WO2001070022A1 - Materiaux de revetement pour tissus biologiques, tissus biologiques revetus et procede d'enduction de tissus biologiques - Google Patents

Description

明 細 書 生物体組織用被覆材、 生物体組織の被覆体、 および生物体組織の被 覆法 技術分野

本発明は、 生物体に由来する （例えば、 所定数の生細胞を含む） 組織ないし組織片を良好に被覆および Z又は保存するために好適に 使用可能な被覆材、 およびそれを用いた被覆体および被覆法に関す る。

本発明の被覆材ないし被覆方法は、 例えば、 手術等で切除、 摘出 したヒ ト等の生物体の組織を良好に被覆および Z又は保存するため に特に好適に使用可能である。

本発明の被覆材ないし被覆方法は、 生物体の組織を、 その活性低 下および/又は損傷を出来る限り抑制しつつ、 保存ないし運搬する 目的でも好適に利用可能である。

本発明の被覆材ないし保存方法を用いて被覆ないし保存されたヒ ト組織は好適な細胞活性の維持が容易であるため、 例えば、 薬剤等 の効果および副作用の高感度測定にも好適に使用可能である。

更に、 本発明の被覆材または被覆方法を用いて被覆ないし保存さ れたヒ ト組織から分離された細胞は、 その細胞活性に基づきバイオ テクノ ロジー的な使用法 （例えば、 ハイブリ ドーマまたはワクチン の製造） にも好適に利用可能である。 また、 本発明の被覆材ないし 被覆方法を用いて被覆ないし保存されたヒ ト組織から分離された生 物由来の材料 （例えば、 蛋白質、 R N AまたはD N A ) は、 その解 析に基づき、 種々の基礎データ （例えば、 疾患の診断または遺伝子 治療等に必要な基礎データ） の集積にも好適に利用可能である。 背景技術

従来よ り、 生物体細胞の被覆法と しては、 凍結保存法が最も一般 的に行われてきた。 この凍結保存法においては、 凍結保護剤と して グリセ リ ン、 ジメチルスルホキシ ド （ D M S O ) 、 ショ糖、 ポリ ビ ニルピロ リ ドン等を用いて細胞を徐冷凍結させ、 最終的には該細胞 を液体窒素中で保存する。

他方、 このよ う に凍結保存した細胞を融解するためには、 4 0 °C 温浴中で該凍結物を振盪して、 急速に解凍する方法が一般的に行わ れてきた。 この急速解凍において融解速度が遅い場合には、 細胞内 に生じた氷が再結晶化し、 細胞構造を破壊して、 細胞の生存率が著 しく低下する。

上述した凍結保護剤のうち、 ショ糖、 ポリ ビュルピロ リ ドンはそ の性能が低いため、 現在ではグリセ リ ンまたは D M S Oが一般的に 使用されている。 しかしながら、 グリセリ ンは、 細胞内に浸透する までに比較的長い時間がかかるという問題がある。 また、 D M S O は 3 7 °Cでは細胞に大きな障害を与えるために、 融解時に遠心によ つて除去する必要があるため操作が煩雑であり、 加えて、 凍結保護 剤たる D M S O自体がその毒性によ り細胞生存率の低下をもたらす という問題が未解決である。

特に、 生物体組織を構成する接着依存性細胞 （例えば、 線維芽細 胞） の場合には、 凍結保存によって基質接着率が著しく低下すると いう重大な問題点がある。

一方、 上記した凍結保存法とは別に、 低温保存法も開発されてい る。 この低温保存法においては、 1 0〜 2 0 °Cまたは 2〜 6 °Cの比 較的低い温度で細胞の物質代謝を低下させることによって細胞の増 殖速度を遅延させ、 培養液の交換や継代の回数を少なく して保存す る方法である。 しかしながら、 上記した凍結保存法および低温保存法のいずれの 場合にも、 保存すべき細胞の生存率の顕著な低下は不可避であり、 加えて、 長期的な保存も不可能である。

一方、 生物体組織 （ないし生物体組織片） の保存法に関しては、 該組織中の細胞の生存率を高く維持した状態で長期間保存すること は、 従来よ り不可能とされて来た。

このような生物体組織の凍結保存が困難であるのは、 生物体組織 は、 通常は細胞と、 コラーゲンを主成分と した Ext race l lular Mat r ix ( E C M ) とからなっているため、 1 ) D M S O、 グリセリ ン等 の凍結保護剤が E C M中に浸透して生物体組織内部の細胞に到達す ることが困難であるこ と ； 2 ) 凍結組織を融解する際に、 細胞と比 較して著しく大きい "かたま り " である凍結組織の内部を急速に融 解することが難しく、 上述したように、 氷の再結晶化によ り細胞生 存率が著しく低下してしま う こと等によるものと考えられている。 他方、 生物体組織の凍結保存が困難であるため、 生物体組織を保 存する際には、 上述した細胞保存の場合と同様に、 組織を低温の培 養液または保存液中に直接に浸漬し、 細胞の物質代謝を低下させて 保存する方法 （低温保存法） が最も一般的に行われている。 しかし ながら、 「細胞」 保存の場合と同様に、 生物体組織中の細胞の生存 率の大きな低下は不可避であり、 またこの方法による 2 、 3 日以上 の長期保存も困難であった。 発明の開示

本発明の目的は、 上記した従来技術の欠点を解消した生物体組織 用被覆材、 生物体組織の被覆体、 および生物体組織の被覆法を提供 することにある。

本発明の更なる目的は、 生物体組織を長期間保存することが可能 な生物体組織用被覆材、 およびそれを用いる生物体組織被覆体、 お よび生物体組織の被覆法を提供するこ とにある。

本発明者らは鋭意研究の結果、 よ り低温でゾル状態、 よ り高温で ゲル化するゾル—ゲル転移温度を有し、 且つ該ゾルーゲル転移が熱 可逆的なハイ ドロゲル形成性の高分子を用いて生物体組織用被覆材 を構成するこ とが、 上記目的の達成のために極めて効果的であるこ とを見出した。

本発明の生物体組織用被覆材は上記知見に基づく ものであり、 よ り詳しく は、 ハイ ドロゲル形成性の高分子を少なく と も含む生物体 組織用被覆材であって ； 該被覆材が低温でゾル状態、 高温でゲル状 態となる熱可逆的なゾルーゲル転移を示し、 且つ、 前記被覆材によ る被覆直前の生物体組織中の細胞の生存率 （A。） と、 該被覆 2 日 後の該組織中の細胞の生存率 （A ₂ ) との比 （A ₂ Z A ₀ ) と して 2 0 %以上を与えるこ とを特徴とするものである。

本発明によれば、 更に、 ハイ ドロゲル形成性の高分子を少なく と も含む生物体組織用被覆材であって ； 該被覆材が低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾルーゲル転移を示し、 且つ、 該 被覆材による被覆直前の生物体組織片中の細胞の生存率 （A _Q ) と 、 該被覆 7 日後の該組織片中の細胞の生存率 （A ₇ ) との比 （A ₇ Z A ₀ ) と して 5 %以上を与えるこ とを特徴とする生物体組織用被覆 材が提供される。

本発明によれば、 更に、 ハイ ドロゲル形成性の高分子を含み、 且 つ低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾルーゲル転 移を示す被覆材を含む溶液を、 該ゾルーゲル転移温度よ り低い温度 でゾル状態と し ；

生物体組織に、 該ゾル状態の被覆材を塗布し、

該被覆材をゾルーゲル転移温度よ り高い温度でゲル化させて前記 生物体組織を被覆することを特徴とする生物体組織の被覆方法が提 供される。

本発明によれば、 更に、 生物体組織と、

該生物体組織の周囲に配置された被覆材とを少なく とも含む生物 体組織の被覆体であって ；

該被覆材が、 ハイ ドロゲル形成性の高分子を含み、 低温でゾル状 態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾルーゲル転移を示し ； 且つ

、 該被覆材による被覆直前の生物体組織中の細胞の生存率 （A。） と、 該被覆 2 日後の該組織中の細胞の生存率 （A ₂ ) との比 （A ₂ Z A ₀ ) が 2 0 %以上であることを特徴とする生物体組織の被覆体が 提供される。

本発明によれば、 更に、 生物体組織と、

該生物体組織の周囲に配置された被覆材とを少なく とも含む生物 体組織の被覆体であって ；

該被覆材が、 ハイ ドロゲル形成性の高分子を含み、 低温でゾル状 態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾルーゲル転移を示し ； 且つ 、 該被覆材による被覆直前の生物体組織中の細胞の生存率 （A。） と、 該被覆 7 日後の該組織片中の細胞の生存率 （A ₇ ) との比 （A ₇ / A ₀ ) が 5 %以上であることを特徴とする生物体組織の被覆体が 提供される。

本発明者の知見によれば、 本発明の被覆材を構成する高分子に基 づくハイ ド口ゲルは、 疎水結合を架橋の少なく とも一部に利用して いると推定される。 このため、 該被覆材は、 1 ) ゾル—ゲル転移温 度よ り低い温度ではゾル （溶液） 状態、 該転移温度よ り高い温度で はゲル状態を示し、 且つ、 該ゾルーゲル転移は熱可逆的である。 更 に、 2 ) ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では、 被覆材の内部に疎 水性領域が形成されて、 疎水性生理活性物質を該領域に吸着、 固定 化することが可能である。 加えて、 3 ) ゾル—ゲル転移温度よ り高 い温度で形成される被覆材に基づくゲルは、 被被覆体たる生物体組 織の速い動作 （すなわち、 よ り高い周波数を有する動作） に対して は固体と して、 該組織の遅い動作 （すなわち、 よ り低い周波数を有 する動作） に対しては液体と して、 それぞれ振舞う という特徴があ る。 従って、 被覆ないし保存中の生物体組織の形態変化に対して、 本発明の被覆材の形状は良く追従でき、 その結果、 該被覆材は生物 体組織に対して良好な密着性を維持できる。

これに対して、 従来よ り細胞 · 組織培養に使用されてきた寒天ゲ ル （正の温度一溶解度変化を示す） は、 架橋が主と して結晶化構造 によって形成されているため、 結合エネルギーが高くゲルがゾルに 転移する温度は約 9 5 °Cで生理的温度範囲 （通常は 0 °C〜 4 0 °C ) よ り も著しく高いため、 熱可逆的な生物体組織の被覆材と しては使 用できない。

従来のアルギン酸ゲル （正の温度一溶解度変化を示す） の場合は 、 架橋がイオン結合によって形成されているために結合エネルギー が高く、 生理的条件下でゲルをゾルに転移させることは困難であり 、 熱可逆的な生物体組織の被覆材と しては使用できない。

更に、 従来のコラーゲン、 ゼラチンゲル （いずれも、 正の温度— 溶解度変化を示す） の場合は架橋が結晶化構造、 或いはイオン結合 によって形成されているためにゲルをゾル化するためにコラゲナー ゼ、 ゼラチナーゼ等の酵素を必要とする。 したがって、 生理的条件 下 （コラゲナーゼ、 ゼラチナーゼ等の使用は生物体組織に酵素反応 による損傷を与える） で保存組織を回収することが困難である。 換 言すれば、 これらのコラーゲン、 ゼラチンゲルは、 熱可逆的な生物 体組織の被覆材と しては使用できない。

