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WO2001044818A2 - Verfahren zur bestimmung der parathormon-aktivität in einer menschlichen probe - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der parathormon-aktivität in einer menschlichen probe Download PDF

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WO2001044818A2
WO2001044818A2 PCT/EP2000/012911 EP0012911W WO0144818A2 WO 2001044818 A2 WO2001044818 A2 WO 2001044818A2 EP 0012911 W EP0012911 W EP 0012911W WO 0144818 A2 WO0144818 A2 WO 0144818A2
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WO
WIPO (PCT)
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pth
hpth
parathyroid hormone
activity
sample
Prior art date
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Application number
PCT/EP2000/012911
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English (en)
French (fr)
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WO2001044818A3 (de
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Franz Paul Armbruster
Albert Missbichler
Heinrich Schmidt-Gayk
Heinz-Jürgen ROTH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immundiagnostik AG
Original Assignee
Immundiagnostik AG
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Publication date
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Priority to AU26746/01A priority patent/AU2674601A/en
Priority to US10/168,185 priority patent/US7851163B2/en
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Publication of WO2001044818A3 publication Critical patent/WO2001044818A3/de
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Priority to US12/830,977 priority patent/US20110003311A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/635—Parathyroid hormone (parathormone); Parathyroid hormone-related peptides

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the parathyroid activity in a sample.
  • the invention particularly relates to the immunological determination of the activity of parathyroid hormone (PTH) and its fragments in a body fluid for the diagnosis, finding of causes and treatment of calcium metabolism disorders, osteopathies and hyper- or hypoparathyroidism.
  • PTH parathyroid hormone
  • Human parathyroid hormone (see SWISS-PROT: P01 270, PTHY-HUMAN) is a linear peptide of 84 amino acids (MW 9500 Da) of the parathyroid gland (Glandulae parathyroideae). It increases the calcium and the phosphate content of the blood and is involved in the mobilization of the extracellular hydroxyapatite of the bones.
  • the PTH content of the blood is therefore an important diagnostic parameter in patients with disturbed calcium metabolism and its knowledge is necessary to clarify 1) the presence and extent of hyper- or hypoparathyroidism, 2) the quantification of osteoblast activity, 3) the quantification of osteoclast activity , 4) securing the supply of vitamin D and active vitamin D metabolites, 5) the assessment of an aluminum load, 6) the assessment of a possible estrogen deficiency in postmenopausal dialysis patients, 6) the necessary steroid or cyclosporine administration after kidney transplants, 7) the need for treatment and the prevention of bone marrow changes, uremic conditions and chronic kidney failure.
  • PTH activity effective in the blood is problematic since the peptide hormone is rapidly broken down into active and inactive fragments in the circulation and by the liver, for example by cleavage in the range from amino acids 34 to 37.
  • physiological concentration of intact human is PTH (hPTH) in the blood plasma only at about 1 to 5 pmol / L.
  • WO 96/1 0041 teaches that antibodies against amino terminal epitopes of PTH recognize biologically active PTH and that if the amino terminal amino acids serine and valine are lost, the activity is lost.
  • Mägerlein et al describe in Pharm. -Forsch. / Drug Res. 48 (l), pp1 97-204 (1 998) used an immunoenzymometric assay to determine the concentration of injected PTH fragment 1-37 in pharmacokinetic studies in dogs.
  • the measuring range of the assay ranges from 100 to 4 pmol / L and ends above the physiological PTH levels normally present in the serum.
  • the true biologically active PTH activity in a sample can currently, if at all, only be determined by the effect on a cellular system such as, for example, pheochromocytoma cells (PC-1 2).
  • the invention also relates to a test system and a method for diagnosing and the extent of hypo- or hyperparathyroidism and finding the cause of calcium metabolism disorders, osteopathies, kidney failure and diseases. which result from a disturbed homeostasis in the calcium and phosphate content of the blood.
  • the method according to the invention for determining the biologically active PTH activity in a sample is characterized by the steps: (i) reacting the sample with an antibody which binds an epitope on the PTH which lies in the region of the binding structure to the PTH receptor; (ii) reacting the sample with an antibody that recognizes an epitope formed by terminal amino acids 1 to 3 of the PTH; (iii) determining the amount of molecules recognized by both antibodies; and (iv) calculating the biologically active PTH activity in the sample.
  • the aforementioned antibodies preferably recognize epitopes of human PTH.
  • the antibody against the receptor binding structure preferably binds an epitope in which at least one of the amino acids 15 to 22 of the human PTH is involved.
  • the invention also includes a method in which a first antibody is bound to a solid phase.
  • the second antibody can carry a label or be conjugated to an enzyme such as alkaline phosphatase or peroxidase.
  • the method is carried out in an immunoassay known per se, preferably in an ELISA, IEMA, ILMA or LIA.
  • the two antibodies are preferably bound to the PTH in the presence of 0.05 to 0.1% by weight of a mild detergent, such as Tween TM -20 or Triton TM X-100, so that the amino-terminal epitope PTH (1 -3 ) to the PTH receptor binding structure is prevented or in order to keep the amino terminal epitope PTH (1 -3) accessible for the binding of the antibody. Since both the receptor binding structure and the amino-terminal epitope PTH (1 -3) are necessary for the biological activity of PTH, these two structures can presumably interact with one another. The presence of a mild detergent can significantly improve the sensitivity and accuracy of the assay.
  • a mild detergent such as Tween TM -20 or Triton TM X-100
  • a known aliquot of the sample is also reacted with antibodies which bind to the PTH sequences between amino acids 4 to 14 and 15 to 37.
  • the number of molecules in a sample that bind antibodies against the epitope PTH (1-3) and the receptor binding structure of the PTH and the number of molecules that bind antibodies against the PTH regions 4 to 14 and 15 to 37, are then related to each other and the biologically active PTH activity is determined.
  • the invention further relates to a diagnostic system for determining the PTH activity in a sample, which is characterized by antibodies which specifically recognize the PTH epitope with amino acids 1 to 3 and antibodies which bind to the region of the PTH receptor binding structure.
  • the diagnostic system also has antibodies that bind specifically to the region between amino acids 4 and 14.
  • the system includes antibodies that bind to the portion between amino acids 24 and 37 of the parathyroid hormone or to the central region (53 to 68) or the C-terminal (53 to 84) region of the peptide hormone.
  • the method according to the invention takes into account the PTH activity of the non-intact PTH fragments and that apparently intact PTH is biologically inactive if the last or the last two amino-terminal amino acids of the peptide hormone are missing.
  • the antagonistic activity of some PTH fragments is also included in the determination, since not only the agonistic but also the antagonistic PTH fragments can be determined in the method.
  • the antagonistic activity is derived from the excess of
  • PTH receptor binding structure to intact PTH amino terminus i.e. from the number of PTH fragments, which contain the binding structure for the PTH receptor, but have no intact amino terminal end. PTH fragments that are neither
  • Receptor binding structure with amino acids 15 to 22 still have an intact amino-terminal epitope PTH (1 -3) have no agonistic or antagonistic
  • Antibody-based assays against the mid-regional (53-68) or C-terminal (53-84) section overlook biologically active PTH fragments of the hPTH (1-37), hPTH (1-32-36) or hPTH type (1 -38).
  • the method according to the invention thus provides the doctor with a PTH activity value which describes the physiological effect of the PTH fragments.
  • PTH activity value which describes the physiological effect of the PTH fragments.
  • the hyperparathyroidism can then be based on the fact that these patients secrete the likewise active PTH fragments hPTH (1-37) and hPTH (1-38) into the bloodstream, so that they suffer from excessive PTH activity and its consequences.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the method according to the invention
  • 4a, b an analysis of the cross-reaction with different hPTH fragments in an immunoenzymometric assay
  • 5 shows a standard curve of the LIA assay according to the invention for determining the effective PTH activity in a sample.
  • peptides are synthesized in a known manner, preferably on a lysine framework on a Wang resin.
  • Fmoc-L-lysine (Fmoc) -OH is first coupled to a C-terminal amino acid bound to Wang resin in three coupling cycles.
  • the Wang resin with the amino-terminal PTH amino acid sequence can then be injected directly - preferably together with complete Freund's adjuvant - into an animal for immunization, for example into a mouse, rat, rabbit or goat.
  • the amino-terminal PTH peptide can also be cleaved off before immunization, isolated and coupled to a carrier protein such as ovalbumin, bovine albumin, thyroglobulin or hemocyanin, for example with dicyclohexylcarbodiimide. After several booster immunizations, the immunoglobulin fraction is isolated, which has an antibody titer against the amino-terminal PTH peptide.
  • a carrier protein such as ovalbumin, bovine albumin, thyroglobulin or hemocyanin, for example with dicyclohexylcarbodiimide.
  • Antibodies which recognize an epitope of the first two amino-terminal amino acids of the hPTH are regularly obtained with the above-mentioned amino-terminal peptides.
  • a fraction with antibodies pure against the amino-terminal epitope hPTH (1-3) can be obtained by affinity chromatography, an hPTH peptide with an intact amino-terminal end being coupled to a solid phase, for example on Wang resin or polystyrene beads.
  • the antibodies directed against the amino terminus PTH (1-3) are bound to it, washed and eluted.
  • the eluate is finally clarified via a second column in which the hPTH peptide coupled to the solid phase has no intact amino terminal epitope, for example as in the peptide sequences SEQ No. 7 and SEQ No. 8 below.
  • a coupling to a carrier peptide is not absolutely necessary for the generation of an immune reaction, since the PTH sequences between humans, cattle, pigs and rats vary in particular in the region of the receptor binding site between positions 15 and 22 and are therefore antigenic (see FIG. 2) ,
  • HPTHd -37 is synthesized as described in Example 2 of WO 91/06564.
  • the aforementioned peptides and their derivatives can also be prepared by gene expression in a suitable prokaryotic or eukaryotic host organism and purified by chromatography.
  • the peptides hPTH (1-32), hPTH (1-33), hPTH (1-34), hPTH (1-38) and other biologically active hPTH fragments for the production of antibodies against the receptor binding sequence of the hPTH.
