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WO2001077337A1 - α1,4-N-ACETYLGALACTOSAMINE TRANSFERASE GENE AND PROCESS FOR PRODUCING THIS ENZYME AND N-ACETYLGALACTOSAMINE-CONTAINING COMPLEX CARBOHYDRATE - Google Patents

α1,4-N-ACETYLGALACTOSAMINE TRANSFERASE GENE AND PROCESS FOR PRODUCING THIS ENZYME AND N-ACETYLGALACTOSAMINE-CONTAINING COMPLEX CARBOHYDRATE Download PDF

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WO2001077337A1
WO2001077337A1 PCT/JP2001/003111 JP0103111W WO0177337A1 WO 2001077337 A1 WO2001077337 A1 WO 2001077337A1 JP 0103111 W JP0103111 W JP 0103111W WO 0177337 A1 WO0177337 A1 WO 0177337A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
dna
galnac
microorganism
transferase activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2001/003111
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuo Endo
Shingo Kakita
Satoshi Koizumi
Akio Ozaki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to EP01919887A priority Critical patent/EP1275721A1/en
Priority to AU46895/01A priority patent/AU4689501A/en
Priority to US10/257,292 priority patent/US20040072324A1/en
Publication of WO2001077337A1 publication Critical patent/WO2001077337A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides

Definitions

  • the present invention relates to a protein having an al, 4-Gal NAc transferase activity, a DNA encoding the protein, a recombinant DNA containing the DNA, a transformant carrying the recombinant DNA, the transformant
  • the present invention relates to a method for producing a 1,4-GalNAc transferase using a body and a method for producing a GaiNAc-containing glycoconjugate.
  • glycoconjugates in the body has been reported for various glycoconjugates (Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Press (1999)), and glycoconjugates protect bacteria and viruses. It is expected to be developed as an effective drug for indications for cardiovascular disorders and immunotherapy.
  • GalNAc-containing glycoconjugates are produced by this enzyme because the 1,4-Ga1NAc transferase gene from animals involved in the synthesis of GalNAc-containing glycoconjugates is highly homologous to the tumor suppressor gene. Glycoconjugates are expected to exhibit anticancer activity, and may be used as diagnostic agents in the field of cancer. However, no industrial production method of GalNac-containing glycoconjugates is known.
  • the wlaC gene present in the genes involved in lipopolysaccharide biosynthesis may be a gene encoding galactose or GaINAc transferase, but its function has been elucidated. No [Microbiology, 144, 2049 (1998)].
  • An object of the present invention is to provide a protein having 1,4-Ga INAc transferase activity, a DNA encoding the protein, a method for producing a ⁇ protein having 1,4-GalNAc transferase activity using the DNA, and It is an object of the present invention to provide an industrial method for producing a GalNAc-containing glycoconjugate using the protein.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and have succeeded in isolating a DNA encoding 1,4-Ga INAc transferase from a microorganism belonging to the genus Campylopa. Furthermore, they have found that the use of the DNA enables mass production of 1,4-GalNAc transferase and a complex saccharide containing GalNAc, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to the following (1) to (20).
  • the product is used as an enzyme source, the enzyme source, the receptor glycoconjugate and peridine diphosphate N-acetylgalactosamine (hereinafter referred to as UDP A GalNAc) is present in an aqueous medium, and N-acetylgalactosamine (hereinafter abbreviated as GalNAc) is transferred to the receptor glycoconjugate in the aqueous medium.
  • a method for producing a GaINAc-containing complex saccharide comprising producing and accumulating a saccharide and collecting a GaINAc-containing complex saccharide from the aqueous medium.
  • the complex carbohydrate containing Ga 1 NA c is GalMco: NO S— having a 4Gal-4GlcNAcH-3Gal 51-4Glc structure or NO S— having a GalNAc «l-4Gal5 4Glc structure (1 ).
  • the protein having a 1,4-Ga INAc transferase activity derived from a microorganism is a protein described in any one of the following [1] to [3], (1) Or the production method according to (2).
  • [3] a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having the enzyme activity
  • microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia.
  • the microorganism belonging to the genus Escherichia is Escherichia coli. (6) Production method described in 1.
  • the oligosaccharide has a lactose, N-acetyllactosamine, lactone N-neotetraose, lactate N-tetraose, paralacto N-neohexaose, Lewis X, or Lewis a structure at the non-reducing end.
  • the processed product of the culture solution is a concentrate of the culture solution, a dried product of the culture solution, cells obtained by centrifuging the culture solution, a dried product of the cells, a lyophilized product of the cells, A surfactant treated product of the cells, an ultrasonic treatment of the cells, a mechanically milled product of the cells, a solvent treatment of the cells, an enzyme treatment of the cells, the cells Protein fraction, immobilization of the cells.
  • the method for producing a complex glycoconjugate containing Gal NAc according to (1) which is a product or an enzyme preparation obtained by extraction from the cells.
  • a GalNAc-containing glycoconjugate producing agent comprising a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added, and has ⁇ , 4-GalNAc transferase activity DNA encoding protein
  • [3] selected from the DNA consisting of the base sequence represented by [1], [2] or SEQ ID NO: 2, and hybridized with any one of the DNAs under stringent conditions, and DNA encoding a protein with transferase activity
  • the protein having ⁇ 1,4-Ga1NAc transferase activity which is the protein of the present invention, may be any protein having the enzyme activity derived from a microorganism, and preferably belongs to the genus Campylopa.
  • a protein derived from a microorganism more preferably, a protein derived from Campylobacter b. Jejuni can be mentioned.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having a 1,4-GalNAc transferase activity is known as Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor. Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as "Molecular 'Cloning 2nd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter "Current Pole Tocols'In'Molecular” abbreviated Biology), Nucleic Acids Research, 10 3 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 Natl. Acad.
  • a DNA encoding a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Can be obtained by introducing a site-specific mutation into the gene.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, it is a number that can be deleted, substituted or added by a well-known method such as the site-directed mutagenesis described above. Preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10 And more preferably 1 to 5.
  • FAST A Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)
  • the homology is at least 60% or more, usually 80% or more, particularly 95% or more.
  • the DNA encoding the protein having 1,4-Ga1NAc transferase activity used in the production method of the present invention may be any DNA that encodes a protein derived from a microorganism and having the enzyme activity. And preferably DNA derived from a microorganism belonging to the genus Campylobacter, more preferably DNA derived from Campylobacter jejuni.
  • DNA derived from a microorganism belonging to the genus Campylobacter more preferably DNA derived from Campylobacter jejuni.
  • the above-mentioned DNA that can be hybridized under stringent conditions is defined as a part of or all of the DNA described in any one of (1) to (3) above as a probe.
  • Knee hybridization method, plaque 'hybridization method' means DNA obtained by using a southern protocol hybridization method, and specifically, DNA derived from a colony or plaque.
  • Using the immobilized filter 0.7 ⁇ : L.
  • SSC solution the composition of a 1-fold concentration SSC solution consists of 150 ol / l sodium chloride and 15 ol / l sodium citrate
  • DNA encoding the protein produced by the above method may be prepared according to the method described in Molecular cloning-cloning 2nd edition.
  • a recombinant DNA is prepared by ligating the recombinant DNA to a single DNA, and a transformant is obtained by transforming a host cell using the recombinant DNA according to the method described in Molecular Cloning, Second Edition,
  • a method of solubilizing the protein, and isolating and purifying the protein by ion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography, or a combination thereof is used. Is raised.
  • the glycoconjugate containing G a1 NAc of the present invention may be obtained by treating a culture solution of a transformant producing the protein or a processed product of a culture solution, or using the purified protein as an enzyme source, It can be obtained by coexisting UDP-Ga INAc in an aqueous solvent.
  • the receptor complex carbohydrate is not particularly limited as long as it serves as a substrate of the protein having the 1,4-galNAc transferase activity encoded by the DNA of the present invention, but is preferably a non-reduced powder.
  • a sugar having galactose or G a1NAc can be mentioned, and more preferred substrates are lactose, N-acetyllactosamine, lacto-1N-neotetraose, lacto-1N-tedolaose, Lewis at the non-reducing end.
  • X or an oligosaccharide having a Lewis a structure.
  • the G a1 NAc-containing complex saccharide thus produced can be obtained by an ordinary chromatography method using activated carbon, an ion exchange resin or the like.
  • DNA encoding a protein having a Ga INAc transferase activity can be prepared using any microorganism that has the enzyme activity.
  • a microorganism belonging to the genus Campylobacter is preferably used. More preferably, there may be mentioned Canopylopak Yuichi Jejuni (ATCC 43446).
  • the microorganism belonging to the genus Canbylobacter can be cultured by a known method [for example, Microbiology, 144, 2049 (1998)]. After culturing, the chromosome DNA of the microorganism is isolated and purified by a known method (for example, current protocol's in molecular biology).
  • a fragment containing a DNA encoding a protein having GaINAc transferase activity was prepared by preparing a primer set based on a known nucleotide sequence [Microbiology, 144, 2049 (1998) 3, and converting the chromosomal DNA into type III. PCR (for example, PCR Protocols, Humana Press (1993)).
  • a hybrid DNA designed as a probe based on a known sequence is used as a probe.
  • the target DNA can also be obtained by a reduction method or the like.
  • DNA encoding a protein having 1,4-G a I NA c transferase activity is synthesized artificially by a PCR method using synthetic DNA according to a conventional method (eg, PCR Protocols, Humana Press (1993), etc.). Can also be synthesized.
  • the DNA prepared in (1) above is cut as it is or after cutting with an appropriate restriction enzyme and the like, and ligated to a vector by a conventional method.
  • any vector such as a phage vector or a plasmid vector can be used as long as it is an autonomously replicable vector in the Escherichia coli K12 strain.
  • ZAP Express (Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)), pBluescript II SK (+) CNucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)), Azap II (Stratagene), AgtlO, Agtll (DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)), ⁇ TriplEx (Clontech), Human BlueMid
  • Escherichia coli used as a host of the DNA can be used as long as it is a microorganism belonging to Escherichia coli. Specifically, Escherichia coli XLl-Blue MRF 5 (Stratagene, Strategies, 5, 81 (1992)), Escherichia coli C600
  • Examples of the transformant having the recombinant DNA obtained as described above include Escherichia coli NM522 / pCJ2, which has a plasmid DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. .
