WO2000037607A2 - Methode de production d'adipocytes a partir de fibroblastes non differencies ainsi que l'utilisation des adipocytes ainsi obtenus - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a production method
- adipocytes from undifferentiated fibroblasts as well as the use of the adipocytes thus obtained to screen molecules intended for the treatment of obesity, diabetes as well as hyperlipiderms and as a model for studying the mechanisms of the biology of adipocytes
- Obesity is a chronic disease with significant health consequences and the frequency of which is increasing worldwide (Hill O et al (1998), Science. 280, 1371-1374) Because obesity results from an imbalance in the energy balance and that adipocytes are considered as the main site for energy storage and mobilization, numerous studies have been carried out to understand the biology of adipocytes 15 Thus primary cultures of preadipocytes similar to fibroblasts can be differentiated in vitro into mature adipocytes which produce lipid droplets
- mice 3T3-L1 (Green H et al (1974), Cell, 1, 1 13-1 16) and 3T3- F442A (Green H et al. (1976), Cell, 7, 105-1 13) and the human brown preadipocyte cell lines
- the differentiation of adipocytes is carried out by adding to confluent preadipocytes, mixtures of different agents which stimulate differentiation, such as for example insulin, pioghtazone, dexamethasone and 3- ⁇ sobutyl -l-methyl-xanthme (Cornelius P. et al.,
- PPAR ⁇ lipase sensitive hormone
- the ⁇ 3 type adrenergic receptor ( ⁇ 3 AR) is a receptor coupled to G proteins which is expressed mainly in adipose tissue (Strosberg AD et al (1996), Prends Pharmacol Sci, 17, 373-381) This receptor is not expressed in preadipocytes but appears in white or brown mature adipocytes.
- ⁇ 3 AR ⁇ 3 type adrenergic receptor
- cAMP intracellular cyclic AMP
- PKA protein kinase A
- ⁇ 3 AR could be involved in the regulation of the proliferation / differentiation of adipocytes, in particular in brown adipose tissue (BAT).
- adipocytes from undifferentiated fibroblasts stably exp ⁇ ming human ⁇ 3 AR and using these adipocytes as a model for studying the mechanisms of biology adipocytes and as a means of screening for specific molecules of ⁇ 3 AR intended for the treatment of obesity, diabetes as well as hyper-epidemics
- the present invention relates to a method for producing adipocytes from undifferentiated fibroblasts, said method being characterized by the cultivation of undifferentiated fibroblasts ar ⁇ vés at confluence and stably expressing human ⁇ 3 AR, in a medium comprising agents stimulating the differentiation of adipocytes such as biotin, panthothenate, trnodothyronine, insulin, dexamethasone. 3- ⁇ sobutyl-1-methyl-xanthine and piog tazone or one of its derivatives.
- the undifferentiated fibroblasts can be CHO / Kl - ⁇ 3 cells and mutated CHO / Kl- ⁇ 3W64R cells. Indeed the density of ⁇ 3-AR in CHO / Kl - ⁇ 3 cells is close to that observed in the cell line
- CHO / Kl cells which express the natural W64R polymorphism of human ⁇ 3 AR, which has been correlated with pathological obesity, show a greater accumulation of lipids compared to CHO / Kl cells expressing the wild type of ⁇ 3 AR.
- the present invention also relates to a model for studying the mechanisms of the biology of adipocytes, characterized in that it comprises adipocytes obtained by the method according to the invention.
- the present invention also relates to the use of the adipocytes thus obtained to wire molecules intended for the treatment of obesity, diabetes as well as hyper-epidemics.
- the invention relates to the use of the adipocytes thus obtained to screen for antilipidic agents.
- Other characteristics and advantages of the invention appear in the following description and examples illustrated by the figures in which:
- FIG. 1 shows the stimulation of lipid accumulation in CHO / Kl cells exp ⁇ mant human ⁇ 3 AR; CHO / K1 cells expressing the wild type of confluent ⁇ 3 AR are cultured in a medium containing agents stimulating the differentiation of adipocytes (see example 1).
- FIG. 2 shows the accumulation of lipids (triglycerides) in CHO / Kl cells transfected either by human ⁇ 3 AR or by the mutated form of this receptor; wild type CHO / Kl cells (control, white), CHO / Kl cells stably transfected with human wild type ⁇ 3 AR ( ⁇ 3, black), CHO / Kl cells stably transfected with ⁇ 3 AR mutated type human ( ⁇ 3W64R, hatched) and CHO / K1 cells transfected stably with human ⁇ 2 AR ( ⁇ 2, gray) are cultured in the presence of differentiating agents; the lipids are marked with a solution of OU Red O., extracted and quantified (see example 1-3). The results are expressed as the mean ⁇ standard error to the mean (wk) of 3 to 7 experiments carried out in duplicate, * p ⁇ 0.05 (t-test),
- FIG. 3 represents the accumulation of lipids (triglycerides) in CHO / Kl cells transfected either by human ⁇ 3 .AR (A), or by the mutated form of this receptor (B) in the presence of ⁇ 3 AR agonist ;
- A CHO / K1 cells transfected stably by human wild-type ⁇ 3 AR are cultured in the presence of differentiating agents either in the absence of ⁇ 3 AR agonist (white), or in the presence of noradrenalinelO ⁇ M (NEPI , black), or in the presence of CGP12177A 10 ⁇ M selective agonist ⁇ 3 AR (CGP12, hatched). The transformation of the cells is followed as indicated in the examples.
