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WO2001070990A1 - Sequences d'acide nucleique comprenant au moins un mecanisme de resistance aux phages, plasmides les contenant, bacteries lactiques et utilisation - Google Patents

Sequences d'acide nucleique comprenant au moins un mecanisme de resistance aux phages, plasmides les contenant, bacteries lactiques et utilisation Download PDF

Info

Publication number
WO2001070990A1
WO2001070990A1 PCT/FR2001/000836 FR0100836W WO0170990A1 WO 2001070990 A1 WO2001070990 A1 WO 2001070990A1 FR 0100836 W FR0100836 W FR 0100836W WO 0170990 A1 WO0170990 A1 WO 0170990A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phage
sequences
seq
plasmid
nucleic acid
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/000836
Other languages
English (en)
Inventor
Fabien Prevots
Sandrine Tolou
Original Assignee
Skw Nature Products Holding France Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Skw Nature Products Holding France Sas filed Critical Skw Nature Products Holding France Sas
Priority to AU2001248412A priority Critical patent/AU2001248412A1/en
Publication of WO2001070990A1 publication Critical patent/WO2001070990A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci

Definitions

  • Nucleic acid sequences comprising at least one mechanism for resistance to pha ⁇ es, plasmids containing them, lactic acid bacteria and use
  • the subject of the present invention is new nucleic acid sequences and plasmids capable of hybridizing with these, carrying at least one phage resistance mechanism, lactic acid bacteria containing these nucleic acid sequences or these plasmids, in particular strains belonging to the species Streptococcus thermophilus, the use of certain strains of these Streptococcus thermophilus to transfer, in particular by conjugation, in particular in the dairy industry, a mechanism of resistance to phages to strains of industrial interest, and the use of certain strains of Streptococcus thermophilus to obtain these plasmids.
  • Lactic acid bacteria are used for the manufacture and preservation of many products consumed on a large scale, such as cheese, yogurt, butter, sausage or sauerkraut. From a commercial point of view, dairy products occupy a preponderant place. However, the use of increasingly large fermentation tanks goes hand in hand with the increased risk of the appearance of bacteriophages. These are responsible for fermentation accidents with various consequences such as: modification of the characteristics of the final product, in particular in terms of texture, aroma, etc ...; absence of the final product due to too weak acidification; loss of the raw material that is milk. To this is added the need to decontaminate the tanks and all the areas in contact with bacteriophages, which generates a blockage of the industrial tool. It is therefore essential that the dairy industry, faced with these problems, find solutions to make lactic acid bacteria more resistant to bacteriophages.
  • the bacteriophages capable of attacking S. thermophilus fall into two large groups of homology defined by studies of DNA / DNA hybridization and of major protein composition according to PREVOTS F. et al (1989), vol. 135, 3337-3344. These two groups include only virulent bacteriophages. One of these groups comprises phages having two major proteins of 23 and 29 kDa (group A), and the other group comprises phages having two major proteins of 23 and 40 kDa (group B). Within the same group, the homologies are strong, and from one group to another, the homologies are weak. However, the groups A and B show weak but not zero DNA homology. All of these bacteriophages have an isometric nucleocapsid.
  • the bacteriophage DNA once inside the cell, is degraded by a restriction endonuclease encoded by the cell.
  • a phage DNA fragment, taken in an ORF (Open Reading Frame) is cloned in an antisense orientation with respect to a strong promoter.
  • the RNA produced hybridizes with the corresponding bacteriophage RNA, inhibiting the development of the bacteriophage.
  • - suicide system one or more restriction systems are cloned downstream of an inducible bacteriophage promoter. During bacteriophage infection, the promoter is induced and causes cell lysis.
  • Other strategies consist solely in transferring by natural plasmids conferring resistance to bacteriophages; On this subject, we can cite the following articles:
  • the Applicant has now isolated from strains resistant to the bacteriophages Streptococcus thermophilus FT78 and FT80 deposited at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, Paris) respectively on March 15, 2000 under the number I-2397 and on March 10, 2000 under the number I-2396, two DNA sequences comprising at least one mechanism resistance to bacteriophages; these DNA sequences respectively comprise a functional part of 2256 base pairs (bp) and 3653 bp.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, Paris
  • the present invention therefore relates to two new nucleic acid sequences comprising at least one phage resistance mechanism, said sequences having respectively 1527 bp and 1015 bp, and being constituted by: a) the DNA sequences having the sequence nucleic acid [SEQ ID NO: 1] or [SEQ ID NO: 2]; b) DNA sequences hybridizing with the above sequences or a fragment thereof; c) the corresponding mRNA and cDNA sequences.
  • sequences [SEQ ID N ° 3] and [SEQ ID N ° 4] are the amino acid sequences deduced respectively from the sequences [SEQ ID N ° 1] and [SEQ ID N ° 4]
  • the 1527 bp fragment can be obtained by the PCR method from the total DNA of the S. thermophilus FT78 strain using the following two oligonucleotides:
  • Oligonucleotide C [SEQ ID N ° 5]: 5 'GCGGATCCATTATGGTAACATAGACG 3'
  • Oligonucleotide D [SEQ ID No. 6]: 5 'GCGGATCCGTAATGCTCTTGTAATTTG 3'
  • the 1015 bp fragment can be obtained by the PCR method from the total DNA of the strain S. thermophilus FT80 using the two oligonucleotides shown below. after:
  • Oligonucleotide E [SEQ ID N ° 7]: 5 'TATAGGATCCAGAAATTCCTTTGATTAG 3'
  • Oligonucleotide F [SEQ ID No. 8]: 5 'TATAGGATCCTATTTCAGTTGAATGGTG 3'.