  • the immunoglobulin fraction is then isolated from the serum of the immunized animal and tested for binding to the hPTH receptor site.
  • the immunoassay is carried out on the active structure of the hPTH under slightly denaturing conditions, so that both epitopes in the unfolded peptide are free for binding to the antibodies.
  • a detergent such as Tween-20 or Triton-X-100 in the binding buffer.
  • the detergents are preferably added to the binding buffer in an amount of 0.01 to 1% by weight, particularly preferably in an amount of 0.1 to 0.3% by weight.
  • Antagonistic hPTH fragments are characterized by a PTH receptor binding site and the absence of an intact amino terminal epitope hPTH (1 -3).
  • the antagonistic activity of a sample is therefore proportional to the number of PTH fragments which contain the receptor binding site between positions 1 5 and 22, but which are not bound by antibodies against the amino-terminal epitope hPTH (1 -3).
  • the antagonistic activity can thus be determined from the difference between the number of molecules which are recognized by the antibody double against the receptor binding site and the amino terminus hPTH (1 -3) and the Number of fragments recognized by the antibody double against the receptor binding structure (or an N-terminal epitope between amino acids 24 and 37) and an epitope in the region of amino acids 4 and 1 4.
  • the latter size is equal to the number of hPTH fragments recognized by the antibody double against sections hPTH (9-1 8) and hPTH ⁇ 24-34), but not by antibodies against hPTH (1- 3) epitope.
  • the antibodies against the hPTH (4-14) region are obtained when the antibodies against the hPTH (1 -3) epitope are purified. They are contained in the antibody fraction which bind to the amino-terminal peptide hPTH (2-10) with an incomplete hPTH-end epitope (see above).
  • Such antibodies can also be made specifically, e.g. as in WO 96/1 0041 or in Tampe et al. (J. Immunoassay (1,992), 1 3 (1), pp. 1 -1 3). So that the antibodies do not interfere with each other, it can be advantageous here to select two antibodies with the binding sites on the hPTH (1-37) somewhat further apart, for example as indicated above as an alternative. If the binding sites are too far apart or too far C-terminal of the receptor binding site between positions 15 and 22, there is a risk that non-inhibiting hPTH fragments are also detected as antagonists.
  • the immunoassay of biological PTH activity according to the invention can moreover be combined with existing PTH immunoassays.
  • the effective PTH activity can then be related to individual PTH molecules of a certain length. This explains in particular the cause of certain hyper and hypoparathyroidisms.
  • the PTH activity assay also includes the additional determination of hPTH molecules with an intact carboxy terminus and antibodies against the central region or C-terminal region of the hPTH.
  • the method for determining the activity of PTH and its fragments in a sample can be implemented as EIA, ELISA, RIA, IRMA, LIA or ILMA, FIA or IFMA, as a manual test system or, preferably, in a version adapted to automata in liquid phase or solid-phase technique.
  • Fmoc-L-lysine (Fmoc) -OH was bound to C-terminal alanine, bound to Wang resin, in three coupling cycles.
  • the Fmoc groups were then split off with 20% piperidine and 2% 1,8-diazabicyc! O [5,4,0] undec-7-ene (DBU) in NN-dimethylformamide, NN-dimethylacetamide.
  • peptide hPTH 1 mg was then coupled in aqueous solution at room temperature to 10 mg of bovine serum albumin using the carbodiimide method and the coupled peptide was precipitated from the aqueous solution with isopropanol.
  • the peptide was taken up in PBS and aliquoted.
  • 1 25 ⁇ g of peptide-carrier conjugate was dissolved in 250 ⁇ l of PBS, emulsified with a double volume of complete Freund's adjuvant and the emulsion was subcutaneously injected into a rabbit at various locations in several units. After 2 and 4 weeks, further booster injections with peptide and incomplete Freund's adjuvant followed.
  • HPTHd -37 HPTHd -37 was synthesized as described in Example 2 of WO 91/06564.
  • 25 ⁇ g peptide hPTH (1-37) bound to Wang resin in 50 ⁇ l PBS was injected intraperitoneally into a mouse. After 2 and 4 weeks there was a booster with 50 ⁇ l peptide hPTH (1-37) on Wang resin.
  • Monoclonal antibody clones were produced in a manner known per se and the various pooled clones on hPTH (1 5-22) heptapeptide, synthesized on polystyrene pins (see Tampe et al., J. Immunassay (1 992), 1 3 (1), pp. 1 -1 3), tested.
  • FIG. 3 shows an analysis of the monoclonal antibodies against the receptor binding site of the PTH and their cross-reaction with the other PTH fragments.
  • Synthetic hPTH (1-84) (Bachern AG) and various hPTH fragments with and without an intact amino-terminal end epitope were dissolved in equal amounts of serum and the resulting PTH activities or the recovery of the biologically active PTH fragments in an immunoenzymometric assay (IEMA ) certainly.
  • the primary antibody was the monoclonal antibody mAK 1 3 / C631 5 against the receptor binding site and bound to the solid phase.
  • the secondary antibody was rabbit polyclonal anti-hPTH (1 -3) IgG.
  • Figures 4a and b show the cross-reaction with different hPTH fragments in two different experiments. The results show that PTH fragments without the last two amino terminal amino acids are not recognized in the test and that all active PTH fragments essentially form a uniform family of curves. Differences are based on differing degrees of purity of the preparations, weighing inaccuracies and the difficulty in determining the exact amount of peptides.
  • Example 4 Determination of the effective PTH activity in a sample
  • P TH receptor binding structure 1.0 ⁇ g MAb 77/78 (subclone against receptor binding site hPTH (1 5-22)) was added to the wells of a microtiter plate, dissolved in 250 ⁇ l 60 mM NaHC0 3 , pH 9.6, and incubated the plate overnight at 4 ° C. The MAb solution in the wells was removed and each well was washed five times with 200 ⁇ l washing buffer (PBS, pH 7.4 with 0.05% Tween-20). Then 250 ul assay buffer was added to each well.
  • PBS pH 7.4 with 0.05% Tween-20
  • the assay buffer 5 g casein was dissolved in 100 ml 0.1 N NaOH and made up to 1 L volume with PBS, pH 7.4, with 0.1% by weight Triton TM -X 100. The solution was boiled for one hour, the volume was made up to one liter with distilled water, the pH was adjusted to 7.4 and 0.1 g of thimerosal was added to avoid microbial growth. The wells in the microtiter plate were incubated for one hour at room temperature with assay buffer, then the assay buffer was removed and each well was washed five times with 200 ⁇ l wash buffer.
  • Venous blood was collected in EDTA tubes (approx. 1.5 to 2 mg K 2 EDTA per
  • Binding structure In each case 100 ⁇ l of diluted EDTA serum supernatant in assay buffer was incubated for half an hour at room temperature in the prepared wells with shaking. The solutions were then removed from the wells and the wells were washed five times with 200 ⁇ l of washing buffer each.
  • affinity-purified rabbit anti-PTH (1 -3 epitope) antiserum (1: 10 000 diluted in assay buffer with 3% (w / v) PEG 6000) were added to the wells and incubated for one hour in the dark and with shaking at room temperature. The solutions were removed from the wells and each well was washed five times with 200 ul wash buffer. The quantitative determination was carried out with 100 ⁇ l anti-rabbit IgG, fc-specific, cross-absorbed and conjugated with alkaline phosphatase (diluted 1: 20,000 in washing buffer). It was incubated for one hour at room temperature. The antibody solutions were then removed and each well was washed five times with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • Lumi-Phos TM Plus ready-to-use solution with 4-methoxy-4- (3-phosphatphenyl) spiro [1,2-dioxetane-3,2'-adamantane] disodium salt and associated enhancer (Lumigen , Michigan, US) in 2-amino-2-methyl-1-propanol buffer (pH 9.6) 1 added to the wells.
  • the luminescence is then measured at 470 nm in a luminometer.
  • Lumigen TM PS-1 was used as the substrate. Briefly described, the wells of the microtiter plate were each washed five times with 250 ⁇ l wash buffer. Then 50 ⁇ l standard or sample was pipetted into the well and finally 50 ⁇ l freshly diluted 1: 500 second anti-hPTH (1 -3) antibody. The mixture was incubated overnight at 2 to 8 ° C. with gentle shaking, the contents of the wells were removed and the wells were washed five times with 250 ⁇ l of washing buffer.
  • POD-antibody conjugate anti-rabbit IgG fc-specific, cross-absorbed and conjugated with peroxidase; diluted 1: 20,000 in washing buffer
  • the luminescence reaction was carried out by adding 100 ⁇ l of freshly mixed Lumigen TM PS substrate solution and incubating for five minutes at room temperature in the dark.
  • the relative light units (RLU) were then determined in a luminometer. Because of the in the plasma However, the so-called pseudoperoxidase present had a higher background or a lower sensitivity of the test.
  • the antagonistic PTH activity potential was determined by coating a microtiter plate with monoclonal antibody against the hPTH region (7-1 4). 1.0 ⁇ g of MAb (clone against hPTH (7-14)) was added to the wells of a microtiter plate, dissolved in 250 ⁇ l of 60 mM NaHCO 3 , pH 9.6, and the plate was incubated at 4 ° C. overnight. The MAb solution in the wells was removed and each well was washed five times with 200 ⁇ l washing buffer (PBS, pH 7.4 with 0.05% Tween TM -20). Then 250 ul assay buffer was added to each well.
  • PBS pH 7.4 with 0.05% Tween TM -20
  • the bound antagonistic PTH fragments (7-37) were each labeled with 100 ⁇ l of affinity-purified rabbit anti-PTH (24-37) antiserum (diluted 1: 10,000 in assay buffer with 3% (w / v) PEG 6000), as stated above, and after washing with washing buffer quantified by adding 1 00 ⁇ l anti-rabbit IgG fc-specific, cross-absorbed and conjugated with alkaline phosphatase (diluted 1: 20,000 in washing buffer) and in an analogous manner to the active PTH- Fragment quantified by luminescence.
  • the molar difference to the biologically active PTH fragments (with amino-terminal PTH (1 -3) epitope) determined in this method is then a measure of the PTH-antagonistic potential in the sample.