- results are expressed as a percentage of the control value observed in CHO / K1 cells transfected stably with human wild-type ⁇ 3 AR cultured in the presence of differentiating agents in the absence of ⁇ 3 AR agonist.
- the data are expressed as the mean ⁇ standard error to the mean (wk) of 3 to 5 experiments carried out in duplicate. (B).
- CHO / Kl cells stably transfected with human ⁇ 3 AR of mutated type W64R are cultured in the presence of differentiating agents, either in the absence of ⁇ 3 AR agonist (white), or in the presence of noradrenalinelO ⁇ M (NEPI, black), or in the presence of CGP12177A 10 ⁇ M selective agonist ⁇ 3 AR, (CGP12, hatched).
- the transformation of the cells is followed as indicated in the examples.
- the results are expressed as a percentage of the control value observed in CHO / K1 cells transfected stably by the human W64R ⁇ 3 AR cultured in the presence of differentiating agents in the absence of ⁇ 3 AR agonist.
- the data are expressed as the mean ⁇ standard error to the mean (wk) of 3 to 5 experiments carried out in duplicate. * p ⁇ 0.05 (t-test),
- FIG. 4 shows the accumulation of lipids (triglycerides) in CHO / K1 cells transfected either by human ⁇ 3 AR, or by the mutated form of this receptor in the presence of a selective antagonist of ⁇ 3 AR;
- CHO / Kl cells stably transfected with human wild type B3 AR ( ⁇ 3) or with human mutated type ⁇ 3 AR ( ⁇ 3W64R) are cultured in the presence of differentiating agents either in the absence (white) or in the presence of bupranolol 10 ⁇ M selective ⁇ 3 AR antagonist (BUPRA).
- BUPRA selective ⁇ 3 AR antagonist
- results are expressed as a percentage of the control value observed in CHO / K1 cells transfected stably with human wild-type ⁇ 3 AR cultured in the presence of differentiating agents in the absence of an antagonist ⁇ 3 AR
- the data are expressed as mean ⁇ standard error of the mean (sem) of at least 3 expé ⁇ ences performed in duplicate. * p ⁇ 0.05 (t-test),
- FIG. 5 shows the induction of adipocyte differentiation markers during the accumulation of lipids in CHO / K1 cells transfected either by human ⁇ 3 AR, or by the mutated form of this receptor; RT-PCR studies are carried out as described in Example 1 CHO / KI cells of the wild type (control). CHO / K1 cells expressing wild human ⁇ 3 AR ( ⁇ 3) or the mutated form of this receptor ( ⁇ 3W64R) are cultured in the absence (-) or in the presence (+) of the differentiation agents as indicated in the examples.
- BAT b ⁇ in adipose tissue
- WAT white adipose tissue
- HSL hpase sensitive hormone
- Example 1 Material and methods used to study the differentiation of fibroblasts into adipocytes
- the cells are cultured to confluence in a mixture (1.1) of Ham's F 12OMEM (Dubelcco s modifiai Eagles medium) supplemented with 20 mM Hepes buffer, 5% of decomplemented fetal calf serum and antibiotics.
- Ham's F 12OMEM Dubelcco s modifiai Eagles medium
- the cells When the cells have reached confluence, they are transferred to a medium supplemented with biotin (33 ⁇ M), panthotenate (18 ⁇ M), truodothyronine (T3, 1 ruVl), insulin (85 nM), dexamethasone (1 ⁇ M), 3- ⁇ sobutyl-l -methyl-xanth ⁇ ne (250 nM) and piog tazone or one of its derivatives (1 ⁇ M)
- the cells are maintained in this medium for 10 to 12 days by changing the medium every 3 days If necessary 10 ⁇ M of the following products are added to the medium (-) - noradrenahne (Sigma ;.
- lipids t ⁇ glyce ⁇ des
- lipids t ⁇ glyce ⁇ des
- curves of carbonation of t ⁇ oleine Sigma according to the method dec ⁇ te by Ramirez-Zaca ⁇ as J.L. (Ramirez-Zaca ⁇ as J L et al (1992), Histochemistry. 97, 493-497)
- Total RNA is extracted from CHO / Kl cells using the isolation agent T ⁇ zol RNA (Life Technology).
- Hamster RNA is extracted from brown mterscapular adipose tissue and white abdominal omental adipose tissue Total RNA is treated for 60 minutes at 37 ° C by
- oligonucleotides were generated relative to the sequences conserved in a significant manner.
- RNA of brown and white adipose tissue from hamsters is used as a control. 200 ng of cDNA template are denatured for 4 minutes at 94
- the exponential phase of the amplification is determined by carrying out 25-30-35-40 cycles and ii) the gene is amplified for ⁇ -actin (15-20-25 cycles) as an internal standard for the quantity and quality of cDNA.