また、 上記した従来のハイ ドロゲルは主と して親水性高分子から 形成されていて、 本発明の被覆材のよ う に疎水性生理活性物質 （薬 剤、 その他） を吸着、 固定化するこ とが困難である。 更に、 上記の 従来のハイ ドロゲルの架橋は結合エネルギーの高い結晶化構造、 ィ オン結合等によって形成されているため、 速い動作のみならず遅い 動作に対しても固体と して振舞う。 したがって、 保存生物体組織の 形態変化にこれら従来のハイ ド口ゲルの形状は追従するこ とができ ず、 該生物体組織と該ハイ ドロゲルの間に間隙が発生して、 優れた 密着性ないしはこれに基づく保存組織の活性の長期間保持の達成は 困難である。

(被覆 · 回収の推定メ カニズム）

上記構成を有する本発明の生物体組織用被覆材が効果的な被覆 · 回収を達成できる理由は、 本発明者の知見によれば、 以下のよ う に 推定される。

一般に、 生物体組織中では、 1 ) 細胞の接着の足場となる細胞外 マ ト リ ックス （Extracellular Matrix、 E CM) によ り細胞の発生 、 極性および行動等の制御が行われている。 2 ) 異種または同種の 細胞間のコ ミ ュニケーシ ョ ンによ り細胞の発生、 成長、 分裂等の細 胞の多様な活性の制御が行われている。

上記 1 ) の E CMは、 コラーゲン、 エラスチン、 フイブロネクチ ン等の繊維形成タンパクが三次元ネッ ト ワーク構造を形成するグリ コサミ ノ ダリ カン鎖からなるハイ ドロゲル中に埋め込まれた構造を している。 生物体組織は E CMのハイ ドロゲル中に線維芽細胞等の 細胞が埋め込まれた結合組織と、 E CMのハイ ドロゲルの上に接着 した上皮または内皮系細胞からなる基底膜組織とに大別される。 細 胞と接触した E C Mのハイ ドロゲルが血液と細胞間での栄養分、 代 謝物、 ホルモンの拡散を可能にしている。

他方、 上記 2 ) の細胞間のコ ミ ュニケーシ ョ ンは、 細胞が化学仲 介物質 （chemical mediator) を分泌し、 ある距離を隔てた細胞に シグナルを伝えるこ とによって行われている。

上記の化学仲介物質と しては、 1 ) 細胞のごく近傍でしか作用し ない局所性化学仲介物質 （local chemical mediator) 、 2 ) 神経 細胞から分泌され有効作用距離がごく短い神経伝達物質 （neurotra nsmitter) 、 3 ) 内分泌細胞から分泌され血流等を通じて全身の標 的細胞に作用するホルモン （hormone) 等が挙げられる。

この 1 ) の局所性化学仲介物質と しては、 神経細胞成長因子等の タンパク、 走化性因子等のペプチ ド、 ヒスタ ミ ン等のアミ ノ酸誘導 体、 プロ スタグランジン等の脂肪酸誘導体等が挙げられる。

上記 2 ) の神経伝達物質と しては、 グリ シン等のアミ ノ酸、 ノル ア ドレナ リ ン、 アセチルコ リ ン、 エンケフア リ ン等の低分子べプチ ド等の低分子量物質が挙げられる。

上記 3 ) のホルモンと しては、 線維芽細胞成長因子 （fibroblast growth factor, F G F ) 上皮細胞成長因子 (epithelial growth factor, E G F ) 、 血管内皮細胞成長因子 (vascular endothelial growth factor, V E G F ) 等の細胞成長因子、 イ ンス リ ン、 ソマ ト ト ロ ピン、 ソマ ト メ ジン、 副腎皮質刺激ホルモン （ A C T H) 、 副甲状腺ホルモン （ P T H) 、 甲状腺刺激ホルモン （T S H) 等の タンパク、 または糖タンパク、 T S H放出因子、 パソプレシン、 ソ マ トスタチン等のアミ ノ酸誘導体、 コルチゾール、 ェス ト ラジオ一 ル、 テス トステロ ン等のステ ロイ ド等が挙げられる。

生物体組織からコラーゲン分解酵素等を用いて細胞外マ ト リ ック ス （ E CM) を酵素分解し抽出分離された細胞の活性または多様な 機能が、 組織中の細胞に比較して著しく低下するこ とは良く知られ ている。 この低下の原因と して、 抽出分離過程で使用されるコラー ゲン分解酵素等が細胞にダメージを与えるこ と も考えられるが、 主 と して、 1 ) 細胞の活性および機能発現に重要な E CMが消失して しま う こ と、 2 ) E CMを介して行われる種々の化学仲介物質によ る細胞間コ ミ ュニケーショ ンが不可能になるこ とによるものと考え られている。

従って、 細胞の活性および機能を高い状態で長期間保存するため には、 抽出分離した孤立細胞の状態よ り も生物体組織と して保存す るこ とが好ま しいと考えられる。

一方、 E CMに接触した複数の細胞から成る生物体組織は、 孤立 した細胞と比較して当然のこ とながら大きな形態を有している。 外 部からの単純な拡散過程による細胞への栄養物の供給、 または細胞 が産生する老廃物の効率の良い除去のためには、 出来るだけ生物体 組織を小さ くするこ とが好ま しい。 その大きさ と しては血流中の栄 養素の細胞への供給および細胞老廃物の血流による除去が毛細血管 と細胞の間の E CM (距離が 2 0 0〜 3 0 0 111 ） を介しての単純 拡散過程によって行われているこ とを考える と 4 0 0〜 6 0 0 m μ 程度が適当である と考えられる。 ここで生物体組織を一辺の長さが Lの立方体と考える と立方体の面積 （ S ) と体積 （V) との比 （ S / V) は次式で表わされる。

S /V = 6 L²/ L³ = 6 / L

即ち、 単位体積あたり の表面積 （ S /V) は組織の大きさに逆比 例し組織を細切すればする程 S ZVは増大するこ とになる。 即ち組 織の栄養供給および老廃物除去を効率よく行う と該組織の単位体積 当たりの表面積が増大し、 表面から該組織中の E CMまたは上記し た化学仲介物質が失われ易く なってしま う。 上述したよ う に E CM はコラーゲン等の繊維形成タンパクがグリ コサミ ノ グリ カン分子の 三次元網目構造の中に埋め込まれたハイ ドロゲルからなっていて比 較的、 水に不溶であるのに対して細胞間コ ミ ュニケーショ ンを司る 化学仲介物質はプロ スタグラ ンジン、 ステ ロイ ドホルモン、 甲状腺 ホルモン等の疎水性物質を除いてタンパク、 糖タンパク、 ペプチ ド 等大部分は水溶性である。 従って、 従来の生物体組織の保存法のよ うに細切された生物体組織を保存液または培養液中に浸漬して保存 すると細胞間コ ミ ュニケーシ ョ ンに不可欠な化学仲介物質の大部分 は容易に組織から保存液または培養液中に散逸してしまう。 即ち細 胞の活性および機能維持に重要な役割を担っている細胞間コミ ュニ ケーシヨ ンが不可能になり非常に短期間 （ 2〜 3 日間） の内に細胞 の生存率或いは機能が低下してしまう。 この現象は身体の一部が切 断されたときに切断面からの出血現象と酷似していて、 止血するた めに wound dr e s s i ngによって切断面を被覆することが日常的に行わ れている。 そこで本発明において生物体組織からの E C Mをはじめ と した化学仲介物質の保存液中への散逸を防止するために wound dr e s s i ngによつて該組織を被覆する方法が開発された。 本発明の生物 体組織用被覆材には下記の特性が要求される、 1 ) 生物体組織中に 含まれている E C Mをはじめと した種々の化学仲介物質の保存液中 への散逸を防止するものの該被覆材は比較的低分子量の栄養素およ び細胞が産生する老廃物の通過の障害になってはならない。

上述したよ うに、 タンパクまたは糖タンパクから成る高分子量の 各種の細胞成長因子、 各種のホルモン類の組織からの散逸を防止し かつ各種のアミ ノ酸、 酸素等の栄養素および老廃物等の低分子量物 質の通過を阻害しないような被覆材と しては三次元網目構造を有す るハイ ドロゲルが最適である。 2 ) 上述したよ うにプロ スタグラン ジン、 ステ ロイ ドホルモン、 甲状腺ホルモン等の低分子量の疎水性 化学仲介物質の組織からの散逸を阻止するには上記の三次元網目構 造を有するハイ ドロゲル中に充分量の疎水性部分が存在することが 不可欠である。 3 ) 非常に柔軟な生物体組織と同等の機械的物性を有するのみな らず保存中の組織の形態変化に追従し被覆材の形態が変化し密着性 の低下と組織または被覆材剤の破損等を起こさないこと、 等である 。 上記の物性を獲得するためには上記のハイ ドロゲルの三次元網目 構造の架橋点結合が強すぎないことが不可欠である。 一般的にハイ ド口ゲルの三次元網目の架橋点の結合エネルギーを△ Fとすると、 架橋点の寿命 （ τ ) は次式で表される。

τ = τ。 e x p (Δ F / K T )

ここで架橋点寿命が τ の三次元網目構造を有するハイ ド口ゲルの 場合は、 1 τ ( s e c—¹) よ り も高い周波数を有する動作に対し ては該ハイ ドロゲルの架橋点は結合した状態、 即ち、 架橋構造体と して対応し、 1 τ ( s e c—¹) よ り も低い周波数を有する動作に 対しては該ハイ ドロゲルの架橋点は非結合の状態、 即ち、 架橋構造 を有さない液体と して対応する。 これは該ハイ ドロゲルは非常に速 い動作に対しては固体と して、 非常にゆつく り した動作に対しては 液体と してそれぞれ振舞う ことを意味している。 これは該ハイ ドロ ゲルで被覆した組織を保存時に移動する、 或いは運搬する際に生ず る動作 （通常、 動きの周波数は高く、 約 1 0— S s e c — ¹オーダーを 越える） に対しては該ハイ ド口ゲルは固体と して振舞い、 上述した ように生物体組織からの E CMをはじめと した化学仲介物質の保存 液中への散逸を阻止する。

一方、 該ハイ ドロゲルは保存期間中に組織が徐々に収縮、 或いは 膨脹し形態変化を生ずるよ うな周波数の低い、 約 1 0— ⁴ s e c ¹ォ ーダ一よ り小さいゆつく り した動作に対しては液体と して振舞う。 従って、 該ハイ ドロゲルは組織の形態変化に良く追従し、 組織と該 被覆材間の密着性を良好に保持するばかりでなく組織の寸法変化に よる該組織、 或いは該被覆材の破損を防止する。 上記のよ うな性質を有する三次元網目構造を形成する架橋点の結 合エネルギーと しては生理的温度範囲 （ 0 °C〜 4 0 °C ) における熱 エネルギー （R T ) と同等度であることが好ましく、 数十〜数百 k c a 1 / o 1 と結合エネルギーの高い共有結合、 結晶化構造、 ィ オン結合による架橋構造によって形成される三次元網目構造体は本 発明の被覆材と しては不適であり、 数 k c a 1 / m o 1 の結合エネ ルギーを有する分散力による結合、 水素結合或いは疎水結合による 三次元網目構造体が本発明の被覆材と して好適に使用可能である。 特に、 上述したよ うに疎水性化学仲介物質の組織からの散逸を防 止する意味で該被覆材の三次元網目構造が疎水結合による架橋点に よ り形成されていることが好ましい。 更に、 疎水結合によって形成 される三次元網目構造体、 即ちハイ ドロゲルは、 疎水結合は温度の 上昇と共に強くなるという性質を有するために、 低温でゾル、 高温 でゲル化する。 従って、 他の結合、 例えば水素結合、 分散力等によ る結合を利用したハイ ドロゲルとは転移の温度依存性が逆になる。 疎水性結合を利用したハイ ドロゲルの物性は、 生物体組織、 或いは 細胞を低温ゾル状態で包埋するこ とができるため、 包埋時の熱的損 傷を回避できるという点で従来のハイ ド口ゲルよ り も本発明の被覆 材と しては好適に使用可能である。 更に、 疎水性結合を利用したハ ィ ドロゲルの転移は熱的に可逆的であるため、 該ゲルに包埋した組 織から該ゲルを除去する際にも低温でゲルを溶解でき、 容易に且つ 組織に熱的損傷を与えることなく該ゲルから保存組織を回収するこ とが可能である。 図面の簡単な説明

