WO2000020580A1 - Nouvelle proteine recepteur couplee a la proteine g et adn associe - Google Patents

Description

明細書 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質およびその DN A 技術分野

本発明は、 ラット小脳由来の新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその 塩およびそれをコードする DNAに関する。 背景技術

多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、 細胞膜に存在する特異 的なレセプ夕一蛋白質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプ夕一 蛋白質のうち多くは共役している guanine nucleot ide-binding protein (以下、 G蛋白質と略称する場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行な い、 また 7個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、 G蛋白 質共役型レセプター蛋白質あるいは 7回膜貫通型レセプ夕一蛋白質 （7TMR) と総称される。

G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在 し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えばホルモン、 神経伝達物質お よび生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。 レセプ夕一 は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシグナルによ り細胞の賦活ゃ抑制といつた種々の反応が惹起される。

各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ 夕一蛋白質、 特には G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との関係を明らかにするこ とは、 各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、 それら機能と密接に関連した医薬 品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。

例えば、 生体の種々の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝達 物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれて いる。 特に、 生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、 それぞれに対応する レセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。 生体内には未だ未 知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、 それらのレセプ夕一 蛋白質の構造に関しても、 これまで報告されていないものが多い。 さらに、 既知 のレセプ夕一蛋白質にいてもサブタイプが存在するかどうかについても分かって いないものが多い。

生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ夕一蛋白質との 関係を明らかにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レセ プター蛋白質に対するァゴニス卜、 アン夕ゴニストを効率よくスクリーニングし、 医薬品を開発するためには、 生体内で発現しているレセプ夕一蛋白質の遺伝子の 機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。

近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 c D N Aの配列を ランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D N Aの断片配列が Expressed Sequence Tag ( E S T) としてデ一夕ベースに登録 され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能 を推定することは困難である。

従来、 G蛋白質共役型レセプ夕一と生理活性物質 （即ち、 リガンド） との結合 を阻害する物質や、 結合して生理活性物質 （即ち、 リガンド） と同様なシグナル 伝達を引き起こす物質は、 これらレセプ夕一の特異的なアン夕ゴニストまたはァ ゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。 従って、 こ のように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、 医薬品開発の標 的ともなりうる G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を新規に見出し、その遺伝子 (例 えば c D N A) をクロ一ニングすることは、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白 質の特異的リガンドゃ、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストを見出す際に、 非常に重要 な手段となる。

しかし、 G蛋白質共役型レセプ夕一はその全てが見出されているわけではなく、 現時点でもなお、 未知の G蛋白質共役型レセプ夕一、 また対応するリガンドが同 定されていない、 いわゆるォーファンレセプ夕一が多数存在しており、 新たな G 蛋白質共役型レセプターの探索および機能解明が切望されている。

G蛋白質共役型レセプ夕一は、 そのシグナル伝達作用を指標とする、 新たな生 理活性物質 （即ち、 リガンド） の探索、 また該レセプ夕一に対するァゴニストま たはアン夕ゴニスト） の探索に有用である。 一方、 生理的なリガンドが見出され なくても、 該レセプ夕一の不活化実験 （ノックアウト動物） から該レセプ夕一の 生理作用を解析することにより、 該レセプターに対するァゴニストまたはアン夕 ゴニストを作製することも可能である。 これら該レセプターに対するリガンド、 ァゴニストまたはアン夕ゴニストなどは、 G蛋白質共役型レセプ夕一の機能不全 に関連する疾患の予防ノ治療薬や診断薬として活用することが期待できる。 さらにまた、 G蛋白質共役型レセプターの遺伝子変異に基づく、 生体での該レ セプターの機能の低下または昂進が、 何らかの疾患の原因となっている場合も多 い。 この場合には、 該レセプ夕一に対するアン夕ゴニストやァゴニストの投与だ けでなく、 該レセプタ一遺伝子の生体内 （またはある特定の臓器） への導入や、 該レセプ夕一遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、 遺伝子治療に応用 することもできる。 この場合には該レセプ夕一の塩基配列は遺伝子上の欠失や変 異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、 該レセプ夕一の遺伝子は、 該 レセプターの機能不全に関与する疾患の予防/治療薬や診断薬に応用することも できる。 発明の開示

本発明は、 上記のように有用な新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を提供す るものである。 即ち、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその部分べプチ ドをコードするポリヌクレオチド （D N A、 R N Aおよびそれらの誘導体） を含 有するポリヌクレオチド （D N A、 R N Aおよびそれらの誘導体） 、 該ポリヌク レオチドを含有する組換えベクター、 該組換えベクターを保持する形質転換体、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩の製造法、 該 G蛋白質共役型レ セプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 該 G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物、 該 G蛋白質共役型レセ プ夕一に対するリガンドの決定方法、 リガンドと該 G蛋白質共役型レセプ夕ー蛋 白質との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） またはその 塩のスクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方法も しくはスクリーニングキットを用いて得られるリガンドと該 G蛋白質共役型レセ プター蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） ま たはその塩、 およびリガンドと該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合性を 変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） もしくは該 G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬な どを提供する。

本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 degenerated PCR法によって作成した E ST情報に基づいて、 ラット小脳由来の新規な G蛋白質共役型レセプター蛋白質 をコードする cDNAを単離し、 その全塩基配列を解析することに成功した。 そ して、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、 第 1〜第 7膜貫通領域が 疎水性プロット上で確認され、 これらの cDNAにコードされる蛋白質が 7回膜 貫通型の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質であることを確認した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、

(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質または その塩、

(2) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたは その塩、

(3) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列 を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、

(4) DNAである上記 （3) 記載のポリヌクレオチド、

(5) 配列番号： 2で表される塩基配列を有する上記 （3) 記載のポリヌクレオ チド、

(6) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一、

(7) 上記 （6) 記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、

(8) 上記 （7) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型 レセプ夕一蛋白質を生成せしめることを特徴とする上記 （1) 記載の G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質またはその塩の製造法、 0

(9) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （2) 記 載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、

(1 0) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質のシグナル伝達を不 活性化する中和抗体である上記 （9) 記載の抗体、

(1 1) 上記 （9) 記載の抗体を含有してなる診断薬、

(12) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることにより得られうる上記 （1) 記載 の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド、

(13) 上記 （12) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質のリガンドを含有 してなる医薬、

(14) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の G 蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、

(1 5) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと上記（ 1 ) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化 合物またはその塩のスクリーニング方法、

(16) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、

(17) 上記 （15) 記載のスクリーニング方法または上記 （16) 記載のスク リ一ニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質 共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその 塩、

(18) 上記 （15) 記載のスクリーニング方法または上記 （16) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質 共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその 塩を含有してなる医薬、 (19) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェン卜な条件下で

(20) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列およびその一部 を含有してなるポリヌクレオチド、

(21) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴 とする上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の mRNAの定量方法、 (22) 上記 （9) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の G蛋 白質共役型レセプター蛋白質の定量方法、

(23) 上記 （21) または上記 （22) 記載の定量方法を用いることを特徴と する上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能が関連する疾患の 診断方法、

(24) 上記 （21) 記載の定量方法を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法、

(25) 上記 （22) 記載の定量方法を用いることを特徴とする、 細胞膜におけ る上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質量を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング方法、

(26) 上記 （24) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその 塩、

(27) 上記 （25) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 細胞膜に おける上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化合物 またはその塩などに関する。

さらには、

( 28) 蛋白質が、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列、 配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸 が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さら に好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30 個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合 わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質またはその塩、

(29) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその塩また は上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させる ことを特徴とする上記 （14) 記載のリガンドの決定方法、

(30) リガンドが例えばアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレ シストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォ ピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナ ル ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラ ジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコト リエン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシ ン、 アドレナリン、 ひおよび3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GR〇ひ、 GROi3、 GRO了、 NAP - 2 , ΕΝΑ— 78、 PF4、 Ι Ρ 10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP - 3、 1—309、 Μ Ι Ρ 1 α、 Μ I P_ l i3、 R ANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒス夕 ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまたはガ ラニンである上記 （29) 記載のリガンドの決定方法、

(31) ( i) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその 塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドとを接触さ せた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは その塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドおよび 試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記 （15) 記載のスクリーニング方法、 (32) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に接 触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分べ プチドもしくはその塩に接触させた場合における、標識したリガンドの上記（1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の 部分べプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とす るリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、

(33) ( i ) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験 化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞に接 触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞に対する結合量を測定し、 比 較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、

(34) ( i ) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドぉ よび試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する 細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞の膜画分に 対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリ一ニング方法、