- the primer sequences are: PPAR ⁇ : upstream primer 5'-AGA CAA CAG ACA AAT CAC CAT-
- HSL upstream primer 5'- GCT GGT GTC CTT CGG GG-3 'and downstream primer 5'- GCG GCT TAC CCT CAC GG-3' ⁇ -actin: upstream primer 5 ' -GAG ACC TTC AAC ACC CC-3' and downstream primer 5'-GTG GTG GTG AAG CTG TAG CC-3 '.
- the amplification products are visualized after electrophoresis on a 1% agarose gel with BET (Ethi ⁇ ium bromide); PPAR ⁇ 401 bp; HSL around 250 bp and ⁇ -actin around 250 bp ( Figure 5).
- EXAMPLE 2 Accumulation of lipids in CHO / K1 cells transfected with the wild form or with the mutated form of human ⁇ 3 AR.
- CHO / Kl - ⁇ 3 cells are cultured under the conditions defined above. After 5 days of culture in the medium supplemented with agents stimulating differentiation, small lipid droplets appear in the cells.
- the ⁇ -actin used as internal standard is detected in untransfected CHO / Kl cells, in CHO / Kl - ⁇ 3 cells and in CHO / Kl - ⁇ 3W64R cells cultured in the presence or not of agents stimulating differentiation.
- the results obtained which demonstrate the modulation of the expression of PPAR ⁇ by human ⁇ 3 AR confirm the importance of the role of this receptor in the biology of adipocytes and show that its expression is linked to a more advanced stage of adipogenesis. .
- the ectopic expression of human ⁇ 3 AR in CHO / Kl cells is capable of modulating the expression of PPAR ⁇ , one of the major genes for adipogenesis.
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Abstract
L'invention concerne une méthode de production d'adipocytes à partir de fibroblastes non différenciés caractérisée par la mise en culture de fibroblastes non différenciés arrivés à confluence et exprimant de manière stable le récepteur adrénergique beta 3 humain ou le récepteur adrénergique beta 3 humain muté W64R, dans un milieu comprenant des agents stimulant la différenciation des adipocytes.
Description
Méthode de production d'adipocytes à partir de fibroblastes non différenciés ainsi que l'utilisation des adipocytes ainsi obtenus
La présente invention est relativ e à une méthode de production
5 d'adipocytes à partir de fibroblastes non différencies ainsi que l'utilisation des adipocytes ainsi obtenus pour cribler des molécules destinées au traitement de l'obésité, du diabète ainsi que des hyperlipidermes et comme modèle d'étude des mécanismes de la biologie des adipocytes
L'obésité est une maladie chronique dont les conséquences sur la 10 santé sont importantes et dont la fréquence a travers le monde est en pleine expansion (Hill O et al (1998), Science. 280, 1371-1374) Parce que l'obésité résulte d'un déséquilibre de la balance énergétique et que les adipocytes sont considères comme le site principal de stockage et de mobilisation de l'énergie, de nombreuses études ont ete réalisées pour comprendre la biologie des adipocytes 15 Ainsi des cultures pπmaires de preadipocytes semblables a des fibroblastes peuvent être différenciées in vitro en adipocytes matures qui produisent des gouttelettes lipidiques
De plus, plusieurs lignées cellulaires de preadipocytes immortalisés ont été développées, comme par exemple les lignées cellulaires de preadipocytes blancs
20 de souris 3T3-L1 (Green H et al ( 1974), Cell, 1 , 1 13-1 16) et 3T3- F442A (Green H et al. (1976), Cell, 7, 105- 1 13) et les lignées cellulaires de preadipocytes bruns humains
PAZ-6 (Zilberfarb V et al (1997). J Cell Se , 110. 801 -807)
Les recherches réalisées ces dernières armées sur ces lignées cellulaires et les cultures primaires de preadipoc tes ont largement contπbué à la
25 connaissance de la différenciation des adipocytes In xitro, la différenciation des adipocytes est réalisée par addition a des preadipocytes confluents, de mélanges de différents agents qui stimulent la différenciation, comme par exemple l'insuline, la pioghtazone, la dexamethasone et la 3-ιsobutyl-l-methyl-xanthme (Cornélius P. et al.,
(1994) Annu Rev Nutr, 14, 99-129 et Grégoire F M (1998), Physiol Rev , 78, 783-
30 809) Pendant la transformation en adipocytes. on observe l'apparition de gouttelettes lipidiques et l'augmentation de la transcription de plusieurs marqueurs spécifiques des gènes tels que PPARγ (γform of peroxisome prohferator activated receptor) ou HSL
(lipase sensitive hormone) PPARγ est un des marqueurs principaux impliqués dans la différenciation des preadypocytes en adipocytes (Fajas L et al , (1998), Curr Opin
35 Cell Btol . 10, 165- 173 , Sptegelman B M , (1996), Cell, 87, 377-389)
i
