WO2001073120A1 - Method of measuring polymorphism - Google Patents

Description

明 細 書

多型性を測定する方法

本出願は、 2 0 0 0 年 3 月 2 7 日 に出願された 日 本特許出 願第 2 0 0 0 — 8 7 5 0 0 、 同 日 に出願された 日 本特許出願 第 2 0 0 0 — 8 7 5 0 1 、 および同 B に出願された 日 本特許 出願第 2 0 0 0 - 8 7 5 0 4 か らの優先権を基礎 とする もの であ り 、 且つ該優先権を主張する ものである。 これらの文献 は、 引用する こ と に よ っ て こ こ に組み込まれる。

技術分野

本発明は多型性を測定する方法に関 し、 特に、 ヌ ク レオチ ドにおける単一塩基置換部位を正確且つ迅速に検出でき る方 法に関する。

背景技術

近年、 特定の疾患 と 遺伝子の多型と の関連が急速に明 らか に さ れつつある。 遺伝子の多型の分析は、 疾患関連遺伝子の 探索、 病気の遺伝子診断、 並びに輸血およ び移植医療におい て極めて有用 と なる も の と 期待される。

遺伝子の多型性を分析する主な方法は、 血清学的な方法と D N Aを用いた方法がある。 後者の方法は、 前者に比べて判 定に試験者の熟練を必要 と せず、 検査工程の 自動化も可能で 優れている。

しか しなが ら、 後者の方法であって も、 （ 1 ) 操作が複雑 であ り 、 分析に長時間を要する こ と 、 （ 2 ) マイ ク ロ タイ タ 一プレー ト等に固相化 されたプロ ーブを用いて多型分析を行 う 場合には、 同時に測定可能な項 目 の数が制限される こ と 、 ( 3 ) 残存標識物質や非特異的反応がある ため、 精度が十分 でなレヽこ と 、 （ 4 ) 検查コ ス ト が高レヽ こ と 、 が問題であ る。

今 日 、 多 く の 多型性の 中 で も 特 に 単ヌ ク レオチ ド多型 (Single Nucleotide Polymorpism ： 以下、 S N P と 称する）の分 析が注目 さ れている。 S N P は、 塩基配列中の 1 塩基が置換 されている こ と に よ っ て定義される多型性である。 ヒ ト の場 合、 個体間における ゲノ ム D N Aの同一性は 9 9 %以下であ り 、 その相違は僅かに 1 %程度である。 従っ て、 S N P への 関心は高ま っている。

S N P を検出する ための主な方法と しては、 P C R — R F L P 、 P C R — S S P お よ び P C R — S S O等 と 呼ばれ る 種々 の方法が存在する。 これらの方法は、 何れも P C R を利 用 している。 これらの方法は、 P C R に よ り 得た産物を電気 泳動や、 プロ ーブ配列 と のハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン反応によ つて解析する も のであ る。

例えば、 P C R — S S P法は、 多型部位を特異的に増幅す る た め のプ フ づ マ ー (sequence-specific-primer)試薬を用 ヽ る 方法である。 こ の方法は、 S N P の判定に頻繁に用い られて いる。 し力 し、 こ の方法は、 当該増幅の後に、 電気泳動に よ つて どの よ う な増副産物が存在するか確認 しな く てはな ら な レヽ

ま た、 D N Aチ ッ プまたは D N Aア レイ と称さ れる装置を 用レヽる V D A (High-Densitv variant detection arravs)技術 こ よ り 、 S N P を 検 出 す る 方 法 も 試 み ら れ て レ、 る （Science vol280，15,Mav 1998)。 V D A技術は、 一般的に、 固相基板上 に多数のプローブ D N Aを高密度に配列 し、 該プローブと 検 体 D N A と を固相表面でハイ ブ リ ダイ ズする方法であ る。 し か し この方法は効率が悪いよ う である。

ま た、 S N P の場合、 多型間の T m値は殆ど変わ ら ないの で、 従来の方法では、 高感度で ミ スマ ッチを検出する こ と は 困難である。 従って、 従来の検出方法では、 臨床学的に充分 な精度は得 られに く い。 '

発明の開示

本発明の 目 的は、 迅速、 簡便、 且つ高精度に多型の分析を 行 う こ と が可能な方法を提供する こ と である。 特に、 本発明 の 目 的は、 1 塩基置換部位であっ て さ えも、 高感度且つ高精 度な分析を簡便に行える多型の分析方法を提供する こ と であ る。

前記目 的は、

多型部位の検出方法であっ て、

( 1 ) 多型部位を含む検体と 、

前記検体の多型部位と 高親和性に結合 し、 且つ標識物質が付 された少な く と も 1 種類のプロ ーブと 、

を反応させる こ と と ； および

( 2 ) 前記反応の進行中において、 複数の経過時点で前 記標識物質の位置変化を光学的に測定する こ と と ；

を具備する検出方法

に よ って達成される。

本発明の 1 側面に従 う と 、 従来に比較 して少ない量の試薬 およ び検体で行 う こ と のでき る 多型分析方法が提供される。 また、 本発明の 1 側面に従 う と 、 少量の検体 と試薬を用いて 複数の多型部位を同時に検出でき る方法が提供される。 本発 明の 1 側面に従 う と 、 極めて多数の多型配列を迅速且つ簡便 に決定する こ と が可能な方法が提供される。 また、 こ の よ う な方法は、 B Z F分離、 P C Rおよび電気泳動等を必要 と し ないので、 各種多型を簡便に分析する こ と が可能であ る。

上述の よ う な本発明の思想か ら は、 更に以下の よ う な効果 も得る こ と が可能である。 即ち、 本発明の方法は、 一塩基置 換部位に限 らず、 多型部位の塩基配列を簡便に決定する こ と が可能である。 また更に、 血液型に代表さ れる血球の多型性 も簡便に検出する こ と が可能であ る。

図面の簡単な説明

図 1 は、 本発明の実施例 1 に従った検出方法において検出 し得る検体 D N Aの模式図であ り 、

図 2 は、 図 1 の検体 D N Aを検出するために使用 し得る プ ロ ーブの 1 例の模式図であ り 、

図 3 は、 本発明の実施例 1 に従った検出方法におけ る 、 プ ロ ーブ I について進行する反応の概要を示すス キーム図であ り 、

図 4 は、 本発明の実施例 1 に従った検出方法におけ る、 プ ローブ I I について進行する反応の概要を示すス キー ム図で あ り 、

図 5 は、 本発明の態様に従っ た検出方法に使用 し得る検出 シス テ ム の 1 例を示す模式図であ り 、

図 6 Aおよび 6 B は、 本発明の態様で使用 し得る蛍光顕微 鏡の測定部分の 1 例を示 し、

図 7 は、 図 5 に示す検出シス テ ム で得られ得る蛍光強度の 時間的変化を示すグラ フであ り 、

図 8 は、 図 7 に示すデータ を 自 己相関関数で変換 した と き の統計学的データ を示すグラ フであ り 、

図 9 Aか ら図 9 D までは、 本発明の態様に従った検出方法 によ る多型配列の決定方法の概念を示す図であ り 、 図 9 Aは 微小空間におけ る比較的小さ い分子の動き を示す図であ り 、 図 9 B は図 9 Aの場合に得られる経時的なゆ ら ぎを示すダラ フの例であ り 、 図 9 C は微小空間における比較的大き い分子 の動き を示す図であ り 、 図 9 D は図 9 Cの場合に得られる経 時的なゆ ら ぎを示すグラ フの例であ り 、

図 1 0 は、 本発明の実施例 3 において用い得る プロ ーブを 示す図であ り 、

図 1 1 は、 本発明の方法の臨床医学への応用例を示す図で あ り 、

図 1 2 Aは、 ス ライ ドグラ ス に点着 された試料を示す模式 図であ り 、 図 1 2 B は、 図 1 2 Aの線 X I I A— Aに沿った 断面図であ り 、

図 1 3 Aか ら C は、 本発明の実施例 4 において使用 し得る マイ ク ロ プ レー ト の例を示 し、 図 1 3 Dは、 図 1 3 C のマイ ク ロ プ レー ト の線 X I I I D — D に沿った断面図を示す。 発明を実施する ための最良の形態

本発明の多型性を測定する方法は、 一般的に大き く 分けて 2 工程、 即ち、 反応工程と検出工程と を具備する。 該反応ェ 程は、 目 的 とする多型部位に特異的に結合するプロ ーブ物質 と 、 該多型部位 と を反応させ結合 させる工程である。 また、 該検出工程は、 前記反応工程中お よび反応工程後に得 られる 分子の動態を測定する過程である。

Γ田Πき。五口

本明細書において、 「多型遺伝子」 と は、 一つの遺伝子座 を占める複数種の対立遺伝子群、 又はこの よ う な対立遺伝子 群に属する個々 の対立遺伝子を指称する も の とする。

こ こで使用 さ れる 「多型部位」 と は、 各多型遺伝子間で塩 基配列が異なる部位をい う 。 例えば、 多型遺伝子 A 1 の塩基 配列が A A A T T T ( C C C ) G G Gであ り 、 多型遺 伝子 A 2 の塩基配列が A A A T T T ( A G T ) G G G である場合には、 括弧内に示されている部位が多型部位に該 当する。 多型部位の中で 1 塩基のみが異な る も の は、 特に 「単ヌ ク レオチ ド多型」 と指称する も の と する。

ま た更に、 本発明の態様に従 う と 、 検出対象と なる 多型性 は、 遺伝子 レベルに限 られる ものではな く 、 タ ンパク 質 レべ ルで表さ れる多型性にまで及ぶ。 従っ て、 こ のよ う な場合に は、 「多型部位」 は発現されたタ ンパク質を示す。

こ こ で使用 さ れる 「 1 塩基置換部位」 の語は、 単ヌ ク レオ チ ド多型性の由来である 1 塩基か ら な る多型部位を指示する , 本発明の態様に従 う と 、 1 つの検体 D N Aの配列中に 1 塩基 置換部位が 1 つ存在 して も、 ま た、 それ以上で存在 して も、 それ （ま たはそれら） は測定さ れ得る。 複数の 1 塩基置換部 位を検出する場合には、 複数種類の標識物質を使用 して も よ レヽ

また、 こ こで使用 される 「多型配列」 の語は、 多型部位に 含まれる塩基配列を意味する。 上記事例では、 括弧内に示さ れている塩基配列であ る。

こ こで使用する 「校正機能を有する核酸合成酵素」 の語は 一部分が二重鎖になっ た塩基配列の 3 ' 末の ミ スマ ッチを認 識 し、 その塩基を削除 し、 且つ適切な条件下で核酸を合成 し て二重鎖を合成する活性を有する酵素をい う 。 本発明の態様 に従 う と 、 使用可能な酵素の例は、 校正機能を有する核酸合 成酵素であ り 、 好ま し く は、 E x ' 丁 3 または ' 丁 3 q 等である。 これら は、 例えば宝酒造から入手でき る が、 こ れに限 られる も のではない。

