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WO2001074387A1 - Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale - Google Patents

Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale Download PDF

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Publication number
WO2001074387A1
WO2001074387A1 PCT/FR2001/000984 FR0100984W WO0174387A1 WO 2001074387 A1 WO2001074387 A1 WO 2001074387A1 FR 0100984 W FR0100984 W FR 0100984W WO 0174387 A1 WO0174387 A1 WO 0174387A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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use according
antigen
hapten
immunogen
aliphatic quaternary
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2001/000984
Other languages
English (en)
Inventor
Christine Klinguer-Hamour
Dominique Velin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pierre Fabre Medicament SA
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pierre Fabre Medicament SA filed Critical Pierre Fabre Medicament SA
Priority to EP01921451A priority Critical patent/EP1267923A1/fr
Priority to AU48441/01A priority patent/AU4844101A/en
Publication of WO2001074387A1 publication Critical patent/WO2001074387A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP

Definitions

  • the present invention relates to the use of aliphatic quaternary ammoniums, preferably Dimethyl Dioctadecyl Ammonium in the form of bromide (DDAB) or chloride (DDAC) as an adjuvant in a pharmaceutical composition which can be administered by the ucosal route, preferably nasally.
  • the invention also relates to the use of at least one quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition intended to be administered by mucosal route, and preferably by nasal route, for inducing or improving the immunity of a mammal vis -with respect to an antigen, unogenic im or hapten.
  • New vaccine approaches highlight the importance of using subunit proteins, peptides or polysaccharides for immunization.
  • these approaches involving purified proteins is the elimination of compounds responsible for undesirable effects.
  • these antigens can be selected on the basis of the immunological effect sought, for example the induction of CTL (Cytotoxic T Lymphocytes) or, on the contrary, the generation of a strong humoral type response.
  • CTL Cytotoxic T Lymphocytes
  • the disadvantage of this type of preparation is that the antigens generally have a low immunogenicity and that it is necessary to mix them with adjuvants.
  • Vaccination by mucosal route and more particularly immunization by nasal route have several advantages compared to systemic vaccination.
  • intramuscular administration of an immunogen or an antigen does not induce an immune response in the mucous membranes.
  • These mucosal responses play an essential role against an invasion of a pathogen with an entrance door and / or a mucosal tropism.
  • mucosal immunizations induce the production of specific IgA directly at the site of infection. These antibodies can inhibit the attachment of pathogens to the mucosa and colonization of the latter.
  • mucosal immunization can stimulate a systemic response of the IgG type which will represent a second barrier against the invasion of tissues by the pathogenic microorganism.
  • the administration of a vaccine by nasal route is easier than an injection by systemic route.
  • cholera toxin The cholera toxin (CTB) subunit B will allow the immune system to generate a mucosal and systemic immune response directed against an immunogen or an antigen administered by the mucosal route in association with CTB.
  • CTB cholera toxin
  • OMV outer membrane vesicles
  • CTB cholera toxin B
  • a protein from the outer membrane of Neisseria meningitidis is used mixed with hapten as an adjuvant for nasal immunization (Van de Verg LL., Infection and immunity, 1996, 64: 5263-5268).
  • hapten as an adjuvant for nasal immunization
  • PCT / FR 99/00703 the international patent application filed under No. PCT / FR 99/00703 on March 26, 1999 describing the use of the protein OmpA of Klebsiella pneumoniae for the preparation of vaccines which can be administered by the nasal route, in particular for the prevention or treatment of respiratory syncytial virus (RSV) infections.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • Another alternative allowing the obtaining of mucosal and systemic immune responses against an immunogen or an antigen administered by the mucosal route and the expression of said immunogen in a living vector can be of bacterial or viral type.
  • the bacteria used are attenuated pathogens (Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Calmette-Guerin bacillus (BCG)) or non-pathogenic bacteria such as lactic acid bacteria or Staphylococci.
  • Adenoviruses or poxviruses are also used as vectors delivering immunogens to the mucous membranes.
  • vaccine with a living vector as the active ingredient.
  • the immunogen or antigen can also be incorporated or combined with chemical preparations: liposomes, ISCOM, polylactic acid, poly (lactide-co-glycolide) acid and detergents
  • DDAB is cited as a cationic surfactant.
  • These compositions form complexes with DNA and are used to transfect cells, i.e. to transport genes into cells.
  • the mode of administration of these formulations envisaged and described is the injectable route of the intramuscular and subcutaneous type.
  • the compositions described are in the form of an emulsion of DDAB in combination with an oil.
  • the present invention relates to the use of aliphatic quaternary ammoniums of general formula (I):
  • Ri, R2, R3 and R4 represent a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl group comprising from 1 to 30 carbon atoms
  • X represents an anion, as an adjuvant in a pharmaceutical composition which can be administered by mucosal route, preferably nasal .
  • R1 and R2 independently of one another represent a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl group comprising from 1 to 8 carbon atoms, and preferably from 1 to.
  • R3 and R4 independently of one another represent a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl group, comprising from 10 to 30 carbon atoms, and preferably from 16 to 20.
  • X represents a halogen atom.
  • the aliphatic quaternary ammonium is chosen from dimethyl dioctadecyl ammonium in the form of bromide (DDAB) or chloride (DDAC) of formula:
  • the present invention also relates to the use of an aliphatic quaternary ammonium of formula (I) as defined above for the preparation of a pharmaceutical composition intended to be administered by mucosal route, and preferably by nasal route, for inducing or improve the immunity of a mammal against an antigen, immunogen or hapten.
  • said aliphatic quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition according to the invention is at a concentration of between 0.01 mg / ml to 100 mg / ml, preferably between 1 mg / ml to 50 mg / ml, and more preferably between 2 mg / ml and 50 mg / ml.
  • the present invention also comprises the use of an aliphatic quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition according to the invention comprises said aliphatic quaternary ammonium of formula (I) mixed with said antigen, immunogen or hapten.
  • said antigen, immunogen or hapten is chosen from proteins, peptides, glycopeptides, lipopeptides, polysaccharides, oligosaccharides, nucleic acids or lipids.
  • peptide is also intended to denote a protein or a polypeptide, these three terms being used interchangeably.
  • the present invention relates to the use of an aliphatic quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition according to the invention, characterized in that said antigen, immunogen or hapten derives from a microorganism such as a virus , bacteria, parasites or fungi.
  • the antigen, immunogen or hapten according to the invention will comprise at least one fragment of said microorganism, such as a fragment known to contain an antigenic epitope, or that a person skilled in the art will be able to determine for its capacity to confer the desired immunity by standard techniques such as those described in the examples below.
  • said antigen or hapten is of peptide nature or a DNA coding for such an immunogenic peptide.
  • the present invention relates to the use of an aliphatic quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition according to the invention, characterized in that said antigen, immunogen or hapten comprises at least one peptide derived from responsible microorganism airway pathologies, in particular chosen from RSV, para influenza virus (PIV), influenza virus, hantaviruses, streptococci, pneumococci, haemophilus influenzae type b, rhinoviruses, coronoviruses and meningococci.
  • responsible microorganism airway pathologies in particular chosen from RSV, para influenza virus (PIV), influenza virus, hantaviruses, streptococci, pneumococci, haemophilus influenzae type b, rhinoviruses, coronoviruses and meningococci.
  • said antigen, immunogen or hapten comprises at least one peptide derived from human or bovine respiratory syncytial virus (RSV), in particular a fragment of protein G from RSV, such as a peptide chosen from those identified in the list sequences SEQ ID No. 2 to SEQ ID No. 74 of the international patent application filed under No. PCT / FR 99/00703 on March 26, 1999 (published under No. WO 99/49892), or a selected peptide among those identified in the list of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 22 of the international patent application filed under No. PCT / FR 98/01570 on July 17, 1998 (published under No.