Le récepteur adrénergique de type β3 (β3 AR) est un récepteur couplé aux protéines G qui est expπme pπncipalement dans le tissu adipeux (Strosberg A.D et al (1996), Prends Pharmacol Sci , 17, 373-381) Ce récepteur n'est pas exprimé dans les preadipocytes mais apparaît dans les adipocytes matures blancs ou bruns. Chez les rongeurs, la stimulation du β3 .AR par les catécholammes conduit à une augmentation de la concentration en AMP cyclique (AMPc) intracellulaire faisant intervenir la protéine Gs (protéine G stimulatnce , cette augmentation est suivie par une activation de la protéine kinase A (PKA) et par la phosphorylation de différentes protéines cibles comme par exemple HSL qui conduit à la polyse. Bien que la stimulation du β3 AR humain induise des augmentations significatives des concentrations intracellulaires en AMPc dans des modèles de cellules transfectées, son rôle dans la régulation de l'équilibre énergétique dans les adipocytes humains est encore controverse (Arch J R.S., Biochemical Society Transaction, 24, 412- 418). II existe a l'état naturel un polymorphisme du β3 AR humain (W64R) qui est associe a ec une obésité pathologique et une résistance à l'insuline (Strosberg A. D , (1997), Trends Pharmacol Se/., 18, 449-454) On ne sait pas à l'heure actuelle comment cette mutation affecte le fonctionnement des adipocytes conduisant ainsi à une obésité et à une résistance à l'insuline Aucune différence au niveau de la Hpolyse faisant intervenir le β3 AR n'a été mise en évidence dans des adipocytes issus d'hommes hétérozygotes pour la mutation W64R (Li L. S et al , (1996), Diabetologia, 39, 857-860). De plus aucune différence n'a été observée au niveau de la liaison au récepteur (binding) ou de l' activation de l'adénylyl cyclase entre des cellules CHO (Chinese hamster ovary) exprimant le type sauvage du β3 AR et des cellules CHO expπmant le type muté du β3 AR (Candelore M.R et al., ( 1996), Endocnnology, 137, 2638-2641 ; Piétri-Rouxel et al., ( 1997), Eur J Biochem , 247, 1 174-1 179) alors que l'accumulation maximale d'AMPc est beaucoup plus faible dans les cellules expπmant le récepteur mutant (Piétπ-Rouxel et al., ( 1997), Eur J Biochem , 247, 1 174-1 179) En plus de son rôle dans la hpolyse, on a suggéré récemment que le β3 AR pourrait être impliqué dans la régulation de la prolifération/différenciation des adipocytes, en particulier dans le tissu adipeux brun BAT (brown adipose tissue). En effet chez les rongeurs, un traitement avec des agonistes β3 provoque une hypertrophie du BAT (Ghorbani M. (1997), Biochem Pharmacol, 54, 121-131 ) et en culture, l' activation du β3 AR stimule la différenciation des adipocytes bruns (Bronnikov G. ( 1992), J Biol Chem , 267, 2006-2013) De plus, les patients atteints de
phéochromocvtome développent une tumeur secrétπce de catécholammes, entourée de tissu adipeux brun ( Himms-Hagen J , (1990), Faseb J . 4, 2890-2898).
Dans les adipocytes de rat, la stimulation du β3 AR conduit à l' activation de la voie de signalisation des kmases ERK1/2 (Extracellular signal regulated Kinases 1/2) (Shimizu Y et al , Endocrinology , 138, 248-253) et à la stimulation de la protéine kinase B (PKB) (Moule S K et al J Biol Chem , 272, 7713- 7719) qui, avec la PI3K (Phosphatιdylιnosιtol-3 Kinase), jouent un rôle important dans la différenciation des adipocytes (Sale E.M et al (1995), Embo J, 14, 674-684 ; Christoffersen C. T. et al. Biochem Biophys Res Coin , 246, 426-430 , Magun R. et al. (1996). Endocrinology, 137, 3590-3593)
Il a été suggéré qu'il existe des différences entre les β3 AR muπn et humain quant a la sélectivité des hgands β3 AR pour ces récepteurs (Howe, R. (1993) Drugs of the Future 18, 529-549) Ainsi des gands du β3 AR qui ont une bonne efficacité dans des systèmes cellulaires de rongeurs se sont avérés peu ou pas efficaces dans des cultures d'adipocytes humains ou in vivo chez l'homme. De plus, la seule lignée cellulaire d'origine humaine PAZ-6 (Zilberfarb V et al. (1997), J Cell Se, 110, 801-807), lorsqu'elle est cultivée en présence d'agents de différenciation, a la propπété d'expπmer tous les récepteurs adrenergiques β (βl AR, β2 AR, β3 AR) et les récepteurs adrenergiques α.2 (al AR) rendant difficile le cπblage de hgands sélectifs du récepteur adrénergique du sous-type β3
En conséquence les Inventeurs se sont donné pour but de mettre au point une méthode de production d'adipocytes a partir de fibroblastes non différenciés expπmant de manière stable le β3 AR humain et d'utiliser ces adipocytes comme modèle d'étude des mécanismes de la biologie des adipocytes et comme moyen de criblage de molécules spécifiques du β3 AR destinées au traitement de l'obésité, du diabète ainsi que des hyper pidémies
Le fait de transfecter de manière stable un gène codant pour un récepteur humain comme le β3 AR humain et la mise au point d'adipocytes à partir de cellules fibroblastiques transfectées par le gène codant pour le récepteur β3 AR et n'expπmant pas les autres sous-types adrenergiques (α2 AR, β, AR et β, AR) présentent un avantage certain quant a l'utilisation de ces cellules pour la mise au point de criblage de molécules sélectives du récepteur β3 AR humain.
