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WO2000032810A1 - In situ-hybridisierungsverfahren mit sonden, welche dendrimerstrukturen enthalten - Google Patents

In situ-hybridisierungsverfahren mit sonden, welche dendrimerstrukturen enthalten Download PDF

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Publication number
WO2000032810A1
WO2000032810A1 PCT/EP1999/009148 EP9909148W WO0032810A1 WO 2000032810 A1 WO2000032810 A1 WO 2000032810A1 EP 9909148 W EP9909148 W EP 9909148W WO 0032810 A1 WO0032810 A1 WO 0032810A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
molecules
labeled
dendrimers
dendrimer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP1999/009148
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andrea Kofler
Regina Bichlmaier
Ludwig STÖCKL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chrombios Gesellschaft fur Molekulare Zytogenetik GmbH
Metabion Gesellschaft fur Angewandte Biotechnologie GmbH
Original Assignee
Chrombios Gesellschaft fur Molekulare Zytogenetik GmbH
Metabion Gesellschaft fur Angewandte Biotechnologie GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chrombios Gesellschaft fur Molekulare Zytogenetik GmbH, Metabion Gesellschaft fur Angewandte Biotechnologie GmbH filed Critical Chrombios Gesellschaft fur Molekulare Zytogenetik GmbH
Priority to AU13868/00A priority Critical patent/AU1386800A/en
Publication of WO2000032810A1 publication Critical patent/WO2000032810A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Definitions

  • the invention relates to an in situ hybridization method and especially in situ hybridization methods using nucleic acid probes, in which the label is bound to the nucleic acid sequence via at least one dendrimeric structure.
  • ISH in si tu hybridization
  • si tu cytohybridization represents a special application of nucleic acid hybridization, in which the hybridization reaction in tissue sections, tissue culture cells, chromosome preparations and cell nuclei, each by means of appropriate pretreatment on a solid support , e.g. a slide that has been fixed.
  • DNA or RNA probes are currently used which have been labeled with hapten (e.g. biotin or digoxigenin), fluorescence-labeled nucleotides (dNTPs) or also radioactively labeled nucleotides.
  • hapten e.g. biotin or digoxigenin
  • dNTPs fluorescence-labeled nucleotides
  • PCR polymerase chain reaction
  • the hybridized probes are detected by means of fluorescence-coupled "reporter molecules” (e.g. avidin or antibodies against digoxigenin).
  • fluorescence-labeled dUTPs are used, the detection is carried out directly in the microscope, for radioactively labeled probes, for example, by means of X-ray film emulsions with which the slides are coated after the hybridization reaction has taken place.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the detection of complementary DNA sequences within a cell or chromosome cluster is more complex and complex. For example, sophisticated and complicated techniques are required for the appropriate sample preparation. Another important point is that the actual hybridization reaction takes place in a much more complex, since biological or essentially biological system. Even after denaturation for the dissociation of the DNA double strands, the DNA is essentially in its biological environment, that is to say surrounded by histone proteins, cell membranes and other cellular components. These cell components present in the vicinity of the DNA interfere with the hybridization reaction, for example by being able to prevent or restrict the access of the nucleic acid probes to the DNA.
  • DNA probes of different complexity have been developed, which are able to "stain” the smallest chromosome regions, larger chromosome sections, or entire chromosomes. These DNA probes are also known as "chromosome paints".
  • the possibility of detecting a DNA probe depends directly on the intensity of the fluorescence signal and the sensitivity of the microscopic procedure. The more fluorescent molecules the probe contains, the stronger the signal.
  • the sensitivity of the recording of the signals can be increased by highly sensitive camera systems, eg cooled "charge coupled device” (CCD) cameras, such as these be used for astronomy, and increased by support by means of digital image processing.
  • CCD charge coupled device
  • differently labeled fluorescent probes in the same experiment allows FISH signals to be displayed in different colors.
  • Different combinations of haptens and / or directly labeled probes can be used ("combinatorial labeling").
  • the differently labeled probes can produce differently colored chromosomes not only through different combinations but also through different concentrations of the fluorescent labeling molecules ("ratio labeling"). With both methods it is in principle conceivable to display all 24 different chromosomes of the human chromosome set in different colors.
  • ratio labeling In comparison to “combinatorial labeling", in which a separate fluorescence filter is required for each color, “ratio labeling” can be used with less complex microscopes in order to arrive at the same number of different colors. The generation of precise and reproducible ratios of the respective marking intensities with classic marking techniques is difficult or impossible. To date, there have been no published experiments in which ratio labeling has been successfully demonstrated for all 24 different human chromosomes.
  • labeled dUTPs are added to the reaction for the synthesis of the nucleotide probes. To ensure the incorporation of these molecules, they are offered in very high concentrations, but only a fraction is actually incorporated. Nucleotides that are not installed are discarded. The labeled dUTPs, however, account for more than 90% of the material costs in the manufacture of labeled DNA probes. The low installation rate is therefore an essential factor for the extreme cost of FISH experiments. A significant reduction in production costs could be achieved if the insertion of labeled nucleotides can be drastically improved.
  • oligonucleotides that have been labeled using dendrimers were used to amplify signals in molecular-biological hybridization experiments on isolated nucleic acids.
  • Urdea et al. (Gene 61: 3, 253-264, 1987) used this system to increase the sensitivity of the detection of hepatitis B viruses in human serum.
  • Shchepinov et al. (Nucl. Acid Res. 25:22, 4447-4454, 1997) synthesized oligonucleotides and radioactively labeled using dendrimers and achieved signal amplification when using these oligonucleotides as probes in hybridization assays on "oligonucleotide arrays".
  • Ddrimer-bearing oligonucleotides can be used as primers in PCR reactions.
  • Reasons for the unsuitability of a nucleic acid probe for hybridization in situ can be, for example, steric and / or electrostatic properties of the probe molecule.
  • the entire prerequisites that must be present for a nucleic acid probe in order to make it suitable for in-situ hybridization have not yet been researched to such an extent that it would be possible to predict an appropriate suitability if the molecular structure of the nucleic acid probe were known.
  • the object of the invention is to provide an alternative in si u hybridization method which has a number of advantages compared to the known methods: when using equivalent amounts signal amplification of nucleic acid probe (s) is made possible; the incorporation of marker molecules into the nucleic acid probe can be controlled more precisely by incorporation into the dendrimeric structure and the amount of signal amplification can thus be varied according to individual needs; due to the specifically possible incorporation of labeling molecules, there is also the possibility of labeling a nucleic acid probe with more than one type of labeling molecule in labeling ratios which can be varied according to individual requirements, which enables a more reproducible and more widely applicable ratio labeling; Due to the different synthetic strategy for the production of the nucleic acid probes, the immense costs due to the low incorporation rate of the labeled dNTPs into the nucleic acid probes for the Si u hybridization methods of the prior art are significantly reduced.
  • nucleotide probes to which dendrimers labeled with labeling molecules such as haptens, fluorescent dyes and radioactive compounds are attached, are used in in-situ hybridization and in particular in molecular cytogenetics and histology.
  • labeling molecules such as haptens, fluorescent dyes and radioactive compounds
  • the general structure of the nucleotide probes used according to the invention comprises three basic components:
  • one or more polyfunctional dendrimeric structures each of which is based on a central branching structural unit and is composed of a plurality of monomeric branching units and which are also referred to below as dendrimers or "trees", and
  • One or more labeling molecules for example hapten molecules and hapten-labeled compounds, fluorescent marker molecules or radioactively labeled compounds, which are attached to the outer ends of the dendrimers.
  • the polymer chain have the function of specifically recognizing certain polynucleic acid chains (RNA or DNA) on the basis of their nucleic acid sequence. Although the polymer chain will often be built up from the four monomeric building blocks of DNA or RNA or hybrids from the DNA and RNA building blocks, there is the possibility that the polymer's chemical composition differs significantly from these classic nucleic acid building blocks.
  • Possibilities of variation of the polynucleic acid chains lie on the one hand in the modification of the purine or pyrimidine bases, for example by generating the following building blocks: 5-methylcytosine, 5-bromocytosine, 5-ethynyluridine, 5- (1-propynyl) -2'-deoxyuridine , 2, 6-diaminopurine, 2-deoxyuridine, 2-deoxy-inosine, 2-deoxynebularine, 3-nitropyrrole, 5-nitroindole; in the modification of the ribose ring, for example to produce 2′-0-methyl and 3′-deoxy derivatives, and also in the modification of the covalent bond between the sugar residues, the backbone of the polymer strand.
  • the phosphorus atom can be preserved and the oxygen atoms can be partially replaced, for example, by sulfur atoms, methylene, dialkylamino, methoxy, ethoxy groups.
  • An example of this are phosphothioate oligonucleotides.
  • the entire phosphorus diester bridge can also be replaced by other functional units, such as carbamates, urea, guanidines, amines, amides, ethers, thioethers, ketones, acetals, hydroxylamines or sulfamates.
  • PNAs polypeptide nucleic acids
  • peptide nucleic acids are achiral, uncharged polyamide nucleic acids, which act as oligonucleotide analogs and which consist of a polyamide backbone made from repeating aminoethylglycine units.
  • the purine or pyrimidine bases are covalently bound to the backbone via an acetyl spacer.
  • the polymer chain can likewise be constructed as a hybrid of the monomeric building blocks, for example DNA, RNA, PNA and O-methyl-RNA, and optionally have one or more different ones of the further modifications explained above by way of example.
  • it is essential that the resulting polymeric chain has the ability to specifically recognize a particular sequence section of RNA or DNA, ie to hybridize with it. This is the case when the polymeric chain can spatially align the optionally modified purine and pyrimidine bases so that they can base pair with complementary purine and pyrimidine bases of the DNA or RNA strand to be analyzed.
  • the dendrimers can be covalently attached to the 5 'end of the polymer chain, internally via a modified base or via the backbone.
  • the degree of branching of the dendrimers and ultimately also the number of functional groups that are available for the attachment of marker molecules is determined by the structure of the mono units from which the tree structure is built.