(35) ( i ) 標識したリガンドを上記 （7) 記載の形質転換体を培養すること によって該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に接 触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （7) 記載の 形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質に接触させた場合における、 標識したリガンドの該 G蛋白 質共役型レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、

(36) ( i) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩 を活性化する化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有 する細胞に接触させた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕 一蛋白質またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 G 蛋白質共役型レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを 特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、

(37) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩を活性 化する化合物を上記 （7) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換 体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に接触させた場合と、 上 記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩を活性化する化合 物および試験化合物を上記 （7) 記載の形質転換体を培養することによって該形 質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合 における、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を介する細胞刺激活性を測定し、 比 較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター 蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法、

(38) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を活性化する化合物 力 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 ダル夕 ミン、 セロトニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 ノ ソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシト ニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 G RP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (力 ルシトニンジーンリレ一ティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアス夕 チン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひお よび ]3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GR〇ひ、 GRO)3、 G RO了、 NAP 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP - 1、 HC 14、 MCP- 3, 1—309、 Μ Ι Ρ 1 α、 MI P - 1 /3、 RANT ESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシ ン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイドまたはガラニンである上記 （3 6) または （37) 記載のスクリーニング方法、

(39) 上記 （31) 〜 （38) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 リガ ンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合 性を変化させる化合物またはその塩、

(40) 上記 （31) 〜 （38) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 リガ ンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合 性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、

(41) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞を含 有することを特徴とする上記 （16) 記載のスクリーニング用キット、

(42) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞の膜 画分を含有することを特徴とする上記 （16) 記載のスクリーニング用キット、

(43) 上記 （7) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細 胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有することを特徴とする上 記 （16) 記載のスク'リーニング用キット、

(44) 上記 （41) 〜 （43) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られ うる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその 塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、

(45) 上記 （41) 〜 （43) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られ うる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその 塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、 (46) 上記 （9) 記載の抗体と、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを接触させること を特徴とする上記 （1) の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分べプチドまたはその塩の定量法、 (47) 上記 （9) 記載の抗体と、 被検液および標識化された上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたは その塩とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたは その塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記載の G蛋白質 共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の 定量法、 および

(48) 被検液と担体上に不溶化した上記 （9) 記載の抗体および標識化された 上記 （9) 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上 の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記載の G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩 の定量法などを提供する。 図面の簡単な説明

図 1は実施例 1で得られた本発明のラット小脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質 r CB 7T084をコードする DN Aの塩基配列、 およびそれから推 定されるアミノ酸配列を示す （図 2に続く） 。

図 2は実施例 1で得られた本発明のラット小脳由来 G蛋白質共役型レセプター 蛋白質 r CB 7 T 084をコードする D N Aの塩基配列、 およびそれから推定さ れるアミノ酸配列を示す （図 1の続き） 。

図 3は図 1および図 2に示したァミノ酸配列をもとに作成した、 本発明のラッ ト小脳由来 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 r CB 7T084の疎水性プロッ卜 を示す。 発明の実施をするための最良の形態

本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質 （以下、 レセプ夕一蛋白質と略記す る場合がある） は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 （図 1および図 2中 のアミノ酸配列） と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ ター蛋白質である。 本発明のレセプ夕一蛋白質は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例 えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 /3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細 胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細 胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチ ュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑 膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間 質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系 の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下 垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋 肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特 に、 脳や脳の各部位） に由来するタンパク質であってもよく、 また合成タンパク 質であってもよい。

配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましく は約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。

実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。

リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方 法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後述するリガンドの決定方法ゃスク リーニング方法に従つて測定することができる。

また、 本発明のレセプター蛋白質としては、 ①配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したァ ミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは 数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が 他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたアミノ 酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。

本明細書におけるレセプ夕一蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N 末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質をはじめとする、 本発明 のレセプ夕一タンパク質は、 C末端が通常カルボキシル基 （一 COOH) または カルボキシレート（_COO— ) であるが、 C末端がアミド （― CONH₂) また はエステル （― COOR) であってもよい。

ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペン チル、 シクロへキシルなどの C₃— _sシクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 a— ナフチルなどの C₆— ₁₂ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二 ルー C i— 2アルキル基もしくは a—ナフチルメチルなどのひ—ナフチルー（^_₂ アルキル基などの C₇_₁₄ァラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用される ビバ口ィルォキシメチル基などが用いられる。

本発明のレセプ夕一蛋白質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシ レート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されて いるものも本発明のレセプター蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。

さらに、 本発明のレセプ夕一タンパク質には、 上記したタンパク質において、

N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルな どの C ₂— ₆アルカノィル基などの ァシル基など）で保護されているもの、 N 端側が生体内で切断され生成したグル夕ミル基がピ口グル夕ミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 — O H、 一 S H、 アミノ基、 イミ ダゾール基、 インド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホル ミル基、 ァセチルなどの C ₂— ₆アルカノィル基などの — 6ァシル基など）で保護 されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タン パク質なども含まれる。

本発明のレセプター蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わさ れるアミノ酸配列を含有するラット由来 （より好ましくはラット小脳由来） のレ セプ夕一蛋白質などが用いられる。

本発明のレセプター蛋白質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記する場 合がある） としては、 前記した本発明のレセプター蛋白質の部分ペプチドであれ ば何れのものであってもよいが、 例えば、 本発明のレセプ夕一蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 レセプター結合活性を有するものなど が用いられる。

具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するレセプ夕一蛋白 質の部分べプチドとしては、 図 3で示される疎水性プロッ卜解析において細胞外 領域 （親水性 （Hydroph i l i c) 部位） であると分析された部分を含むペプチドであ る。 また、 疎水性 （Hydrophob i c) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いること ができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数のドメイン を同時に含む部分のペプチドでも良い。

本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明のレセプ夕一蛋白質 の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より 好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。

実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 90% 以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。 ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は前記と同様に行なうことができる。

また、 本発明の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が 欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜20 個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。

また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 C〇〇H) ま たはカルボキシレート （一 C〇〇—） であるが、 前記した本発明のタンパク質の ごとく、 C末端がアミド （― CONH₂) またはエステル （― COOR) であつ てもよい。

さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のレセプ夕一蛋白質と同 様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端 側が生体内で切断され生成した G 1 nがピロダル夕ミン酸化したもの、分子内のアミ ノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結 合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。

また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 COOH) ま たはカルボキシレート（一 COO一） であるが、 前記した本発明のタンパク質のご とく、 C末端がアミド （― CONH₂) またはエステル （― COOR) であって もよい。

本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸または塩 基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン 酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安 息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩は、 前述したヒトゃ哺乳動物の細胞ま たは組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもで きるし、 後述する本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N Aを含有する形質 転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のタンパク 質合成法またはこれに準じて製造することもできる。

ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。

本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩またはその アミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルァ ルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシ メチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 (2' , 4' -ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル）フエノキシ樹脂、 4一 (2 ' , 4' - ジメトキシフエニル— Finocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることがで きる。 このような樹脂を用い、 ーァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミ ノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種 保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施 し、 目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。

上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 DC (：、 N, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル -Ν' - (3- ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性 化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOB t, HOOB t )とともに保護アミノ酸を直接 樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または HOB tエステルあるいは H00B tエステ ルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することが できる。

保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルビ 口リ ドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのェ一テ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテ ス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰 り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な 縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミ、ダゾールを用いて未反 応アミノ酸をァセチル化することができる。

原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Boc、 ターシャリーペンチルォ キシカルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4ーメトキシベンジルォキシ カルボニル、 C卜 Z、 Br- Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロアセチ ル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジフエニルホス フイノチオイル、 Fmocなどが用いられる。

カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 夕ーシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステ ル、 4一二トロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4—クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルボニルヒドラジド化、 夕ーシャリーブトキシカルポニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。

セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセテル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボニル 基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラ二ル基、 卜ブチル基などである。

チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 Cl ₂- Bz l、 2 一二トロベンジル、 Br- Z、 夕一シャリーブチルなどが用いられる。

ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、例えば、 Tos、 4 -メトキシ -2， 3, 6- トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Bo Trし Fmocなどが用いられる。

原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペン夕クロ口フエノール、 2, 4, 5- トリクロ口フエノール、 2, 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール、 ラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフタルイミ ド、 HOBt) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化されたも のとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。

保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d -黒あるいは P d -炭素など の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタン スルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれら の混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウム による還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約— 2 0 °C 〜 4 0での温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエ ノール、 チオアニソール、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフィ ド、 1, 4-ブタンジチオール、 1, 2 -エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤 の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2, 4-ジニ卜口フエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファン のィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2 -エタンジチオール、 1, 4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナト リウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。

