CN119699315A - 一种生物组织材料的存储方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：水凝胶涂层处理的生物组织材料进行戊二醛保存。生物组织材料直接采用戊二醛保存，会因为戊二醛残留导致抗钙化能力降低，本发明通过水凝胶涂层处理，避免了生物组织材料与戊二醛的直接接触，避免了抗钙化能力的降低。因此，本发明提供的存储方法在克服戊二醛保存缺陷的同时，能够发挥戊二醛的抑菌优势；而且，同时，避免了干法保存生物组织材料存在的水含量过低，导致生物组织材料长久存储性能衰减与复水困难等问题。

Description

一种生物组织材料的存储方法

技术领域

本发明属于医疗材料技术领域，涉及一种生物组织材料的处理方法，尤其涉及一种生物组织材料的存储方法。

背景技术

为了维持生物组织材料的性能，往往需要在液体环境中保存，一旦脱离液体环境，则会对生物组织材料造成不可逆的结构和性能损伤。以生物瓣膜材料为例，生物瓣膜材料一般存储于低浓度的戊二醛溶液中，为生物瓣膜材料的长期保存提供了相对安全有效的无菌湿环境。但戊二醛溶液长期接触生物瓣膜材料，会导致生物瓣膜材料的表面残留大量游离态醛基，不利于保持生物瓣膜材料的抗钙化能力。

基于戊二醛溶液湿态保存的缺点，本领域技术人员提出了干态存储的概念。干态存储可以避免戊二醛存储带来的醛基残留问题。

但在干态存储的方法中需要使用醇类有机溶剂进行脱水，难以避免的对生物组织材料造成永久性的损伤，并影响瓣膜的机械性能。此外，采用非戊二醛保存，其抑菌优势并不明显。虽然戊二醛存储会带来的醛基残留问题，但戊二醛保存具有很好的抑菌优势。

因此，需要提供一种有效避免醛基残留，又能够利用戊二醛优异的抑菌功能的生物组织材料的存储方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法在克服戊二醛保存缺陷的同时，能够发挥戊二醛的抑菌优势；而且，能够同时避免干法保存生物组织材料存在的水含量过低，导致生物组织材料长久存储性能衰减与复水困难等问题

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：

所述生物组织材料进行水凝胶涂层处理，通过层层自组装的方式形成水凝胶涂层。

生物组织材料直接采用戊二醛保存，会因为戊二醛残留导致抗钙化能力降低。本发明对生物组织材料进行水凝胶涂层处理，形成避免生物组织材料与戊二醛直接接触的水凝胶涂层，有效避免了戊二醛溶液保存带来的醛基残留以及钙化等问题；而且，本发明提供的存储方法不需要进行脱水处理，能够避免干法保存生物组织材料存在的水含量过低，导致的存储性能衰减以及复水困难等问题；此外，水凝胶涂层处理形成的水凝胶涂层，还能够使生物组织材料的表面具有保水作用，提高了存储的稳定性。

鉴于不同生物组织材料对于存储的要求不同，通过层层自组装的方法能够灵活控制形成的水凝胶涂层的厚度，且所得水凝胶涂层的厚度均一；而且，层层自组装的方法简单，对设备要求较低，制备得到的水凝胶涂层的强度较高，便于对生物组织材料的稳定存储。因此，作为优选的技术方案，所述水凝胶涂层的形成方法包括层层自组装。

优选地，所述水凝胶涂层处理包括：生物组织材料于材料保存液中进行至少1次浸提，每浸提至少1次进行光诱导，形成保护生物组织材料的水凝胶涂层。

优选地，每次所述浸提的浸泡时间为2-8min，例如可以是2min、4min、5min、6min或8min，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述层层自组装形成的水凝胶涂层的层数为3-10层，例如可以是3层、5层、6层、8层或10层，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明中，水凝胶涂层的层数与浸提后的光诱导次数相关，每光诱导一次形成1层水凝胶涂层。

优选地，所述材料保存液中含有0.01-1％(w/w)的光引发剂与0.01-0.2％(w/w)的双键修饰高分子材料。

本发明所述材料保存液中含有0.01-1％(w/w)的光引发剂，例如可以是0.01％(w/w)、0.1％(w/w)、0.3％(w/w)、0.5％(w/w)、0.6％(w/w)、0.8％(w/w)或1％(w/w)，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明通过控制材料保存液中光引发剂的含量，实现了交联效率的调节，避免了交联速率过快或过慢的问题，改善了交联的均一性。

本发明所述材料保存液中含有0.01-0.2％(w/w)的双键修饰高分子材料，例如可以是0.01％(w/w)、0.05％(w/w)、0.1％(w/w)、0.15％(w/w)或0.2％(w/w)，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述光引发剂包括紫外光引发剂。

优选的，所述紫外光引发剂包括2-羟基-2-甲基苯基丙酮、2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮或2-羟基-2-甲基-1-[4-(叔丁基)苯基]-1-丙酮中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括2-羟基-2-甲基苯基丙酮与2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的组合，2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮与2-羟基-2-甲基-1-[4-(叔丁基)苯基]-1-丙酮的组合，或，2-羟基-2-甲基苯基丙酮、2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮与2-羟基-2-甲基-1-[4-(叔丁基)苯基]-1-丙酮的组合。

优选地，所述双键修饰高分子材料包括壳聚糖、壳聚糖衍生物、明胶、明胶衍生物、可溶性纤维素、可溶性纤维素衍生物、海藻酸钠、海藻酸钠衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、硫酸软骨素、硫酸软骨素衍生物、丝蛋白、丝蛋白衍生物、β-环糊精或β-环糊精衍生物中的任意一种或至少两种的组合，优选为壳聚糖和/或壳聚糖衍生物。

本发明选择合适的双键修饰高分子材料，通过诱导双键形成可光交联自由基，从而形成互穿网络结构。

优选地，所述材料保存液中还含有0.01-1mM的抑菌活性物质，例如可以是0.01mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.8mM或1mM，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明通过在材料保存液中添加抑菌活性物质，能够改善水凝胶涂层的抑菌性能，改善长期存储的染菌问题。