  • the simplest monomer is a phosphoramidite based on glycerin. Two hydroxyl groups are protected with a dimethoxytrityl group and a further hydroxyl group is activated as cyanoethyl phosphoramidite. The number of reactive 5'-hydroxyl groups doubles in each coupling cycle, whereby 2 n functional hydroxyl groups are obtained with n condensations. Synthones based on pentaerythritol triple the number of reactive hydroxyl functions.
  • a large number of monomeric units and their combinations are available for the construction of the dendrimers.
  • the degree of branching can be increased by a larger number of hydroxyl groups (eg sorbitol; saccharides) or the hydroxyl group can be replaced by other nucleophilic groups, such as amino or thiol functions.
  • Methylene groups can be substituted by N-alkyl derivatives, P-alkyl derivatives or the alkyl spacers by polyoxyethylene chains of various lengths.
  • the tree structures can be built up selectively by choosing a suitable orthogonal protection group technique and strategy.
  • a monomer comprising several hydroxyl groups can be used, in which the individual hydroxyl groups are protected by different types of protective groups. Due to a suitable selection of the protective groups, probes are thus accessible which contain a different number of markings and possibly also types of markings in a desired ratio.
  • a glycerin-based monomer can be used in which one hydroxyl function is protected with a dimethoxytrityl group and the other with a levulinyl group.
  • Nucleic acid probes currently particularly preferred in the context of this invention are based on the dendrimer structure concept described in the examples below and which can also be taken from FIG. 1 by way of example.
  • the marker molecules are the marker molecules.
  • marking molecules known in the prior art for use with nucleic acid probes or primers such as hapten molecules, fluorescent marker molecules (fluorochromes), chromophores, chemiluminescent molecules, radioactively marked molecules or enzymatically active molecules or fragments, can be used as marking molecules.
  • Labeling molecules such as haptens or fluorescent dyes, which are available as phosphoramidite, can be coupled directly to the free hydroxyl functions which form the outer ends of the dendrimers. Labels that are present as active esters must be attached via amino-functionalized dendrimer ends.
  • Digoxigenin, biotin, dinitrophenol, estradiol, benzopyran or also fluorescein isothiocyanate (FITC) can be used as haptens. After the hybridization reaction, haptens can be detected using an anti-hapten labeled, preferably using a fluorescent molecule.
  • avidin e.g. avidin-Cy5, avidin-FITC, avidin-Cy3
  • Digoxigenin is raised using an anti-digoxigenin antibody, e.g. of a FITC-conjugated anti-digoxigenin antibody or rhodamine-anti-digoxigenin antibody.
  • FITC labeling molecules can, for example, be detected using a primary unlabeled rabbit anti-FITC antibody and a secondary FITC-conjugated goat anti-rabbit antibody in succession.
  • the fluorescent dyes which can be used as a labeling molecule in the present context are numerous. Fluorescein isothiocyanate (FITC), cyanine dyes such as e.g. Cyanin2, Cyanin3, Cyanin3.5, Cyanin5, Cyanin5.5 and Cyanin7, Rhodamin, Rhoda in 110, Lissamin, Phycoerythrin, Fern, FluorX, Hex (Hexachlorfluorescein), Tet (Tetrachlorofluorescein), Texas Red, Fluorescein, Rox , Tamra, Joe, the BODIPY dyes, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Spectrum Green, Spectrum Orange, the Alexa dyes, pyrene, eosin or erythrosine.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • cyanine dyes such as e.g. Cyanin2, Cyanin3, Cyanin3.5, Cyanin5, Cyanin5.5 and Cyan
  • Donor-acceptor pairs energy transfer pairs
  • the nucleic acid probes which can be used according to the invention can be produced with their entire nucleic acid sequence by, in particular, automated synthesis, as is explained, for example, in Example 1. However, they are preferred starting from the oligonucleotide primers containing the dendrimers, which e.g. are prepared as described in Example 1. In this case, the nucleic acid probe is produced, for example, by a PCR reaction to extend the oligonucleotide portion to the desired length. Chromosome-specific DNA serves as the PCR template. Various methods are known to the person skilled in the art for the production of chromosome preparations suitable for this purpose. With this method it is possible to incorporate 100% of the label of the primer into the synthesized probe. Alternatively, the nucleic acid probes are labeled by means of "random priming" using the oligonucleotide primers containing the dendrimer (s).
  • the in situ hybridization method according to the invention is characterized in that at least one nucleic acid probe is used for the si u hybridization, which comprises at least one dendrimer that is labeled with one or more labeling molecules.
  • at least one nucleic acid probe is used for the si u hybridization, which comprises at least one dendrimer that is labeled with one or more labeling molecules.
  • more than one label molecule and / or more than one label molecule type can be bound to a dendrimer structure his.
  • the polymer chain can also carry more than one dendrimer structure labeled with labeling molecule (s).
  • a nucleotide probe that can be used in accordance with the invention can carry a plurality of dendrimers, each of which has different labeling molecules bound to it, here also being considered as a possibility of providing several different types of labeling molecules on one and the same dendrimer.
  • the nucleic acid probe comprises different types of marker molecules in a certain, precisely defined relationship to one another.
  • the nucleic acid probe explained above can be used, for example, as a “chromosome paint”, as a centromer-specific probe or as a probe for identifying a gene.
  • the in situ hybridization method according to the invention can be carried out on a large number of biological or clinical samples from humans, animals or plants, on cells in mitosis and meiosis or on interphase cells, for example on chromosomes, cell nuclei, cells obtained from biological samples, such as lymphocytes from peri pure blood, cells from cell culture, tissue sections or spread DNA.
  • the hybridization method according to the invention using dendrimer-labeled nucleic acid probes is otherwise carried out by standard in si u hybridization techniques (see, for example, Gall and Pardue, 1981, Meth. Enzym. 21: 470-480; Henderson, 1982, Int. Review of Cytology 76: 1-46). Any necessary adaptation of the hybridization conditions can easily be carried out by the person skilled in the art on the basis of the numerous known in si u hybridization protocols.
  • in situ hybridization involves the following major steps:
  • the in situ hybridization reaction can also take place by means of the “pri ed in situ” (PRINS) method.
  • PRINS pri ed in situ
  • a mixture of primer, nucleotides and DNA polymerase is placed directly on previously denatured chromosomes on the slide.
  • an elongation takes place by means of the polymerase, which uses the chromosomal DNA as a template.
  • a nucleotide of the freely added nucleotides is usually labeled, be it with a hapten or a fluorescent dye.
  • the marking is introduced via the marking of the primer as in the FISH experiments described above. This can contain, for example, a dendrimer with eight biotin or FITC molecules or other dye molecules.
  • Primed in situ hybridization comprises the following Steps:
  • the detection reaction for the hybridization signal corresponds to that which is described below for the "chromosome painting" experiment.
  • the invention also relates to a kit for use in the in situ hybridization method according to the invention.
  • the kit comprises one or more of the nucleic acid probes explained above, which can be provided in the kit both individually and in the form of mixtures.
  • the nucleic acid probes in the kit they are formulated in a manner customary in the prior art and, if appropriate, mixed with customary auxiliaries.
  • the kit can also contain other reagents required for the si u hybridization, such as formamide and dextran sulfate, and, if necessary, additional reagents required for the detection of the labeling molecules, such as e.g. one or more antibodies.
  • additional reagents can be provided separately or, if possible, in the form of mixtures of certain components.
  • the preparations of the reagents can likewise comprise auxiliaries customary in the prior art, which, however, should not have a negative effect on the hybridization reaction and the subsequent detection.
  • kit may include instructions for use, which may also include drawings and reference pictures.
  • the new method should help to drastically reduce the effort (material and labor costs) when labeling the probes and will be essential for the economic success of DNA / RNA probes that are labeled at low cost.
  • Another advantage of this marking is that for the first time a precisely defined "ratio labeling" of DNA probes can be carried out.
  • probes are accessible that contain a different number of markings in a desired ratio.
  • the ratios of the labels can be determined precisely on the basis of the number of individual fluorochrome-labeled dendrimers.
  • a nucleotide probe can e.g. contain three FITC dendrimers, the other FITC and cyanine 3 in a ratio of 1: 2, etc.
  • the monomer based on the glycerol structure is used for these purposes.
  • One hydroxyl function is protected with a dimethoxytrityl group, the other with a levulinyl group.
  • Another advantage of this type of marking is the possibility of simply performing "multi-color" PRINS. In a normal PRINS reaction with the addition of labeled molecules, this is only possible if the entire experiment is carried out two or more times, the labeled nucleotides of the previous reaction having to be washed out in each case. A method that could not prevail in practice due to the complexity.
  • multi-reporter phosphoramidites to be coupled to one another multiple times enables the installation of the respective reporter molecules at any desired position and in any number, this synthesis preferably being automated.
  • the invention is described below using the example of three in situ hybridization methods according to the invention using dendrimer-labeled probe types, "chromosome paints” and satellite DNA as well as PRINS.
  • dendrimer-labeled probe types "chromosome paints” and satellite DNA as well as PRINS.
  • any other dendri-armed DNA, RNA or PNA probe can be used for the method according to the invention, the polymer chain portion of which is or could be complementary to a sequence section of the DNA present in the sample to be examined.
  • PCR primers were synthesized, each with a dendrimer containing eight biotin or eight fluorescein molecules. were.
  • the synthesis of these multi-labeled primers was carried out on an ABI 392 DNA synthesizer using standard phosphoramidite chemistry (ABI).
  • the synthesis cycle was carried out according to the conventional protocol described in ABI's User Manual for a 40 nmol synthesis.
  • the concentration of the phosphoramidites (A, G, C, T) used was 0.05 mol / 1.
  • the coupling yields were determined by measuring the conductivity of the DMT cation.
  • the branching branches of the dendrimer were made with Cruachem Ltd.'s symmetrical "branching phosphor amidite” based on the molecular structure of glycerin. (((DMTO-CH 2 ) 2 CH-0-CEP); C 54 N 6 ⁇ N 2 0 8 P); Order number 22-8424-17) synthesized.