  • the protein having INAc transferase activity can be obtained by the method described in Molecular-Cloning 2nd Edition or Current Protocols 'In' Molecular Biology et al.
  • the DNA obtained above can be expressed in a host cell for production.
  • a DNA ′ fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared, if necessary, and the DNA fragment is used as a promoter for an appropriate expression vector.
  • the recombinant DNA inserted downstream of the evening is prepared.
  • the recombinant DNA is introduced into a host cell suitable for the expression vector to obtain a transformant, and the transformant is cultured in a medium, and the transformant is added to the culture solution. It can be produced by accumulating a protein having Ga INAc transferase activity.
  • Host cells include bacteria, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc. Any gene can be used as long as it can express the gene.
  • the expression vector may be an autonomously replicable or chromosomal chromosome in the above host cell.
  • DNA that can be incorporated into DNA and contains a promoter at a position where DNA encoding a protein having 1,4-GaINAc transferase activity can be transcribed is used.
  • a recombinant DNA containing DNA encoding a protein having 1,4-GalNAc transferase activity can replicate autonomously in the prokaryote.
  • the vector be composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. A gene that controls the promoter overnight may be included.
  • expression vectors include, for example, pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all sold by Behringer Linnheim), PKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO (JP-A-58-110600), KYP200 CAgric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl CAgric. Biol.
  • any promoter can be used as long as it functions in the host cell.
  • trp promoter Isseki one (P trp), lac off; mouth motor primary, P L promoter, P a promoter Isseki one, derived from the T7 promoter Isseki one such as Escherichia coli or phage, such as promoter I can give you the evening.
  • the promoter Isseki one obtained by two series of P trp (P trp x 2) , tac promoter evening one, lacT7 promoter Isseki one, the let I promoter Isseki one way artificially designed and modified promoter Isseki One or the like can also be used.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • the transcription termination sequence is not always necessary, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., for example, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue , Escherichia coli DH1 N Escherichia coli MC1000 S Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escher98ia, Escherichia coli, Escherichia coli1 ⁇ Serratia fonticola, Serratia liquefaciens s Serratia marcescens s Bacillus subtil is s Bacillus amyloliquefacine
  • Any method for introducing the recombinant DNA can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cells.
  • yeast When yeast is used as a host cell, as an expression vector, for example, YEP13
  • Any promoter can be used as long as it functions in yeast strains.
  • promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, etc. Evening, PGK promoter, GA P Promoting, ADH Promoting, gal 1 Promoting, gal 10 Promoting, Heat Shock Polypeptide Promoting, MF «1 Promoting, CUP 1 Promos can be given for one night.
  • the Yadoo cells Saccharomyces spp ⁇ genus Schizosaccharomyces, Kluyveromyces genus Trichosporon genus Schwanniomyces genus Pichia genus microorganism belonging to the genus Candida or the like, is for example, Saccharomyces cerevisiae N Schizosaccharomyces pomoe s
  • Kluyveromyces lactis Trichosporon pullulans, Scnwanniomyces alluvius, Candida utilis and the like.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the electrolysis method Diethods EnzymoL, 194, 182 (1990)] the spheroplast method Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]
  • lithium acetate method J. BacterioL, 153, 163 (1983)
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) The methods described above can be used.
  • the expression base Kuta one, for example, pcDNAI, pcDM8 (manufactured by Funakoshi) ⁇ PAGE107 [Hei 3-22979, Cytotechnology, 3 3 133 ( 1990) ], PAS3-3 (especially Kaihei 2-227075), pCDM8 Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pAGE210 and the like.
  • any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • the promoter of the IE (immediate early) gene of cytomegalovirus (CMV) and the early promoter of SV40 can be used.
  • CMV cytomegalovirus
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Examples of the host cell include Namalwa cell, which is a human cell, COS cell, which is a monkey cell, CH0 cell, which is a Chinese hamster cell, and HBT5637 (Japanese Patent Publication No. 63-299).
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • electoporation method Cytotechnology, 3, 133 (1990)], calcium phosphate Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], Virology, 52, 456 (1973), and the like.
  • insect cells When insect cells are used as hosts, for example, current protocols, molecular, quality, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, (1992), Bio / Technology, 6, 47 ( 1988) and the like.
  • the recombinant gene transfer vector and the baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain a recombinant virus in the culture supernatant of insect cells. Can be expressed.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include, for example, pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitorogen) and the like.
  • Baculoviruses include, for example, Atographa, a Californian virus, a nuclear force, a nucleus, a polyhedrosis, a virus that infects night insects (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) and the like can be used.
  • insect cells examples include Sf9 and Sf21 which are ovarian cells of Spodoptera frugiperda [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, (1992) 3, and High 5 which is an ovarian cell of Trichoplusia ni (manufactured by Invitrogen). Can be used.
  • Examples of a method for co-transferring the above-described recombinant gene into insect cells and the above baculovirus into an insect cell for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), a lipofection method, and the like. [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987.)].
  • the expression vector may be, for example, a Ti plasmid, a tobacco mosaic will vector, or the like. Any promoter may be used as long as it functions in plant cells. For example, 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV), inactin 1 promoter, etc. Can be.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • inactin 1 promoter etc. Can be.
  • Examples of the host cell include plant cells of tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, abrana, alfa alfa, rice, wheat, wheat, and the like.
  • Any method for introducing the recombinant DNA can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • Agrobacterium Agrobacterium
  • an electroporation method JP-A-60-251887
  • a method using a particle gun Gene gun
  • Patent No. 2606856, Patent No. 2517813 Patent No. 2606856, Patent No. 2517813
  • the transformant of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, the protein of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the protein of the present invention is produced by collecting from the culture. it can.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the transformant of the present invention is a prokaryote such as Escherichia coli or a transformant obtained by using a eukaryote such as yeast as a host
  • the transformant may be used as a medium for culturing the transformant.
  • Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium contains an assimilable carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like and can efficiently culture the transformant.
  • the carbon source may be any as long as the transformant can be assimilated, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, and organic acids such as acetic acid and propionic acid. Alcohols such as ethanol, propanol and the like can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or inorganic salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, and corn starch. Plyka, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium monophosphate potassium monophosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, mangas sulfate copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culturing temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culturing time is usually 16 hours to 7 days. It is preferable to maintain the pH during culturing between 3.0 and 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin, tetracycline or chloramphenicol may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium if necessary.
  • a microorganism transformed with a recombinant DNA using a promoter a microorganism transformed with a recombinant DNA using a promoter such as isopropyl 1 ⁇ -D-thiogalactovyranoside is used.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • RPMI 1640 medium J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)
  • Eagle's MEM medium Science , 122, 501 (1952)
  • Dulbecco's modified MEM medium Virology, 8, 396 (1959)
  • 199 medium Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)
  • a medium containing bovine fetal serum or the like can be used.
  • Culture is carried out usually pH 6 ⁇ 8, 3 0 ⁇ 4 0 ° C ;, 5% C 0 2 under the conditions such as the presence 1-7 days.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • TNM-FH medium As a medium for culturing a transformant obtained using insect cells as a host, generally used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies), ExCell400, ExCell405 ( All of them are manufactured by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium CNature, 195, 788 (1962)), etc.
  • the cultivation is usually carried out for 1 to 5 days under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C and the like. If necessary, an antibiotic such as genyumycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a cell organ of a plant.
  • a medium for culturing the transformant commonly used Murashige 'and' Skoog (MS) medium, white (White) medium or a medium obtained by adding a plant hormone such as auxin or cytokinin to these mediums can be used.
  • Cultivation is usually performed at pH 5 to 9, 20 to 40, and ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant DNA into which a DNA encoding the polypeptide of the present invention has been incorporated is cultured according to a conventional culture method, and the protein is purified. By producing and accumulating the protein, and collecting the protein from the culture, the protein can be produced.
  • the method for producing the protein of the present invention includes a method of producing the protein in a host cell, a method of secreting the protein out of the host cell, and a method of producing the protein on the outer membrane of the host cell.
  • the method can be selected by changing the structure.
  • the protein of the present invention is produced in a form in which a signal peptide is added in front of the polypeptide containing the active site of the protein of the present invention using a gene recombination technique, so that the protein of the present invention can be positively extracellularly extracellularly. Can be secreted.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like. Furthermore, by regenerating the cells of the transgenic animal or plant, an individual animal (transgenic non-human animal) or a plant (transgenic plant) into which the gene has been transduced is created. Using the protein of the present invention using an individual Quality can also be manufactured.
  • the protein is produced or cultivated according to a usual method to produce and accumulate the protein, and the protein is collected from the animal individual or plant individual to obtain the protein. Can be manufactured.
  • a transgenic non-human animal into which DNA encoding the protein of the present invention has been introduced is bred, the protein is produced and accumulated in the animal, and the protein is collected from the animal. By doing so, the protein can be produced.
  • the place of production and accumulation in the animal include milk of the animal (JP-A-63-309192), eggs, and the like.
  • the promoter used at this time any promoter that can be expressed in animals can be used. For example, ⁇ -casein promoter, 5-casein promoter, Globulin promoter overnight, whey acidic protein promoter and the like are preferably used.
  • a transgenic plant into which a DNA encoding the protein of the present invention has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, 20 (1994 tissue culture, 21 (1995) Trends BiotechnoL, 15, 45 (1997)], producing the protein in the plant, accumulating the protein, and collecting the protein from the plant to produce the protein. .
  • the following general method for isolating and purifying the enzyme can be used.
  • the protein of the present invention when expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with a sonicator, French press, and Mentongaurinho. Crush cells with a mogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method can be used, that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Cylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, anion exchange chromatography using a resin such as DIAI0N HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), and cation using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as ethyl sepharose, phenylsepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, etc.
  • a purified sample can be obtained by using techniques such as electrophoresis such as electrofocusing alone or in combination.
  • the cell When the protein forms an insoluble substance in the cell, the cell is similarly recovered, crushed, and centrifuged to collect the protein insoluble substance as a precipitate fraction.
  • the insoluble form of the recovered protein is solubilized with a protein denaturant.