原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。

タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末 端アミノ酸のひ一カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端の α ーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端の力ルポキシル基の保護基 のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記したような混合 溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質を得ることができる。 この粗タンパク質は既知の各種精製手 段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド 体を得ることができる。

タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の α— 力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タン パク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることがで きる。

本発明の夕ンパク質の部分べプチドまたはその塩は、 自体公知のぺプチドの合 成法に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断するこ とによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合 成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明のタンパク質を構 成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護 基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することが できる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載 された方法力挙げられる。

®M. Bodanszky および M. A. Onde t i i , ペプチド シンセシス （Pept i de Synthesis), Interscience Publ ishers, New York (1966年)

② Schroederおよび Luebke、ザ ペプチド（The Pept ide), Academic Press, New York (1965年)

③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）

④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）

⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成 広川書店

また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分べ プチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊離体 である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩 で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。

本発明のレセプ夕一蛋白質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述した 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする塩基配列 （DNAまたは RNA、 好まし くは DNA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該ポリヌク レオチドとしては、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNA、 mRNA等 の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイブリッドでもよい。 一 本鎖の場合は、 センス鎖 （即ち、 コード鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （即ち、 非コード鎖） であってもよい。

本発明のレセプ夕一蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて、 例えば、 公知の実験医学増刊「新 PC Rとその応用」 15(7)、 1997記載の方法またはそれに 準じた方法により、 本発明のレセプター蛋白質の mRNAを定量することができ る。

本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノ ム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組 織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に 使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミ ドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より total RN Aまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase ChainReaction (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅することもでき る。

具体的には、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で表 わされる塩基配列とハイス卜リンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配 列を有し、 本発明のレセプター蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合 活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプ夕一蛋白質をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。

配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 70以上、 好ましくは約 80% 以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有 する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。

ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー.クロ一ニング（Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrooket al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことが できる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の 方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条 件に従って行なうことができる。

該ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 19〜 40 mM、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 ° (：、 好ましくは約 6 0〜65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 65°C の場合が最も好ましい。

より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するレセプ夕一 蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有す る DN Aなどが用いられる。

本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAの塩基配列の一部、 または該 D N Aと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記の本 発明の部分べプチドをコードする DNAを包含するだけではなく、 R N Aをも包 含する意味で用いられる。

本発明に従えば、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の複製又は発現を阻 害することのできるアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化し たあるいは決定された G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする D N Aの塩 基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド （核酸） は、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の R N Aとハイブリダィズすることがで き、 該 R N Aの合成又は機能を阻害することができるか、 あるいは G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質関連 R N Aとの相互作用を介して G蛋白質共役型レセプター 蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質関連 R N Aの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 及び G蛋白質 共役型レセプ夕一蛋白質関連 R N Aと特異的にハイブリダイズすることができる ポリヌクレオチドは、 生体内及び生体外で G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝 子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療又は診断に有用 である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列又は核 酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレ ォチド、 塩基配列又は核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌ クレオチド（核酸）の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋 白質） のアミノ酸を通常指している。 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6—ベースペア ' リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳開始コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 及び 3 ' 端ヘアピンループは好まし い対象領域として選択しうるが、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子内の如 何なる領域も対象として選択しうる。

目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、 「ァ ンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·ポリヌクレオチドは、 2ーデォキシー D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 D—リ ポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 プリン又はピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオ チド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸及び合成配列特 異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を含有するその他のポリマ一 （但し、 該ポ リマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリナグゃ塩基の付着を 許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2 本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R N A、 1本鎖 R N A、 さらに D NA : R N Aハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （又は非修飾 オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野 で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個 以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾の されたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエス テル、 ホスホルアミデート， 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合 又は硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌクレア一ゼ'インヒビ夕一、 トキ シン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L—リジンなど） や糖 （例えば、 モノサ ッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 イン夕一力レント化合物 （例 えば、 ァクリジン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金 属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキ ル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核 酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 及び 「核 酸」 とは、 プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他 の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル 化されたプリン及びピリミジン、 ァシル化されたプリン及びピリミジン、 あるい はその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド及び修飾さ れたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば 1個以上の水酸基 がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミン などの官能基に変換されていてよい。

本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） は、 R N A、 D NA、 ある いは修飾された核酸 （R N A、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例として は核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミド やオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられる力 それに限定 されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設 計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和 性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性 をより小さなものにする。

こうして修飾は当該分野で数多く知られており。 例えば J. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vo l. 8, pp. 247, 1992 ; Vo l. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke e t al. ed. , Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開 示がある。

本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ ート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着さ せることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特異 的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどのヌク レアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の 基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのグリコ —ルをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに 限定されるものではない。

アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは G蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外 の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸其れ自体公知の各種の方法で細胞 に適用できる。

本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明の部分べ プチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ レ^ また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DNAのい ずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 ブラ スミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細 胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅す ることもできる。

具体的には、本発明の部分べプチドをコ一ドする DN Aとしては、例えば、 （ 1 ) 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DN A、 または （2) 配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな 条件下で八イブリダィズする塩基配列を有し、 本発明のレセプ夕一蛋白質べプチ ドと実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプ夕一蛋白質をコードする DNAの部分塩基配列を有する DN Aな どが用いられる。

配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 70 %以上、好ましくは約 80 % 以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有 する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。

本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチド （以下、 本発明のレセプ夕 一蛋白質と略記する場合がある） を完全にコードする DN Aのクローニングの手 段としては、 本発明のレセプ夕一蛋白質の部分塩基配列を有する合成 DN Aブラ イマ一を用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み込ん だ DN Aを本発明のレセプ夕一蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DN A 断片もしくは合成 DNAを用いて標識したものとのハイブリダィゼーシヨンによ つて選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モレキ ユラ— ·クロ—ニンク (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行 なうことができる。

DNAの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、 Mutan™-G (宝酒造（株））、 Mutan™-K (ま酒造 （株） ） などを用いて、 Gupped duplex法や Kunkel法などの自 体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。

クローン化されたレセプター蛋白質をコードする DN Aは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用するこ とができる。 該 DN Aはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TG Aまたは TAGを有し ていてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNA アダプタ一を用いて付加することもできる。

本発明のレセプター蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のレセプ ター蛋白質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN A断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより 製造することができる。

ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 PBR322, p BR 32 5, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10， pTP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19, p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 XT 1 > p R cZCMV、 pRc/RSV、 p c DNA I ZNe oなどが用いられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモータ一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRひプロモータ一、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモ一夕一、 HS V- TKプロモー夕一などが挙げられる。 これらのうち、 CMVプロモー夕一、 SRaプロモーターなどを用いるのが好ま しい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ一、 l a cプロ モーター、 r e cAプロモーター、 λ Ρ,プロモーター、 l ppプロモーターな どが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SP01プロモー夕一、 SP〇2プロ モータ一、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロ モー夕一、 PGKプロモー夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなど が好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10 プロモーターなどが好ましい。

発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V400 r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp「と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 N e 0「と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 CH〇 （dh ί r— ) 細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マーカ一として 使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。 また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のレセプ夕一蛋白 質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナ ル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひーァ ミラ—ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン · シグナル配列などが、 宿主が酵母であ る場合は、 MFa · シグナル配列、 SUC 2 · シグナル配列など、 宿主が動物細 胞である場合には、 インシュリン ' シグナル配列、 ひ —インターフェロン ' シグ ナル配列、 抗体分子 · シグナル配列などがそれぞれ利用できる。

このようにして構築された本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DN Aを含 有するベクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。

宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。

ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia col i) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ 'ザ'ナショナル ·アカデミー ·ォブ · サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック ·ァシッズ · リサーチ， (Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1 98 1)〕 ， J A 22 1 〔ジャー ナル 'ォブ'モレキュラー 'バイオロジー （Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120巻， 5 1 7 (1 978)〕 ， HB 10 1 〔ジャーナル'ォブ ·モレキュラー ' バイオロジー， 4 1巻， 4 5 9 ( 1 9 6 9)〕 , C 6 0 0 〔ジエネティックス (Genetics) , 39巻， 440 ( 1 954)〕 などが用いられる。

バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·ズブチルス (Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナル · ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1 98 4)〕 などが用いられる。

酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22 , AH22 R—， ΝΑ 8 7 - 1 1 A, DKD— 5D， 20 B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) N C Y C 1 9 1 3， NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) などが 用いられる。

昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell ； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中腸 由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™ 細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyxmori ； BmN細胞） など が用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞（以上、 Vaughn, J.し ら、イン ·ヴイボ（In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。

昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) , 3 15巻， 592 (1 985)〕 。

動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Vero, チャイニーズハムス 夕一細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r") 細胞と略記） ， マウス L細 胞， マウス A t T_20, マウスミエローマ細胞， ラッ卜 GH3, ヒト FL細胞 などが用いられる。 ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 プロシージングズ'ォブ'ザ ' ナショナル 'アカデミー'ォブ ·サイェンジィズ'ォブ ·ザ'ュ一エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2 1 1 0 (1 972)やジーン （Gene) ， 1 7巻， 1 07 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。 バチ ルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキユラ一 'アンド 'ジェネラル 'ジ エネティックス （Molecular & General Genetics) ， 1 68巻， 1 1 1 (197 9 )などに記載の方法に従って行なうことができる。

酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ 'イン 'ェンザィモロジ一（Methods inEnzymology) , 1 94巻， 1 82— 187 ( 199 1 ) 、 プロシージングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1 929 (1 978) など に記載の方法に従って行なうことができる。

昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジー (Bio/Technology) , 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことがで さる。

動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロト コール. 263— 267 ( 1995) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジー （Virology) , 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。

このようにして、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする DN Aを含有 する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。

宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加して もよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。 ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) , ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンッ · ィン ·モレキュラー ·ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 43 1 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 9 72〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせるために、 例えば、 3 /3—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿 主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43°Cで約 3〜24時間行な レ 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー （Burkholder) 最小培地 CBosUan, K. L. ら、 「プロシ一ジングズ 'ォ ブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77巻， 4505 (1980)〕 や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 「プロシージングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 8 1巻， 5330 ( 1 984 ) 〕 力 挙げられる。培地の ρ Ηは約 5〜 8に調整するのが好ましい。培養は通常約 20 °C 〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T.C. C. ,ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培 地の ρΗは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 122巻， 5 01 (1952)〕， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) , 8巻， 396 (1 959)〕 ， RPMI 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ 'ザ'アメリカン ·メデ ィカル'ァソシェ一ション (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 5 1 9 (1 967)〕 ， 1 99培地 〔プロシージング ·ォブ ·ザ ·ソサ イエティ ·フォー'ザ 'バイオロジカル'メディスン （Proceedingof the Society for the Biological Medicine) , 73巻， 1 ( 1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30° (：〜 40 で約 1 5〜60 時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。

以上のようにして、 形質転換体の細胞膜に本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質を生成せしめることができる。

上記培養物から本発明のレセプ夕一蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下記 の方法により行なうことができる。

本発明のレセプ夕一蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりレセプ夕一蛋白質の粗抽出液を得る方法など が適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X— 100^TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にレセ プ夕ー蛋白質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体ぁ るいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。

このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるレセプター蛋 白質の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができ る。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利 用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一などの特異的新和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一など の疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方 法などが用いられる。

かくして得られるレセプ夕一蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の 方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得ら れた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。

なお、 組換え体が産生するレセプ夕一蛋白質を、 精製前または精製後に適当な 蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 卜リブシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコ シダ一ゼなどが用いられる。

かくして生成する本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩の活性は、 標識した リガンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどに より測定することができる。

本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであって もよい。

本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のレセプ夕一蛋白質等と略記する場合もある） に対する抗体は、 本発明のレ セプ夕一蛋白質等を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に従 つて製造することができる。

〔モノクローナル抗体の作製〕

( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製

本発明のレセプ夕一蛋白質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能 な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体 産生能を高めるため、 完全フロイン卜アジュバントゃ不完全フロイントアジュバ ントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行 なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが好 ましく用いられる。

モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化レセプ夕一蛋白質等と 抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより 行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタイン の方法 〔ネイチヤー （Nature), 256巻、 495頁 （1975年） 〕 に従い実施 することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P EG) やセンダイウィルスなどが挙げられる力 好ましくは PEGが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2/0などが挙げら れるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG 1000〜PEG6000) 力 10〜 80 %程度の濃度で添加 され、 約 20〜40°C、 好ましくは約 30〜37°Cで約 1〜10分間インキュべ 一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。

モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 レセプ夕一蛋白質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸 着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次 に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられ る細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グ ロブリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を 添加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプ夕一蛋白質等を加え、 固相に結 合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。

モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培 地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPM 1 1640培地、 1〜 10 %の牛胎児血清を含む G I T培地 (和光純薬工業 (株)） またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ） な どを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 ° (：、 好ましくは約 3 7 °C である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗 体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

( b ) モノクロナール抗体の精製

モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。

〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕

本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法にし たがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原（レセプ夕一蛋白質等の抗原） とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のレセプ夕一蛋白質等に 対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。 哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリア一蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール ' リンペット ·へモシァニン等を重量比でハ プテン 1に対し、約 0. 1〜2 0、好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法 が用いられる。

また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。

縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。

抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。

本発明のレセプター蛋白質またはその塩、 その部分ペプチドまたはその塩、 お よび該レセプ夕ー蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D N Aは、 （1 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド （ァゴ二スト） の決 定、 （2 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患 の予防および/または治療剤、 （3 ) 遺伝子診断剤、 （4 ) 本発明のレセプ夕一 蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方 法、 （5 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化さ せる化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤、 （6 ) 本発明の G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドの定量法、 （7 ) 本発明の G蛋 白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二 スト、 アン夕ゴニストなど） のスクリーニング方法、 （8 ) 本発明の G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニス卜） を含有する各種疾病の予防および または治療剤、 （9 ) 本発 明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量、 （1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化さ せる化合物のスクリーニング方法、 （1 1 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一 蛋白質またはその部分べプチドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予 防および/または治療剤、 （1 2 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩に対する抗体による中和、 （1 3 ) 本発明の G蛋白質共役 型レセプター蛋白質をコードする D N Aを有する非ヒト動物の作製などに用いる ことができる。 特に、 本発明の組換え型 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の発現系を用いたレ セプタ一結合アツセィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な G蛋 白質共役型レセプ夕一に対するリガンドの結合性を変化させる化合物 （例、 ァゴ 二スト、 アン夕ゴニストなど） をスクリーニングすることができ、 該ァゴ二スト またはアン夕ゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができ る。

本発明のレセプ夕一蛋白質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発明 のレセプ夕一タンパク質等と略記する場合がある） 、 本発明のレセプター蛋白質 またはその部分ペプチドをコードする DNA (以下、 本発明の DNAと略記する 場合がある） および本発明のレセプター蛋白質等に対する抗体 （以下、 本発明の 抗体と略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明する。

(1)本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンド （ァゴニスト） の決定

本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩または本発明の部分べプチドもしく はその塩は、 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二 スト） を探索し、 または決定するための試薬として有用である。

すなわち、 本発明は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩または本発明 の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供する。

試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシ ン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 Ρ ACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマ トス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソァク ティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス 夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシト ニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび /3 ーケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROひ、 GRO/3、 GROr > NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP - 1、 HC 14、 MCP— 3、 I— 309、 M I P l a、 M I P— l j3、 RANT ESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまたはガラニンなど） の他に、 例えば、 ヒト または哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の 組織抽出物、 細胞培養上清などが用いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培養 上清などを本発明のレセプター蛋白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しなが ら分画し、 最終的に単一のリガンドを得ることができる。

具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしく はその部分ペプチドもしくはその塩を用いるか、 または組換え型レセプター蛋白 質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いること によって、 本発明のレセプ夕一蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a²⁺遊離、 細胞内 CAM P生成、 細 胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質の リン酸化、 c— f o s活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活 性） を有する化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化 合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法である。

本発明のリガンド決定方法においては、 本発明のレセプター蛋白質またはその 部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該レセプター蛋白質 または該部分べプチドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性などを測定 することを特徴とする。

より具体的には、 本発明は、

①標識した試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩または本発 明の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識した試験化合 物の該蛋白質もしくはその塩、 または該部分べプチドもしくはその塩に対する結 合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対す るリガンドの決定方法、

②標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞または該細 胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞または該膜 画分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質また はその塩に対するリガンドの決定方法、

③標識した試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質をコ一ドする D N Aを含有 する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプ夕一蛋白質に 接触させた場合における、 標識した試験化合物の該レセプター蛋白質またはその 塩に対する結合量を測定しすることを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質に対 するリガンドの決定方法、

④試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞に接触させた場合に おける、 レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a ^{2 +}遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c G M P 生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c _ f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を 測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガ ンドの決定方法、 および

