WO2000023582A1

WO2000023582A1 - Gene transfer cell sheet and process for preparing the same

Info

Publication number: WO2000023582A1
Application number: PCT/JP1999/005794
Authority: WO
Inventors: Minoru Ueda; Nobuhiko Emi; Hirokazu Mizuno
Original assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd
Current assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2000-04-27
Anticipated expiration: 2001-04-21
Also published as: AU6227599A; JP2000125863A

Description

明細書遺伝子導入細胞シート及びその作製方法技術分野 - 本発明は、遺伝子導入細胞シート及びその作製方法に関し、特に、遺伝子治療用及び移植片に有用な遺伝子導入細胞シート及びその作製方法に関する。景技術

ヒトを始めとする生体に、生きた細胞や組織を移植したり導入したりすることがある。

例えば、創傷包帯としての組織を移植することがある。この場合、手術や事故などによって生体の組織が一部除去された個所が、除去された部分を補うためや外観をよくするために、他の組織（移植片）で補われる。このような目的のために、様々な移植片が用いられている。

特に、表皮細胞のシートは、自己の表皮細胞から作製することができる。このように作製された表皮細胞シートは、火傷などの場合に有用な、拒絶反応の無い移植片として高く評価されている。

また、口腔粘膜細胞から単離された上皮細胞は、皮膚の角化細胞、即ち表皮細胞ょりも未分化の細胞であるため、表皮細胞よりも短い代謝サイクルを有しており、また角化することなく長期間の維持が可能であるという利点を有する。このような性質から、口腔粘膜細胞は、表皮細胞よりも、移植用組織として一層有用であると考えられている。

一方、遺伝子治療の分野でも、細胞を治療遺伝子のキャリアとして使用し、生体から取り出した細胞に治療遺伝子を導入して、生体へ戻すことがある。

このような遺伝子のキヤリアとしての用途に用いられる細胞には、造血幹細胞、血管内皮細胞、小腸上皮細胞などの細胞が含まれる。これらの細胞は、生体に戻された後、対象遺伝子を生体内で発現させる。

しかしながら、組織を生体に移植する場合、移植の必要性が生じてから短時間に移植片を用意する必要がある。その上、元々移植部位にない組織を生体に生着させるため、首尾よく移植片が生着しない場合がある。特に、移植部位は、元々の組織が除去されているため、細菌等に対する抵抗力が弱く、細菌感染を引き起こした場合には、移植片は生着することができない。

また、遺伝子導入を行う場合、対象遺伝子のキャリアとしての細胞を、治療を行う個体から採取する必要があるが、キャリアとして使用しやすい細胞は、生体から採取し難いことがある。例えば、造血幹細胞は未分化の細胞であるため遺伝子を導入し発現させやすいが、骨髄から採取しなければならない。また、対象遺伝子を導入しても生体内でその遺伝子産物を長期間にわたり生成することができるとは限らない。

このため、例えば表皮細胞を介して遺伝子を導入しょうとしても、増殖速度が遅い上に、遺伝子が導入しにくく、導入できたとしても遺伝子産物を長期間にわたり生成することができない。

従って、本発明の目的は、対象遺伝子が導入しやすく短時間に調製することができる遺伝子導入細胞シートを提供することである。

特に、本発明の目的は、生体への生着効率が高められた移植用として有用な遺伝子導入細胞シートを提供することである。

本発明の目的は、更に、導入後に長期間にわたり導入遺伝子産物を生成することができる遺伝子治療用として有用な遺伝子導入細胞シートを提供することであまた、本発明の目的は、上述のような有用な遺伝子導入細胞シートを容易に作製することができる遺伝子導入細胞シートの作製方法を提供することである。発明の開示

本発明の遺伝子導入細胞シートは、対象遺伝子が導入された複数層の粘膜上皮細胞からなることを特徴としている。また、上記粘膜上皮細胞のうち、好ましくは、 4 0 %~ 6 0 %又は 9 0 %以上の細胞に対象遺伝子が導入されている。また、本発明の遺伝子導入細胞シートは、対象遺伝子が、血液凝固因子、インシュリン、成長因子、腫瘍抗原遺伝子及び癌抑制遺伝子からなる群より選択されたものであることを特徴としている。