  • the present invention relates in particular to DNA sequences comprising at least one mechanism of resistance to phages which have one of the nucleic sequences [SEQ ID No. 1] or [SEQ ID No. 2].
  • a subject of the invention is also the DNA sequences which have a high degree of homology with the above DNA sequences [SEQ ID No. 1], [SEQ ID No. 2].
  • a high degree of homology here means a homology (ratio between identical nucleotides and the total number of nucleotides) of at least 70%, and preferably at least 80%, of the nucleotide sequences, when they are aligned with after the maximum homology, according to the method of optimal alignment of the sequences of Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., Vol. 48, 443-453. This method is used in particular in the UWGCG software from the University of Wisconsin: Devreux et al., Nucl. Ac. Res., Vol. 12, 8711-8721 - GAP option.
  • the present invention relates in particular to DNA sequences which hybridize with one of the DNA sequences SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 3 or a fragment thereof.
  • hybridizing with designates a hybridization under strict conditions, that is to say under the following stringency conditions: 42 ° C. in a hybridization buffer (ECL kit Amersham, reference RPN 3000 ) for 12 hours, then 2 washes at 42 ° C for 20 minutes in primary buffer (Urea 6M, 0.4% SDS, 0.5 X SSC) with gentle agitation, then 2 washes for 5 minutes in secondary buffer ( 2X SSC) at 20 ° C.
  • primary buffer Urea 6M, 0.4% SDS, 0.5 X SSC
  • 2X SSC secondary buffer
  • the subject of the invention is also the plasmids transformed with one of the nucleic acid sequences according to the invention.
  • These plasmids can be for example the plasmids pPFT78-1 and pPFT80-1 in which we have cloned, according to the usual techniques well known to those skilled in the art, respectively the sequences [SEQ ID No. 1] or [SEQ ID No. 2].
  • the invention also relates to lactic phage-resistant bacteria, preferably belonging to the species Streptococcus thermophilus, which contain at least one nucleic acid sequence or a plasmid as defined above.
  • This nucleic acid sequence or this plasmid may have been introduced into lactic acid bacteria by conjugation, transformation, transduction, fusion of protoplasts or by any other method of gene transfer well known to those skilled in the art.
  • the lactic acid bacteria which can advantageously be transformed using the nucleic acid sequences according to the invention or a plasmid containing them are for example the Streptococcus thermophilus strains.
  • strains thus transformed can be used to transmit, by conjugation, transformation, transduction, protoplast fusion or by any other method of gene transfer well known to those skilled in the art, a mechanism of resistance to phages to a strain of industrial interest. .
  • This mechanism can be carried by a plasmid or by another part of the genome of the bacteria. When this is carried by a plasmid, it is advantageous to transfer it by conjugation.
  • the invention also relates to strains of industrial interest resistant to phages thus obtained.
  • the invention will be better understood with the aid of the following examples, which include experimental results and a discussion thereof. Some of these examples relate to experiments with the aim of carrying out the invention, others to examples of carrying out the invention given of course purely by way of illustration. A large part of the set of techniques described in these examples, well known to those skilled in the art, is explained in detail in the work by Sambrook Fritsch and Maniatis: "Molecular Cloning; a Laboratory Manual” published in 1989 by Cold Spring Harbor Press in New York (2 nd edition).
  • Example 1 Obtaining fragments of 2256 bp and 3653 bp.
  • Plasmid pLDP10 was used.
  • the plasmid pLDP10 is derived from the plasmid pLDP1 (PREVOTS et al., FEMS Microbiol. Lett. (1996), vol. 142, 295- 299) as follows: amplification of the origin of ori pA15 replication by PCR using the oligonucleotides G [SEQ ID No. 9] and H [SEQ ID No.
  • This plasmid was ligated to the DNA fragment containing the origin of ori pVA replication, itself amplified by PCR using the oligonucleotides K [SEQ ID No. 13] and L [SEQ ID No. 14] using as template, the plasmid pLDPl.
  • This ligating product was used to transform the Lactococcus lactis MG1363 strain, giving the plasmid pLDP8.
  • This new plasmid is digested with the restriction enzyme Bcl ⁇ then dephosphorylated.
  • This plasmid was ligated to the DNA fragment containing the lacZ 'gene fragment, itself amplified by PCR using the oligonucleotides M [SEQ ID No.
  • This new plasmid is capable of replicating in E. coli thanks to ori pA15, in L. lactis and S. thermophilus thanks to ori pVA. Selection can be made in each of these three species thanks to the erythromycin resistance gene (5 ⁇ g / ml for L. lactis and S. thermophilus, 200 ⁇ g / ml for E. coli). Cloning of DNA fragments can easily be done in the polylinker present in lacZ '. Finally, lacZ 'makes it possible to visualize the presence of cloned DNA fragments.
  • strains FT78 and FT80 The DNA of strains FT78 and FT80 was extracted and digested completely with the restriction enzyme Hind ⁇ , then ligated with DNA ligase T4 to the plasmid pLDPIO itself digested by the restriction enzyme Hind ⁇ , unique site present in lacZ '.