図 1 ( a ) 、 図 1 ( b ) および図 1 ( c ) は、 本発明の被覆材を 用いて生物体組織の包埋、 培養、 および回収を行う方法の一例を示 す模式斜視図である。

図 2は、 種々のゾル—ゲル転移温度を有する本発明の被覆材の、 温度変化に基づく粘度の変化の一例を示すダラフである。

図 3は、 大腸癌の原発巣を示す光学顕微鏡写真 （ 1 0 0倍像） で め O

図 4は、 大腸癌の培養 1 4 日後を示す光学顕微鏡写真 （ 1 0 0倍 像） である。

図 5は、 大腸癌組織の 7 日培養後を示す光学顕微鏡写真 （ 1 0 0 倍像） である。

図 6は、 大腸癌組織の 7 日培養後を示す光学顕微鏡写真 （ 2 0 0 倍像） である。

図 7は、 大腸正常組織の 7 日培養後を示す光学顕微鏡写真 （ 1 0 0倍倍像） である。

図 8は、 大腸正常組織の 7 日培養後を示す光学顕微鏡写真 （ 2 0 0倍像） である。 発明を実施するための最良の形態

以下、 必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明 する。 以下の記载において量比を表す 「部」 および 「％」 は、 特に 断らない限り質量基準とする。

(被覆）

本発明において、 「被覆」 とは、 生物体組織の少なく とも一部を 、 被覆材で覆う ことを言う。 本発明の被覆材の効果を効率的に発揮 可能な点からは、 被覆されるべき生物体組織の全表面積 （ S _t) と 、 被覆材で被覆された生物体組織の表面積 （ S_c) との比 （ S_e S _t ) は、 5 0 %以上であることが好ましく、 更には 7 0 %以上、 特 に 9 0 %以上であることが好ましい。 この比 （ S_eZ S _t) が実質的 に 1 0 0 %であることが最も好ましい。

本発明において、 被覆材で覆われた生物体組織の状態、 態様等は 特に制限されない。 すなわち、 例えば後述する図 1 ( b ) に模式的 に示すように、 被覆材を含むゲル中に生物体組織が浮遊ないし包埋 されていてもよい。 このよ う にゲル中に生物体組織が浮遊ないし包 埋された状態は、 該組織の容器壁および 又は組織同士の接触 · 衝 突に基づく組織の破損 · 障害等が効果的に防止できるため、 組織の 保存および 又は運搬に特に好適である。

(生物体組織用被覆材）

本発明の生物体組織用被覆材は、 ゾルーゲル転移温度を有するハ ィ ドロゲル形成性の高分子を含み、 該被覆材はよ り低い温度でゾル 状態、 よ り高い温度でゲル化する熱可逆的なゾルーゲル転移を示す

(ゾルーゲル転移温度）

本発明において 「ゾル状態」 、 「ゲル状態」 および 「ゾル—ゲル 転移温度」 は以下のよ うに定義される。 この定義については文献 （ Po l yme r Journa l . 1 8 ( 5 ) ， 4 1 1 〜 4 1 6 ( 1 9 8 6 ) ) を参 照することができる。 ゾル状のハイ ドロゲル 1 m Lを内径 1 c mの 試験管に入れ、 所定の温度 （一定温度） と した水浴中で 1 2時間保 持する。 この後、 試験管の上下を逆にした場合に、 溶液/空気の界 面 （メニスカス） が溶液の自重で変形した場合 （溶液が流出した場 合を含む） には、 上記所定温度においてハイ ドロゲルは 「ゾル状態 」 であると定義する。 一方、 上記試験管の上下を逆にしても、 上記 した溶液ノ空気の界面 （メニスカス） が溶液の自重で変形しない場 合には、 該ハイ ドロゲルは、 上記所定温度において 「ゲル状態」 で あると定義する。 一方、 上記測定において、 濃度が例えば約 3質量 %のゾル状のハイ ド pゲル （溶液） を用い、 上記した 「所定温度」 を徐々に （例えば 1 °Cきざみで） 上昇させて 「ゾル状態」 力 s 「ゲル 状態」 に転移する温度を求めた場合、 これによつて求められる転移 温度を 「ゾルーゲル転移温度」 と定義する （この際、 「所定温度」 を例えば 1 °cきざみで下降させ、 「ゲル状態」 力 s 「ゾル状態」 に転 移する温度を求めてもよい） 。

本発明においては、 生物体組織の熱的損傷を防ぐ点からは、 上記 ゾル—ゲル転移温度は 0 °Cよ り高く 、 4 5 °C以下であるこ とが好ま しく 、 更には、 0 ょ り高く 4 2で以下 （特に 4 °C以上 4 0 °C以下 である） こ とが好ましい。

このよ うな好適なゾルーゲル転移温度を有するハイ ドロゲルは、 後述するよ う な具体的な化合物の中から、 上記したスク リーユング 方法 （ゾルーゲル転移温度測定法） に従って容易に選択するこ とが できる。 本発明の被覆材を用いて生物体組織を保存、 および Z又は 回収する という一連の操作においては、 上記したゾル—ゲル転移温 度 （ a °C) を保存時の温度 （ b °C) と、 回収するための冷却時の温 度 （ c °C ) との間に設定するこ とが好ま しい。 すなわち、 上記した 3種の温度 a ：、 b ：、 および c °Cの間には、 b > a 〉 cの関係が あるこ とが好ま しい。 よ り具体的には、 （ b— a ) は：！ 〜 4 0 °C、 更には 2〜 3 0 °Cであるこ とが好ま しく 、 また （ a — c ) は：！ 〜 4 0 °C、 更には 2〜 3 0 °Cであるこ とが好ま しい。

(被覆材の動作に対する追従性）

本発明の被覆材に基づくハイ ドロゲルは、 その生物体組織の保持 性と、 該組織の形態変化への追従性のバランスの点から、 よ り高い 周波数に対しては固体的な挙動を示し、 他方、 よ り低い周波数に対 しては液体的な挙動を示すこ とが好ま しい。 よ り具体的には、 該ハ イ ド口ゲルの動作に対する追従性は以下の方法で好適に測定するこ とが可能である。 (動作に対する追従性の測定方法）

ハイ ドロゲル形成性の高分子を含む本発明の被覆材 （ハイ ドロゲ ルと して l m L ) をゾル状態 （ゾル—ゲル転移温度よ り低い温度） で内径 1 c mの試験管に入れ、 該被覆材のゾルーゲル転移温度よ り も充分高い温度 （たとえば該ゾルーゲル転移温度よ り も約 1 0 °C高 い温度） と した水浴中で上記試験管を 1 2時間保持し、 該ハイ ドロ ゲルをゲル化させる。

次いで、 該試験管の上下を逆にした場合に溶液ノ空気の界面 （メ ニスカス） が溶液の自重で変形するまでの時間 （T) を測定する。 ここで 1 ZT ( s e c—¹) よ り低い周波数の動作に対しては該ハイ ドロゲルは液体と して振舞い、 1 ZT ( s e c—¹) よ り高い周波数 の動作に対しては該ハイ ド口ゲルは固体と して振舞う こ とになる。 本発明のハイ ドロゲルの場合には Tは 1分〜 2 4時間、 好ま しく は 5分〜 1 0時間である。

(定常流動粘度）

本発明の被覆材に基づくハイ ドロゲルのゲル的性質は、 定常流動 粘度の測定によっても好適に測定可能である。 定常流動粘度 (ィ ータ） は、 例えばク リ ープ実験によって測定するこ とができる。

ク リーブ実験では一定のずり応力を試料に与え、 ずり歪の時間変 化を観測する。 一般に粘弾性体のク リ ープ挙動では、 初期にずり速 度が時間と と もに変化するが、 その後ずり速度が一定となる。 この 時のずり応力とずり速度の比を定常流動粘度 η と定義する。 この定 常流動粘度は、 ニュー ト ン粘度と呼ばれるこ ともある。 ただし、 こ こで定常流動粘度は、 ずり応力にほとんど依存しない線形領域内で 決定されなければならない。

具体的な測定方法は、 測定装置と してス ト レス制御式粘弾性測定 装置 C S L型レオメーター （C S L 5 0 0、 米国キャ リ ーメ ド社製 ) を、 測定デバイスにアク リル製円盤 （直径 4 c m) を使用し、 試 料厚み 6 0 0 μ mと して少なく とも 5分間以上の測定時間ク リーブ 挙動 （遅延曲線） を観測する。 サンプリ ング時間は、 最初の 1 0 0 秒間は 1秒に 1 回、 その後は 1 0秒に 1回とする。

適用するずり応力 （ス ト レス） の決定にあたっては、 1 0秒間ず り応力を負荷して偏移角度が 2 X I 0—³ r a d以上検出される最低 値に設定する。 解析には 5分以降の少なく とも 2 0以上の測定値を 採用する。 本発明の被覆材に基づくハイ ドロゲルは、 そのゾルーゲ ル転移温度よ り約 1 0 °C高い温度において、 ηカ 5 X 1 0³〜 5 X 1 0⁶ P a · s e cであることが好ましく、 更には 8 x i 0³〜 2 x 1 0⁶ P a · s e c、 特に l x l 0⁴ P a · s e c以上、 1 X 1 0⁶ P a · s e c以下であることが好ましい。

上記 力 S 5 x i 0³ P a · s e c未満では短時間の観測でも流動 性が比較的高くなり、 ゲルによる生物体組織の被覆 · 固着の困難性 が増大する。 他方、 77力 S 5 x i 0⁶ P a · s e c を超えると、 長時 間の観測でもゲルが流動性をほとんど示さなくなる傾向が強ま り、 生物体組織の動きに追従するこ との困難性が増大する。 また、 ηが 5 X 1 0⁶を超えるとゲルが脆さを呈する可能性が強ま り、 わずか の純弾性変形の後、 一挙にもろく破壊する脆性破壊が生起しゃすい 傾向が強まる。

(動的弾性率）

本発明の被覆材に基づくハイ ドロゲルのゲル的性質は、 動的弾性 率によっても好適に測定可能である。 該ゲルに振幅 0/。、 振動数を ω / 2 π とする歪み τ/ ( t ) = Y _Q c o s o) t ( t は時間） を与え た際に、 一定応力をび ₀、 位相差を δ とする σ ( t ) = 。 _Q c o s ( ω t + δ ) が得られたとする。 I G I 二 σ。/ γ。とすると、 動的弾 性率 G' ( o> ) = I G I c o s δ と、 損失弾性率 G" ( ω ) = I G I s i n δ との比 （G" ZG， ) が、 ゲル的性質を表す指標となる 本発明の被覆材に基づくハイ ドロゲルは、 ω/ 2 π = 1 Η ζの歪 み （速い動作に対応する） に対しては固体と して挙動し、 且つ、 ω 2 π = 1 0 Η ζ の歪み （遅い動作に対応する） に対しては固体 と して挙動する。 よ り具体的には、 発明の被覆材に基づくハイ ド口 ゲルは、 以下の性質を示すことが好ましい （このよ うな弾性率測定 の詳細については、 例えば、 文献 ： 小田良平ら編集、 近代工業化学 1 9、 第 3 5 9頁、 朝倉書店、 1 9 8 5を参照することができる） ω / 2 π = 1 Η ζ (ゲルが固体と して挙動する振動数） の際に、 ( G " Z G， ) _s = ( t a n δ ) _sが 1未満であることが好ましい (よ り好ましくは 0. 8以下、 特に好ましく は 0. 5以下） 。