优选地，所述抑菌活性物质包括双胍类物质、异噻唑类物质、酚醚类物质或苯酚类物质中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括双胍类物质与异噻唑类物质的组合，酚醚类物质与苯酚类物质的组合，或，双胍类物质、异噻唑类物质、酚醚类物质与苯酚类物质的组合。

优选地，所述水凝胶涂层处理的温度为25-37℃，例如可以是25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选的，所述生物组织材料包括心包组织、软骨组织或皮肤组织中的任意一种。

本发明所述心包组织包括但不限于主动脉瓣膜、二尖瓣、三尖瓣、肺动脉、外科瓣或静脉瓣中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述生物组织材料进行水凝胶涂层处理之前，进行表面处理。

本发明提供的保存方法采用的表面处理技术，提高所得水凝胶涂层的结构稳定性，使生物组织材料即使经过长时间保存，也能够避免戊二醛与生物组织材料的接触。

优选地，所述表面处理包括预交联处理、表面修饰处理或错位交联处理中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括预交联处理与表面修饰处理的组合，表面修饰处理与错位交联处理的组合，预交联处理与错位交联处理的组合，或预交联处理、表面修饰处理与错位交联处理的组合。

优选地，所述表面修饰处理包括氧化处理、接枝处理或还原处理中的任意一种或至少两种的组合。

本发明所述表面修饰处理不仅能够提高生物组织材料的抗钙化性能，还能够提高所得水凝胶涂层的结构稳定性。

本发明通过进行预交联处理，有利于对生物组织材料进行定型。

优选地，所述预交联处理包括：浸泡于戊二醛溶液。

优选地，所述戊二醛溶液的浓度为0.1-0.5％(w/w)，例如可以是0.1％(w/w)、0.2％(w/w)、0.3％(w/w)、0.4％(w/w)或0.5％(w/w)，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述预交联处理的温度为25-37℃，时间为10-60min。

本发明所述预交联处理的温度为25-37℃，例如可以是25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述预交联处理的时间为10-60min，例如可以是10min、20min、30min、40min、50min或60min，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述氧化处理有利于提高生物组织材料的生物组织相容性。

优选地，所述氧化处理包括：浸泡于氧化剂溶液。

优选地，所述氧化剂溶液的浓度为0.01-0.1mM，例如可以是0.01mM、0.03mM、0.05mM、0.08mM或0.1mM，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述氧化剂溶液中的氧化剂包括高碘酸钠、高碘酸钾、重铬酸钾、过氧乙酸、过氧化氢或2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括高碘酸钠与高碘酸钾的组合，重铬酸钾与过氧乙酸的组合，过氧化氢与2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物的组合，高碘酸钠、高碘酸钾与重铬酸钾的组合，重铬酸钾、过氧乙酸与过氧化氢的组合，或，高碘酸钠、高碘酸钾、重铬酸钾、过氧乙酸、过氧化氢与2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物的组合。

优选地，所述氧化处理的温度为25-37℃，时间为10-50min。

本发明所述氧化处理的温度为25-37℃，例如可以是25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述氧化处理的时间为10-50min，例如可以是10min、20min、30min、40min或50min，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述接枝处理有利于提高水凝胶涂层的稳定性，有利于保持生物组织材料的性能。

优选地，所述接枝处理包括：浸泡于含末端活性双键结构物质的溶液。

优选地，所述含末端活性双键结构物质的溶液的浓度为0.01-0.1M，例如可以是0.01M、0.03M、0.05M、0.06M、0.08M或0.1M，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述含末端活性双键结构物质包括甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐油脂、二(2-甲基-2-丙烯酸)2-羟基-1,3-丙二醇酯、甲基丙烯酸羟乙酯或丙烯酰氯中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括甲基丙烯酸酐与甲基丙烯酸酐油脂的组合，二(2-甲基-2-丙烯酸)2-羟基-1,3-丙二醇酯与甲基丙烯酸羟乙酯的组合，甲基丙烯酸羟乙酯与丙烯酰氯的组合，甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐油脂与二(2-甲基-2-丙烯酸)2-羟基-1,3-丙二醇酯的组合，二(2-甲基-2-丙烯酸)2-羟基-1,3-丙二醇酯、甲基丙烯酸羟乙酯与丙烯酰氯的组合，或甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐油脂、二(2-甲基-2-丙烯酸)2-羟基-1,3-丙二醇酯、甲基丙烯酸羟乙酯与丙烯酰氯的组合。

优选地，所述接枝处理的温度为25-37℃，时间为12-24h。

本发明所述接枝处理的温度为25-37℃，例如可以是25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述接枝处理的时间为12-24h，例如可以是12h、15h、16h、18h、20h、21h或24h，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述还原处理有利于提高生物组织材料的抗钙化性能。

优选地，所述还原处理包括：浸泡于还原剂溶液。

优选地，所述还原剂溶液的浓度为0.01-0.1M，例如可以是0.01M、0.03M、0.05M、0.06M、0.08M或0.1M，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述还原剂溶液中的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠或三乙酰基硼氢化钠中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括硼氢化钠与氰基硼氢化钠的组合，氰基硼氢化钠与三乙酰基硼氢化钠的组合，硼氢化钠与三乙酰基硼氢化钠的组合，或硼氢化钠、氰基硼氢化钠与三乙酰基硼氢化钠的组合。

优选地，所述还原处理的温度为25-37℃，时间为12-24h。

本发明所述还原处理的温度为25-37℃，例如可以是25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述还原处理的时间为12-24h，例如可以是12h、15h、16h、18h、20h、21h或24h，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述表面修饰处理的溶液环境为缓冲溶液体系和/或有机溶剂体系，所述缓冲溶液体系的缓冲液包括MES缓冲液、HEPES缓冲液、PBS缓冲液或CB缓冲液中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括MES缓冲液与HEPES缓冲液的组合，PBS缓冲液与CB缓冲液的组合，HEPES、PBS缓冲液与CB缓冲液的组合，或，MES缓冲液、HEPES缓冲液、PBS缓冲液与CB缓冲液的组合。

本发明所述错位交联处理通过分子链相互交联形成的网状结构，提高了生物组织材料的抗降解能力，保持了生物组织材料长时间存放后的性能。

优选地，所述错位交联处理包括依次进行的第一交联与第二交联。

优选地，所述第一交联包括：浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液。

优选地，所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为20-80mM，耦合试剂的浓度为10-40mM。