  • RSV human or bovine respiratory syncytial virus
  • VRS peptide sequences incorporated herein by reference, more particularly, the peptides G2Na (also known as G2A) of sequence SEQ ID No. 2 (PCT / FR 99 / 00703) and G5a of sequences SEQ ID No. 5 (PCT / FR 98/01570), or the peptides exhibiting, after optimal alignment with these sequences, a percentage identity of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 99%.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window” to identify and compare the regions sequence similarity locale.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out, besides manually, by means of the algorithm of local homology of Smith of Waterman (1981) (Ad. App. Math.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences per comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared. may include additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window. and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • BLAST 2 sequences available on the website http://www.ncbi.nim.nih.gov/gorf/bl2.html, the parameters "open gap pensitie”: 5, and “extension gap penaltie”: 2; the chosen matrix being for example the "BLOSUM 62" matrix proposed by the program), the percentage of identity between the two sequences to be compared being calculated directly by the program.
  • the invention also relates to the use of an aliphatic quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition according to the invention, characterized in that said antigen, immunogen or hapten derives from a tumor cell.
  • antigens immunogens or haptens derived from a tumor cell
  • the tumor antigen is associated with or specific to a tumor cell. It is in particular chosen from any compound capable of specifically directing a CTL response against said tumor cell.
  • the invention also relates to the use of an aliphatic quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition according to the invention, characterized in that said antigen, immunogen or hapten is associated, by mixing or by coupling, with a carrier compound.
  • said carrier compound is chosen from the group of peptides comprising toxoids, in particular diphtheria toxoid (DT) or tetanus toxoid (TT), proteins derived from streptococcus (such as the protein for binding to human serum albumin, called “ BB “described in the patent application published under the number WO 96/14415), the membrane proteins OmpA or OmpC (OmpA or OmpC for" "Outer Membrane Protein type A” and “Outer Membrane Protein type complex”) or Heat shock proteins (HSP).
  • toxoids in particular diphtheria toxoid (DT) or tetanus toxoid (TT)
  • proteins derived from streptococcus such as the protein for binding to human serum albumin, called " BB “described in the patent application published under the number WO 96/14415
  • the membrane proteins OmpA or OmpC OmpA or OmpC for" "Outer Membrane Protein type A”
  • said carrier compound is covalently coupled with the antigen or the hapten.
  • linking elements in particular amino acids to facilitate the coupling reactions between the carrier compound and the antigen or the hapten, in particular when they are of peptide nature.
  • the covalent coupling of the antigen or the hapten can be carried out at the N or C terminus of the carrier compound.
  • the bifunctional reagents allowing this coupling will be determined according to the end of the chosen carrier compound and the nature of the antigen or the hapten to be coupled. These coupling techniques are well known to those skilled in the art.
  • the conjugates resulting from a coupling of peptides can also be prepared by genetic recombination.
  • the hybrid (conjugated) peptide can in fact be produced by recombinant DNA techniques by insertion or addition to the DNA sequence coding for the carrier compound, of a sequence coding for the antigen, immunogenic or hapten peptides. These techniques for preparing hybrid peptide by genetic recombination are well known to those skilled in the art (cf. for example SC MAKRIDES, 1996, Microbiologicals Reviews, 60.3, 512-538).
  • said carrier compound is a protein derived from streptococcus or an OmpA membrane protein from enterobacteria, in particular from Klesiella pneumoniae, or one of its fragments, fragments preferably capable of exerting the “carrier” activity of the whole protein, from which they come.
  • carrier compound is the protein P40 as identified in the international patent application filed under No. PCT / FR 99/00703 on March 26, 1999 by the sequence SEQ ID No. 1 (published under No. WO 99/49892), corresponding to the OmpA of Klebsiella pneumoniae, or a protein whose sequence has, after optimal alignment with this sequence SEQ ID No. 1, a percentage identity of at least 80%.
  • the invention also relates to the use of an aliphatic quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition also comprises a second adjuvant different from the aliphatic quaternary ammoniums of formula (I) .
  • said second adjuvant is chosen from the group of adjuvants comprising MPL-A (MonoPhospho Lipide A), Quil-A (saponins derived from Quillage saponaria Molina), ISCOM (for “Immune Stimulating COMplexes”), CpG (oligodeoxynucleotides containing the Cytosine- Phosphorothioate-Guanide immunostimulatory dinucleotide motifs, Leif (protein derived from Leishmania known to stimulate human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)), CT (cholera toxin) or LT (“Heat”) labile enterotoxin "heat labile enterotoxin), as are the detoxified versions of CT or LT.
  • MPL-A MonoPhospho Lipide A
  • Quil-A saponins derived from Quillage saponaria Molina
  • ISCOM for “Immune Stimulating COMplexes”
  • CpG oli
  • the present invention relates to the use of an aliphatic quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition according to the invention, characterized in that the mixture of aliphatic quaternary ammonium of formula (I) and immunogen, antigen or hapten, possibly associated with the carrier compound, is incorporated into vectors making it possible to ensure and / or improve their stability or their bioavailability, in particular the vectors chosen from liposomes, virosomes, nanospheres, microspheres or microcapsules.
  • the present invention also comprises the use of an aliphatic quaternary ammonium for the preparation of a pharmaceutical composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition also comprises a cytokine or a growth factor, in particular IL- 12, IL-2, GM-CSF and IL-18, which potentiates the response.
  • a cytokine or a growth factor in particular IL- 12, IL-2, GM-CSF and IL-18, which potentiates the response.
  • the present invention also comprises the use of an aliphatic quaternary ammonium of formula (I) as defined above for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial or parasitic infections.
  • the present invention also relates to the use of an aliphatic quaternary ammonium of formula (I) for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers and preferably to inhibit the growth of tumors.
  • the invention also relates to the use of at least one aliphatic quaternary ammonium of formula (I) as defined above in combination with a therapeutic substance for the preparation of a pharmaceutical composition intended to be administered by mucosal route, and preferably nasally.
  • Said therapeutic substance is especially chosen from antibiotics, hormones, anticancer drugs, anti-inflammatory drugs, vitamins, trace elements, growth factors and monoclonal antibodies.
  • Another subject of the invention is the use of at least one aliphatic quaternary ammonium of formula (I) as defined above, in combination with a nucleic acid sequence which can be included in a vector for the preparation of '' a pharmaceutical composition intended to be administered by mucosal route, and preferably by nasal route.
  • the subject of the invention is also the use of an aliphatic quaternary ammonium of formula (I) as defined above and of a nucleic acid sequence in or for the preparation of a pharmaceutical composition allowing expression of a peptide encoded by said nucleic acid sequence in the cells of the organism receiving the preparation and preferably the epithelial cells of the respiratory tract.
  • An object of the invention is the use of at least one quaternary ammonium of formula (I) as defined above in association with a living vector expressing an antigen, immunogen or hapten for the preparation of a pharmaceutical composition intended to be administered by mucosal route, and preferably by nasal route.
  • composition or a vaccine as defined above in solid form is a further object of the invention.
  • This composition or vaccine can in particular be in the form of powder, suppository or ovum.
  • the subject of the invention is also an aqueous suspension comprising an aliphatic quaternary ammonium of general formula (I):
  • RI, R2, R3 and R4 represent a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl group, comprising from 1 to 30 in which RI, R2, R3 and R4 independently represent a linear or branched alkyl group , saturated or unsaturated, comprising from 1 to 30 carbon atoms, and X represents an anion.
  • aqueous suspension comprising an aliphatic quaternary ammonium as defined according to the invention
  • a composition in which said aliphatic quaternary ammonium is suspended in an aqueous solution, in particular in water or an aqueous buffer such as PBS (for phosphate buffered saline) or any other aqueous buffer, preferably for amounts ranging from 0.01 mg / ml to 100 mg of quaternary ammonium / ml of aqueous solution, preferably from 1 mg / ml to 50 mg / ml, then the composition being homogenized, in particular by means of a vortex, to give the said aqueous suspension.
  • PBS for phosphate buffered saline
  • any other aqueous buffer preferably for amounts ranging from 0.01 mg / ml to 100 mg of quaternary ammonium / ml of aqueous solution, preferably from 1 mg / ml to 50 mg /
  • an aqueous suspension according to the invention cannot, by definition, comprise an oil or an oil-based emulsion as described in particular in the documents cited in the introduction.
  • said aqueous suspension comprises an aliphatic quaternary ammonium in which general formula RI and R2 independently of one another represent a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl group, comprising from 1 to 8 carbon atoms, and preferably from 1 to 4.
  • R3 and R4 represent in this general formula, independently of one another, a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl group, comprising from 10 to 30 carbon atoms, and preferably from 16 at 20.