こ こで使用する 「標識物質」 の語は、 異な る測定時点にお いて、 略一定の出力 を維持する よ う な標識材料を示す。 例え ば、 発光性物質、 蛍光物質、 磁性物質および放射性物質等で ある。 なお、 該標識物質は、 後述する検出工程で使用する手 段に適切な標識物質を選択するべきである。

こ こで使用する 「 自 由な微小運動」 または 「微小運動」 と は、 主に、 ブラ ウ ン運動をレヽ う 。

こ こで使用する 「微小空間」 と は、 分子の 自 由 な微小運動 を良好に検出するための微小な空間をい う 。 本発明の態様に 従 っ て使用 さ れる微小空間の例は、 容積 と して 1 0 — ^{2 1} L ( lOOnm 四方の立方体の体積に相当する ） 〜 1 0 — ³ L であ ればよ く 、 典型的には 1 0 — ^{1 8} L 〜 ： L O — ⁹ L 、 最も典型的 に は 1 0 _ ^{1 5} L 〜 1 0 — ^{1 2} L の空間をレ、 う 。 微小空間の形 状は、 球状、 円柱、 円錐状、 立方体状、 直方体状等任意の形 状であ り 得る。

本発明の 1 つの側面に従 う と 、 任意の多型遺伝子の多型部 位に含まれる塩基配列を明 らかにする方法、 即ち、 多型遺伝 子の型を決定する方法が提供でき る。

なお、 以下では、 検出 しょ う と する多型遺伝子 （以下標的 多型遺伝子 と称する） の多型部位中に含まれる こ と が知 られ てレ、る 多型配列 を、 P S i P S n ( n は 2 以上の整数） と 表記する もの と する。 例えば、 上記の例にぉレ、ては、 P S ₂ は C C C であ り 、 P S ₂は A G Tである。

本発明の態様に従 う と 、 方法を用いれば、 極めて迅速に多 型部位の型を決定でき る。 また、 本発明の態様に従 う と 、 多 数の多型部位を含有する多型遺伝子や多種類の多型か ら なる 多型部位を含む多型遺伝子が検出でき る。 このよ う な遺伝子 と しては、 種々 の S N P 、 ヒ ト 白血球抗原 （以下 HLA と称 する） を含む主要組織適合抗原、 種々 の疾患関連遺伝子を挙 げる こ と ができ る が、 これに限定される も のではない。

本発明の態様に従 う と 、 多型部位の検出ま たは多型部位の 型を決定する場合、 まず、 標的多型遺伝子またはタ ンパク質 を含む検体を準備する。 本発明の態様に従 う と 、 ヒ ト に適用 する場合、 典型的には、 検体は血液、 骨髄液、 脳脊髄液等を 含む体液であ り 得る が、 これら に限定されない。

本発明の態様に従 う と 、 高感度に多型を検出する こ と がで き る。 従って、 遺伝子を扱 う 場合でも、 従来法の よ う な P C R増幅の操作は省略さ れて も よい。 しか しなが ら、 標的多型 遺伝子が特に少量であれば、 P C R増幅を行って も よい。 実施例 1

本発明の 1 つの側面に従 う と 、 ヌ ク レオチ ドにおける 単一 ヌ ク レオチ ド多型部位を検出する方法が提供される。

前記反応工程は、 一般的に、 検体 D N A と 、 標識 した D N Aプロ ーブと をハイ ブ リ ダィ ゼーシ ョ ンする こ と と 、 得 られ た二重鎖を校正機能を有する酵素で処理する こ と と を具備す る。

前記検出工程は、 一般的に、 前記反応工程の反応系で生 じ た分子の 自 由 な微小運動を測定 して評価する工程である。

1 . 反応工程

以下、 本例の反応工程の 1 例を図 1 か ら 3 を用いて説明す る。 しか しなが ら、 これは例示であ り 、 本発明を制限する も のではない。

( 1 ) 検体 D N A

図 1 に、 本例の検体 D N Aの 1 例を模式的に示 した。 こ こ では、 検体 D N Aにおける多型遺伝子が、 2 つの多型配列を 持つ、 即ち、 多型 I と 多型 I I と して存在する場合を例 と し て説明する。 多型 I と 多型 I I は、 1 塩基置換部位を除く 他 の部分の塩基配列は相同である。 また、 多型 I の 1 塩基置換 部位は、 アデニ ン [以下、 塩基 （ A ) または A と称 し、 図中 では A と示す] であ り 、 多型 I I の 1 塩基置換部位は、 グァ ニ ン [以下、 塩基 （ G ) ま たは G と 称 し、 図 中 では G と 示 す] とする。

( 2 ) 標識 D N Aプローブ 次に、 図 1 に示 した 1 塩基置換部位を検出する ためのプロ ーブの 1 例を図 2 に示す。 プロ ーブ I は、 多型 I の 3 ， 末端 か ら 1 塩基置換部位ま での配列に相補的な配列か らな り 、 且 つプロ ーブ I の 3 ' 末端の塩基 （即ち、 1 塩基置換部位の塩 基と 対をなす塩基） には、 標識物質が付与されている。 この 例では、 プロ ーブ I の 3 ' 末端は標識されたチ ミ ン [以下、 塩基 （ T ) または T と 称 し、 図中では T と 示す] であ る。

同様に、 プロ ーブ I I は多型 I I の 3 ' 末端か ら 1 塩基置 換部位ま での配列に相補的な配列か ら な り 、 且つプロ ーブ I I の 3 ' 末端の塩基には標識物質が付与さ れている。 こ の例 では、 プロ ーブ I I の 3 ' 末端は標識されたシ ト シン [以下 塩基 （ C ) または C と称 し、 図中では C と 示す] であ る。

( 3 ) 反応工程

以下に、 本発明の最もシンプルな例 と して、 実施例 1 に従 う 方法で得 られる反応系における反応を図 3 および 4 に例示 し、 該反応をシ ミ ュ レー トする。 この例では、 試料中に含ま れる検体 D N Aは、 多型 I である のか、 または多型 I I であ る のかが検出 さ れる。 こ こ では、 試料中に多型 I が含まれて いる と過程する。 まず、 該試料を 2 つの容器、 即ち、 容器 I と容器 I I に添加する。

図 2 に示 した夫々 のプロ ーブは種類毎に夫々 の容器に添加 され、 該試料と の反応に供される。 図 3 は、 容器 I で進行す る反応を示す。 即ち、 図 3 の容器 I では、 多型 I と プロ ーブ I と のハイ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ンが適切な条件下で進む。 図 3 か ら 明 らかであ る よ う に、 多型 I と プロ ーブ I と は完全マ ツ チ している （図 3 ) 。 一方、 図 4 は、 容器 I I において進行 する反応を示す。 即ち、 図 4 の容器 I I では、 多型 I と プロ ーブ I I と のハイ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ンが適切な条件下で進行 する。 図 4 から明 らかである よ う に、 1 塩基置換部位での ミ スマ ッチが生 じてレヽる。

続いて、 前記完全マ ッチの二重鎖と ミ スマ ッチの二重鎖に 対 して、 夫々 、 校正機能を有 した D N Aポ リ メ ラーゼを添加 する （図 3 およ び 4 ) 。 その結果、 容器 I における完全にマ ツチ した二重鎖に対 しては、 前記ポ リ メ ラーゼは活性 （即ち 3 ' → 5 ' ェク ソヌ ク レアーゼ活性） を示さ ない （図 3 ) 。 それに対 して、 容器 I I における前記ポ リ メ ラ一ゼは、 多型 I と プロ ーブ I I カゝ ら なる 二重鎖の 3 ' 末での ミ スマ ッ チを 認識 し、 該 ミ スマ ッチ した塩基を削除 し、 更に該 D N A鎖を 伸長する （図 4 ) 。 こ の結果、 容器 I I では、 標識さ れた塩 基 （ C ) が遊離する （図 4 ) 。

即ち、 局所的な ミ スマ ッ チが存在 し得るハイ プ リ ダイ ゼー シ ヨ ン反応生成物に対 して、 核酸合成試薬と しての D N Aポ リ メ ラーゼを処理 した場合、 そ こ において生 じ得る反応は以 下の 2 通 り である。

ハイ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン反応生成物に ミ スマ ッチが存在す る場合、 該 D N Aポ リ メ ラ ーゼは該ミ スマ ッチを認識する。 その結果、 該 D N Aポ リ メ ラーゼによ る 当該 D N A鎖の伸長 反応が進行 し、 同時に、 ミ スマ ッチ していた塩基を含む標識 分子は、 前記伸長反応の進行過程において標的 D N Aか ら脱 離する。 これに対 して、 も う 1 つの場合は、 ハイ ブ リ ダィ ゼーシ ョ ン反応生成物に ミ ス マ ツチが存在せず、 該反応生成物が完全 マ ッチの二重鎖であっ た場合である。 言い換えれば、 標的 D N A と 、 標識分子を具備する塩基 と が完全にマ ッチ してハイ ブ リ ダィ ズされている場合である。 この よ う な場合、 該 D N Aポ リ メ ラ ーゼは、 その二重鎖が完全マ ッ チで結合されてい る こ と を認識する。 その結果、 該 D N Aポ リ メ ラ ーゼは、 伸 長反応を引 き起こ さ ないか、 伸長を引 き起こ した と して もそ の途中で該伸長を中断 し、 それ以上は該伸長反応は進行 しな い。 また、 ミ スマ ッチが存在 しないので校正機能に関連する 該 D N Aポ リ メ ラーゼのェキソヌ ク レアーゼ活性は機能 しな い。 こ の よ う な D N Aポ リ メ ラーゼの校正機能を、 ミ スマ ツ チ した塩基を含む標識分子を脱離する ために使用する と い う 本発明者のユニーク な発想は、 全く 新 し く 且つ非常に有効な 多型性の検出方法の提供に大き く 寄与する も のである。

D N Aポ リ メ ラーゼによ る校正機能を利用 して該検出を行 えば、 ハイ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ンの有無を検出する こ と と 、 続 く 、 該校正活性によ る標識分子の脱離の有無を検出する こ と と 、 の二段階の検出が行われる。 従っ て、 よ り 精度の高い当 該検出方法が提供さ れる。

こ の よ う な二段階の検出は、 言い換えれば以下の よ う な 2 工程であ る と 言える。 即ち、 第 1 の検出工程では、 ハイ プ リ ダイ ゼーシ ョ ンが起こ り 得る条件下で、 試料と標識分子 と が 混合 され反応され、 こ の反応時におけるハイ プ リ ダイ ゼーシ ヨ ンの有無が検出 さ れる。 これに よ り 、 標的 D N Aの有無お よび/ま たはハイ プ リ ダイ ゼーシ ョ ンの反応量が決定される 続く 、 第 2 の検出工程では、 当該合成反応が起こ り 得る条件 下で当該核酸合成酵素が添加され反応 され、 こ の と き に生 じ る脱離分子が検出 さ れる。 これに よ り 、 遺伝学的変異の有無 およ び Zまたは変異 した配列が決定される。