⑤試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N Aを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させ た場合における、 レセプ夕一蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン 酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a ^{2 +}遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c G M P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン 酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性 など） を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対 するリガンドの決定方法を提供する。

特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明のレセプ夕一蛋白質に 結合することを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。 まず、 リガンド決定方法に用いるレセプ夕一蛋白質としては、 上記した本発明 のレセプ夕一蛋白質または本発明の部分ペプチドを含有するものであれば何れの ものであってもよいが、 動物細胞を用いて大量発現させたレセプ夕一蛋白質が適 している。

本発明のレセプ夕一蛋白質を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが、 該レセプ夕ー蛋白質をコードする DN Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現するこ とにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする DN A断片 には、 通常、 相補 DN Aが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではな レ^ 例えば、 遺伝子断片や合成 DNAを用いてもよい。 本発明のレセプ夕一蛋白 質をコードする DNA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させ るためには、 該 DN A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角 体病ウィルス （nuclear polyhedrosis virus； NP V) のポリヘドリンプロモ一 ター、 SV40由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタロチ ォネインプロモータ一、 ヒトヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィル スプロモーター、 S R αプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現 したレセプ夕一の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。 例え ば、 文献 〔Nambi, P. ら、 ザ ·ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカル ·ケミストリ 一 a Biol. Chem. ) , 267巻， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行 うことができる。

したがって、 本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質 もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するものとしては、 それ自体公知 の方法に従って精製したレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその 塩であってもよいし、 該レセプ夕ー蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分 を用いてもよい。

本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細 胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化しても よい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。

本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞としては、 本発明のレセプター蛋白 質を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。

細胞膜画分としては、 細胞を破枠した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehj em 型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリ トロン (Kinematica社製） による破碎、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧 ₄Q しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。 細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （150 00 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を 膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一蛋白質と細胞由来のリン脂 質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。

該レセプ夕ー蛋白質を含有する細胞やその膜画分中のレセプ夕一蛋白質の量は、 1細胞当たり 10³〜 10⁸分子であるのが好ましく、 10⁵〜 10⁷分子であるの が好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活 性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。

本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の① 〜③の方法を実施するためには、 適当なレセプター蛋白質画分と、 標識した試験 化合物が必要である。

レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一画分などが望ましい。 ここで、 同等 の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。

標識した試験化合物としては、 〔³H〕 、 〔¹²⁵ I〕 、 〔¹⁴C〕 、 〔³⁵S〕 な どで標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリ ン、 バソプレツシン、 ォキシ卜シン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 力 ルシ卜ニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACT H、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リ ィテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイ コトリエン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデ ノシン、 アドレナリン、 ひおよび j3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROひ、 GR〇 3、 GR〇了、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP - 1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 309、 M I P 1 ひ、 λ4 I P— 1 /3、 R ANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドま たはガラニンなどが好適である。

具体的には、 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定 方法を行なうには、 まず本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞または細胞の 膜画分を、 決定方法に適したバッファーに懸濁することによりレセプ夕一標品を 調製する。 ノ ッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バ ッファー、 トリス—塩酸バッファーなどのリガンドとレセプ夕一蛋白質との結合 を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減さ せる目的で、 CHAPS、 Twe e n - 80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニ ン、 デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンゃゼラチンなどの 各種蛋白質をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるリ セプ夕一やリガンドの分解を抑える目的で PMSF、ロイぺプチン、 E— 64 (ぺ プチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもで きる。 0. 0 lm 1〜 10mlの該レセプタ一溶液に、 一定量 （5000 c pm〜 500000 c pm) の 〔³H〕 、 〔¹²⁵ I〕 、 〔¹⁴C〕 、 〔³⁵S〕 などで標識 した試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の 未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°Cから 50で、 望ましくは約 4 °Cから 37 °Cで、 約 20分から 24時間、 望ましくは約 30分か ら 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗 浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ 一あるいはァ一カウンターで計測する。 全結合量 （B) から非特異的結合量 （N SB) を引いたカウント （B— NSB) が 0 c pmを越える試験化合物を本発明 のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二スト） として選択す ることができる。

本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の④ 〜⑤の方法を実施するためには、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a²⁺遊離、 細胞内 cA MP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細 胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性ま たは抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定す ることができる。 具体的には、 まず、 レセプ夕一蛋白質を含有する細胞をマルチ ゥエルプレート等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮 な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物な どを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収 して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標と する物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によ つて検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なつ てもよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなど で細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出 することができる。

本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に結合するリガンド決定用キットは、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩、 本発明の部分ペプチドもしくはその 塩、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞、 または本発明のレセプ夕一蛋白 質を含有する細胞の膜画分などを含有するものである。

本発明のリガンド決定用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。

1. リガンド決定用試薬

①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液

Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。

孔径 0.45 /zmのフィルターで濾過滅菌し、 4 :で保存するか、 あるいは用時 調製しても良い。

② G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質標品'

本発明のレセプ夕一蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 10⁵個/穴で継代し、 37°C、 5%C〇₂、 95 % a i rで 2日間培養したもの。 ③標識試験化合物

市販の 〔³H〕 、 〔¹²⁵ I〕 、 〔¹⁴C〕 、 〔³⁵S〕 などで標識した化合物、 ま たは適当な方法で標識化したもの

水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 /xMに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチルホル ムアミド、 D^IS〇、 メタノール等に溶解する。

④非標識試験化合物

標識化合物と同じものを 100〜1 000倍濃い濃度に調製する。

2. 測定法

① 1 2穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプ夕一蛋白質発現 CHO 細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 ;U 1の測定用緩衝液を各 穴に加える。

②標識試験化合物を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を 知るためには非標識試験化合物を 5 1加えておく。

③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識 試験化合物を 0. 2 N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一 夕一 A (和光純薬製） と混合する。

④液体シンチレーシヨンカウン夕一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測定 する。

本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドとし ては、 例えば、 脳、 下垂体、 脬臓などに特異的に存在する物質などが挙げられ、 具体的には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリ ン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 力 ルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACT H、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リ レイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 ァミリ ン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび /3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L一 8、 GROひ、 GRO/3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA_ 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP_3、 I一 309、 M I P Iひ、 M I P— 1 /3、 R ANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガス卜り ン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイ ド、 ガラニンなどが用いられる。

(2) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予 防および/または治療剤

上記 （1) の方法において、 本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドが明 らかになれば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質 または②該レセプ夕一蛋白質をコ一ドする DNAを、 本発明のレセプ夕一蛋白質 の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤などの医薬として使用す ることができる。

例えば、 生体内において本発明のレセプター蛋白質が減少しているためにリガ ンドの生理作用が期待できない （該レセプター蛋白質の欠乏症） 患者がいる場合 に、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質を該患者に投与し該レセプ夕一蛋白質の量を補 充したり、 ② （ィ） 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNA 該患者に投 与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発明のレセプ 夕一蛋白質をコードする DNAを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植 することなどによって、 患者の体内におけるレセプ夕一蛋白質の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる。 即ち、 本発明のレセプター蛋 白質をコードする DNAは、 安全で低毒性な本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不 全に関連する疾患の予防および/または治療剤として有用である。

本発明のレセプ夕一蛋白質は、 G蛋白共役型レセプター蛋白質の一種である M ASとアミノ酸配列レベルで約 30%の相同性が認められる。 MAS遺伝子欠損 マウスに不安の昂進等の中枢機能の変化が認められたとの報告 〔 J. B. C. , 273 (No.19), 11867-11873 (1998)) があることから、 M A S遺伝子は中枢機能発現に 何らかのはたらきがあると考えられる。 従って、 MASと相同性が認められる本 発明のレセプター蛋白質は、 中枢機能の不全に関連する疾患 （例えば、 不安症、 分裂病、 躁鬱病、 痴呆症、 精神遅滞および運動障害を包含する精神病など） の予 防および Zまたは治療に有用である。 ラッ卜の MAS遺伝子の発現が生後直後に 末梢の種々の臓器で高い発現を示し、 成熟後は中枢以外では精巣で高い発現を示 すとの報告 [FEBS Le t t. 357 : 27-32 (1995) ]があることから、 細胞の増殖'機能の 獲得および生殖に重要な役割があると考えられる。 従って、 M A Sと相同性が認 められる本発明のレセプ夕一蛋白質は、 呼吸器疾患 '循環器疾患 ·消化管疾患'肝/ 胆 /膨疾患 ·内分泌疾患の予防および Zまたは治療に有用である。