  • X represents in this general formula a halogen atom.
  • the invention relates to an aqueous suspension comprising an aliphatic quaternary ammonium chosen from dimethyl dioctadecyl ammonium in the form of bromide (DDAB) or chloride (DDAC) of formula:
  • the invention further relates to an aqueous suspension according to the present invention as a medicament, preferably as an adjuvant, in particular immunity.
  • the invention further relates to an aqueous suspension according to the present invention, said aqueous suspension further comprising an antigen, immunogen or hapten as defined above in the uses according to the invention, in particular derived from a microorganism such as a virus, bacteria, parasite or fungus, or associated with a tumor cell.
  • the invention further relates to an aqueous suspension according to the present invention, said aqueous suspension further comprising a second adjuvant different from said aliphatic quaternary ammoniums of formula (I) as defined above, and preferably chosen from the group of adjuvant including MPL-A, Quil-A, ISCOM, CpG, Leif, CT, LT or detoxified versions of CT or LT.
  • the subject of the invention is also a device suitable for administration by mucosal route, and in particular nasal route, characterized in that it contains a composition or a vaccine as defined above.
  • This device can in particular be an aerosol device comprising or not a propellant.
  • Figure 1A Systemic response obtained after administration via the nasal route of BBG2Na associated with DDA.
  • Figure 1B Mucosal response obtained after administration by the nasal route of BBG2Na associated with DDA.
  • Figure 2A Systemic response obtained after administration via the nasal route of G2Na associated with DDA.
  • Figure 2B Mucosal response obtained after administration via the nasal route of G2Na associated with DDA.
  • Figure 3 Systemic response obtained after administration via the nasal route of BBG2Na associated with DDA in the cottons rat.
  • Figure 4A Systemic response obtained after nasal administration of DT associated with DDA.
  • Figure 4B Mucosal response obtained after nasal administration of DT associated with DDA.
  • Figure 5A Systemic response obtained after nasal administration of TT associated with DDA.
  • Figure 5B Mucosal response obtained after nasal administration of TT associated with DDA.
  • Example 1 Production of a recombinant chimeric protein BBG2Na
  • This example illustrates the obtaining of recombinant BBG2Na from a culture of Escherichia coli bacteria, transformed by a plas ide expression vector, called pvaBBG2Na: the plasmid contains the gene coding for the Albumin binding domain of the G protein of Streptococcus (BB) followed by a G2Na fragment of 101 aa of GRS protein of RSV (Long strain) (aa 130 to aa 230 of whole protein G of human RSV type A), the expression of the gene is under the control of promoter of the tryptophan operon
  • Amplicillin 0.1; Tetracycline 0.008; Thiamine, 0.07; magnesium sulfate, 1 and 1 ml / 1 of trace element solution and 0.65 ml / 1 of vitamin solution.
  • the following are kept constant: the feeding of carbon sources (glycerol and / or glucose); the pH at 7.3; the temperature at 37 ° C; the dissolved oxygen tension signal at 30%.
  • the turbidity of the culture at 580 nm
  • the expression of the protein is induced by adding indole acrylic acid (IAA) to the final concentration of 25 mg / 1 approximately 3 hours later, the cells are harvested by centrifugation. About 150 g of wet biomass are obtained per liter of culture.
  • a fraction of biomass (approximately 30 g) is resuspended in a TST solution (50 mM Tris-HCl buffer pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.05% Tween 20 and 0.5 mM EDTA).
  • the cells can be lysed either by sonication or using a press, for example of the “French press” type. After centrifugation of the cell lysate, it is filtered through 1.2 mm, the soluble proteins can be purified directly on an affinity column, the insoluble proteins (inclusion bodies) present in the majority are dissolved in 30 ml of 7 M guanidine hydrochloride.
  • the DDA is suspended in PBS, 0.9% NaCl or any other buffer (from 0.01 mg / ml to 40 mg / ml), vortexed for 2 min, followed by an optional sonication step for 20 min in a water bath. ultrasound. Then add an adequate amount of a solution of BBG2Na solubilized in water. This solution is stirred. The amount of BBG2Na adsorbed measured by BCA is 100% at a DDA concentration of 3 mg / ml.
  • DDA is suspended in water (0.01 mg / ml to 20 mg / ml).
  • the DDA solution is heated for 30 min at 62 ° C. It is then left at room temperature. When the temperature is approximately 37 ° C., an adequate amount of a solution of BBG2Na dissolved in water is added, as well as an adequate amount of mannitol.
  • the mixture is then frozen and lyophilized.
  • the lyophilisate can be taken up in “ppi” quality water (preparation for injection) before the injection.
  • Example 4 Administration by the nasal route of BBG2Na associated with DDA a. Systemic response
  • mice Groups of 5 mice are immunized by the nasal route on day 0, 10 and 20 with 20 ⁇ l of isotonic saline preparation (PBS) alone or containing 40 ⁇ g of BBG2Na associated or not with 400 ⁇ g of DDA or with 10 ⁇ g of Cholera Toxin B (CTB).
  • PBS isotonic saline preparation
  • CTB Cholera Toxin B
  • the sera of the mice are recovered, then the serum titers of the total immunoglobulins G (IgG) directed against the G2Na antigen are determined by ELISA.
  • IgG immunoglobulins G
  • FIG. 1A shows the results obtained. It can be noted that the control groups (PBS, BBG2Na 40 ⁇ g) do not exhibit anti-G2Na serum titers, on the contrary the BBG2Na 40 ⁇ g + DDA or BBG2Na 40 ⁇ g + CTB groups show very strong anti-G2Na titers.
  • IgA immunoglobulins A
  • Figure 1B shows the results obtained. It can be noted that the control groups (PBS, BBG2Na 40 ⁇ g) do not present anti-G2Na IgA, on the contrary the BBG2Na 40 ⁇ g + DDA or BBG2Na 40 ⁇ g + CTB groups show very high anti-G2Na IgA titers .
  • Example 5 Administration by the nasal route of G2Na associated with DDA a.
  • Systemic response Groups of 5 mice are immunized by the nasal route on day 0, 10 and 20 with 20 ⁇ l of isotonic saline preparation (PBS) alone or containing 20 ⁇ g of G2Na associated or not with 400 ⁇ g of DDA or 10 ⁇ g of Cholera Toxin B (CTB).
  • PBS isotonic saline preparation
  • CTB Cholera Toxin B
  • the sera of the mice are recovered, then the serum titers of the total immunoglobulins G (IgG) directed against the G2Na antigen are determined by ELISA.
  • IgG immunoglobulins G directed against the G2Na antigen
  • Figure 2A shows the results obtained. It can be noted that the control groups (PBS, G2Na 20 ⁇ g) have no or very few anti-G2Na serum titers, on the contrary, the groups
  • G2Na 20 ⁇ g + DDA or G2Na 20 ⁇ g + CTB show very strong anti-G2Na titres.
  • mice Groups of 5 mice are immunized by the nasal route on day 0, 10 and 20 with 20 ⁇ l of isotonic saline preparation (PBS) alone or containing 20 ⁇ g of G2Na associated or not with 400 ⁇ g of DDA or with 10 ⁇ g of Cholera Toxin B (CTB).
  • PBS isotonic saline preparation
  • CTB Cholera Toxin B
  • the nasal fluids of the mice are recovered, then the titers of immunoglobulins A (IgA) directed against the G2Na antigen are determined by ELISA.
  • IgA immunoglobulins A directed against the G2Na antigen
  • Figure 2B shows the results obtained. It can be noted that the control groups (PBS, G2Na 20 ⁇ g) do not present anti-G2Na IgA, on the contrary, the G2Na 20 ⁇ g + DDA or G2Na 20 ⁇ g + CTB groups show very high anti-IgA titers G2Na.
  • EXAMPLE 6 Administration by the nasal route of G2Na associated with DDA Groups of 6 cottons rats are immunized by the nasal route on day 0, 10, 20 and 30 with 20 ⁇ l of isotonic saline preparation (PBS) alone or containing 40 ⁇ g of BBG2Na, 400 ⁇ g of DDA or 40 ⁇ g of BBG2Na associated with 400 ⁇ g of DDA. A last group received 80 ⁇ g of BBG2Na associated with 400 ⁇ g of DDA solubilized in water. On day 40, the sera of the cottons rats are recovered, then the serum titers of the total immunoglobulins G (IgG) directed against the G2Na antigen are determined by ELISA.