  • the antagonistic capacity of the PTH (4-37) fragments can then be influenced by a factor k ant with the agonistic capacity of the biologically active PTH fragments hPTHd -37) or hPTHd -34), hPTHd -38), hPTHd - 37 + x ) ... hPTH (1-84) can be related.
  • the agonistic and the antagonistic portions of the amino terminal PTH fragments (ie, amino terminal of the amino acid 38) be related 1: 1.
  • the physiological hPTH activity can then essentially be determined as follows.
  • k are factors for the agonistic or antagonistic activity of the various PTH fragments and [hPTH (1-37)], [hPTH (1-84)], [hPTH (1-mid.], [hPTHd -Cterm] and [hPTH (4-37) l, the concentrations of the various fragments in the sample.
  • the term includes hPTH (1-33 ⁇ 38) fragments of 33 to 38 amino acids. in general, the constant k 2 for the Fragments hPTHd-mid), hPTH (l-Cterm) and hPTH (1-84) be approximately equal to k.
  • An activity constant will have to be determined for each individual PTH fragment if the activity constants k u k 2 k 3 ... should be different.
  • the proportion of fragments with mid-regional and C-terminal hPTH immunoreactivity and an hPTH (1-3) epitope will then have to be determined specifically, in an analogous manner to the agonistic and antagonistic fragments of the amino terminal area.
  • PTHrP tumor-typical PTH
  • the determination of the biological PTH activity with the aid of the assay according to the invention also includes the activities of the fragments PTH (1-34), PTH (1-37), PTH (1-
  • Hyperparathyroidism was suspected in a 48-year-old dialysis patient with a calcium metabolic disorder. Sarcoidosis could be excluded due to normal 1,25-hydroxy-vitamin D 3 levels. The patient was irregularly hypercalcemic. A bone biopsy was performed for the pathology (bone cylinder 3 times 1, 2 cm each). Microscopically, a trabecular bone was visible, which was accompanied in some places by a slight endosteal fibrosis. There were increased signs of absorption on the bone surface, some with active osteoclasts. The osteoblast activity was slightly increased. There was no stronger osteoid formation. The bone was mostly lamellar. Hematopoietically active bone marrow was found in the medullary spaces.

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Abstract

Immunoassay zur Bestimmung der Parathormon-Aktivität in einer Probe sowie die Diagnose, Ursachenfindung und Behandlung von Calciumstoffwechselstörungen, Osteopathien und Hyper- oder Hypoparathyreoidismen. Die Parathormon-Aktivität wird gemessen mit Hilfe eines Antikörpers, der an ein Epitop im Bereich der Rezeptorbindungsstruktur 15 bis 22 des Parathormons bindet, und einem Antikörper, der erkennt, ob das aminoterminale Ende 1 bis 3 des Parathormons intakt geblieben ist. Der Assay erlaubt eine Berücksichtigung der antagonistischen Eigenschaften mancher Parathormonfragmente.

Description

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER BIOLOGISCH WIRKSAMEN PARATHORMON-AKTIVITÄT IN EINER PROBE
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Parathormon-Aktivität in einer Probe. Die Erfindung betrifft insbesondere die immunologische Bestimmung der Aktivität von Parathormon (PTH) und seinen Fragmenten in einer Körperflüssigkeit zur Diagnose, Ursachenfindung und Behandlung von Calciumstoffwechselstörungen, Osteopathien und Hyper- oder Hypoparathyreoidismen.
Humanes Parathormon (siehe SWISS-PROT: P01 270, PTHY-HUMAN) ist ein lineares Peptid von 84 Aminosäuren (MW 9500 Da) der Nebenschilddrüse (Glandulae parathyroideae). Es erhöhtden Calcium- und vermindert den Phosphatgehalt des Blutes und ist an der Mobilisierung des extrazellulären Hydroxylapatits der Knochen beteiligt. Der PTH-Gehalt des Blutes ist daher ein wichtiger diagnostischer Parameter bei Patienten mit gestörtem Calciumstoffwechsel und seine Kenntnis erforderlich zur Klärung von 1 ) Vorliegen und Ausmaß eines Hyper- oder Hypoparathyreoidismus, 2) der Quantifizierung der Osteoblastenaktivität, 3) der Quantifizierung der Osteo- klastenaktivität, 4) der Absicherung der Versorgung mit Vitamin-D und aktiven Vitamin- D-Metaboliten, 5) der Abschätzung einer Aluminiumbeladung, 6) der Abschätzung eines eventuellen Östrogenmangels bei postmenopausalen Dialysepatientinnen, 6) der notwendigen Steroid- oder Cyclosporingabe nach Nierentransplantationen, 7) des Behandlungsbedarfs und der Vorbeugung von Knochenmarksveränderungen, urämischen Zuständen und chronischem Nierenversagen.
Die Bestimmung der im Blut wirksamen PTH-Aktivität ist problematisch, da das Peptidhormon in der Zirkulation und von der Leber rasch in aktive und inaktive Fragmente zerlegt wird, beispielsweise durch Spaltung im Bereich der Aminosäuren 34 bis 37. Zudem liegt die physiologische Konzentration von intaktem humanen PTH (hPTH) im Blutplasma nur bei etwa 1 bis 5 pMol/L.
Die Bestimmung von intaktem hPTH( 1 -84) erfolgt im Stand der Technik durch den immunologischen Nachweis von zwei voneinander weit entfernten Epitopen auf dem Peptid. Es gibt jedoch trotzdem viele Patienten mit acht- bis zehnfach erhöhten Ge-
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halten an intaktem PTH( 1 -84) im Blut und niedrignormaler knochenspezifischer alkalischer Phosphatase (Ostase), das heißt, frei von Symptomen einer überhohen PTH-Aktivität. Erklärt wird dies durch falsche Messwerte oder eine PTH-Resistenz der Osteoblasten, beispielsweise durch eine genetisch verminderte Expression von PTH-Rezeptoren. Weiter erschwert wird die Bestimmung der wirksamen PTH-Aktivität dadurch, dass einige PTH-Fragmente eine Aktivität vergleichbar intaktem hPTH(1 -84) besitzen (siehe EP-A 0 349 545), andere PTH-Fragmente wiederum antagonistisch wirken (siehe LePage et al (1 998), Clinicai Chemistry, 44:4, pp805-809; Schmidt-Gayk et al. ( 1 999) Osteologie forum, 5, pp48-58, sowie Verweise) . So weiß man, dass die Fragmente hPTH(3-34) und hPTH(7-34) die Wirkungen des PTH inhibieren (Suva et al. (1 987) Science, 237, 893ff; EP 0 451 867) .
Die WO 96/1 0041 lehrt, dass Antikörper gegen aminoterminale Epitope des PTH biologisch aktives PTH erkennen und dass bei einem Verlust der aminoterminalen Aminosäuren Serin und Valin die Aktivität verloren geht.
Mägerlein et al beschreiben in Arzneim. -Forsch. /Drug Res. 48(l), pp1 97-204 ( 1 998) einen immunoenzymometrischen Assay für die Bestimmung der Konzentration von injiziertem PTH-Fragment 1 -37 bei Pharmakokinetikstudien an Hunden. DerMessbe- reich des Assays reicht von 100 bis 4 pMol/L und endet oberhalb der normalerweise im Serum vorliegenden physiologischen PTH-Gehalte.
Die wahre biologisch wirksame PTH-Aktivität in einer Probe kann zurzeit, wenn überhaupt, nur über die Wirkung auf ein zelluläres System wie bspw. Pheochromo- zytomzellen (PC-1 2) bestimmt werden.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung der gesamten wirksamen Parathormon-Aktivität in einer Probe zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 . Weitere vorteilhafte Ausführungsformen des Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben. Die Erfindung betrifft zudem ein Testsystem sowie Verfahren zur Diagnose und Ausmaß eines Hypo- oder Hyperparathyreoidismus sowie der Ursachenfindung von Calciumstoffwechselstörungen, Osteopathien, Nierenversagen und Erkrankungen, die von einer gestörten Homeostase des Calcium- und Phosphatgehalts des Bluts herrühren.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der biologisch wirksamen PTH- Aktivität in einer Probe ist gekennzeichnet durch die Schritte: (i) Umsetzen der Probe mit einem Antikörper, der ein Epitop auf dem PTH bindet, das im Bereich der Bindungsstruktur an den PTH-Rezeptor liegt; (ii) Umsetzen der Probe mit einem Antikörper, der ein Epitop erkennt, das von den terminalen Aminosäuren 1 bis 3 des PTH gebildet wird; (iii) Bestimmen der Menge der Moleküle, die von beiden Antikörpern erkannt werden; und (iv) Berechnen der biologisch wirksamen PTH-Aktivität in der Probe.