  • the branching phosphor amidite which was dissolved with acetonitrile (max. 7 ppm water) to a concentration of 0.1 molar, was introduced into the synthesis cycle at a separate bottle position. The increase in the degree of branching could be followed via the conductivity measurements of the DMT cation (doubling of the measured values).
  • the CPG carrier (1000 A) was split off and the protective groups were split off with 33% ammonia solution (800 ⁇ l) at 55 ° C. for 6 hours. After the ammonia had been stripped off, the oligonucleotide was precipitated with 2 ml of ethanol after the addition of 60 ⁇ l of 3 M sodium acetate buffer, pH 5.2. After cooling for 20 min at -20 ° C., centrifuging at 13500 rpm, decanting the supernatant and dissolving the pellet in deionized or disinfected water, the amount of oligonucleotide was determined by UV measurement at 260 nm.
  • the structure is shown schematically in FIG. ture of the PCR primer oligonucleotide prepared above.
  • primers for the synthesis of the nucleic acid probes by means of PCR, primers, each as explained in the previous section, were used with a dendrimer of eight. Biotin or eight fluorescein molecules were used.
  • the PCR buffer used consisted of 100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 15 mM MgCl 2 , 500 nM KC1, 1% Triton X-100, 0.1% (w / v) stabilizer.
  • a 50 ⁇ l reaction mixture for probe synthesis contained the following components:
  • Taq polymerase 5 U / ⁇ l; SuperTaq, HT Biotechnology Ltd. 31.5 ⁇ l aqua dest.
  • nucleic acid probes were obtained as a so-called DOP-PCR product, which were subsequently used in in situ hybridization experiments.
  • the dendrimer and labeling section of the nucleic acid probes thus produced corresponds to the structure shown in FIG. 1; only the oligonucleotide section of the molecule shown there was extended by the PCR reaction.
  • 1 ⁇ l DOP-PCR product was used as a DNA probe in 14 ⁇ l hybridization buffer for hybridization on an area of 22 mm ⁇ 22 mm.
  • the hybridization buffer consisted of 50% formamide, 20% dextran sulfate in 2x SSC.
  • the DNA probe was denatured for 5 min at 70 ° C and then incubated for 60 min at 37 ° C so that repetitive DNA sequences could reassociate.
  • the denatured probe was placed directly on the denatured chromosomes without waiting for the DNA to reassociate.
  • Chromosome preparations were produced according to standard protocols.
  • An exemplary standard protocol comprises the following steps:
  • the preparation was stored at -20 ° C until use.
  • the slides with the chromosome preparation applied to them were incubated for 50-100 seconds in a cuvette preheated to 68 ° C. with 70% formamide / 2x SSC and then dehydrated in an ascending ethanol series (70%, 90%, 100%).
  • the DNA probe was pipetted onto a previously selected area of the slide, provided with a 22 mm x 22 mm cover glass and sealed with Fixogum.
  • the hybridization took place at 37 ° C ("chromosome paints") or 42 ° C (satellite DNAs) for 24 hours.
  • a further washing step in 4x SSC / 0.2% Tween (room temperature) was followed by the detection reaction of the DNA probes labeled with biotin using fluorescein-coupled avidin.
  • the detection reaction of the DNA probes labeled with biotin was carried out using fluorescein-coupled avidin and fluorescein-coupled anti-avidin antibody.
  • the former was diluted 1: 250 in 4x SSC / 1% Tween, 15% human AB serum, the antibody 1: 125 in the same solution. Both were combined in a 1: 1 ratio. 100 ⁇ l of this mixture were used per slide. There was an incubation at 37 ° C for 20 min. The mixture was then washed three times at 42 ° C. with 4x SSC / 1% Tween. If PCR primers were used that were exclusively labeled with directly fluorochrome-coupled dendrimer, a chromosomal counterstaining with DAPI followed instead.
  • the microscopic analysis was carried out on a Zeiss fluorescence microscope (Axioplan II), which was equipped with fluorescence filters from Chroma Techn., Bratlaffh, USA.
  • a 50 ⁇ l reaction mixture contained the following components:
  • This reaction mixture was applied to denatured chromosome preparations (preparation according to standard protocol) and incubated in a moist chamber at 65 ° C. for 2 min.
  • the reaction was then stopped by incubating the slides in a cuvette preheated to 65 ° C. and containing stop buffer (50 mM NaCL / 50 mM EDTA) for 5 min. The preparations were finally washed in 4 x SSC / 0.2% Tween for 5 min at room temperature. If the primers were labeled with biotin, a detection reaction followed, as already described. If primers were used which had only been labeled directly, only counterstaining with DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole) followed. The microscopy was carried out as already described.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein in situ-Hybridisierungsverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass für die in situ-Hybridisierung mindestens eine Nukleinsäuresonde verwendet wird, die mindestens ein Dendrimer umfasst, das mit einem oder mehreren Markierungsmolekülen markiert ist.

Description

IN SITU-HYBRIDISIERUNGSVERFAHREN MIT SONDEN, WELCHE DENDRIMERSTRUKTUREN ENTHALTEN
Die Erfindung betrifft ein in situ-Hybridisierungsverfahren und speziell in situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von Nukleinsäuresonden, bei denen die Markierung über mindestens eine dendrimere Struktur an die Nukleinsäuresequenz gebunden ist.
Die in si tu-Hybridisierung (ISH) oder, synonym, in si tu- Cytohybridisierung stellt eine spezielle Anwendung der Nuklein- säurehybridisierung dar, bei der die Hybridisierungsreaktion in Gewebeschnitten, Gewebekulturzellen, Chromosomenpräparationen und Zellkernen, die jeweils mittels entsprechender Vorbehandlung auf einem festen Träger, z.B. einem Objektträger, fixiert wurden, erfolgt.
Hierfür werden gegenwärtig DNA- oder RNA-Sonden eingesetzt, die mit Hapten (z.B. Biotin oder Digoxigenin) , Fluoreszenzmarkierten Nukleotiden (dNTPs) oder auch radioaktiv markierten Nukleotiden markiert worden sind. Die Markierung der Sonden erfolgt in der Regel über "nick translation", "random priming" oder über die Polymerasekettenreaktion (PCR) . Die hybridisierten Sonden werden im Falle einer Markierung mit Haptenen, wie Biotin oder Digoxigenin, mittels Fluoreszenz-gekoppelter "Reportermoleküle" (z.B. Avidin oder Antikörper gegen Digoxigenin) nachgewiesen. Im Falle einer Verwendung von Fluoreszenz-markierten dUTPs erfolgt der Nachweis direkt im Mikroskop, bei radioaktiv markierten Sonden beispielsweise mittels Röntgenfilmemulsionen, mit denen die Objektträger nach erfolgter Hybridisierungsreaktion überzogen werden.
Beispielsweise wird gegenwärtig insbesondere die Fluores- zenz-in si tu-Hybridisierung (FISH) an Chromosomen und Geweben in verschiedenen Feldern der biologischen Grundlagenforschung und der medizinischen Diagnostik angewandt. Das in situ-Hybridisierungsverfahren erlaubt es nicht nur, die molekulare Homologie einer Sonde zu einem bestimmten Genomabschnitt zu belegen, sondern darüber hinaus mit Hilfe der Sonde die homologe DNA- oder RNA-Sequenz räumlich im Zellverband, in einer Zelle oder innerhalb eines Chromosomensatzes zu lokalisieren. Dies ist der wichtigste Unterschied zu klassischen molekularbiologischen Hybridisierungen (z.B. Blot-Hybridisie- rungen, wie "Southern-Blot" oder "Northern-Blot", u.a.).
Gegenüber den klassischen molekularbiologischen Hybridisie- rungsexperimenten, die an isolierter DNA erfolgen, ist der Nachweis komplementärer DNA-Sequenzen innerhalb eines Zeil- oder Chromosomenverbands aufwendiger und komplizierter. So sind beispielsweise für die geeignete Probenvorbereitung ausgefeilte und komplizierte Techniken erforderlich. Ein weiterer wesentlicher Punkt besteht darin, daß die eigentliche Hybridisierungsreaktion in einem wesentlich komplexeren, da biologischen oder im wesentlichen biologischen System erfolgt. Auch nach der Denaturierung zur Dissoziation der DNA-Doppelstränge liegt die DNA im wesentlichen in ihrer biologischen Umgebung vor, also umgeben von Hi- ston-Proteinen, Zellmembranen und weiteren zellulären Komponenten. Diese in der Umgebung der DNA vorliegenden Zellkomponenten interferieren mit der Hybridisierungsreaktion, indem sie beispielsweise den Zutritt der Nukleinsäuresonden zu der DNA verhindern oder einschränken können.
In den letzten Jahren wurden Fluoreszenz-markierte DNA- Sonden von unterschiedlicher Komplexität entwickelt, die in der Lage sind, kleinste Chromosomenregionen, größere Chromosomenabschnitte, oder ganze Chromosomen "anzufärben". Diese DNA-Sonden werden auch als "chromosome paints" bezeichnet. Die Möglichkeit, eine DNA-Sonde nachzuweisen, hängt unmittelbar mit der Intensität des Fluoreszenzsignals und der Empfindlichkeit des mikroskopischen Verfahrens ab. Je mehr fluoreszierende Moleküle die Sonde enthält, desto stärker ist das Signal. Die Empfindlichkeit der Aufnahme der Signale kann durch hoch-sensitive Kamerasysteme, z.B. gekühlte "charge coupled device" (CCD) -Kameras, wie sie für die Astronomie verwendet werden, und durch Unterstützung mittels der digitalen Bildverarbeitung gesteigert werden.