  • IgG immunoglobulins G
  • Figure 3 shows the results obtained. It can be noted that the control groups (PBS, PBS + DDA, BBG2Na 40 ⁇ g + PBS) show little or no anti-G2Na serum titers, on the contrary, the BBG2Na 40 ⁇ g + DDA + PBS or BBG2Na 80 ⁇ g + DDA + PBS groups show very strong anti-G2Na titres.
  • the control groups PBS, PBS + DDA, BBG2Na 40 ⁇ g + PBS
  • BBG2Na 80 ⁇ g + DDA + PBS groups show very strong anti-G2Na titres.
  • Example 7 Administration via the nasal route of DT associated with DDA a. Systemic response
  • mice Groups of 5 mice are immunized by the nasal route on day 0, 10 and 20 with 20 ⁇ l of isotonic saline preparation (PBS) alone or containing 10 ⁇ g of DT associated or not with 400 ⁇ g of DDA or with 10 ⁇ g of Cholera Toxin B (CTB).
  • PBS isotonic saline preparation
  • CTB Cholera Toxin B
  • the sera of the mice are recovered, then the serum titers of the total immunoglobulins G (IgG) directed against the DT antigen are determined by ELISA.
  • IgG immunoglobulins G
  • Figure 4A shows the results obtained. It can be noted that the control groups (PBS, DT 10 mg) show no or very few anti-DT serum titers, on the contrary, the groups
  • mice Groups of 5 mice are immunized by the nasal route on day 0, 10 and 20 with 20 ⁇ l of isotonic saline preparation (PBS) alone or containing 10 ⁇ g of DT associated or not with 400 ⁇ g of DDA or with 10 ⁇ g of Cholera Toxin B (CTB).
  • PBS isotonic saline preparation
  • CTB Cholera Toxin B
  • the nasal fluids of the mice are recovered, then the titers of immunoglobulins A (IgA) directed against the DT antigen are determined by ELISA.
  • IgA immunoglobulins A
  • FIG. 4B shows the results obtained. It can be noted that the control groups (PBS, DT 10 ⁇ g) do not have anti-DT IgA, on the contrary, the DT groups 10 ⁇ g + DDA or DT 10 ⁇ g + CTB show very high anti-IgA titers DT.
  • Example 8 Administration by the nasal route of TT associated with DDA a. Systemic response
  • mice are immunized by the nasal route on day 0, 10 and 20 with 20 ⁇ l of isotonic saline preparation (PBS) alone or containing 10 ⁇ g of TT associated or not with 400 ⁇ g of PBS
  • Figure 5A shows the results obtained. It can be noted that the control groups (PBS, TT 10 ⁇ g) have no or very few serum anti-TT titers, on the contrary, the groups
  • TT 10 ⁇ g + DDA or TT 10 ⁇ g + CTB show very strong anti-TT titres.
  • b. Mucosal response Groups of 5 mice are immunized by the nasal route on day 0, 10 and 20 with 20 ⁇ l of isotonic saline preparation (PBS) alone or containing 10 ⁇ g of TT associated or not with 400 ⁇ g of DDA or with 10 ⁇ g of Cholera toxin B (CTB).
  • PBS isotonic saline preparation
  • CTB Cholera toxin B
  • the nasal fluids of the mice are recovered, then the titers of immunoglobulins A (IgA) directed against the TT antigen are determined by ELISA.
  • IgA immunoglobulins A
  • Figure 5B shows the results obtained. It can be noted that the control groups (PBS, TT 10 ⁇ g) have no or very little anti-TT IgA, on the contrary, the groups TT 10 ⁇ g + DDA or TT 10 ⁇ g + CTB show very high titers of Anti-TT IgA.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques, de préférence du diméthyl dioctadécyl ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale, de préférence nasale.

Description

UTILISATION D'AMMONIUMS QUATERNAIRES ALIPHATIQUES COMME ADJUVANT DANS UNE COMPOSITION PHARMACEUTIQUE ADMINISTRABLE PAR VOIE MUCOSALE
La présente invention concerne l'utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques, de préférence du Dimethyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie ucosale, de préférence nasale. L'invention porte également sur l'utilisation d'au moins un ammonium quaternaire pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale, pour induire ou améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène, im unogène ou haptène. Les nouvelles approches vaccinales soulignent l'importance de l'utilisation de protéines sous unitaires, de peptides ou de polysaccharides pour l'immunisation. L'avantage de ces approches mettant en jeu des protéines purifiées est l'élimination de composés responsables d'effets indésirables. Par ailleurs, ces antigènes pourront être sélectionnés sur la base de l'effet immunologique recherché comme par exemple l'induction de CTL (Lymphocytes T Cytotoxiques) ou au contraire la génération d'une forte réponse de type humoral. Cependant, le désavantage de ce type de préparation est que les antigènes possèdent généralement une faible immunogénicité et qu' il est nécessaire de les mélanger à des adjuvants.
Un autre axe de recherche particulièrement étudié en matière de vaccin concerne les voies mucosales . L'immunisation par voie mucosale représente en effet un formidable enjeu dans la mesure où la majorité des pathogènes initient une infection en interagissant avec les muqueuses de l'hôte et qu'après colonisation de la muqueuse, certains micro-organismes génèrent une maladie par le biais d'une sécrétion de facteurs toxiques alors que d'autres pénètrent les tissus de l'hôte pour générer des maladies systémiques . Les défenses mucosales sont par conséquent très importantes dans le contrôle de l'infection et le déroulement de la maladie.
La vaccination par voie mucosale et plus particulièrement l'immunisation par voie nasale présentent plusieurs avantages par rapport à la vaccination systémique. En effet, l'administration intramusculaire d'un immunogène ou d'un antigène n'induit pas de réponse immunitaire au niveau des muqueuses. Ces réponses muqueuses jouent pourtant un rôle essentiel contre une invasion d'un pathogène à porte d'entrée et/ou à tropisme muqueux. Tout d'abord, les immunisations par voie mucosale induisent la production d' IgA spécifiques directement au site de l'infection. Ces anticorps peuvent inhiber l'attachement des pathogènes à la muqueuse et la colonisation de celle-ci. Par ailleurs, en plus de la réponse locale, une immunisation par voie muqueuse peut stimuler une réponse systémique de type IgG qui représentera une seconde barrière contre l'invasion des tissus par le micro-organisme pathogène. Enfin, d'un point de vue pratique, l'administration d'un vaccin par voie nasale est plus aisée qu'une injection par voie systémique.
L'utilisation de vaccin par voie orale ou par voie nasale aurait une grande influence sur l' éradication de germes pathogènes. En effet, toute modification d'un vaccin lui permettant d'être utilisé avec une plus grande flexibilité (thermostabilité, distribution sans seringue, ...) aurait pour conséquence une vaccination plus efficace et plus étendue. D'autre part, l'immunisation par les voies muqueuses permet d' induire une immunité locale constituant la première barrière à l'invasion par un micro-organisme. Le problème majeur rencontré lors d'un protocole d'immunisation par la voie muqueuse est l'état de tolérance qui est en général obtenu avec les préparations vaccinales. Cet état de tolérance est nécessaire pour maintenir l'homéostasie entre le soi et le milieu extérieur, par exemple il permet que l'organisme ne reconnaisse pas comme étranger les aliments nécessaire à sa survie. A l'image de ce qui est pratiqué lors des vaccinations systémiques, les préparations vaccinales administrées par la voie muqueuse doivent être associées à des adjuvants pour induire des réponses immunitaires efficaces. De nombreuses molécules chimiques et biologiques sont utilisées comme adjuvants muqueux, le plus connu et le plus efficace est dérivé d'une toxine sécrétée par une bactérie : la toxine cholérique. La sous unité B de la toxine cholérique (CTB) va permettre au système immunitaire de générer une réponse immunitaire muqueuse et systémique dirigée contre un immunogène ou un antigène administré par la voie muqueuse en association avec la CTB. Bien que la CTB soit potentiellement un très bon adjuvant muqueux, son utilisation chez l'homme nécessite la démonstration de sa totale innocuité. Des préparations d'enveloppes bactériennes de Neisseria menlngitidis (OMV : outer membrane vésicules) peuvent également servir de vecteur pour induire une réponse immunitaire muqueuse et systémique contre un antigène incorporé dans ces OMV. Bien que des études chez l'animal aient donné des résultats très prometteurs, la production à l'échelle industrielle des OMV est un processus qui va demander un gros effort afin d'obtenir une reproductibilité du produit final .