本発明の遺伝子導入細胞シートは、遺伝子治療における遺伝子キヤリアとして用いられる遺伝子治療用のものである。また、本発明の遺伝子導入細胞シートは、移植片として用いられるものである。本発明の遺伝子導入細胞シー卜の作製方法は、対象遺伝子が導入された複数層の粘膜上皮細胞からなる遺伝子導入細胞シートの作製方法であって、細胞シートを作製するための粘膜上皮細胞と、該粘膜上皮細胞に適合する支持細胞とを得て、前記粘膜上皮細胞に、前記対象遺伝子及びマーカー遺伝子を含む発現系を導入し、血清を含有しない無血清選択培養液中で培養して、前記発現系が導入された粘膜上皮細胞を選択し、前記発現系が導入された粘膜上皮細胞を、前記支持細胞と共に、血清を含有する成育培地中で培養し、複数層を形成した粘膜上皮細胞を得る、ことを含むことを特徴としている。図面の簡単な説明

図 1は、遺伝子導入に用いたヒト血液凝固 I X因子を含むプラスミドのコンストラクシヨンである。

図 2は、口腔粘膜上皮細胞に対する感染効率を示したグラフである。

図 3 Aは、血清含有選択培地で選択培養された遺伝子導入粘膜上皮細胞の図、図 3 Bは、図 3 Aの 1 0 0倍拡大図、図 3 Cは、無血清選択培地で選択培養された遺伝子導入粘膜上皮細胞の図である。

図 4 Aは、移植後 1週間の遺伝子導入粘膜上皮シートの染色状態を示した 1 0 倍の拡大図、図 4 Bは、移植後 3週間の遺伝子導入粘膜上皮シートの染色状態を示した 1 0倍の拡大図、図 4 Cは、移植後 5週間の遺伝子導入粘膜上皮シートの染色状態を示した 1 0倍の拡大図である。

図 5 Aは、移植後 1週間の遺伝子導入粘膜上皮シ一トの染色状態を示した 2 5 0倍の拡大図、図 5 Bは、移植後 3週間の遺伝子導入粘膜上皮シートの染色状態を示した 2 5 0倍の拡大図、図 5 Cは、移植後 5週間の遺伝子導入粘膜上皮シートの染色状態を示した 2 5 0倍の拡大図である。

図 6は、遺伝子導入粘膜上皮細胞シートを移植したマウスにおける血中のヒト血液凝固 I X因子濃度の変化を示したグラフである。発明の詳細な説明

本発明の遺伝子導入細胞シートは、対象遺伝子が導入された複数層の粘膜上皮細胞からなる。本発明における粘膜上皮細胞には、口腔粘膜細胞、鼻腔粘膜細胞、咽頭粘膜細胞、膣粘膜細胞、消化管粘膜細胞などが使用できるが、採取の容易性などの観点から口腔粘膜細胞が特に好ましい。このような粘膜上皮細胞で構成させることによって、移植片ゃ遺伝子キャリアとしてそのまま利用することができる。また、これらの粘膜上皮細胞細胞は、表皮細胞と異なり角化し難いため、生体の広範な種々の部位に対して移植することができる。 - これらの粘膜上皮細胞は、適当な生体から採取することができる。

たとえば、口腔粘膜細胞は、粘膜下組織ごと健常者の口腔内から採取することができる。採取された粘膜組織には粘膜細胞以外に結合組織などが含まれているため、粘膜細胞を単離する必要がある。粘膜細胞の単離では、採取された粘膜組織から結合組織や真皮を除去するために、適当な酵素、例えばデイスパーゼ、トリブシンなどが用いられる。また、ナイロンメッシュなどを用いてデブリスなどを除去する。

上記のようにして単離された粘膜細胞には、通常用いられる発現系と共に対象遺伝子が導入される。このような用途に用いられる発現系には、当業界において周知のものが適用可能であり、例えば発現プラスミドが含まれる。

ここで用いられ得る発現系には、マーカー遺伝子と、対象遺伝子が挿入される遺伝子導入部位と、挿入された対象遺伝子の発現を制御するプロモー夕などの制御部位とが含まれる。

制御部位にはプロモー夕ゃェンハンサ一が配置されている。これらには、通常用いられるものがそのまま適用可能であり、例えばラウス肉腫ウィルス（R S V) 、ヒト免疫不全ウィルス（H I V ) 、センダイウィルス（H V J ) のようなレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルスなどのものを使用することができる。

マーカー遺伝子は、対象遺伝子が発現プラスミドに導入されたか否かを確認するための遺伝子であり、当業界で既知のものが適用可能である。このようなマ一カー遺伝子には、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子や、 ?一ガラクトシダーゼのような特定の色を発色する発色遺伝子、ルシフェラーゼなどが挙げられる。