La présente invention a pour objet une méthode de production d'adipocytes a partir de fibroblastes non différencies, ladite méthode étant caractérisée par la mise en culture de fibroblastes non différencies arπvés a confluence et exprimant de manière stable le β3 AR humain, dans un milieu comprenant des agents
stimulant la différenciation des adipocytes comme la biotine, le panthothénate, la trnodothyronine, l'insuline, la dexaméthasone. la 3-ιsobutyl- l-méthyl-xanthine et la piog tazone ou un de ses dérivés.
Les fibroblastes non différenciés peuvent être des cellules CHO/Kl -β3 et des cellules mutées CHO/Kl-β3W64R. En effet la densité de β3-AR dans les cellules CHO/Kl -β3 est proche de celle observée dans la lignée cellulaire
PAZ-6 d'adipocytes bruns humains dont le Bn est voisin de 0,4 pmole de récepteur/mg protéine (Zilberfarb V. et al. (1997), J Cell Se , 110, 801-807), ce qui en fait un modèle physiologique intéressant. Dans ces conditions, et ce de manière surprenante, des gouttelettes lipidiques apparaissent au bout de cinq jours de culture et cette accumulation semble spécifiquement liée à la présence du β3 AR , en effet des cellules CHO/Kl non transfectées ou des cellules expπmant le récepteur β2 adrénergique (β2 AR) humain n'accumulent pas de quantités significatives de lipides lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu supplémente en agents stimulant la différenciation des adipocytes. De plus cette production de lipide peut être inhibée de manière significative en cultivant les cellules en présence de bupranolol. antagoniste de β3 AR.
Les cellules CHO/Kl qui expπment le polymorphisme naturel W64R du β3 AR humain, lequel a été corrélé avec une obésité pathologique, montrent une accumulation supérieure de lipides comparativement à des cellules CHO/Kl expπmant le type sauvage de β3 AR.
La présente invention concerne également un modèle d'étude des mécanismes de la biologie des adipocytes, caractérisé en ce qu'il comprend des adipocytes obtenus par la méthode selon l'invention. La présente invention a également pour objet l'utilisation des adipocytes ainsi obtenus pour cπbler des molécules destinées au traitement de l'obésité, du diabète ainsi que des hyper pidémies.
Plus particulièrement l'invention concerne l'utilisation des adipocytes ainsi obtenus pour cribler des agents antilipidiques. D'autres caractéπstiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la descπption et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles :
- la figure 1 représente la stimulation de l'accumulation des lipides dans les cellules CHO/Kl expπmant le β3 AR humain ; les cellules CHO/Kl exprimant le type sauvage du β3 AR à confluence sont cultivées dans un milieu contenant des agents stimulant la différenciation des adipocytes (voir exemple 1).
Après 10 jours de culture, les cellules sont fixées et marquées avec une solution de Oïl
Red O.- Grossissement 40 x,
- la figure 2 représente l'accumulation de lipides (triglycérides) dans des cellules CHO/Kl transfectées soit par le β3 AR humain soit par la forme mutée de ce récepteur ; les cellules CHO/Kl de type sauvage (control, blanc), les cellules CHO/Kl transfectées de manière stable par le β3 AR humain de type sauvage (β3, noir), les cellules CHO/Kl transfectées de manière stable par le β3 AR humain de type muté (β3W64R, hachuré) et les cellules CHO/Kl transfectées de manière stable par le β2 AR humain (β2, gris) sont cultivées en présence des agents de différenciation ; les lipides sont marqués par une solution de OU Red O., extraits et quantifiés (voir exemple 1-3). Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± erreur standard à la moyenne (sem) de 3 à 7 expériences réalisées en double, * p< 0,05 (test-t),
- la figure 3 représente l'accumulation de lipides (triglycérides) dans des cellules CHO/Kl transfectées soit par le β3 .AR humain (A), soit par la forme mutée de ce récepteur (B) en présence d'agoniste du β3 AR ; (A) les cellules CHO/Kl transfectées de manière stable par le β3 AR humain de type sauvage sont cultivées en présence des agents de différenciation soit en l'absence d'agoniste β3 AR (blanc), soit en présence de noradrénalinelO μM (NEPI, noir), soit en présence de CGP12177A 10 μM agoniste sélectif β3 AR (CGP12, hachuré). La transformation des cellules est suivie comme indiqué dans les exemples. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la valeur témoin observée dans les cellules CHO/Kl transfectées de manière stable par le β3 AR humain de type sauvage cultivées en présence des agents de différenciation en l'absence d'agoniste β3 AR. Les données sont exprimées comme la moyenne ± erreur standard à la moyenne (sem) de 3 à 5 expériences réalisées en double. (B). Les cellules CHO/Kl transfectées de manière stable par le β3 AR humain de type muté W64R sont cultivées en présence des agents de différenciation, soit en l'absence d'agoniste β3 AR (blanc), soit en présence de noradrénalinelO μM (NEPI, noir), soit en présence de CGP12177A 10 μM agoniste sélectif β3 AR, (CGP12, hachuré). La transformation des cellules est suivie comme indiqué dans les exemples. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la valeur témoin observée dans les cellules CHO/Kl transfectées de manière stable par le W64R β3 AR humain cultivées en présence des agents de différenciation en l'absence d'agoniste β3 AR. Les données sont exprimées comme la moyenne ± erreur standard à la moyenne (sem) de 3 à 5 expériences réalisées en double. * p< 0,05 (test-t),
- la figure 4 représente l'accumulation de lipides (triglycérides) dans des cellules CHO/Kl transfectées soit par le β3 AR humain, soit par la forme mutée de ce récepteur en présence d'un antagoniste sélectif du β3 AR ; les cellules CHO/Kl
transfectées de manière stable par le B3 AR humain de type sauvage (β3) ou par le β3 AR humain de type muté (β3W64R) sont cultivées en présence des agents de différenciation soit en l'absence (blanc), soit en présence de bupranolol 10 μM antagoniste sélectif du β3 AR (BUPRA). La transformation des cellules est suivie comme indiqué dans les exemples. Les résultats sont expπmés en pourcentage de la valeur témoin observée dans les cellules CHO/Kl transfectées de manière stable par le β3 AR humain de type sauvage cultivées en présence des agents de différenciation en l'absence d'antagoniste β3 AR Les données sont expπmees comme la moyenne ± erreur standard à la moyenne (sem) d'au moins 3 expéπences réalisées en double. * p< 0,05 (test-t),
- la figure 5 représente l' induction des marqueurs de différenciation adipocytaire pendant l'accumulation des lipides dans des cellules CHO/Kl transfectées soit par le β3 AR humain, soit par la forme mutée de ce récepteur ; les études de RT-PCR sont réalisées comme décrit dans l'exemple 1 Les cellules CHO/Kl de type sauvage (control). les cellules CHO/Kl expπmant le β3 AR humain sauvage (β3) ou la foπne mutée de ce récepteur (β3W64R) sont cultivées en l'absence (-) ou en présence (+) des agents de différenciation comme indiqué dans les exemples. BAT = tissu adipeux bπin , WAT = tissu adipeux blanc , HSL = hormone sensitive hpase , PPARgamma = PPAR^ = γform of the peroxisome proliferator activated receptor
Exemple 1 : Matériel et méthodes mis en œuvre pour étudier la différenciation des fibroblastes en adipocytes
1 Cultures cellulaires
Les cellules CHO, "Kl (Chinese Hamster Ovary/Kl) expπmant le β3 AR humain sauvage (Braax = 0,47 pmole de récepteur/mg protéine) appelées CHO/Kl -β3 ou exprimant la forme mutée de ce récepteur W64R (Bma- = 0,32 pmole de récepteur/ mg protéine) appelées CHO Kl -β3W64R sont décrites par Piétπ-Rouxel et al., (1997). Eur J Biochem , 247, 1174-1179 , les cellules CHO/Kl transfectées de manière stable (Bm.„ = 0,30 pmole de recepteur/mg protéine) avec le gène codant pour le récepteur adrénergique β2 AR humain sau age clone par Emoπne L. et al. (PNAS, (1987), 84, 6995-6999), ont été fournies par le Dr S Marullo (France)
Les cellules sont cultivées jusqu'à confluence dans un mélange (1.1) de Ham's F 12OMEM (Dubelcco s modifiai Eagles médium) supplémente avec du tampon Hepes 20 mM, 5 % de sérum de veau foetal decomplémenté et des antibiotiques. Lorsque les cellules ont atteint la confluence, elles sont transférées dans un milieu supplémente avec de la biotine (33 μM), du panthoténate ( 18 μM), de la
truodothyronine (T3, 1 ruVl), de l'insuline (85 nM), de la dexamethasone (1 μM), de la 3-ιsobutyl-l -methyl-xanthιne (250 nM) et de la piog tazone ou un de ses déπvés ( l μM) Les cellules sont maintenues dans ce milieu pendant 10 à 12 jours en changeant le milieu tous les 3 jours Si nécessaire 10 μM des produits suivants sont ajoutés dans le milieu (-)-noradrenahne (Sigma;. CGP12177A [(±)-4-(3-t-butyl- amιno-2-hydroxypropoxy)benzιmιdazol-2-one] (don de Ciba-Geigy) et bupranolol (Schvvarz Pharma AG)
2 Marquage au Ou Red O et quantification de l'accumulation des lipides dans les cellules La solution de Oïl Red O est préparée selon la méthode décπte par
Ramirez-Zacaπas J L ét al ( 1992). Histochemistry, 97, 493-497 Six plaques multi- puits sont lavées 2 fois par du tampon PBS salin (phosphate buffered saline), fixées pendant 1 heure par une solution de formaline a 10 % dans le PBS, lavées avec de l'eau, marquées pendant 2 heures par immersion complète dans une solution de Oïl Red O et rincées deux fois avec de l'eau L'excès d'eau est évapore en plaçant les plaques a 37 °C Le colorant est extrait par 200 μl d'alcool isopropylique par puits et l'absorbance d'un ahquot est mesurée immédiatement à 492 nM.