Die vorgenannten Antikörper erkennen bevorzugt Epitope des humanen PTH. Der Antikörper gegen die Rezeptor-Bindungsstruktur bindet bevorzugt ein Epitop, an dem mindestens eine der Aminosäuren 1 5 bis 22 des humanen PTH beteiligt ist. Die Erfindung umfasst zudem ein Verfahren, bei dem ein erster Antikörper an eine feste Phase gebunden ist. Der zweite Antikörper kann eine Markierung tragen oder konjugiert sein mit einem Enzym wie alkalische Phosphatase oder Peroxidase. Das Verfahren erfolgt erfindungsgemäß in einem an sich bekannten Immunoassay, vorzugsweise in einem ELISA, IEMA, ILMA oder LIA. Die Bindung der beiden Antikörper an das PTH erfolgt bevorzugt in Gegenwart von 0,05 bis 0, 1 Gew. % eines milden Detergens wie Tween™-20 oder Triton™X-100, so dass eine Faltung des aminoterminalen Epitops PTH( 1 -3) zur PTH-Rezeptorbindungsstruktur verhindert ist bzw. um das aminoterminale Epitop PTH( 1 -3) für die Bindung des Antikörpers zugänglich zu halten. Da für die biologische Aktivität des PTH sowohl die Rezeptorbindungsstruktur als auch das aminoterminale Epitop PTH( 1 -3) nötig sind, können diese beiden Strukturen vermutlich miteinander wechselwirken. Durch die Gegenwart eines milden Detergens kann die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Assays deutlich verbessert werden. In einer Ausführungsform des Verfahrens wird ein bekanntes Aliquot der Probe zudem mit Antikörpern umgesetzt, die an die PTH-Sequenzen zwischen Aminosäure 4 bis 1 4 und 1 5 bis 37 binden. Die Zahl der Moleküle in einer Probe, die Antikörper gegen das Epitop PTH( 1 -3) und die Rezeptorbindungsstruktur des PTH binden, und die Zahl der Moleküle, die Antikörper gegen die PTH-Bereiche 4 bis 14 und 1 5 bis 37 binden, werden dann zueinander in Beziehung gebracht und die biologisch wirksame PTH-Aktivität ermittelt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Diagnosesystem zur Bestimmung der PTH-Aktivität in einer Probe, das gekennzeichnet ist durch Antikörper, die spezifisch das PTH-Epitop mit den Aminosäuren 1 bis 3 erkennen und Antikörper, die an den Bereich der PTH- Rezeptorbindungsstruktur binden. In einer Ausführungsform weist das Diagnosesystem zudem Antikörper auf, die spezifisch an den Bereich zwischen Aminosäure 4 und 14 binden. In einer weiteren Ausführungsform beinhaltet das System Antikörper, die an den Abschnitt zwischen Aminosäure 24 und 37 des Parathormons binden oder an den mittregionalen Bereich (53 bis 68) oder den C-terminalen (53 bis 84) Bereich des Peptidhormons.
Das erfindungsgemäße Verfahren berücksichtigt im Gegensatz zu früheren Immunoassays die PTH-Aktivität der nicht-intakten PTH-Fragmente und dass scheinbar intaktes PTH biologisch inaktiv ist, wenn die letzte oder die letzten beiden aminoter- minalen Aminosäuren des Peptidhormons fehlen. Auch die antagonistische Aktivität einiger PTH-Fragmente geht in die Bestimmung ein, indem bei dem Verfahren nicht nur die agonistischen, sondern auch die antagonistischen PTH-Fragmente bestimmt werden können. Die antagonistische Aktivität leitet sich ab aus dem Überschuss von
PTH-Rezeptor-Bindungsstruktur zu intaktem PTH-Aminoterminus, d.h. aus der Zahl der PTH-Fragmente, die zwar die Bindungsstruktur für den PTH-Rezeptor enthalten, aber kein intaktes aminoterminales Ende haben. PTH-Fragmente, die weder eine
Rezeptor-Bindungsstruktur mit den Aminosäuren 15 bis 22 noch ein intaktes aminoter- minales Epitop PTH(1 -3) aufweisen, besitzen keine agonistische oder antagonistische
Aktivität.
Herkömmliche immunologische Assays auf sogenanntes "truely intact" hPTH( 1 -84) oder hPTHd -37) geben falsch hohe Aktivitätswerte, da nur aus dem Vorhandensein von funktionell unbedeutenden Epitopen auf eine physiologische Aktivität geschlossen wird. Sie beachten nicht, dass die richtige Faltung bzw. die Bindung an den PTH- Rezeptor von einem intaktem Aminoterminus mit den Aminosäuren H2N-Ser1-Val2 abhängig ist. Die in herkömmlichen Assays oft als "aktives" PTH bestimmten Fragmente hPTH(7-84), hPTH(3-84) oder hPTH(4-37) besitzen aber keine oder anta- gonistische Aktivität. Assays auf der Basis von Antikörpern gegen den mittregionalen (53-68) oder C-terminalen (53-84) Abschnitt übersehen hingegen biologisch aktive PTH-Fragmente des Typs hPTH( 1 -37), hPTH( 1 -32 ~ 36) oder hPTH( 1 -38) .
Auch mit Immunoassays auf der Grundlage von Antikörpern gegen den aminoter- minalen Bereich des PTH bzw. gegen Peptide aus der hPTH( 1 -37)-Sequenz werden falsch Aktivitäten ermittelt, da einerseits die antagonistische Aktivitäten verschiedener Fragmente nicht erfasst wird und andererseits kein positiver Nachweis der biologisch aktiven Struktureinheit erfolgt. Mit polyklonalen Antikörpern oder Antiseren gegen das aminoterminaie Peptid mit den Aminosäuren 1 bis 5 oder 6, werden sogar teilweise antagonistisch wirkende PTH-Fragmente als aktive PTH-Fragmente erkannt.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit dem Arzteinen PTH-Aktivitätswert zur Verfügung, der die physiologische Wirkung der PTH-Fragmente beschreibt. So gibt es Patienten mit Hyperparathyreoidismus, die normale oder verminderte Gehalte an intaktem hPTH( 1 -84) im Serum haben. Der Hyperparathyreoidismus kann dann darauf beruhen, dass diese Patienten die gleichfalls aktiven PTH-Fragmente hPTH ( 1 -37) und hPTH (1 -38) in den Blutstrom sezernieren, so dass sie an einer überhohen PTH- Aktivität und deren Folgen leiden.
Weitere Vorteile, Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen und den anliegenden Zeichnungen. Es zeigt:
Fig. 1 eine Prinzipdarstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 2 ein Vergleich der aminoterminaler PTH-Sequenzen und der Rezeptor- Bindungsstruktur von Mensch, Rind, Schwein und Hund;
Fig. 3 eine Analyse der Bindungsepitope von monoklonalen Antikörpern gegen die Rezeptor-Bindungsstelle des PTH und deren Kreuzreaktion mit benachbarten
PTH-Fragmenten;
Fig. 4a, b eine Analyse der Kreuzreaktion mit verschiedenen hPTH-Fragmenten in einem immunoenzymometrischen Assay; Fig. 5 eine Standardkurve des erfindungsgemäßen LIA-Assays zur Bestimmung der wirksamen PTH-Aktivität in einer Probe.
Siehe Figur 1 mit dem Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Antikörper gegen das aminoterminaie Epitop des humanen PTH mit den Aminosäuren HjN-Ser1- Val2-Ser3 werden gewonnen, indem man eine Immunreaktion gegen eines der nachgenannten Peptide hervorruft.
SEQ Nr. 1
H2N-Ser1-Val2-Ser3-Glu4-lle5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asnl 0-0H
SEQ Nr. 2:
H2N-Ser1-Val2-Ser3-Glu4-lle5-Gln6-Leu7-Met8-His9-0H
SEQ Nr. 3: H2N-Ser1-Val2-Ser3-Glu4-lle5-Gln6-Leu7-Met8-OH
SEQ Nr. 4: H2N-Ser1-Val2-Ser3-Glu4-lle -Gln6-Leu7-OH
SEQ Nr. 5: H2N-Ser1-Val2-Ser3-Glu4-lle5-Gln6-OH
SEQ Nr. 6:
H2N-Ser1-Val2-Ser3-Glu4-lle5-OH
Die Synthese dieser Peptide erfolgt in bekannter Weise bevorzugt auf ein Lysin-Gerüst an einem Wang-Harz. Hierzu wird zunächst an eine an Wang-Harz gebundene C- terminale Aminosäure in drei Kupplungszyklen jeweils Fmoc-L-Lysin(Fmoc)-OH angekoppelt. Durch Abspaltung der Schutzgruppen mit Piperidin werden acht freie Aminofunktionen erhalten, an denen die aminoterminaie Sequenz des human Parathormons synthetisiert werden kann. Das Wang-Harz mit der aminoterminalen PTH-Aminosäuresequenz kann dann direkt - bevorzugt zusammen mit komplettem Freundschem Adjuvans - für eine Immunisierung in ein Tier injiziert werden, bspw. in Maus, Ratte, Kaninchen oder Ziege. Das aminoterminaie PTH-Peptid kann vor einer Immunisierung auch erst abgespalten, isoliert und mit einem Trägerprotein wie Ovalbumin, Rinderalbumin, Thyreoglobulin oder Hämocyanin koppelt werden, bspw. mit Dicyclohexylcarbodiimid. Nach mehreren Booster-Immunisierungen wird die Immunglobuün-Fraktion isoliert, die einen Antikörpertiter gegen das aminoterminaie PTH-Peptid aufweist.
Mit den vorstehend genannten aminoterminalen Peptiden werden regelmäßig Antikörper erhalten, die ein Epitop der ersten beiden aminoterminalen Aminosäuren des hPTH erkennen. Eine Fraktion mit Antikörpern rein gegen das aminoterminaie Epitop hPTH(1 - 3) kann durch Affinitätschromatographie gewonnen werden, wobei an eine feste Phase, bspw. an Wang-Harz oder Polystyrol-Beads, ein hPTH-Peptid mit intaktem aminoterminalen Ende gekoppelt ist. Die gegen das aminoterminaie Ende PTH( 1 -3) gerichteten Antikörper werden daran gebunden, gewaschen und eluiert. Das Eluat wird schließlich über eine zweite Säule geklärt, bei der das an die feste Phase gekoppelte hPTH-Peptid kein intaktes aminoterminales Epitop aufweist, bspw. wie in den nachstehenden Peptidsequenzen SEQ Nr. 7 und SEQ Nr. 8.
SEQ Nr. 7 H2N-Val2-Ser3-GIu -lle5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asn10— Träger
SEQ Nr. 8 H2N-Ser3-Glu -Ile5-Glnβ-Leu7-Met8-His9-Asn10— Träger
In an sich bekannter Weise können auf diesem Weg auch monoklonale Antikörper gegen das aminoterminaie Epitop des PTH gewonnen werden. Polyklonale Antiseren gegen das N-terminale hPTH-Epitop sind aber bevorzugt. Es versteht sich, dass die Schritte der vorstehend beschriebenen Reinigung vertauscht und die zum Aufreinigen und Klären des Serums verwendeten PTH-Peptide länger oder kürzer sein können. Es muss nur das aminoterminaie Epitop hPTH( 1 -3) in einem Fall intakt vorliegen. Für die Gewinnung des zweiten Antikörpers gegen die Sequenz der Rezeptorbindungsstelle des PTH wird intaktes hPTH( 1 -84) oder biologisch aktives hPTH( 1 -37) synthetisiert, an ein Trägerpeptid gekoppelt und mit komplettem Freundschen Adjuvans in ein Tier, bspw. in Maus, Ratte, Kaninchen oder Ziege, injiziert.