こ の よ う な第 1 お よび第 2 の検出工程か ら なる二段階の検 出工程は、 F C S に よ って、 二段階の工程を通 して継続的 し て実施されても、 ま た F C S に よ って夫々 の工程を別々 に行 われて も よい。 F C S に よ り 、 こ のよ う な二段階の検出を行 つた場合には次のよ う な結果が得られる。 第 1 の検出工程に おいて、 当該ハイ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ンが起こ る と 、 標識分子 のサイ ズが大き く な る ので、 F C S の反応曲線が変化する。 続く 第 2 の検出工程おいて、 該脱離が起こ る と 、 標識分子の サイ ズが小さ く なる ので、 前工程を経て変化 した F C S の反 応曲線は、 更に変化する。 この よ う に、 D N Aポ リ メ ラ ーゼ に よ る校正機能を利用 した場合には、 初めに、 ハイ ブ リ ダィ ゼーシ ョ ンの有無が検出 され、 次に該校正に よ る標識分子の 脱離の有無が検出 される。 従って、 従来の方法よ り も有意に 精度が高 く 且つ信頼性が高い検出方法が提供される。

なお、 本発明の態様に従 う と 、 校正機能を有 した D N Aポ リ メ ラーゼ類等の試薬を用いた ミ スマ ッチの検出は、 F C S を検出手段 と して用いた方法に限る ものではない。 検出手段 と し て 、 例 え ば、 結合の 有無 で分離す る よ う な種々 の B (bound)/ F (free)分離技術を用いて、 当該検出が行われて も よい。 その場合、 例えば、 上記の 2 段階の検出工程の夫々 か ら 得 ら れ る 標的 D N A に結合 し た標識分子の量 （ B i ) と ( B ₂ ) を比較 し て も 、 と 脱離 した標識分子の量 ( F ₂ ) を比較 して も 、 当 該検出 はな さ れ得 る 。 こ こ で、 ( B ！ ) は第 1 の検出工程後に得 られる標的 D N Aにハイ ブ リ ダィ ズ したプロ ーブに含まれる標識分子の量であ り 、 （ B

₂ ) は第 2 の検出工程後に得 られる標的 D N A にハイ プ リ ダ ィ ズ したプロ ーブに含まれる標識分子の量であ り 、 （ F ₂ ) は第 2 の検出工程後に得られる脱離 した標識分子の量である < 上述の よ う な反応に よ り 得られる標識さ れた分子の 自 由な 微小運動を、 後述する検出手段に よ り 測定 し評価する。 標識 分子の 自 由 な微小運動は、 該標識分子の大き さ に依存 して変 化する。 従って、 標識物質を指標に して、 その微小運動を測 定する こ と によ って塩基配列に関する情報を得る こ と が可能 である。

( 4 ) 反応工程の他の態様

本発明の検出方法に具備 される反応工程の最も シンプルな 1 例は、 上述 した通 り であ るが、 種々 の変更および修飾を行 な う こ と が可能であ る。 例えば、 複数の標識物質を用いて も よい。 また、 標識物質によ るプロ ーブの標識は、 プロ ーブの

3 ' 末だけではな く 5 ' 末に対 して行なっ て も よい。 また、 複数のプロ ーブを 1 つの容器内で試料と反応 させても よい。

また、 校正機能を有する核酸合成酵素に よ る ミ スマ ッチの 認識および切断の後で、 該切断部から 3 ' 末端方向に塩基配 列を延伸する こ と も可能である。 その場合、 適切な条件を設 定 し、 且つ更に必要な基質および試薬等を供給 して も よ く 、 ポ リ メ ラ ーゼ連鎖反応 （以下、 P C R と称する） 等に よ って 行なって も よい。 しか しなが ら、 該延伸を必ず しも行な う 必 要はない。

また、 上述 した反応を行な う 前に、 P C R等の技術に よ り 試料に含有 される多型を増幅する こ と も可能である。

2 . 検出工程

( 1 ) 検出原理

本発明の検出工程では、 所定空間内におけ る 1 以上の標識 分子の出力強度が測定される。 更に、 得られた出力強度の増 減ま たは消出が指標 と して使用 される。 出力強度の変化から 微小の測定視野内を出入 り する標識分子の運動速度が得 られ る。 従っ て、 プロ ーブを標識する標識分子は、 複数の測定時 点に亘つ て、 略一定 した出力を維持でき る よ う な標識材料で ある こ と が好ま しい。 この よ う な標識分子の材料の例は、 発 光性物質、 蛍光性物質、 磁性物質および放射性物質等が挙げ られる。 発光性物質 と 蛍光物質は、 長時間、 発光または蛍光 を発する よ う な色素を選ぶこ と が好ま しい。

標識に用い られる蛍光色素 と しては、 D A P I 、 F I T C ロ ーダ ミ ン、 C y 3 、 C Y 3 . 5 、 C y 5 、 C y 5 . 5 、 C y 7 等の種々 の公知物質が含まれる。

また、 例えば、 複数の項 目 を同時に測定するために、 複数 の蛍光物質を同時に用いて も よい。

ま た発光色素や蛍光色素を有する も のを標識分子と して使 用すれば、 容易な構成の装置に よ って分子 レベルを光学的に 測定でき る。 また、 後述する実施例 3 のハイ ブ リ ダィ ゼーシ ョ ンのよ う な、 ヌ ク レオチ ド分子同士の相補的な結合の際に その相補的結合部分にイ ンターカ レー ト し、 それに よ つ て遊 離時 と は蛍光特性が変化する よ う な物質も、 蛍光色素 と して 使用する こ と ができ る。 そのよ う な蛍光色素の例は、 ア タ リ ジンオレンジ、 チア ゾーノレオ レンジ、 ォキサゾーノレイ ェ ロ ー およ びロ ーダミ ン等がある。

蛍光分子の位置変化を測定する場合には、 フォ ト マルチプ ラ イ ヤゃフ ォ ト ダイ ォー ド等の蛍光測定手段を検出手段 と し て用 いて蛍光デー タ を受光 して も よ い。 更に、 蛍光分子を 夫々 個々 に測定でき る よ う に、 該蛍光測定手段が、 単一フォ ト ンを計測 し得る よ う な測定モ ー ドを備えていて も よ い。 本発明の態様に従 う と 、 検出工程を行 う ための検出手段は 標識分子の材質に応 じて標識分子のシグナルを測定でき る測 定手段と 、 前記測定手段に よ って所定時間内に得られる複数 の測定データ を記憶する手段 と 、 記憶 した複数の測定データ を 自 己相関関数で演算する演算手段と を具備 して よい。

ま た、 検出手段は更に以下を具備 して も よい。 即ち、 所定 の測定領域内で得られる複数の標識分子に関する測定データ を記憶する手段 と 、 記憶 した測定データ を こ この標識分子倍 に 自 己相関関数で演算する演算手段と を具備 して も よい。 更 にま た、 得られたデータおよび解析結果を出力する ための出 力手段を設けて も よ い。 データ 出力手段は、 自 己相関関数で 演算 された結果に基づいて、 複数の追跡データ に関する時間 的な位置変化を表現する統計学的データ に変換する変換手段 を含むんでも よい。 本例における検出工程では、 液体中での標識分子のゆ ら ぎ 運動を測定する こ と に よ って、 該標的分子の微小運動を正確 に測定 し評価 して も よい。 ゆ ら ぎ運動の評価は、 自 己相関関 数 （Autocorrelation function) を用レヽて演算 して行っ て も よ い。 標識分子と して蛍光物質を用いる場合、 自 己相関蛍光分 光 fe ( Fluoresence Correlation Spectroscopy、 以 卜 、 F C S と 略する） を採用 して も よい。

生物学的材料の性質を F C S で測定 して得たデータ を解析 す る た め の 演 算 方 法 は 、 金 城 ら の 報 告 を 参 照 で き る ( K i nj 0, M., Rig ler,R , Nucleic Acids Research, 23, 1795- 1799,1995 ) 。 こ の文献は引用に よ って こ こ に組み込まれる 該報告では、 標識された核酸プロ ーブと標的核酸分子 と のハ イ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン反応を、 F C S で観察 した例が報告さ れている。 また、 F C S およびその測定データ の演算につい ては、 更に後段で記述する。

F C S では、 分離過程な しに、 非常に小 さ な試料体積に含 まれる蛍光粒子の数や拡散定数を略 リ アルタ イ ムで求め る こ と が可能である。 F C S を用いれば、 B Z F 分離が不要であ り 、 測定に係る 時間が短縮でき る。 溶液系のままで測定でき るので、 測定時間は更に短縮でき る。 また、 生体分子を 自然 な状態で測定でき る。

上述の反応工程で得 られた標識分子の検出は、 以下の よ う な工程に よ り 実施 して も よい。 上述 した本発明の実施例 1 に おいて具備 される検出工程は、 微小視野において顕微鏡的に 前記標識分子の動態を観察する こ と と 、 複数の測定データ を 時間変化のばらつき に応 じた統計学的データ に変換する こ と と 、 統計学的データ に基づいてハイ プ リ ダイ ゼーシ ョ ン反応 の反応曲線を得る こ と と を具備する。 こ こで、 反応曲線の立 ち上が り の高さ がヌ ク レオチ ド分子の個数を表 している。 本発明の検出工程が、 3 次元の微小視野内において実行さ れる こ と に よ り 、 標的分子の試料含有液の中における 自 由な 微小運動を高精度に検出 し評価でき る。 仮に、 こ の検出工程 を 2 次元的な視野内で測定する こ と に よ って実施 した場合、 ブラ ウ ン運動の よ う に、 標識分子の 3 次元的に 自 由な移動を 漏れな く 捕える こ と ができ ない。 そのため測定精度は低 く な る ので、 それは好ま し く ない。

検出工程の微小視野が共焦点光学系によ り 形成 される こ と に よ り 、 被写界深度の深い測定データ が得られる。 それに よ つて個々 の任意の標識分子が視野内で常に合焦する ので、 正 確な位置および出力データ が得 られる。

即ち、 微小分子の運動状態の検出手段は、 焦点付近の回折 限定領域に齎される微小視野内での測定を実施でき る光学系 を有する手段が好ま しい。 または、 検出手段は共焦点光学系 に よ り 形成される微小視野内での測定を実施する顕微鏡を有 する手段が好ま しい。

微小視野が、 焦点付近の回折限定領域である こ と に よ り 、 個々 の標識分子を高い S N比で測定でき る。

該回折限定が平均直径 1 5 ± 5 a mの ピンホールに よ り 形 成さ れる こ と に よ り 、 少数の選ばれた標識分子か らの測定デ ータ を効率良 く 得る こ と ができ る。 特に好ま しい微小空間は、 平均半径 2 0 0 ± 5 0 n mおよ び光軸上の平均長 さ 2 0 0 0 ± 5 0 0 n mの略円柱状領域で ある こ と によ り 、 測定視野内に照準された標識分子に関する 自 由 な微小運動を効率良 く 取得する こ と ができ る。