Die Verwendung von unterschiedlich markierten fluoreszierenden Sonden im gleichen Experiment erlaubt die Darstellung von FISH-Signalen in unterschiedlichen Farben. Dabei können verschiedene Kombinationen von Haptenen und/oder direkt markierte Sonden eingesetzt werden ("combinatorial labelling"). In einem anderen Ansatz können die unterschiedlich markierten Sonden nicht nur durch unterschiedliche Kombinationen sondern auch durch unterschiedliche Konzentrationen der fluoreszierenden Markierungsmoleküle verschieden angefärbte Chromosomen erzeugen ("ratio labelling"). Mit beiden Verfahren ist es prinzipiell denkbar, alle 24 verschiedenen Chromosomen des menschlichen Chromosomensatzes in unterschiedlichen Farben darzustellen. Gezeigt wurde dies bisher aber nur für das "combinatorial labelling" (Speicher et al., Nature Genet 12: 368-375, 1996; Schröck et al., Science 273: 494-491 , 1996; siehe auch US-Patent 8, 640, 657) .
Im Vergleich zum "combinatorial labelling", bei dem für jede Farbe ein eigener Fluoreszenzfilter benötigt wird, kann beim "ratio labelling" mit weniger aufwendigen Mikroskopen gearbeitet werden, um zur gleichen Zahl unterschiedlicher Farben zu kommen. Die Erzeugung von präzisen und reproduzierbaren Verhältnissen ("ratios") der jeweiligen Markierungsintensitäten mit klassischen Markierungstechniken ist aber schwierig bis unmöglich. Es gibt bisher keine publizierten Experimente, in denen ein "ratio labelling" erfolgreich für alle 24 unterschiedlichen Chromosomen des Menschen gezeigt wurde.
Bei den oben genannten gängigen Markierungssystemen werden markierte dUTPs der Reaktion zur Synthese der Nukleotidsonden zugegeben. Um einen Einbau dieser Moleküle zu gewährleisten, werden sie in sehr hoher Konzentration angeboten, aber nur ein Bruchteil wird tatsächlich eingebaut. Nicht eingebaute Nukleoti- de werden verworfen. Die markierten dUTPs machen jedoch mehr als 90% der Materialkosten bei der Herstellung markierter DNA-Sonden aus. Damit ist die geringe Einbaurate ein wesentlicher Faktor für die extremen Kosten von FISH-Experimenten. Eine wesentliche Verringerung der Produktionskosten könnte erreicht werden, wenn es gelingt, den Einbau markierter Nukleotide drastisch zu verbessern.
Die bisher gängigen Verfahren zur Markierung der Sonden haben darüber hinaus den weiteren Nachteil, daß das Ausmaß der Markierung nur unzureichend kontrolliert werden kann, z.B. wenn zwei unterschiedliche Haptene in die gleiche Sonde eingebaut werden sollen. Ein präzises, reproduzierbares "ratio labelling" ist im Rahmen derartiger Markierungen nicht möglich.
Seit Ende der 70er Jahre hat sich die Chemie der polyfunktionalen organischen "starburst"-Polymere (Kaskaden, Silvane, Arborane, Dendrimere) zu einem wichtigen Zweig der Polymerwissenschaft entwickelt. Gemeinsam ist diesen Polymeren, daß sie eine Mehrzahl von organischen Molekülketten aufweisen, die sich von einem gemeinsamen Zentrum aus nach außen erstrecken. Für deren Synthese wurden zwei grundlegende Strategien vorgeschlagen: eine divergente Synthese, bei der die Struktur ausgehend von dem Zentrum in Richtung der Peripherie aufgebaut wird, und eine konvergente Synthese mit einem Wachstum des Moleküls von der Peripherie zum Zentrum.
Das diesen "starbursf-Poly eren zugrundeliegende strukturelle Konzept wurde auch im Bereich der Biotechnologie aufgegriffen, und zwar in Verbindung mit der durch diese Strukturen gebotenen Möglichkeit, eine Mehrzahl von Markierungsmolekülen an einer einzelnen molekularen Grundstruktur vorzusehen und damit eine Amplifizierung eines Markierungssignals zu erzielen.
So wurden Oligonukleotide, die mittels Dendrimeren markiert worden sind, verwendet, um in molekularbiologischen Hybridisie- rungsexperimenten an isolierten Nukleinsäuren Signale zu verstärken. Urdea et al. (Gene 61:3, 253-264, 1987) verwendeten dieses System, um die Empfindlichkeit des Nachweises von Hepatitis B-Viren im menschlichen Serum zu steigern. Shchepinov et al. (Nucl. Acid Res. 25:22, 4447-4454, 1997) synthetisierten mittels Dendrimeren mehrfach radioaktiv markierte Oligonukleotide und erzielten bei Einsatz dieser Oligonukleotide als Sonden in Hy- bridisierungsassays an "oligonucleotide arrays" eine Signalverstärkung. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, daß Den- drimer-tragende Oligonukleotide in PCR-Reaktionen als Primer verwendet werden können.
Nach Kenntnis der Anmelder wurden somit Hybridisierungen unter Verwendung von Nukleinsäuresonden, bei denen eine Mehrzahl von Markierungsmolekülen über eine dendrimere Struktur an die für die Hybridisierung zur Verfügung stehende Nukleinsäurese- quenz gebunden ist, nur an isolierten Nukleinsäuremolekülen, also in rein molekularbiologischen Hybridisierungsverfahren durchgeführt .
Wie bereits vorstehend erläutert, liegt im Vergleich zu rein molekularbiologischen Hybridisierungsverfahren bei in situ- Hybridisierungsverfahren ein wesentlich komplexeres Reaktionssystem vor, bei dem insbesondere makromolekulare Zellbestandteile, wie Histonproteine und zelluläre Membranen, neben der zu analysierenden DNA anwesend sind. Diese makromolekularen Zellbestandteile, die sich z.T. auch nach einer Denaturierung zur Trennung der DNA-Doppelstränge in enger Assoziierung mit der zu analysierenden DNA befinden, interferieren mit Nukleinsäuresonden und können bei fehlender Eignung der Sonden dazu führen, daß trotz komplementärer Sequenzen keine Hybridisierung mit der zu analysierenden zellulären DNA erfolgt. Gründe für die fehlende Eignung einer Nukleinsäuresonde für die in si tu-Hybridisierung können beispielsweise in sterischen und/oder elektrostatischen Eigenschaften des Sondenmoleküls liegen. Jedoch sind die gesamten Voraussetzungen, die bei einer Nukleinsäuresonde vorliegen müssen, um diese für eine in si tu-Hybridisierung geeignet zu machen, bei weitem noch nicht so umfassend erforscht, als daß eine Voraussage einer entsprechenden Eignung bei Kenntnis der Molekülstruktur der Nukleinsäuresonde möglich wäre.
Ein einfacher Rückschluß aus der Eignung einer Nukleinsäuresonde für rein molekularbiologische Hybridisierungsexperimente an "isolierter" DNA auf eine entsprechende Eignung für in situ- Hybridisierungsverfahren ist somit nicht möglich.
Gegenüber dem hier dementsprechend allein einschlägigen Stand der Technik in Verbindung mit in situ-Hybridisierungsverfahren liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein alternatives in si u-Hybridisierungsverfahren bereitzustellen, das im Vergleich zu den bekannten Verfahren eine Reihe von Vorteilen aufweist : bei einer Verwendung äquivalenter Mengen von Nukleinsäuresonde (n) wird eine Signalverstärkung ermöglicht; der Einbau von Markierungsmolekülen in die Nukleinsäuresonde kann über den Einbau in die dendrimere Struktur genauer gesteuert und damit das Ausmaß der Signalverstärkung nach den individuellen Bedürfnissen gezielt variiert werden; aufgrund des gezielt möglichen Einbaus von Markierungsmolekülen besteht ferner die Möglichkeit, eine Nukleinsäuresonde mit mehr als einem Markierungsmolekültyp in nach den individuellen Bedürfnissen variierbaren Markierungsverhältnissen zu markieren, was ein besser reproduzierbares und umfassender einsetzbares "ratio labelling" ermöglicht; aufgrund der andersartigen Synthesestrategie für die Herstellung der Nukleinsäuresonden werden die immensen Kosten aufgrund der nur geringen Einbaurate der markierten dNTPs in die Nukleinsäuresonden für die in si u-Hybridisierungsverfahren des Standes der Technik deutlich verringert.
Hier wird erstmals ein Verfahren beschrieben, in dem Nu- kleotidsonden, an die mit Markierungsmolekülen, wie Haptenen, Fluoreszenzfarbstoffen und radioaktiven Verbindungen, markierte Dendrimere angeknüpft sind, in der in situ-Hybridisierung und insbesondere in der molekularen Zytogenetik und Histologie eingesetzt werden. Gegenstand der Erfindung sind die in situ- Hybridisierungsverfahren und Kits zur Verwendung in diesen Verfahren, wie sie in den Ansprüchen definiert sind.
Aufgrund der komplexen Zusammensetzung der Hybridisie- rungsprobe mit z.T. eng mit der zu analysierenden DNA assoziierten makromolekularen Zellbestandteilen und angesichts des bedingt durch die ausladenden dendrimeren Strukturen überaus hohen sterischen Platzbedarfs der erfindungsgemäß eingesetzten Nukleinsäuresonden war die Feststellung der Eignung dieser Nukleinsäuresonden für die in situ-Hybridisierung völlig überraschend. Wie erläutert, konnte diese Eignung aufgrund der aus dem Stand der Technik bekannten Hybridisierungsexperimente in Lösung oder von Oligonukleotiden an Oligonukleotid-Arrays nicht erwartet werden, da bei diesen Experimenten die zu analysierende DNA stets isoliert von übrigen zellulären Bestandteilen vorlag.
In dem hier vorgeschlagenden Verfahren
• werden komplexe Sonden (z.B. mittels "degenerate oligonucleo- tide primed PCR, Telenius et al . , 1992, Genes, Chromosomes & Cancer 4:257-263), die Dendrimere enthalten, hergestellt und
• diese Sonden werden an komplexe biologische Strukturen, wie z.B Zellen, Zellkerne und Chromosomen, hybridisiert.