SEQ Nr. 9
Ser1-Val2-Ser3-Glu -Ile5-Gln6-Leu7-Met8-His9-Asnl0-Leu1 l-Gly12-Lysl 3-Hisl4-Leu15-Asn16- Ser17-Metl8-Glu19-Arg20-Val2 -Glu22-Trp23-Leu24-Arg25-Lys26-Lys27-Leu28-Gln29-Asp30-Val31- His32-Asn33-Phe34-Val35-Ala36-Leu37
Eine Kopplung an ein Trägerpeptid ist für die Erzeugung einer Immunreaktion nicht unbedingt erforderlich, da die PTH-Sequenzen zwischen Mensch, Rind, Schwein und Ratte insbesondere im Bereich der Rezeptorbindungsstelle zwischen Position 1 5 und 22 variieren und somit antigen sind (siehe Fig. 2). Gegenüber dem humanem PTH( 1 - 37)-Fragment unterscheidet sich bspw. das bovine PTH in den Positionen 1 (Ala), 7 (Phe) und 1 6 (Ser), Ratten-PTH in den Positionen 1 (Ala), 1 6 (Ala), 1 8 (Val) und 36 (Ser), porcines PTH in den Positionen 1 6 (Ser) und 1 8 (Leu) sowie canines PTH in den Position 7 (Ser) und 1 6 (Ser) (Heinrich G. et al ( 1 984) J. Biol. Chem. 259:3320-3329; Kronenberg H.M. et al ( 1 979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:4981 -4985; Schmelzer H.-J., et al. ( 1 987) Nucleic Acids Res. 1 5 :6740-6740; Rosol T et al. ( 1 995) Gene 1 60:241 -243). Die Kopplung an einen Träger empfiehlt sich für die Immunisierung, da die genannten Peptide nicht nur immunogen, sondern auch biologisch aktiv sein können.
Die Synthese von hPTHd -37) erfolgt wie in Beispiel 2 der WO 91 /06564 beschrieben. Die vorgenannten Peptide und ihre Derivate können auch durch Genexpression in einem geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtsorganismus hergestellt und chromatographisch aufgereinigt werden. Neben dem vorgenannten Peptid sind auch die Peptide hPTH( 1 -32), hPTH( 1 -33), hPTH( 1 -34), hPTH( 1 -38) und andere biologisch aktive hPTH-Fragmente für die Gewinnung von Antikörpern gegen die Rezeptorbindungssequenz des hPTH geeignet.
Nach mehreren Immunisierungsboostern mit aufgereinigtem hPTH-Peptid oder Fragment wird dann die Immunglobulinfraktion aus dem Serum des immunisierten Tieres isoliert und auf deren Bindung an die Rezeptorstelle des hPTH getestet. Hierzu wird das nachstehende Heptapeptid hPTH( 1 5-22)
SEQ NR. 9 Leu15-Asn16-Ser17-Met18-Glu19-Arg20-Val2l-Glu22— Träger
auf einem makroskopischen Träger wie Polystyrol-Beads oder Polystyrol-Pins synthetisiert und Antikörper, die spezifisch die Rezeptorbindungsstruktur des hPTH binden, durch Affinitätschromatographie isoliert. Mit Hilfe der Peptid-Pin-Technik können so auch monoklonale Antikörper gegen die Rezeptorbindungsstruktur des PTH gefischt und Klone, deren Antikörper die Rezeptorbindungsstruktur erkennen, vereinzelt werden. Es versteht sich, dass anstelle des o.g. Heptapeptids auch ein Hexapeptid oder wenig längere Sequenzen von der Rezeptorbindungsstelle verwendet werden können.
Mit den Antikörpern gegen das N-terminale Epitop des hPTH( 1 -3) und die Rezeptorbindungsstruktur hPTH( 1 5-22) stehen Antikörper zur Verfügung, welche die funktionell aktive Struktur erfassen.
Erfindungsgemäß erfolgt der Immunoassay auf die aktive Struktur des hPTH unter leicht denaturierenden Bedingungen, so dass im entfalteten Peptid beide Epitope für eine Bindung an die Antikörper frei sind. Dies erfolgt durch den ansonsten unüblichen Zusatz eines Detergens wie Tween-20 oder Triton-X-1 00 im Bindungspuffer. Die Detergentien werden bevorzugt in einer Menge von 0,01 bis 1 Gew. %, besonders bevorzugt in einer Menge von 0, 1 bis 0,3 Gew. %, in den Bindungspuffer gegeben.
Antagonistische hPTH-Fragmente sind gekennzeichnet durch eine PTH-Rezeptorbin- dungstelle und das Fehlen eines intakten aminoterminalen Epitops hPTH( 1 -3) . Die antagonistische Aktivität einer Probe ist somit proportional zur Zahl der PTH- Fragmente, welche die Rezeptorbindungsstelle zwischen Position 1 5 und 22 enthalten, aber von Antikörpern gegen das aminoterminaie Epitop hPTH(1 -3) nicht gebunden werden. Die antagonistische Aktivität lässt sich also ermitteln aus der Differenz zwischen der Zahl der Moleküle, die vom Antikörper-Doppel gegen die Rezeptorbindungsstelle und den Aminoterminus hPTH( 1 -3) erkannt werden, und der Zahl der Fragmente, die vom Antikörper-Doppel gegen die Rezeptorbindungsstruktur (oder einem N-terminalen Epitop zwischen Aminosäure 24 und 37) und einem Epitop im Bereich der Aminosäuren 4 und 1 4 erkannt wird. Die letztgenannte Größe ist in der Praxis gleich der Zahl der hPTH-Fragmente, die vom Antikörper-Doppel gegen die Abschnitte hPTH(9-1 8) und hPTH{24-34) erkannt wird, nicht aber von Antikörpern gegen das hPTH( 1 -3)-Epitop.
Die Antikörper gegen den Bereich hPTH(4-14) fallen bei der Aufreinigung der Antikörper gegen das hPTH(1 -3)-Epitop an. Sie sind in der Antikörperfraktion enthalten, die an das aminoterminaie Peptid hPTH(2-1 0) mit unvollständigem hPTH-End-Epitop (siehe oben) binden. Derartige Antikörper können auch spezifisch hergestellt werden, z.B. wie in der WO 96/1 0041 oder in Tampe et al. (J. Immunoassay ( 1 992), 1 3( 1 ), pp. 1 -1 3) beschrieben. Damit sich die Antikörper gegenseitig nicht stören, kann es hierbei vorteilhaft sein, zwei Antikörper mit etwas weiter auseinander liegenden Bindungsstel- len auf dem hPTH(1 -37) auszuwählen, bspw. wie oben als Alternative angegeben. Liegen die Bindungsstellen zu weit auseinander oder weit C-terminal der Rezeptorbindungsstelle zwischen Position 1 5 und 22, so besteht die Gefahr, dass auch nicht- inhibierende hPTH-Fragmente als Antagonisten erfasst werden.
Der erfindungsgemäße Immunoassay der biologischen PTH-Aktivität kann im Übrigen mit bestehenden PTH-Immunoassays kombiniert werden. So kann bei einigen Diagnosen angezeigt sein, nicht nur die biologische Aktivität des hPTHs zu messen, sondern auch die Menge und Verteilung der hPTH-Moleküle einer bestimmten Länge. Das heißt, es kann vorteilhaft sein, einen hPTH-Assay zu haben, der neben den Antikörpern gegen das aminoterminaie hPTH(1 -3) auch Antikörper mit mittregionaler (53-68) oder C-terminaler (53-84) Spezifität verwendet. Mit einem solchen PTH-Assay kann dann die effektive PTH-Aktivität in Beziehung gesetzt werdem zu einzelnen PTH- Molekülen bestimmter Länge. Hierdurch lassen sich insbesondere die Ursache bestimmterHyper- und Hypoparathyreoidismen erklären. Erfindungsgemäß umfasst der PTH-Aktivitätsassay auch die zusätzliche Bestimmung von hPTH-Molekülen mit einem intakten Carboxyterminus und Antikörper gegen den mittregionalen oder C- terminalen Bereich des hPTH. Das Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von PTH und seinen Fragmenten in einer Probe kann verwirklicht werden als EIA, ELISA, RIA, IRMA, LIA oder ILMA, FIA oder IFMA, als ein manuelles Testsystem oder bevorzugt in einer auf Automaten angepasste Version in Flüssigphasen- oder Festphasentechnik.
BEISPIELE
Beispiel 1 Antikörper gegen das hPTH(1-3)-Epitop
Zunächst wurde eine dreifache Lysin-Verzweigung auf einem Wang-Harz hergestellt. Hierzu wurde an C-terminales Alanin, gebunden an Wang-Harz, in drei Kupplungszyklen jeweils Fmoc-L-Lysin(Fmoc)-OH gebunden. Die Abspaltung der Fmoc-Gruppen erfolgte dann mit 20% Piperidin und 2% 1 ,8-Diazabicyc!o[5,4,0]undec-7-en (DBU) in NN- Dimethylformamid, NN-Dimethylacetamid. An die freien Aminogruppen erfolgte dann die Synthese des N-terminalen Hexapeptids hPTH( 1 -6) in an sich bekannter Weise durch eine Festphasensynthese und Kopplung der C-terminalen Aminosäuren mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid als Koppiungsmittel. Das Peptid
H2N-Ser1-Val2-Ser3-Glu -lle5-Gln6-(3 x Lys)-Ala-Träger
wurde dann vom Träger abgespalten und deblockiert bei Raumtemperatur durch 30 bis 90 Minuten Behandeln mitTrifluoressigsäure, die 5% Scavenger, Wasser, Ethandiol und Phenol enthielt. Das Peptid wurde mit Trifluoressigsäure gewaschen, mit tert- Butylmethylether aus wässriger Lösung ausgefällt. Das Rohprodukt wurde über eine C 1 8-Reverse-Phase-Säule ( l O m, Puffer A: 0,01 N HCI in Wasser; Puffer B: 20% Isopropanol, 30% Methanol, 50% Wasser, 0,01 N HCL; Gradient: 1 0-80% in 60 Minuten ausgefällt) chromatographisch aufgereinigt.