  • the ligating product served to transform E. coli TG1 by selecting with erythromycin.
  • 7200 and 7500 clones were obtained from strains FT78 and FT80, respectively. These clones were mixed for each bank, the plasmid DNA was extracted and used to transform the Streptococcus thermophilus FT56 strain deposited at the CNCM under the number I-2395 on March 10, 2000.
  • This industrial strain was chosen because it can be transformed by electroporation with correct efficiency (of the order of 10 5 transformants per ⁇ g of pLDPIO).
  • This strain contains a small plasmid of approximately 2 kb.
  • the transformants were spread on boxes of M17 + erythromycin 5 ⁇ g / ml + at the rate of 100 to 200 clones per box and left in the oven at 40 ° C for 48 hours.
  • the M17 medium is described by TERZAGHI et al (1975), in Appl. About. Microbiol., Vol. 29, 807-813.
  • Plasmid pLDPI O present in clones FT90 and FT87 contains a fragment of approximately 2.3 kb and 3.6 kb, respectively. These new plasmids were called pPFT78 and pPFT80. The nucleic acid sequence of these fragments was determined by the method of Sanger et al. (PNAS - USA (1977), vol. 14, 5463): their exact size is 2256 bp and 3653 bp, for the plasmids pPFT78 and pPFT80, respectively.
  • the oligonucleotides C [SEQ ID No. 5] and D [SEQ ID No. 6] were used to amplify, by the PCR method, a 1527 bp fragment from the plasmid pPFT78.
  • the oligonucleotides E [SEQ ID No. 7] and F [SEQ ID No. 8] were used to amplify, by the PCR method, a 1015 bp fragment from the plasmid pPFT80. Each of these fragments was cloned using the restriction enzyme
  • Example 3 Phage resistance conferred by the 1527 bp and 1015 bp fragments in other S. thermophilus strains.
  • the plasmids pPFT78-1, pPFT80-1 and pLDPIO were introduced by electroporation into different S. thermophilus strains.
  • the phage resistance of the clones obtained was tested by carrying out a titration (UFP / ml) at 42 ° C. with a phage attacking each of these strains. The results are given below:
  • + total resistance to phages under the conditions of the experiment.
  • +/- partial resistance to phages under the conditions of the experiment.
  • the phage resistance carried by the plasmid pPFT7 ⁇ -1 works completely with the 3 phages tested from group A and partially with the
  • Example 4 Study of phage adsorption.
  • the phages ⁇ FT33, ⁇ FT4 ⁇ and ⁇ FT52 were propagated on the strain FT56 (pPFT78-1) and the phage ⁇ FT56 was propagated on the strain FT56 (pPFT80-1).
  • the phage stocks thus formed were tested by phage typing at 42 ° C on the same strains. No difference in phage titer and appearance of lysis plaques was observed between these new phage stocks and the old phage stocks ⁇ FT3 ⁇ , ⁇ FT48, ⁇ FT52 and ⁇ FT56 propagated on strains FT38, FT4 ⁇ , FT52 and FT56, respectively.
  • Example 6 Thermosensitivity of the phage resistance mechanisms.
  • the table below collates the results obtained for the two strains FT56 containing the plasmids pPFT78-1 and pPFT80-1 and the strain FT56 containing pLDPIO as a control at temperatures of 30 ° C, 37 ° C and 42 ° C.

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Abstract

L'invention a pour objet deux séquences d'acide nucléique comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par: a) Les séquences d'ADN présentant les enchaînements d'acides nucléiques [SEQ ID N°1] et [SEQ ID N°2]; b) Les séquences d'ADN hybridant avec les séquences ci-dessus ou un fragment de celles-ci; c) Les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes. Application: bactéries, notamment lactiques résistantes aux phages.

Description

Séquences d'acide nucléique comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phaαes, plasmides les contenant, bactéries lactiques et utilisation
La présente invention a pour objet des nouvelles séquences d'acide nucléique et des plasmides susceptibles de s'hybrider avec celles-ci, porteurs d'au moins un mécanisme de résistance aux phages, les bactéries lactiques contenant ces séquences d'acide nucléique ou ces plasmides, en particulier les souches appartenant à l'espèce Streptococcus thermophilus, l'utilisation de certaines souches de ces Streptococcus thermophilus pour transférer, notamment par conjugaison, en particulier dans l'industrie laitière, un mécanisme de résistance aux phages à des souches d'intérêt industriel, et à l'utilisation de certaines souches de Streptococcus thermophilus pour obtenir ces plasmides.
Les bactéries lactiques sont utilisées pour la fabrication et la conservation de nombreux produits consommés à grande échelle, tels que le fromage, le yaourt, le beurre, le saucisson ou la choucroute. D'un point de vue commercial, les produits laitiers occupent une place prépondérante. Or, la mise en œuvre de cuves de fermentation de plus en plus importantes va de pair avec le risque accru d'apparition de bacteriophages. Ceux-ci sont responsables d'accidents de fermentation avec différentes conséquences telles que : modification des caractéristiques du produit final, notamment au niveau de la texture, de l'arôme, etc ... ; absence du produit final due à une acidification trop faible ; perte de la matière première qu'est le lait. A cela se rajoute la nécessité de décontaminer les cuves et toutes les zones en contact avec les bacteriophages, ce qui engendre un blocage de l'outil industriel. Il est donc indispensable que l'industrie laitière, face à ces problèmes, trouvent des solutions permettant de rendre les bactéries lactiques plus résistantes aux bacteriophages.