Der generelle Aufbau der erfindungsgemäß eingesetzten Nu- kleotidsonden umfaßt drei grundlegende Komponenten:
- eine polymere Kette, die in der Lage ist, DNA-Sequenzen als komplementär zu erkennen,
- eine oder mehrere polyfunktionale dendrimerische Strukturen, die jeweils ausgehend von einer zentralen verzweigenden Struktureinheit aus einer Mehrzahl monomerer verzweigender Einheiten aufgebaut sind und die im Folgenden auch als Dendrimer oder "Bäumchen" bezeichnet werden, und
- ein oder mehrere Markierungsmoleküle, beispielsweise Hapten- Moleküle und Hapten-markierte Verbindungen, Fluoreszenzmarker- moleküle oder radioaktiv markierte Verbindungen, die an den äußeren Enden der Dendrimere angeknüpft sind.
ie polymere Kette Die polymeren Ketten haben die Funktion, bestimmte Polynu- kleinsäureketten (RNA oder DNA) aufgrund von deren Nukleinsäure- abfolge spezifisch zu erkennen. Obwohl die polymere Kette häufig aus den vier monomeren Bausteinen der DNA oder RNA oder Hybriden aus den DNA- und RNA-Bausteinen aufgebaut sein wird, besteht die Möglichkeit, daß sich das Polymer in seiner chemischen Zusammensetzung von diesen klassischen Nukleinsäurebausteinen deutlich unterscheidet. Variationsmöglichkeiten der Polynukleinsäureket- ten liegen zum einen in der Modifizierung der Purin- bzw. Pyri- midinbasen z.B. unter Erzeugung der folgenden Bausteine: 5- Methylcytosin, 5-Bromcytosin, 5-Ethinyluridin, 5- (1-Propinyl) - 2 '-desoxyuridin, 2, 6-Diaminopurin, 2-Desoxyuridin, 2-Desoxy- inosin, 2-Desoxynebularin, 3-Nitropyrrol, 5-Nitroindol; in der Modifizierung des Riboserings z.B. unter Erzeugung von 2'-0- Methyl- und 3 ' -Desoxy-Derivaten wie auch in der Modifizierung der kovalenten Verbindung zwischen den Zuckerresten, dem Rückgrat des Polymerstrangs. Bei diesen Rückgratmodifizierungen kann das Phosphoratom konserviert und die Sauerstoffatome teilweise z.B. durch Schwefelatome, Methylen-, Dialkylamino-, Methoxy-, Ethoxygruppen ersetzt sein. Ein Beispiel hierfür bilden Phos- phothioat-Oligonukleotide. Ebenso kann die gesamte Phosphordie- sterbrücke durch andere funktioneile Einheiten, wie Carbamate, Harnstoff, Guanidine, Amine, Amide, Ether, Thioether, Ketone, Acetale, Hydroxylamine oder Sulfamate ausgetauscht werden.
Ein gänzlich alternatives Konzept ist der Aufbau des Polymers aus sogenannten PNAs oder Peptidnukleinsäuren. Dabei handelt es sich um achirale, ungeladene Polyamidnukleinsäuren, die als Oligonukleotidanaloga fungieren und die aus einem Polyamidrückgrat aus sich wiederholenden Aminoethylglycyleinheiten bestehen. Die Purin- bzw. Pyrimidinbasen sind über einen Acetyl- Spacer kovalent an das Rückgrat gebunden.
Die polymere Kette kann gleichfalls als Hybrid aus den monomeren Bausteinen z.B. der DNA, RNA, PNA und O-Methyl-RNA aufgebaut sein und gegebenenfalls eine oder mehrere unterschiedliche der vorstehend beispielhaft erläuterten weiteren Modifizierungen aufweisen. In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist allein wesentlich, daß die resultierende polymere Kette die Fähigkeit aufweist, einen bestimmten Sequenzabschnitt von RNA oder DNA spezifisch zu erkennen, d.h. mit diesem zu hybridisieren. Dies ist dann der Fall, wenn die polymere Kette die daran gebundenen, gegebenenfalls modifizierten Purin- und Pyrimidinba- sen räumlich so ausrichten kann, daß diese eine Basenpaarung mit komplementären Purin- und Pyrimidinbasen des zu analysierenden DNA- oder RNA-Strangs eingehen können.
Die Dendrimere
Die Dendrimere können an das 5 '-Ende der polymeren Kette, intern über eine modifizierte Base oder über das Rückgrat kova- lent angeknüpft werden. Der Verzweigungsgrad der Dendrimere und letztlich auch die Anzahl der funktionellen Gruppen, die für die Anheftung von Markierungsmolekülen zur Verfügung stehen, wird durch die Struktur der mono eren Einheiten bestimmt, aus denen die Baumstruktur aufgebaut ist. Das einfachste Monomer ist ein Phosphoramidit, basierend auf Glycerin. Dabei sind zwei Hydroxylgruppen mit einer Dimethoxytritylgruppe geschützt und eine weitere Hydroxylgruppe ist als Cyanoethylphosphoramidit aktiviert. Bei jedem Kopplungszyklus verdoppelt sich die Anzahl der reaktiven 5 ' -Hydroxylgruppen, wodurch man bei n Kondensationen 2n funktionale Hydroxylgruppen erhält. Auf Pentaerythritol basierende Synthone verdreifachen die Anzahl der reaktiven Hy- droxylfunktionen .
Zum Aufbau der Dendrimere stehen eine Vielzahl von monomeren Einheiten und deren Kombinationen zur Verfügung. So kann der Verzweigungsgrad durch eine größere Anzahl von Hydroxylgruppen (z.B. Sorbit; Saccharide) erhöht oder die Hydroxylgruppe durch andere nukleophile Gruppen, wie z.B. Amino- oder Thiolfunktionen ersetzt werden. Methylengruppen können durch N-Alkyl-Derivate, P-Alkyl-Derivate oder die Alkyl-Spacer durch Polyoxyethylenket- ten unterschiedlichster Länge substituiert werden. Durch die Wahl von geeigneter orthogonaler Schutzgruppentechnik und -Strategie können diese Bäumchenstrukturen selektiv aufgebaut werden.
Hinsichtlich Beispielen für mögliche erfindungsgemäß einsetzbare Dendrimere und deren Herstellungsverfahren sei auf die folgenden Beispiele sowie die bereits erwähnten Veröffentlichungen von Urdea et al . (1987, a.a.O.) und Shchepinov et al. (1997, a.a.O.), deren Offenbarung in diese Anmeldung unter Bezugnahme aufgenommen wird, verwiesen.
Wie bereits erwähnt, können die Bäumchenstrukturen durch die Wahl von geeigneter orthogonaler Schutzgruppentechnik und -Strategie selektiv aufgebaut werden. Für diese Zwecke kann beispielsweise ein mehrere Hydroxylgruppen umfassendes Monomer eingesetzt werden, bei dem die einzelnen Hydroxylgruppen durch unterschiedliche Schutzgruppentypen geschützt sind. Aufgrund einer geeigneten Auswahl der Schutzgruppen sind somit Sonden zugänglich, die eine unterschiedliche Anzahl von Markierungen und ggf. auch Markierungstypen in einem gewünschten Verhältnis enthalten. So kann beispielsweise ein auf Glycerin basierendes Monomer eingesetzt werden, bei dem die eine Hydroxylfunktion mit einer Dimethoxytritylgruppe und die andere mit einer Levulinylgruppe geschützt ist.
Im Rahmen dieser Erfindung gegenwärtig besonders bevorzugte Nukleinsäuresonden beruhen auf dem in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen sowie auch aus der Figur 1 beispielhaft zu entnehmenden Dendrimer-Strukturkonzept .
Die Markierungsmoleküle
Als Markierungsmoleküle können sämtliche im Stand der Technik für eine Verwendung mit Nukleinsäuresonden oder Primern bekannten Markierungsmoleküle, wie Hapten-Moleküle, Fluoreszenz- markermoleküle (Fluorochrome), Chromophore, chemolumineszierende Moleküle, radioaktiv markierte Moleküle oder enzymatisch aktive Moleküle oder Fragmente, eingesetzt werden. Markierungsmoleküle, wie Haptene oder fluoreszierende Farbstoffe, die als Phosphoramidit erhältlich sind, können direkt an die freien Hydroxylfunktionen, die die äußeren Enden der Dendrimere bilden, gekoppelt werden. Markierungen, die als Aktivester vorliegen, müssen über aminofunktionalisierte Dendrimerenden angeknüpft werden.
Als Haptene können beispielsweise Digoxigenin, Biotin, Di- nitrophenol, Estradiol, Benzopyran oder auch Fluoresceinisothio- cyanat (FITC) eingesetzt werden. Nach der Hybridisierungsreaktion können Haptene unter Verwendung eines - bevorzugt mittels eines fluoreszierenden Moleküls - markierten Anti-Haptens nachgewiesen werden. Beispielsweise wird Avidin (z.B. Avidin-Cy5, Avi- din-FITC, Avidin-Cy3) verwendet, um Biotin-markierte Sonden nachzuweisen. Digoxigenin wird mittels eines anti-Digoxigenin- Antikörpers, z.B. eines FITC-konjugierten anti-Digoxigenin- Antikörpers oder Rhodamin-anti-Digoxigenin-Antikörpers, nachgewiesen. FITC-Markierungsmoleküle können beispielsweise unter nacheinander erfolgender Verwendung eines primären unmarkierten Kaninchen-anti-FITC-Antikörpers und eines sekundären FITC- konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörpers detektiert werden.
Die als Markierungsmolekül im vorliegenden Zusammenhang einsetzbaren fluoreszierenden Farbstoffe sind zahlreich. Lediglich beispielhaft seien hier Fluoresceinisothiocyanat (FITC) , Cyaninfarbstoffe, wie z.B. Cyanin2, Cyanin3, Cyanin3.5, Cyanin5, Cyanin5.5 und Cyanin7, Rhodamin, Rhoda in 110, Lissamin, Phycoe- rythrin, Farn, FluorX, Hex (Hexachlorfluorescein) , Tet (Tetra- chlorfluorescein) , Texas Red, Fluorescein, Rox, Tamra, Joe, die BODIPY-Farbstoffe, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Spectrum Green, Spectrum Orange, die Alexa- Farbstoffe, Pyrene, Eosin oder Erythrosin angeführt.