  • the protein is returned to a normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the solubilized solution and reducing the concentration of the protein denaturing agent in the solubilized solution. After this operation, a purified sample of the protein can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein of the present invention or a derivative such as a protein having a sugar chain added to the protein is secreted extracellularly, the protein or a derivative of the protein can be recovered in the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the culture supernatant by using the same isolation purification method as described above. Can be obtained.
  • Examples of the protein obtained in this manner include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the protein of the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). be able to. Also, Advanced ChemTech, Parkin 'Elma One Chemical synthesis can also be carried out using a peptide synthesizer such as Co., Pharmacia, Protein Technology Instr., Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu.
  • a Ga INAc-containing glycoconjugate is produced in an aqueous medium. be able to.
  • Examples of the processed product of the culture solution include a concentrate of the culture solution, a dried product of the culture solution, cells obtained by centrifuging the culture solution, a dried product of the cells, a freeze-dried product of the cells, and the cells.
  • Surfactant treated product ultrasonically treated product of the cells, mechanically milled product of the cells, solvent-processed product of the cells, enzyme-treated product of the cells, protein fractionation of the cells Products, immobilized products of the cells, enzyme preparations obtained by extraction from the cells, and the like.
  • the enzyme source used in the production of the complex containing saccharides containing Ga INAc is defined as an activity capable of producing 1 ⁇ mol of the complex saccharides containing Ga INAc per minute at 37 ° C as 1 unit (U). lmU / L10,000 U / L, preferably used at a concentration of lmU / L to 1,000 U / L.
  • Aqueous media used in the production of complex sugars containing Ga INAc include water, buffer solutions such as phosphate, carbonate, acetate, borate, citrate, and tris; alcohols such as methanol and ethanol. And esdels such as ethyl acetate, ketones such as acetone, and amides such as acetamide.
  • a culture solution of the microorganism used as the enzyme source can be used as an aqueous medium.
  • a surfactant or an organic solvent may be added as necessary.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as polyoxyethylene octadecylamine (for example, Nimeen S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyltrimethylammonium, promide-alkyldimethyl Cationic surfactants such as benzylammonium chloride (eg, cation F2-40E, manufactured by NOF Corporation), anionic surfactants such as lauroyl'sarcosine, alkyldimethylamines (eg, tertiary amine FB, NOF Any of tertiary amines, such as tertiary amines, can be used as long as it promotes the production of GalNAc-containing glycoconjugates.
  • Surfactants are usually used at a concentration of 0.1 to 50 g / L.
  • the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, and ethyl acetate, which are usually used at a concentration of 0.1 to 5 Oml / L.
  • UDP-GalNAc a sugar nucleotide substrate used in the production of G a 1 NAc-containing glycoconjugates, is a commercially available product and a reaction solution produced by utilizing the activity of microorganisms. Can be used.
  • the sugar nucleotide substrate is used at a concentration of 0.1-50 Ommo 1 L.
  • any receptor glycoconjugate can be used as long as it serves as a substrate for glycosyltransferase.
  • lactose lactose N-neotetraose
  • Oligosaccharides with a lactose N-acetyl-lactosamine, lactose N-neotetraose, lactate N-tetraose, paralacto-N-neohexaose, Lewis X or Lewis a structure at the non-reducing end And the like.
  • the receptor glycoconjugate is used at a concentration of 0.1 to 50 Ommo 1 / L.
  • MnC 1 2 such as inorganic salts,? _ Merukapute Yunoichiru as necessary.
  • the formation reaction of the GalNAc-containing glycoconjugate is carried out in an aqueous medium at pH 5 to 10, preferably pH 6 to 8, at 20 to 50 ° C :! Perform for ⁇ 96 hours.
  • the quantification of G a1 N Ac-containing glycoconjugates formed in the aqueous medium can be performed according to a known method [Chemical and Industrial, 953 (1990)].
  • glycoconjugates containing GalNAc generated in the reaction solution is performed using activated carbon or ions. It can be performed by a usual method using an exchange resin or the like.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of the plasmid pCJ2 expressing the l, 4-GaINAc transferase gene.
  • Amp r Ambicillin resistance gene
  • DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 3 and 4 were synthesized using a Perceptive Biosystems 8905 DNA synthesizer.
  • PCR was performed using synthetic DNA as a primer set and chromosomal DNA of Campylobacter jeju2 (ATCC43446) as type III. PCR was performed using 0.5 ⁇ mol / L of Plu DNA polymerase (manufactured by Stratagene), 2.5 units, X10 buffer for Pfu DNA polymerase (Stratagene). Using a reaction mixture 40 ⁇ 1 containing 4 ⁇ 1 and 200 ⁇ mol ZL each of deoxyNTP, the reaction was performed in one step consisting of 1 step at 94, 2 minutes at 37 ° C, and 3 minutes at 72. This was performed by repeating the procedure twice.
  • Escherichia coli NM522 strain was transformed according to the above-mentioned known method, and the transformant was transformed into an LB agar medium containing 50 g / m1 of ampicillin [Pacto Tryptone (manufactured by Difco Co. 10 g / L, 5 gZL of yeast extract (manufactured by Difco), 5 g / L of NaCl (pH 7.2), 15 g / L of agar], followed by culturing at 30 ° C.
  • ampicillin Pacto Tryptone (manufactured by Difco Co. 10 g / L, 5 gZL of yeast extract (manufactured by Difco), 5 g / L of NaCl (pH 7.2), 15 g / L of agar
  • Plasmids were extracted from the grown transformant colonies in accordance with a conventional method, and the restriction enzyme sites and the like of the plasmid were analyzed to confirm that the plasmid was the desired plasmid pCJ2.
  • Escherichia coli NM522 / pCJ2 which was a transformant expressing the al, 4-galNAc transferase gene, could be obtained.
  • the Escherichia coli NM522 / pCJ2 strain obtained in Example 1 was inoculated into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, and cultured at 28 ° C. for 17 hours.
  • the culture solution was inoculated at 1% into a flask with a 2 L baffle containing 400 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, cultured at 30 ° C. for 4 hours, and further cultured at 40 ° C. for 3 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • the Wet cells can be stored at -20 C if necessary and thawed before use.
  • reaction product is analyzed using a Dionex Sugar Analyzer (DX-500) under the following analysis conditions, and new oligosaccharide (NOS-H) is generated and accumulated in the reaction solution. It was confirmed. '
  • Detector pulsed ensemometry detector
  • the reaction solution was heat-treated at 100 ° C for 2 minutes, and the cells were removed by centrifugation.
  • the supernatant was charged into a column (2.5 cm inside diameter, 12 O cm long) packed with 40 Oml of BioGel-P2 (manufactured by Bio-Rad), and eluted with H 20 .
  • the fractions containing NOS- were collected and concentrated by evaporation.
  • the NOS-hi thus isolated was measured with a JEOL JMS-HX110 / 110A mass spectrometer, and it was shown that the molecular weight of the NOS-hi was 910.
  • the following signals were obtained as the main signals as a result of NMR analysis using JNM-A400 manufactured by JEOL Ltd., indicating that the structure of N0S-a is GtalNAc a-4Gal? L-4GlcMc H-3Gal 34Glc It turned out to be.
  • the Escherichia coli NM522 / pCJ2 strain obtained in Example 1 was inoculated into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, and cultured at 28 ° C. for 17 hours.
  • the culture was inoculated at 1% into a 2 L baffled flask containing 400 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin. After culturing at C for 4 hours, the cells were further cultured at 40 ° C for 3 hours.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • the wet cells could be stored at 120 ° C. if necessary and thawed before use.
  • reaction product was analyzed using a sugar analyzer (DX-500, manufactured by Dionex) (same as the analysis conditions described in Example 2), and a new oligosaccharide (NOS-?) Was added to the reaction solution. Was confirmed to be generated and accumulated.
  • DX-500 manufactured by Dionex
  • NOS- new oligosaccharide
  • 1,4-GalNAc transferase can be obtained by genetic recombination. It can be produced in large quantities.
  • a glycoconjugate containing GalNAc can be efficiently produced.