Les bacteriophages susceptibles d'attaquer S. thermophilus se répartissent en deux grands groupes d'homologie définis par des études d'hybridation ADN/ADN et de composition en protéines majeures selon PREVOTS F. et al (1989), vol. 135, 3337-3344. Ces deux groupes comprennent uniquement des bacteriophages virulents. L'un de ces groupes comprend des phages possédant deux protéines majeures de 23 et 29 kDa ( groupe A ), et l'autre groupe comprend des phages possédant deux protéines majeures de 23 et 40 kDa ( groupe B ). A l'intérieur d'un même groupe, les homologies sont fortes, et d'un groupe à l'autre , les homologies sont faibles. Cependant, les groupes A et B présentent une homologie ADN faible mais non nulle. Tous ces bacteriophages ont un nucléocapside isométrique.
Certains auteurs ( voir la revue sur le sujet : BRUSSOW et al., Virus gènes (1998) vol. 16, 95-109 ) ont démontré la présence de bacteriophages tempérés. Cependant, ces phages appartiennent au même groupe d'homologie.
Plusieurs mécanismes de résistance aux phages ont été mis en évidence et décrits par SANDERS M. dans Biochimie 70, (1988), 411-421 , et FORDE M. et
FITZGERALD G. F. dans Antonie van Leeuwenhoek 76, (1999), 89-113 : interférence avec l'adsorption des bacteriophages ; ce mécanisme permet d'inhiber ou de retarder l'adsorption des bacteriophages. prévention de l'injection de l'ADN du bactériophage ; l'adsorption du bactériophage sur la bactérie a lieu, mais le mécanisme empêche la pénétration de l'ADN du bactériophage dans la cellule.
- restriction et modification ; l'ADN du bactériophage, une fois à l'intérieur de la cellule, est dégradé par une endonucléase de restriction codée par la cellule.
- l'infection abortive ; selon ce dernier mécanisme, toute une série de défenses peuvent empêcher le développement intracellulaire du bactériophage et la libération de particules bactériophagiques, en agissant sur la réplication du génome, la transcription, la traduction, ou l'assemblage des bacteriophages. Plusieurs stratégies dites non naturelles, faisant appel aux techniques du génie génétique, ont été élaborées pour mettre au point des bactéries lactiques résistantes aux phages et décrites par MOINEAU S. dans Antonie van Leeuwenhoek 76, (1999), 377-382 et FORDE M. et FITZGERALD G. F. dans Antonie van Leeuwenhoek 76, (1999), 89-113 : - utilisation d'un fragment d'ADN de bactériophage ; cette stratégie permet d'inhiber le développement de bacteriophages apparentés par la présence de produits de gènes de bacteriophages sous une forme altérée, en excès ou exprimés à un mauvais moment du développement du bactériophage.
- technique anti-sens ; un fragment d'ADN du phage, pris dans une ORF (Open Reading Frame : phase de lecture ouverte) est clone dans une orientation anti-sens par rapport à un promoteur fort. L'ARN produit s'hybride avec l'ARN bactériophagique correspondant, inhibant le développement du bactériophage. - système suicide ; un ou plusieurs systèmes de restriction sont clones en aval d'un promoteur inductible de bactériophage. Lors de l'infection bactériophagique, le promoteur est induit et provoque la lyse cellulaire. D'autres stratégies consistent uniquement à transférer par conjugaison des plasmides naturels conférant la résistance aux bacteriophages ; à ce sujet, on peut citer les articles ci-après :
- SANDERS et al., Applied and Environ. Microbiol. (1986), vol.52, 1001-1007.
- HARRINGTON , A., et HILL, C, Applied and Environ. Microbiol. (1991 ), vol. 57, 3405-3409. - KLAENHAMMER, T.R., et FITZGERALD, G.F. (1994), Genetics and Biotechnology of lactic acid bacteria, (1994), 106-168, éd. Chapman et Hall, London.
- MURPHY, M.C., et al (1988) Applied and Environ. Microbiol., vol. 54, 1951- 1956. - PREVOTS, F. et al (1996) Le Lait, vol. 76, 417-421.
Toutes ces études ont été faites essentiellement sur l'espèce Lactococcus lactis. Concernant l'espèce Streptococcus thermophilus, peu de mécanismes de résistance aux bacteriophages ont été mis en évidence. Cinq systèmes de restriction et modification codés par le chromosome ont été identifiés, mais non pas été clones par MOINEAU, S. (1997) An update. Proc. 34th Marschall ltalian and Specialty cheeses, 9-17, Madison, Wl. . D'autres auteurs ( LARBI, D., et al (1992) J. of Dairy Research, vol. 59, 349-357) suggèrent que des résistances aux bacteriophages de type abortif pourraient être présents dans Streptococcus thermophilus : ces résistances ne seraient pas de type restriction/modification ou impliquées dans l'inhibition de l'adsorption phagique. Cependant, ces auteurs n'ont pas tentés de cloner les éventuels gènes responsables de ces phénotypes de résistance.
La demanderesse a maintenant isolé à partir des souches résistantes aux bacteriophages Streptococcus thermophilus FT78 et FT80 déposées à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris) respectivement le 15 mars 2000 sous le numéro I-2397 et le 10 mars 2000 sous le numéro I-2396, deux séquences d'ADN comprenant au moins un mécanisme de résistance aux bacteriophages ; ces séquences d'ADN comprennent respectivement un partie fonctionnelle de 2256 paires de bases (pb) et 3653 pb.