上記プロモー夕の上流又は下流には、対象遺伝子が挿入される。ここで用いられる対象遺伝子は、本発明の遺伝子導入粘膜細胞シートの用途に応じて選択されることができる。

本発明の遺伝子導入粘膜細胞シートを移植片として用いる場合には、移植片の生着を容易化するための因子、例えば、移植片の生着時における細菌感染を阻止するための因子、例えば抗生物質、抗菌ペプチド（ディフェンシンなど）、また移植片の生着を促進する因子、例えば血小板成長因子（P D G F ) 、線維芽細胞成長因子（F G F ) 、肝細胞成長因子（H F G) などの成長因子の遺伝子を対象遺伝子とすることができる。これらの遺伝子は、文献等において公知であると共に公的機関から容易に入手可能である。

また、本発明の遺伝子導入粘膜細胞シ一トを遺伝子治療のためのキヤリアとして用いる場合には、治療用の遺伝子を対象遺伝子とすることができる。このような遺伝子治療の対象となり得る対象遺伝子には、先天的 ·後天的欠損因子、例えば血液凝固因子、インシュリン、各種成長因子、癌抑制遺伝子、腫瘍抗原遺伝子などが挙げられる。これらの対象遺伝子の配列は、文献等で既に公知であり、種々の公的機関から入手可能である。

上述のような発現系は、同時に 2種以上用いてもよく、また可能であれば 1つの発現系に 2種以上の対象遺伝子を配置させてもよい。

上記発現プラスミドは、リン酸カルシウム、リボソーム、エレクトロボレ一シヨンなどの通常の方法で、ウィルス産生細胞へトランスフエクトされる。ウィルス産生細胞には、種々のものが既知であり、そのいずれも使用することができる。粘膜上皮細胞への遺伝子導入には、このウィルス産生細胞を同時培養などによつてそのまま用いてもよく、またこのウィルス産生細胞の培養上清を用いてもよい。ゥィルス産生細胞が細胞シー卜に混入する可能性を確実に排除することができ、また操作の容易性の観点から、ウィルス産生細胞の培養上清を用いることが好ましい。

ウィルス上清を用いた粘膜上皮細胞への遺伝子導入では、プレート上に播種された粘膜上皮細胞の培養系にウィルス上清を添加することによって行うことができる。なお、この際ウィルス上清と共に 3〜8〃g/m lのポリプレンを添加することが好ましい。粘膜上皮細胞は、数時間でウィルス上清中のウィルスに感染し、これにより対象遺伝子が粘膜上皮細胞に導入される。感染後、感染細胞は、後述する選択培地中で培養され、これにより、対象遺伝子が導入された粘膜上皮細胞（以下、導入細胞）が選別される。本発明において用いられる選択培地は、選択薬剤を含有するが、血清を含まないものである。

選択薬剤は、対象遺伝子と共に細胞に導入されたマ一力一遺伝子に対応するものであり、マーカー遺伝子が導入された、即ち対象遺伝子が導入された細胞以外細胞を死滅させるなどにより、目的とする細胞のみを選択するために用いることができる薬剤をいう。このようなマーカ一遺伝子と選択薬剤との組み合わせは、 - 当業界において周知であり、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマ一カー遺伝子として選択した場合には、 G418のような薬剤が用いられる。本発明の遺伝子導入細胞シートの場合、使用される G 418の量は、表皮細胞などに比べて少量でよく、 100〜200/ g/ml、好ましくは 100〜150〃g/mlで十分である。

本発明には、この選択培地が血清を含有しないものであることが必須である。選択培地に血清を含有しないことによって、細胞の分化能が抑止され、未分化状態を維持することができる。

このような選択培地には、表皮細胞選択培地（KGM) が挙げられる。この GMは、クラボウから市販の正常ヒト表皮角化細胞増殖用無血清液体培地（Hu Med i a— KG2) として市販されている。

このような選択培地中での培養により、遺伝子導入細胞シ一トにおける導入細胞の割合は調整可能である。遺伝子導入細胞シートにおける導入細胞の割合は、シートから産生される導入遺伝子産物の量及び調製期間に影響する。

本発明の遺伝子導入上皮細胞シートは、得られる細胞シートにおける導入細胞の割合を、 40〜60%とすることができる。このような細胞シートは、導入遺伝子の産物が適正に産生されると共に、培養期間が短く早期に調製することができる。 40%〜 60%の割合で遺伝子が導入された遺伝子導入細胞シートは、選択培地中で約 5日間培養することにより容易に得ることができる。