ω / 2 π = 1 0 "⁴Η ζ (ゲルが液体と して挙動する振動数） の際 に、 （ G " ノ G ' ) L = ( t a η δ ) _Lが 1以上であることが好ま しい （よ り好ましく は 1 . 5以上、 特に好ましく は 2以上） 。

上記 （ t a n S ) _sと、 （ t a n δ ) !_との比 { ( t a n δ ) _s Ζ ( t a n δ ) _L } が 1未満であることが好ましい （よ り好ま しく は 0. 8以下、 特に好ましく は 0. 5以下） 。

<測定条件〉

被覆材の濃度 ： 約 3質量％

温度 ： 被覆材のゾルーゲル転移温度よ り約 1 0 °C高い温度 測定機器 ： ス ト レス制御式レオメ ータ （機種名 ： C S L 5 0 0

、 米国キヤリーメ ド社製）

(ハイ ドロゲル形成性の高分子）

上述したよ うな熱可逆的なゾルーゲル転移を示す （すなわち、 ゾ ルーゲル転移温度を有する） 限り、 本発明の被覆材に使用可能なハ ィ ドロゲル形成性の高分子は特に制限されない。 生理的温度 （ 0〜 4 2 °C程度） において好適なゾル—ゲル変化を示すこ とが容易な点 からは、 例えば、 該ハイ ドロゲル形成性の高分子中の曇点を有する 複数のブロ ック と親水性のブロ ックの曇点、 両ブロ ックの組成およ び両ブロ ックの疎水性度、 親水性度、 および Z又は分子量等をそれ ぞれ調整するこ とによって達成するこ とが好ま しい。

その水溶液がゾルーゲル転移温度を有し、 該転移温度よ り低い温 度で可逆的にゾル状態を示す高分子の具体例と しては、 例えば、 ポ リ プロ ピレンォキサイ ドとポリ エチレンォキサイ ドとのブロ ック共 重合体等に代表されるポリ アルキ レンォキサイ ドブロ ック共重合体 ； メ チノレセノレロ ース、 ヒ ド ロ キシプロ ピノレセノレロ ース等のエーテノレ ィ匕セノレロ ース ； キ トサン誘導体 (K. R. Holme, et al. Macromolecule s, 2 4 , 3 8 2 8 ( 1 9 9 1 ) ) 等が知られている。

ポリ アルキ レンォキサイ ドブロ ック共重合体と して、 ポリ プロ ピ レンォキサイ ドの両端にポリ エチレンォキサイ ドが結合したプル口 ニック （Pluronic) F— 1 2 7 (商品名、 B A S F Wyandotte Ch emicals Co. 製） ゲルが開発されている。 こ のプル口ニック F— 1 2 7の高濃度水溶液は、 約 2 0 °C以上でハイ ド口ゲルとなり、 これ よ り低い温度で水溶液となるこ とが知られている。 しかしながら、 こ の材料の場合は約 2 0質量％以上の高濃度でしかゲル状態にはな らず、 また約 2 0質量％以上の高濃度でゲル化温度よ り高い温度に 保持しても、 さ らに水を加える とゲルが溶解してしま う。 また、 プ ルロ ニ ッ ク F— 1 2 7は分子量が比較的小さ く 、 約 2 0質量％以上 の高度のゲル状態で非常に高い浸透圧を示すのみならず細胞膜を容 易に透過するので、 生物体組織に悪影響を及ぼす可能性がある。 一方、 メチノレセノレロース、 ヒ ドロキシプロ ピノレセノレロース等に代 表されるエーテル化セルロ ースの場合は、 通常は、 ゾル—ゲル転移 温度が高く約 4 5 °C以上である （N. Sarkar , J. App l . Po l ym. Sc i enc e ， 2 4， 1 0 7 3 , 1 9 7 9 ) 。 これに対して、 生物体組織の保存 は殆ど 3 7 °C近辺またはそれ以下の温度で実施されるため、 上記ェ 一テル化セルロースはゾル状態であり、 該エーテル化セルロースを 用いる生物体組織の被覆は事実上は困難である。 . 上記したよ う に、 その水溶液中がゾルーゲル転移点を有し、 且つ 該転移温度よ り低い温度で可逆的にゾル状態を示す従来の高分子の 問題点は、 1 ) ゾルーゲル転移温度よ り高い温度でー且ゲル化して も、 さ らに水を添加する とゲルが溶解してしま う こ と、 2 ) ゾル一 ゲル転移温度が保存温度 （ 3 7 °C近辺またはそれ以下） よ り も高く 、 保存温度ではゾル状態であるこ と、 3 ) ゲル化させるためには、 水溶液の高分子濃度を非常に高くする必要があるこ と、 等である。

これに対して、 本発明者の検討によれば、 好ましく は 0 °Cよ り高 く 4 2 °C以下であるゾルーゲル転移温度を有するハイ ド口ゲル形成 性の高分子 （例えば、 曇点を有する複数のブロ ック と親水性のプロ ックが結合してな り、 その水溶液がゾル—ゲル転移温度を有し、 且 つ、 ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で可逆的にゾル状態を示す高 分子） を用いて生物体組織の被覆材を構成した場合に、 上記問題は 解決されるこ とが判明している。

(好適なハイ ドロゲル形成性の高分子）

本発明の被覆材と して好適に使用可能な疎水結合を利用したハイ ドロゲル形成性の高分子は、 曇点を有する複数のプロ ック と親水性 のプロ ックが結合してなるこ とが好ましい。 該親水性のブロ ックは 、 ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で該ハイ ドロゲルが水溶性にな るために存在するこ とが好ま しく 、 また曇点を有する複数のプロ ッ クは、 ハイ ドロゲルがゾルーゲル転移温度よ り高い温度でゲル状態 に変化するために存在するこ とが好ま しい。 換言すれば、 曇点を有 するプロ ックは該曇点よ り低い温度では水に溶解し、 該曇点よ り高 い温度では水に不溶性に変化するために、 曇点よ り高い温度で、 該 ブロ ックはゲルを形成するための疎水結合からなる架橋点と しての 役割を果たす。 すなわち、 疎水性結合に由来する曇点が、 上記ハイ ド口ゲルのゾル—ゲル転移温度 対応する。

ただし、 該曇点と ゾルーゲル転移温度とは必ずしも一致しなく て もよい。 これは、 上記した 「曇点を有するブロ ック」 の曇点は、 一 般に、 該ブロ ック と親水性ブロ ック との結合によって影響を受ける ためである。

本発明に用いるハイ ドロゲルは、 疎水性結合が温度の上昇と共に 強く なるのみならず、 その変化が温度に対して可逆的である という 性質を利用したものである。 1分子内に複数個の架橋点が形成され 、 安定性に優れたゲルが形成される点からは、 ハイ ドロゲル形成性 の高分子が 「曇点を有するブロ ック」 を複数個有するこ とが好ま し い

一方、 上記ハイ ド口ゲル形成性の高分子中の親水性ブロ ックは、 前述したよ う に、 該ハイ ドロゲル形成性の高分子がゾルーゲル転移 温度よ り も低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、 上記転移温 度よ り高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイ ドロゲルが 凝集沈澱してしま う こ とを防止しつつ、 含水ゲルの状態を形成させ る機能を有する。

(曇点を有する複数のブロ ック）

曇点を有するブロ ック と しては、 水に対する溶解度一温度係数が 負を示す高分子のブロ ックであるこ とが好ま しく 、 よ り具体的には 、 ポリ プロ ピレンォキサイ ド、 プロ ピレンォキサイ ドと他のアルキ レンォキサイ ドとの共重合体、 ポリ N—置換アク リ ルアミ ド誘導体 、 ポリ N—置換メ タアク リルアミ ド誘導体、 N—置換アク リルアミ ド誘導体と N—置換メ タアク リ ルアミ ド誘導体との共重合体、 ポリ ビュルメチルエーテル、 ポリ ビュルアルコール部分酢化物からなる 群よ り選ばれる高分子が好ま しく使用可能である。 上記の高分子 （ 曇点を有するブロ ック） の曇点が 4 °Cよ り高く 4 0 °C以下であるこ とが、 本発明に用いる高分子 （曇点を有する複数のブロ ック と親水 性のブロ ッ クが結合した化合物） のゾルーゲル転移温度を 4 °Cよ り 高く 4 0 °C以下とする点から好ま しい。

ここで曇点の測定は、 例えば、 上記の高分子 （曇点を有するプロ ック） の約 1質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液と した後、 除々に昇温 （昇温速度約 1 oC Z m i n ) して、 該溶液がはじめて白 濁する点を曇点とするこ とによって行う こ とが可能である。

本発明に使用可能なポリ N —置換アク リ ルアミ ド誘導体、 ポリ N 一置換メ タァク リルアミ ド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。 ポ リ 一 N—ァク ロイ ノレビペリ ジン ； ポリ 一 N— n —プロ ピルメ タ アタ リ ノレア ミ ド ； ポ リ 一 N—イ ソプロ ピルアタ リ ノレア ミ ド ； ポ リ 一 N , N—ジェチルアク リ ルア ミ ド ； ポ リ 一 N—イ ソプロ ピルメ タァ ク リ ルア ミ ド ； ポ リ 一 N—シク ロ プロ ピルアタ リ ノレア ミ ド ； ポ リ 一 N—ァク リ ロイノレピロ リ ジン ； ポ リ 一 N， N—ェチルメ チルアタ リ ルア ミ ド ； ポ リ 一 N—シク ロ プロ ピルメ タァク リ ノレア ミ ド ； ポ リ 一 N—ェチルァク リ ルア ミ ド。

上記の高分子は単独重合体 （ホモポリ マー） であっても、 上記重 合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。 このよ うな共重合体を構成する他の単量体と しては、 親水性単量体 、 疎水性単量体のいずれも用いるこ とができる。 一般的には、 親水 性単量体と共重合する と生成物の曇点は上昇し、 疎水性単量体と共 重合する と生成物の曇点は下降する。 従って、 これらの共重合すベ き単量体を選択するこ とによつても、 所望の曇点 （例えば 4 °Cよ り 高く 4 0 °C以下の曇点） を有する高分子を得るこ とができる。

(親水性単量体）

上記親水性単量体と しては、 N—ビュルピロ リ ドン、 ビュルピリ ジン、 ァク リノレアミ ド、 メ タアタ リノレアミ ド、 N —メチルアタ リノレ アミ ド、 ヒ ドロキシェチルメ タァク リ レー ト、 ヒ ドロキシェチルァ ク リ レー ト、 ヒ ドロキシメチルメ タアタ リ レー ト、 ヒ ドロキシメチ ルアタ リ レー ト、 酸性基を有するアク リル酸、 メ タアク リル酸およ びそれらの塩、 ビニルスルホン酸、 スチレンスルホン酸等、 並びに 塩基性基を有する N， N —ジメチルアミ ノエチルメ タク リ レー ト、 N , N —ジェチルアミ ノエチルメ タク リ ー ト、 N， N —ジメチルァ ミ ノプロ ピルァク リルアミ ドおよびそれらの塩等が挙げられるが、 これらに限定されるものではない。