本发明所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为20-80mM，例如可以是20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM或80mM，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述混合溶液中耦合试剂的浓度为10-40mM，例如可以是10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM或40mM，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述羰基活化试剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐或二甲基氨基丙基乙基碳酰胺中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的组合，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与二甲基氨基丙基乙基碳酰胺的组合，或，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与二甲基氨基丙基乙基碳酰胺的组合。

优选地，所述耦合试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐、1-羟基苯并三唑或苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐的组合，1-羟基苯并三唑与苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺的组合，或，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐、1-羟基苯并三唑与苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺的组合。

优选地，所述第一交联的温度为25-37℃，时间为4-12h。

本发明所述第一交联的温度为25-37℃，例如可以是25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述第一交联的时间为4-12h，例如可以是4h、5h、6h、8h、10h或12h，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述第二交联包括：浸泡于金属抑制剂溶液。

优选地，所述金属抑制剂溶液中的金属离子浓度为1-10mM，例如可以是1mM、3mM、5mM、8mM或10mM，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述金属抑制剂溶液中的金属离子包括铁离子、锌离子或镁离子中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括铁离子与锌离子的组合，锌离子与镁离子的组合，铁离子与镁离子的组合，或铁离子、锌离子与镁离子的组合。

优选地，所述第二交联的温度为5-15℃，时间为2-6h。

本发明所述第二交联的温度为5-15℃，例如可以是5℃、6℃、7℃、10℃、12℃或15℃，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述第二交联的时间为2-6h，例如可以是2h、3h、4h、5h或6h，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述存储方法还包括表面处理之前的脱细胞处理。

脱细胞处理有利于减少生物组织材料的细胞成分残留，减少免疫排除反应；另外，脱细胞处理还有利于降低生物组织材料的磷脂成分，从而减少钙离子的沉积位点，提高生物组织材料的抗钙化性能。

优选地，所述脱细胞处理包括：浸泡于去垢剂溶液。

优选地，所述脱细胞处理的温度为5-15℃，时间为1-4h。

本发明所述脱细胞处理的温度为5-15℃，例如可以是5℃、6℃、8℃、10℃、12℃或15℃，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

本发明所述脱细胞处理的时间为1-4h，例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h或4h，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述去垢剂溶液的浓度为0.01-2％(w/w)，例如可以是0.01％(w/w)、0.1％(w/w)、0.5％(w/w)、0.8％(w/w)、1％(w/w)、1.2％(w/w)、1.5％(w/w)、1.8％(w/w)或2％(w/w)，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

优选地，所述去垢剂溶液中的去垢剂包括十二烷基磺酸钠、十六烷基溴化铵、甜菜碱型去垢剂或Triton X-100中的任意一种或至少两种的组合，典型但非限制性的组合包括十二烷基磺酸钠与十六烷基溴化铵的组合，甜菜碱型去垢剂与Triton X-100的组合，十二烷基磺酸钠、甜菜碱型去垢剂与Triton X-100的组合，或，十二烷基磺酸钠、十六烷基溴化铵、甜菜碱型去垢剂与Triton X-100的组合。

优选地，所述甜菜碱型去垢剂包括3-([N,N-二甲基二甲基(3-十四酰胺丙基)铵]丙烷-1-磺酸盐(ABS-14)和/或3-[N,N-二甲基(3-棕榈酰氨基丙基)铵基]-丙烷磺酸内盐(ABS-16)。

本发明所述脱细胞处理的目的为减少细胞成分残留，本发明不对脱细胞处理的次数做过多限定。示例性的，所述脱细胞处理的次数为至少1次，例如可以是1次、2次或3次，但不限于所列举的数值，数值范围内其它未列举的数值同样适用。

作为本发明所述存储方法的优选技术方案，所述存储方法包括如下步骤：

(1)生物组织材料于5-15℃浸泡于浓度为0.01-2％(w/w)的去垢剂溶液1-4h，以进行脱细胞处理；所述去垢剂溶液中的去垢剂包括十二烷基磺酸钠、十六烷基溴化铵、甜菜碱型去垢剂或Triton X-100中的任意一种或至少两种的组合；

(2)然后于25-37℃浸泡于浓度为0.1-0.5％(w/w)的戊二醛溶液10-60min，以进行预交联处理；

(3)然后于25-37℃浸泡于浓度为0.01-0.1mM的氧化剂溶液10-50min，以进行氧化处理；所述氧化剂溶液中的氧化剂包括高碘酸钠、高碘酸钾、重铬酸钾、过氧乙酸、过氧化氢或2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物中的任意一种或至少两种的组合；

(4)然后于25-37℃浸泡于浓度为0.01-0.1M的含末端活性双键结构物质的溶液12-24h，以进行接枝处理；所述含末端活性双键结构物质包括甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐油脂、二(2-甲基-2-丙烯酸)2-羟基-1,3-丙二醇酯、甲基丙烯酸羟乙酯或丙烯酰氯中的任意一种或至少两种的组合；

(5)然后于25-37℃浸泡于浓度为0.01-0.1M的还原剂溶液12-24h，以进行还原处理；所述还原剂溶液中的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠或三乙酰基硼氢化钠中的任意一种或至少两种的组合；

(6)然后依次进行第一交联与第二交联，以进行错位交联处理；

所述第一交联包括：于25-37℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中4-12h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为20-80mM，耦合试剂的浓度为10-40mM；

所述第二交联包括：于5-15℃浸泡于金属离子浓度为1-10mM的金属抑制剂溶液；所述金属抑制剂溶液中的金属离子包括铁离子、锌离子或镁离子中的任意一种或至少两种的组合；

(7)最后于25-37℃的材料保存液中进行至少1次浸提，每浸提至少1次进行光诱导，形成保护生物组织材料的3-10层水凝胶涂层；所述材料保存液中含有0.01-1％(w/w)的光引发剂、0.01-0.2％(w/w)的双键修饰高分子材料以及0.01-1mM的抑菌活性物质。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明对生物组织材料进行水凝胶涂层处理，形成避免生物组织与戊二醛直接接触的水凝胶涂层，有效避免了戊二醛溶液保存带来的醛基残留以及钙化等问题；而且，本发明提供的存储方法不需要进行脱水处理，能够避免干法保存生物组织材料存在的水含量过低，导致的存储性能衰减以及复水困难等问题；此外，水凝胶涂层处理形成的水凝胶涂层，还能够使生物组织材料的表面具有保水作用，提高了存储的稳定性。