また、本発明の遺伝子導入上皮細胞シートは、得られる細胞シートにおける導入細胞の割合を、 90%以上とすることができる。このような細胞シートは、導入遺伝子の産物を十分に産生することができる。 90%以上の割合で遺伝子が導入された遺伝子導入細胞シートは、選択培地中で 10〜14日培養することにより得ることができる。なお、 100%の割合のものは、選択培地中での培養の期間を一層延長させることにより得ることができる。遺伝子導入細胞シートにおける導入細胞の割合は、導入遺伝子の種類によって変更しても良い。例えば、生着効率を高めるために抗菌ペプチド等の遺伝子を導入遺伝子とした場合には、 90%以上の高い割合とし、欠損因子の遺伝子を導入遺伝子とした場合には、 40〜60%程度の割合でも有効であることもある。本発明では、導入細胞である粘膜上皮細胞を層状に且つ高効率で成育させるために、支持細胞を用いる。支持細胞には、例えば線維芽細胞、例えばマウス N-I H3T3細胞、 3T3J 2、スイス 3 T 3が含まれ、得られる導入細胞の層の厚みや支持細胞上での導入細胞の増殖速度の観点から、 3 T 3 J 2細胞が好ましい。支持細胞の増殖能は、導入細胞の成育を干渉しないように消失しておく。増殖能の消失は、当技術分野において周知の方法、例えば、マイトマイシン Cによる処理ゃ放射線照射によって行うことができる。また、培養は、通常のプラスチックディッシュのような培養容器を用いて行う。

導入細胞は、支持細胞の種類によって、支持細胞と同時培養してもよく、また先に播種し層状に成育している支持細胞上に播種してもよい。このとき、導入細胞は、 1 X 10⁵/cm²の細胞密度で播種することができ、この場合に支持細部は、 1 x 10

l X 10³/cm³以上で播種することができる。支持細胞が、これよりも少ないと支持細胞としての役割を十分に果たすことができず、またこれよりも多いと導入細胞の増殖の妨げとなるため好ましくない。また、導入細胞が、この範囲よりも少ない又は多いと効率よく増殖することができないため、好ましくない。

本発明において、導入細胞を支持細胞上で成育させるために成育培地が用いられる。この目的に用いられる成育培地には、当業界で既知の種々の培地から選択することができる。成育培地中での培養によって、導入細胞は容易に複数層を形成する。一方、支持細胞は、粘膜上皮細胞の成育を支持するのみで死滅し、粘膜上皮細胞が複数層を形成したときには、もはや培養系には存在しない。

成育培地には、シート形成能がある上皮シート形成培地（EFM) を用いることが好ましい。 EFMは、通常、表皮細胞を層状に成育させるために用いられている培地であり、 D MEMとハム F— 12培地の 3 ： 1混合液で構成され、 5% FBS、 5 g/mlのインシュリン、 5〃 /1111のトランスフェリン、 2x 10-⁹Mのトリヨ一ドサイロニン、 1 xlO— ⁹Mのコレラ毒素、 0.4 g/mlのハイド口コルチゾン、 10 OU/mlのペニシリン、 0.1 /g/mlのカナマイシン、 0 . 2 5〃g/m lのアンホテリシン B及び 1 O n g/m lのヒトリコンビナント上皮細胞増殖因子（E G F ) が補充されている。

複数層化した粘膜上皮細胞は、層構成を維持したまま培養容器から分離される。この分離は、当業界において既知の方法によって行うことができ、例えばデイスパーゼなどの適当な酵素を用いて基底層の接着を阻害することにより容易に行うことができる。 - 得られた粘膜上皮細胞シートは、当分野において既知の方法により、生体へ移植される。本発明の遺伝子導入細胞シートは、複数層の粘膜上皮細胞で構成されているので、例えばそのまま移植片として移植部位に移植することができる。また、本発明の遺伝子導入粘膜上皮細胞シートは、粘膜上皮細胞で構成されているので、外界に接している表皮上にも移植することができるが、口腔内、皮膚下など湿潤環境下にも移植することにも適している。また、遺伝子治療の場合、特定の固定された部位で対象遺伝子の遺伝子産物の生成を行うことができるが、例えば遺伝子産物が血流に放出されるような移植部位を選択すれば、遺伝子産物を血流によって全身にデリバリーさせることができる。

移植の方法は、導入細胞シートの種類及び導入された遺伝子の発現部位によつて変えることができ、適合した既知の方法をそのまま適用して実施することができる。例えば、遺伝子導入細胞シートを適当な移植キャリアと共に又は単独で、皮膚下、口腔内、小腸上皮、消化管上皮に移植することができ、また背部に皮弁を作製して、その下に配置させてもよい。