Ces séquences d'ADN de 2256 pb et 3653 pb , ont été isolées à partir de l'ADN génomique contenus dans les souches FT78 et FT80, respectivement. Plus précisément, les fragments de 2256 pb et 3653 pb ont été isolés par digestion totale à l'aide de l'enzyme de restriction Hind\\\ de l'ADN génomique contenus dans les souches Streptococcus thermophilus FT78 et FT80, respectivement. Ces fragments sont porteurs d'un ou plusieurs mécanismes de résistance aux bacteriophages. Ces fragments ont été entièrement séquences. Par la suite, à partir de ces séquences de 2256 pb et 3653 pb , la demanderesse a isolé deux séquences de, respectivement, 1527 pb et 1015 pb qui confèrent à elles seules la résistance aux phages.
La présente invention a donc pour objet deux nouvelles séquences d'acide nucléique comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, lesdites séquences ayant respectivement 1527 pb et 1015 pb, et étant constituées par : a) les séquences d'ADN présentant l'enchaînement nucléique [SEQ ID N°1] ou [SEQ ID N°2] ; b) les séquences d'ADN hybridant avec les séquences ci-dessus ou un fragment de celles-ci ; c) les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes.
Les séquences [SEQ ID N°3] et [SEQ ID N°4] sont les séquences d'acides aminés déduites respectivement des séquences [SEQ ID N°1] et [SEQ
ID N°2]. Le fragment de 1527 pb peut être obtenu par la méthode PCR à partir de l'ADN total de la souche S. thermophilus FT78 à l'aide des deux oligonucléotides ci-après :
Oligonucléotide C [SEQ ID N°5] : 5' GCGGATCCATTATGGTAACATAGACG 3'
Oligonucléotide D [SEQ ID N°6] : 5' GCGGATCCGTAATGCTCTTGTAATTTG 3' Le fragment de 1015 pb peut être obtenu par la méthode PCR à partir de l'ADN total de la souche S. thermophilus FT80 à l'aide des deux oligonucléotides ci-après :
Oligonucléotide E [SEQ ID N°7] : 5' TATAGGATCCAGAAATTCCTTTGATTAG 3'
Oligonucléotide F [SEQ ID N°8] : 5' TATAGGATCCTATTTCAGTTGAATGGTG 3'. La présente invention concerne en particulier les séquences d'ADN comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages qui ont l'un des enchaînements nucléiques [SEQ ID N°1] ou [SEQ ID N°2].
L'invention a également pour objet les séquences d'ADN qui présentent un degré d'homologie élevé avec les séquences d'ADN ci-dessus [SEQ ID N°1], [SEQ ID N°2]. Un degré d'homologie élevé signifie ici une homologie (rapport entre les nucléotides identiques et le nombre total de nucléotides) d'au moins 70 %, et de préférence au moins 80 %, des séquences de nucléotides, lorsqu'elles sont alignées d'après l'homologie maximale, selon la méthode d'alignement optimal des séquences de Needleman et Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., vol. 48, 443-453. Cette méthode est notamment utilisée dans le logiciel UWGCG de l'Université du Wisconsin : Devreux et al., Nucl. Ac. Res., vol. 12, 8711-8721 - option GAP.
La présente invention concerne en particulier les séquences d'ADN qui hybrident avec l'une des séquences d'ADN SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°3 ou un fragment de celles-ci.
Dans la présente description, le terme "hybridant avec " désigne une hybridation dans des conditions strictes, c'est-à-dire dans les conditions de stringence suivantes : 42°C dans un tampon d'hybridation (kit ECL Amersham, référence RPN 3000) pendant 12 heures, puis 2 lavages à 42°C pendant 20 minutes dans du tampon primaire (Urée 6M, SDS 0,4%, 0,5 X SSC) avec agitation douce, ensuite 2 lavages pendant 5 minutes dans du tampon secondaire (2X SSC) à 20°C.
L'invention a également pour objet les plasmides transformés avec l'une des séquences d'acides nucléiques seion l'invention. Ces plasmides peuvent être par exemple les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1 dans lesquels on a clone, selon les techniques habituelles bien connues de l'homme du métier, respectivement les séquences [SEQ ID N°1] ou [SEQ ID N°2].
L'invention a également trait aux bactéries lactiques résistantes aux phages, de préférence appartenant à l'espèce Streptococcus thermophilus, qui contiennent au moins une séquence d'acide nucléique ou un plasmide tel que défini ci-dessus.
Cette séquence d'acide nucléique ou ce plasmide peuvent avoir été introduits dans les bactéries lactiques par conjugaison, transformation, transduction, fusion de protoplastes ou par toute autre méthode de transfert de gènes bien connue de l'homme du métier.
Les bactéries lactiques qui peuvent avantageusement être transformées à l'aide des séquences d'acide nucléique selon l'invention ou d'un plasmide les contenant sont par exemple les souches Streptococcus thermophilus.
Ces souches ainsi transformées peuvent être utilisées pour transmettre par conjugaison, transformation, transduction, fusion de protoplastes ou par toute autre méthode de transfert de gènes bien connue de l'homme du métier, un mécanisme de résistance aux phages à une souche d'intérêt industriel. Ce mécanisme peut être porté par un plasmide ou par une autre partie du génome de la bactérie. Lorsque celui-là est porté par un plasmide , il est avantageux de le transférer par conjugaison.