Les lipides (tπglyceπdes) sont quantifiés en utilisant des courbes de ca bration de tπoléine (Sigma) selon la méthode décπte par Ramirez-Zacaπas J.L. (Ramirez-Zacaπas J L ét al (1992), Histochemistry. 97, 493-497)
3 RT-PCR
L'ARN total est extrait des cellules CHO/Kl en utilisant l'agent d'isolement Tπzol RNA (Life Technology) L'.ARN d'hamster est extrait du tissu adipeux brun mterscapulaire et du tissu adipeux blanc abdominal omental L'ARN total est traite pendant 60 minutes a 37 °C par
0,3 U d'ADNase I sans ARNase/μg d'acide nucléique (RQ1 DNase Promega) dans un milieu contenant du Tπs-HCl 40 mM, à pH 9, NaCl 10 mM, MgCL 6 mM, CaCl, 10 mM en présence de 2 U/ul d'inhibiteur d'ARNase (RNasin Promega). Après extraction par un mélange phenol/chloro forme et précipitation de TARN, 2 μg d'ARN sont utilisés pour synthétiser de l'ADNc L'.ARN est incubé pendant 90 minutes à 42 °C avec la transcπptase inverse du Virus de Moloney de la leucémie muπne (SuperScπpt™ II, Gibco-BRL) dans 10 ul de tampon de transcπptase inverse (Tπs-HCl 50 mM, à pH 8,3, KC1 75 mM, MgC 3 mM et dithiothreitol 10 mM) contenant 0,4 mM de chaque dNTP, 0.0033 U d'hexanucléotides aléatoires (Pharmacia France) et 2 U d'inhibiteur de ARnase
La PCR semi-quantitative est réalisée dans un volume final de 50 μl
>
contenant 0,25 mM d'amorces, 2,5 U de Taq polymérase (Gibco), 0,25 mM de chaque dNTP, lx de tampon de réaction (Gibco) supplémente par 1,5 mM de MgC .
Parmi les gènes étudiés, seules les séquences codant pour le PPARγ
(Aperlo C. Et al., (1995), Gène. 162, 297-302) sont connues du hamster. En conséquence les séquences pour le gène HSL ont été alignées à partir d'autres espèces
(rat, cochon et humain) et des oligonucléotides ont été générés par rapport aux séquences conservées de manière importante.
L'ARN de tissu adipeux brun et blanc de hamster est utilisé comme témoin. 200 ng de matrice d'ADNc sont dénaturés pendant 4 minutes à 94
°C et amplifiés comme suit : PPARy (94 °C. 30 s ; 51 °C, 30 s ; 72°C, 40 s ; 35 cycles) ; HSL (94 °C, 30 s ; 55 °C. 30 s ; 72°C, 45 s ; 35 cycles) ; β-actine (94 °C, 30 s ; 60 °C, 30 s ; 72°C, 30 s ; 25 cycles). L'extension finale est réalisée pendant 3 minutes à 72 °C. Pour comparer les produits issus de la PCR d'une manière semi- quantitative on procède de la manière suivante : i) on détermine la phase exponentielle de l'amplification en réalisant 25-30-35-40 cycles et ii) on amplifie le gène pour la β-actine (15-20-25 cycles) comme standard interne de la quantité et de la qualité de l'ADNc. Les séquences amorces sont : PPARγ : amorce amont 5'-AGA CAA CAG ACA AAT CAC CAT-
3' et amorce aval 5'-AAG TTT GAG TTT GCT GTG AAG-3'
HSL : amorce amont 5'- GCT GGT GTC CTT CGG GG-3' et amorce aval 5'- GCG GCT TAC CCT CAC GG-3' β-actine : amorce amont 5 '-GAG ACC TTC AAC ACC CC-3' et amorce aval 5'-GTG GTG GTG AAG CTG TAG CC-3'.
Les produits d'amplification sont visualisés après électrophorèse sur un gel d'agarose à 1 % par du BET (Ethiάium bromide) ; PPARγ 401 bp ; HSL environ 250 bp et β-actine environ 250 bp (figure 5).
EXEMPLE 2 : Accumulation des lipides dans les cellules CHO/Kl transfectées par la forme sauvage ou par la forme mutée du β3 AR humain.
Des cellules CHO/Kl -β3 sont cultivées dans les conditions définies ci-dessus. Après 5 jours de culture dans le milieu supplémente en agents stimulant la différenciation, de petites gouttelettes de lipides apparaissent dans les cellules.