附图说明

图1为本发明实施例9-15中生物组织材料的表面化学键变化示意图；

图2-1至图2-3为实施例5中经处理所得生物组织材料的复水示意图；

图3-1至图3-3为实施例7中经处理所得生物组织材料的复水示意图；

图4-1至图4-3为实施例12中经处理所得生物组织材料的复水示意图；

图5-1与图5-2为生物组织材料自然干态保存后的复水示意图。

其中：S001为预交联处理；S002为氧化处理；S003为接枝处理；S004为还原处理；S005为错位交联处理。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

为了清楚说明本发明技术方案，本发明具体实施方式中的生物组织材料为牛心包组织，该生物组织材料的组成不应视为对生物组织材料的具体限定。

实施例1

本实施例提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：

生物组织材料于30℃浸泡于材料保存液中进行5次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过层层自组装的方式形成5层水凝胶涂层；

每次浸提的浸泡时间为5min；

所述材料保存液中含有0.02％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.05％(w/w)的羧甲基壳聚糖(取代度80％)以及0.08mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐(XW3228958003)。

实施例2

本实施例提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：

生物组织材料于30℃浸泡于材料保存液中进行10次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过层层自组装的方式形成10层水凝胶涂层；

每次浸提的浸泡时间为2min；

所述材料保存液中含有0.01％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.01％(w/w)的羧甲基壳聚糖(取代度80％)以及0.01mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐(XW3228958003)。

实施例3

本实施例提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：

生物组织材料于30℃浸泡于材料保存液中进行3次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过层层自组装的方式形成3层水凝胶涂层；

每次浸提的浸泡时间为8min；

所述材料保存液中含有1％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.2％(w/w)的羧甲基壳聚糖(取代度80％)以及1mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐(XW3228958003)。

实施例4

本实施例提供了一种生物组织材料的存储方法，与实施例1相比，本实施例在水凝胶涂层处理之前还进行氧化处理；

所述氧化处理为：于25℃浸泡于浓度为0.1mM的重铬酸钾中40min。

实施例5

本实施例提供了一种生物组织材料的存储方法，与实施例1相比，本实施例在水凝胶涂层处理之前还进行还原处理；

所述还原处理为：于25℃浸泡于浓度为0.1M的氰基硼氢化钠的PBS缓冲液中24h。

实施例6

本实施例提供了一种生物组织材料的存储方法，与实施例1相比，本实施例在水凝胶涂层处理之前还包括接枝处理；

所述接枝处理为：于25℃浸泡于浓度为0.1M的甲基丙烯酸羟乙酯的CB缓冲液中24h。

实施例7

本实施例提供了一种生物组织材料的存储方法，与实施例1相比，本实施例在水凝胶涂层处理之前还包括依次进行的预交联处理、接枝处理以及错位交联处理；

所述预交联处理为：于37℃浸泡于浓度为0.5％(w/w)的戊二醛溶液20min；

所述接枝处理为：于25℃浸泡于浓度为0.1M的甲基丙烯酸羟乙酯的CB缓冲液中24h；

所述错位交联处理包括依次进行第一交联与第二交联；

所述第一交联包括：于25℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中8h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为40mM，耦合试剂的浓度为20mM；所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；所述耦合试剂为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐；

所述第二交联包括：于10℃浸泡于镁浓度为10mM的金属抑制剂溶液中2h。

实施例8

本实施例提供了一种生物组织材料的存储方法，与实施例7相比，本实施例还包括预交联处理之前的脱细胞处理；

所述脱细胞处理为：生物组织材料于10℃浸泡于浓度为0.01％(w/w)的十二烷基磺酸钠中1h，然后采用PBS缓冲液漂洗；接着于10℃在0.5％(w/w)的Triton X-100中浸泡2h，再采用D-Hanks溶液漂洗。

实施例9

本发明提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：生物组织材料依次进行脱细胞处理、预交联处理、表面修饰处理、错位交联处理以及水凝胶涂层处理；

所述表面修饰处理包括依次进行的氧化处理、接枝处理以及还原处理；

其中，预交联处理S001、氧化处理S002、接枝处理S003、还原处理S004以及错位交联处理S005的生物组织材料的表面化学键变化示意图如图1所示；所述存储方法具体包括：

(1)生物组织材料于10℃浸泡于浓度为0.01％(w/w)的十二烷基磺酸钠中1h，然后采用PBS缓冲液漂洗；接着于10℃在0.5％(w/w)的Triton X-100中浸泡2h，再采用D-Hanks溶液漂洗，以完成脱细胞处理；

(2)然后于37℃浸泡于浓度为0.5％(w/w)的戊二醛溶液20min，以进行预交联处理；

(3)然后于25℃浸泡于浓度为0.1mM的重铬酸钾中40min，以进行氧化处理；

(4)然后于25℃浸泡于浓度为0.1M的甲基丙烯酸羟乙酯的CB缓冲液中24h，以进行接枝处理；

(5)然后于25℃浸泡于浓度为0.1M的氰基硼氢化钠的PBS缓冲液中24h，以进行还原处理；

(6)然后依次进行第一交联与第二交联，以进行错位交联处理；

所述第一交联包括：于25℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中8h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为40mM，耦合试剂的浓度为20mM；所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；所述耦合试剂为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐；

所述第二交联包括：于10℃浸泡于镁浓度为10mM的金属抑制剂溶液中2h；

(7)最后于25℃的材料保存液中进行3次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过紫外光照射层层自组装的方法形成3层水凝胶涂层；所述材料保存液中含有0.02％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.05％(w/w)的羧甲基壳聚糖(取代度80％)以及0.08mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐；每次浸提的浸泡时间为8min。

实施例10

本发明提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：生物组织材料依次进行脱细胞处理、预交联处理、表面修饰处理、错位交联处理以及水凝胶涂层处理；