Denkbar sind hier auch Donor-Akzeptor-Paare (Energie- Transfer-Paare) , die kovalent an die Dendrimere gebunden werden.
Da es bei einer zu hohen Dichte an Fluoreszenzfarbstoffen zu Fluoreszenzlöschungen kommen kann, ist in einem solchen Falle das Vorsehen von Spacer-Struktureinheiten, wie langkettigen AI- kyl- oder Polyoxyethylenketten unterschiedlicher Länge, die als Abstandshalter (Spacer) dienen, an den äußeren Dendrimerenden ein probates Mittel, um dieses Phänomen zu unterdrücken. Die hierfür vorzunehmenden präparativen Maßnahmen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt.
Der Einbau der jeweiligen Markierungs- oder Reportermoleküle an jeder gewünschten Position und in beliebiger Anzahl, bevorzugt in einer automatisierten Synthese, wird insbesondere durch den Einsatz von mehrfach einander zu koppelnder "Multi- Reporter-Phosphoramidite", z.B. Multi-Biotin-Phosphoramidit, ermöglicht .
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Nukleinsäuresonden können mit ihrer gesamten Nukleinsäuresequenz durch insbesondere automatisierte Synthese, wie sie beispielsweise in Beispiel 1 erläutert wird, hergestellt werden. Bevorzugt werden sie jedoch ausgehend von das oder die Dendrimere enthaltenden Oligonukleo- tidprimern, die z.B. wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt werden, hergestellt. Die Nukleinsäuresonde wird in diesem Falle beispielsweise durch PCR-Reaktion zur Verlängerung des Oligonu- kleotidanteils bis zur gewünschten Länge hergestellt. Als PCR- Matrize dient dabei chromosomenspezifische DNA. Für die Herstellung von hierzu geeigneten Chromosomenpräparaten sind dem Fachmann diverse Methoden bekannt. Mit diesem Verfahren gelingt es, 100% der Markierung des Primers in die synthetisierte Sonde zu inkorporieren. Alternativ erfolgt die Markierung der Nukleinsäuresonden mittels "random priming" unter Verwendung der das oder die Dendrimere enthaltenden Oligonukleotidprimer .
Das erfindungsgemäße in situ-Hybridisierungsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß für die in si u-Hybridisierung mindestens eine Nukleinsäuresonde verwendet wird, die mindestens ein Dendrimer umfaßt, das mit einem oder mehreren Markierungsmolekülen markiert ist. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann mehr als ein Markierungsmolekül und/oder mehr als ein Markierungsmolekültyp an eine Dendrimerstruktur gebunden sein. Darüber hinaus kann die polymere Kette auch mehr als eine mit Markierungsmolekül (en) markierte Dendrimerstruktur tragen. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäß einsetzbare Nukleo- tidsonde mehrere Dendrimere tragen, die jeweils unterschiedliche Markierungsmoleküle daran gebunden aufweisen, wobei auch hier als eine Möglichkeit in Betracht gezogen wird, mehrere unterschiedliche Markierungsmolekültypen an ein und demselben Dendrimer vorzusehen. In einer besonderen Ausführungsform umfaßt die Nukleinsäuresonde unterschiedliche Markierungsmolekültypen in einem bestimmten, präzise festgelegten Verhältnis zueinander.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die vorstehend erläuterte Nukleinsäuresonde beispielsweise als "chromosome paint", als Zentromer-spezifische Sonde oder als Sonde zum Identifizieren eines Gens eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße in situ-Hybridisierungsverfahren kann an einer Vielzahl biologischer oder klinischer Proben von Menschen, Tieren oder Pflanzen, an Zellen in Mitose und Meiose oder an Interphasezellen ausgeführt werden, beispielsweise an Chromosomen, Zellkernen, aus biologischen Proben gewonnenen Zellen, wie Lymphozyten des peri- pheren Bluts, Zellen aus Zellkultur, Gewebeschnitten oder an gespreiteter DNA.
Das erfindungsgemäße Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von Dendrimer-markierten Nukleinsäuresonden erfolgt ansonsten durch Standard-in si u-Hybridisierungstechniken (siehe z.B. Gall und Pardue, 1981, Meth. Enzym. 21:470-480; Henderson, 1982, Int. Review of Cytology 76:1-46). Eine gegebenenfalls nötige Anpassung der Hybridisierungsbedingungen kann durch den Fachmann anhand der zahlreichen bekannten in si u-Hybridisierungsproto- kolle leicht vorgenommen werden.
Allgemein umfaßt die in situ-Hybridisierung die folgenden hauptsächlichen Schritte:
(1) Fixierung der zu analysierenden biologischen Probe;
(2) Behandlung der biologischen Probe, um die Zugänglichkeit der Ziel-DNA zu erhöhen (z.B. Denaturierung mittels Hitze oder Alkali) ; (3) gegebenenfalls eine Vorhybridisierungsbehandlung, um eine nicht-spezifische Bindung zu verringern (z.B. durch Blok- kieren der Hybridisierungskapazität repetitiver Sequenzen) ;
(4) Hybridisierung der Nukleinsäuresonde (n) mit den Nukleinsäuren in der biologischen Probe;
(5) Waschschritte zur Entfernung von während der Hybridisierungsreaktion nicht gebundenen Nukleinsäuresondenmolekülen;
(6) Nachweis der an die Ziel-DNA hybridisierten Nukleinsäuresonden;
(7) Gegebenenfalls Gegenfärbung der Chromosmen.
Die in situ-Hybridisierungsreaktion kann auch gemäß einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels des "pri ed in situ" (PRINS) - Verfahrens erfolgen. Hierbei wird eine Mischung aus Primer, Nukleotiden und DNA Poly- erase direkt auf zuvor denaturierte Chromosomen auf den Objektträger gegeben. Nach Hybridisierung des oder der Primer an die Zielsequenz auf dem Chromosom erfolgt eine Elongation mittels der Polymerase, welche die chromosomale DNA als Matrize benutzt. Üblicherweise ist ein Nukleotid der frei zugesetzten Nukleotide markiert, sei es mit einem Hapten oder einem Fluoreszenzfarbstoff. In dem hier beschriebenen Verfahren wird die Markierung wie bei dem zuvor beschriebenen FISH Experimenten über die Markierung des Primers eingebracht. Dieser kann beispielsweise ein Dendrimer mit acht Biotin- oder FITC-Molekülen oder anderen Farbstoffmolekülen enthalten.
Das Hybridisierungsverfahren erfolgt ansonsten durch Standard- Reaktionen (siehe z. B. Hindkj-er et al., in "In Situ Hybridization Protocols" . Vol. 33, Editor K. H. Andy Choo, Humana Press) Allgemein umfaßt die primed in situ-Hybridisierung folgende Schritte:
(1) Fixierung der zu analysierenden biologischen Probe
(2) Behandlung der biologischen Probe, um die Zugänglichkeit der Ziel-DNA zu erhöhen (z.B. Denaturierung mittels Hitze oder Alkali) (3) Hybridisierung des oder der Primer an das Chromosom und Elongation durch die Polymerase
(4) Beenden der Reaktion durch Inkubation in Stop-Puffer
(5) Waschschritte zur Entfernung ungebundener Primer
(6) Bei indirekter Markierung Nachweis mittels Fluoreszenzmarkierter Antikörper oder Avidin
(7) Gegebenenfalls Gegenfärbung der Chromosomen
Die Nachweisreaktion für das Hybridisierungssignal entspricht jener, die nachfolgend für das "chromosome painting"- Experiment beschrieben wird.
Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Kit zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen in situ-Hybridisierungsverfahren. Als wesentlichen Bestandteil umfaßt der Kit eine oder mehrere der vorstehend erläuterten Nukleinsäuresonden, die sowohl einzeln als auch in Form von Mischungen in dem Kit vorgesehen werden können. Für die Bereitstellung der Nukleinsäuresonden in dem Kit werden diese auf im Stand der Technik übliche Weise formuliert und gegebenenfalls mit üblichen Hilfsstoffen versetzt. Der Kit kann darüber hinaus weitere für die in si u-Hybridisierung erforderliche Reagenzien enthalten, wie Formamid und Dextransul- fat, und gegebenenfalls zusätzlich erforderliche Reagenzien für den Nachweis der Markierungsmoleküle, wie z.B. einen oder mehrere Antikörper, umfassen. Diese zusätzlichen Reagenzien können getrennt oder, sofern möglich, auch in Form von Mischungen bestimmter Komponenten vorgesehen werden. Die Zubereitungen der Reagenzien können ebenfalls im Stand der Technik übliche Hilfsstoffe umfassen, die jedoch die Hybridisierungsreaktion und den anschließenden Nachweis nicht negativ beeinflussen sollten.
Darüber hinaus kann der Kit eine Gebrauchsanweisung enthalten, die zusätzlich Zeichnungen und Referenzabbildungen enthalten kann. Das neue Verfahren soll den Aufwand (Material- und Arbeitskosten) bei der Markierung der Sonden drastisch verringern helfen und wird wesentlich für den wirschaftlichen Erfolg von entsprechend kostengünstig markierten DNA/RNA-Sonden sein.
Durch die Ankopplung einer Mehrzahl von Markierungsmolekülen über ein einzelnes Dendrimer oder alternativ auch über mehrere Dendrimere an die Nukleinsäuresonde wird eine bedeutende Signalverstärkung erzielt. Hierbei kann unter Umständen in Abhängigkeit von dem speziellen Aufbau des Dendrimers ein mehr als additiver Effekt beobachtet werden, d.h. das Signal erfährt eine größere Verstärkung als dies aufgrund der Anzahl der Markierungsmoleküle zu erwarten gewesen wäre. Es wird vermutet, daß dies ist auf einen gewissen Einfluß der Dendrimerstruktur zurückzuführen ist.