ま た、 極微小の平均半径からなる アパーチャ一 （ピンホー ル、 光フ ァ イ バ端面等） か ら出射する よ う に光学設計する こ と に よ って得る こ と が もでき るが、 レーザー光線によ る収束 光も好ま しい。

励起光である レーザー光は、 試料溶液のほんの 1 点に集中 され、 且つ共焦点光学系の特性か らその 1 点か ら の蛍光発光 を検出系で捕 ら える こ と になる。 実際の容器中の測定領域は 理想的な点ではな く 、 図 6 B に示すよ う な円柱状の領域と な る。 その大き さ は、 微量空間を形成する容量であればよ く 、 例えば、 直径約 5 0 0 n m、 軸長約 2 0 0 0 n m、 容積と し てフ エム ト リ ッ トルであっ て も よい。

F C S の測定領域は溶液であ り 、 領域中に存在する蛍光分 子はブラ ウ ン運動を行っている。 従って、 一定の測定領域の おけ る分子の数は常に一定ではな く 、 ある値を中心に変動 し て 「数ゆ ら ぎ」 が生 じている。 更にこ の数ゆ ら ぎに起因 して 測定される蛍光強度に 「強度ゆ ら ぎ」 が発生する。 こ の蛍光 強度のゆ ら ぎを解析する こ と で拡散速度に関する情報 と 分子 の数に関する情報を得る こ と が出来る。

F C S 自 体は公知であ り 、 その詳細は、 例えば特願平 1 0 — 3 0 1 3 1 6 号等に記載されている。 ま た、 F C S に よ る データ解析には、 Z e i s s 社製の C o n f o C o r (登録 商標） に付属の解析用 ソ フ ト ウ ェ アである 「 F C S A C C E S S 」 を使用でき る。

実施例 2

実施例 1 に記載 した態様で使用 し得る測定装置の例を図 5 を用いて説明する。 図 5 には本発明の態様に従 う F C S 装置 が示される。 該装置は、 共焦点光学系を用いた倒立型の蛍光 顕微鏡 1 と 、 試料か らの蛍光を測定する ためのフォ ト マルチ プラ イ ヤ 2 と 、 測定データ を受信 して 自 己相関関数に よ る演 算を行なっ て該測定デー タ の数値化ま たはダラ フ化を行な う データ処理装置 3 と 、 前記演算結果を画面上に表示する表示 装置 4 と を備えている。

試料含有液 1 1 は、 図 5 に示す通 り 、 試料台 1 2 に載せた ス ラ イ ドガラ ス 1 3 上に点着させる こ と に よ って簡単にセ ッ ト でき る。 こ の装置では、 特に、 微量の試料含有液 1 1 を用 いている ため、 水分の蒸発を防止する ための蓋 1 4 をス ライ ドガラ ス 1 3 上にかぶせてある。 こ の蓋 1 4 は、 好ま し く は 光透過性の低い ものを用いる。 これに よ つて気密性と遮光性 が同時に得 られる。 更に、 蓋の内面は、 励起光線の反射を防 止する よ う に、 でき るだけ光射性の低い も のを使用する こ と が好ま しい。

試料含有液 1 1 が位置する ス ラ イ ドガラ ス 1 3 の部分の真 下には、 試料含有液 1 1 中で焦点を結ぶよ う に設定した対物 レ ンズ 1 5 が配置される。 なお、 蛍光顕微鏡 1 は落射型でも よい。 落射型においては、 対物 レ ンズ 1 5 の レ ンズ下面に直 接的に試料含有液 1 1 を点着 して も よい。 また、 図 5 に示す 例においては、 蛍光顕微鏡 1 の光源である レーザ発生装置 1 6 と して、 アルゴン （ A r ) イ オン レーザを使用 している。 ま た、 蛍光顕微鏡 1 における ス ライ ドガラ ス 1 3 の搬入や 搬出、 ス ラ イ ドガラ ス 1 3 等への試料含有液の点着、 蓋 1 4 の開閉等の各種動作は、 必要に応 じて適宜自 動化 されて も よ レヽ

この よ う な検出は、 図 5 に示すよ う な共焦点顕微鏡によ つてな し得る。 共焦点顕微鏡自 体は、 本分野で公知である。 共焦点顕微鏡を用いた検出は、

(1)レーザー光を励起光と して照射する ；

(2)フ ィ ルタ ー（IF)を通過 させた後、 レーザー光を集光 し、 ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラ ー（DM)に よ っ て試料中の一点に レーザ 一光を照射する ；

(3)試料中の蛍光物質を レーザー光で励起 して蛍光発光 さ せる ；

(4)ピ ン ホ ールを通過 さ せる こ と に よ り 、 試料の焦点中の 蛍光物質か ら発せ られた蛍光のみを光増倍管（PMT)で増幅す る

(5)増幅 した蛍光を検出する

こ と に よ っ てな される。

図 5 では、 アルゴンイ オ ン レーザーが例示されてい る が、 蛍光物質の種類に応 じて、 波長の異なる ク リ プ ト ンアルゴン イ オン レーザー、 ヘ リ ゥムネオン レーザー、 ヘ リ ゥムカ ド ミ ニ ゥ ム レーザー も使用でき る。 ま た、 図 5 は、 典型的な共焦 点顕微鏡の模式図にすぎないので、 図 5 に記載の共焦点顕微 鏡以外のシステム も 当然使用でき る。

こ のよ う な検出方法は、 微少な一点から発せられる蛍光の みを検出する ので、 ノ ッ ク グラ ウ ン ドがな く 、 通常の蛍光検 出に比べて、 感度が著 し く 高い。

標的多型遺伝子の検出は、 一般的には ミ リ 秒〜分の単位、 最も一般的には秒の単位で行われる。

検出結果が得 られた ら、 該結果を解析 して、 核酸プロ ーブ の う ちの何れが標的多型遺伝子に結合 したかを決定する。 標 的多型遺伝子に結合 した核酸プロ ーブの種類が決定されれば 標的多型遺伝子の型が明 らかになる。

図 6 Aおよび 6 B は、 図 5 の蛍光顕微鏡 1 の測定部分の拡 大図である。 図 6 Aにおいて、 ス ライ ドガラ ス 1 3 と 所定の 開 口数 （図では F A = 1 . 2 ) の対物 レンズ 1 5 と の位置関 係に応 じて、 微小空間 2 0 が形成される。 図 6 B に示すよ う に、 この微小空間 2 ◦ は、 実際にはボ リ ュームを有 した レー ザ光線の焦点である。 その形状は、 中間の く びれた部分から 上下に伸びた略円柱状であ る （図 6 B ) 。 焦点を基準位置と して、 この視野領域 2 0 は光軸上の長 さ Z と 平均半径 Yによ つて制限さ れる。 こ の よ う な微小空間 2 0 において個々 の蛍 光分子の蛍光が正確に測定される のは、 微小空間 2 0 の体積 を蛍光分子の微小運動を追跡 し得る最小の領域にまで小さ く した こ と に よ る。 それによ つて試料含有液 1 1 の中の焦点付 近以外の蛍光分子に由来する ノ イ ズは有効に除去 される。

以上の様な F C S 装置を用いての解析例を以下に説明する， 該 F C S を用いて、 図 6 に示すよ う な共焦点領域に出入 り する蛍光分子の蛍光強度を、 1 分子 レベルで捕える と 、 該蛍 光強度にゆ ら ぎが検出 される。 更に、 この蛍光強度のゆ ら ぎ のデータ を 自 己相関関数で変換 し、 統計学的データ を得る。 これよ つ て、 分子を分離する こ と な く 、 蛍光分子の分子数お よび大き さ が評価さ れる。

上述の態様に よ って測定 したデータ の例をグラ フ と して図 7 に示 した。 図 7 の グラ フ は、 縦軸に蛍光強度 I (t)を、 横 軸は時間（t)と する。 こ のデー タ を以下の よ う な 自 己相関関 数で変換する と 図 8 のグラ フが得 られる。

自 己相関関数は、

G ( τ ) ： G ( r ) = < I ( t ) I ( t + τ ) > であ り 、

これを平均強度 〈 I 〉 の 2 乗で規格化 して展開する と 、

2

G(x) /〈1广 = C(X)

+一 (1) N + 4Dて I w^y² + 4DT / W_Z ² 2 と 近似でき る。 この と き、 τ = 0 の と き C ( 0 ) = 1 + 1 / N、 D =拡散定数、 N =溶液中の分子数である。

こ の よ う な分析の概念は、 図 9 A力 ら図 9 Dま でに よ つて よ り 明確 と なる であろ う 。 即ち、 蛍光強度の関数 I ( t ) は 標識分子が結合 していない場合には、 分子のサイ ズが小さ い のでブラ ウ ン運動の速度が大き く （図 9 A ) 、 I ( t ) の周 波数が大き い （図 9 B ) 。 これに対 して、 標識分子が結合 し ている と 、 ブラ ウ ン運動の速度は小 さ く （図 9 C ) 、 周波数 の大き いデータ が得 られる （図 9 D ) 。 それ故、 上述の ごと く 、 蛍光強度を基に して得られた 自 己相関関数を解析すれば 標識分子の状態が明 ら かと なる わけである。

本発明の も う 1 つの側面に従 う と 、 上述 したよ う な態様を 以下の様に変更する こ と が可能である。 該プロ ーブの 3 ' 末 の塩基分子に付与する標識物質と して、 多型部位の塩基配列 の種類毎に、 蛍光波長が互いに異なる標識物質を付加 しても よい。 こ の よ う なプロ ーブを検体 D N A と 混合 し、 実施例 1 と 同様にハイ ブ リ ダイ ズを し、 ミ スマ ッチを起こ した塩基の 削除を該酵素を用いて行な う 。 続いて F C S に よ る検出を実 施する。 こ の際、 異な る波長を用いて、 それぞれの標識物質 の解析を行 う 。 それに よ つて、 どのプロ ーブが完全マ ッチで ある かが明確に分かる。 それと 同時に、 3 ' 末の塩基の種別 が識別さ れ、 どの多型であるかが分る。 その結果、 よ り 確実 に 1 塩基置換を検出でき る。 また、 異種蛍光を利用する場合 には、 励起光の波長を変えて も よ く 、 または検出部にフ ィ ル タ ーを用いる こ と に よ って検出光の波長を変えて も よい。

以上、 F C S 装置の例を記載 したが、 本発明は、 これに限 定される ものではない。 こ の発明の実施の形態の各構成は、 各種の変形、 変更が可能である。

こ のよ う な本発明側面に よ って、 簡便且つ短時間で実施す る こ と が可能な 1 塩基置換検出方法が提供される。 こ の効果 は、 本発明の独創的な原理に基づ く も のである。 即ち、 本発 明は、 目 的 とする検出を、 夫々 の多型性に特異的なプロ ーブ に標識を付 して使用 して検体 D N A と 反応 し、 これを検出す る こ と に よ って、 こ の反応を分子 レベルで捉える。 こ の と き 複数の経過時点で標識物質を測定 し、 その時間的な位置変化 を検出 し評価する こ と に よ って、 分子の大き さ に依存 して変 化する位置変化を定量的に検出する こ と が可能になる。