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Description

明 細 書
al, 4— N—ァセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子、 該酵素および N—ァ セチルガラクトサミン含有複合糖質の製造法 技術分野
本発明は、 al, 4— Gal NAc転移酵素活性を有する蛋白質、 該蛋白質 をコードする DNA、 該 DNAを含有する組換え体 DNA、 該組換え体 DN A を保有する形質転換体、 該形質転換体を用いたひ 1, 4一 GalNAc転移酵 素の製造法および G a 1 N A c含有複合糖質の製造法に関する。
背景技術
生体内に存在する複合糖質の重要性は、 様々な複合糖質について報告されて おり (Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Press (1999)〕、 複 合糖質は、 細菌 'ウィルス等の感染防御、 心血管障害への適応および免疫治療 等に有効な医薬品としての開発が期待されている。
GalNAc含有複合糖質に関しては、 GalNAc含有複合糖質の合成に 関わる動物由来のひ 1 , 4-Ga 1 NA c転移酵素遺伝子が癌抑制遺伝子と相 同性が高いことから、 本酵素によって生産される複合糖質が抗癌作用を示すこ とも期待され、 また、 ガン分野での診断薬としての用途なども考えられるが、 GalNA c含有複合糖質の工業的生産方法は知られていない。
G a 1 N A c含有複合糖質の生合成に関わる 1 , 4-Gal N A c転移酵 素に関しては、 動物由来の酵素 〔 J. Biol. Chem., 270, 22190 (1995)、 Glycobiology, 9, 697 (1999)、 J. Biol. Chem., 274, 13933 (1999)〕 が知ら れており、 該酵素遺伝子も取得されている〔 J.Biol. Chem.， ， 13933 (1999) 〕 。 該酵素はグルクロン酸を非還元末端に有する複合糖質を基質とするが、 ガ ラクト一スまたは Ga INAcを非還元末端に有する複合糖質を基質とすると いう報告はない。 一方、 原核生物であるキャンピロバクタ一'ジェジュ二においては、 細胞表 層のリポ多糖にガングリオシド構造を有するこどが知られており 〔
BacterioL,里， 1324 (1992)、 Biochemistry, 33, 241 (1994)、 Biochemistry, 33, 250 (1994)、 Infect. I顧 un., 62, 2122 (1994)〕、 その生合成に関与す る/? 1, 4一 G a INAc転移酵素遺伝子が取得されている 〔 J. Biol. Chem. , 275, 3896 (2000)〕 。 また、 該微生物において、 G a 1 N A cが G a 1 N A c にひ 1 , 4結合した糖鎖構造が知られている 〔 Crit. Rev. Microbiol. , 22, 139 (1996)〕 。 また、 リポ多糖の生合成に関与する遺伝子群に存在する wl a C遺 伝子がガラクト一スまたは Ga INAc転移酵素をコードする遺伝子ではない かと予想されているが、その機能は明らかにされていない〔 Microbiology, 144, 2049 (1998)〕 。
発明の開示
本発明の目的は、 ひ 1, 4— Ga INAc転移酵素活性を有する蛋白質、 該 蛋白質をコードする DNA、 該 DNAを用いた《1, 4— GalNAc転移酵 素活性を有する蛋白質の製造法、 および該蛋白質を用いた GalNAc含有複 合糖質の工業的製造法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、 キャンピロパク夕 —属に属する微生物よりひ 1， 4— Ga INAc転移酵素をコードする DNA を単離することに成功した。 さらに該 DNAを利用することにより、 ひ 1, 4 -GalNAc転移酵素および GalNAc含有複合糖質の大量生産が可能で あることを見出し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は以下の （1)〜（20) に関する。
(1) 微生物由来の al， 4— Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素 （以下、 al, 4— GalNAc転移酵素と略す） 活性を有する蛋白質を発現する形質 転換体の培養液、 または該培養液の処理物を酵素源に用い、 該酵素源、 受容体 複合糖質およびゥリジン二リン酸 N—ァセチルガラクトサミン （以下、 UDP 一 GalNAcと略す） を水性媒体中に存在せしめ、 該水性媒体中で N—ァセ チルガラクトサミン （以下、 GalNAcと略す） を受容体複合糖質に転移さ せることにより G a 1 NA c含有複合糖質を生成蓄積させ、 該水性媒体中から Ga INAc含有複合糖質を採取することを特徴とする、 Ga INAc含有複 合糖質の製造法。
(2) 微生物由来のひ 1, 4一 GalNAc転移酵素活性を有する蛋白質を 発現する形質転換体を培地に培養し、 培養物中に 1, 4一 GalNAc転移 酵素活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、 該培養物から該蛋白質を採取するこ とを特徴とする、 《1， 4_GalNAc転移酵素活性を有する蛋白質の製造 法。 '
(3) Ga 1 N A c含有複合糖質が、 GalMco:卜 4Gal - 4GlcNAcH-3Gal 5 l-4Glc構造を有する NO S— 、 または GalNAc«l-4Gal5 4Glc構造を有する NO S— ?である （1) に記載の製造法。
(4) 微生物由来のひ 1, 4— Ga INAc転移酵素活性を有する蛋白質が、 以下の [ 1 ]〜[ 3 ]のいずれか 1つに記載の蛋白質であることを特徴とする、 （ 1) または （2) に記載の製造法。
[1]キャンピロパクター属に属する微生物由来の該酵素活性を有する蛋白質 [ 2 ]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[ 3 ]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1つ以上のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ該酵素活性を有する蛋白 質
(5) 形質転換体が、 微生物に組換え体 DNAを導入して得られる形質転換 体である （1) または （2) に記載の製造法。
(6) 微生物が、 ェシエリヒア属に属する微生物である （5) に記載の製造 法。
(7) ェシエリヒア属に属する微生物が、 ェシエリヒア 'コリである （6) に記載の製造法。
(8) 組換え体 DNAが、 以下の [1]〜[6]に記載の DNAから選ばれる D NAを含有する組換え体 DNAである （5) に記載の製造法。
[ 1 ]微生物由来の α 1， 4一 G a 1 N A c転移酵素活性を有する蛋白質をコ一 ドする DNA
[2]キャンピロバク夕一属に属する微生物由来の 1 , 4一 Ga INAc転移 酵素活性を有する蛋白質をコードする DNA
[3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA [ 4 ]配列番号 2で表される塩基配列を有する D N A
[ 5 ]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1つ以上のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつひ 1, 4-GalNAc 転移酵素活性を有する蛋白質をコードする DNA
[6]上記[1]〜[5]のぃずれか1っに記載の0 とストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、 かつ 1, 4 Ga INAc転移酵素活性を有する蛋 白質をコードする DNA
(9) 受容体複合糖質が、 非還元末端にガラクト一スまたは GalNAcを 有する 10糖以下のオリゴ糖を含む複合糖質である （1) に記載の GalNA c含有複合糖質の製造法。
(10) オリゴ糖が、 非還元末端にラクト一ス、 N—ァセチルラクトサミン、 ラクト一N—ネオテトラオース、 ラクトー N—テトラオース、 パララクトー N —ネオへキサオース、 ルイス X、 またはルイス a構造を有する （9)に記載の製 造法。
(11) 培養液の処理物が、 培養液の濃縮物、 培養液の乾燥物、 培養液を遠 心分離して得られる菌体、 該菌体の乾燥物、 該菌体の凍結乾燥物、 該菌体の界 面活性剤処理物、 該菌体の超音波処理物、 該菌体の機械的摩砕処理物、 該菌体 の溶媒処理物、 該菌体の酵素処理物、 該菌体の蛋白質分画物、 該菌体の固定化 物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品である （1) に記載の Gal NAc含有複合糖質の製造法。
(12) 以下の [ 1 ]または [ 2 ]に記載の G a 1 N A c含有複合糖質。
[ 1 ] GalNAc l-4Gal β l-4GlcNAc β l-3Gal β卜 4Glc構造を有する N◦ S—ひ [ 2 ] GalNAc a l-4Gal β 1- 4Glc構造を有する Ν OS- ?
(13) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を含有する、 G a 1 N A c含有複合糖質製造剤。
( 1 ) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1つ以上のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、'かつひ 1， 4-Ga 1 N A c転移酵素活性を有する蛋白質。
(15) 以下の [1]〜[3]のいずれか 1つに記載の DNA。
[1] (14) に記載の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 2で表される塩基配列において、 1つ以上の塩基が欠失、 置換若 しくは付加された塩基配列からなる DNAであり、 かつ αΐ, 4— GalNA c転移酵素活性を有する蛋白質をコードする DNA
[ 3 ] [ 1 ]、 [ 2 ]または配列番号 2で表される塩基配列からなる D N Aから選ば れる、 いずれか 1つの DNAのとストリンジェントな条件下でハイブリダィズ し、 かつひ 1, 4一 GalNAc転移酵素活性を有する蛋白質をコードする D NA
(16) (15) に記載の DNAをベクターに連結して得られる組換え体 D
NA。
(17) (16) に記載の組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる形 質転換体 ,
(18) 宿主細胞が、 微生物である （17) に記載の形質転換体。
(19) 微生物が、 ェシヱリヒア属に属する微生物である （18) に記載の 形質転換体。 ( 2 0 ) ェシエリヒア属に属する微生物が、 ェシエリヒア 'コリである （1 9 ) に記載の形質転換体。 以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の蛋白質である α 1 , 4— G a 1 N A c転移酵素活性を有する蛋白質 は、 微生物由来の該酵素活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、 好まし くはキャンピロパク夕一属に属する微生物由来の蛋白質、 より好ましくはキヤ ンピロバクタ一 'ジェジュニ由来の蛋白質をあげることができる。具体的には、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、 配列番号 1で表されるァ ミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたァミノ 酸配列からなり、 かつ 1 , 4— G a l NA c転移酵素活性を有する蛋白質を あげることができる。
1以上のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 か つひ 1 , 4— G a l N A c転移酵素活性を有する蛋白質は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以下、モレキュラー 'クロ一ニング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレント ·プ 口トコ一ルズ 'イン 'モレキュラー■バイオロジーと略す） 、 Nucleic Acids Research, 103 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、 例えば配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする D N A に部位特異的変異を導入することにより、 取得することができる。
欠失、 置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、 上記の 部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、 置換もしくは付加できる程度の 数であり、 1個から数十個、 好ましくは 1〜2 0個、 より好ましくは 1〜1 0 個、 さらに好ましくは 1〜5個である。
また、 本発明の蛋白質がひ 1， 4一 Gal NAc転移酵素活性を有するため には、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列と、 BLAST Q.Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕 や FAST A (Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕等を用 いて計算したときに、 少なくとも 60%以上、 通常は 80%以上、 特に 95% 以上の相同性を有していることが好ましい。
本発明の製造法に用いられるひ 1 , 4一 G a 1 N A c転移酵素活性を有する 蛋白質をコードする DN Aは、 微生物由来の該酵素活性を有する蛋白質をコ一 ドする DNAであればいずれでもよく、 好ましくはキャンピロパクター属に属 する微生物由来の DNA、 より好ましくはキャンピロバクタ一 ·ジェジュニ由 来の DNAをあげることができる。 具体的には、
( 1 )配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコ一ドする DN A
(2)配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA
(3)配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつひ 1, 4_GalNAc転 移酵素活性を有する蛋白質をコードする DNA
(4)上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つに記載の DN Aとストリンジェント な条件下でハイプリダイズし、 かつ《1, 4— Ga 1 NAc転移酵素活性を有 する蛋白質をコードする DN Aをあげることができる。