Ein weiterer Vorteil dieser Markierung ist, daß erstmalig auch ein genau definiertes "ratio labelling" von DNA-Sonden durchgeführt werden kann. Durch geschickte Auswahl der Schutzgruppenkombinationen sind Sonden zugänglich, die eine unterschiedliche Zahl von Markierungen in einem gewünschten Verhältnis enthalten. Werden z.B. Sonden mit PCR-Primern markiert, die mit FITC bzw. mit Cyanin 3 markierte Dendrimere enthalten, können die Verhältnisse der Markierungen anhand der Anzahl der einzelnen Fluorochrom-markierten Dendrimeren genau bestimmt werden. Eine Nukleotidsonde kann z.B. drei FITC-Dendrimere enthalten, die andere FITC und Cyanin 3 im Verhältnis 1:2, usw. Durch die Wahl einer geeigneten orthogonalen Schutzgruppentechnik können diese Bäumchenstrukturen, wie erläutert, selektiv aufgebaut werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird für diese Zwecke das auf der Glycerinstruktur basierende Monomer eingesetzt. Dabei wird eine Hydroxylfunktion mit einer Dimethoxytritylgruppe, die andere mit einer Levulinylgruppe geschützt.
Ein derart präzises "ratio labelling" ist mit herkömmlichen Verfahren der PCR-Markierung oder mit "nick translation" nicht möglich und wird es erlauben, daß die "Viel-Farben" -Fluoreszenz- mikroskopie drastisch vereinfacht werden kann. Im Vergleich zu dem klassischen "combinatorial labelling" kann mit weniger Filtern gearbeitet werden, um zu der gleichen Anzahl unterschiedlicher Farben zu kommen.
Eine weiterer Vorteil dieser Markierungsweise ist die Möglichkeit, einfach "Multi colour" PRINS durchzuführen. Bei normaler PRINS-Reaktion unter Zusatz markierter Moleküle ist das nur bei zwei- oder mehrfacher Durchführung des gesamten Experiments möglich, wobei die markierten Nukleotide der vorangegangenen Reaktion jeweils herausgewaschen werden müssen. Eine Methode, die sich aufgrund der Umständlichkeit in der Praxis nicht durchsetzen konnte.
Der Einsatz von mehrfach aneinander zu koppelnden "Multi- Reporter-Phosporamiditen" ermöglicht den Einbau der jeweiligen Reportermoleküle an jeder gewünschten Position und in beliebiger Anzahl, wobei diese Synthese bevorzugt automatisiert wird.
Zur Veranschaulichung wird die Erfindung im Folgenden am Beispiel dreier erfindungsgemäßer in situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung Dendrimer-markierter Sondentypen, von "chromosome paints" und von Satelliten-DNA sowie von PRINS, beschrieben. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist aber prinzipiell auch jede andere dendri er- arkierte DNA-, RNA- oder PNA- Sonde einsetzbar, deren polymerer Kettenanteil komplementär zu einem Sequenzabschnitt der in der zu untersuchenden Probe vorliegenden DNA ist oder sein könnte.
BEISPIELE
A FISH Experimente
1. Synthese der Nukleinsäuresonden
PCR-Primer-Synthese
Es wurden PCR-Primer synthetisiert, die jeweils mit einem Dendrimer mit acht Biotin- oder acht Fluorescein-Molekülen mar- kiert waren. Die Synthese dieser mehrfach markierten Primer wurde an einem ABI 392 DNA Synthesizer mittels der Standardphos- phoramidit-Chemie (ABI) durchgeführt. Der Synthesezyklus erfolgte gemäß dem im Benutzerhandbuch ("User Manual") von ABI beschriebenen konventionellen Protokoll für eine 40 nMol Synthese. Die Konzentration der eingesetzten Phosphoramidite (A, G, C, T) lag bei 0,05 mol/1. Die Kopplungsausbeuten wurden über Leitfähigkeitsmessung des DMT-Kations bestimmt. Die sich verzweigenden Äste des Dendrimers wurden mit dem auf der molekularen Struktur von Glycerin basierenden symmetrischen "Branching-Phosphor- amidit" von Cruachem Ltd. ( ( (DMTO-CH2) 2CH-0-CEP) ; C54N6ιN208P) ; Bestellnummer 22-8424-17) synthetisiert. Das Branching-Phosphor- amidit, das mit Acetonitril (max. 7 ppm Wasser) auf eine Konzentration von 0,1 molar gelöst wurde, wurde an einer separaten Flaschenposition in den Synthesezyklus eingeführt. Die Zunahme des Verzweigungsgrades konnte über die Leitfähigkeitsmessungen des DMT-Kations (Verdoppelung der gemessenen Werte) verfolgt werden. Nach drei Zyklen erhielt man acht freie Hydroxylgruppen an der Peripherie des Dendrimers. Die Modifizierung mit Biotin bzw. Fluorescein erfolgte mittels der Amidite von Cruachem Ltd. (Fluorescein; Bestellnummer 22-8409-35) und ABI (Biotin; Bestellnummer 401396) . Sowohl der Aufbau des Dendrimers als auch die Modifizierung der freien Hydroxylgruppen mit Biotin bzw. Fluorescein zur Markierung des Dendrimers erfolgten nach dem vorstehend erwähnten Standardprotokoll für eine 40 nMol Synthese.
Die Abspaltung vom CPG-Träger (1000 A) und die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte mit 33% Ammoniak-Lösung (800 μl) bei 55°C über 6h. Nach Abziehen des Ammoniaks wurde das Oligonukleo- tid nach Zugabe von 60 μl 3 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2, mit 2 ml Ethanol ausgefällt. Nach 20 min Abkühlen bei -20°C, Zentrifu- gation bei 13500 U/min, Dekantieren des Überstandes und Lösen des Pellets in entionisiertem oder desinfiziertem Wasser wurde die Menge an Oligonukleotid durch UV-Messung bei 260 nm bestimmt .
Zur Veranschaulichung ist in Figur 1 schematisch die Struk- tur des vorstehend hergestellten PCR-Primer-Oligonukleotids gezeigt .
Herstellung der Nukleinsäuresonden mittels PCR
Für die Synthese der Nukleinsäuresonden mittels PCR wurden Primer, die jeweils, wie im vorangegangenen Abschnitt erläutert, mit einem Dendrimer mit acht. Biotin- bzw. acht Fluorescein- Molekülen markiert waren, verwendet. Für die PCR wurde der Primer 6-MW (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3'; N = A, C, G oder T) (Telenius et al., 1992, a.a.O.) verwendet. Der verwendete PCR-Puffer bestand aus 100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 15 mM MgCl2, 500 nM KC1, 1% Triton X-100, 0,1% (Gew. /Vol.) Stabilisator.
Als Matrize für die PCR-Reaktion diente menschliche, voram- plifizierte („primary*) chromosomenspezifische DNA.
Ein 50 μl-Reaktionsansatz für die Sondensynthese enthielt folgende Komponenten:
1 μl DNA-Matrize (etwa 50 ng)
5 μl lOx PCR-Puffer
5 μl lOx dNTP-Mix (Endkonzentration: jeweils 250 uM)
5 μl 6 MW-Primer, markiert mit Dendrimeren
(etwa 20 uM)
2 μl 25mM MgCl2
0, . 5 μl Taq-Polymerase (5 U/μl; SuperTaq, HT Biotechnolo- gy Ltd. ) 31,5 μl Aqua dest .
Es wurden folgende PCR-Bedingungen gewählt (Hybai TouchDown Thermocycler) :
9 °C 5 Min. (Anfangsdenaturierung, lx)
94°C 1 Min.
30 Zyklen 62°C 1 Min.
72°C 1 Min.
72°C 5 Min. Auf diese Weise wurden Nukleinsäuresonden als sogenanntes DOP-PCR-Produkt erhalten, die in der Folge in in situ-Hybridi- sierungsexperimenten eingesetzt wurden. Der Dendrimer- und Markierungsabschnitt der so erzeugten Nukleinsäuresonden entspricht der in Figur 1 gezeigten Struktur; es wurde lediglich der Oligo- nukleotidabschnitt des dort gezeigten Moleküls durch die PCR- Reaktion verlängert.
2) FISH mit "chromosome paints" und Satelliten-DNA in si u-Hybridisierung
Es wurde 1 μl DOP-PCR-Produkt als DNA-Sonde in 14 μl Hybri- disierungspuffer für eine Hybridisierung auf einer Fläche von 22 mm x 22 mm eingesetzt. Der Hybridisierungspuffer bestand aus 50% Formamid, 20% Dextransulfat in 2x SSC. Die DNA-Sonde wurde 5 min bei 70°C denaturiert und anschließend 60 min bei 37°C inkubiert, sodaß repetitive DNA-Sequenzen reassoziieren konnten.
Bei der Hybridisierung von Satelliten-DNAs wurde die denaturierte Sonde direkt auf die denaturierten Chromosomen gegeben, ohne eine Reassoziierung der DNA abzuwarten.
Die Herstellung von Chromosomenpräparaten erfolgte nach Standardprotokollen. Ein beispielhaftes Standardprotokoll umfaßt die folgenden Schritte:
1) Synchronisation der Zellen durch Colchizin. Nach Zugabe von Colchizin zu einer Endkonzentration von 0,1 μg/ml wurde die Kultur 1-2 Stunden bei 37 °C inkubiert.
2) Hypotone Behandlung der Zellen. Nach Trypsinisieren und Ab- zentrifugieren der Zellen wurden sie in 10 ml 0,4% KCl-Lösung resuspendiert und bei 37°c 12 min inkubiert.
3) Fixierung der Zellen in Fixativ (Eisessig/Methanol im Verhältnis 3:1). Nach Zugabe von ca. 1 ml Fixativ wurde die Zellsuspension zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Das Pellet wurde in 10 ml Fixativ resuspendiert. Zentrifugieren und Re- suspendieren wurden zweimal wiederholt. Die letzte Resuspendie- rung erfolgt in geringerem Volumen (ca. 5 ml) .
Die Präparation wurde bei -20°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
Die Objektträger mit der darauf aufgebrachten Chromosomen- präparation wurden für 50-100 Sekunden in einer auf 68 °C vorgeheizten Küvette mit 70% Formamid/2x SSC inkubiert und anschließend in einer aufsteigenden Ethanolreihe (70%, 90%, 100%) dehydriert.