所述表面修饰处理包括依次进行的氧化处理、接枝处理以及还原处理；

其中，预交联处理S001、氧化处理S002、接枝处理S003、还原处理S004以及错位交联处理S005的生物组织材料的表面化学键变化示意图如图1所示；所述存储方法具体包括：

(1)生物组织材料于5℃浸泡于浓度为0.01％(w/w)的十二烷基磺酸钠中1h，然后采用PBS缓冲液漂洗；接着于5℃在0.5％(w/w)的Triton X-100中浸泡4h，再采用D-Hanks溶液漂洗，以完成脱细胞处理；

(2)然后于32℃浸泡于浓度为0.3％(w/w)的戊二醛溶液10min，以进行预交联处理；

(3)然后于32℃浸泡于浓度为0.05mM的重铬酸钾中18min，以进行氧化处理；

(4)然后于32℃浸泡于浓度为0.05M的甲基丙烯酸羟乙酯的CB缓冲液中24h，以进行接枝处理；

(5)然后于32℃浸泡于浓度为0.05M的氰基硼氢化钠的PBS缓冲液中18h，以进行还原处理；

(6)然后依次进行第一交联与第二交联，以进行错位交联处理；

所述第一交联包括：于32℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中4h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为20mM，耦合试剂的浓度为10mM；所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；所述耦合试剂为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐；

所述第二交联包括：于5℃浸泡于镁浓度为5mM的金属抑制剂溶液中6h；

(7)最后于32℃的材料保存液中进行10次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过紫外光照射层层自组装的方法形成10层水凝胶涂层；所述材料保存液中含有0.01％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.01％(w/w)的羧甲基壳聚糖(取代度80％)以及0.01mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐；每次浸提的浸泡时间为2min。

实施例11

本发明提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：生物组织材料依次进行脱细胞处理、预交联处理、表面修饰处理、错位交联处理以及水凝胶涂层处理；

所述表面修饰处理包括依次进行的氧化处理、接枝处理以及还原处理；

其中，预交联处理S001、氧化处理S002、接枝处理S003、还原处理S004以及错位交联处理S005的生物组织材料的表面化学键变化示意图如图1所示；所述存储方法具体包括：

(1)生物组织材料于15℃浸泡于浓度为2％(w/w)的十二烷基磺酸钠中1h，然后采用D-Hanks溶液漂洗；接着于15℃在2％(w/w)的Triton X-100中浸泡1h，再采用PBS缓冲液漂洗，以完成脱细胞处理；

(2)然后于25℃浸泡于浓度为0.1％(w/w)的戊二醛溶液60min，以进行预交联处理；

(3)然后于37℃浸泡于浓度为0.01mM的重铬酸钾中50min，以进行氧化处理；

(4)然后于37℃浸泡于浓度为0.01M的甲基丙烯酸羟乙酯的CB缓冲液中12h，以进行接枝处理；

(5)然后于37℃浸泡于浓度为0.01M的氰基硼氢化钠的PBS缓冲液中12h，以进行还原处理；

(6)然后依次进行第一交联与第二交联，以进行错位交联处理；

所述第一交联包括：于37℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中12h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为80mM，耦合试剂的浓度为40mM；所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；所述耦合试剂为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐；

所述第二交联包括：于15℃浸泡于镁浓度为1mM的金属抑制剂溶液中4h；

(7)最后于32℃的材料保存液中进行5次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过紫外光照射层层自组装的方法形成5层水凝胶涂层；所述材料保存液中含有1％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.2％(w/w)的羧甲基壳聚糖(取代度80％)以及0.1mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐；每次浸提的浸泡时间为4min。

实施例12

本发明提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：生物组织材料依次进行脱细胞处理、预交联处理、表面修饰处理、错位交联处理以及水凝胶涂层处理；

所述表面修饰处理包括依次进行的氧化处理、接枝处理以及还原处理；

其中，预交联处理S001、氧化处理S002、接枝处理S003、还原处理S004以及错位交联处理S005的生物组织材料的表面化学键变化示意图如图1所示；所述存储方法具体包括：

(1)生物组织材料于15℃浸泡于浓度为0.01％(w/w)的BSA-14中1h，然后采用PBS缓冲液漂洗；接着于15℃在1％(w/w)的Triton X-100中浸泡2h，再采用D-Hanks溶液漂洗，以完成脱细胞处理；

(2)然后于25℃浸泡于浓度为0.1％(w/w)的戊二醛溶液60min，以进行预交联处理；

(3)然后于30℃浸泡于浓度为0.1mM的高碘酸钾中30min，以进行氧化处理；

(4)然后于25℃浸泡于浓度为0.1M的甲基丙烯酸酐的CB缓冲液中24h，以进行接枝处理；

(5)然后于25℃浸泡于浓度为0.1M的三乙酰基硼氢化钠的PBS缓冲液中24h，以进行还原处理；

(6)然后依次进行第一交联与第二交联，以进行错位交联处理；

所述第一交联包括：于25℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中12h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为20mM，耦合试剂的浓度为10mM；所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；所述耦合试剂为1-羟基苯并三唑；

所述第二交联包括：于10℃浸泡于锌浓度为8mM的金属抑制剂溶液中5h；

(7)最后于25℃的材料保存液中进行10次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过紫外光照射层层自组装的方法形成10层水凝胶涂层；所述材料保存液中含有0.01％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.1％(w/w)的明胶衍生物(Innochem B25612)以及0.1mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐；每次浸提的浸泡时间为2min。

实施例13

本发明提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：生物组织材料依次进行脱细胞处理、预交联处理、表面修饰处理、错位交联处理以及水凝胶涂层处理；

所述表面修饰处理包括依次进行的氧化处理、接枝处理以及还原处理；

其中，预交联处理S001、氧化处理S002、接枝处理S003、还原处理S004以及错位交联处理S005的生物组织材料的表面化学键变化示意图如图1所示；所述存储方法具体包括：

(1)生物组织材料于15℃浸泡于浓度为0.01％(w/w)的BSA-16中1h，然后采用PBS缓冲液漂洗；接着于15℃在1％(w/w)的Triton X-100中浸泡2h，再采用D-Hanks溶液漂洗，以完成脱细胞处理；