生体に取り込まれた遺伝子導入粘膜上皮細胞シートは、発現プラスミドの作用によって、導入された遺伝子に応じた物質を生成する。この遺伝子導入粘膜上皮細胞シートの遺伝子産物生成能は、少なくとも 5週間、好ましくは 8週間に及ぶ長期間にわたり持続すると思われる。生成された物質は、種々の既知の方法によつて、その生成が確認され得る。

生成物質の確認には、当分野において種々の方法が既知であるが、生成物質に対する抗体が既知である場合には、簡便性及び感度の観点から E L I S A法で行うことが好ましい。

このように本発明の遺伝子導入細胞シートは、高い増殖性と未分化段階における遺伝子導入の容易性を有する粘膜上皮細胞で構成されているので、容易に作製することができる。また、粘膜上皮細胞であるので、湿潤環境下で粘膜細胞として使用することができると共に、皮膚などの乾燥条件下において表皮細胞の代わりとしても使用することができる。

また、移植片の生着を促進するような遺伝子、 - 例えば成長因子や、感染を防止するための抗菌べプチドの遺伝子を対象遺伝子に選択した場合には、移植片として一層高い効率で生体に生着させることができる。

更に、遺伝子治療を目的として治療のための遺伝子を対象遺伝子に選択した場合には、容易に作製できる上に、長期にわたる遺伝子産物生成能を有する有用な遺伝子キヤリアとして用いることができる。実施例

以下に本発明を代表する実施例を説明する。

I . 細胞の調製

粘膜組織を、患者の了解を得て健康な口腔粘膜から得た。粘膜下組織を鋏で除去した後、小片に刻んだ。粘膜組織の小片を、 100 OU/mlのペニシリン (Sigma, St. Louis, M0)、 1 mg/m 1のカナマイシン及び 2.5 gのアンホテリシン B(Gibco， Gland Island, NY)を含有するリン酸緩衝液（PBS) で、 30 分間 37°Cで 2回浸潰した。

組織をそれから 100 OPU/mlのディスパ一ゼ（登録商標）（合同酒精株式会社製）を含有するダルベッコ改変最小必須培地（DMEM) に 16時間 4°Cで浸漬し、その後、 30分間室温で 0.25%トリプシン（Gibco, Gland

Island,NY)で処理して、細胞を分離した。酵素活性は、 1◦%ゥシ胎児血清（F B S) (Hyclone, UT)を含有する DMEMで洗浄することにより停止させた。その後、 10%FBSを含有する DMEMで 30分間攪拌してから、 50〃m のナイロンガーゼでデブリスをろ過して、粘膜細胞を精製した。

この精製粘膜細胞を、 1500 r pmで 5分間遠心分離し、得られた細胞ペレットを KGM (クラボウ社製）に再懸濁した。精製された粘膜細胞を、 10%C 0₂インキュベータ中で 37 °Cで培養した。培養液は 2— 3日毎に新鮮な培養液と交換した。

II. プラスミドコンストラクシヨン

モロニ一マウス白血病ウィルス（MoMLV) 主体レトロウイルスベクター p LRNLは、ラウス肉腫ウィルス（RSV) のプロモー夕の制御下にあるネオマイシン耐性（Neoつ遺伝子を含有している（Liら、 Virology, (1989)171:33卜 341)。この R S Vプロモー夕のすぐ上流には Pstl部位がある。この Pstl部位に、一ガラクトシダ一ゼの全コード:領域又は血液凝固第 IX因子の c DNAを含む Pstlフラグメント（Matsushitaら、 Thromb. Res. , (1993)69:387- 393)を挿入した。これにより、それそれ pLBZ又は pL IXRNL (図 1) のコンストラクトを得た（Matsushitaら、 Thromb. Res. , 69:387-393(1993) )₀ -

III. ウィルス生成及びトランスフエクシヨン

ウィルス生成細胞である P A 317は、高濃度グルコース添加 10%ゥシ胎仔血清（FCS)含有の DMEM中で成育させた。

プラスミド pLBZ又は pL IXRNLを、両指向性パッケージング細胞株 P A317に、既述 (Emiら、 J. Virol.，（1991)65:1202-1207)にしたがってリン酸カルシウム法でトランスフヱクトし、その後 2週間にわたり、これらの細胞を、 G418 (400 xg/ml) によるネオマイシン耐性遺伝子の発現について選択した。これにより、それそれにウィルス産生細胞、 PA317/LAZ又は PA 317/L I XRNLが得られた。 208 F細胞に対する各ウィルス産生細胞のウィルス力価は、約 4 X 10⁴/m lであった。