従って、 従来方法に必要であっ た B / F 分離等の工程や、 酵素標識試薬の場合の基質反応等、 および R I 標識試薬を用 いた場合の放射性感応フ ィ ルムへの暴露、 並びに P C Rおよ び電気泳動工程等が不要である。

具体的には、 従来の方法では、 P C Rが必須であ り 、 また 電気泳動を行なった際に明確な結果を得る ためには、 その伸 長する長 さ も 2 0 0 カゝ ら 3 0 0 塩基ま で行な う こ と が好ま し い と されてレヽる。 しか しなが ら、 本発明の態様に従 う と 、 電 気泳動も P C R も必ず しも行な う 必要はない。 仮に、 よ り 高 い確実性を求めて P C R を行な う 場合であっても、 1 0 力、 ら 3 0 塩基の伸長だけ行えば充分に確実なデータ を得る こ と が でき る。

本発明の態様に従 う 検出方法は、 検体量および試薬量と も 非常に少量のみを用いて実施する こ と が可能である。 具体的 には、 検体 と して用いる試料はフ ェ ム ト リ ッ ト ル （ f L ) レ ベルで充分であ る。 従って、 本発明の態様に従 う と 、 極小型 の容器で多数の検体を同時に測定する こ と が可能であ り 、 検 查に要する検体量および酵素試薬等の検出に必要な試薬を低 減する こ と が可能である。

また、 本発明の態様に従 う と 、 同一容器内で異なる多型部 位に特異性を有する複数の試薬を混合 し、 同時に検体に対 し て処理する こ と が可能である。 従って、 検体 D N Aの必要量 の低減、 および反応容器数の低減が可能であ る。 また、 多型 遺伝子検査が簡便に行える。

本発明の態様に従 う と 、 高感度な 1 塩基置換の検出が達成 される。 また上述 した本例の方法は、 ノ ッ ググラ ウ ン ドの影 響が少ないホモジニァ ス系であ る ため、 判定精度が高い。 こ れは本発明の検出原理に基づ く ものである。

実施例 3

本発明の も う 1 つの側面に従 う と 、 ヌ ク レオチ ドにおける S N P 以外の多型性を検出でき る方法が提供される。

即ち、 本態様は、 多型の検出方法であっ て、

前記ポ リ ヌ ク レオチ ドを含む検体を準備する工程と 、

検出可能な標識がラ ベルさ れた核酸プロ ーブ P R i 〜 P R „ であ っ て、 前記多型配列 P S 〜 P S _n と 特異的に結合 し 得る核酸プロ ーブ P R P R _n と 前記検体 と を混合する こ と に よ り 、 前記核酸プロ ーブ P R i P R n を前記ポ リ ヌ ク レオチ ドに結合せ しめる工程と 、

微小空間内 に存在する前記核酸プロ ーブ P R 〜 P R _n を 検出する 工程と 、

検出結果を解析 して、 P R i P R nの う ち の何れが前記 ポ リ ヌ ク レオチ ドに結合 したかを決定する こ と に よ り 、 前記 多型部位の塩基配列が多型配列 P S 〜 P S _nの何れであ る かを決定する工程と

を具備する方法である。 こ の態様に従 う と 、 ポ リ ヌ ク レオチ ド中に含まれる多型部位の塩基配列が多型配列 P S 〜 P S _n ( n は 2 以上の整数） の何れである かが決定され得る。 本態様に従 う と、 所定のポリ ヌ ク レオチ ド、 最も典型的に は多型遺伝子中に含まれる多型部位を検出する と 同時に、 そ の多型部位の塩基配列を迅速且つ簡便に決定する方法が提供 される。

標的多型遺伝子を P C R増幅する場合には、 まず、 型を決 定すべき多型部位を挟むよ う にプライ マー対を選択しなけれ ばな らない。

続いて、 多型配列 P S i 〜 P s _n と相補的な塩基配列を含 む核酸プローブ P R P R n ( n は 2 以上の整数） を、 前 記検体と 混合する。 核酸プローブ P R i は、 多型配列 P S と相補的な塩基配列を含むので、 標的多型遺伝子の型が P S の場合には、 核酸プロ ーブ P R iのみが標的多型遺伝子 と 結合 し得る。 同様に、 標的多型遺伝子の型が P S ₂ 〜 P S _n の場合には、 それぞれ核酸プローブ P R ₂ 〜 P R _nが標的多 型遺伝子と結合 し得る。

標的多型遺伝子に未知の多型配列が存在 しない限り 、 該多 型遺伝子には、 多型配列 P S i 〜 P S _nの う ちの何れかが含 まれる ので、 該多型遺伝子 と核酸プロ ーブ P R i P R n と を混合すれば、 核酸プロ ーブ P R i 〜 P R _nの何れかが該多 型遺伝子の多型部位に結合する。

核酸プローブ P R i P R nには、 検出可能な標識物質、 好ま しく は蛍光物質又は発光物質が標識されているので、 核 酸プローブが結合した多型遺伝子は、 以下で詳述する検出操 作で検出する こ と が可能と なる。

各核酸プローブに標識すべき標識物質は、 全て同種であつ て も よい。 しか し、 何れの核酸プロ ーブが標的多型遺伝子に 結合 したかを識別でき る よ う に、 少な く と も 2 種類の標識物 質を用い る こ と が好ま しい。 1 種類の標識物質のみを使用す る場合には、 例えば、 各核酸プロ ーブの長さ を変える こ と に よ っ て、 何れの核酸プロ ーブが標的多型遺伝子に結合 したか 識別する こ と ができ る。

核酸プロ ーブ p R i〜 p R _n の何れかを標的多型遺伝子に 結合 さ せた後に、 微小空間内 に存在する核酸プロ ーブ P R ！

〜 P R _nを検出する。

微小空間内の標的多型遺伝子は、 該遺伝子に結合 した核酸 プロ ーブの標識を検出する こ と に よ っ て検出 される。 前述の よ う に、 微小空間の容積は極めて小さ いので、 該検出は、 レ 一ザ一光を用いて、 顕微鏡視野下で微小空間内の蛍光発光を 検出する こ と が好ま しい。

検出工程は、 例えば、 実施例 2 に示すよ う な装置を用いて 行 う こ と が可能である。 例えば、 本態様では、 核酸プロ ーブ の う ち何れが標的対立遺伝子に結合 したかを明 らかにする た めに、 以下の よ う に F C S を行い得る。

( 1 )図 6 B に示 さ れてい る微小空間に レーザー光を照射す る。

( 2 )該微小空間 中に存在する蛍光物質か ら発せ られる 蛍光 の蛍光強度を経時的

に測定 し、 図 9 A力ゝ ら 図 9 D に示 されてレヽる よ う なデー タ を取得する。

( 3 )異な る 2 時点の蛍光強度 l it )と Iit+ τ )の積の期待値を 計算 し、 自 己相関関

数 G( τ ) = <I(t) I(t+て )>を得る

(4)下式 2 ：

Y

G(T) = 1 + - N + + S 2

^Tunbound -unbound

+ y

(2)

+ + S'

"bound bound

(こ こで、 N : 蛍光分子の平均数

2 / 4

^ u n b o u n d = ^W ° D b o u n d 遊離の核酸プロ一 ブの並進拡散時間

2 / 4

て o u n d = W O D _b 。 _{u n d} ： 結合 した核酸プロ ーブの 並進拡散時間

y =結合 した核酸プロ ーブの割合

¾ = W O / Z O であ ^)

(なお、 wo は検出領域の径、 2zo は領域長、 D_{u n b} 。 _{u n d} と D _b 。 _{u n d}は、 それぞれ遊離の

核酸プローブ及び結合 した核酸プロ ーブの並進拡散定数 である） ）

を用いて、 （3)で得た 自 己相関関数を解析する。

(5)各核酸プロ ーブについて、 添加前 と 添加後の 自 己相関 関数を比較する。

FCS に よ って、 何れの核酸プロ ーブが結合 したのかを決定 する ためには、 例えば、 各核酸プローブを励起波長及び 又 は蛍光波長の異なる蛍光標識で区別すればよい。

また、 各核酸プロ ーブのサイ ズが異なれば、 ブラ ウ ン運動 の変化及び自 己相関関数も異なる ので、 サイ ズの異な る核酸 プロ ーブを用いる こ と によ って何れの核酸プロ ーブが結合 し たかを決定する こ と もでき る。 も ちろん、 サイ ズと蛍光標識 の両者を組み合わせる こ と によ っ て、 標的対立遺伝子に結合 した核酸プロ ーブの種類を決定 して も よい。

上記の よ う なハイ ブ リ ダィゼーシ ョ ン反応を指標と した検 出のみな らず、 プロ ーブと して用いた標識配列をプラ イ マー と して用いて P C R反応を行い、 増幅産物の標識種類の判別 に よ って も標的対立遺伝子を決定する こ と が可能である。 ま た、 こ う した P C R反応を指標 と する こ と も可能である。 ま た、 こ う した P C R反応を指標 と する場合、 多型に よ って増 幅産物のサイ ズが異なる よ う にプライ マーの設計をする こ と によ り 、 増幅産物のサイ ズの差異に基づ く 自 己相関関数の差 によ って標的対立遺伝子の型を決定する こ と ができ る。

こ のよ う に、 本発明の方法を用いれば、 極めて迅速且つ簡 便に標的対立遺伝子の多型部位の型を決定でき る。

H L Aの型の決定 （図 1 0 参照）

実施例 3 に示す本発明の 1 側面に従 う と 、 例えば、 H L A の型を決定する方法が提供される。

本例では、 H L Aク ラ ス I I 領域 D R B 1 のァ ロ抗原性を 示す多型配列の型を決定する。 D R 2 のサブタイ プである D R B 1 * 1 5 (配列番号 1 ) と D R B 1 * 1 6 (配列番号 2 ) は、 1 4 1 番 目 のヌ ク レオチ ド （T→ C) と 1 8 0 番 目 のヌ ク レオチ ド（G→ C)のみが異なっている。

D R B 1 * 1 5 の 1 4 1〜 1 8 0 番 目 の塩基配列 と相補的 な塩基配列を有する プロ ーブ 1 と 、 D R B 1 * 1 6 の 1 4 1 〜 1 8 0番 目 の塩基配列 と 相補的な塩基配列を有する プロ一 ブ 2 を調製 し、 プロ ーブ 1 はフルォ レセイ ンィ ソ チオシァネ 一 ト（FITC)、 プロ ーブ 2 はロ ーダ ミ ンで標識する。 プロ ーブ 1 及びプロ ーブ 2 が、 各々 1 0 - ⁸ M程度の濃度にな る よ う に溶液に力 Pえる。