(疎水性単量体）

一方、 上記疎水性単量体と しては、 ェチルァク リ レー ト、 メチル メ タク リ レー ト、 グリ シジルメ タク リ レー ト等のアタ リ レー ト誘導 体およびメ タク リ レー ト誘導体、 N— n _ブチルメ タァク リ ノレアミ ド等の N—置換アルキルメ タアク リルアミ ド誘導体、 塩化ビュル、 アク リ ロニ ト リル、 スチレン、 酢酸ビュル等が挙げられるが、 これ らに限定されるものではない。

(親水性のブロ ック）

一方、 上記した曇点を有するプロ ック と結合すべき親水性のプロ ック と しては、 具体的には、 メチルセルロース、 デキス トラン、 ポ リ エチレンオキサイ ド、 ポリ ビニルアルコール、 ポリ N _ビエルピ 口 リ ドン、 ポリ ビニルピリ ジン、 ポリ アク リノレアミ ド、 ポリ メ タァ ク リノレアミ ド、 ポリ N —メチルァク リノレアミ ド、 ポリ ヒ ドロキシメ チルアタ リ レー ト、 ポリ アク リル酸、 ポリ メ タク リル酸、 ポリ ビニ ルスルホン酸、 ポ リ スチレンスルホ ン酸およびそれらの塩 ； ポ リ N ， N—ジメチルアミ ノエチルメ タク リ レー ト、 ポリ N , N —ジェチ ルアミ ノエチルメ タク リ レー ト、 ポリ N， N —ジメチルァミ ノプロ ピルァク リルアミ ドおよびそれらの塩等が挙げられる。

曇点を有するブロ ック と上記の親水性のブロ ック とを結合する方 法は特に制限されないが、 例えば、 上記いずれかのブロ ック中に重 合性官能基 （例えばァク リ ロイル基） を導入し、 他方のブロ ックを 与える単量体を共重合させるこ とによって行う こ とができる。 また 、 曇点を有するブロ ック と上記の親水性のブロ ック との結合物は、 曇点を有するプロ ックを与える単量体と、 親水性のブロ ックを与え る単量体とのプロ ック共重合によって得るこ と も可能である。 また 、 曇点を有するブロ ック と親水性のブロ ック との結合は、 予め両者 に反応活性な官能基 （例えば水酸基、 アミ ノ基、 カルボキシル基、 イ ソシァネー ト基等） を導入し、 両者を化学反応によ り結合させる こ とによって行う こ ともできる。 この際、 親水性のブロ ック中には 通常、 反応活性な官能基を複数導入する。 また、 曇点を有するポリ プロ ピレンオキサイ ドと親水性のブロ ック との結合は、 例えば、 ァ 二オン重合またはカチオン重合で、 プロ ピレンオキサイ ドと 「他の 親水性ブロ ッ ク」 を構成するモノマー （例えばエチレンオキサイ ド ) とを繰り返し逐次重合させる.こ とで、 ポリ プロ ピレンオキサイ ド と 「親水性ブロ ック」 （例えばポリ エチレンオキサイ ド） が結合し たブロ ック共重合体を得るこ とができる。 このよ うなブロ ック共重 合体は、 ポリ プロ ピレンオキサイ ドの末端に重合性基 （例えばァク リ ロイル基） を導入後、 親水性のブロ ックを構成するモノ マーを共 重合させるこ とによつても得るこ とができる。 更には、 親水性のブ ロ ック中に、 ポ リ プロ ピレンオキサイ ド末端の官能基 （例えば水酸 基） と結合反応し得る官能基を導入し、 両者を反応させるこ とによ つても、 本発明に用いる高分子を得るこ とができる。 また、 ポリ プ 口 ピレンダリ コールの両端にポリ エチレンダリ コールが結合した、 プル口ニック F— 1 2 7 (商品名、 旭電化工業 （株） 製） 等の材 料を連結させることによつても、 本発明に用いるハイ ドロゲル形成 性の高分子を得ることができる。

この曇点を有するブロ ックを含む態様における本発明の高分子は 、 曇点よ り低い温度においては、 分子内に存在する上記 「曇点を有 するブロ ック」 が親水性のブロ ック と ともに水溶性であるので、 完 全に水に溶解し、 ゾル状態を示す。 しかし、 この高分子の水溶液の 温度を上記曇点よ り高い温度に加温すると、 分子内に存在する 「曇 点を有するブロ ック」 が疎水性となり、 疎水的相互作用によって、 別個の分子間で会合する。

一方、 親水性のブロ ックは、 この時 （曇点よ り高い温度に加温さ れた際） でも水溶性であるので、 本発明の高分子は水中において、 曇点を有するブロ ック間の疎水性会合部を架橋点と した三次元網目 構造を持つハイ ドロゲルを生成する。 このハイ ドロゲルの温度を再 び、 分子内に存在する 「曇点を有するブロ ック」 の曇点よ り低い温 度に冷却すると、 該曇点を有するブロ ックが水溶性となり、 疎水性 会合による架橋点が解放され、 ハイ ドロゲル構造が消失して、 本発 明の高分子は、 再び完全な水溶液となる。 このよ う に、 好適な態様 における本発明の高分子のゾルーゲル転移は、 分子内に存在する曇 点を有するプロ ックの該曇点における可逆的な親水性、 疎水性の変 化に基づく ものであるので、 温度変化に対応して、 完全な可逆性を 有する。

(ゲルの溶解性）

上述したよ うに水溶液中でゾルーゲル転移温度を有する高分子を 少なく とも含む本発明のハイ ドロゲル形成性の高分子は、 該ゾルー ゲル転移温度よ り高い温度 （ d °C ) で実質的に水不溶性を示し、 ゾ ルーゲル転移温度よ り低い温度 （ _e °C) で可逆的に水可溶性を示す

上記した高い温度 （ d °C) は、 ゾルーゲル転移温度よ り 1 °C以上 高い温度であるこ とが好ま しく 、 2 °C以上 （特に 5 °C以上） 高い温 度であるこ とが更に好ま しい。 また、 上記 「実質的に水不溶性」 と は、 上記温度 （ d °C) において、 水 1 0 O m Lに溶解する上記高分 子の量が、 5. O g以下 （更には 0. 5 g以下、 特に 0. l g以下 ) であるこ とが好ましい。

一方、 上記した低い温度 （ e °C) は、 ゾルーゲル転移温度よ り （ 絶対値で） 1 °C以上低い温度であるこ とが好ましく 、 2 °C以上 （特 に 5 °C以上） 低い温度であるこ とが更に好ま しい。 また、 上記 「水 可溶性」 とは、 上記温度 （ e °C) において、 水 1 0 O m Lに溶解す る上記高分子の量が、 0. 5 g以上 （更には 1 . O g以上） である こ とが好ましい。 更に 「可逆的に水可溶性を示す」 とは、 上記ハイ ドロゲル形成性の高分子の水溶液が、 一旦 （ゾルーゲル転移温度よ り高い温度において） ゲル化された後においても、 ゾル—ゲル転移 温度よ り低い温度においては、 上記した水可溶性を示すこ とをいう

上記高分子は、 その 1 0 %水溶液が 5 °Cで、 1 0〜 3， 0 0 0セ ンチボイズ （更には 5 0〜 1， 0 0 0センチボイズ） の粘度を示 すこ とが好ま しい。 このよ うな粘度は、 例えば以下のよ うな測定条 件下で測定するこ とが好ましい。

粘度計 ： ス ト レス制御式レオメータ （機種名 ： C S L 5 0 0 、 米国 キャ リ ーメ ド社製）

口—タ—直径 ： 6 0 mm ローター形状 ： 平行平板

測定周波数 ： 1 H z (ヘルツ） 本発明のハイ ドロゲル形成性の高分子の水溶液は、 上記ゾルーゲ ル転移温度よ り高い温度でゲル化させた後、 多量の水中に浸漬して も、 該ゲルは実質的に溶解しない。 上記被覆材料の上記特性は、 例 えば、 以下のよ うにして確認するこ とが可能である。

すなわち、 本発明のハイ ドロゲル形成性の高分子 0 . 1 5 g を、 上記ゾルーゲル転移温度よ り低い温度 （例えば氷冷下） で、 蒸留水 1 . 3 5 gに溶解して 1 0 W %の水溶液を作製し、 該水溶液を径が 3 5 m mのプラスチックシャーレ中に注入し、 3 7 °Cに加温するこ とによって、 厚さ約 1 . 5 m mのゲルを該シャーレ中に形成させた 後、 該ゲルを含むシャーレ全体の重量 （ f グラム） を測定する。 次 いで、 該ゲルを含むシャーレ全体を 2 5 0 m 1 中の水中に 3 7 °Cで 1 0時間静置した後、 該ゲルを含むシャーレ全体の重量 （ g グラム ) を測定して、 ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。 こ の際、 本発明のハイ ドロゲル形成性の高分子においては、 上記ゲル の重量減少率、 すなわち （ f 一 g ) Z f が、 5 . 0 %以下であるこ とが好ま しく 、 更には 1 . 0 %以下 （特に 0 . 1 %以下） であるこ とが好ましい。

本発明のハイ ドロゲル形成性の高分子の水溶液は、 上記ゾルーゲ ル転移温度よ り高い温度でゲル化させた後、 多量 （体積比で、 ゲル の 0 . 1 〜 1 0 0倍程度） の水中に浸漬しても、 長期間に亘つて該 ゲルは溶解するこ とがない。 このよ うな本発明に用いる高分子の性 質は、 例えば、 該高分子内に曇点を有するブロ ックが 2個以上 （複 数個） 存在するこ とによって達成される。

これに対して、 ポリ プロ ピレンォキサイ ドの両端にポリエチレン ォキサイ ドが結合してなる前述のプル口エック F— 1 2 7 を用いて 同様のゲルを作成した場合には、 数時間の静置で該ゲルは完全に水 に溶解するこ とを、 本発明者らは見出している。 非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは

、 水に対する濃度、 すなわち { (高分子） / (高分子 +水） } X I 0 0 ( % ) で、 2 0 %以下 （更には 1 5 %以下、 特に 1 0 %以下） の濃度でゲル化が可能なハイ ドロゲル形成性の高分子を用いること が好ましい。

(他の成分）

本発明の被覆材は、 上記したゾルーゲル転移温度を有する高分子 を少なく とも含むものであるが、 必要に応じて他の成分を含んでい てもよい。 このよ うな態様における 「他の成分」 と しては、 例えば 、 抗生剤、 コラーゲン等の E C M、 前述した局所性化学仲介物質、 イ ンスリ ン細胞、 成長因子等のホルモン類等が挙げられる。

(生物体組織）

本発明において 「生物体組織」 とは、 動物 （特にヒ ト） 、 植物、 微生物、 ウィルス等の生物体の組織をいい、 組織そのもの、 組織の 断片、 さらには組織から分離した細胞ないしその集合体を包含する 意味で用いる。 本発明に使用可能な 「生物体組織」 は、 保存 ， 維持 が可能な程度の生細胞数を有していれば足り、 単細胞状態でも多細 胞状態でもよい。 また、 該組織が由来する ドナー自体は、 特に制限 されない。 例えば、 該ドナーは、 生体でもよく、 また所定の状態 （ 例えば、 極低温） で保存された生物の死体であってもよい。 前述し たように、 例えば極低温で保存された生物死体から取り出された細 胞組織は、 急速融解する際に、 その一部ないし大部分 （例えば、 該 組織片の中心部） の細胞が破壊されて生存細胞数が著しく減少する 可能性があるが、 このような場合であっても、 本発明の被覆材を用 いて保存 · 維持が可能な程度の生細胞数を有している限り、 本発明 において使用可能である。