D'autres essais ont ainsi été effectués sur des administrations mucosales de la PspA qui correspond à la protéine de surface A de Pneumocoque (Briles D.E., brevet EP 0 682 950) sur les filaments d'hémaglutinine (Capron A., brevet
FR 2 718 750 ; Ki ura A., brevet EP 0 471 177 ; Shahin R.D., brevet US 7532327) , sur un fragment de la toxine tétanique
(Dougant G., brevet WO 93/21950), sur le choléra toxin B (CTB).
Une protéine de la membrane externe de Neisseria meningitidis est utilisée mélangée à l'haptene en tant qu'adjuvant pour une immunisation par voie nasale (Van de Verg LL., infection and immunity, 1996, 64 : 5263-5268) . On peut encore citer la demande internationale de brevet déposée sous le No. PCT/FR 99/00703 le 26 mars 1999 décrivant l'utilisation de la protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae pour la préparation de vaccins administrables par voie nasale, notamment pour la prévention ou le traitement des infections par le virus syncytial respiratoire (VRS) .
Une autre alternative permettant l'obtention de réponses immunitaires muqueuse et systémique contre un immunogène ou un antigène administré par la voie muqueuse et l'expression dudit immunogène dans un vecteur vivant. Différents vecteurs vivants sont en cours de développement pré-clinique ou clinique, ces vecteurs peuvent être de type bactérien ou viral. Les bactéries utilisées sont des pathogènes atténuées (Salmonella typhi, Vibrio cholerae, bacille de Calmette-Guerin (BCG) ) ou des bactéries non pathogènes comme des bactéries lactiques ou des Staphylocoques. Des adénovirus ou poxvirus sont également utilisés comme vecteurs délivrant des immunogènes au niveau des muqueuses. L'utilisation de ces vecteurs vivants pose également de très gros problèmes de sécurité sanitaire, en effet, ces organismes sont génétiquement modifiés et les conséquences de leur dissémination dans la nature ne sont pas connues et devront être définies avant toute mise sur le marché de nouveau vaccin avec un vecteur vivant comme principe actif. L' immunogène ou l'antigène peut également être incorporé ou associé à des préparations chimiques : liposomes, ISCOM, acide polylactique, acide poly (lactide-co-glycolide) et des détergents
(polysorbates, caprylic/capric glycérides par exemple) . Ces préparations chimiquement définies permettent dans certains cas une production industrielle de la préparation vaccinale et la mise en place d'études de toxicité pré-clinique et clinique bien adaptées assurant une définition optimale des critères d'innocuité du vaccin.
Il est connu que les détergents sont indispensables à la solubilisation de nombreuses protéines, et notamment les protéines issues de membranes, et ces complexes protéines/détergents qui forment des micelles peuvent être utilisés comme immunogènes par voie systémique dans des protocoles expérimentaux (Mukhlis et al. 1984, Vaccine 2, 199- 203 ; Playfair J. H. L. et al . , 1988, Parasite Immunol. 8, 409- 414) . Il est connu que les bases azotées aliphatiques, parmi lesquelles se trouve cité le chlorure de dimethyl dioctadécyl ammonium peuvent être utilisées comme adjuvants par voie systémique (Gall, D. 1966. The adjuvant activity of aliphatic nitrogenous bases. Immunology 11:369). Un brevet européen revendique l'utilisation d'une suspension adjuvante de bromure de dimethyl dioctadécyl ammonium stabilisée à l'aide de Carbopol® comme vaccin (EP 0 273 512).
On peut également citer la demande de brevet publiée sous le numéro WO 98/33932 qui concerne des émulsions huile/eau composées de 2 à 30 % d'huile, de 0,01 % à 20 % de tensioactif, notamment cationique, en solution aqueuse. Comme tensioactif cationique est cité le DDAB. Ces compositions forment des complexes avec 1 'ADN et sont utilisées pour transfecter des cellules, i.e. pour transporter des gènes dans les cellules. On peut également citer le brevet publié sous le numéro US 5,951,988 qui a pour objet de nouvelles formulations adjuvantes comprenant un sel d'ammoniums quaternaires et une huile ou une émulsion huile/eau. Dans ce document, le mode d'administration de ces formulations envisagée et décrite est la voie injectable de type intramusculaire et sous cutanée. En outre, les compositions décrites sont sous forme d' émulsion de DDAB en association avec une huile.
On peut enfin citer le document Hilgers et al. (Research in Immunology, vol. 143, N° 5, 1992, pages 494-503), et le document cité, Thapar et al. (J. of Reproductive Immunology, vol. 17, 1990, pages 207-216) qui suggèrent tous deux clairement qu'il est préférable d'utiliser le DDA plutôt par voie sous cutanée que par voie mucosale.
Ainsi, il existe un grand besoin de disposer de nouveaux adjuvants, dépourvus de toxicité ou faiblement toxiques et permettant la génération ou l'amplification d'une réponse immunitaire pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées à être administrées par voie mucosale, notamment par voie nasale. Ceci est justement l'objet de la présente invention. La Demanderesse a mis en évidence que les détergents de type aliphatique, tels que le DDAB ou DDAC ou ses dérivés et analogues, sont, de manière surprenante, capables d'induire ou d'améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène ou d'un haptène lorsque lesdits détergents sont administrés par voie mucosale, notamment par voie nasale.
Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques de formule (I) générale :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle Ri, R2, R3 et R4 représentent un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 30 atomes de carbone, et X représente un anion, comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie mucosale, de préférence nasale. Avantageusement, RI et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 8 atomes de carbone, et préférentiellement de 1 à .
Avantageusement, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 10 à 30 atomes de carbone, et préférentiellement de 16 à 20.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, X représente un atome d'halogène. De façon particulièrement préférée, l'ammonium quaternaire aliphatique est choisi parmi le dimethyl dioctadécyl ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) de formule :
Figure imgf000008_0001
La présente invention concerne encore l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique de formule (I) tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale, pour induire ou améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène, immunogène ou haptène .
De manière générale, l'homme de l'art saura adapter la concentration dudit ammonium quaternaire aliphatique de formule
(I) en fonction de sa concentration micellaire critique spécifique, de la nature et de la concentration des autres composés contenus dans la composition pharmaceutique, en particulier de la nature et de la concentration de l'antigène ou haptène choisi, et des éventuels adjuvants qui pourront être également incorporés dans ladite composition.
De manière avantageuse, ledit ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention est à une concentration comprise entre 0,01 mg/ml à 100 mg/ml, préférentiellement entre 1 mg/ml à 50 mg/ml, et plus préférentiellement entre 2 mg/ml et 50 mg/ml.
La présente invention comprend également l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique selon l'invention comprend ledit ammonium quaternaire aliphatique de formule (I) mélangé audit antigène, immunogène ou haptène.
De préférence, ledit antigène, immunogène ou haptène est choisi parmi les protéines, les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques ou les lipides. Par le terme "peptide", on entend également désigner une protéine ou un polypeptide, ces trois termes étant utilisés indifféremment .
De préférence, la présente invention concerne l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un microorganisme tel que d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon. L'antigène, immunogène ou l'haptene selon l'invention comprendra au moins un fragment dudit micro-organisme, tel qu'un fragment connu pour contenir un épitope antigénique, ou que l'homme de l'art saura déterminer pour sa capacité à conférer l'immunité recherchée par des techniques standards telles que celles décrites dans les exemples ci-après.
De préférence, ledit antigène ou haptène est de nature peptidique ou un ADN codant pour un tel peptide immunogène.
De préférence, la présente invention concerne l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes, en particulier choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV) , l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques .
De manière préférée, ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé du virus respiratoire syncytial (VRS) humain ou bovin, en particulier un fragment de la protéine G du VRS, tel qu'un peptide choisi parmi ceux identifiés dans la liste des séquences SEQ ID No. 2 à SEQ ID No. 74 de la demande internationale de brevet déposée sous le No. PCT/FR 99/00703 le 26 mars 1999 (publiée sous le No. WO 99/49892) , ou un peptide choisi parmi ceux identifiés dans la liste des séquences SEQ ID No. l à SEQ ID No. 22 de la demande internationale de brevet déposée sous le No. PCT/FR 98/01570 le 17 juillet 1998 (publiée sous le No. WO 99/03987), séquences de peptides VRS incorporées ici par référence, de manière plus particulière, les peptides G2Na (dénommé également G2A) de séquence SEQ ID No. 2 (PCT/FR 99/00703) et G5a de séquences SEQ ID No. 5 (PCT/FR 98/01570), ou les peptides présentant après alignement optimal avec ces séquences un pourcentage d' identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 % .
Par "pourcentage d' identité" entre deux séquences d' acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucleotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith de Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1998) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444] , au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconti Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N OU BLAST P) .
Le pourcentage d' identité entre deux séquences d' acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d' acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences . Le pourcentage d' identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, "BLAST 2 séquences", disponible sur le site http://www.ncbi.nim.nih.gov/gorf/bl2.html, les paramètres "open gap pensitie" : 5, et "extension gap penaltie" : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice "BLOSUM 62" proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.
Sous un autre aspect, l'invention concerne aussi l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'une cellule tumorale.
Parmi les antigènes, immunogènes ou haptènes dérivés d'une cellule tumorale, on préfère ceux immunogènes capables d'induire une réponse immune, de type humoral ou CTL, en particulier destinée à inhiber ou à diminuer la croissance et/ou la prolifération desdites cellules tumorales.
On peut citer comme exemple mais sans s'y limiter les peptides immunogènes dérivés de cellules de mélanomes, du pancréas, de la prostate, de la vessie, du sein ou des poumons. L'antigène tumoral est associé ou spécifique d'une cellule tumorale. Il est notamment choisi parmi tout composé capable de diriger spécifiquement une réponse CTL contre ladite cellule tumorale .
Sous un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est associé, par mélange ou par couplage, à un composé porteur.
De préférence, ledit composé porteur est choisi dans le groupe de peptide comprenant les anatoxines, notamment le toxoïde diphtérique (DT) ou le toxoïde tétanique (TT) , les protéines dérivées du streptocoque (comme la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine, appelée "BB" décrite dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 96/14415) , les protéines membranaires OmpA ou OmpC (OmpA ou OmpC pour «"Outer Membrane Protein de type A" et "Outer Membrane Protein de type complexe") ou les protéines de choc thermique (« Heat Shock Protein » ou HSP) .
Avantageusement, ledit composé porteur est couplé de façon covalente avec l'antigène ou l'haptene.
Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre le composé porteur et l'antigène ou l'haptene, en particulier lorsqu'ils sont de nature peptidique, le couplage covalent de l'antigène ou l'haptene pouvant être réalisé à l'extrémité N ou C terminale du composé porteur.
Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité du composé porteur choisi et de la nature de l'antigène ou l'haptene à coupler. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme et de l'art.
Les conjugués issus d'un couplage de peptides peuvent être également préparés par recombinaison génétique. Le peptide hybride (conjugué) peut en effet être produit par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour le composé porteur, d'une séquence codant pour le ou les peptides antigènes, immunogènes ou haptènes. Ces techniques de préparation de peptide hybride par recombinaison génétique sont bien connues de l'homme de l'art (cf. par exemple S.C. MAKRIDES, 1996, Microbiologicals Reviews, 60,3, 512-538). De préférence, ledit composé porteur est une protéine dérivée du streptocoque ou une protéine de membrane OmpA d' entérobactérie, notamment de Klesiella pneumoniae, ou l'un de ses fragments, fragments de préférence capables d'exercer l'activité « porteur » de la protéine entière, dont ils sont issus .
On préfère tout particulièrement comme composé porteur la protéine P40 telle qu'identifiée dans la demande internationale de brevet déposée sous le No. PCT/FR 99/00703 le 26 mars 1999 par la séquence SEQ ID No. 1 (publiée sous le No. WO 99/49892), correspondant à l'OmpA de Klebsiella pneumoniae, ou une protéine dont la séquence présente après alignement optimal avec cette séquence SEQ ID No. 1 un pourcentage d'identité d'au moins 80 %.
L'invention concerne également l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre un deuxième adjuvant différent des ammoniums quaternaires aliphatiques de formule (I) . De préférence, ledit deuxième adjuvant est choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A (MonoPhospho Lipide A), le Quil-A (saponines dérivée de Quillage saponaria Molina) , l'ISCOM (pour « Immune Stimulating COMplexes ») , les CpG (oligodeoxynucleotides contenant les motifs Cytosine- Phosphorothioate-Guanide dinucléotides immunostimulant, Leif (protéine dérivée de Leishmania connue pour stimuler les cellules mononucléaires humaines du sang périphérique (PBMCs) ) , la CT (toxine cholérique) ou la LT (LT pour « Heat labile enterotoxin » entérotoxine labile à la chaleur) , tout comme les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
Sous un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que le mélange ammonium quaternaire aliphatique de formule (I) et immunogène, antigène ou haptène, éventuellement associé au composé porteur, est incorporé dans des vecteurs permettant d'assurer et/ou d'améliorer leur stabilité ou leur biodisponibilité, en particulier les vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules. La présente invention comprend également l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre une cytokine ou un facteur de croissance, notamment l'IL-12, l'IL-2, GM-CSF et l'IL-18, qui permet de potentialiser la réponse.
La présente invention comprend également l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique de formule (I) tel que défini ci-avant pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes ou parasitaires.
La présente invention concerne encore l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique de formule (I) pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers et préférentiellement à inhiber la croissance des tumeurs.
L'invention concerne encore l'utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique de formule (I) tel que défini ci-dessus en association avec une substance thérapeutique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale.
Ladite substance thérapeutique est notamment choisie parmi les antibiotiques, les hormones, les anticancéreux, les antiinflammatoires, les vitamines, les oligo-éléments, les facteurs de croissance et les anticorps monoclonaux.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique de formule (I) tel que défini ci-dessus, en association avec une séquence d'acide nucléique pouvant être comprise dans un vecteur pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique de formule (I) tel que défini ci-dessus et d'une séquence d'acide nucléique dans ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique permettant l'expression d'un peptide codé par ladite séquence d'acide nucléique dans les cellules de l'organisme recevant la préparation et préférentiellement les cellules épithéliales du tractus respiratoire.
Un objet de l'invention est l'utilisation d'au moins un ammonium quaternaire de formule (I) tel que défini ci-dessus en association avec un vecteur vivant exprimant un antigène, immunogène ou haptène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie mucosale, et préférentiellement par voie nasale.
Une composition ou un vaccin tel que défini ci-dessus sous forme solide est un objet supplémentaire de l'invention. Cette composition ou vaccin peut notamment être sous forme de poudre, de suppositoire ou d'ovule.
L'invention a aussi pour objet une suspension aqueuse comprenant un ammonium quaternaire aliphatique de formule (I) générale :
Figure imgf000015_0001
dans laquelle RI, R2, R3 et R4 représentent un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 30 dans laquelle RI, R2, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 30 atomes de carbone, et X représente un anion. Par suspension aqueuse comprenant un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini selon l'invention, on entend désigner une composition dans laquelle ledit ammonium quaternaire aliphatique est mis en suspension dans une solution aqueuse, notamment dans de l'eau ou un tampon aqueux tel que le PBS (pour tampon phosphate salin) ou tout autre tampon aqueux, de préférence pour des quantités allant de 0,01 mg/ml à 100 mg d'ammonium quaternaire / ml de solution aqueuse, de manière préférée de 1 mg/ml à 50 mg/ ml, puis la composition étant homogénéisée, notamment au moyen d'un vortex, pour donner la dite suspension aqueuse. Par exemple, une telle suspension aqueuse selon l'invention ne pourra pas comprendre par définition d'huile ou d' émulsion à base d'huile comme décrit notamment dans les documents cités dans l'introduction. De manière préférée, ladite suspension aqueuse comprend un ammonium quaternaire aliphatique dans laquelle formule générale RI et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 8 atomes de carbone, et préférentiellement de 1 à 4. De manière également préférée, R3 et R4 représentent dans cette formule générale indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 10 à 30 atomes de carbone, et préférentiellement de 16 à 20.