L'invention a également trait aux souches d'intérêt industriel résistantes aux phages ainsi obtenues. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après, qui comprennent des résultats expérimentaux et une discussion de ceux-ci. Certains de ces exemples concernent des expériences dans le but de réaliser l'invention, d'autres des exemples de réalisation de l'invention donnés bien sûr à titre purement illustratif. Une grande partie de l'ensemble des techniques décrites dans ces exemples, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook Fritsch et Maniatis : " Molecular Cloning ; a Laboratory Manual " publié en 1989 par les éditions Cold Spring Harbor Press à New York (2e édition).
Exemple 1 : Obtention des fragments de 2256 pb et 3653 pb.
Les souches Streptococcus thermophilus FT78 et FT80 déposées à la
C.N.C.M. respectivement le 15 mars 2000 sous le numéro I-2397 et le 10 mars 2000 sous le numéro I-2396 sont naturellement très résistantes aux phages.
C'est pourquoi une banque d'ADN a été construite à partir du génome de ces souches.
Le plasmide pLDP10 a été utilisé. Le plasmide pLDP10 dérive du plasmide pLDP1 ( PREVOTS et al., FEMS Microbiol. Lett. (1996), vol. 142, 295- 299 ) de la façon suivante : amplification de l'origine de réplication ori pA15 par PCR grâce aux oligonucléotides G [SEQ ID N°9] et H [SEQ ID N°10] et du gène de résistance à l'érythromycine par PCR grâce aux oligonucléotides I [SEQ ID N°11] et J [SEQ ID N°12] en utilisant comme matrice, le plasmide pLDP Ces deux fragments sont ensuite digérés par les enzymes de restriction Mlu\ et Sc/I, puis ligaturés ensemble par la DNA ligase T4 pour ensuite transformer E. coli TG1 - (GIBSON I.J., Studies on the Epstein-Barr génome, Ph.D thesis, Cambridge University, Cambridge UK, 1984). Le plasmide résultant, nommé pLDP5, a ensuite été digéré par l'enzyme de restriction Mlu\ et déphosphorylé. Ce plasmide a été ligaturé au fragment d'ADN contenant l'origine de réplication ori pVA, lui-même amplifié par PCR grâce aux oligonucléotides K [SEQ ID N°13] et L [SEQ ID N°14] en utilisant comme matrice, le plasmide pLDPl . Ce produit de ligaturation a servi à transformer la souche Lactococcus lactis MG1363, donnant le plasmide pLDP8. Ce nouveau plasmide est digéré par l'enzyme de restriction Bcl\ puis déphosphorylé. Ce plasmide a été ligaturé au fragment d'ADN contenant le fragment de gène lacZ', lui-même amplifié par PCR grâce aux oligonucléotides M [SEQ ID N°15] et N [SEQ ID N°16] en utilisant comme matrice pUC19. Ce nouveau plasmide, nommé pLDPIO, est capable de se répliquer dans E. coli grâce à ori pA15, dans L. lactis et S. thermophilus grâce à ori pVA. La sélection peut se faire dans chacune de ces trois espèces grâce au gène de résistance à l'érythromycine (5 μg / ml pour L. lactis et S. thermophilus, 200 μg / ml pour E. coli). Le clonage de fragments d'ADN peut se faire facilement dans le polylinker présent dans lacZ'. Enfin, lacZ' permet de visualiser la présence de fragments d'ADN clones. L'ADN des souches FT78 et FT80 a été extrait et digéré totalement avec l'enzyme de restriction Hind\\\, puis ligaturé avec la DNA ligase T4 au plasmide pLDPIO lui-même digéré par l'enzyme de restriction Hind\\\, site unique présent dans lacZ'. Le produit de ligaturation a servi à transformer E. coli TG1 en sélectionnant avec l'érythromycine. 7200 et 7500 clones ont été obtenus à partir des souches FT78 et FT80, respectivement. Ces clones ont été mélangés pour chaque banque, l'ADN plasmidique a été extrait et a servi à transformer la souche Streptococcus thermophilus FT56 déposée à la C.N.C.M. sous le numéro I-2395 le 10 mars 2000. Cette souche industrielle a été choisie car elle est transformable par électroporation avec une efficacité correcte (de l'ordre de 105 transformants par μg de pLDPIO). Cette souche contient un petit plasmide d'environ 2 kb. Les transformants ont été étalés sur des boîtes de M17 + érythromycine 5 μg / ml + à raison de 100 à 200 clones par boîte et laissés à l'étuve à 40°C pendant 48 heures. Le milieu M17 est décrit par TERZAGHI et al (1975), dans Appl. Environ. Microbiol., vol. 29, 807-813. Puis ces clones ont été répliqués par la technique de réplique sur velours sur des boîtes de M17 + CaCI2 10 mM sur lesquelles 108 phages φFT56 (ce phage du groupe A attaque la souche FT56) ont été étalés par boîte. Par ce procédé, on a trouvé, respectivement, 1 et 3 clones résistants au phage φFT56 sur 1934 et 5737 clones testés. Un clone par banque, nommé FT90 pour la banque FT78 et FT87 pour la banque FT80, a été testé par lysotypie à 42°C : chacun d'eux montrent une résistance au phage φFT56 (partielle ou totale) :
= titre approximatif, étan donné la très faible taille des plages de lyse.