以下に述べる生細胞率、 細胞生存率の測定においては、 例えば食 道、 胃、 小腸、 大腸、 腌臓、 肝臓、 皮フ、 血管、 骨等 （特に、 後述 するヒ ト大腸癌組織） のヒ ト由来の組織が好適に使用可能である。

(生物体組織の例示）

本発明の被覆材は、 例えば、 従来よ り種々の 「保存液」 を用いて 保存および Z又は運搬していた生物体組織 （ないし細胞） に対して も好適に使用可能である。 このよ うな生物体組織 （ないし細胞） の 例と しは、 上記したもの （例えば、 食道、 胃、 小腸、 大腸、 膝臓、 肝臓、 皮フ、 血管、 骨等） 以外にも、 以下のものを例示することが できる。

( 1 ) 移植用の組織 · 器官 ： 角膜、 皮膚、 骨

( 2 ) 血液成分 ： 赤血球、 白血球、 血小板

( 3 ) 免疫システム関連細胞 ： T細胞 （例えば、 被験者から採取し た T細胞を保存して、 必要に応じて、 該被験者に戻す） 、 樹状細胞

( 4 ) その他 ： 胎児細胞、 E S細胞 （いわゆる万能細胞） 、 受精卵 (例えば、 体内 体外受精用）

(被覆直前の生細胞率）

保存 · 維持が可能である限り、 本発明に使用可能な 「生物体組織 」 のサイズ、 形態、 構造等は特に制限されないが、 取扱の容易性の 点からは、 被覆材で被覆する直前の状態で、 後述するよ うな酵素活 性を用いる方法によ り測定された O D ( 4 5 0 ) /m g p r o t e i nの値 （生物体組織中の生細胞率に対応 ； T ='0 ) で、 1 . 0 以上程度、 更には 2 . 0以上程度であることが好ましい。

(被覆 7 日後の生細胞率）

本発明においては、 被覆材による保存 · 維持の容易性の点からは 、 上記被覆材で被覆してから 7 S後の状態で、 上記した生細胞率に 対応する A_T = O D ( 4 5 0 ) /m g p r o t e i n の値 （T = 7 ) で、 1 . 0以上程度、 更には 1 . 5以上程度であることが好 ましい。

(生物体組織の細胞生存率）

本発明において、 被覆直前の生物体組織片中の細胞の生存率 （A ₀) と、 被覆 2 日後の該組織片中の細胞の生存率 （A₂) との比 （A ₂/ A₀) は、 2 0 %以上、 更には 3 0 %以上 （特に 5 0 %以上） で あることが好ましい。

また、 本発明において、 被覆直前の生物体組織片中の細胞の生存 率 （A。） と、 被覆 7 日後の該組織片中の細胞の生存率 （A₇) の比

( A ₇ A。） は、 5 %以上、 更には 1 0 %以上 （特に 2 0 %以上） であることが好ましい。

上記した各生存率 （Α_τ) は、 例えば、 以下の酵素活性を利用す る方法によ り測定可能である。

<細胞生存率の測定方法 >

2 4—ゥエルプレー ト （材料 ： プラスチック製、 ゥヱル 1個の大 きさは縦 1 5 mm、 横 1 5 mm、 深さ 2 0 mm程度 ； 市販品では、 例え Becton— Dickinson社製の商口口口名 ： Multiwell) の各ウエノレ中 で、 測定対象たる生物体組織 （体積 ： 0. 5 X 0. 5 X 0. 5 mm 程度） を本発明の被覆材中 （ゾル状態で 2 0 0 1程度） に抱埋し 、 保存した生物体組織の温度を、 該被覆材のゾルーゲル転移温度よ り低い温度 （例えば、 ゾル—ゲル転移温度よ り 1 0 °C低い温度） に 下げることによって該被覆材を溶解した後、 各ゥヱル中にコハク酸 脱水素酵素活性測定用試薬たる W S T— 8試薬 （同仁化学 （株） 製 ) 5 0 μ 1 を添加する。 この 2 4 —ゥエルプレー トを、 ゾル—ゲル 転移温度よ り低い温度 （例えばゾルーゲル転移温度よ り 1 0 °C低い 温度、 例えば 1 0 °C) で 1 0時間反応させた後、 約 4 °Cに 1時間保 存し完全に均一な水溶液の状態にする。

該水溶液を 9 6 —ゥエルプレー トに 2 0 0 μ 1 づっ分注し、 マイ ク 口プレー ト用比色計を用いて 4 5 0 n m (参照波長 6 2 0 n m ) で吸光度 （O D ( 4 5 0 ) ) を測定する。 この O D ( 4 5 0 ) と、 生物体組織中の生細胞数とは比例関係にあるこ とが確かめられてい る (例 ば、 文献 Furukawa, T. et al , High in vitro - in vitro c or relat ion of drug response using spongegel- supported three - dimensional histoculture and MTT end point", Int. J. Cancer 5 1 : 4 8 9、 1 9 9 2 を参照） 。

一方、 生物体組織の全細胞数の目安と しては、 該組織の総タ ンパ ク量を用いるこ とができる。 組織中の総タンパク量は、 例えば B C A (Bicinchoninic acid) Protein Assay Kit (同仁ィヒ学 （株） 製 ) を用いて測定するこ とができる。

組織中の総タンパク量の測定は、 生物体組織 （体積 ： 0. 5 X 0 • 5 X 0. 5 mm程度） を W S T— 8試薬と反応させた後、 4 °Cで 多架式遠心分離機 （例えば、 ト ミ一精ェ社製、 商品名 ： Multipurpo se Refrigerated Centrifuge L X - 1 2 0 ； 回転数 4， 0 0 0 r P m) によって遠心し、 組織と反応液を分離し、 反応液を除去した 後、 組織を含むゥェル中に B C A試薬 2 0 0 μ 1 を添加し、 3 7 °C で 3 0分間反応させた後、 マイ ク ロプレー ト用比色計 （例えば、 大 日本製薬社製、 商品名 ： Labosystems Multiscan M S ) を用いて波 長 5 7 0 n mで吸光度 （O D ( 5 7 0 ) ) を測定する。

組織の重量と O D ( 5 7 0 ) は比例関係にあるこ とが確かめられ ている （例えば、 松岡博光、 "熱可逆性ハイ ドロゲル （T G P ) を 培養用基材に用いた三次元培養による抗癌剤感受性試験" 、 聖マリ アンナ医科大学雑誌、 2 7 ： 1 3 3〜 ： 1 4 0， 1 9 9 9 を参照） 上記で測定した O D ( 4 5 0 ) と、 O D ( 5 7 0 ) とに基づき、 一定期間 （T 日） 保存後の組織中の細胞の生存率 Α_τは以下の式で 表される。

A_T = O D ( 4 5 0 ) /Ο Ό ( 5 7 0 ) (例えば、 T = 0、 2、 7以上）

(溶出抑制作用）

本発明の被覆材 （前記高分子に基づくハイ ドロゲル） は、 被被覆 体たる生物体組織中の物質 （例えば生理活性物質） の該組織外への 溶出を抑制する三次元網目構造を有する。 また、 該被覆材が疎水性 部分を含む態様において、 この疎水性部分は、 生物体組織中の脂溶 性物質 （例えば脂溶性生理活性物質） の該組織外への溶出を抑制す る作用を有する。

(生物体組織の保存 · 維持法）

生物体組織、 好ましく は動物 （特にヒ ト） の生体組織から手術等 によつて摘出した組織、 或いは器官の断片を活性を維持した良好な 状態で保存するためには、 外部からの栄養分の補給、 および該組織 、 或いは器官断片の中に蓄積される老廃物の除去を効率よく行う こ とが好ましい。

生物体組織の保存 · 維持が可能である限り、 本発明の被覆法で被 覆可能な生物体組織の大きさは特に制限されないが、 上記した栄養 補給 · 老廃物除去効率の点からは、 本発明の被覆材による被覆に先 行して、 上述した該組織、 或いは器官の断片の大きさ （例えば該断 片と同一体積の立方体と した時の一辺の長さ） が 2 mm以下、 好ま しく は l mm以下、 よ り好ましく は 0. 5 mm以下となるよ うに細 切することが好ましい。

別に、 ハイ ドロゲル形成性高分子 （本発明の被覆材） を組織培養 液 （例えば、 Life Technologies 社製、 商品名 ： R P M I — 1 6 4 0 ) に好ましく は 1 〜 2 0質量％、 更に好ましく は 3〜 1 5質量％ (特に、 5〜 1 0質量％) の濃度範囲内で該高分子のゾルーゲル転 移温度よ り低い温度の温度で溶解する。

本発明において、 上記で得た生物体組織 （例えば、 断片） を本発 明の被覆材に被覆ないし包埋して保存する方法は非常に簡便である 。 例えば、 ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で該被覆材をゾル （溶 解） 状態と し、 結果と して得られた該被覆材溶液中に組織断片を浸 漬する方法、 或いは該組織断片上に該ハイ ドロゲルの溶液をふりか けることによ り被覆する方法等が採用可能である。 このよ うに被覆 材を浸漬、 塗布ないし包埋した組織断片の周囲に配置された被覆材 を、 ハイ ドロゲル形成性高分子のゾルーゲル転移温度よ り高い温度 でゲル化させ、 組織断片を本発明の被覆材で被覆することが可能で ある。

ここで、 生物体組織を保存する温度は、 該生物体細胞の適温以下 であることが好ましい。 すなわち、 定温動物細胞を用いる場合には

、 保存温度は、 通常、 その体温 （ヒ トでは約 3 7 °C ) 以下であるこ とが好ましい。 代謝速度抑制の点からは、 該保存温度は、 更には室 温 （約 2 5 °C ) 以下、 特に 2 0 °C以下であることが好ましい。 また 、 ヒ ト組織を用いる場合には、 ハイ ドロゲル形成性高分子のゾル— ゲル転移温度は 3 7 °C以下 （更には 2 5 °C以下） であることが好ま しい。

(保存した生物体組織の回収）

一方、 本発明の被覆材によ り保存した生物体組織 （例えば、 組織 断片） を該被覆材から回収する方法 （換言すれば、 保存した生物体 組織から被覆材を除去する方法） も、 非常に簡便である。 該被覆材 のゾルーゲル転移温度よ り低い温度で該被覆材を融解 （ゾル化） す る方法、 或いは該被覆材によつて被覆保存した生物体組織をゾルー ゲル転移温度よ り低い温度に冷却した培養液、 或いは保存液中に浸 漬して、 該被覆材を溶解する方法等が実施可能である。 (包埋 支持）

本発明の被覆材を用いて、 生物体組織を包埋/支持、 保存培養し

、 更に回収する方法を、 図 1 ( a ) 、 図 1 ( b ) および図 1 ( c ) の模式斜視図に示す。 この図 1 ( a ) 、 図 1 ( b ) および図 1 ( c ) の例では、 例えば、 ゾルーゲル転移温度が約 2 0 °Cのハイ ドロゲ ル形成性高分子を用い、 1 0 °Cの水溶液状態で生物体組織を入れ （ 図 1 ( a ) ) 、 次いで 3 7 °Cでゲル化させて該組織を包埋し （図 1