上記のストリンジ工ントな条件下でハイプリダイズ可能な DN Aとは、 上記 (1) 〜 （3) のいずれか 1つに記載の DN Aの一部、 または全部をプロ一プ として、 コ口ニー ·ハイブリダイゼ一ション法、 プラーク 'ハイブリダイゼ一 ション法ぁる tはサザンプロヅトハイブリダイゼーション法等を用いることに より得られる DN Aを意味し、 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DN Aを固定化したフィル夕一を用いて、 0. 7〜： L. 0mol/lの塩化ナトリウ ム存在下、 65°Cでハイプリダイゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の S S C溶液 （ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 150雇 ol/l塩化ナトリウム、 15雇 ol/lクェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65°C条件下でフィルター を洗浄することにより同定できる D N Aをあげることができる。 ハイブリダイ ゼ一シヨンは、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、 カレント 'プロトコ一ル ズ 'イン ·モレキュラー ·バイオロジー、 DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載さ れている方法に準じて行うことができる。 ハイプリダイズ可能な D N Aとして 具体的には、 BLAST CJ. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕 や FAST A 〔 Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕等を用いて計算したときに、 配列番 号 2で表される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する DNA、 好 ましくは 80%以上の相同性を有する DNA、 さらに好ましくは 95%以上の 相同性を有する D N Aをあげることができる。
l, 4-Ga 1 N A c転移酵素活性を有する蛋白質を製造する方法として は、 例えば上記方法により作製した該蛋白質をコードする DNAをモレキユラ ― ·クロ一ニング第 2版記載の方法に従ってべク夕一 DNAと連結することで 組換え体 DNAを作製し、 該組換え体 DNAを用いてモレキュラー ·クロ一二 ング第 2版記載の方法に従って宿主細胞を形質転換して形質転換体を取得し、 該形質転換体を該形質転換体が生育し得る適当な培地中で培養し、 該培養液中 に該蛋白質を蓄積させ、 該培養液から該蛋白質を得る方法があげられる。 また 該培養液から該蛋白質を採取するには、 該蛋白質を可溶化後、 イオン交換、 ゲ ルろ過あるいは疎水性ク口マトグラフィ一法等、 または該クロマトグラフィ一 法を組み合わせることにより単離精製する方法があげられる。
本発明の G a 1 N A c含有複合糖質は、 該蛋白質を生産する形質転換体の培 養液や培養液の処理物、 あるいは精製した該蛋白質を酵素源に用い、 受容体複 合糖質、 UDP— Ga INAcを水性溶媒中で共存させることにより得ること ができる。 受容体複合糖質は、 本発明の DN Aがコードする 1, 4— GalNAc転 移酵素活性を有する蛋白質の基質になるものであれば特に限定されないが、 好 ましくは非還元末 έ耑にガラクト一スまたは G a 1 N A cを有する糖があげられ、 より好ましい基質としては非還元末端にラクトース、 N—ァセチルラクトサミ ン、 ラクト一N—ネオテトラオース、 ラクト一N—テドラオース、 ルイス X、 ま たはルイス a構造を有するオリゴ糖をあげることができる。
生成した G a 1 NA c含有複合糖質は、 活性炭やイオン交換樹脂などを用い る通常のクロマトグラフィ一法によつて取得することができる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
[1] αΐ, 4— Ga INAc転移酵素活性を有する蛋白質を発現する形質転 換体の作製
(1) l, 4— Ga INAc転移酵素活性を有する蛋白質をコードする DN Aの調製
a l, 4一 Ga INAc転移酵素活性を有する蛋白質をコードする DNAは、 該酵素活性を有する微生物であればいずれの微生物を用いても調製できるが、 例えば、 好ましくはキャンピロパクター属に属する微生物、 より好ましくはキ ヤンピロパク夕一 ·ジェジュニ (ATCC43446)等をあげることができる。
キャンビロバクタ一属に属する微生物は、公知の方法〔例えば、 Microbiology, 144, 2049 (1998)〕 により培養できる。 培養後、 公知の方法 （例えば、 カレン ト ·プロトコ一ルズ 'イン■モレキュラー ·バイオロジー） により、 該微生物 の染色体 D N Aを単離精製する。
a l, 4一 Ga INAc転移酵素活性を有する蛋白質をコードする DNAを 含む断片は、 公知の塩基配列 〔Microbiology, 144, 2049 (1998)3に基づいた プライマーセットを調製し、 該染色体 DNAを錶型として PCR 〔例えば、 PCR Protocols, Humana Press (1993)〕 により取得することができる。
また、 公知の配列に基づいて設計された合成 DN Aをプローブとしたハイブ リダィゼーシヨン法などにより目的とする D N Aを取得することもできる。 また、 ひ 1， 4— G a I NA c転移酵素活性を有する蛋白質をコードする D N Aを合成 D N Aを用いて常法 〔例えば、 PCR Protocols, Humana Press (1993) 等〕 に従って P C R法などにより人工的に合成することも可能である。
( 2 ) a l , 4— G a l NA c転移酵素活性を有する蛋白質をコードする D NAのクローン化と塩基配列の確認
上記 （ 1 ) .で調製した D NAをそのまま、 あるいは適当な制限酵素などで切 断後、 常法によりべクタ一に連結する。
該 D NAを連結するべク夕一としては、 ェシエリヒア 'コリ K 1 2株中で自 立複製可倉 なベクタ一であればファージベクター、 プラスミ ドベクタ一等いず れも使用可能であるが、具体的には、 ZAP Express〔Stratagene社製、 Strategies, 5, 58 (1992)〕、 pBluescript II SK (+) CNucleic Acids Research, 17, 9494 (1989) 〕、 Azap II (Stratagene社製) 、 AgtlO, Agtll (DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)〕、 λ TriplEx (クローンテック社製）、 人 BlueMid
(クローンテック社製）、 人 ExCell (フアルマシア社製） 、 PT7T318U (フアル マシア社製） 、 pcD2 C ol. Cell. Biol. , 3, 280 (1983))、 pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)〕 等をあげることができる。
該ベクタ一に （ 1 ) で取得した D NAを連結して得られる組換え体: D NAの 宿主に用いるェシエリヒア ·コリは、 ェシエリヒア ·コリに属する微生物であ ればいずれでも用いることができるが、具体的には、 Escherichia coli XLl-Blue MRF5 〔Stratagene社製、 Strategies, 5, 81 (1992)〕、 Escherichia coli C600
(Genetics, 39, 440 (1954)〕、 Escherichia coli Y1088 (Science, 222, 778 (1983)〕、 Escherichia coli Y1090 〔Science, 222, 778 (1983)〕、 Escherichia coli NM522 〔J. Mol. Biol. , 1665 1 (1983)〕、 Escherichia coli K802 〔J. Mol. Biol. , 16, 118 (1966)〕、 Escherichia coli JM1Q5 〔Gene， 38, 275 (1985)〕 等をあげることができる。 組換え体 D N Aの導入方法としては、 上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法 であればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 CProc. Natl. Acad. Sci. USA, R9, 2110 (1972)〕 、 プロトプラスト法 （特開 昭 63-248394) 、 エレクトロポレ一シヨン法 Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。
上記のようにして得られた形質転換体から組換え体 D N Aを抽出し、 該組換 え体 DNAに含まれるひ 1， 4— Ga INAc転移酵素をコードする DNAの 塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定には、 通常用いられる塩基 配列解析方法、 例えばジデォキシ法〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕 または 373A'DNAシ一クェンサ一 （パーキン 'エルマ ^社製）等の塩 基配列分析装置を用いることができる。
上記のようにして取得した組換え体 D N Aを保有する形質転換体として、 例 えば配列番号 2で表される塩基配列を有するプラスミド DNAを保有する大腸 菌、 Escherichia coli NM522/pCJ2をあげることができる。
[2] a l, 4— Ga INAc転移酵素活性を有する蛋白質の調製
a l, 4一 G a INAc転移酵素活性を有する蛋白質は、 モレキュラー -ク ローニング第 2版やカレント■プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー ·バイオ ロジ一等に記載された方法等を用い、 例えば以下のように上記で取得された D NAを宿主細胞中で発現させて、 製造することができる。
即ち、 上記で取得された DN Aを基にして、 必要に応じて該蛋白質をコード する部分を含む適当な長さの DNA'断片を調製し、 該 DN A断片を適当な発現 ベクターのプロモ一夕一の下流に挿入した組換え体 DN Aを作製する。 該組換 え体 DNAを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入して形質転換体を取 得し、 該形質転換体を培地中で培養し、 該培養液にひ 1, 4— Ga INAc転 移酵素活性を有する蛋白質を蓄積せしめることにより製造できる。
宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的と する遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないし ίま染色体
D NA中への組込が可能で、 ひ 1 , 4— G a I NA c転移酵素活性を有する蛋 白質をコードする D N Aを転写できる位置にプロモータ一を含有しているもの が用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、 ひ 1 , 4 - G a l NA c 転移酵素活性を有する蛋白質をコードする D NAを含有してなる組換え体 D N Aは原核生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモーター、 リボソーム結 合配列、 本発明の D NA、 転写終結配列、 より構成されたぺク夕一であること が好ましい。 プロモ一夕一を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現べクタ一としては、 例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもべ一リ ンガーマンハイム社より巿販）、 PKK233-2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen 社製）、 pGEMEX- 1 (Promega社製）、 pQE- 8 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600 )、 KYP200 CAgric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)〕、 pLSAl CAgric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)〕、 pGELl 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescript II SK (-) (Strafagene社製） 、 pTrS30 (Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407) より調製〕、 pTrS32 (Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) より調製〕、 pPAC31 (W098/12343) 、 pGHA2 〔 Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400) より調製、 特開昭 60- 221091〕、 pGKA2 [： Escherichia coli IGKA2 (FEMBP-6798)より調製、特閧昭 60-221091〕、 pTerm2 (US468619U US4939094, US5160735)、 pSupex、 pUBllOヽ pTP5ヽ pC194、 pEG400 〔J. Bacteriol. , 172, 2392 (1990)〕、 pGEX (Pharmacia社製） 、 pETシステム (Novagen社製） 等をあげることができる。
プロモーターとしては、 宿主細胞中で機能するものであればいかなるもので もよい。例えば、 trpプロモ一夕一 （Ptrp)、 lacフ;口モータ一、 PLプロモーター、 Paプロモ一夕一、 T7プロモ一夕一等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモー 夕一をあげることができる。 また Ptrpを 2つ直列させたプロモ一夕一 （Ptrp x 2 ) 、 tacプロモー夕一、 lacT7プロモ一夕一、 let Iプロモ一夕一のように人為的に 設計改変されたプロモ一夕一等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン一ダルガノ （Shine- Dalgarno) 配列と開 始コドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜18塩基） に調節したプラスミドを用 いることが好ましい。