IV. 粘膜上皮細胞への遺伝子導入効率

粘膜上皮細胞への遺伝子の導入効率を検討するために、異なる感染方法で粘膜上皮細胞を感染させた。

感染源は、上記のウィルス産生細胞のウィルス上清と、このウィルス産生細胞を支持細胞として 1 x 10⁶/35 mmディヅシュで播種したものとを用意した。支持細胞としてウィルス産生細胞を用いる場合には、ウィルス産生細胞は、マイトマイシン Cで処理し、増殖能を消失させた。

これらの感染源に対して、それそれ粘膜上皮細胞を播種した。粘膜上皮細胞は、 35 mmディッシュに 1 x 10⁶とした。遺伝子導入された細胞は、 24時間後に、 5—ブロモ一4一クロロー 3—インドリル B— D—ガラクトピラノシド（X -gal) 染色で特定した。評価は、 2 X 2 mm領域における陽性細胞の数で比較することにより行った。

粘膜上皮細胞には、図 2に示されるように、支持細胞としてのウィルス産生細胞によってもウィルス産生細胞のウィルス上清によっても、同様に遺伝子を導入することができた。このため、操作性がよく、ウィルス産生細胞を直接使用せずに遺伝子を導入することができるウイルス上清を用いて遺伝子導入を行うことにした。

V. G418の濃度検定 - 遺伝子導入された細胞の選択するための用いられる G 418の最適な量を検討した。

ネオマイシン耐性遺伝子を有していない粘膜上皮細胞及び他の上皮系細胞株 (PA317) を、上述のようにして調製し、 10日培養した後、トリプシン処理を経て、 35mmディッシュに 3— 6 x 10⁶細胞の密度で播種した。細胞がコンフレント状態になったとき、種々の量の G418を培養液に添加した。結果を表 1に示す。「一」は細胞が G418の作用によって死滅すること（適性に選別可能）を示し、「十」は G418の作用によって死滅しないこと（適性に選別不可能）を示す。粘膜上皮細胞については、 2回行った。表 1 粘膜上皮細胞及び上皮系細胞株に対する

ネオマイシンの影響

G418濃度

粘膜上皮細胞上皮系細胞株

600

500

400 +

300 +

200 +

150 +

100 + + + 表 1に示されるように、粘膜上皮細胞は、通常の上皮系細胞株よりも低い濃度で G418による選択が可能であった。従って、粘膜上皮細胞への遺伝子導入の際には 150 / /1111の濃度の0418を用いることとした。

VI. 遺伝子導入粘膜上皮細胞シートの形成

上記と同様に、調製された粘膜上皮細胞を 10日培養した後、トリブシン処理を経て、 35 mmディヅシュに 3— 6 x 10⁴細胞の密度で播種した。一晩培養した後、 5〃g/mlのポリプレン（Sigma, St. Louis, MO)を含有するウィルス上清 2 m 1で 3時間、粘膜上皮細胞に対する感染を行った。

感染後 24時間で、 G418 (150 g/ml ； (Gibco, Gland Island, NY) を含有する KGM培地中で 10—14日培養させることにより、遺伝子導入粘膜上皮細胞を選別した。選別により得られた粘膜上皮細胞集団を、トリプシン— E DTAで処理して 1 X 10⁵細胞/ mlの細胞懸濁液に調製した。

支持細胞としての 3 T 3— J 2細胞を、血清を含有しない DMEM中 4〃g/ mlのマイトマイシン C (協和醱酵、東京）で処理した。 2時間後に、 PBS (―) で数回リンスしてマイトマイシン Cを除去し、トリプシン処理した後、 1 10⁴細胞/ mlの細胞懸濁液を調製した。

1 10⁵細胞/ mlの粘膜細胞懸濁液と、 1 X 10⁴細胞/ mlの支持細胞懸濁液とを、 6ゥエルプレートの各ゥエルに lmlずつ添加して、 KGM選択培地中で培養した。 2— 3日毎に培地の半分を、新鮮な上記 EFM選択培地と交換して維持し、層状の上皮細胞シートを形成させた。

このように支持細胞上に播種して培養した粘膜上皮細胞は、支持細胞上で増殖した。また、 KGM選択培地での 10— 14日の選択培養により、未分化段階の粘膜細胞を維持することができ、層状化及び上皮細胞シートの形成能が維持されていた（図 3 A及び図 3 B) 。支持細胞上での約 2週間ほどの培養により、移植片として十分な厚さ（3〜5層、 100〃m程度）になった。このように層状化して上皮細胞シートを形成することができるので、この遺伝子導入細胞シートは、移植片として又は治療用の遺伝子キヤリアとして用いることができる。