1 mg aufgereinigtes Peptid hPTH(1 -6) wurde dann in wässriger Lösung bei Raumtemperatur mit der Carbodiimid-Methode an 10 mg Rinderserumalbumin gekoppelt und das gekoppelte Peptid mit Isopropanol aus der wässrigen Lösung gefällt. Das Peptide wurde in PBS aufgenommen und aliquotiert. Für die Erstimmunisierung wurde 1 25 μg Peptid-Träger-Konjugat in 250μl PBS gelöst, mit einem doppelten Volumen komplettes Freundsches Adjuvans emulgiert und die Emulsion in ein Kaninchen an verschiedenen Stellen, in mehreren Einheiten subcutan injiziert. Nach 2 und 4 Wochen folgten weitere Booster-Injektionen mit Peptid und inkomplettem Freundschem Adjuvans.
Nach 6 Wochen wurden 50 ml Blut entnommen und Antikörper gegen das aminoterminaie hPTH(1 -3)-Epitop gewonnen durch sequentielle Affinitätschromatographie durch Bindung an Protein-A, Bindung an das Peptid hPTH(1 -6) und Klären über eine hPTH(2-1 0)-Peptidsäule. Im letzten genannten Schritt fielen nach der weiteren Eluierung auch Antikörper gegen hPTH(3-6) an, die zum Nachweis antagonistischer PTH-Fragment verwendet werden können.
Beispiel 2 Antikörper gegen die Rezeptor-Bindungsstruktur
Die Synthese von hPTHd -37) erfolgte wie in Beispiel 2 der WO 91 /06564 beschrieben. Für die Immunisierung wurde 25 μg Peptid hPTH(1 -37), gebunden an Wang-Harz, in 50 μl PBS intraperitoneal in eine Maus injiziert. Nach 2 und 4 Wochen erfolgte ein Boostern mit je 50μl Peptid hPTH(1 -37) an Wang-Harz. Es wurden in an sich bekannter Weise monoklonale Antikörper-Klone hergestellt und die verschiedenen gepoolten Klone an hPTH( 1 5-22)-Heptapeptid, synthetisiert auf Polystyrol-Pins (siehe Tampe et al., J. Immunassay (1 992), 1 3( 1 ), pp. 1 -1 3), getestet. Bei vier Klonen wurden die Bindungsepitope mit hPTHd -1 0), hPTH(9-1 8), hPTHd 6-24) und hPTH(24-37) nachkartiert und auf eventuelle Kreuzreaktivität untersucht. Figur 3 zeigt eine Analyse der monoklonalen Antikörper gegen die Rezeptor-Bindungsstelle des PTH und sowie deren Kreuzreaktion mit den weiteren PTH-Fragmenten.
Beispiel 3 Untersuchung der Kreuzreaktivität zu nicht-aktiven Fragmenten
Synthetisches hPTH(1 -84) (Bachern AG) und verschiedene hPTH-Fragmente mit und ohne intaktem aminoterminalen Endepitop wurden in gleichen Mengen Serum gelöst und die resultierenden PTH-Aktivitäten bzw. die Wiederfindung der biologisch aktiven PTH-Fragmente in einem immunoenzymometrischen Assay (IEMA) bestimmt. Als Primärantikörper wurde der monoklonale Antikörper mAK 1 3/C631 5 gegen die Rezeptorbindungsstelle eingesetzt und an die feste Phase gebunden. Der Sekundärantikörper war polyklonales Kaninchen-anti-hPTH(1 -3)-lgG. Die Farbreaktion erfolgte mit Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG und dem ABTS-System von Röche Diagnostics, Mannheim (ABTS = 2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolin- sulfonat) . Es wurde die Extinktion bei 405 nm gemessen.
Figuren 4a und b zeigen die Kreuzreaktion mit verschiedenen hPTH-Fragmenten in zwei verschiedenen Versuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass PTH-Fragmente ohne die letzten zwei aminoterminalen Aminosäuren im Test nicht erkannt werden und alle aktiven PTH-Fragmente im Wesentlichen eine einheitliche Kurvenschar bilden. Unterschiede beruhen auf differierenden Reinheitsgraden der Präparationen, Ein- wageungenauigkeiten und der Schwierigkeit einer genauen Mengenbestimmung bei Peptiden.
Beispiel 3 Antikörper gegen hPTH(4- 14), hPTH(7- 14) und hPTH(24-37)
Es wurden zwei polyklonale Antiseren aus Ziege und Maus sowie zwei monoklonale Antikörper, welche die hPTH-Region zwischen Aminosäuren 7 und 14 erkennen, wie von Tampe et al. (J. Immunoassay (1 992) 13(1 ), pp1 -1 3) beschrieben, hergestellt. Die Antikörper gegen die hPTH(24-37)- und die hPTH(4-1 4)-Region wurden wie in der WO 96/1 0041 beschrieben hergestellt.
Beispiel 4 Bestimmung der wirksamen PTH-Aktivität in einer Probe
Um die Nachweisgrenze zu erniedrigen wurden die Konzentrationsverhältnisse optimiert und als Detektionssystem alkalische Phophatase in Verbindung mit Lumineszenz- verfahren eingesetzt. Bei Verwehdung von Peroxidase und einem Lumineszenzverfahren kann im Blutplasma vorhandene Pseudoperoxidase die Nachweisgrenze nachteilig heben. (/') Beschichten einer Mikrotiterplatte mit monoklonalem Antikörper gegen die
P TH-Rezep torbin dungss truk tur In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurde jeweils 1 ,0μg MAk 77/78 (Subklon gegen Rezeptorbindungsstelle hPTH ( 1 5-22)) gegeben, gelöst in 250 μl 60 mM NaHC03, pH 9,6, und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die MAk-Lösung in den Vertiefungen wurde entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit 200 μl Waschpuffer (PBS, pH 7.4 mit 0.05 % Tween-20) gewaschen. Dann wurde in jede Vertiefung 250 μl Assaypuffer gegeben. Für den Assaypuffer wurde 5 g Casein in 100 ml 0, 1 N NaOH gelöst und mit PBS, pH 7,4, mit 0, 1 Gew. % Triton™-X 100 auf 1 L Volumen aufgefüllt. Die Lösung wurde eine Stunde gekocht, das Volumen mit destilliertem Wasser auf einen Liter ergänzt, der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und 0, 1 g Thimerosal zur Vermeidung von Mikrobenwachstum zugefügt. Die Vertiefungen in der Mikrotiterplatte wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit Assaypuffer inkubiert, dann der Assaypuffer entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen.
(ii) Probenvorbereitung
Es wurde venöses Blut in EDTA-Röhrchen gesammelt (ca. 1 ,5 bis 2 mg K2EDTA pro
Milliliter Blut), geschüttelt, und nach einer Gerinnungszeit von 1 0 bis 1 5 Minuten mit 1 800 x G 1 0 Minuten zentrifugiert. Der Plasmaüberstand wurde 1 : 1 mit Assaypuffer verdünnt und bei -20°C bis zum Test aufbewahrt. Enthielten die Proben mehr als 800 pMol/L PTH, wurde der Überstand 1 : 1 0 mit Assaypuffer verdünnt. Vor einem Einsatz in den ELISA wurden die Proben kurz bei maximaler Drehzahl zentrifugiert.
(iii) Bindung von intaktem PTH(1-84) und PTH-Fragmenten mit Rezeptor-
Bin dungss truk tur Es wurde jeweils 100 μl verdünnter EDTA-Serumüberstand in Assaypuffer eine halbe Stunde bei Raumtemperatur in die vorbereiteten Vertiefungen unter Rütteln inkubiert. Dann wurden die Lösungen aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen.
(iv) Bestimmung der Bindung von aktivem PTH
Es wurde jeweils 100 μl affinitätsgereinigtes Kaninchen-anti-PTH(1 -3-Epitop)-Antiserum ( 1 : 1 0 000 verdünnt in Assaypuffer mit 3 % (w/v) PEG 6000) in die Vertiefungen gegeben und eine Stunde im Dunkeln und unter Rütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösungen wurden aus den Vertiefungen entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen. Die quantitative Bestimmung erfolgte mit 100 μl anti-Kaninchen-IgG, fc-spezifisch, kreuzabsorbiert und konjugiert mit alkalischer Phosphatase ( 1 :20 000 verdünnt in Waschpuffer) . Es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Antikörper-Lösungen abgenommen und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen. Für die Farbreaktion wurden 100 μl Lumi-Phos™ Plus [gebrauchsfertige Lösung mit 4-Methoxy- 4-(3-phosphatphenyl)spiro[ 1 ,2-dioxetan-3,2'-adamantan]-Dinatriumsalz und zuge- hörigem Enhancer (Lumigen, Michigan, US) in 2-Amino-2-methyl-1 -propanol-Puffer (pH 9.6)1 in die Vertiefungen gegeben. Die Messung der Lumineszenz erfolgt im Anschluss bei 470 nm in einem Luminometer.
Als Standard wurden Lösungen von PTH( 1 -84) in Assaypuffer mit folgenden Konzentrationen eingesetzt: 0, 0, 1 , 1 , 1 0, 100 und 1000 pMol/L. Die Standardkurve mit alkalischer Phospatase für die Nachweisreaktion zeigt, dass dieses System die Bestimmung von einigen Hunderstel pMol PTH pro Liter erlaubt.