Die DNA-Sonde wurde auf ein zuvor ausgewähltes Areal des Objektträgers pipettiert, mit einem 22 mm x 22 mm großen Deckglas versehen und mit Fixogum versiegelt. Die Hybridisierung erfolgte bei 37°C ("chromosome paints") bzw. 42°C (Satelliten- DNAs) für 24h.
Nachweisreaktion
Nach der Hybridisierung wurden die Deckgläser entfernt und die Objektträger 2 x 4 min in lx SSC/50% Formamid, 2 x 4 min in 2 x SSC (jeweils bei 45°C) und 1 x 4 min in 0,lx SSC (45°C) gewaschen.
Einer Äquilibrierung in 4x SSC/0,2% Tween (Raumtemperatur) folgte eine zwanzigminütige Inkubation in 4x SSC/0,2% Tween/3% Rinderserumalbumin (Gew. /Vol.) bei 37 °C.
Einem weiteren Waschschritt in 4x SSC/0,2% Tween (Raumtemperatur) schloß sich die Nachweisreaktion der mit Biotin markierten DNA-Sonden mittels Fluorescein-gekoppeltem Avidin an. Die Nachweisreaktion der mit Biotin markierten DNA-Sonden erfolgte in diesem Falle mittels Fluorescein-gekoppeltem Avidin und Fluorescein-gekoppeltem Anti-Avidin-Antikörper. Ersteres wurde 1:250 in 4x SSC/1% Tween, 15% humanes AB-Serum verdünnt, der Antikörper 1:125 in der gleichen Lösung. Beide wurden im Verhältnis 1:1 zusammengegeben. Jeweils 100 μl dieser Mischung wurden pro Objektträger eingesetzt. Es erfolgte eine Inkubation bei 37 °C für 20 min. Anschließend wurde dreimal bei 42 °C mit 4x SSC/1% Tween gewaschen. Wurde mit PCR-Primern gearbeitet, die ausschließlich mit direkt Fluorochrom-gekoppeltem Dendrimer markiert worden waren, schloß sich statt dessen eine chromosomale Gegenfärbung mit DAPI an.
a) Mikroskopie
Die mikroskopische Analyse erfolgte an einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop (Axioplan II), das mit Fluoreszenzfiltern der Firma Chroma Techn., Bratlbourgh, USA, ausgestattet war.
Auf die geschilderte Weise wurde mittels des in diesem Beispiel veranschaulichten erfindungsgemäßen Verfahrens eine menschliche Metaphase mit dem für das Chromosom 4 spezifischen "paint" deutlich nachweisbar angefärbt. Die Hybridisierungs- signale waren selbst unter kleiner Vergrößerung (25x Objektiv) sichtbar und zeigten eine stabile Fluoreszenz. Chromosomen, die über den indirekten Nachweis mittels Biotin/Fluorescein-gekop- peltes Avidin angefärbt wurden, zeigten eine etwas stärkere Fluoreszenz, als jene in Experimenten, in denen Fluoreszein direkt an die Dendrimere gekoppelt war.
B PRINS Experiment
Die Primer-Synthese erfolgte wie unter "FISH Experimente" Punkt 1 beschrieben. Es wurden Primer gewählt, die spezifisch an al- pha-Satelliten Monomere des Chromosoms X binden: XI (5' -ATT TCT TTG GAA TCG GGA ATA TTT CC - 3') und X2 (5' - CTC TCG TCT TTC TGT GAA GAT AAA G - 3' ) nach Waye J.S. und Willard H.F., 1985.
PRINS Hybridisierung
Ein 50 μl-Reaktionsansatz enthielt folgende Komponenten:
5 μl 10 x PCR - Puffer
1 μl 50 x dNTP - Mix (Endkonzentration jeweils 200 μM)
1 μl Primer XI (ca. 50 ng/μl)
1 μl Primer X2 (ca. 50 ng/μl)
0,2 μl Taq-Polymerase (5u / μl)
41,8 μl Aqua dest. 10 x PCR - Puffer und Taq-Polymerase waren diegleichen wie zuvor bei "FISH Experimente" beschrieben.
Dieses Reaktionsgemisch wurde auf denaturierte Chromosomenpräparate (Herstellung nach Standardprotokoll) gegeben und in einer feuchten Kammer bei 65°C für 2 min inkubiert.
Anschließend wurde die Reaktion durch Inkubation der Objektträger in einer auf 65°C vorgewärmten, Stop-Puffer (50 mM NaCL/ 50 mM EDTA) enthaltenden Küvette für 5 min abgestoppt. Die Präparate wurden abschließend in 4 x SSC/ 0,2% Tween für 5 min bei Raumtemperatur gewaschen. Waren die Primer mit Biotin markiert, schloß sich eine Nachweisreaktion, wie bereits beschrieben, an. Wurden Primer verwendet, die ausschließlich direkt markiert worden waren, folgte nur eine Gegenfärbung mit DAPI (4', 6'- Diamidino-2-phenylindol) . Die Mikroskopie erfolgte wie bereits beschrieben.
97

Claims

ANSPRÜCHE
in situ-Hybridisierungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß für die in situ-Hybridisierung mindestens eine Nukleinsäuresonde verwendet wird, die mindestens ein Dendrimer umfaßt, das mit einem oder mehreren Markierungsmolekülen markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonde eine DNA-, RNA- oder PNA-Sequenz oder ein Hybrid aus DNA, RNA und/oder PNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als ein Markierungsmolekül an das Dendrimer gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder mehrere unterschiedliche Markierungsmolekültypen an das Dendrimer gebunden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das bzw. die Markierungsmolekül (e) ausgewählt ist bzw. sind aus Hapten-Molekülen, Fluoreszenzmarkermole- külen, Chro ophoren, chemolumineszierenden Molekülen, radioaktiv markierten Molekülen oder enzymatisch aktiven Molekülen oder Fragmenten.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das bzw. die Markierungsmolekül (e) ausgewählt ist bzw. sind aus Biotin, Digoxigenin, Dinitrophenol, Fluoresceinisothiocya- nat (FITC), Cyaninfarbstoffen, wie z.B. Cyanin2, Cyanin3, Cyanin3.5, Cyanin5, Cyanin5.5 und Cyanin7, Rhodamin, Rhodamin 110, Lissamin und Phycoerythrin.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das bzw. die Markierungsmolekül (e) ausgewählt ist bzw. sind aus Biotin und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) .
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonde ein Dendrimer umfaßt, das mit einem oder mehreren Hapten-Molekülen und einem oder mehreren Fluores- zenzmarkermolekülen markiert ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonde ein Dendrimer umfaßt, das mit einem oder mehreren Biotin-Molekül (en) und einem oder mehreren FITC- Molekül(en) markiert ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonde zwei oder mehrere Dendrimere umfaßt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Dendrimere mit mehr als einem Markierungsmolekül markiert ist.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Dendrimere mit zwei oder mehreren unterschiedlichen Markierungsmolekültypen markiert ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonde zwei oder mehrere Dendrimere, die jeweils mit Haptenen oder Fluoreszenz ar- kermolekülen oder Kombinationen von Haptenen und/oder Fluo- reszenzmarkermolekülen markiert sind, in unterschiedlichen Verhältnissen enthält.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonde Dendrimere, die jeweils mit FITC oder Biotin markiert sind, in unterschiedlichen Verhältnissen enthält.
15. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonde ein "chromosome paint" ist.
16. Ver a ren nac e nem er nsprüc e 1 is 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäures eine Zentromer- spezifische Sonde ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonde eine Sonde zum Identifizieren eines Gens ist.
18. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungsreaktion an Chromosomen erfolgt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungsreaktion an Zellkernen erfolgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungsreaktion an gespreiteter DNA erfolgt.
21. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungsreaktion in einem Gewebeschnitt erfolgt.
22. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die in situ-Hybridisierungsreaktion mittels des "primed in situ (PRINS)-" Verfahrens erfolgt.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die PRINS-Reaktion mittels Nukleinsäuresonden durchgeführt wird, die unterschiedlich markierte Dendrimere enthalten, oder mittels unterschiedlicher Nukleinsäuresonden, die jeweils unterschiedlich markierte Dendrimere enthalten.
24. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Dendrimer enthaltenden Nukleinsäuresonden unter Verwendung von das oder die Dendrimere enthaltenden Oligonukleotidpri ern hergestellt werden.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonden durch Polymerasekettenreaktion (PCR- Reaktion) zur Verlängerung der das oder die Dendrimere enthaltenden Oligonukleotidprimer hergestellt werden.
26. Verfahren nac Anspruc 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung der Nukleinsäuresonden mit den Dendri erstruktu- ren mittels "rando priming" unter Verwendung von das oder die Dendrimere enthaltenden Oligonukleotidprimern erfolgt.
27. Kit zur Verwendung in einem in situ-Hybridisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäuresonde, die mindestens ein Dendrimer umfaßt, das mit einem oder mehreren Markierungsmolekülen markiert ist, gegebenenfalls weitere Reagenzien für die Zytogenetik und gegebenenfalls eine Gebrauchsanweisung umfaßt.
28. Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß er als weitere Reagenzien für die Zytogenetik Formamid, Dextransulfat und/oder gegebenenfalls zusätzlich erforderliche Reagenzien für den Nachweis der Markierungsmoleküle, wie einen oder mehrere Antikörper, umfaßt.
29. Kit nach einem der Ansprüche 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß er mehrere unterschiedliche DNA-, RNA- und/oder PNA-Sonden umfaßt.
30. Kit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß er mehrere unterschiedliche "chromosome paints" umfaßt.
31. Kit nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß er mehrere unterschiedliche "chromosome paints" umfaßt, die jeweils unterschiedlich markiert sind.
32. Kit nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß er einzelne oder mehrere unterschiedliche "chromosome paints" als Sonden für die Identifizierung von einem oder mehreren Genen und/oder anderen DNA-Sequenzen umfaßt.
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