Le plasmide pLDPI O présent dans les clones FT90 et FT87 contient un fragment d'environ 2,3 kb et 3,6 kb, respectivement. Ces nouveaux plasmides ont été appelés pPFT78 et pPFT80. La séquence d'acide nucléique de ces fragments a été déterminée par la méthode de Sanger et al. (PNAS - USA (1977), vol. 14, 5463) : leur taille exacte est de 2256 pb et 3653 pb, pour les plasmides pPFT78 et pPFT80, respectivement.
L'analyse de la séquence a montré que ces fragments de 2256 et 3653 pb possèdent entre une et plusieurs phases de lecture ouverte (ORF) d'une taille supérieure à 300 paires de base. Exemple 2 : amplification par PCR de fragments internes des fragments de 2256 et 3653 pb des plasmides pPFT78 et pPF80, respectivement.
Les oligonucléotides C [SEQ ID N°5] et D [SEQ ID N°6] ont été utilisés pour amplifier par la méthode PCR un fragment de 1527 pb à partir du plasmide pPFT78.
Les oligonucléotides E [SEQ ID N°7] et F [SEQ ID N°8] ont été utilisés pour amplifier par la méthode PCR un fragment de 1015 pb à partir du plasmide pPFT80. Chacun de ces fragments a été clone grâce à l'enzyme de restriction
SamHI dans pLDPIO, donnant respectivement les plasmides pPFT78-1 et pPFTδ0-1. Dans chacun des exemples suivants, aucune différence concernant la résistance aux phages n'a été observée entre les plasmides pPFT7δ et pPFTδO et leur dérivé pPFT7δ-1 et pPFTδ0-1.
Exemple 3 : résistance aux phages conférée par les fragments de 1527 pb et 1015 pb dans d'autres souches S. thermophilus.
Les plasmides pPFT78-1 , pPFT80-1 et pLDPIO ont été introduits par électroporation dans différentes souches S. thermophilus. La résistance aux phages des clones obtenus a été testée en réalisant une titration (UFP / ml) à 42°C avec un phage attaquant chacune de ces souches. Les résultats sont donnés ci-après :
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
En tenant compte des groupes d'homologie A et B, on peut résumer les résultats de la façon suivante :_
Phage testé
Plasmide Groupe A Groupe B testé φFT28 φFT50 φFT56 φFT38 φFT46 φFT52
pPFT7δ-1 + + + +/- +/- +/- pPFTδ0-1 + + +/- + + +
+ : résistance totale aux phages dans les conditions de l'expérience. +/- : résistance partielle aux phages dans les conditions de l'expérience.
La résistance aux phages portée par le plasmide pPFT7δ-1 fonctionne de façon totale avec les 3 phages testés du groupe A et de façon partielle avec les
3 phages testés du groupe B. Enfin, la résistance aux phages portée par le plasmide pPFTδ0-1 fonctionne de façon totale avec chacun des phages testés, excepté avec le phage φ56 pour lequel la résistance est partielle.
Exemple 4 : Etude de l'adsorption phagique.
A partir d'une culture de nuit de bactéries, on place dans un tube
Eppendorf :
- 600 μl de culture bactérienne ;
- 12 μl de CaCI2, 1 M ; - 600 μl de phages (à 6 x 107 UFP / ml).
On laisse à l'étuve à 42°C pendant 12 minutes, puis l'adsorption est stoppée en plongeant le tube dans la glace. On centrifuge ensuite ce tube dans une microfuge à tubes Eppendorf pendant 2 minutes à +4°C pour se débarrasser des bactéries et des phages adsorbés. Le surnageant est prélevé, dilué à +4°C dans du M17. Le nombre de phages non adsorbés est déterminé sur des tapis de la souche FT56.
Ce test a été effectué sur les deux souches FT56 contenant les plasmides pPFT7δ-1 et pPFT80-1 et la souche FT56 (témoin) avec comme phage φFT56 (groupe A) :
Figure imgf000012_0001
Titre initial de phages = 2,97 x 10' UFP / ml
Aucune différence d'adsorption phagique significative n'a été constatée entre FT56 sans résistance aux phages et FT56 contenant chacune des deux résistances aux phages.
L'adsorption phagique n'est donc pas impliquée dans les mécanismes de résistance portés par ces souches. Exemple 5 : Etude de la restriction et modification.
Dans tous les cas où une résistance partielle aux phages a été observée (FT56 (pPFT78-1 ) testée avec les phages φFT3δ, φFT4δ et φFT52 et FT56 (pPFTδ0-1 ) testée avec le phage φFT56), l'expérience suivante a été réalisée :
Les phages φFT33, φFT4δ et φFT52 ont été propagés sur la souche FT56 (pPFT78-1 ) et le phage φFT56 a été propagé sur la souche FT56 (pPFT80-1 ). Les stocks de phages ainsi constitués ont été testés par lysotypie à 42°C sur les mêmes souches. Aucune différence de titre phagique et d'aspect de plages de lyse n'a été observée entre ces nouveaux stocks de phages et les anciens stocks de phages φFT3δ, φFT48, φFT52 et φFT56 propagés sur les souches FT38, FT4δ, FT52 et FT56, respectivement, et testés sur la souche FT56 (pPFT7δ-1 ) pour les phages φFT33, φFT48 et φFT52 et sur la souche FT56 (pPFT80-1 ) pour le phage φFT56. L'ADN de ces phages n'a pas été modifié par une enzyme de modification. Les résistance aux phages conférées par les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1 ne sont pas de type restriction et modification. Ce résultat, ainsi que la taille des plages de lyse et le fait que l'adsorption phagique ne soit pas impliquée dans la résistance, permet de conclure que les résistances aux phages conférées par les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1 sont de type abortif.