(2)然后于30℃浸泡于浓度为0.2％(w/w)的戊二醛溶液40min，以进行预交联处理；

(3)然后于28℃浸泡于浓度为0.1mM的高碘酸钠中40min，以进行氧化处理；

(4)然后于30℃浸泡于浓度为0.1M的甲基丙烯酸甘油酯的PBS缓冲液中12h，以进行接枝处理；

(5)然后于30℃浸泡于浓度为0.05M的硼氢化钠的PBS缓冲液中16h，以进行还原处理；

(6)然后依次进行第一交联与第二交联，以进行错位交联处理；

所述第一交联包括：于30℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中8h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为20mM，耦合试剂的浓度为10mM；所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；所述耦合试剂为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐；

所述第二交联包括：于10℃浸泡于锌浓度为10mM的金属抑制剂溶液中4h；

(7)最后于25℃的材料保存液中进行5次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过紫外光照射层层自组装的方法形成5层水凝胶涂层；所述材料保存液中含有0.05％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.2％(w/w)的明胶衍生物(Innochem B25613)以及0.05mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐；每次浸提的浸泡时间为4min。

实施例14

本发明提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：生物组织材料依次进行脱细胞处理、预交联处理、表面修饰处理、错位交联处理以及水凝胶涂层处理；

所述表面修饰处理包括依次进行的氧化处理、接枝处理以及还原处理；

其中，预交联处理S001、氧化处理S002、接枝处理S003、还原处理S004以及错位交联处理S005的生物组织材料的表面化学键变化示意图如图1所示；所述存储方法具体包括：

(1)生物组织材料于10℃浸泡于浓度为0.01％(w/w)的十六烷基溴化铵中1h，然后采用PBS缓冲液漂洗；接着于10℃在1％(w/w)的BSA-16中浸泡2h，再采用D-Hanks溶液漂洗，以完成脱细胞处理；

(2)然后于25℃浸泡于浓度为0.3％(w/w)的戊二醛溶液50min，以进行预交联处理；

(3)然后于25℃浸泡于浓度为0.05mM的2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物中20min，以进行氧化处理；

(4)然后于25℃浸泡于浓度为0.1M的丙烯酰氯的二甲亚砜溶液中4h，以进行接枝处理；

(5)然后于25℃浸泡于浓度为0.1M的硼氢化钠的PBS缓冲液中16h，以进行还原处理；

(6)然后依次进行第一交联与第二交联，以进行错位交联处理；

所述第一交联包括：于25℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中4h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为40mM，耦合试剂的浓度为20mM；所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；所述耦合试剂为1-羟基苯并三唑；

所述第二交联包括：于10℃浸泡于锌浓度为5mM的金属抑制剂溶液中6h；

(7)最后于25℃的材料保存液中进行8次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过紫外光照射层层自组装的方法形成8层水凝胶涂层；所述材料保存液中含有0.01％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.05％(w/w)的海藻酸钠(Innochem A21509)以及0.01mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐；每次浸提的浸泡时间为2min。

实施例15

本发明提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法包括：生物组织材料依次进行脱细胞处理、预交联处理、表面修饰处理、错位交联处理以及水凝胶涂层处理；

所述表面修饰处理包括依次进行的氧化处理、接枝处理以及还原处理；

其中，预交联处理S001、氧化处理S002、接枝处理S003、还原处理S004以及错位交联处理S005的生物组织材料的表面化学键变化示意图如图1所示；所述存储方法具体包括：

(1)生物组织材料于15℃浸泡于浓度为0.1％(w/w)的BSA-16中1h，然后采用PBS缓冲液漂洗；接着于15℃在1％(w/w)的Triton X-100中浸泡2h，再采用D-Hanks溶液漂洗，以完成脱细胞处理；

(2)然后于30℃浸泡于浓度为0.1％(w/w)的戊二醛溶液50min，以进行预交联处理；

(3)然后于25℃浸泡于浓度为0.1mM的高碘酸钠中40min，以进行氧化处理；

(4)然后于25℃浸泡于浓度为0.1M的甲基丙烯酸酐的CB缓冲液中12h，以进行接枝处理；

(5)然后于25℃浸泡于浓度为0.1M的硼氢化钠的CB缓冲液中16h，以进行还原处理；

(6)然后依次进行第一交联与第二交联，以进行错位交联处理；

所述第一交联包括：于25℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中12h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为20mM，耦合试剂的浓度为10mM；所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；所述耦合试剂为1-羟基苯并三唑；

所述第二交联包括：于10℃浸泡于锌浓度为10mM的金属抑制剂溶液中4h；

(7)最后于25℃的材料保存液中进行10次浸提，每浸提1次进行光诱导，通过紫外光照射层层自组装的方法形成10层水凝胶涂层；所述材料保存液中含有0.01％(w/w)的2-羟基-2-甲基苯基丙酮、0.05％(w/w)的可溶性纤维素(thermo scientific 045847)以及0.1mM的聚六亚甲基双胍盐酸盐；每次浸提的浸泡时间为3min。

对比例1

本对比例提供了一种生物组织材料的存储方法，所述存储方法为：直接将生物组织材料进行戊二醛保存。

性能表征

(1)组织复水性能检测

将10×10mm的样品摊平在表面光滑的不锈钢平板上，置于温度为40℃，相对湿度为70％的恒温恒湿箱中放置一周，之后将样品浸泡在PBS缓冲液中，观察样品复水情况，所得结果如表1所示；

其中，对比组为自然干态保存，其复水示意图如图5所示；其中图5-1为在40℃的条件下，相对湿度为70％的恒温恒湿箱中放置一周的干态组织；图5-2为在37℃的条件下放置于生理盐水中孵育30min的复水示意图。

其中，实施例1至实施例5在生物组织材料表面形成的涂层仅有范德华作用力，具体的，实施例5中经处理所得生物组织材料的复水示意图如图2所示；其中，图2-1为样品在40℃的条件下，相对湿度为70％的恒温恒湿箱中放置一周的干态组织；图2-2为在37℃的条件下放置于生理盐水中孵育15min的复水示意图；图2-3为在37℃的条件下放置于生理盐水中孵育30min的复水示意图。