De manière également préférée, X représente dans cette formule générale un atome d'halogène.
De manière encore plus préférée, l'invention concerne une suspension aqueuse comprenant un ammonium quaternaire aliphatique choisi parmi le dimethyl dioctadécyl ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) de formule :
Figure imgf000016_0001
L'invention concerne en outre une suspension aqueuse selon la présente invention à titre de médicament, de préférence comme adjuvant, notamment de l'immunité.
L'invention concerne en outre une suspension aqueuse selon la présente invention, ladite suspension aqueuse comprenant en outre un antigène, immunogène ou haptène tel que défini ci-avant dans les utilisations selon l'invention, notamment dérivant d'un micro-organisme tel que d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon, ou associé à une cellule tumorale. L' invention concerne en outre une suspension aqueuse selon la présente invention, ladite suspension aqueuse comprenant en outre un deuxième adjuvant différent desdits ammoniums quaternaires aliphatiques de formule (I) tels que définis ci- avant, et de préférence choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, les CpG, la Leif, la CT, la LT ou les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
Enfin, l'invention a aussi pour objet un dispositif adapté pour une administration par voie mucosale, et notamment nasale, caractérisé en ce qu'il contient une composition ou un vaccin tel que défini ci-dessus.
Ce dispositif peut notamment être un dispositif aérosol comprenant ou non un agent propulseur.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Ils seront notamment décrits en référence aux figures annexées sur lesquelles :
Figure 1A : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA.
Figure 1B : Réponse muqueuse obtenue après administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA.
Figure 2A : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de G2Na associé au DDA.
Figure 2B : Réponse muqueuse obtenue après administration par la voie nasale de G2Na associé au DDA. Figure 3 : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA chez le rat des cottons .
Figure 4A : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de DT associée au DDA.
Figure 4B : Réponse muqueuse obtenue après administration par la voie nasale de DT associée au DDA.
Figure 5A : Réponse systémique obtenue après administration par la voie nasale de TT associé au DDA. Figure 5B : Réponse muqueuse obtenue après administration par la voie nasale de TT associé au DDA.
Exemple 1 : Production d' une protéine chimérique recombinante BBG2Na
Cet exemple illustre l'obtention de BBG2Na recombinante à partir d'une culture de bactéries Escherichia coli, transformé par un vecteur plas ide d'expression, nommé pvaBBG2Na : le plasmide contient le gène codant pour l'Albumin binding domaine de la protéine G du Streptocoque (BB) suivi par un fragment G2Na de 101 aa de la protéine G du VRS (Long strain) (aa 130 à aa 230 de la protéine G entière du VRS humain de type A), l'expression du gène est sous contrôle du promoteur de l'operon tryptophane
(trp) . Dans un fermenteur équipé de sondes de régulation de température, de pH et de taux d'oxygénation, contenant 2 litres de milieu contenant (en g/1) : glycérol, 5 ; sulfate d'ammonium, 2,6 ; dihydrogénophosphate de potassium, 3 ; hydrogénophosphate dipotassium, 2 ; citrate de sodium 0,5 ; extrait de levure, 1 ;
Amplicilline, 0,1 ; Tétracycline 0,008 ; Thiamine, 0,07 ; sulfate de magnésium, 1 et 1 ml/1 de solution de traces éléments et 0,65 ml/1 de solution de vitamines. Sont maintenus constants : l'alimentation de sources carbonées (glycérol et/ou glucose) ; le pH à 7.3 ; la température à 37°C ; le signal de tension en Oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (à 580 nm) atteint la valeur de 80, l'expression de la protéine est induite par ajout de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/1 Environ 3 heures après, les cellules sont récoltées par centrifugation. On obtient environ 150 g de biomasse humide par litre de culture.
On resuspend une fraction de biomasse (environ 30 g) dans une solution de TST (tampon Tris-HCl 50mM pH 8,0, NaCl 200 mM, 0,05 % Tween 20 et EDTA 0,5 mM) . On peut lyser les cellules soit par sonication soit à l'aide d'une presse, par exemple de type « French press ». Après centrifugation du lysat cellulaire, on filtre sur 1,2 mm, les protéines solubles peuvent être purifiées directement sur colonne d'affinité, les protéines insolubles (corps d'inclusion) présentes en majorité sont solubilisées dans 30 ml de chlorhydrate de guanidine 7 M, Tris-HCl 25 mM (pH 8,5), dithiothréitol (DTT) 10 mM, suivi d'une incubation à 37°C pendant 2 H. On dilue le milieu avec un tampon de renaturation (Tris-HCl 25 mM (pH 8,5) ; NaCl 150 mM et 0,05 % Tween 20) afin d'arriver à ajuster en concentration finale 0,5 M (HC1- Guanidine) . Incubation à température ambiante sous agitation pendant 16 heures. Après filtration, les protéines solubles sont purifiées soit par chromatographie d'affinité soit par chromatographie par échange d' ions . Exemple 2 : Préparation du mélange immunogène ou antigène et DDA sous forme d' une suspension
Le DDA est mis en suspension en PBS, NaCl 0,9 % ou tout autre tampon (de 0,01 mg/ml à 40 mg/ml), vortexé 2 min, suivi par une étape facultative de sonication pendant 20 min au bain à ultrasons. On ajoute ensuite une quantité adéquate d'une solution de BBG2Na solubilisée dans l'eau. Cette solution est mise sous agitation. La quantité de BBG2Na adsorbee mesurée par BCA est de 100 % à une concentration en DDA de 3 mg/ml.
Exemple 3 : Préparation du mélange BBG2Na, mannitol et DDA sous forme de lyophilisât
Le DDA est mis en suspension dans de l'eau (de 0,01 mg/ml à 20 mg/ml) . La solution de DDA est chauffée pendant 30 min à 62°C. Elle est ensuite laissée à température ambiante. Lorsque la température est de 37 °C environ, on ajoute une quantité adéquate d'une solution de BBG2Na solubilisé dans l'eau ainsi qu'une quantité adéquate de mannitol. Le mélange est ensuite congelé et lyophilisé. Le lyophilisât peut être repris dans de l'eau de qualité « ppi » (préparation pour injection) avant 1' injection.
Exemple 4 : Administration par la voie nasale de BBG2Na associé au DDA a. Réponse systémique
Des groupes de 5 souris sont immunisés par la voie nasale au jour 0, 10 et 20 avec 20 μl de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 40 μg de BBG2Na associé ou non à 400 μg de DDA ou à 10 μg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les sera des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 1A reprend les résultats obtenus . On peut noter que les groupes contrôles (PBS, BBG2Na 40 μg) ne présentent pas de titres sériques anti-G2Na, au contraire les groupes BBG2Na 40 μg + DDA ou BBG2Na 40 μg + CTB montrent de très forts titres anti-G2Na. b. Réponse muqueuse Des groupes de 5 souris sont immunisés par la voie nasale au jour 0, 10 et 20 avec 20 μl de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 40 μg de BBG2Na associé ou non à 400 μg de DDA ou à 10 μg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 1B reprend les résultats obtenus . On peut noter que les groupes contrôles (PBS, BBG2Na 40 μg) ne présentent pas d' IgA anti-G2Na, au contraire les groupes BBG2Na 40 μg + DDA ou BBG2Na 40 μg + CTB montrent de très forts titres d' IgA anti- G2Na.
Exemple 5 : Administration par la voie nasale de G2Na associé au DDA a. Réponse systémique Des groupes de 5 souris sont immunisés par la voie nasale au jour 0, 10 et 20 avec 20 μl de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 20 μg de G2Na associé ou non à 400 μg de DDA ou à 10 μg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les sera des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 2A reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, G2Na 20 μg) ne présentent pas ou très peu de titres sériques anti-G2Na, au contraire, les groupes
G2Na 20 μg + DDA ou G2Na 20 μg + CTB montrent de très forts titres anti-G2Na. b. Réponse muqueuse
Des groupes de 5 souris sont immunisés par la voie nasale au jour 0, 10 et 20 avec 20 μl de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 20 μg de G2Na associé ou non à 400 μg de DDA ou à 10 μg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 2B reprend les résultats obtenus . On peut noter que les groupes contrôles (PBS, G2Na 20 μg) ne présentent pas d' IgA anti-G2Na, au contraire, les groupes G2Na 20 μg + DDA ou G2Na 20 μg + CTB montrent de très forts titres d' IgA anti-G2Na.
