisierung von C57BL/6-Mäusen, jetzt mit chromatographisch gereinigtem IGELa2 gp96, wie durch Elution von den gp96/Scfv-Sepharose-Beads erhalten, durchgeführt. Wie in den Fig. 6C bis 6F gezeigt, sind mit dem Hochsalz-Puffer (1,3 M NaCl) eluierte gp96-Moleküle tatsächlich in der Lage, CTLs zu generieren, die spezifisch Minor- H-Antigene aus BALB.B-Zellen erkennen (Fig. 6F) . Die affinitäts- gereinigten gp96-Moleküle sind genauso effizient bei der Generierung einer CTL-Antwort wie das gp96, welches aus denselben Maus-IGELa2-Zellen unter Verwendung des Standardprotokolls stammt (Fig. 6D) . Dagegen wird bei der Maus mit gp96, das von der scFv- Säule mittels des pH 10,5-Puffers eluiert ist, keine CTL-Antwort festgestellt (Fig. 6E) . Dies kann durch den Verlust vom gp96 gebundener Peptide während des Elutionsvorgangs bei basischem pH erklärt werden. Im selben Experiment verursachen nicht immunisierte C57BL/6-Mäuse keine CTL-Antwort (Fig. 6C) .
Seguenzprotokoll - freier Text
SEQ ID NO: 1 : Randomisierte CDR3-Schleife als Bestandteil einer schweren Kette eines Antikörpers, siehe Nissim et al, EMBO J. 11(3), 692-98 (1994) ; SEQ ID NO: 2 und 3 : Zufsllssequenz für CDR3 einer schweren Kette eines Antikörpers, Herstellung gemäss Nissim et al., 1994. SEQ ID NO: 10 bis 12: Rekombinante Sequenz für variablen Teil der schweren Kette von Antikörpern mit Zufallssequenz für CDR3 (Nissim, 1994); SEQ ID NO 14 bis 16: Zufalls- sequenz, codiert für CDR3 einer schweren Kette eines Antikörpers, Herstellung siehe Nissim et al . , 1994; SEQ ID NO: 23 bis 25: Rekomb. Sequenz, codiert für variablen Teil der schweren Kette von Antikörpern mit Zufallssequenz für CDR 3 (Nissim, 1994).

Claims

Ansprüche :
1. Rekombinante Antikörper, die natives gp96 binden.
2. Antikörper gemäss Anspruch 1 , welche die dritte Komplementari- tat determinierende Region (CDR3) der schweren Kette eines
Antikörpers gemäss SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfassen.
3. Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 und 2, welche (a) die vom variablen Teil der schweren Kete abgeleiteten Abschnitte CDR3 der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3; CDR2 der Sequenz SEQ ID NO: 4; und CDR 1 der Sequenz SEQ ID NO: 5 oder insbesondere SEQ ID NO: 6 und (b) die vorm variablen Teil der schweren Kette abgeleiteten Abschnitte CDR1 ' mit der Sequenz SEQ ID NO: 7, CDR2 ' mit der Sequenz SEQ ID NO: 8 und CDR3 ' mit der SEQ ID NO: 9 umfassen.
4. Antikörper, vorzugsweise Einzelketten-Antikörper, gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, welcher (a) die variable Sequenz der schweren Kette gemäss SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 oder SEQ ID
NO: 12 und (b) die variable Sequenz der leichten Sequenz gemäss SEQ ID NO: 23 umfasst, getrennt durch einen Spacer.
5. Verwendung eines rekombinanten Antikörpers gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Reinigung oder Markierung von gp96.
6. Verwendung eines rekombinanten Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Reinigung von intakten gp96/Peptid-Komplexen aus kleinen Mengen von Tumormaterial oder infizierten Zellen.
7. Verfahren zur Reinigung von gp96, dadurch gekennzeichnet, dass nach Zentrifugation zur Klärung eines Zellysates ein Trennungsschritt an einer Matrix vorgenommen wird, die gebundene Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 trägt, und anschliessend das gebundene gp96 freigesetzt wird.
8. gp96 mit gebundenen Peptiden, welches nach dem Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 7 gewinnbar ist.
9. gp96 mit gebundenen Peptiden nach Anspruch 8 zur Anwendung in einem Verfahren zu therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere zur autologen Immunisierung.
10. Verwendung von gp96 mit gebundenen Peptiden gemäss Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur (insbesondere autologen) Immunisierung bei Patienten, die an einer Tumorerkrankung oder einer Infektion leiden.
11. Verwendung von gp96 mit gebundenen Peptiden gemäss Anspruch 8 zur Immunisierung von Patienten.
12. Vorrichtung zur Reinigung von nativem gp96, welche einen rekombinanten Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
13. Kit zur Reinigung oder zum Nachweis von nativem gp96, umfassend einen rekombinanten Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4.
14. Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 kodieren.
15. Wirtszellen, insbesondere Prokaryonten, wie E.coli, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 codierende Sequenzen umfassen.
16. Eine Matrix, insbesondere Sepharose oder ein Gel auf Polyacrylamidbasis, die einen rekombinanten Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 trägt.
17. Verfahren zur Isolierung von Peptiden, welche an natives gp96 aus Warmblüterzellen, das nach dem Verfahren in Anspruch 7 gewinnbar ist, gebunden sind, insbesondere aus Warmblütern, die an einer Erkrankung leiden.
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