本発明のレセプ夕一蛋白質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套手 段に従って製剤化することができる。

一方、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N A (以下、 本発明の D N A と略記する場合がある） を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D N Aを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノ ウィルスァソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで、 ある いは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ うなカテーテルによって投与できる。

例えば、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質または②該レセプ夕一蛋白質をコードす る D N Aは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイ クロ力プセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許 容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用 できる。 例えば、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質または②該レセプター蛋白質をコ ードする D N Aを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単 位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤における 有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

【0 0 6 0】

錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化 剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリン のような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤など が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料にさ らに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は 注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出 植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方すること ができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の 補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソ）レビトール、 D—マンニトール、 塩化ナト リウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 ェ 夕ノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ —ル） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ一ト 80^TM、 HCO-50) な どと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸べンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。

【0061】

また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、' リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調整された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。

本発明のレセプター蛋白質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 分裂病患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜l 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する 場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 分裂病患者 （6 O k として） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜20 mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するの が好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与するこ とができる。

本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 分裂病患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜 10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50m g、 より好ましくは約 1. 0〜 2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 そ の 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 分裂病患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。

(3) 遺伝子診断剤

本発明の DN Aは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは哺乳動物 (例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） にお ける本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DNAまた は mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DN Aまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRN Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。

本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハ イブリダィゼ一シヨンや PC R_S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5 巻， 874〜 879頁 （1989年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ 'ナショナ ル'アカデミー ·ォブ 'サイェンシィズ'ォブ'ユーエスェ一（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ， 第 86巻， 2766〜2770頁 （ 1989年） ） などにより実施することができる。

(4) 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる 化合物のスクリーニング方法

本発明の DNAは、 プローブとして用いることにより、 本発明のレセプター蛋 白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用 いることができる。

すなわち本発明は、 例えば、 （ i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （H ) 形質転換体等に含まれる本 発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの m R N A量を測定することに よる、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる 化合物のスクリーニング方法を提供する。

本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの m R N A量の測定は具体 的には以下のようにして行なう。

( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラッ卜、 ゥサ ギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴 呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過した 後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器 から単離した組織、 あるいは細胞を得る。

得られた細胞に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの m R N Aは、 例えば、 通常の方法により細胞等から m R N Aを抽出し、 例えば TaqManPCR などの手法を用いることにより定量することができ、 自体公知の手段 によりノザンブロットを行うことにより解析することもできる。

( i i ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換 体を前述の方法に従い作製し、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白 質またはその部分ペプチドの mR N Aを同様にして定量、 解析することができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合 物のスクリーニングは、

( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的ス トレスなどを与える一定時間前 （3 0分前ないし 2 4時間前、 好ましくは 3 0分 前ないし 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） もしくは一定時 間後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましく は 1時間後ないし 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被 検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後） 、 細胞に含 まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの mR N A量を定量、 解析することにより行なうことができ、

(i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一 定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 より好ま しくは 2日後ないし 3日後） 、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプター蛋白 質またはその部分ペプチドの mR N A量を定量、 解析することにより行なうこと ができる。

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本発明 のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用を有する 化合物であり、 具体的には、 （ィ） 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分べ プチドの発現量を増加させることにより、 G蛋白質共役型レセプ夕一を介する細 胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a ^{2 +}遊 離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f 0 sの活性化、 p Hの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物、 （口） 本発明のレ セプ夕一蛋白質またはその部分べプチドの発現量を減少させることにより、 該細 胞刺激活性を減弱させる化合物である。

該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公 知の化合物であってもよい。

該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等の生理活 性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。

該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等の生理活 性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプター蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることがで さる。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。

該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 分裂病患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 0mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 分裂病患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. ：！〜 20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 (5) 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる 化合物を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤

本発明のレセプ夕一蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何ら かの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本発明のレセプ夕一蛋白 質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、 本発明のレセプ夕一 蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およびノまたは治療剤として用いること ができる。

該化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および /または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができ る。

例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよ うにするものである。

錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 —スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化 剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリン のような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤など が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料にさ らに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は 注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出 植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方すること ができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の 補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナト リウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 ェ 夕ノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ —ル） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ一ト 8 0 ^TM、 H C O— 5 0 ) な どと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤（例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調整された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。

該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 分裂病患者 （6 0 k g として） においては、 一日につき約 0. 1〜 1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 分裂病患者 （60 kgとして） においては、 一曰につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. ：!〜 20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。

(6) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプター蛋白質等は、 リガンドに対して結合性を有しているので、 生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。

本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いることが できる。 すなわち、 被検体を本発明のレセプ夕一蛋白質等と接触させることによ つて被検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば、 以 下の①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いること ができる。

①入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行）

②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）

(7) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化さ せる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニストなど） のスクリーニング方法

本発明のレセプ夕一蛋白質等を用いるか、 または組換え型レセプ夕一蛋白質等 の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いることに よって、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物 (例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物な ど） またはその塩を効率よくスクリ一二ングすることができる。

このような化合物には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一を介して細胞刺激活 性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca²⁺遊離、 細胞 内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変 動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— i o sの活性化、 pHの低下などを促進する 活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一 蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆ る、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （八） リガンドと本 発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるいは (二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を減少さ せる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物は、 上記したリガンド決 定方法によってスクリーニングすることが好ましい） 。

すなわち、 本発明は、 （ i ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と （i i ) 本発明のレセプ夕一 蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と、 リガンドおよび試験化合物と を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明のレセプ 夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。

本発明のスクリーニング方法においては、 （ i ) と （i i ) の場合における、 例 えば、 該レセプター蛋白質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測 定して、 比較することを特徴とする。

より具体的には、 本発明は、

①標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合と、 標識 したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプター蛋白質等に接触させた場合 における、 標識したリガンドの該レセプ夕一蛋白質等に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、

②標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞または該細 胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明の レセプ夕—蛋白質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合にお ける、 標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較 することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、

③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することに よって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質等に接触させた場合と、 標識したリ ガンドおよび試験化合物を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現した本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合にお ける、 標識したリガンドの該レセプ夕一蛋白質等に対する結合量を測定し、 比較 することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、

④本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ夕 一蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明のレセプター蛋白質等を含有する細 胞に接触させた場合と、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物および 試験化合物を本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合にお ける、 レセプ夕一を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチル コリン遊離、 細胞内 C a ^{2 +}遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o s の活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および

⑤本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ夕 一蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培 養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプター蛋白質等に接触させ た場合と、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物および試験化合物を 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し た本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合における、 レセプ夕一を介する 細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a ^{2 +} 遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細 胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c 一 f o sの活性化、 p Hの低下など を促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはそ の塩のスクリーニング方法を提供する。

本発明のレセプ夕一蛋白質等が得られる以前は、 G蛋白質共役型レセプ夕ーァ ゴニストまたはアン夕ゴニストをスクリーニングする場合、 まずラッ卜などの G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含む細胞、 組織またはその細胞膜画分を用いて 候補化合物を得て （一次スクリーニング） 、 その後に該候補化合物が実際にヒ卜 の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認 する試験 （二次スクリーニング） が必要であった。 細胞、 組織または細胞膜画分 をそのまま用いれば他のレセプ夕一蛋白質も混在するために、 目的とするレセプ 夕一蛋白質に対するァゴニストまたはアン夕ゴニストを実際にスクリーニングす ることは困難であった。

しかしながら、 例えば、 本発明のラット由来レセプ夕一蛋白質を用いることに よって、 一次スクリーニングの必要がなくなり、 リガンドと G蛋白質共役型レセ プ夕一蛋白質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングすることがで きる。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴニストかアン夕ゴニストかを 簡便に評価することができる。

本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。

まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプター蛋白質等とし ては、 上記した本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有するものであれば何れのもの であってもよいが、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する哺乳動物の臓器の細 胞膜画分が好適である。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なこと から、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現さ せたラット由来のレセプ夕一蛋白質等などが適している。

本発明のレセプター蛋白質等を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 本 発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする D N A断片には相補 D N Aが用いられる力^ 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D N Aを用 いてもよい。 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N A断片を宿主動物細胞 に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D N A断片を昆虫を宿主と するバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuc l ear po lyhedros i s v i rus； N P V) のポリヘドリンプロモーター、 S V 4 0由来のプロモーター、 レ トロウィルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモー夕一、 ヒトヒートショ ックプロモー夕一、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R aプロモ一ターな どの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプ夕一の量と質の検査はそれ自 体公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Namb i， P. ら、 ザ'ジャーナ ル'ォブ ·バイオロジカル'ケミストリ一 （J. B i o l. C em. ) , 267巻， 19555〜1 9559 頁， 1 992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。

したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白 質等を含有するものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製したレセプター 蛋白質等であってもよいし、 該レセプ夕一蛋白質等を含有する細胞を用いてもよ く、 また該レセプタ一蛋白質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。

本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有す る細胞を用いる場合、 該細胞をグルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化し てもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。

本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞としては、 該レセプター蛋白質等 を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆 虫細胞、 動物細胞などが好ましい。

細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破碎方法としては、 Po t ter— E lvehj em 型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮ一リングプレンダーゃポリ トロン (Ki nema t i ca社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧 しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などが挙げられる。 細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を 膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一蛋白質等と細胞由来のリン 脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。

該レセプ夕ー蛋白質等を含有する細胞や膜画分中のレセプ夕一蛋白質の量は、 1細胞当たり 1 0 ³〜1 0 ⁸分子であるのが好ましく、 1 0 ⁵〜1 0 ⁷分子であるの が好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活 性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。

リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物をスク D ί

リーニングする上記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当なレセプター蛋 白質画分と、 標識したリガンドが必要である。

レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。 標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化 合物などが用いられる。 例えば 〔³H〕 、 〔¹²⁵ I〕 、 〔¹⁴C〕 、 〔³⁵S〕 など で標識されたリガンドなどが用いられる。

具体的には、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる 化合物のスクリーニングを行なうには、 まず本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有 する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁する ことによりレセプ夕一蛋白質標品を調製する。バッファーには、 pH4〜l 0 (望 ましくは pH6〜8) のリン酸バッファ一、 トリス—塩酸バッファ一などのリガ ンドとレセプ夕一蛋白質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよ い。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n - 80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッ ファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによるレセプ夕一やリガン ドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製）、 ぺプス夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 0 lm l〜 10m lの該レセプ夕一溶液に、一定量（5000 c pm〜 500000 c pm) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10_⁴M〜10— ^1GMの試験化合物を共存 させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識のリガンドを加 えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°Cから 50°C、 望ましくは約 4でから 37 で、 約 20分から 24時間、 望ましくは約 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファ一で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙 に残存する放射活性を液体シンチレ一ションカウンターまたはァ一カウンターで 計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント（B。） から非特異的結合量 （NS B) を引いたカウント （B。一 NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 （B — NSB) が、 例えば、 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補 00 物質として選択することができる。

リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物スクリ 一二ングする上記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 レセプ夕一蛋白 質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 C a遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c G M P生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの 低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測 定用キットを用いて測定することができる。

具体的には、 まず、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞をマルチゥェ ルプレート等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な 培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物など を添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収し て、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とす る物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によつ て検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なって もよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで 細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出す ることができる。

細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なレセプ夕一蛋白 質を発現した細胞が必要である。 本発明のレセプター蛋白質等を発現した細胞と しては、 天然型の本発明のレセプ夕一蛋白質等を有する細胞株、 前述の組換え型 レセプ夕一蛋白質等を発現した細胞株などが望ましい。

試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用いら れ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよ い。

リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング用キットは、 本発明のレセプ夕一蛋白質等、 本発明のレ セプター蛋白質等を含有する細胞、 または本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有す る細胞の膜画分を含有するものなどである。

本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。

1. スクリーニング用試薬

①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液

Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。

孔径 0.45 mのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時 調製しても良い。

② G蛋白質共役型レセプ夕一標品

本発明のレセプ夕一蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレー に 5 X 10⁵個ノ穴で継代し、 37°C、 5%C〇₂、 95 % a i rで 2日間培養したもの。

③標識リガンド

市販の 〔³H〕 、 〔¹²⁵ I〕 、 〔¹⁴C〕 、 〔³⁵S〕 などで標識したリガンド 水 溶液の状態のものを 4°Cあるいは— 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて I Mに希釈する。

④リガンド標準液

リガンドを 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（シグマ社製） を含む PBSで ImMと なるように溶解し、 一 2 CTCで保存する。

2. 測定法

① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプ夕一蛋白質発現 CHO 細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 ^ 1の測定用緩衝液を各 穴に加える。

② 10— ³〜10— ^1QMの試験化合物溶液を 5 w 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化合物 の代わりに 10— ³Mのリガンドを 5 1加えておく。

③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識 リガンドを 0. 2N N aOH- 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕 一 A (和光純薬製） と混合する。

④液体シンチレ一シヨンカウン夕一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測定 DU

し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める <

PMB- [ (B -NS B) Z (B。一 NSB) ] X 100

PMB Percent Ma imum Binding

B 検体を加えた時の値

NSB Non-specific Binding (非特異的結合量)

取大糸口口里 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変 化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ ターを介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a²⁺遊離、 細胞内 CAM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシト一ルリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆ る、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を 有しない化合物（いわゆる、本発明のレセプ夕一蛋白質に対するアンタゴニスト）、 (八） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を増強す る化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 との結合力を減少させる化合物である。

該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公 知の化合物であってもよい。

本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するァゴニストは、 本発明のレセプ夕一蛋白 質等に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該リガ ンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。

本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するアン夕ゴニストは、 本発明のレセプター 蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 該リ ガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。 ：本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を増強する化 合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を増強 するための安全で低毒性な医薬として有用である。

リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を減少させる 化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を減 少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従って 実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する 医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無 菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。

該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 分裂病患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 0mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 分裂病患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 (8) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化さ せる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） を含有する各種疾病の予防およびノ または治療剤

本発明のレセプ夕一蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何ら かの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本発明のレセプター蛋白 質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） は、 O 本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および zまたは治療 剤として用いることができる。

該化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および /または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができ る。

例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよ うにするものである。

錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化 剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリン のような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤など が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料にさ らに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は 注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出 植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方すること ができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の 補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナト リウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 ェ 夕ノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ —ル） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ一ト 8 0 ^TM、 H C O - 5 0 ) な どと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 上記予防，治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調整された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。

該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 分裂病患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 分裂病患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 ( 9 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の定量 本発明の抗体は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を特異的に認識することができ るので、 被検液中の本発明のレセプター蛋白質等の定量、 特にサンドイッチ免疫 測定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、

( i) 本発明の抗体と、 被検波および標識化レセプ夕一蛋白質等とを競合的に反 応させ、 該抗体に結合した標識化レセプター蛋白質等の割合を測定することを特 徵とする被検液中の本発明のレセプ夕一蛋白質等の定量法、

(ii) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗 体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測 定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプター蛋白質等の定量法を提供 する。

上記 （ii) においては、 一方の抗体が本発明のレセプ夕一蛋白質等の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のレセプター蛋白質等の C端部に反応する 抗体であることが好ましい。

本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のレセプ夕一蛋白質等の 測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目 的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。本発明のレセプター蛋白質等に対す る抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原 量 （例えば、 レセプ夕一蛋白質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複 合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標 準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を 用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサ ンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイツ チ法を用いるのが特に好ましい。

標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔^{1 2 5} I〕 、 〔^{1 3 1} I〕 、 〔³ H〕 、 〔^{1 4} C〕 などが用いられる。 上記酵素 としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダー ゼ、 3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダ一ゼ、 リン ゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレス力ミ ン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用い られる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を 用いることもできる。

抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方 法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。 サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応さ せ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検 液中の本発明のレセプ夕一蛋白質量を定量することができる。 1次反応と 2次反 応は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行な つてもよい。 標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用 抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させ る等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。

本発明のサンドイッチ法によるレセプ夕一蛋白質等の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプ夕一蛋白質等 の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および 2 次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 レセプ夕一 蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端 部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。

本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの ち、 未反応の標識抗原と（F ) と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本 反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレングリコー ル、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固 相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として 固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。

ィムノメトリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検波中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検波中の抗原量を定量する。 また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈 降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー などが好適に用いられる。

これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプ夕一蛋白質またはそ の塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノア ッセィ〕 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ〕 (講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭 和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「メソッズ 'イン'ェンジモノジー （Methods in ENZYM0L0GY)」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)) 、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)) > 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0), 同 書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays))、 同 書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) 、 同 書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and Monoclonal Ant ibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。

以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のレセプ夕一蛋白 質またはその塩を感度良く定量することができる。

さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のレセプ夕一蛋白質または その塩を定量することによって、 本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連す る各種疾患の診断をすることができる。

また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセプ ター蛋白質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発明の レセプター蛋白質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分 画中の本発明のレセプ夕一蛋白質等の検出、 被検細胞内における本発明のレセプ ター蛋白質の挙動の分析などのために使用することができる。