本発明の組換え体 D N Aにおいては、 転写終結配列は必ずしも^要ではない が、 構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 ブレビパク テリゥム属、 コリネバクテリウム属、 ミクロバクテリウム属、 シュ一ドモナス 属等に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XL1- Blue、 Escherichia coli XL2 - Blue、 Escherichia coli DH1N Escherichia coli MC1000S Escherichia coli KY3276、 Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110、 Escherichia coli NY49、 Escherichia coli GI698、 Escherichia coli TB1、 Serratia ficaria、 ■Serratia fonticola、 Serratia liquefacienss Serratia marcescenss Bacillus subtil iss Bacillus amyloliquefacines、 Corynebacterium ammoniagenes^ Brevibacterium immariophilum ATCC14068、 Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、 Brevibacterium f la蘭 ATCCl 4067、 Brevibacterium lactofermentum ATCCl 3869N Corynebacterium glutamicum ATCC13032、 Corynebacterium glutamicum ATCC13869、 Corynebacteriim acetoacidophilum ATCC13870、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354S Pseudomonas putida s Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
組換え体 D N Aの導入方法としては、 上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法 であればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕 、 プロトプラスト法 （特開 昭 63-248394)、または Gene， 17, 107 (1982)や Mol. Gen. Genet. , 168, 111 (1979) に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YEP13
(ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を あげることができる。
プロモ—夕—としては、 酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモ一夕 ―、 P H 0 5プロモ一夕一、 P G Kプロモーター、 GA Pプロモ一夕一、 AD Hプロモー夕一、 gal 1プロモー夕一、 gal 10プロモー夕一、 ヒートショックポ リペプチドプロモ一夕一、 MF «1 プロモ一夕一、 CUP 1プロモ一夕一等をあげる ことができる。
宿王細胞としては、 Saccharomyces属ヽ Schizosaccharomyces属、 Kluyveromyces 属、 Trichosporon属、 Schwanniomyces属、 Pichia属、 Candida属等に属する微生 物、 例えは、 Saccharomyces cerevisiaeN Schizosaccharomyces pomoes
Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pullulans、 Scnwanniomyces alluvius、 Candida utilis等をあげることができる。
組換え体 D N Aの導入方法としては、 酵母に D NAを導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 エレクトロボレ一シヨン法 Diethods EnzymoL , 194, 182 (1990)〕 、 スフエロプラスト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、 酢酸リチウム法〔J. BacterioL , 153, 163 (1983) 〕、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげること ができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現べクタ一として、例えば、 pcDNAI 、 pcDM8 (フナコシ社製） ヽ PAGE107〔特開平 3-22979、 Cytotechnology, 33 133 (1990)〕、 PAS3-3 (特開平 2-227075)、 pCDM8 Nature, 329, 840 (1987)〕、 pcDNAI/Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGE103〔J. Biochem.， 101, 1307 (1987)〕、 pAGE210等をあげることができる。
プロモ一夕一としては、 動物細胞中で機能するものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺伝子のプロモ一夕一、 SV40の初期プロモ一夕一、 レトロウイルスのプロモ一 夕一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒ一トショヅクプロモ一夕一、 S R a プロモー夕一等をあげることができる。 また、 ヒト C MVの I E遺伝子のェン ハンサーをプロモー夕一と共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒトの細胞であるナマルバ (Namalwa) 細胞、 サルの細胞 である COS細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特 開昭 63- 299) 等をあげることができる。
動物細胞への組換え体 D N Aの導入方法としては、 動物細胞に D N Aを導入 する方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーショ ン法 Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、 リン酸カルシウム法 (特開平 2-227075 ) 、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、 Virology, 52, 456 (1973)等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばカレント ·プロトコールズ · ィン ·モレキュラー ·ク イォロジ一、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, ( 1992)、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、 蛋白質を生産することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入べクタ一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導 入して昆虫細胞培養上清中に,組換えウィルスを得た後、 さらに,組換えウィルス を昆虫細胞に感染させ、 蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べク夕一としては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製） 等をあげることができる。 バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであ るァゥトグラファ ·カリフォルニ力 ·ヌクレア一 ·ポリへドロシス ·ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができ る。
昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞である Sf 9、 Sf21 〔 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, (1992)3、 Trichoplusia niの卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社 製） 等を用いることができる。
組換えゥィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べク 夕一と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシゥ ム法 （特開平 2-227075) 、 リポフエクシヨン法〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987.)〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現ぺク夕一として、 例えば、 T iプラスミド、 タバコモザイクウィル ベクタ一等をあげることができる。 プロモ一夕一としては、 植物細胞中で機能するものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 35Sプロモー 夕一、 ィネアクチン 1プロモ一夕一等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 アブ ラナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞等をあげること ができる。
組換え体 D N Aの導入方法としては、 植物細胞に D N Aを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテリゥム (Agrobacterium ) (特開昭 59- 140885、 特開昭 60-70080、 W094/00977) 、 エレクトロポレーショ ン法 （特開昭 60-251887)、 パ一ティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （特許 第 2606856、 特許第 2517813) 等をあげることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に 本発明の蛋白質を生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 本発明の 蛋白質を製造することができる。 本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常 の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるレ、は酵母等の真核生物を宿主 として得られた形質転換体である場合、 該形質転換体を培養する培地として、 該形質転換体が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 該形質転換 体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いて もよい。
炭素源としては、 該形質転換体が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクトース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプ ン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プ ロパノ一ルなどのアルコ一ル類等を用 ヽることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸 アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム 塩、 その他の含窒素化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コ —ンスチ一プリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガス 硫 酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培養 温度は 1 5〜4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 1 6時間〜 7日間である。 培養 中の p Hは 3 . 0〜9 . 0に保持することが好ましい。 p Hの調整は、 無機ま たは有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用い て行う。
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリン、 テトラサイクリンやクロラムフ ェニコール等の抗生物質を培地に添加してもよい。 プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換え体 D N Aで形質転 換した微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデューサ一を培地に添カロ してもよい。例えば、 プロモーターを用いた組換え体 D N Aで形質転換した 微生物を培養するときにはィソプロピル一^― D—チォガラクトビラノシド等 を、 プロモ一夕一を用いた組換え体 D N Aで形質転換した微生物を培養する ときにはィンドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている RPMI 1640培地〔J. Am. Med. Assoc. , 199, 519 (1967)〕 、 Eagle の MEM培地 〔Science, 122, 501 (1952))、 ダルベッコ改変 MEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、 1 9 9培地〔Proc. Soc. Biol. Med. , 73, 1 (1950)〕 また はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常 pH 6〜8、 3 0〜4 0 °C；、 5 % C 02存在下等の条件下で 1〜 7 日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている TNM- FH培地 （Pharmingen社製） 、 Sf-900 II SFM培地 (Life Technologies社製) 、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製) 、 Grace' s Insect Medium CNature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができ o
培養は、 通常 p H 6〜7、 2 5〜3 0 °C等の条件下で、 1〜5日間行う。 また、 培養中必要に応じて、 ゲン夕マイシン等の抗生物質を培地に添加して もよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、 細胞として、 または植物の細 胞ゃ器官に分化させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地と しては、 一般に使用されているムラシゲ 'アンド 'スクーグ (MS)培地、 ホワイ ト（White)培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイトカイニン等、 植物ホル モンを添カロした培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 5〜9、 2 0〜 4 0,°Cの条件下で 3〜 6 0日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質 を培地に添加してもよい。