Après 10 jours, l'accumulation de lipides atteint son maximum et les lipides sont marqués par de VOil Red O. comme décrit précédemment. L'examen macroscopique des boites montrent qu'il y a accumulation des lipides dans environ
40 % des cellules transfectées (figure 1 )
Ni les cellules CH0/Kl-β3 cultivées dans un milieu normal (lipides non détectables), ni les cellules CHO/Kl de type sauvage cultivées dans un milieu supplémente en agents stimulant la différenciation ne présentent une telle accumulation de lipides (figure 2)
L'accumulation de gouttelettes de lipides observée dans les cellules
CHO/Kl -β3 dont la densité en récepteur est telle que Bn = 0,47 pmole de récepteur, mg protéine, n'est pas due a un effet de clone puisque des cellules qui expriment une densité supeπeure en β3 AR accumulent des lipides de façon similaire lorsqu'elles sont cultivées en milieu supplémente
Apres culture des cellules CHO/Kl -β3 en milieu supplémente, on extrait 1055 = 273 ug/ml/puits de triglycérides (n = ") alors que le taux basai observe dans des cellules CHO/Kl non transfectées est de 218 = 47 μg/ml/puits (n=7) (figure 2)
Les cellules CHO/Kl -β2 cultivées dans les mêmes conditions n'accumulent pas de manière significativ e plus de lipides que les cellules CHO/Kl de type sauvage (212 ± 470 ug/ml/puits (n=3) (figure 2)
De manière intéressante, les cellules CHO/Kl -β3W64R accumulent en revanche significativement plus de tπglyceπdes que les cellules CHO/Kl -β3 de type sauvage (1473 ± 254 ug/ml/puits (n=7) (figure 2) Ces résultats montrent que la présence de β3 AR suffit par elle- même a augmenter la formation de lipides intracellulaires
EXEMPLE 3 : Modulation de l'accumulation des lipides par les Hgands β-adrenergiques La noradrenalme et le CGP 12177A (agoniste sélectif du β3 AR) diminuent la quantité de gouttelettes lipidiques dans les cellules CHO/Kl -β3 respectivement de 32 % et 22 % par rapport au mêmes cellules cultivées en l'absence de ces agomstes β-adrenergiques (figure 3A)
Dans les cellules CHO/Kl -β3W64R en revanche aucune diminution de l'accumulation de lipides n est observ ée en présence de ces agomstes (figure 3 B)
Lorsque les cellules CHOT l-βS sont cultivées en présence de bupranolol, antagoniste sélectif du β3 AR, a 10 uM, une diminution drastique (91 %) de l'accumulation des lipides est observée (figure 4)
Dans les cellules CHO/Kl -β3W64R cultivées en présence de bupranolol. antagoniste sélectif du β3 AR, a 10 uλl une diminution drastique (92 %) de l'accumulation des lipides est également observée (figure 4)
Ces résultats montrent que l'accumulation de lipides nécessitent la présence d'un récepteur fonctionnel mais pas nécessairement la présence de son ligand. EXEMPLE 4 : Expression de marqueurs spécifiques des adipocytes Les cellules CHO/Kl non transfectées préconfluentes, les cellules
CHO/Kl-β3 préconfluentes, les cellules CHO/Kl -β3W64R préconfluentes, expriment toutes le même taux de HSL. Ce taux n'est pas modifié dans les cellules confluentes qu'elles soient en présence ou en absence d'agents stimulant la différenciation (figure 5). Les cellules CHO/Kl non transfectées préconfluentes expriment
PPARγ ; en revanche dans les cellules CHO/Kl -β3 préconfluentes et les cellules CHO/Kl -β3W64R préconfluentes l'expression de PPARγ est diminuée de manière significative (figure 5).
Après culture des différents types de cellules en présence d'agents stimulant la différenciation, l'expression du PPARγ n'est pas modifiée dans les cellules non-transfectées mais est augmentée dans les cellules transfectées (figure 5).
La β-actine utilisée comme standard interne est détectée dans les cellules CHO/Kl non transfectées, dans les cellules CHO/Kl -β3 et dans les cellules CHO/Kl -β3W64R cultivées en présence ou non d'agents stimulant la différenciation. Les résultats obtenus qui mettent en évidence la modulation de l'expression de PPARγ par le β3 AR humain confirment l'importance du rôle de ce récepteur dans la biologie des adipocytes et montrent que son expression est liée à un stade plus avancé de l'adipogénèse.
L'expression ectopique du β3 AR humain dans les cellules CHO/Kl est capable de moduler l'expression de PPARγ, un des gènes majeurs de l'adipogénèse.
Claims
REVENDICATIONS
1) Méthode de production d'adipocytes a partir de fibroblastes non différencies caractéπsee par
- la mise en culture de fibroblastes non différencies arπvés à confluence et expπmant de manière stable le récepteur adrénergique β3 humain ou le récepteur adrénergique β3 humain mute W64R, dans un milieu comprenant des agents stimulant la différenciation des adipocytes
2) Méthode selon la revendication 1 caractéπsée en ce que les fibroblastes sont choisis dans le groupe comprenant des cellules CHO/Kl expπmant de manière stable le récepteur adrénergique β3 humain et les cellules CHO/Kl expπmant de manière stable le récepteur adrénergique β3 humain muté W64R
3) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisée en ce que les agents stimulant la différenciation des adipocytes sont la biotine, le panthothénate, la tπiodothyronme, l'insuline, la dexamethasone, la 3-ιsobutyl-l-méthylxanthιne et la pioghtazone ou un de ses dénves
4) Utilisation des adipocytes obtenus par la méthode selon la revendication 1 pour le cπblage de molécules destinées au traitement de l'obésité, du diabète ainsi que des hyper pidémies
5) Utilisation selon la revendication 4 caractéπsee en ce qu'elle permet le cnblage d'agents antihpidiques
6) Modèle d'étude des mécanismes de la biologie des adipocytes, caractérisé en ce qu'il comprend des adipoc tes obtenus par la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 a 3
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| WO2000044882A3 (fr) * | 1999-01-29 | 2001-08-09 | Zen Bio Inc | Methodes et compositions de differenciation de preadipocytes humaines en adipocytes |
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