Exemple 6 : Administration par la voie nasale de G2Na associé au DDA Des groupes de 6 rats des cottons sont immunisés par la voie nasale au jour 0, 10, 20 et 30 avec 20 μl de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 40 μg de BBG2Na, 400 μg de DDA ou 40 μg de BBG2Na associé à 400 μg de DDA. Un dernier groupe a reçu 80 μg de BBG2Na associé à 400 μg de DDA solubilisés dans de l'eau. Au jour 40, les sera des rats des cottons sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène G2Na sont déterminés par ELISA.
La figure 3 reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, PBS+DDA, BBG2Na 40 μg + PBS) ne présentent pas ou très peu de titres sériques anti-G2Na, au contraire, les groupes BBG2Na 40 μg + DDA + PBS ou BBG2Na 80 μg + DDA + PBS montrent de très forts titres anti-G2Na.
Exemple 7 : Administration par la voie nasale de DT associé au DDA a. Réponse systémique
Des groupes de 5 souris sont immunisés par la voie nasale au jour 0, 10 et 20 avec 20 μl de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 10 μg de DT associé ou non à 400 μg de DDA ou à 10 μg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les sera des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène DT sont déterminés par ELISA.
La figure 4A reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, DT lOmg) ne présentent pas ou très peu de titres sériques anti-DT, au contraire, les groupes
DT 10 μg + DDA ou DT 10 μg + CTB montrent de très forts titres anti-DT. b. Réponse muqueuse
Des groupes de 5 souris sont immunisés par la voie nasale au jour 0, 10 et 20 avec 20 μl de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 10 μg de DT associé ou non à 400 μg de DDA ou à 10 μg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène DT sont déterminés par ELISA.
La figure 4B reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, DT 10 μg) ne présentent pas d' IgA anti-DT, au contraire, les groupes DT 10 μg + DDA ou DT 10 μg + CTB montrent de très forts titres d' IgA anti-DT. Exemple 8 : Administration par la voie nasale de TT associé au DDA a. Réponse systémique
Des groupes de 5 souris sont immunisés par la voie nasale au jour 0, 10 et 20 avec 20 μl de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 10 μg de TT associé ou non à 400 μg de
DDA ou à 10 μg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les sera des souris sont récupérés, puis les titres sériques des immunoglobulines G (IgG) totales dirigées contre l'antigène TT sont déterminés par ELISA.
La figure 5A reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS, TT 10 μg) ne présentent pas ou très peu de titres sériques anti-TT, au contraire, les groupes
TT 10 μg + DDA ou TT 10 μg + CTB montrent de très forts titres anti-TT. b. Réponse muqueuse Des groupes de 5 souris sont immunisés par la voie nasale au jour 0, 10 et 20 avec 20 μl de préparation saline isotonique (PBS) seule ou contenant 10 μg de TT associé ou non à 400 μg de DDA ou à 10 μg de Toxine Cholérique B (CTB) . Au jour 30, les fluides nasaux des souris sont récupérés, puis les titres des immunoglobulines A (IgA) dirigées contre l'antigène TT sont déterminés par ELISA.
La figure 5B reprend les résultats obtenus. On peut noter que les groupes contrôles (PBS,TT 10 μg) ne présentent pas ou très peu d' IgA anti-TT, au contraire, les groupes TT 10 μg + DDA ou TT 10 μg + CTB montrent de très forts titres d' IgA anti-TT.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'ammoniums quaternaires aliphatiques de formule générale :
Θ Θ
\. /R3 X
R2 R4
dans laquelle RI, R2, R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 30 atomes de carbone, et X représente un anion, comme adjuvant dans une composition pharmaceutique administrable par voie nasale.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que Ri et R2 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 1 à 8 atomes de carbone, et préférentiellement de 1 à 4.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyl linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comprenant de 10 à 30 atomes de carbone, et préférentiellement de 16 à 20.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que X représente un atome d'halogène.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'ammonium quaternaire aliphatique est choisi parmi le dimethyl dioctadécyl ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC) de formule :
Figure imgf000024_0001
6.Utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale, pour induire ou améliorer l'immunité d'un mammifère vis-à-vis d'un antigène, immunogène ou haptène.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend ledit ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 mélangé audit antigène, immunogène ou haptène .
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est choisi parmi les protéines, les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques ou les lipides.
9. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon .
10. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes.
11. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que ledit micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes est choisi parmi le virus syncytial respiratoire (VRS) , le para influenza virus (PIV) , 1'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, l'haemophilus influenza type b virus, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques .
12. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du virus respiratoire syncytial.
13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins le peptide de séquence SEQ ID No. 2 de la demande de brevet publiée sous le No. WO 99/49892, le peptide de séquences SEQ ID No. 5 de la demande de brevet publiée sous le No. WO 99/03987, ou un peptide présentant après alignement optimal avec l'une de ces séquences SEQ ID No. 2 ou SEQ ID No. 5 un pourcentage d'identité d'au moins 80 %.
14. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisée en ce que l'antigène, immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale.
15. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est associé, par mélange ou par couplage, à un composé porteur.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit composé porteur est choisi parmi les anatoxines, dont le toxoïde diphtérique ou le toxoïde tétanique, les protéines dérivées du streptocoque, les protéines de membrane OmpA ou OmpC ou les HSP.
17. Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit composé porteur est une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment de Klebsiella pneumoniae, ou l'un de ses fragments .
18. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 17, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend un deuxième adjuvant différent des ammoniums quaternaires aliphatiques tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5.
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit deuxième adjuvant est choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, les CpG, la Leif, la CT, la LT ou les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 19, caractérisée en ce que le mélange ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, et l'antigène, immunogène ou haptène associé éventuellement à un composé porteur est incorporé dans des vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules. -
21. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 20, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre une cytokine ou un facteur de croissance.
22. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 21, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques.
23. Utilisation selon l'une des revendications 6 à 21, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers et préférentiellement à inhiber la croissance de tumeurs.
24. Utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 en association avec une substance thérapeutique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale.
25. Utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce que ladite substance thérapeutique est choisie parmi les antibiotiques, les hormones, les anticancéreux, les antiinflammatoires, les vitamines, les oligoéléments, les facteurs de croissance et les anticorps monoclonaux.
26. Utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, en association avec une séquence d'acide nucléique pouvant être comprise dans un vecteur pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale.
27. Utilisation d'un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, et d'une séquence d'acide nucléique dans ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique permettant l'expression d'un peptide codé par ladite séquence d' acide nucléique dans les cellules de l'organisme recevant la préparation et préférentiellement les cellules épithéliales du tractus respiratoire.
28. Utilisation d'au moins un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, en association avec un vecteur vivant exprimant un antigène, immunogène ou haptène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale.
29. Composition ou vaccin tel que défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 27 sous forme solide.
30. Composition ou vaccin selon la revendication 29, sous forme de poudre, de suppositoire ou d'ovule.
31. Suspension aqueuse comprenant un ammonium quaternaire aliphatique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5.
32. Suspension aqueuse selon la revendication 31, à titre de médicament.
33. Suspension aqueuse selon la revendication 31 ou 32, comme adjuvant .
34. Suspension aqueuse selon l'une des revendications 31 à 33, comprenant en outre un antigène, immunogène ou haptène tel que défini dans l'une quelconque des revendications 7 à 17.
35. Suspension aqueuse selon l'une des revendications 31 à 34, comprenant en outre un deuxième adjuvant tel que défini dans la revendication 19.
36. Dispositif adapté pour une administration par voie nasale, caractérisé en ce qu'il contient une composition ou un vaccin tel que défini dans la revendication 29 sous forme de poudre .
37. Dispositif selon la revendication 36, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un dispositif aérosol comprenant ou non un agent propulseur.
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