( b ) ) 、 更に図 1 ( c ) に示すように再び 1 0 °Cで水溶液状態と して該組織を回収する。

(保存 運搬）

本発明の被覆材は、 生物体組織の保存および Z又は運搬にも、 好 適に使用可能である。 例えば、 後述する実施例に示すように本発明 の被覆材に基づくゲル中に生物体組織を包埋ないし支持して実際の 使用時または使用場所まで保存 Z運搬することができる。 このよ う な場合、 従来は種々の 「保存液」 に浮遊ないし懸濁させて生物体組 織を保存ノ運搬していたが、 このよ うな 「保存液」 を使用した場合 には、 生物体組織と容器壁等との接触ないしは生物体組織同士の接 触によ り、 保存 運搬時に生物体組織が損傷を受けることが多く あ つた。 更には、 保存/運搬すべき生物体組織が赤血球、 白血球、 血 小板等の血液成分である場合には、 これらの成分は接触によ り機械 的損傷を受けたり、 凝集してしまう場合があった。

これに対して、 本発明の被覆材に基づくゲル中に生物体組織を包 埋ないし支持させた場合には、 ゲル状態であることに基づいて生物 体組織 · 器官の相互接触、 容器への接触等が効果的に防止され、 該 組織 · 器官の機械的な損傷が防止できる。 同様の理由から、 赤血球 、 白血球、 血小板等の血液成分の凝集も防止できる。 更には、 本発 明の被覆材に基づくゲル中に生物体組織を包埋ないし支持させるこ とによ り、 保存ノ運搬時に喩え容器が破損しても、 生物体組織 · 器 官の周辺環境への飛散が防止できる。 このような飛散防止は、 例え ば、 該組織 · 器官が周辺環境の汚染を生ずる可能性がある （例えば 、 遺伝子工学によ り作成した細胞、 あるいは感染力の強い細菌、 ゥ ィルス等の） 場合に、 特に効果的である。

免疫関係の細胞に本発明の被覆材を適用した場合には、 例えば、 免疫が低下している被験者から採取した T細胞をィ ンタ一ロイキン 等の活性化物質を用いて再活性化した後、 該被験者に戻して免疫増 強を図ることが可能となる。 このよ うな場合には、 T細胞の採取、 活性化、 戻しがそれぞれ異なる場所で行われる場合も多いため、 そ の保存ノ運搬に本発明の被覆材が特に好適に使用可能である。 本発 明の被覆材を E S細胞 （いわゆる万能細胞） に適用した場合にも、 該細胞同士および Z又は該細胞と容器との接触を有効に防止でき、 該細胞の活性維持が容易である。 実施例

以下に実施例を示し、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明 の範囲は特許請求の範囲によ り限定されるものであり、 以下の実施 例によって限定されるものではない。

製造例 1

ポリ プロ ピレンォキサイ ドーポリ エチレンォキサイ ド共重合体 （ プロ ピレンォキサイ ド Zエチレンォキサイ ド平均重合度約 6 0 1 8 0、 旭電化工業 （株） 製 ： プル口ニック F— 1 2 7 ) 1 0 gを乾 燥ク ロ 口ホルム 3 0 m 1 に溶解し、 五酸化リ ン共存下、 へキサメチ レンジイ ソシァネー ト 0 . 1 3 gを加え、 沸点還流下に 6時間反応 させた。 溶媒を減圧留去後、 残さを蒸留水に溶解し、 分画分子量 3 万の限外濾過膜 （アミ コン P M— ³ 0 ) を用いて限外濾過を行い、 高 分子量重合体と低分子量重合体を分画した。 得られた水溶液を凍結 して、 F— 1 2 7高重合体および F— 1 2 7低重合体を得た。

上記によ り得た F— 1 2 7高重合体 （T G P— 1 ) を、 氷冷下、 8質量％の濃度で蒸留水に溶解した。 この水溶液をゆるやかに加温 していく と、 2 1 °Cから徐々に粘度が上昇し、 約 2 7 °Cで固化して 、 ハイ ド口ゲルとなった。 このハイ ド口ゲルを冷却する と、 2 1 °C で水溶液に戻った。 この変化は、 可逆的に繰り返し観測された。 一 方、 上記 F— 1 2 7低重合体を、 氷点下 8質量％の濃度で蒸留水に 溶解したものは、 6 0 °C以上に加熱しても全く ゲル化しなかった。 製造例 2

ト リ メ チロールプロ ノ、。ン 1 モルに対し、 エチレンォキサイ ド 1 6

0モルをカチオン重合によ り付加して、 平均分子量約 7 0 0 0のポ リ エチレンォキサイ ド ト リ オールを得た。

上記によ り得たポ リ エチレンォキサイ ド ト リ オール 1 0 0 g を蒸 留水 1 0 0 0 m 1 に溶解した後、 室温で過マンガン酸力 リ ゥム 1 2 g を徐々に加えて、 そのまま約 1 時間、 酸化反応させた。 固形物を 濾過によ り 除いた後、 生成物をク ロ 口ホルムで抽出し、 溶媒 （ク ロ 口ホルム） を減圧留去してポリエチレンォキサイ ド ト リ カルボキシ ル体 9 0 g を得た。

上記によ り得たポリ エチレンォキサイ ド ト リ カルボキシル体 1 0 g と、 ポリ プロ ピレンオキサイ ドジァミ ノ体 （プロ ピレンォキサイ ド平均重合度約 6 5、 米国ジヱフ ァーソ ンケ ミ カル社製、 商品名 ： ジェフ ァー ミ ン D— 4 0 0 0、 曇点 ： 約 9 °C ) 1 0 g とを四塩化炭 素 1 0 0 0 m 1 に溶解し、 ジシク ロへキシルカルポジイ ミ ド 1 . 2 g を加えた後、 沸点還流下に 6時間反応させた。 反応液を冷却し、 固形物を濾過によ り 除いた後、 溶媒 （四塩化炭素） を減圧留去し、 残さを真空乾燥して、 複数のポリ プロ ピレンォキサイ ドとポリ ェチ レンォキサイ ドとが結合した被覆用高分子 （ T G P— 2 ) を得た。 これを氷冷下、 5質量％の濃度で蒸留水に溶解し、 そのゾルーゲル 転移温度を測定したと ころ、 約 1 6 °Cであった。

製造例 3

N—イ ソプロ ピルアク リ ルアミ ド （イース トマンコダック社製） 9 6 g 、 N—ァク リ ロキシスク シンイ ミ ド （国産化学 （株） 製） 1 7 g、 および n _ブチルメ タク リ レー ト （関東化学 （株） 製） 7 g をク ロ 口ホルム 4 0 0 0 m 1 に溶解し、 窒素置換後、 N， N ' —ァ ゾビスイ ソブチロニ ト リル 1 . 5 g を加え、 6 0 °Cで 6時間重合さ せた。 反応液を濃縮した後、 ジェチルェ一テルに再沈 （再沈殿） し た。 濾過によ り 固形物を回収した後、 真空乾燥して、 7 8 gのポリ ( N—イ ソプロ ピルアタ リノレアミ ドーコ 一 N—ァク リ ロキシスクシ ンイ ミ ドーコ一 _n —ブチルメ タク リ レー ト） を得た。

上記によ り得たポリ （N—イ ソプロ ピルァク リ ノレアミ ドーコ 一 N —ァク リ ロ キシス ク シンィ ミ ド一 コ一 n —ブチルメ タ ク リ レー ト） に、 過剰のイ ソプロ ピルアミ ンを加えてポリ （N—イ ソプロ ピルァ ク リルアミ ドーコ _ n —ブチルメ タク リ レー ト） を得た。 このポリ ( N —ィ ソプロ ピルァク リ ノレア ミ ドー コ _ n —ブチルメ タク リ レ一 ト） の水溶液の曇点は 1 9 °Cであった。

前記のポリ （N—イ ソプロ ピルアク リルアミ ド一コ 一 N—ァク リ ロキシスクシンイ ミ ドーコ 一 n —ブチルメ タク リ レー ト） 1 0 g 、 および両末端アミ ノ化ポ リ エチレンオキサイ ド （分子量 6 ， 0 0 0 、 川研ファイ ンケミカル （株） 製） 5 g をク ロ 口ホルム 1 0 0 0 m 1 に溶解し、 5 0 °Cで 3時間反応させた。 室温まで冷却した後、 ィ ソプロ ピルアミ ン 1 g を加え、 1時間放置した後、 反応液を濃縮し 、 残渣をジェチルエーテル中に沈澱させた。 濾過によ り 固形物を回 収した後、 真空乾燥して、 複数のポリ （N—イ ソプロ ピルアク リル アミ ド―コ一 _n —ブチルメ タク リ レー ト） とポリ エチレンォキサイ ドとが結合した被覆用高分子 （T G P— 3 ) を得た。

このよ うにして得た T G P— 3を氷冷下、 5質量％の濃度で蒸留 水に溶解し、 そのゾル—ゲル転移温度を測定したと ころ、 約 2 1 °C であった。

製造例 4

(滅菌方法）

上記した高分子 （T G P— 1 ) の 2. 0 gを、 E O G (エチレン ォキサイ ドガス） 滅菌バッグ （ホギメディカル社製、 商品名 ： ハイ ブリ ツ ド滅菌バッグ） に入れ、 E O G滅菌装置 （イージーパック、 井内盛栄堂製） で E O Gをバッグに充填し、 室温にて一昼夜放置し た。 さ らに 4 0 °Cで半日放置した後、 E O Gをバッグから抜き、 ェ ア レーシ ヨ ンを行った。 バッグを真空乾燥器 （ 4 0 °C) に入れ、 時 々 エア レーショ ンしながら半日放置するこ とによ り滅菌した。

この滅菌操作によ り高分子のゾルーゲル転移温度が変化しないこ とを、 別途確認した。

製造例 5

プチルメ タク レリ レー トの使用量を以下のよ う に変更した以外は 製造例 3 と同様にして、 ゾル—ゲル転移温度がそれぞれ 1 0 °C、 2 0 °Cおよび 3 5 °Cのハイ ドロゲル形成性の高分子を得た。

< ゾル—ゲル転移温度 >くブチルメ タ ク レ リ レー トの使用量 >

1 0。C 1 4 g

2 0 °C 8 g

3 5 °C 0 g

これらのハイ ドロゲル形成性の高分子の温度変化に基づく粘度変 化を測定したと ころ、 図 2のグラフに示す結果が得られた。

製造例 6 製造例 3の被覆用高分子 （T G P— 3 ) を 1 0質量％の濃度で蒸 留水に溶解し、 3 7 °Cにおける を測定したところ、 5. 8 X 1 0 ⁵ P a · s e cであった。 一方、 寒天を 2質量％の濃度で蒸留水 に 9 0 °Cで溶解して、 1 0 °Cで 1時間ゲル化させた後、 3 7 °Cにお ける ηを測定したところ、 その ηは機器の測定限界 （ 1 X 1 0⁷ Ρ a · s e c ) 越えてレヽた。

実施例 1

製造例 1で作製したポリマー （T G P— 1 ) を製造例 4の方法に よって滅菌した後、 該ポリマーの最終濃度が約 8 %になるよ うに 2 0 %の胎児牛血清 ( F C S ； Dainippon Pharmaceutical社製、 商品 名 ： Fetal Calf Serum) および抗生剤 （Life Technologies 社製、 商品名 ： penicillin； 最終濃度 1 0， O O O UZm l ) を含有する R P M I - 1 6 4 0 (Life Technologies 社製） 中に、 4 °Cで 2 4 時間、 撹拌下に溶解した。 この操作は無菌的に実施した。