上記のとおり、 本発明のポリペプチドをコードする D N Aを組み込んだ組換 え体 D N Aを保有する微生物、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体 を、 通常の培養方法に従って培養し、 該蛋白質を生成蓄積させ、 該培養物より 該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質の生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細 胞外に分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使 用する宿主細胞や、 生産させる蛋白質の構造を変えることにより、 該方法を選 択することができる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポ —ルソンらの方法〔 Biol. Chem. , 264, 17619 (1989))、 ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990)〕 、 または特開平 5-336963、 W094/23021等に記載の方法を準用することにより、 該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 本発明の蛋白質の活性部位を含む ポリぺプチドの手前にシグナルぺプチドを付加した形で生産させることにより、 本発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、 特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵 素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。 さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺伝子が導入された動物個体 （トランスジエニック非ヒト動物） または植物個， 体 （トランスジヱニック植物） を造成し、 これらの個体を用いて本発明の蛋白 質を製造することもできる。
B質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育 または栽培し、 該蛋白質を生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該蛋 白質を採取することにより、 該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、 例えば公知の方 法 Affl. J. Clin. Nutr. , 63, 639S (1996)、 Am. J. Clin. Nutr. , 63, 627S (1996) 、 Bio/Technology, 9, 830 (1991)〕 に準じて遺伝子を導入して造成した動物中 に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、 例えば、 本発明の蛋白質をコードする D N Aを導入した トランスジエニック非ヒト動物を飼育し、 該蛋白質を該動物中に生成 ·蓄積さ せ、 該動物中より該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を製造することが できる。 該動物中の生成 ·蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク （特開 昭 63-309192) 、 卵等をあげることができる。 この際に用いられるプロモータ一 としては、 動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、 例 えば、 乳腺細胞特異的なプロモ一夕一である αカゼインプロモーター、 5カゼ インプロモーター、 ラクトグロプリンプロモ一夕一、 ホエー酸性プロテイン プロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、 例えば本発明の 蛋白質をコードする D NAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法〔 組織培養， 20 (1994 組織培養， 21 (1995 Trends BiotechnoL， 15, 45 (1997) 〕 に準じて栽培し、 該蛋白質を該植物中に生成 '蓄積させ、 該植物中より該蛋 白質を採取することにより、 該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離精製するためには、 通常， の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば本発明の蛋白質が、 細胞内 に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波破砕機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホ モゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。 該無 細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、 通常の酵素の単離精 製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿 法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) —セファロ一ス、 DIAI0N HPA-75 (三菱化成 社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 プ チルセファロ一ス、 フエ二ルセファロ一ス等のレジンを用いた疎水性クロマト グラフィ一法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ 一法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を 単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができる。
また、 該蛋白質が細胞内に不溶体を形成した場合は、 同様に細胞を回収後、 破砕し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収す る。 回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。 該可溶化液を希釈 または透析し、 該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、 該蛋 白質を正常な立体構造に戻す。 該操作の後、 上記と同様の単離精製法により該 蛋白質の精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質、 あるいは該蛋白質に糖鎖の付加された蛋白質等の誘導体が 細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該蛋白質あるいは該蛋白質の誘導体 を回収することができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法に より処理することにより培養上清を取得し、 該培養上清から、 上記と同様の単 離精製法を用いることにより、 精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、 例えば配列番号 1で表されるアミ ノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、 本発明の蛋白質は、 F m o c法 （フルォレニルメチルォキシカルボ二 ル法） 、 t B o c法 （t—ブチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法によつ ても製造することができる。 また、 Advanced ChemTech社、 パーキン 'エルマ一 社、 Pharmacia社、 Protein Technology Instr匿 nt社、 Synthecell - Vega社、 PerSeptive社、 島津製作所等のぺプチド合成機を利用して化学合成することも できる。
[3] Gal N A c含有複合糖質の調製
上記 [2]記載の培養により得られた形質転換体の培養液および該培養液を 種々処理した培養液の処理物を酵素源として用い、 水性媒体中で G a INAc 含有複合糖質を製造することができる。
培養液の処理物としては、 培養液の濃縮物、 培養液の乾燥物、 培養液を遠心 分離して得られる菌体、 該菌体の乾燥物、 該菌体の凍結乾燥物、 該菌体の界面 活性剤処理物、 該菌体の超音波処理物、 該菌体の機械的摩砕処理物、 該菌体の 溶媒処理物、 該菌体の酵素処理物、 該菌体の蛋白質分画物、 該菌体の固定化物 あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
Ga INAc含有複合糖質の生成において用いられる酵素源は、 37°Cで 1 分間に 1〃モルの G a INAc含有複合糖質を生成することのできる活性を 1 単位 （U) として、 0. lmU/L l O, 000U/Lであり、 好ましくは lmU/L〜l， 000U/Lの濃度で用いる。
Ga INAc含有複合糖質の生成において用いられる水性媒体としては、 水、 りん酸塩、 炭酸塩、 酢酸塩、 ほう酸塩、 クェン酸塩、 トリスなどの緩衝液、 メ タノ一ル、 エタノールなどのアルコール類、 酢酸ェチルなどのエスデル類、 ァ セトンなどのケトン類、 ァセトアミドなどのアミド類などをあげることができ る。 また、 酵素源と,して用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることが できる。
Ga INAc含有複合糖質の生成において、 必要に応じて界面活性剤あるい は有機溶媒を添加してもよい。 界面活性剤としては、 ポリオキシエチレン ·ォ クタデシルァミン （例えばナイミーン S- 215、 日本油脂社製） などの非イオン界 面活性剤、 セチルトリメチルアンモニゥム ·プロマイドゃアルキルジメチル · ベンジルアンモニゥムクロライド （例えばカチオン F2- 40E、 日本油脂社製） な どのカチオン系界面活性剤、 ラウロイル 'ザルコシネートなどのァニオン系界 面活性剤、 アルキルジメチルァミン （例えば三級アミン FB、 日本油脂社製） な どの三級アミン類など、 G a 1 N A c含有複合糖質の生成を促進するものであ ればいずれでもよく、 1種または数種を混合して使用することもできる。 界面 活性剤は、 通常 0. 1〜50 g/Lの濃度で用いられる。 有機溶剤としては、 キシレン、 トルエン、 脂肪族アルコール、 アセトン、 酢酸ェチルなどが挙げら れ、 通常 0. 1〜5 Oml/Lの濃度で用いられる。
G a 1 N A c含有複合糖質の生成において用いられる糖ヌクレオチド基質で ある UDP— GalNAcとしては、 市販品の他、 微生物等の活性を利用して 生成した反応液ある ヽは該反応液から精製したものを用いることができる。 該糖ヌクレオチド基質は 0. 1〜50 Ommo 1ノ Lの濃度で用いる。
Ga INAc含有複合糖質の生成において用いられる受容体複合糖質として は、 糖転移酵素の基質となるものであればいずれも用いることができ、 例えば、 ラクトース、 ラクトー N—ネオテトラオースの他、 非還元末端にラクトース、 N—ァセチルラクトサミン、 ラクトー N—ネオテトラオ一ス、 ラクト一 N—テ トラオース、 パララクトー N—ネオへキサオース、 ルイス X、 またはルイス a構 造を有する 10糖以下のォリゴ糖などを例示することができる。
該受容体複合糖質は 0. 1〜50 Ommo 1/Lの濃度で用いる。
該生成反応において、 必要に応じて MnC 12等の無機塩、 ?_メルカプトェ 夕ノ一ル等を添加することができる。
GalNAc含有複合糖質の生成反応は水性媒体中、 pH5~10、 好まし くは pH6〜8、 20〜50°Cの条件で:！〜 96時間行う。
水性媒体中に生成した G a 1 N A c含有複合糖質の定量は公知の方法に準じ て行うことができる 〔化学と工業， 953 (1990)〕 。
反応液中に生成した GalNAc 含有複合糖質の採取は、 活性炭やイオン 交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
図面の簡単な説明
第 1図 a l， 4— Ga INAc転移酵素遺伝子発現プラスミ ド pC J 2の 構造を示す図である。
第 1図の符号の意味は以下の通りである。
Amp r ：アンビシリン耐性遺伝子
PL： PLプロモー夕一 ， c I 857 : c I 857リプレッサー
wl aC :ひ 1, 4一 Ga l NA c転移酵素遺伝子
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示すが、 本発明はこれら実施例に限定されるもので はない。
実施例 1 a l, 4一 Ga INAc転移酵素を発現する形質転換体の造成 キャンピロバクタ一 ·ジェジュニ (ATCC43446)を公知の方法 〔Microbiology， 144, 2049 (1998)〕 により培養した。 培養後、 カレント 'プロトコ一ルズ■ィ ン ·モレキュラー ·バイオロジーに記載されている方法により、 該微生物の染 色体 DN Aを単離精製した。
配列番号 3および 4で表される塩基配列を有する DNAをパーセプティブ · バイオシステムズ社製 8905型 DN A合成機を用いて合成した。
上言 3合成 DN Aをプライマ一セヅトとして用い、 キャンピロパクター ·ジェ ジュ二 ( ATCC43446 )の染色体 D NAを錶型として PCRを行った。 PCRは染色 体 DNA 0. lug プライマ一各 0. 5〃mo l/L、 Pf u DNAポリ メラ一ゼ（ストラタジーン社製） 2. 5ユニット、 Pfu DNAポリメラ一ゼ 用 X 10緩衝液（ストラタジーン社製） 4〃1、 deoxyNTP各 200〃mo lZ Lを含む反応液 40〃1を用い、 94 で1分間、 37 °Cで 2分間、 72でで 3分間を 1工程とする反応を 30回繰り返すことにより行った。 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、 目的の断片が増幅して いることを確認後、 残りの反応液と等量の TE[1 Ommo 1/L Tr i s- HC 1 (pH8. 0) 、 lmmo l/L ED T A]飽和フエノール/クロロホ ルム （1 vol/1 vol) を添加し、 混合した。
該混合液を遠心分離後、 得られた上層に 2倍容量の冷エタノールを加えて混合 し、 一 80°Cに 30分間放置した。該放置液を遠心分離し DN Aの沈殿を得た。 該 DNAの沈殿を 20 /1の TEに溶解した。 該溶解液 5〃1を用い、 DN Aを制限酵素 C 1 a Iおよび BamH Iで切断後、 制限酵素 C l a Iおよび B amHIで切断した pPAC31 DNA 0. 2〃gと共にライゲーシヨンキヅ ト （宝酒造社製） を用いて、 16°Cで 16時間、 連結反応を行った。
該連結反応液を用いて Escherichia coli NM522株を前述の公知の方法に従つ て形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 50 g/m 1を含む L B寒天培 地〔パクトトリプトン （ディフコ社製） 10 g/L、 酵母エキス （ディフコ社 製） 5 gZL、 NaCl 5 g/L (pH7. 2) 、 寒天 15 g/L〕 に塗布 後、 30°Cでー晚培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより、 常法に従ってプラスミドを抽出し、 該プラスミドの制限酵素部位等を解析し、 該プラスミドは目的とするプラスミ ド pC J 2であることを確認した。