これに対して、 KGM選択培地を使用せず、血清を含有する EFM選択培地のみで培養した細胞は、不規則な層を形成し、脱核していた（図 3C)。これは最終分化が既に行われ、均一に層状化するシート形成能が失われていることを意味する。

VII. 遺伝子導入粘膜上皮シートの移植

遺伝子導入粘膜上皮細胞は、培養開始後 10— 14日で、コンフレント状態となり、重層化した。この細胞シートを、移植片として用いた。

上皮細胞シートを、ディスパ一ゼ（400 PU/ml) で剥離し、 PBSで 2 回洗浄した。細胞シートは、ベントバルビ夕一ル 0.04mg/gの腹腔内投与による全身麻酔下のヌ一ドマウス（5— 6週齢、雄、 BALB/c nu/n u) (日本エスエルシ一株式会社、浜松）に移植した。移植方法は、 Barrandonらの方法（Barrandonら、 J. Invest. Dermatol.，（1998) 91, 315-318)及び杉村らの方法（杉村ら、 J.cranio-maxillofac

Surg.，（1997)24,352-359)に基づいて行った。 - すなわち、マウス背部を 10%ヒビテンアルコールで十分に消毒した後、 30 X 30mmの矩形の皮弁を作製し、筋層を露出させた。露出したマウス筋層の全面に、滅菌したシリコーン膜を載置して、皮弁と筋層とを隔離した。次に作製した培養粘膜上皮細胞シ一トを、移植キヤリアとしての滅菌したシリコーン膜に配置し、培養粘膜上皮細胞が皮弁内側と接するようにシリコーン膜上に移植した。それから、移植した粘膜上皮細胞シート及びシリコーン膜を覆うように皮弁を戻し、 5—ナイロン糸で縫合して移植を終了した。これにより、粘膜上皮細胞の培養中プレートと接していた面（基底層）をマウス皮弁内側に接するようにして、粘膜上皮細胞を固定した。

VIII. 組織学的解析

移植された遺伝子導入粘膜上皮細胞の生着を確認するために、組織学的解析を行った。移植された遺伝子導入粘膜上皮細胞シートの生着は、 pLBZ (^—ガラクトシダ一ゼの遺伝子を含む）により発現される ?一ガラクトシダ一ゼを、 X — Ga 1で染色することによって確認した。

移植後 1、 3及び 5週間で、遺伝子導入粘膜上皮細胞を含む皮弁を採取し、凍結保護培地（O.T. ， Tissue Tek，Miles)中で凍結した。凍結保護培地で包埋した上記皮弁の凍結切片（5〃m) を、 PBS中 2.5%のグルタルアルデヒド溶液に 15分間 4°Cで固定した。その後、切片を PBS中で 2回洗浄し、染色液

(ImMの MgCl₂、 5mMの K₃F e(CN)₆、 5 mMの K₄( C N)₆及び 4 00 /1111のー0& 1を含有するジメチルホルムアミド溶液）にー晚 3 7°Cで浸して、染色した。結果を図 4及び図 5に示す。

遺伝子導入粘膜上皮細胞シートの移植片は、移植後 1週間でほぼ全域にわたり青く染色された（図 4A、 X 5) 。これは移植後 1週間では、移植された遺伝子導入粘膜上皮細胞が/?一ガラクトシダーゼタンパク質を生成しており、十分に生着していることを意味している。また、この移植後 1週間の移植片は、完全に付着しており、多くの表皮細胞が移植片に沿って浸潤してきていた（図 5A、 X 2 50)

このような移植片の染色は、 3週間後になると弱くなり（図 4B) 、 5週間後ではほとんど染色されなくなった（図 4C) 。移植後 3週間では、 ?—ガラクトシダ一ゼの発現は少なくなり、移植片は次第に厚くなつてきて、基底膜の欠如など細胞分解の兆候が認められた（図 5B) 。しかしながら、移植後 5週間において、 ?一ガラクトシダ一ゼの発現が検出可能であった（図 5 C) 。

IX. 血液凝固 IX因子の生成

粘膜上皮細胞に導入された遺伝子産物の産生を確かめるために、血液凝固 I-X 因子の遺伝子を導入し、この因子の血中濃度を測定した。なお、この使用された血液凝固 IX因子の発現産物に活性があることは、既に証明されている。この遺伝子導入粘膜上皮細胞による血液凝固 IX因子の生成は、血友病の遺伝子治療のモデルである。

pLIXRNLを用いて遺伝し導入された遺伝子導入粘膜上皮細胞を、 G41 8で上述のように 2週間選択培養し、 35mmの培養ディッシュに播種して、支持細胞と同時培養した。培養後、経時的に成育培地中に放出されたヒト血液凝固 IX因子を、各ディッシュごとに計測した。血液凝固 IX因子の測定は、既述の E L I S A方法によって行った（Takahashiら、 J. Lab. Clin. Med., (1991), 118:317- 325)。結果を表 2に示す。表 2 遺伝子導入口腔粘膜上皮細胞による