コ ンセ ンサス領域に特異的に結合 し得る プライ マ一対を用 いた P C R反応に よ り 、 6 0〜 2 0 0番 目 の塩基配列を増幅 する。 1 0 — ⁸程度の濃度にな る よ う に溶液を加えて、 DNA 検体を調製する。

カバーグラ ス の面に該 DNA 検体を 1 滴載置 し、 プロ ーブ 1 と プロ ーブ 2 を添力 [] した後、 5 8〜 6 0 °C前後のハイ ブ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応を行 う 。

ハイ プ リ ダイ ゼーシ ョ ン反応の前後におけ る、 蛍光発光の 自 己相関関数の変化を測定する。

例えば、 検体 D N Aの型が D R B 1 * 1 5 の ホモ であ る場 合には、 プロ ーブ 1 のみが結合する ので、 F I T Cか ら発せ られる黄緑色の蛍光の 自 己相関関数のみが変化する。 他方、 検体 D N Aの型が D R B 1 * 1 6 の ホモ であ る場合には、 プ ローブ 2 のみが結合する。 従って、 ロ ーダ ミ ンか ら発せ られ る黄緑色の蛍光の 自 己相関関数のみが変化する。 また、 検体 D N Aの型が D R B 1 * 1 5 と D R B 1 * 1 6 のへテ ロ であ る場合には、 プロ ーブ 1 と プロ ーブ 2 が共に結合する。 従つ て、 F I T C カゝ ら発せ られる蛍光 と ロ ーダ ミ ンカゝ ら発せ られ る蛍光の 自 己相関関数が共に変化する。 も し、 検体 D N Aの 型力 S D R B 1 * 1 5 と D R B 1 * 1 6 の何れで も なければ、 自 己相関関数は全く 変化 しない。

こ の よ う に、 プロ ーブ 1 と プロ ーブ 2 は異なる標識物質で ラベルさ れている ので、 同一の容器中に添カ卩 して も、 何れの プロ ーブが検体 D N A と結合 したかを決定でき る。 近年、 H L Aには多 く の多型部位が存在する ので、 多種類のプロ ーブ を同時に同 じ容器に添加 して分析でき る こ と は、 本発明の方 法の大き な利点であ る。

本例では、 異なる標識物質でラベルされたプロ ーブを用い る方法を記載 したが、 長さ が異な る プローブを用いて も よい, この場合、 各プロ ーブの長さ は、 FCS によ っ てゆ ら ぎの差異 を判別でき る よ う に選択 しなければな らない。 例えば、

D R B 1 * 1 5 と D R B 1 * 1 6 を判別する 上記事例におい ては、 プロ ーブ 1 と プロ ーブ 3 (配列番号 3 ； プロ ーブ 1 よ り 20塩基長い） を使用する こ と ができ る。

図 1 1 には、 本例の方法の臨床検査への応用を示 した。 該 応用によれば、 多数の多型配列のサブク ラ ス の型を迅速に決 定でき る ので、 多数の多型部位が存在 し、 多型部位毎に多く のサブク ラ スが同定されている H L Aの型を決定するのに有 用である。

図 1 1 カゝ ら明 らかのよ う に、 該方法では、 ガラ ス平板上の 各窪みの 中 には、 H L Aの多型配列 （ Α2、 Α26、 Β40···等） がそれぞれ各別に添加 した後、 各多型配列のサブク ラ ス と特 異的に結合 し得るプロ ーブ群を加える。 続いて、 本例で詳述 した よ う に、 各窪み毎に何れのプローブが結合 したかを決定 すれば、 多数の多型配列のサブタ イ プを決定する こ と ができ る。 勿論、 前記窪みの中に添加すべき 多型配列は H L Aのみ に限 ら ない。 ま た、 各窪みには、 全く 種類の異な る多型遺伝 子を添加 しても よい。

本発明の 1 例である この よ う な方法に従えば、 多種類のポ リ ヌ ク レオチ ド中の多型部位を迅速且つ簡便に決定でき る。 実施例 4

本発明の更な る も う 1 つの側面に従 う と 、 多型の 1 つであ る血型を解析する こ と ができ る方法を提供する こ と ができ る そのよ う な方法は、 例えば、 以下の通 り に行える。 まず、 試料中の抗原 と 抗体 と の反応を、 標識化抗体の運動状態を蛍 光相関分光法を用いて直接的に観察する。 それに よ つて、 標 識化抗体の存在状態を解析 し、 試料中で抗原抗体反応が生 じ ているか否かを判定する。

従って、 本発明の 1 つの側面に よれば、 本例は、 例えば、 血球血型の判定、 特に、 赤血球血型ォモテ試験およびゥ ラ試 験、 不規則抗体の検出、 抗血球特異抗原お よび抗体の検出、 ウ ィ ルスおよび細菌等の抗原および抗体の検出等を実施する こ と が可能であ る。

具体的には、 本例は、 まず、 試料中の検出対象 と なる抗原 ま たは抗体を検出する ために、 蛍光物質を付 した前記抗原ま たは抗体に特異的な抗体ま たは抗原を使用 し、 これ ら を反応 させる。 次に、 前記蛍光物質の蛍光強度のゆ ら ぎを経時的に 測定 し、 得 られたデータ を蛍光 自 己相関関数で変換する こ と によ り 、 蛍光物質を具備する分子の分子数および大き さ を検 出する。

本発明の態様に従 う 方法では、 測定開始か ら終了する まで を通 して、 試料に存在する何れの物質も B — F分離等の分離 操作を行 う 必要がない。 本例における標識分子の運動状態の 測定は、 試料お よび任意の試薬を反応容器に添加 した時点か ら、 経時的に該容器中で反応が進行する過程において継続 し て追跡する こ と に よ り 行われる。 従っ て、 抗原抗体反応によ る標識分子の運動状態の変化を経時的に測定する こ と が可能 であ る。 ま た、 この測定は、 該反応系において進行する抗原 抗体反応に応 じた 自 然状態のま まで高精度に測定する こ と が 可能であ る。

本発明の態様に従 う 方法は、 特異反応その もの以外の工程 即ち、 従来の輸血検査で実施されていたよ う な凝集反応また は洗浄反応、 および遠心反応凝集パタ ーン形成等の工程、 は 不要であ り 、 更に、 検体と試薬の混合直後に リ アルタイ ムに 測定開始でき る。 従って、 従来法に比較 して検査時間は短縮 され、 検査工程は簡便化され、 非特異反応は低減される。 上述の通 り に反応工程を行っ た後、 検出工程は実施例 2 に 従 う 装置に よ り 実施でき る。 得られたデータ の解析方法の例 を以下に説明する。 こ こでは、 蛍光信号は約 1 分間測定する こ と とする。 ま た、 得 られた蛍光信号を逐次記憶部に記憶さ せる と 共に、 蛍光 自 己相関関数 G ( t ) に適用 させる こ と に よ り 解析される よ う にプロ ダラ ミ ング して評価 してよい。 蛍光 自 己相関関数 G ( t ) は、 測定領域内での蛍光分子の 平均数 N、 蛍光標識物質を含む非反応分子 と しての遊離の標 識化基質分子の並進時間 τ _m。 _n 。 と 、 抗原抗体反応後に標的 分子に結合 した標識化基質分子の並進時間 て _p 。 _{t y} と 力ゝ ら、 R i g l e r 等の方法 （ F l u o r e s c e n c e S p e c t r o s c o p y — N e w M e t h o d s a n d a p p l i c a t i o n s , S p r i n g e r B e r l i n , 1 3 - 2 4 , I n J . R . L a d o w i c z ( E d . ) , 1 9 9 2 を参照 されたい） に基づき 、 以下の式 3 に よ っ て計算 した。 こ の文献は参照によ り こ こ に組み込ま れる。

Y

G(t) = 1 +

N + + S2 -

T, mono X mono

+ y

(3)

+ + _S2

Τροΐγ y 丄， ροΐγ 数式 3 において、 y は反応成分の割合 て _m。 _n 。 = W o ² // 4 D _m 。 _n 。 、 _{T p} 。 _{l y} = W o ² / 4 D _p 。 _{l y} 、 S = W o / Z o (こ こ で、 W o は焦点付近の微小視野に形成 される略円柱状 の測定領域 （図 3 を参照 さ れたい） ） の体積要素の径であ り 2 Z o はその長 さ を意味する） 、 0 „₁。 ₁₁ 。ぉ ょ び 13 ₁₃ 。 _{1 7} は 夫々 非結合成分および結合成分の並進拡散係数である。

本例は、 後述する血型に関する方法のみな らず、 同様の構 成に よ って ウ ィ ルスや細菌等の感染症またはその他抗原抗体 反応を介 した判定検査に応用する こ と も可能であ る等の幅広 い応用が可能である。

更に、 本態様では、 抗原抗体反応に影響を与えない蛋 白質 で修飾する こ と によ り 分子量で変化を付け る方法も実施する こ と も可能であ る。 この場合、 どの分子量の抗体試薬の移動 速度に変化が生 じたかが検出の指標であ り 、 用いる蛍光物質 は 1 種類で多項 目 の判定が可能と なる。

本例に使用する こ と が可能な反応容器は、 上述で示 したス ライ ドグラ ス に点着する タ イ プ （図 1 2 Aおよび B ) 、 マイ ク ロ ウ エルを多数設けたマイ ク ロ プレー ト （図 1 1 ) または 適 当 な数の ウ エ ノレ を具備する プ レ ー ト （図 1 3 Aカゝ ら 1 3 D ) を使用する こ と が可能である。 その場合、 必要な反応容 量は微量で十分である ため、 3 8 4 ゥ エル等の超マイ ク ロ ウ エルプレー ト タ イ プも適用可能で輸血検査を極めて高速のハ イ ス ループッ トイ匕する こ と が出来る。

以下の例は、 図 5 に示 した F C S装置を用いて F C S 測定 を実行 した。 即ち、 その試料液滴を試料用ス ライ ドに添加 し た状態で市販の F C S 装置 （ C o n f o C o r ， C a r 1 Z i s s J e n a G m b H ) の試料台に載せ、 倍率 4 0倍の 対物 レ ンズ （ C _ A p o c h r o m a t , N A = 1 . 2 ) に よ り 、 レンズ内を通ってき た C W A r + レーザー ビームで 励起 し、 得 られる放出光はァバ ラ ンシュ ■ ダイ オー ド （ A P D ) であ る S P C M— 2 0 0 — P Q ( E G & G社） でシング ル ' フォ ト ン ' カ ウ ンテ ィ ング ' モー ドに よ り その蛍光信号 と して測定 した。 測定 した蛍光信号は、 デジタル · コ リ レー ターであ る A L V 5 0 0 0 Z E ( A L V G m b H ) で解析 する こ と に よ り 評価 した。 焦点領域の試料体積は、 ロ ーダ ミ ン 6 Gの拡散係数値か ら決定 した。 ま た、 体積要素は、 フル ォレ ツセイ ン と F 1 u — d U T P の溶液の濃度を用いて定め た。