Bei der Verwendung von Peroxidase für die Nachweisreaktion wurde Lumigen™ PS-1 als Substrat verwendet. Kurz beschrieben wurden die Vertiefungen der Mikrotiterplatte jeweils fünfmal mit 250 μl Waschpuffer gewaschen. Dann wurde 50μl Standard bzw. Probe in die Vertiefung pipettiert und schließlich 50 μl frisch 1 :500 verdünnter zweiter anti-hPTH( 1 -3)-Antikörper. Es wurde über Nacht bei 2 bis 8 °C mit sanftem Rütteln inkubiert, der Inhalt der Vertiefungen abgenommen und die Vertiefungen jeweils fünf mal mit 250 μl Waschpuffer gewaschen. Für die Nachweisreaktion wurde 1 00 μl POD-Antikörper-Konjugat (anti-Kaninchen-IgG fc-spezifisch, kreuzabsorbiert und konjugiert mit Peroxidase; 1 :20000 verdünnt in Waschpuffer) zugegeben, eine Stunde bei Raumtemperatur unter Rütteln inkubiert, die Lösungen abgenommen und die Vertiefungen fünfmal mit 250μl Waschpuffer gewaschen. Die Lumineszenzreaktion erfolgte durch Zugeben von 1 00μl frisch gemischter Lumigen™PS-Substratlösung und fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln. Es wurden dann die relativen Lichteinheiten (RLU) in einem Luminometer bestimmt. Aufgrund der im Plasma vorhandenen sogenannten Pseudoperoxidase war der Hintergrund aber höher bzw. die Empfindlichkeit des Tests geringer.
(v) Bestimmung antagonistischer PTH-Fragmente Das antagonistische PTH-Aktivitätspotential wurde bestimmt durch Beschichten einer Mikrotiterplatte mit monoklonalem Antikörper gegen die Region hPTH(7-1 4) . In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurde jeweils 1 ,Oμg MAk (Klon gegen hPTH (7-14)) gegeben, gelöst in 250 μl 60 mM NaHC03, pH 9,6, und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die MAk-Lösung in den Vertiefungen wurde entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit 200 μl Waschpuffer (PBS, pH 7.4 mit 0.05% Tween™-20) gewaschen. Dann wurde in jede Vertiefung 250 μl Assaypuffer gegeben. Die Vertiefungen in der Mikrotiterplatte wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit Assaypuffer inkubiert, der Assaypuffer entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen. Für die Bindung antagonistischer PTH-Fragmente wurde jeweils 10Oμl verdünnter EDTA-Serumüberstand in Assaypuffer eine halbe Stunde bei Raumtemperatur in der Vertiefung unter Rütteln inkubiert. Die Lösung wurde aus der Vertiefungen entfernt und die Vertiefung fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen. Die gebundenen antagonistischen PTH-Fragmente-(7-37) wurden mit jeweils 100 μl affinitätsgereinigtem Kaninchen-anti-PTH(24-37)-Antiserum (1 : 10000 verdünnt in Assaypuffer mit 3% (w/v) PEG 6000) markiert, wie oben angegeben, und nach Waschen mit Waschpuffer quantitativ bestimmt durch Zugabe von 1 00 μl anti-Kaninchen-IgG fc-spezifisch, kreuzabsorbiert und konjugiert mit alkalischer Phosphatase ( 1 :20 000 verdünnt in Waschpuffer) und in analoger Weise wie die aktiven PTH-Fragment durch Lumineszenz quantifiziert.
Die in diesem Verfahren bestimmte molare Differenz zu den biologisch aktiven PTH- Fragmenten (mit aminoterminalem PTH( 1 -3)-Epitop) ist dann ein Maß für das PTH- antagonistische Potential in der Probe. Das antagonistische Vermögen der PTH (4-37)- Fragmente kann dann über einen Faktor kant mit dem agonistischen Vermögen der biologisch aktiven PTH-Fragmente hPTHd -37) bzw. hPTHd -34), hPTHd -38), hPTHd - 37 + x) ... hPTH( 1 -84) in Beziehung gesetzt werden.
In der Regel wird es ausreichen, wenn die agonistischen und die antagonistischen Anteile der aminoterminalen PTH-Fragmente (d.h., aminoterminal der Aminosäure 38) 1:1 in Beziehung gesetzt werden. Für einige Indikationen kann es aber vorteilhaft sein, die einzelnen Anteile an biologisch aktivem hPTH(1-84), hPTH(l-mid) [mid. = PTH-Fragment mit mittregionaler Spezifität 53-68], hPTHd-Cterm) [Cterm = PTH- Fragment mit C-terminaler Spezifität 53-84] mit den aktiven hPTH(1 -33-38)- Fragmenten und den inhibierenden hPTH(4-37) zueinander in Beziehung zu setzen. Die physiologische hPTH-Aktivität kann dann im Wesentlichen wie folgt ermittelt werden.
V>TΗ~Α\rt- = k, [hPTH(l-32/ 138) ] +kx __£[hPTH(l-X/mid/cterm) ] +k2 ± [hPTlHl-84) ] k,[hPTH(4-25 bis 84)]
wobei k Faktoren für die agonistische bzw. antagonistische Aktivität der verschiedenen PTH-Fragmente sind und [hPTH(1-37)], [hPTH(1-84)], [hPTH(1-mid.], [hPTHd -Cterm] und [hPTH(4-37)l die Konzentrationen der verschiedenen Fragmente in der Probe. Dabei versteht sich, dass die Bezeichnung hPTH(1-33~38) Fragmente mit 33 bis 38 Aminosäuren umfasst. In der Regel wird die Konstante k2 für die Fragmente hPTHd-mid), hPTH(l-Cterm) und hPTH(1-84) ungefähr gleich k, sein. Für jedes einzelne PTH-Fragment wird eine Aktivitätskonstante zu ermitteln sein, wenn die Aktivitätskonstanten ku k2 k3... verschieden sein sollten. Der Anteil der Fragmente mit mittregionaler und C-terminaler hPTH-lmmunreaktivität und einem hPTH(1-3)-Epitop wird dann eigens zu bestimmen sein und zwar in analoger Weise wie die agonistischen und antagonistischen Fragmente des aminoterminalen Bereichs.
In der Regel wird aber nachstehende vereinfachte Gleichung den Anforderungen genügen.
k, [hPTH{l-32 bis 38) ] + k,[hPTH(l-84)' PTH-Aktivität = — 2 ic, [hPTHXk-25 bis 84) ]
wobei k,, k2 und k3 in erster Näherung gleich gesetzt werden können. Beispiel 5 Diagnose von primärem Hyperparathyreoidismus
Fallstudie 1
Abklärung des Verdachts eines Hyperparathyreoidismus bei einer 57-jährigen Patientin mit Hypercalciämie. Eine Tumorhypercalciämie wurde ausgeschlossen durch O-Sono, CT-Thorax, CT-Abdomen, MRT-Abdomen, Gastroskopie und Coloskopie. Für das Vorliegen eines primären Hyperparathyreoidismus sprachen die Befunde Hypophosphaturie, leicht erhöhte cAMP-Ausscheidung, ein erhöhter Quotient von Calcium-Clearance zu Creatinin-Clearance und zudem der klinische Verlauf mit ansteigenden Calcium- werten, die Nephrocaicinose mit Niereninsuffizienz, typische Depressionen, rezidive Pankreatitis und grenzgradige Osteopathie am Schenkelhals. Zudem wäre bei einer Tumorhypercalciämie ein niederer PTH-Spiegel zu erwarten. Die einschlägigen Laborwerte vom Plasma waren aber wie folgt:
Figure imgf000020_0001
PTHrP: tumortypisches PTH
Es lag somit auch keine Sarkoidose bzw. eine Vitamin-D vermittelte Hypercalciämie vor. Dafür waren die Werte für 25-Hydroxy-Vitamin-D3 und 1 ,25-Vitamin-D3 zu nieder. Ein Therapieversuch mit Prednison führte zu keiner Senkung des Calciums. Zudem wäre bei einer Vitamin-D-vermittelten Hypercalciämie ein niederer PTH-Spiegel zu erwarten.
Die Bestimmung der biologischen PTH-Aktivität mit Hilfe des erfindungsgemäßen Assays, umfassend auch die Aktivitäten der Fragmente PTH(1 -34), PTH(1 -37), PTH(1 -
38) und aminoterminaie Teil von PTH( 1 -84), einschließlich intakt-PTH( 1 -84) - nicht aber der PTH-Fragmente PTH(3-37/38) und PTH(3-84) - zeigte eine überhöhe PTH-Akti- vität im Serum der Patientin (nämlich 37 pMol, 31 pMol, 22 pMol und 30 pMol bioaktive PTH-Fragmente pro Liter an 4 verschiedenen Tagen innerhalb eines Monats), entsprechend dem 3- bis 4-f achen der normalen PTH-Aktivität, so dass die Diagnose primärer Hyperparathyreoidismus labordiagnostisch fassbar wurde. Wegen des eindeutig erhöhten PTH-Fragments 1 bis 38 im Serum war somit von der Sekretion eines N-terminalen Fragments des PTH auszugehen, während eine Niereninsuffizienz in der Regel nicht zu einer Akkumulation von N-terminalen, sondern von mittregionalen und C-terminalen Fragmenten des PTH führt.
Fallstudie 2
Bei einem 48-jährigen Dialyse-Patienten mit einer Calciumstoffwechselstörung bestand Verdacht auf Hyperparathyreoidismus. Eine Sarkoidose konnte aufgrund normaler 1 ,25-Hydroxy-Vitamin-D3-Spiegel ausgeschlossen werden. Der Patient war unregelmäßig hypercalcemisch. Für die Pathologie wurde eine Knochenbiopsie vorgenommen (Knochenzylinder 3 mal je 1 ,2 cm). Mikroskopisch war ein trabekulärer Knochen zu sehen, der stellenweise von einer leichter endostalen Fibröse begleitet war. An der Knochenoberfläche bestanden vermehrte Resorptionsspuren, zum Teil mit aktiven Osteoklasten. Die Osteoblastenaktivität war geringfügig gesteigert. Es bestand keine stärkergradige Osteoidbildung. Der Knochen war zumeist lamellär auf- gebaut. In den Markräumen war hämatopoetisch aktives Knochenmark.