由图2-1至图2-3可知，生物组织与涂层之间仅依靠范德华力不足以维持涂层的长久稳定性，不利于心包保存，这也是导致生物组织复水卷曲的原因之一。

实施例6至实施例15在生物组织材料表面形成的涂层存在范德华作用力与共价键的协同作用，具体的，实施例7中经处理所得生物组织材料的复水示意图如图3所示；其中，图3-1为样品在40℃的条件下，相对湿度为70％的恒温恒湿箱中放置一周的干态组织；图3-2为在37℃的条件下放置于生理盐水中孵育15min的复水示意图；图3-3为在37℃的条件下放置于生理盐水中孵育30min的复水示意图。

实施例12中经处理所得生物组织材料的复水示意图如图4所示；其中，图4-1为样品在40℃的条件下，相对湿度为70％的恒温恒湿箱中放置一周的干态组织；图4-2为在37℃的条件下放置于生理盐水中孵育15min的复水示意图；图4-3为在37℃的条件下放置于生理盐水中孵育30min的复水示意图。

由图3-1至图3-3，以及图4-1至图4-3可知，经过相关技术方案处理的生物组织，从干态到湿态的展平相应迅速，实施例7对应方案在复水后存在轻微卷取，实施例12对应方案的展平平整，柔顺性良好。

表1

(2)抗菌性能测试

将500mg切成小片的样品放入涂有10mL浓度为5×10⁵CFU/mL的细菌悬浮液的锥形烧瓶中；在37℃下摇动烧瓶(120rpm)。孵育0小时和4小时后，将20μL细菌悬浮液涂在营养琼脂平板上；37℃培养18h后计数菌落形成单位，菌落数数量越少，表明抗菌性能效果更好，所得结果如表2所示。

孵育0小时的菌落数为M0，孵育4小时的菌落数为M1，则抑菌率为：

抑菌率＝[(M0-M1)/M0]×100％；

(3)酶促稳定性测试

通过胶原酶II和弹性蛋白酶处理后的重量损失百分比来测量交联组织的胶原蛋白和弹性蛋白稳定性：将样品(1×1cm²，每组n＝6)冷冻干燥并称重(W₀)；将干燥的碎片在含有125U mL^-1胶原酶II的Tris缓冲液(Tris 0.1M，CaCl₂ 0.05M，pH 7.4)或含有30U mL^-1弹性蛋白酶的Tris缓冲液(Tris 0.1M，CaCl₂ 0.001M，pH 7.8)中分别孵育作用24小时；将酶处理后的组织用蒸馏水冲洗3次，然后冷冻干燥并称重(Wt)，所得结果如表2所示。

表2

由表2可知，对比例1采用戊二醛进行抑菌保存，心包组织的抑菌性能来源于微量的游离的戊二醛，无明显抑菌效果。从抑菌率的结果可知，对比例1的抑菌率明显小于其他实施例的试验组。

实施例1至实施例3采用层层自组装形成水凝胶涂层，相比对比例1，具有一定的抗菌效果。水凝胶涂层的作用力是范德华力，未形成化学键，其抑菌相比于实施例6进行了化学接枝的实施例，其稳定性偏低，抑菌性能偏低。

实施例4进行了氧化处理，其钙含量明显降低，说明氧化处理能够降低戊二醛残留与增强稳定性。

实施例5进行了还原处理，改善戊二醛交联固定带来的不稳定性因素。

实施例6进行了接枝处理，相比实施例1，在水凝胶涂层之间增加了化学键合力，增加了涂层稳定性，保留有效抗菌成分，大大改善抑菌性能。实施例6钙含量降低，说明接枝能够改善抗钙化性能，抗菌剂保留量可达到长久抑菌功效。

实施例7进行了预交联处理，相比实施例1，增加了复合交联增强纤维稳定性，其抗钙化性能也有所改善。

实施例8进行了脱细胞处理，脱细胞可增加组织生物相容性，其改善了生物相容性，减少异物性带来的免疫排异现象。增加了抗钙化功能，对增加抗钙化性能也有所益处。

实施例9-15在脱细胞、预处理、表面修饰与复合交联等基础上，通过调节浸提与光交联时间角度来改善组织的性能，从抗钙化、抗酶解、抑菌率等角度综合评估，实施例9-15均具有优异的抗钙化、抗酶解、生物相容性、以及良好的抑菌性能。其中复合交联的引入显著改善抗酶解性能。

综上所述，本发明对生物组织材料进行水凝胶涂层处理，形成避免生物组织与戊二醛直接接触的水凝胶涂层，有效避免了戊二醛溶液保存带来的醛基残留以及钙化等问题；而且，本发明提供的存储方法不需要进行脱水处理，能够避免干法保存生物组织材料存在的水含量过低，导致的存储性能衰减以及复水困难等问题；此外，水凝胶涂层处理形成的水凝胶涂层，还能够使生物组织材料的表面具有保水作用，提高了存储的稳定性。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种生物组织材料的存储方法，其特征在于，所述存储方法包括：

所述生物组织材料进行水凝胶涂层处理，通过层层自组装的方式形成水凝胶涂层。

2.根据权利要求1所述的存储方法，其特征在于，所述水凝胶涂层处理包括：生物组织材料于材料保存液中进行至少1次浸提，每浸提至少1次进行光诱导，形成保护生物组织材料的水凝胶涂层；

优选地，每次所述浸提的浸泡时间为2-8min；

优选地，所述层层自组装形成的水凝胶涂层的层数为3-10层；

优选地，所述材料保存液中含有0.01-1％(w/w)的光引发剂与0.01-0.2％(w/w)的双键修饰高分子材料；

优选地，所述光引发剂包括紫外光引发剂；

优选的，所述紫外光引发剂包括2-羟基-2-甲基苯基丙酮、2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮或2-羟基-2-甲基-1-[4-(叔丁基)苯基]-1-丙酮中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述双键修饰高分子材料包括壳聚糖、壳聚糖衍生物、明胶、明胶衍生物、可溶性纤维素、可溶性纤维素衍生物、海藻酸钠、海藻酸钠衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、硫酸软骨素、硫酸软骨素衍生物、丝蛋白、丝蛋白衍生物、β-环糊精或β-环糊精衍生物中的任意一种或至少两种的组合；优选为壳聚糖和/或壳聚糖衍生物；