こ こ では、 検出領域 （ 1 0 — ^{1 5} L ) にお け る 分子の平均 数と 分子の並進拡散係数が求め られ.る。 以下に示す態様は、 特異的反応前と反応後における こ う した情報の時間的な変化 を検出、 変換 して図 9 に示すよ う な拡散速度から分子の大き さ を検出する こ と を利用 した血型の同定方法である。

( 1 ) 赤血球血液型ォモテ試験

図 1 3 B のよ う な複数の凹みを有 したス ラ イ ドガラ ス状の 測定用容器の コ ン ト ロ ールゥ エルに、 F I T C等の蛍光で標 識 した抗体試薬を分注 し、 直ちに測定する。 測定容器の体積 は、 例えば 1 0 μ 1 前後であれば F C S の測定領域と して十 分であ る。 また、 コ ン ト ロ ーノレウ エノレと 測定用 ウ エノレを各々 別にする 必要性は必ず しも ない。 試薬混合の前後を夫々 コ ン ト ロ ール と 被検試料群 と して測定する方式でも よい。

ま た、 使用する試料中の赤血球濃度は、 通常の血液型ォモ テ試験に使用 される ものに比較 して、 低い濃度でよい。 例え ば、 1 0 ³〜 1 0 ⁴ cells/ / L でよ く 、 好ま し く は 2 〜 5 X 1 0 ³ cells/μ L でよい。 従って、 本態様を血型試験に使用すれ ば、 従来法 と 比較 して よ り 少ない採血量で試験を行 う こ と が 可能であ る。 即ち、 全血の希釈率は 0 . 1 %前後でよい。

反応系 と しては、 図 1 3 Cの よ う に、 F I T C で標識 した 抗 A抗体および抗 B抗体を夫々別々 の ゥ エルで試験する反応 系以外に、 図 1 3 Aの よ う な 1 つの ウ エノレ内でに、 抗 A抗体 を F I T C で、 抗 B抗体を C y 3 で標識 して同 じ ゥ エルにて 混合する 系 も可能である。 試験の判定は、 標識 した蛍光物質 の移動度に変化があったものを、 抗体 と 血球 と が反応 した反 応陽性 （ + ) と し、 移動度に変化のないも のを、 抗体と 血球 と が反応 しなかった反応陰性 （一） と する。

本反応方法に よれば、 抗原と抗体と を混合する ヮ ンステ ツ プのみで測定する こ と が可能である。 従って、 凝集パタ ー ン 形成に必要なィ ンキ ュ ベーシ ョ ン時間や遠心操作は不要 と な る。 また、 測定領域が極微小であるために、 反応に要する検 体血球や抗体試薬も微量でよ く 、 従つて、 反応コ ス ト が低減 でき る。 ま た、 固相面や凝集パター ンを介 さずに、 純粋に、 抗原抗体 1 分子間の反応の有無を蛍光分子の移動度の変化で 直接捕 ら える ため、 非特異性の反応が生 じる機会が少な く 、 測定数値と して定量的判定が可能であ る。 こ の こ と は、 現在 の輸血検査で問題と なっている亜型の判定上か ら も重要な特 徴である。

更に、 図 1 3 Aで示 した よ う に 1 検体の判定につき 、 同一 容器で複数項目 測定でき、 測定時間の短縮や検体および試薬 量等の削減も可能と なる。

ま た、 反応系の試料を超音波等の適切な手段に よ り 攪拌 し て も よい。

( 2 ) 赤血球血液型ゥ ラ試験

A型お よび B型の標準血球と被検血清と を混合 した後で、 これを、 蛍光標識した標準抗体を予め分注 しておい†こ ゥ 二 /レ に添加 し、 混合 して直ちに測定する。 この場合の判定原理は 被検血清中の抗血液型抗体 と標準抗体と の競合反応に よ る も のである。

ォモテ試験と 同様に異な る蛍光物質を標識に用いる こ と に よ り 、 A型および B型の両方の標準血球、 並びに抗 Aお よび 抗 B 両方の蛍光標識標準抗体を 1 検体について、 同一ウ エノレ 内にて反応する こ と が可能である。

試験の判定は、 標識 した蛍光物質の移動度に変化があった も のを、 抗体と 血球と が反応 した反応陽性 （ + ) と し、 移動 度に変化のないものを、 抗体と 血球と が反応 しなかつた反応 陰性 （一） とする。

表 2

( 3 ) 不規則性抗体のス ク リ ーニ ン グ試験

赤血球に対する不規則性抗体のス ク リ一ユング試験を行 う ためには、 反応 ゥエルに二次抗体であ る抗ヒ ト グロ ブ リ ン血 清を蛍光標識 した も のを予め分注 してお く 。 次に、 標準血球 即ち、 臨床的に重要な抗体を検出する のに十分な抗原構成と した、 通常 2 〜 3 種類の O型正常ヒ ト 血球 と 被検血清 と を混 合する。 混合後、 直ち に これを前記反応ゥ エルに分注 し、 検 出を行 う 。

被検血清中に遊離 している不規則性抗体以外のグロ ブ リ ン に対 して も蛍光標識血清は結合 し、 それに よ り 蛍光物質の移 動度に変化が現れる。 しカゝ しなが ら、 標準血球に結合 した不 規則抗体が存在する場合には、 蛍光物質の移動速度の変化は 前者の場合よ り も顕著に大き く 変化する。 不規則性抗体の存 在の判定は容易であ る。

( 4 ) 応用

上述 した態様は、 ス ク リ ーニング後の抗体同定にも応用す る こ と が可能である。 この場合、 臨床的に重要な抗原構成を パネルと して配分 した抗体同定用のパネル血球を別ゥ エルで 反応を用い、 その反応パターンを解析する こ と に よ り 抗体を 同定する。

ま た、 標準血球を用いた反応を用いる場合、 所望に応 じて 標準血球を反応容器に固相化する こ と 、 あ る いは、 仕切 り を 設けて微小視野内に血球が侵入 しないよ う な反応容器を使用 して も よい。 これに よ り 、 ノ ッ ク グラ ウ ン ドを最小 とする こ と が可能である。

こ こで引用 される文献は、 引用 される こ と に よ り その全体 に亘つて、 本命最初に組み込まれる。

更なる利益および変更が当業者によ って容易に想到 される であろ う 。 従っ て、 そのよ り 広い範囲の側面における本発明 は、 こ こ に示 し且つ記載さ れた詳細お よび代表的な態様に よ り 限定される も のではない。 従って、 添付された請求の範囲 およびそれ らの等価物によ り 限定される よ う な全般的な発明 の思想の精神お よび範囲か ら逸脱 しなせずに、 種々 の変更が な される こ と が可能である。

産業上の利用可能性

本発明は、 遺伝子治療および診断等の臨床的における疾患 関連遺伝子の解析、 輸血および臓器移植における多型の解析 において有用である。 また同様に、 基礎的な多型および疾患 関連遺伝子の研究において も有用であ る。

Claims

求 の 範 囲

1 . 多型部位の検出方法であっ て、

( 1 ) 多型部位を含む検体 と 、

前記検体の多型部位 と 高親和性に結合 し、 且つ標識物質が付 された少な く と も 1 種類のプロ ーブと 、

を反応させる こ と と ； および

( 2 ) 前記反応の進行中において、 複数の経過時点で前 記標識物質の位置変化を光学的に測定 し、 解析する こ と によ つて多型部位の検出を行 う こ と と ；

を具備する方法。

2 . 請求項 1 に従 う 多型部位の検出方法であって、 前記標 識物質が蛍光物質であ り 、 前記検出が共焦点顕微鏡に よ って 行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分光法に よ って行われる こ と を特徴 と する方法。

3 . 請求項 1 に従 う 多型部位の検出方法であって、 前記多 型部位が単一ヌ ク レオチ ド多型である こ と を特徴とする方法 4 . 多型部位の検出方法であっ て、

( 1 ) 多型部位の配列を含む検体 D N A断片 と 、 前記検体 D Ν Α断片に含まれる配列に相補的な配列を有 し、 且つ標識物質が付与された少な く と も 1 種類の D N Aプロ一 ブと 、

をハイ ブ リ ダィ ズする こ と と ； および

( 2 ) 前記ハイ ブ リ ダィ ズの進行中において、 複数の経 過時点で前記標識物質の変化を光学的に測定、 解析する こ と に よ って多型部位の検出を行 う こ と と ； を具備する方法。

5 . 請求項 4 に従 う 多型部位の検出方法であって、 前記標 識物質が蛍光物質であ り 、 前記検出が共焦点顕微鏡に よ って 行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分光法に よ って行われる こ と を特徴と する方法。

6 . 請求項 4 に従 う 多型部位の検出方法であって、 前記多 型部位が単一ヌ ク レオチ ド多型である こ と を特徴とする方法 7 . 多型部位の検出方法であっ て、

( 1 ) 多型部位の配列を含む検体 D N A断片 と 、

前記検体 D N A断片に含まれる配列に相補的な配列を有 し、 且つ前記多型部位に対応する塩基に標識物質が付与さ れた少 な く と も 1 種類の D N Aプローブと 、

をハイ ブ リ ダィ ズする こ と と ；

( 2 ) 得られたハイ プ リ ダイ ズ産物に校正機能を有する 核酸合成酵素を反応させる こ と と ； および

( 3 ) ( 1 ) と （ 2 ) の工程の進行中において、 複数の 経過時点で前記標識物質の変化を光学的に測定 し、 解析する こ と によ っ て多型部位の検出を行 う こ と と ；

を具備する方法。

8 . 請求項 7 に記載の多型部位の検出方法であって、 前記 標識物質が蛍光物質であ り 、 前記検出が共焦点顕微鏡に よ つ て行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分光法に よ っ て行われる こ と を特徴 とする方法。

9 . 請求項 7 に従 う 多型部位の検出方法であっ て、 前記多 型部位が単一ヌ ク レオチ ド多型である こ と を特徴とする方法,

1 0 . 請求項 7 に記載の多型部位の検出方法であっ て、 前 記校正機能を有する核酸合成酵素がエタ ソ ヌ ク レアーゼ活性 を有する酵素である こ と を特徴と する方法。

1 1 . 多型部位の検出方法であって、

( 1 ) 前記ポ リ ヌ ク レオチ ドを含む検体を準備する工程と

( 2 ) 検出可能な標識がラ ベルされた核酸プロ ーブ PRi〜 PR_n であっ て、 前記多型配列 PS 〜 PS„ と 特異的に結合 し得 る核酸プロ ーブ PRi〜PR_n と 前記検体 と を混合する こ と によ り 、 前記核酸プロ ーブ PRi PRn を前記ポ リ ヌ ク レオチ ドに 結合せ しめ る工程と 、