血液凝固 I X因子の in vitro発現

表 2に示されるように、成育培地中に検出された血液凝固 IX因子の最大値は、培養の開始から 30日目であった。また培養条件下では、導入遺伝子は、少なくとも 7週間にわたり発現することが示された。

次いで、導入遺伝子の in vivoにおける発現を解析した。

粘膜上皮細胞に上記ヒト血液凝固 IX因子を導入して選別し、支持細胞と 2週間同時培養した後、上述のように形成した遺伝子導入粘膜上皮シートを 3 X 3 c m のシリコン膜に載置して、 2匹のヌードマウスの背部に移植した。それそれのマウスの血液を、眼窩下に穿刺することにより採取し、 1 / 1 0量の 3 . 8 %のクェン酸ナトリウム溶液に回収した。細胞を遠心分離して除去し、血漿試料を— 8 0 °Cで保存する。血液凝固 I X因子のレベルは、上述の E L I S Aで測定した。遺伝子導入粘膜上皮細胞を移植された 2匹のマウスでは、移植後の初期において 1 . 5— 1 . 8 n g/m lのヒト血液凝固 IX因子が生成されていることが確認された（図 6 ) 。この血中のヒト血液凝固 IX因子は、 3週間以上検出された。このことは、遺伝子導入粘膜上皮細胞が移植後においても、培養条件下と同様に遺伝子産物を安定して長期にわたり生成していることを意味している。

このように本遺伝子導入細胞シートは、容易に作製することができ、またシート形状のまま背部に移植しても、血中にヒト血液凝固 I X因子を長期にわたり生成することができる。産業上の利用可能性

本発明の遺伝子導入粘膜上皮細胞シートによれば、より未分化の粘膜上皮細胞で構成されているので、対象遺伝子を容易に導入することができると共に、短時間で調製することができる。これにより、導入遺伝子の遺伝子産物を長期間にわたり産生する有用な遺伝子治療用のキヤリアを提供することができ、また移植片の生着が促進された生着効率のよい移植片を提供することができる。

また、本発明の遺伝子導入粘膜上皮細胞シートの作製方法によれば、上述のような有用な遺伝子治療用のキヤリアや生着効率のよい移植片を容易に作製することができる。

本明細書の記載は、単に本発明の説明を目的とするものであって本発明の制限として取り扱われるべきではなく、種々の変更が本発明の精神及び範囲を逸脱することなく可能である。

Claims

請求の範囲

1 . 対象遺伝子が導入された複数層の粘膜上皮細胞からなる遺伝子導入細胞シート。

2 . 前記粘膜上皮細胞の 4 0 %〜 6 0 %に、前記対象遺伝子が導入されている請求の範囲第 1に記載の遺伝子導入細胞シート。 -

3 . 前記粘膜上皮細胞の 9 0 %以上に、前記対象遺伝子が導入されている請求の範囲第 1項に記載の遺伝子導入細胞シート。

4 . 前記対象遺伝子が、血液凝固因子、インシュリン、成長因子、腫瘍抗原遺伝子及び癌抑制遺伝子からなる群より選択されたものである請求の範囲第 1項に記載の遺伝子導入細胞シート。

5 . 遺伝子治療における遺伝子キャリアとして用いられる遺伝子治療用の請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか 1項に記載の遺伝子導入細胞シート。

6 . 移植片として用いられる請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれか 1 項に記載の遺伝子導入細胞シート。

7 . 対象遺伝子が導入された複数層の粘膜上皮細胞からなる遺伝子導入細胞シートの作製方法であって、

細胞シートを作製するための粘膜上皮細胞と、該粘膜上皮細胞に適合する支持細胞とを得て、

前記粘膜上皮細胞に、前記対象遺伝子及びマ一カー遺伝子を含む発現系を導入し、

血清を含有しない無血清選択培養液中で培養して、前記発現系が導入された粘膜上皮細胞を選択し、

前記発現系が導入された粘膜上皮細胞を、前記支持細胞と共に、血清を含有する成育培地中で培養し、

複数層を形成した粘膜上皮細胞を得る、

ことを含む遺伝子導入細胞シートの作製方法。