以上により、 a l， 4一 Gal NAc転移酵素遺伝子を発現する形質転換株 である Escherichia coli NM522/pCJ2を取得できたことを確認した。
実施例 2 GalNAc a 1- 4Gal^卜 4GlcNAc ? 3Gal;51 - 4Glcの生産
実施例 1で得られた Escherichia coli NM522/pCJ2株をァンピシリン 50〃 g/mlを含む LB培地 8 mlの入った太型試験管に接種し、 28°Cで 17時 間培養した。該培養液をアンピシリン 50〃g/mlを含む LB培地 400 m 1の入った 2 Lバヅフル付きフラスコに 1 %接種し、 30 °Cで 4時間培養後、 さらに 40°Cで 3時間培養した。 該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。 該 湿菌体は必要に応じて— 20 Cで保存することが可能で、 使用前に解凍して用 いることができた。
100 g/L 該湿菌体、 5 Ommo 1/L クェン酸バッファ一 （p H 7. 0) 、 1 Ommo 1/L MnC 12ヽ 4 Ommo 1/L ラクト—N -ネオテト ラオ一ス、 4mmo l/L UDP-Ga INAc, 0. 4% ナイミ一ン S-215 からなる 4mlの反応液を調製し、 37 °Cで 24時間反応を行った。
反応終了後、 反応生成物をダイォネックス社製糖分析装置 (DX- 500)を用いて 以下の分析条件で分析し、 反応液中に新たなオリゴ糖 （NOS—ひ） が生成蓄 積していることを確認した。 '
分析条件
カラム： CarboPAC PA10
溶離液： A； H20、 B； 500雇 ol/L NaOH
グラジェント ： 8— 20% B in 21min
検出器：パルスドアンべロメトリー検出器 反応液を 100 °Cで 2分間熱処理した後、 遠心分離により菌体を除去した。 その上清を BioGel-P2(Bio-Rad社製）を 40 Oml充填したカラム （内径 2. 5 cm、 長さ 12 O cm) にチャージした後、 H20にて溶出した。 NOS— を 含む画分を集め、 エバポレー夕一により濃縮した。
このようにして単離した NO S—ひを日本電子製 JMS- HX110/110A質量分析 器により測定したところ、 NOS—ひの分子量が 910であることが示された。 また、 日本電子製 JNM- A400による NMR分析の結果、 主要なシグナルとして以下 に示すシグナルが得られたことから、 N0S-aの構造が GtalNAc a l-4Gal ?l- 4GlcMc H-3Gal 3 4Glcであることが判明した。
1H2.07, 2.10, 3.31, 3.61, 3.62, 3.62， 3.66, 3.66, 3.67, 3.76, 3.77, 3.77, 3.77, 3.78, 3.79, 3.83, 3.86, 4.00, 4.03, 4.08, 4.19, 4.23, 4.42, 4.47, 4.57, 4.70, 4.75, 4.93, 5.2613C22.9, 22.9, 50.8, 56.2, 61.3, 67.9, 68.9,
69.1, 70.7, 71.5, 71.6， 71.93 72.2， 12.9, 72.9， 74.6, 75.1, 77.4, 79.2,
79.2, 79.2, 82.8， 92.5, 96.5, 99.1, 103.4， 103.7, 103.9、 175.2, 175.7 実施例 3 GalNAc l-4Gal β 1- 4Glcの生産
実施例 1で得られた Escherichia coli NM522/pCJ2株をァンピシリン 50〃 g/mlを含む LB培地 8 mlの入った太型試験管に接種し、 28°Cで 17時 間培養した。 該培養液をアンピシリン 50〃g/mlを含む LB培地 400 m 1の入った 2 Lバヅフル付きフラスコに 1 %接種し、 30。Cで 4時間培養後、 さらに 40°Cで 3時間培養した。 該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。 該 湿菌体は必要に応じて一 20°Cで保存することが可能で、 使用前に解凍して用 いることができた。
100 g/L 該湿菌体、 S Ommo l/L クェン酸バッファー （p H 7 · 0) 、 10 mmo 1/L MnC 12ヽ 40 mmo 1/L ラクト一ス、 4mmo 1/L UDP-Ga INAc, 0. 4% ナイミ一ン S - 215からなる 4mlの反 応液を調製し、 37 °Cで 24時間反応を行った。
反応終了後、 反応生成物をダイォネヅクス社製糖分析装置 (DX- 500)を用いて 分析し （実施例 2に記載の分析条件と同様） 、 反応液中に新たなオリゴ糖 （N OS- ?) が生成蓄積していることを確認した。
反応液を 100°Cで 2分間熱処理した後、 遠心分離により菌体を除去した。 その上清を BioGel- P2(Bio- Rad社製）を 40 Oml充填したカラム （内径 2. 5 cm、 長さ 120 cm) にチャージした後、 H20にて溶出した。 NOS— ^を 含む画分を集め、 エバポレー夕一により濃縮した。
このようにして単離した NO S— ^を NMRにて解析したところ、 NOS— βの構造が GalNAc a l-4Gal β 4Glcであることが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明により、 ひ 1， 4— GalNAc転移酵素を遺伝子組換え手法により 大量に生産することが可能となる。 また、 該酵素を用いることにより、 Gal NAc含有複合糖質を効率的に製造できる。
「配列フリーテキスト」
配列番号 3—人工配列の説明：合成 D N A
配列番号 4—人工配列の説明：合成 DN A

Claims

請求の範囲
1. 微生物由来のひ 1, 4一 N—ァセチルガラクトサミン転移酵素
(以下、 αΐ, 4— GalNA c転移酵素と略す） 活性を有する蛋白質を発現 する形質転換体の培養液、 または該培養液の処理物を酵素源に用い、 該酵素源、 受容体複合糖質およびゥリジン二リン酸 N—ァセチルガラクトサミン （以下、 UDP— Ga lNAcと略す） を水性媒体中に存在せしめ、 該水性媒体中で N —ァセチルガラクトサミン （以下、 Ga lNAcと略す） を受容体複合糖質に 転移させることにより Ga lNA c含有複合糖質を生成蓄積させ、 該水性媒体 中から G a 1 N A c含有複合糖質を採取することを特徴とする、 GalNAc 含有複合糖質の製造法。
2. 微生物由来の α: 1， 4一 GalNAc転移酵素活性を有する蛋白質を発 現する形質転換体を培地に培養し、 培養物中に ΐ, 4— Ga lNAc転移酵 素活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、 該培養物から該蛋白質を採取すること を特徴とする、 α ΐ, 4— GalNAc転移酵素活性を有する蛋白質の製造法。
3. GalNAc含有複合糖質が、 GalNAc l-4Gal β l-4GlcNAc ?l-3Gal β l-4Glc構造を有する Ν 0 S—ひ、 または GalNAc a l-4Gal β 1 - 4Glc構造を有する NOS- ?である請求項 1に記載の製造法。
4. 微生物由来のひ 1， 4一 GalNAc転移酵素活性を有する蛋白質が、 以下の （1) 〜 （3) のいずれか 1つに記載の蛋白質である請求項 1または 2 に記載の製造法。
(1) キャンピロパク夕一属に属する微生物由来の該酵素活性を有する蛋白質
(2) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(3) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1つ以上のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ該酵素活性を有する 蛋白質
5. 形質転換体が、 微生物に組換え体 DNAを導入して得られる形質転換体 である請求項 1または 2に記載の製造法。
6. 微生物が、 ェシヱリヒア属に属する微生物である請求項 5に記載の製造 法。
7. ェシエリヒア属に属する微生物が、 ェシエリヒア 'コリである請求項 6 に記載の製造法。
8. 組換え体 DNAが、 以下の （1)〜 （6) に記載の DNAから選ばれる D N Aを含有する組換え体 D N Aである請求項 5に記載の製造法。
(1)微生物由来のひ1， 4一 GalNAc転移酵素活性を有する蛋白質をコ —ドする DNA
(2) キャンピロバク夕一属に属する微生物由来の 1， 4— GalNAc転 移酵素活性を有する蛋白質をコードする DN A
(3)配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA
(4)配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA
(5)配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1つ以上のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつひ 1, 4-Ga 1N Ac転移酵素活性を有する蛋白質をコードする DNA
(6)上記 （1) ~ (5) のいずれか 1つに記載の DN Aとストリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつひ 1 , 4-Ga INAc転移酵素活性を有 する蛋白質をコードする DN A
9. 受容体複合糖質が、 非還元末端にガラクトースまたは Ga INAcを有 する 10糖以下のオリゴ糖を含む複合糖質である請求項 1に記載の Ga 1NA c含有複合糖質の製造法。
10. オリゴ糖が、 非還元末端にラクトース、 N—ァセチルラクトサミン、 ラクトー N—ネオテトラオース、 ラクト一N—テトラオース、 パララクト一N —ネオへキサオース、 ルイス X、 またはルイス a構造を有する請求項 9に記載の
11. 培養液の処理物が、 培養液の濃縮物、 培養液の乾燥物、 培養液を遠心 分離して得られる菌体、 該菌体の乾燥物、 該菌体の凍結乾燥物、 該菌体の界面 活性剤処理物、 該菌体の超音波処理物、 該菌体の機械的摩砕処理物、 該菌体の 溶媒処理物、 該菌体の酵素処理物、 該菌体の蛋白質分画物、 該菌体の固定化物 あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品である請求項 1に記載の Gal N A c含有複合糖質の製造法。
12. 以下の （1) または （2) に記載の Gal NAc含有複合糖質。
( 1 ) GalNAc l-4Gal β l-4GlcNAc β l-3Gal β 1- 4Glc構造を有する N 0 S— ( 2 ) GalNAc a l-4Gal β 4Glc構造を有する N◦ S—
13. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を含有する、 G a 1 NAc含有複合糖質製造剤。
14. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1つ以上のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつひ 1, 4-Gal NAc転移酵素活性を有する蛋白質。
15. 以下の （1)〜（3) のいずれか 1つに記載の DNA。
(1)請求項 14に記載の蛋白質をコードする DN A
(2)配列番号 2で表される塩基配列において、 1つ以上の塩基が欠失、 置換 若しくは付加された塩基配列からなる DNAであり、 かつひ 1, 4-Ga 1N Ac転移酵素活性を有する蛋白質をコードする DN A
(3) (1) 、 （2) または配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAか ら選ばれる、 いずれか 1つの DN Aのとストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズし、 かつ《1， 4一 G a 1 NAc転移酵素活性を有する蛋白質をコード する DNA
16. 請求項 15に記載の DNAをベクターに連結して得られる組換え体!） NA。
17. 請求項 16に記載の組換え体 DN Aを宿主細胞に導入して得られる形 質転換体。
18. 宿主細胞が、 微生物である請求項 1 7に記載の形質転換体。
19. 微生物が、 ェシヱリヒア属に属する微生物である請求項 1 8に記載の 形質転換体。
20. ェシヱリヒア属に属する微生物が、 ェシヱリヒア ·コリである請求項 1 9に記載の形質転換体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRY B.N. ET AL.: "The lipopolysaccharide biosynthesis locus of campylobacter jejuni 81116", MICROBIOLOGY, vol. 144, no. PT. 8, 1998, pages 2049 - 2061, XP002942935 *
GILBERT M. ET AL.: "Biosynthesis of ganglioside mimics in campylobacter jejuni OH4384", J. BIOL. CHEM., vol. 275, no. 6, February 2000 (2000-02-01), pages 3896 - 3906, XP002942937 *
KITAGAWA H. ET AL.: "N-acetylgalactosamine (GalNAc) transfer to the common carbohydrate-protein linkage region of sulfated glycosaminoglycans", J. BIOL. CHEM., vol. 270, no. 38, 1995, pages 22190 - 22195, XP002942940 *
KITAGAWA H. ET AL.: "The tumor suppressor EXT-like gene EXTL2 encodes an alpha 1,4-N-acetylhexosaminyltransferase that transfers N-acetylgalactosamine and N-acetylglucosamine to the common glacosaminoglycan-protein linkage region", J. BIOL. CHEM., vol. 274, no. 20, 1999, pages 13933 - 13937, XP002942939 *
PARKHILL J. ET AL.: "The genome sequences of the food-borne pathogen campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences", NATURE, vol. 403, February 2000 (2000-02-01), pages 665 - 668, XP002942936 *
PRESTON A. ET AL.: "The lipopolysaccharides of pathogenic gram-negative bacteria", CRIT. REV. MICROBIOL., vol. 22, no. 3, 1996, pages 139 - 180, XP002942938 *

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