优选地，所述材料保存液中还含有0.01-1mM的抑菌活性物质；

优选地，所述抑菌活性物质包括双胍类物质、异噻唑类物质、酚醚类物质或苯酚类物质中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述水凝胶涂层处理的温度为25-37℃。

3.根据权利要求1或2所述的存储方法，其特征在于，所述生物组织材料包括心包组织、软骨组织或皮肤组织中的任意一种；

优选地，所述生物组织材料进行水凝胶涂层处理之前，进行表面处理；

优选地，所述表面处理包括预交联处理、表面修饰处理或错位交联处理中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述表面修饰处理包括氧化处理、接枝处理或还原处理中的任意一种或至少两种的组合。

4.根据权利要求3所述的存储方法，其特征在于，所述预交联处理包括：浸泡于戊二醛溶液；

优选地，所述戊二醛溶液的浓度为0.1-0.5％(w/w)；

优选地，所述预交联处理的温度为25-37℃，时间为10-60min。

5.根据权利要求3或4所述的存储方法，其特征在于，所述氧化处理包括：浸泡于氧化剂溶液；

优选地，所述氧化剂溶液的浓度为0.01-0.1mM；

优选地，所述氧化剂溶液中的氧化剂包括高碘酸钠、高碘酸钾、重铬酸钾、过氧乙酸、过氧化氢或2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述氧化处理的温度为25-37℃，时间为10-50min。

6.根据权利要求3-5任一项所述的存储方法，其特征在于，所述接枝处理包括：浸泡于含末端活性双键结构物质的溶液；

优选地，所述含末端活性双键结构物质的溶液的浓度为0.01-0.1M；

优选地，所述含末端活性双键结构物质包括甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐油脂、二(2-甲基-2-丙烯酸)2-羟基-1,3-丙二醇酯、甲基丙烯酸羟乙酯或丙烯酰氯中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述接枝处理的温度为25-37℃，时间为12-24h。

7.根据权利要求3-6任一项所述的存储方法，其特征在于，所述还原处理包括：浸泡于还原剂溶液；

优选地，所述还原剂溶液的浓度为0.01-0.1M；

优选地，所述还原剂溶液中的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠或三乙酰基硼氢化钠中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述还原处理的温度为25-37℃，时间为12-24h。

8.根据权利要求3-7任一项所述的存储方法，其特征在于，所述错位交联处理包括依次进行的第一交联与第二交联；

优选地，所述第一交联包括：浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液；

优选地，所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为20-80mM，耦合试剂的浓度为10-40mM；

优选地，所述羰基活化试剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐或二甲基氨基丙基乙基碳酰胺中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述耦合试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐、1-羟基苯并三唑或苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述第一交联的温度为25-37℃，时间为4-12h；

优选地，所述第二交联包括：浸泡于金属抑制剂溶液；

优选地，所述金属抑制剂溶液中的金属离子浓度为1-10mM；

优选地，所述金属抑制剂溶液中的金属离子包括铁离子、锌离子或镁离子中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述第二交联的温度为5-15℃，时间为2-6h。

9.根据权利要求3-8任一项所述的存储方法，其特征在于，所述存储方法还包括表面处理之前的脱细胞处理；

优选地，所述脱细胞处理包括：浸泡于去垢剂溶液；

优选地，所述脱细胞处理的温度为5-15℃，时间为1-4h；

优选地，所述去垢剂溶液的浓度为0.01-2％(w/w)；

优选地，所述去垢剂溶液中的去垢剂包括十二烷基磺酸钠、十六烷基溴化铵、甜菜碱型去垢剂或Triton X-100中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述甜菜碱型去垢剂包括3-([N,N-二甲基二甲基(3-十四酰胺丙基)铵]丙烷-1-磺酸盐和/或3-[N,N-二甲基(3-棕榈酰氨基丙基)铵基]-丙烷磺酸内盐。

10.根据权利要求1-9任一项所述的存储方法，其特征在于，所述存储方法包括如下步骤：

(1)生物组织材料于5-15℃浸泡于浓度为0.01-2％(w/w)的去垢剂溶液1-4h，以进行脱细胞处理；所述去垢剂溶液中的去垢剂包括十二烷基磺酸钠、十六烷基溴化铵、甜菜碱型去垢剂或Triton X-100中的任意一种或至少两种的组合；

(2)然后于25-37℃浸泡于浓度为0.1-0.5％(w/w)的戊二醛溶液10-60min，以进行预交联处理；

(3)然后于25-37℃浸泡于浓度为0.01-0.1mM的氧化剂溶液10-50min，以进行氧化处理；所述氧化剂溶液中的氧化剂包括高碘酸钠、高碘酸钾、重铬酸钾、过氧乙酸、过氧化氢或2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物中的任意一种或至少两种的组合；

(4)然后于25-37℃浸泡于浓度为0.01-0.1M的含末端活性双键结构物质的溶液12-24h，以进行接枝处理；所述含末端活性双键结构物质包括甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐油脂、二(2-甲基-2-丙烯酸)2-羟基-1,3-丙二醇酯、甲基丙烯酸羟乙酯或丙烯酰氯中的任意一种或至少两种的组合；

(5)然后于25-37℃浸泡于浓度为0.01-0.1M的还原剂溶液12-24h，以进行还原处理；所述还原剂溶液中的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠或三乙酰基硼氢化钠中的任意一种或至少两种的组合；

(6)然后依次进行第一交联与第二交联，以进行错位交联处理；

所述第一交联包括：于25-37℃浸泡于羰基活化试剂与耦合试剂的混合溶液中4-12h；所述混合溶液中羰基活化试剂的浓度为20-80mM，耦合试剂的浓度为10-40mM；

所述第二交联包括：于5-15℃浸泡于金属离子浓度为1-10mM的金属抑制剂溶液；所述金属抑制剂溶液中的金属离子包括铁离子、锌离子或镁离子中的任意一种或至少两种的组合；

(7)最后于25-37℃的材料保存液中进行至少1次浸提，每浸提至少1次进行光诱导，形成保护生物组织材料的3-10层水凝胶涂层；所述材料保存液中含有0.01-1％(w/w)的光引发剂、0.01-0.2％(w/w)的双键修饰高分子材料以及0.01-1mM的抑菌活性物质。