( 3 ) 微小空間内に存在する前記核酸プロ ーブ PR 〜 PR_n を検出する 工程と 、

( 4 ) 検出結果を解析 して、 PRi 〜PR_n の う ち の何れが前 記ポ リ ヌ ク レオチ ドに結合 したかを決定する こ と によ り 、 前 記多型部位の塩基配列が多型配列 PS i 〜 P S _nの何れである か を決定する 工程と

を具備する方法。

1 2 . 請求項 1 1 に記載の多型部位の検出方法であって、 前記標識物質が蛍光物質であ り 、 前記検出が共焦点顕微鏡に よ っ て行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分光法に よ って行わ れる こ と を特徴とする請求項 1 1 に記載の方法。

1 3 . 請求項 1 1 に記載の多型部位の検出方法であって、 前記ポ リ ヌ ク レオチ ドが ヒ ト組織適合性抗原の遺伝子である こ と を特徴 とする方法。

1 4 . 多型部位の検出方法であ って、 ( 1 ) 被検試料と 、 該被検試料に含まれる抗原に特異的 であ り 且つ蛍光物質の付さ れた抗体と を同一容器内に存在さ せる こ と と 、

( 2 ) 前記反応の進行中において、 複数の経過時点で前 記標識物質の位置変化を光学的に測定 し、 解析する こ と によ つて多型部位の検出を行 う こ と と ；

を具備する方法。

1 5 . 請求項 1 4 に従 う 多型部位の検出方法であっ て、 前 記標識物質が蛍光物質であ り 、 前記検出が共焦点顕微鏡によ つて行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分光法に よ って行われ る こ と を特徴と する方法。

1 6 . 請求項 1 4 に従 う 多型部位の検出方法であっ て、 前 記多型部位がタ ンパク 質で構成 さ れる こ と を特徴 と する検出 方法。

1 7 . 請求項 1 4 に従 う 多型部位の検出方法であっ て、 前 記被検試料が赤血球であ り 、 前記抗原が赤血球の表層抗原で ある こ と を特徴とする方法。

1 8 . 多型部位の検出方法であって、

( 1 ) 被検試料と 、 該被検試料に含まれる抗体に特異的 な抗原 と 、 前記抗体に等 し く 且つ蛍光物質を付 した抗体 と を 同一容器内に存在させる こ と と 、

( 2 ) 前記反応の進行中において、 複数の経過時点で前 記標識物質の位置変化を光学的に測定 し、 解析する こ と に よ つて多型部位の検出を行 う こ と と ；

を具備する方法。

1 9 . 請求項 1 8 に従 う 多型部位の検出方法であって、 前 記標識物質が蛍光物質であ り 、 前記検出が共焦点顕微鏡によ つて行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分光法に よ って行われ る こ と を特徴と する方法。

2 0 . 請求項 1 8 に従 う 多型部位の検出方法であっ て、 前 記被検試料が生物由来の体液である こ と を特徴と する方法。

補正書の請求の範囲

[200 1年 7月 1 7日 （1 7. 07. 0 1 ) 国際事務局受理：出願当初の請求の範囲 1， 4， 7， 1 4及び 1 8は補正された；新しい請求の範囲 2 1 —2 6が加えられた； 他の請求の範囲は変更なし。 （6頁） ]

1 (補正後） . 多型部位の検出方法であって、

(1) 多型部位を含む検体と、

前記検体の多型部位について同定すべき複数の型のそれぞれと高親和性に結合し、 且つ標識物質が付された複数種類のプローブと、

を反応させることと、

ここで、 各種プローブは光学的に互いに区別し得るように設定されている ；および

(2) 前記反応の進行中において、 複数の経過時点で前記標識物質の位置変 化を光学的に測定し、 解析することによって前記検体の多型部位の型を同定する ことと ；

を具備する方法。

2. 請求項 1に従う多型部位の検出方法であって、 前記標識物質が蛍光物質で あり、 前記検出が共焦点顕微鏡によって行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分光法 によって行われることを特徴とする方法。

3. 請求項 1に従う多型部位の検出方法であって、 前記多型部位が単一ヌクレ ォチド多型であることを特徴とする方法。

4 (補正後） . 多型部位の検出方法であって、

(1) 多型部位の配列を含む検体 DN A断片と、

前記検体 D N A断片に含まれる同定すべき複数の配列のそれぞれに相補的な配列 を有し、 且つ標識物質が付与された複数種類の D N Aプローブと、

をハイブリダィズすることと

ここで、 各種プローブは光学的に互いに区別し得るように設定されている ；および

(2) 前記ハイブリダィズの進行中において、 複数の経過時点で前記標識物 補正された用紙 (条約第 19 質の変化を光学的に測定、 解析することによって前記検体の多型部位の型を同定 することと ；

補正された用紙 (条約第 19 を具備する方法。

5 . 請求項 4に従う多型部位の検出方法であって、 前記標識物質が蛍光物質で あり、 前記検出が共焦点顕微鏡によって行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分光法 によって行われることを特徴とする方法。

6 . 請求項 4に従う多型部位の検出方法であって、 前記多型部位が単一ヌクレ ォチド多型であることを特徴とする方法。

7 (補正後） . 多型部位の検出方法であって、

( 1 ) 多型部位の配列を含む検体 D N A断片と、

前記検体 D N A断片に含まれる同定すべき複数の配列のそれぞれに相補的な配列 を有し、.且つ前記多型部位に対応する塩基に標識物質が付与された複数種類の D N Aプローブと、

をハイブリダィズすることと

ここで、 各種プローブは光学的に互いに区別し得るように設定されてい る ；

( 2 ) 得られたハイブリダイズ産物に校正機能を有する核酸合成酵素を反応 させることと ；および

( 3 ) ( 1 ) と （2 ) の工程の進行中において、 複数の経過時点で前記標識 物質の変化を光学的に測定し、 解析することによつて前記検体の多型部位の型を 同定することと ；

を具備する方法。

8 . 請求項 7に記載の多型部位の検出方法であって、 前記標識物質が蛍光物質 であり、 前記検出が共焦点顕微鏡によって行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分光 法によって行われることを特徴とする方法。

9 . 請求項 7に従う多型部位の検出方法であって、 前記多型部位が単一ヌクレ ォチド多型であることを特徴とする方法。 補正された用紙 (条約第 19

1 0 . 請求項 7に記載の多型部位の検出方法であって、 前記校正機能を有する 核酸合成酵素がェクソヌクレアーゼ活性を有する酵素であることを特徴とする方 法。

1 1 . 多型部位の検出方法であって、

( 1 ) 前記ポリヌクレオチドを含む検体を準備する工程と、

( 2 ) 検出可能な標識がラベルされた核酸プロー であって、 前記多 型配列 PS ₁〜PS_nと特異的に結合し得る核酸プローブ

と前記検体とを混 合することにより、 前記核酸プローブ PR 〜!³ を前記ポリヌクレオチドに結合 せしめる工程と、

( 3 ) 微小空間内に存在する前記核酸プローブ PR i〜PR_nを検出する工程と、 ( 4 ) 検出結果を解析して、 Ρ 〜ΡΚ_ηのうちの何れが前記ポリヌクレオチド に結合したかを決定することにより、 前記多型部位の塩基配列が多型配列 PS j

PS_nの何れであるかを決定する工程と

を具備する方法。

1 2 . 請求項 1 1に記載の多型部位の検出方法であって、 前記標識物質が蛍光 物質であり、 前記検出が共焦点顕微鏡によって行われ、 且つ前記解析が蛍光相関 分光法によって行われることを特徴とする請求項 1 1に記載の方法。

1 3 . 請求項 1 1に記載の多型部位の検出方法であって、 前記ポリヌクレオチ ドがヒ ト組織適合性抗原の遺伝子であることを特徴とする方法。

1 4 (補正後） . 多型部位の検出方法であって、

( 1 ) 被検試料と、

該被検試料に含まれる同定すべき複数の抗原のそれぞれに特異的であり、 且つ蛍 光物質の付された複数種類の抗体と、

を同一容器内に存在させることと

ここで、 それぞれの抗体に付された蛍光物質は、 異なる種類の抗体間で互 補正された用紙 (条約第 19 いに区別し得るように設定されている

；および

( 2 ) 前記反応の進行中において、 複数の経過時点で前記標識物質の位置変 化を光学的に測定し、 解析することによって前記検体の多型部位の型を同定する ことと ；

を具備する方法。

1 5 . 請求項 1 4に従う多型部位の検出方法であって、 前記標識物質が蛍光物 質であり、 前記検出が共焦点顕微鏡によって行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分 光法によって行われることを特徴とする方法。

1 6 . 請求項 1 4に従う多型部位の検出方法であって、 前記多型部位がタンパ ク質で構成されることを特徴とする検出方法。

1 7 . 請求項 1 4に従う多型部位の検出方法であって、 前記被検試料が赤血球 であり、 前記抗原が赤血球の表層抗原であることを特徴とする方法。

1 8 (補正後） . 多型部位の検出方法であって、

( 1 ) 被検試料と、

該被検試料に含まれる同定すべき複数の抗体のそれぞれに特異的な複数種類の抗 原と、

前記抗体のそれぞれに等しく且つ蛍光物質を付した複数種類の抗体と、 を同一容器内に存在させることと

ここで、 それぞれの抗体に付された蛍光物質は、 異なる種類の抗体間で互 いに区別し得るように設定されている

；および

( 2 ) 前記反応の進行中において、 複数の経過時点で前記標識物質の位置変 化を光学的に測定し、 解析することによって多型部位の検出を行うことと ； を具備する方法。 補正された用紙 (条約第 19

1 9 . 請求項 1 8に従う多型部位の検出方法であって、 前記標識物質が蛍光物 質であり、 前記検出が共焦点顕微鏡によって行われ、 且つ前記解析が蛍光相関分 光法によって行われることを特徴とする方法。

2 0 . 請求項 1 8に従う多型部位の検出方法であって、 前記被検試料が生物由 来の体液であることを特徴とする方法。

2 1 (追加） . 請求項 1から 3の何れか 1項に記載の検出方法であって、 前記 光学的な測定が前記標識物質のゆらぎを測定することを含んでいる方法。

2 2 (追加） . 請求項 4から 6の何れか 1項に記載の検出方法であって、 前記 光学的な測定が前記標識物質のゆらぎを測定することを含んでいる方法。

2 3 (追加） . 請求項 7から 1 0の何れか 1項に記載の検出方法であって、 前 記光学的な測定が前記標識物質のゆらぎを測定することを含んでいる方法。 2 4 (追加） . 請求項 1 1から 1 3の何れか 1項に記載の検出方法であって、 前記光学的な測定が前記標識物質のゆらぎを測定することを含んでいる方法。 2 5 (追加） . 請求項 1 4から 1 7の何れか 1項に記載の検出方法であって、 前記光学的な測定が前記標識物質のゆらぎを測定することを含んでいる方法。 2 6 (追加） . 請求項 1 9から 2 0の何れか 1項に記載の検出方法であって、 前記光学的な測定が前記標識物質のゆらぎを測定することを含んでいる方法。

補正された用紙 (条約第 19