Es lag somit scheinbar eine Osteopathie vom Typ eines Hyperparathyreoidismus vor. Die Osteopathie war aktiv. Der bisher eingetretene Umbau gering. Für eine Mineralisationsstörung (Osteoidose, Osteomalazie) bestand kein Anhalt. Gleichfalls bestand kein Anhalt für ein Plasmozytom. Nichtsdestotrotz waren die gemessenen Werte an intaktem PTH nicht erhöht. Die Laborwerte waren wie folgt:
Figure imgf000022_0001
Wegen dieses Befunds war eine partielle Parathyreoidektomie empfohlen worden. Dererfindungsgemäße Immunoassay derbiologisch wirksamen PTH-Aktivitätzeigte auf, dass auch insgesamt keine erhöhte PTH-Aktivität vorlag, so dass die chirurgischen Behandlung zurückgestellt werden konnte.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Verfahren zur Bestimmung der Parathormon-Aktivität in einer Probe, gekennzeichnet durch die Schritte:
Umsetzen einer Probe mit einem Antikörper, der ein Epitop erkennt im Bereich der Rezeptorbindungsstruktur des Parathormons;
Umsetzen der Probe mit einem Antikörper, der ein Epitop erkennt, das von den N-terminalen Aminosäuren 1 bis 3 des Parathormons gebildet wird und die N-terminale Aminosäure enthält;
Bestimmen der Zahl der Moleküle, die von beiden Antikörpern erkannt werden; und/oder
Berechnen der wirksamen Parathormon-Aktivität aus der Zahl der Moleküle in der Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei ein Antikörper an den Bereich zwischen Aminosäure 1 5 und 22 des humanen Parathormons bindet.
3. Verfahren nach Ansprüche 1 oder 2, wobei ein Antikörper an eine feste Phase gebunden ist und der andere Antikörper eine Markierung trägt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Bindung der beiden Antikörper in Gegenwart von 0,05 bis 0, 1 Gew. % eines leichten Detergens erfolgt.
5. Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 4, wobei ein bekanntes Aliquot der Probe mit zwei Antikörpern umgesetzt wird, die an die Parathormon-Sequenzen zwischen Aminosäure 4 bis 1 4 und 1 5 bis 37 binden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zahl der Moleküle in einer Probe, die von den Antikörpern gegen das Epitop mit den Aminosäuren 1 bis 3 und die Rezeptorbindungsstelle des Parathormons gebunden werden, und die Zahl der Moleküle, die von Antikörpern gegen die Parathormon- Regionen zwischen den Aminosäuren 4 und 14 beziehungsweise 1 5 bis 37 gebunden werden, zur Bestimmung der physiologisch wirksamen Parathormon- Aktivität zueinander in Beziehung gebracht werden.
6. Diagnosesystem zur Bestimmung der Parathormon-Aktivität in einer Probe, gekennzeichnet durch Antikörper, die spezifisch das Parathormon-Epitop mit den Aminosäuren 1 bis 3 erkennen und Antikörper, die an den Bereich der Rezeptorbindungsstelle des Parathormons binden.
7. Diagnosesystem nach Anspruch 8, das weiterhin beinhaltet Antikörper, die spezifischen an den Bereich zwischen Aminosäure 4 und 14 des Parathormons binden.
8. Diagnosesystem nach Anspruch 6 oder 7, das weiterhin beinhaltet Antikörper, die spezifisch an Bereich zwischen Aminosäure 24 und 37 des Parathormons binden.
9. Verfahren zur Diagnose und Ausmaß eines Hypo- oder Hyperparathyreoidismus, dadurch gekennzeichnet, dass das in den Ansprüchen 1 bis 6 beanspruchte Verfahren zur Bestimmung der PTH-Aktivität in einer Probe zur Anwendung gelangt.
1 0. Verfahren zur Ursachenfindung von Calciumstoffwechselstörungen, Osteo- pathien, Nierenversagen und Erkrankungen, die von einer gestörten Homeostase des Calcium- und Phosphatgehalts des Bluts herrühren, dadurch gekenn- zeichnet, dass das in den Ansprüchen 1 bis 6 beanspruchte Verfahren zur
Bestimmung der PTH-Aktivität in einer Probe zur Anwendung gelangt.
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1151307A1 (de) 1999-01-14 2001-11-07 Scantibodies Laboratory, Inc. Verfahren zum differenzieren und überwachen von parathyroid und krankheiten, die mit dem zustand der knochen verbunden sind
WO2003003986A2 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Parathyroid hormone antibodies and related methods
WO2002082092A3 (de) * 2001-04-03 2003-03-20 Abc Armbruster Biochemicals Bestimmung der wirksamen parathormon-aktivität in einer probe
JP2008521824A (ja) * 2004-11-29 2008-06-26 ジェイ． ザーラドニク、リチャード 生理活性インタクト副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）１−８４に対する選択的結合特異性を有する抗体および同抗体を作製するためのペプチド抗原
EP1643894A4 (de) * 2003-07-10 2009-06-10 Scantibodies Lab Inc Verfahren, kits und antikörper zum nachweis von parathyroid
EP2631247A1 (de) 2012-02-22 2013-08-28 Immundiagnostik AG Mittel und Verfahren zum Messen des Parathyroid-Hormons bei unter oxidativem Stress leidenden Patienten
EP2775306A1 (de) 2013-03-08 2014-09-10 Immundiagnostik AG Nicht oxidiertes, biologisch aktives Parathormon zur Bestimmung der Sterblichkeit bei Hämodialysepatienten
WO2019141791A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Immundiagnostik Ag Biomarker predicting coronary artery disease

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6838264B2 (en) * 2000-12-05 2005-01-04 Immutopics, Inc. Antibodies and peptide antigens for producing antibodies having a selective binding specificity to bioactive intact parathyroid hormone (PTH) 1-84
US20050170443A1 (en) * 2003-10-03 2005-08-04 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods and use of binding components for improving assay specificity
EP3108259B1 (de) 2014-02-20 2018-12-05 Immundiagnostik AG In-vitro-diagnose und -prognose von kontrastinduzierter nephropathie (cin) in patienten, die einer koronarangiographie unterzogen werden
US11120478B2 (en) * 2015-01-12 2021-09-14 Ebay Inc. Joint-based item recognition
EP3499235A1 (de) 2017-12-13 2019-06-19 Immundiagnostik AG Verfahren zur messung von autoantikörpern in körperflüssigkeiten
CN109188000A (zh) * 2018-08-08 2019-01-11 施康培医疗科技（武汉）有限公司 一种便携式检测人甲状旁腺激素的试纸条及其制备方法
US12492974B2 (en) 2018-08-20 2025-12-09 Immundiagnostik Ag Sorbent composition for pre-analytical treatment of samples
JP7639420B2 (ja) * 2021-03-16 2025-03-05 東ソー株式会社 パラチロイドホルモンの測定方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4434551A1 (de) * 1994-09-28 1996-04-04 Forssmann Wolf Georg Prof Dr D Peptide aus der Sequenz des hPTH (1-37)
US6689566B1 (en) * 1999-01-14 2004-02-10 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7943323B2 (en) 1999-01-14 2011-05-17 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods for differentiating and monitoring parathyroid and bone status related diseases
US7892749B2 (en) 1999-01-14 2011-02-22 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods for differentiating and monitoring parathyroid and bone status related diseases
US8298770B2 (en) 1999-01-14 2012-10-30 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone
US7723042B2 (en) 1999-01-14 2010-05-25 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods for differentiating and monitoring parathyroid and bone status related diseases
EP1729135A2 (de) 1999-01-14 2006-12-06 Scantibodies Laboratory, Inc. Verfahren zur Differenzierung und Überwachung von Erkrankungen in Zusammenhang mit dem Nebenschilddrüsen- und Knochenstatus
EP1151307A1 (de) 1999-01-14 2001-11-07 Scantibodies Laboratory, Inc. Verfahren zum differenzieren und überwachen von parathyroid und krankheiten, die mit dem zustand der knochen verbunden sind
EP1729135A3 (de) * 1999-01-14 2008-07-02 Scantibodies Laboratory, Inc. Verfahren zur Differenzierung und Überwachung von Erkrankungen in Zusammenhang mit dem Nebenschilddrüsen- und Knochenstatus
US7790398B2 (en) 2001-04-03 2010-09-07 Franz Paul Armbruster Method for determining effective parathormone activity in a sample
EP2006688A3 (de) * 2001-04-03 2009-04-08 Immundiagnostik AG Bestimmung der wirksamen Parathormon-Aktivität in einer Probe
WO2002082092A3 (de) * 2001-04-03 2003-03-20 Abc Armbruster Biochemicals Bestimmung der wirksamen parathormon-aktivität in einer probe
WO2003003986A2 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Parathyroid hormone antibodies and related methods
EP1455821A4 (de) * 2001-07-03 2006-04-12 Quest Diagnostics Invest Inc Parathormon-antikörper und damit zusammenhängende verfahren
EP1643894A4 (de) * 2003-07-10 2009-06-10 Scantibodies Lab Inc Verfahren, kits und antikörper zum nachweis von parathyroid
JP2008521824A (ja) * 2004-11-29 2008-06-26 ジェイ． ザーラドニク、リチャード 生理活性インタクト副甲状腺ホルモン（ｐｔｈ）１−８４に対する選択的結合特異性を有する抗体および同抗体を作製するためのペプチド抗原
EP2631247A1 (de) 2012-02-22 2013-08-28 Immundiagnostik AG Mittel und Verfahren zum Messen des Parathyroid-Hormons bei unter oxidativem Stress leidenden Patienten
WO2013124462A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 Immundiagnostik Ag Means and methods of measuring parathyroid hormone in patients suffering from oxidative stress
EP2775306A1 (de) 2013-03-08 2014-09-10 Immundiagnostik AG Nicht oxidiertes, biologisch aktives Parathormon zur Bestimmung der Sterblichkeit bei Hämodialysepatienten
WO2014135701A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Immundiagnostik Ag Non-oxidized, biological active parathyroid hormone determines mortality in hemodialysis patients
WO2019141791A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Immundiagnostik Ag Biomarker predicting coronary artery disease

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US20030175802A1 (en) 2003-09-18
AU2674601A (en) 2001-06-25

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