3人の大腸癌患者から手術によ り摘出された大腸癌組織、 および その周辺の正常大腸粘膜組織を、 組織細切器 （The Mickle Laborat ory Engineering Co. Ltd. 製） で約 0. 5 m mの厚さに細切した。 8 %の T G P— 1含有培養液を、 1 0 °Cに冷却しゾル状態にして、 そのゾル （約 2 0 0 μ 1 ) 中に該癌組織および正常組織を分散させ た。 上記によ り得た組織分散液を、 2 4—ゥエルプレー ト （Becto n- Dickinson社製、 商品名 ： Mul t iwe 11 ) の各ゥヱル （大きさ ： 1 5 X I 5 mm) 中に組織 （組織片 1個の大きさ ： 0. 5 X 0. 5 mm 程度） 力 S 1 〜 2個含有されるように、 約 6 0 0 μ 1 ウエルの組織 分散 T G Ρ— 1溶液を分注した。

該 2 4 —ゥエルプレー トを 3 7 °C、 5 % C O 2 濃度のイ ンキュ ベータ一 （ダバイェスペック社製、 商品名 ： C 0₂ Incubator) 中で 、 それぞれ 1 、 2、 4、 7、 および 1 4 日間保存した。 各期間保存 後、 上述した細胞生存率の測定法によって細胞生存率を測定し、 保 存前の生存率 （A o ) と各期間 （T 日） 保存後の生存率 （Α_τ) と の比 （ A τ Z A o X I 0 0 %) を測定した。 得られた結果を、 表 1 および 2に示す。

大腸癌組織を TGP— 1ゲル内に抱埋して保存した時の組織中の 細胞生存率の比 （Α_τ / X 1 0 0%) と保存日数との関係

表 2

正常粘膜組織を TG P— 1ゲル内に抱埋して保存した時の組織中の 細胞生存率の比 （Α_τ / X 1 0 0%) と保存日数との関係

比較例 1

実施例 1 で用いた大腸癌組織および正常大腸粘膜組織を、 2 0 % の胎児牛血清、 （Dainippon Pharmaceut i cal社製、 商品名 ： Fetal Calf Serum) および抗生剤 （Life Technologies 社製、 商品名 ： pe nicillin) を含有する R P M I — 1 6 4 0 (Life Technologies 社 製） 中に分散させた。 得られた分散液を、 2 4 —ゥエルの各ゥエル 中に組織が 1〜 2個含有するよ う に約 6 0 0 μ 1 /ゥエルを注入し 、 3 7 °C、 5 % C O 2 濃度のイ ンキュベータ一中で 1 、 2、 4、 7、 および 1 4 日間保存した。 各期間保存後に、 実施例と同様の方 法で各組織中の細胞の生存率の比 （ A _τ A o x 1 0 0 % ) を測 定した。 得られた結果を表 3および 4に示す。

表 3

大腸癌組織を培地中に保存した時の細胞生存率の比 ( AT /A。 X 1 0 0 % ) と保存日数との関係

生存率が低く測定不能 表 4

正常粘膜組織を培地中に保存した時の細胞生存率の比

( A T / A。 X 1 0 0 %) と保存日数との関係

一 ：生存率が低く測定不能

上記した実施例 1 に示したよ う に、 本発明の被覆材 （T G P ) で 被覆保存した癌組織、 および正常組織中の細胞生存率の比 （ 2 日間 保存） は共に 1 0 0 %以上であった。 これに対して、 比較例 1 に示 したよ う に、 従来の被覆法である保存液中に浸漬した場合には、 細 胞生存率の比 （ 2 日間保存） は殆ど 0であった。 T G P中で 2 日間保存した際の細胞生存率が保存前の生存率よ り も高くなる理由と しては、 本発明者の知見によれば、 組織を生体か ら取り出し細切するという操作が細胞に損傷を与えるが、 T G P中 で保存するとその損傷が回復し、 細胞生存率が改善されるものと推 定される。 また、 7 日間保存した試料では、 T G P被覆保存の場合 は生存率の比は癌組織の場合で約 1 0 0 %、 正常組織の場合で 4 0

~ 5 0 %であるのに対して、 従来の被覆法では細胞の生存は認めら れなかった。 更に、 上記した実験事実は、 癌組織は正常組織よ り も 保存性が良好であることを示している。

上記の結果を、 図 3 (大腸癌の原発巣の 1 0 0倍像） 、 図 4 (大 腸癌の培養 1 4 日後の 1 0 0倍像） 、 図 5および 6 (大腸癌組織の 7 日培養の 1 0 0倍および 2 0 0倍像） 、 および図 7および 8 (大 腸正常組織の 7 日培養の 1 0 0倍および 2 0 0倍像） の光学顕微鏡 写真に、 それぞれ示す。 これらの写真を見れば、 本発明の被覆材を 用いることによ り、 培養前の組織が、 培養後も良好に保持されてい ることが容易に理解できょ う。 産業上の利用可能性

上述したよ うに本発明によれば、 生物体組織を細胞活性を維持し つつ、 長期間保存し、 および 又は運搬することが可能な生物体組 織用被覆材、 および該被覆材を用いる生物体組織の被覆体、 および 生物体組織の被覆法が提供される。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . ハイ ド口ゲル形成性の高分子を少なく とも含む生物体組織用 被覆材であって ；

該被覆材が低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾ ルーゲル転移を示し、 且つ、 前記被覆材による被覆直前の生物体組 織中の細胞の生存率 （A_Q) と、 該被覆 2 日後の該組織中の細胞の 生存率 （A₂) との比 （A₂ZA。） と して 2 0 %以上を与えること を特徴とする生物体組織用被覆材。

2. ハイ ドロゲル形成性の高分子を少なく とも含む生物体組織用 被覆材であって ；

該被覆材が低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾ ルーゲル転移を示し、 且つ、 該被覆材による被覆直前の生物体組織 片中の細胞の生存率 （Α。） と、 該被覆 7 日後の該組織片中の細胞 の生存率 （Α₇) との比 （Α₇/Α₀) と して 5 %以上を与えること を特徴とする生物体組織用被覆材。

3. 前記高分子に基づくハイ ドロゲルが、 生物体組織中の物質の 該組織外への溶出を抑制する三次元網目構造を有する請求項 1 また は 2に記載の生物体組織用被覆材。

4. 前記高分子に基づくハイ ドロゲルが、 生物体組織中の脂溶性 物質の該組織外への溶出を抑制する疎水性部分を少なく とも,一部に 含む請求項 1〜 3のいずれかに記載の生物体組織用被覆材。

5. 前記高分子に基づくハイ ドロゲルが、 被被覆物たる生物体組 織の形態的変形に追従して該組織との密着性を維持する部分を少な く とも一部に含む請求項 1〜 4のいずれかに記載の生物体組織用被 覆材。

6. 前記高分子に基づくハイ ドロゲルが、 曇点を有する、 複数の プロ ック と親水性のプロ ック とが結合してなる部分を少なく と も一 部に含む請求項 1 〜 5のいずれかに記載の生物体組織用被覆材。

7 . その水溶液がゾルーゲル転移温度よ り低い温度で可逆的に液 体状態 （ゾル状態） を示し、 且つそのゾルーゲル転移温度よ り高い 温度で一旦ゲル化した状態が、 該温度で新たに加えた水に対して実 質的に不溶である請求項 1 〜 6のいずれかに記載の生物体組織用被 覆材。

8 . 前記ゾルーゲル転移温度が 0 °Cよ り高く 4 2 °C以下である請 求項 1 〜 7のいずれかに記載の生物体組織用被覆材。

9 . ハイ ド口ゲル形成性の高分子を含み、 且つ低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾルーゲル転移を示す被覆材を含 む溶液を、 該ゾルーゲル転移温度よ り低い温度でゾル状態と し ； 生物体組織に、 該ゾル状態の被覆材を塗布し、

該被覆材をゾルーゲル転移温度よ り高い温度でゲル化させて前記 生物体組織を被覆するこ とを特徴とする生物体組織の被覆方法。

1 0 . 更に、 前記生物体組織を被覆している被覆材をゾルーゲル 転移温度よ り低い温度で再びゾル状態と して、 生物体組織から除去 する請求項 9記載の生物体組織の被覆方法。

1 1 . 生物体組織と、

該生物体組織の周囲に配置された被覆材とを少なく とも含む生物 体組織の被覆体であつて ；

該被覆材が、 ハイ ドロゲル形成性の高分子を含み、 低温でゾル状 態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾルーゲル転移を示し ； 且つ 、 該被覆材による被覆直前の生物体組織中の細胞の生存率 （A。） と、 該被覆 2 日後の該組織中の細胞の生存率 （A ₂ ) との比 （A ₂ Z A ₀ ) が 2 0 %以上であるこ とを特徴とする生物体組織の被覆体。

1 2 . 生物体組織と、 該生物体組織の周囲に配置された被覆材とを少なく とも含む生物 体組織の被覆体であって ；

該被覆材が、 ハイ ドロゲル形成性の高分子を含み、 低温でゾル状 態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾルーゲル転移を示し ； 且つ

、 該被覆材による被覆直前の生物体組織中の細胞の生存率 （A。） と、 該被覆 7 日後の該組織片中の細胞の生存率 （A₇ ) との比 （A₇ / A₀) が 5 %以上であることを特徴とする生物体組織の被覆体。

1 3 . 前記生物体組織が動物由来の組織である請求項 1 1 または 1 2に記載の生物体組織被覆体。

1 4. 前記生物体組織が哺乳類由来の組織である請求項 1 3に記 載の生物体組織被覆体。

1 5. 前記生物体組織がヒ ト由来の組織である請求項 1 4に記載 の生物体組織被覆体。

1 6 . 前記ヒ ト由来の組織が、 食道、 胃、 小腸、 大腸、 腌臓、 肝 臓、 皮フ、 血管、 骨、 血液成分から選ばれた少く とも 1つの組織由 来である請求項 1 5に記載の生物体組織被覆体。

1 7 . ハイ ド口ゲル形成性の高分子を少なく とも含む生物体組織 用被覆材であつて ；

該被覆材が低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾ ルーゲル転移を示し、 且つ、

そのゾルーゲル転移温度よ り約 1 0 °C高い温度において、 振動数 ifi ω / 2 π = 1 H z の歪みに対して固体と して挙動し、 π = 1 0—⁴ H zの歪みに対して液体と して挙動することを特徴とする生 物体組織用被覆材。

1 8 . ハイ ド口ゲル形成性の高分子を少なく とも含む生物体組織 用被覆材であって ；

該被覆材が低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾ ルーゲル転移を示し、 且つ、

そのゾルーゲル転移温度よ り約 1 0 °c高い温度において、 振動数 が ω / 2 π = 1 Η ζ の歪みに対する動的弾性率 Z損失弾性率 （G" / G ' ) _s = ( t a n δ ) _sと、 ω / 2 π = 1 0 -⁴ Η ζ の歪みに対 する （G" ^/G， ） _L = ( t a n S ) _Lとの比 { ( t a n δ ) _s / ( t a n δ ) _L } が 1未満であるこ とを特徴とする生物体組織 用被覆材。

1 9. ハイ ド口ゲル形成性の高分子を少なく と も含む生物体組織 用被覆材であって ；

該被覆材が低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可逆的なゾ ルーゲル転移を示し、 且つ、

そのゾルーゲル転移温度よ り約 1 0 °C高い温度において、 定常流 動粘度 77カ 5 1 0³〜 5 < 1 0⁶ ? 3 · s e c であるこ とを特徴と する生物体組織用被覆材。