Exemple 6 : Thermosensibilité des mécanismes de résistance aux phages.
Afin de déterminer la résistance à la température de ces mécanismes de résistance aux phages, le test suivant a été effectué :
Les bactéries à tester sont cultivées jusqu'à une phase exponentielle de croissance ( D06oo = 0 ,5 ). Puis ces bactéries sont préchauffées à la température que l'on veut tester pendant 15 minutes de même que les boîtes de milieu M17 gélose + CaCI2 5 mM. Ensuite un tapis de ces bactéries est coulé avec de la gélose molle M17 contenant du CaCI2 à 5 mM et des gouttes de phages à différentes dilutions sont déposées sur ce tapis. La boîte de Pétri est ensuite immédiatement mise à la température testée, dans une étuve appropriée.
Le tableau ci-après rassemble les résultats obtenus pour les deux souches FT56 contenant les plasmides pPFT78-1 et pPFT80-1 et la souche FT56 contenant pLDPIO comme témoin aux températures de 30°C, 37°C et 42°C.
Figure imgf000014_0001
= titre approximatif, étant donné la très faible taille des plages de lyse.
On constate qu'aux trois températures testées, les deux mécanismes de résistance aux phages sont actifs. Cependant, à 37°C et 42°C, on observe que la résistance aux phages contenus dans FT56 (pPFT80-1 ) est moins active qu'à 30°C.

Claims

Revendications
1 Séquences d'acide nucléique comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par : a) Les séquences d'ADN présentant les enchaînements d'acides nucléiques [SEQ ID N°1] et [SEQ ID N°2] ; b) Les séquences d'ADN hybπdant avec les séquences ci-dessus ou un fragment de celles-ci , c) Les séquences d'ARNm et d'ADNc correspondantes.
2. Séquences d'ADN comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages caractérisées en ce qu'elles ont les séquences [SEQ ID N°1] et [SEQ ID N°2] ou des séquences présentant un degré d'homologie élevé avec lesdites séquences [SEQ ID N°1] et [SEQ ID N°2].
3. Plasmide comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1.
4. Plasmide comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'acide nucléique selon la revendication 2.
5. Bactérie lactique résistante aux phages, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un plasmide selon l'une des revendications 3 ou 4.
6 Utilisation des bactéries lactiques selon la revendication 5 pour conférer un mécanisme de résistance aux phages à des souches d'intérêt industriel.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015124718A1 (fr) * 2014-02-20 2015-08-27 Dsm Ip Assets B.V. Streptococcus thermophilus insensible aux bactériophages
US12268219B2 (en) 2019-02-14 2025-04-08 International N&H Denmark Aps Lactic acid bacterium with a reduction of sensitivity to cos-type bacteriophages

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0643134A1 (fr) * 1993-08-09 1995-03-15 Systems Bio-Industries Séquence d'acides nucléiques et plasmides comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, bactéries les contenant et leur utilisation
EP0764724A1 (fr) * 1995-08-22 1997-03-26 Systems Bio-Industries Séquences d'acides nucléiques et plasmides comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, bactéries les contenant et leur utilisation
EP0764723A1 (fr) * 1995-08-18 1997-03-26 Systems Bio-Industries Séquence d'acides nucléiques et plasmides comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, bactéries les contenant et leur utilisation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0643134A1 (fr) * 1993-08-09 1995-03-15 Systems Bio-Industries Séquence d'acides nucléiques et plasmides comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, bactéries les contenant et leur utilisation
EP0764723A1 (fr) * 1995-08-18 1997-03-26 Systems Bio-Industries Séquence d'acides nucléiques et plasmides comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, bactéries les contenant et leur utilisation
EP0764724A1 (fr) * 1995-08-22 1997-03-26 Systems Bio-Industries Séquences d'acides nucléiques et plasmides comprenant au moins un mécanisme de résistance aux phages, bactéries les contenant et leur utilisation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEJLA LARBI ET AL.: "Different bacteriophage resistance mechanisms in Streptococcus salivarius subsp. thermophilus", JOURNAL OF DAIRY RESEARCH, vol. 59, 1992, pages 349 - 357, XP000971883 *
EMBL Database Entry STH243105 Accession number AJ243105; 26 January 2000 BURRUS V.: "Streptococcus thermophilus partial site-specific integrative conjugative element ICESt1" *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015124718A1 (fr) * 2014-02-20 2015-08-27 Dsm Ip Assets B.V. Streptococcus thermophilus insensible aux bactériophages
US10041135B2 (en) 2014-02-20 2018-08-07 Dsm Ip Assets B.V. Phage insensitive Streptococcus thermophilus
US10519519B2 (en) 2014-02-20 2019-12-31 Dsm Ip Assets B.V. Phage insensitive streptococcus thermophilus
US12268219B2 (en) 2019-02-14 2025-04-08 International N&H Denmark Aps Lactic acid bacterium with a reduction of sensitivity to cos-type bacteriophages

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