( 1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量 を変化させる化合物のスクリーニング方法

本発明の抗体は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたは その塩を特異的に認識することができるので、 細胞膜における本発明のレセプタ 一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニングに用 いることができる。

すなわち本発明は、 例えば、

( i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もしく は細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレ セプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜における 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のス クリーニング方法、

( i i ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換 体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ 夕一蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜における本発 明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリ 一二ング方法、

( i i i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、②特定の臓器、③臓器から単離した組織もしく は細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該受容 体夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該夕ンパク質を 確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分 ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。

( iv) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換 体等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該受容体夕 ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該タンパク質を確認 することによる、 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ぺプ チドの量を変化させる化合物のスクリ一二ング方法を提供する。 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの定 量は具体的には以下のようにして行なう。

( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサ ギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴 呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過した 後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器 から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 へぺス緩衝 液など） 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壊し、 界面活性剤 （例えば、 トリ トン X 1 0 0 ^TM、 ツイ一ン 2 0 ^TMなど） などを用い、 さらに遠心分離や濾過、 カラム分画などの手法を用レ ^て細胞膜画分を得る。

細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Po t t er— E lvehj em 型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリ トロン (Ki nemat i ca社製） のよる破碎、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧 しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。 細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜 3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を 膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一蛋白質等と細胞由来のリン 脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。

細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドは、 例えば、 本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、 ウエスタンプロット解 折などにより定量することができる。

かかるサンドィツチ免疫測定法は前述の方法と同様にして行なうことができ、 ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。 ( i i ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換 体を前述の方法に従い作製し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一蛋白質 またはその部分ペプチドを定量することができる。

細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化 させる化合物のスクリーニングは、

( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的ス トレスなどを与える一定時間前 （3 0分前ないし 2 4時間前、 好ましくは 3 0分 前ないし 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） もしくは一定時 間後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましく は 1時間後ないし 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被 検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後） 、 細胞膜に おける本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を定量することに より行なうことができ、

( i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一 定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 より好ま しくは 2日後ないし 3日後） 、 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質または その部分ペプチドの量を定量することにより行なうことができる。

細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの確 認は具体的には以下のようにして行なう。

( i i i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサ ギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴 呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過した 後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器 から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細胞等を、 常法に従い組織切片とし、 本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。 細胞表層での 該受容体夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該夕ンパ ク質を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞膜における本発明のレ セプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を確認することができる。

( iv) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換 体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞膜 における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる作 用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 細胞膜における本発明のレセプ夕 一蛋白質またはその部分べプチドの量を増加させることにより、 G蛋白質共役型 レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 C a ^{2 +}遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c G M P生成、 イノシト 一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 : f o sの活性 ィ匕、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合 物、 （口） 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの 量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。

該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公 知の化合物であってもよい。

該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等の生理活 性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。

該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等の生理活 性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプター蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることがで さる。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 分裂病患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 0mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 分裂病患者 （6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 (1 1) 細胞膜における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの量 を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防およびノまたは治療剤

本発明のレセプター蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何ら かの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 細胞膜における本発明の レセプター蛋白質またはその部分べプチドの量を変化させる化合物は、 本発明の レセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤として 用いることができる。

該化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および ノまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができ る。

例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよ うにするものである。

錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化 剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリン のような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤など が用いられる。 調剤単位形態がカブセルである場合には、 上記タイプの材料にさ らに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は 注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出 植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方すること ができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の 補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナト リウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 ェ 夕ノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ ール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 80^TM、 HCO— 50) な どと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 醴化防止剤などと配 合してもよい。 調整された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラッ卜、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。

該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 分裂病患者 （60kg として） においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 分裂病患者 （6 Okgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0 . 1〜 1 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。 ( 1 2 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体による中和

本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体が、 それらレセプ夕一蛋白質などに対する中和活性とは、 即ち、 該レセプ夕ー 蛋白質の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。 従って、 該 抗体が中和活性を有する場合は、 該レセプ夕ー蛋白質の関与するシグナル伝達、 例えば、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a ^{2 +}遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c G M P 生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を 不活性化することができる。 従って、 該レセプタ一蛋白質の過剰発現などに起因 する疾患の予防および Zまたは治療に用いることができる。

( 1 3 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする D NAを有する 非ヒ卜動物の作製

本発明の D N Aを用いて、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を発現するトランスジ エニック非ヒト動物を作製することができる。非ヒ卜動物としては、哺乳動物（例 えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など （以下、 動物と略記する） が挙げれるが、 特に、 マウス、 ゥサギなどが好適 である。

本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 D N Aを動物細胞で 発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いる のが一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の D N Aを動物細胞で発現させうる各種プ 口モー夕一の下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥサギ受精卵へ マイクロインジェクションすることによって本発明のレセプ夕一蛋白質等を高産 生する D N A転移動物を作出できる。 このプロモーターとしては、 例えば、 ウイ ルス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロモーターも 使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する NGF遺伝子プロモータ一ゃェ ノラ一ゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。

受精卵細胞段階における本発明の DN Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明のレセプ夕一蛋白質等が存在することは、 作出動物の子孫が全て その胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明のレセプ夕一蛋白質等を有することを意 味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の 全てに本発明のレセプター蛋白質等を有する。

本発明の DN A転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認し て、 該 DNA保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さ らに、 目的 DNAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 本発明の DN Aが転移された動物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等が高発現さ せられているので、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するァゴニストまたはアン 夕ゴニス卜のスクリーニング用の動物などとして有用である。

本発明の D N A転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することもで きる。 例えば、 本発明の DNA転移マウスの組織中の DNAもしくは RNAを直 接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプ夕一蛋白質が存 在する組織を分析することにより、 本発明のレセプ夕一蛋白質等について分析す ることができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質等を有する組織の細胞を標準組織培 養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来のような一 般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。 また、 その細胞 を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能 である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明のレセプ夕一蛋白質等 を単離精製することも可能である。

本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC - I UB Commission on Biochemical Nomenclature による ffl各号あるい は当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミ ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものと する。

DNA デォキシリボ核酸

c DNA 相補的デォキシリポ核酸

A /アーノ

T チミン

G グァニン

C

RNA リボ核酸

mRNA メッセンジャーリボ核酸

d ATP デォキシアデノシン三リ 酸

dTTP デォキシチミジン三リン酸

d GTP デォキシグアノシン三リン酸

d CTP デォキシシチジン三リン酸

ATP アデノシン三リン酸

EDTA エチレンジァミン四酢酸

SDS ドデシル硫酸ナトリウム

G 1 y グリシン

A 1 a ァラニン

V a 1 バリン

Leu

I 1 e イソロイシン

S e r セリン

Th r スレオニン

Cy s

Me t メチォニン

G 1 u ダル夕ミン酸

As p

L y s リジン Ar g アルギニン

H i s ヒスチジン

P h e フエ二ルァラニン

Ty r チロシン

T r p トリブトファン

P r o プロリン

A s n

G 1 n グルタミン

p G 1 υ ピログルタミン酸

MMee ：メチル基

E t ェチル基

B u ブチル基

P h フエニル基

TC チアゾリジン一 4 (R) —カルボキサミド基

また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。

To s ： p—トルエンスルフォニル

CHO ：ホルミル

B z 1

Cl₂Bzl 2, 6—ジクロロべンジル

Bom ベンジルォキシメチル

Z ベンジルォキシカルボニル

B o c t—ブ卜キシカルボニル

DNP ジニトロフエノール

T r t hリチル

Bum t—ブトキシメチル

Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル HOB t : 1ーヒドロキシベンズトリアゾ一ル

HOOB t : 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4一ォキソ一

1, 2, 3—ベンゾ卜リアジン

HONB ： 卜ヒドロキシ- 5-ノルボルネン- 2, 3-ジカルボキシイミド 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。

〔配列番号： 1〕

本発明のラット小脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 rCB7T084のアミ ノ酸配列を示す。

〔配列番号： 2〕

配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のラット小脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 rCB7T084をコードする c DN Aの塩基配列を示 す。

〔配列番号： 3〕

本発明のラット小脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 rCB7T084をコー ドする c DN Aをクローニングするために使用したプライマー 1の塩基配列を示 す。

〔配列番号： 4〕

本発明のラッ卜小脳由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 r CB 7T08 4をコードする c DNAをクロ一ニングするために使用したプライマ一 2の塩基 配列を示す。

後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia col 0 DH 1 OB/pAK- r CB 084は、 平成 10年 9月 4日から通商産業省工業 技術院生命工学工業技術研究所（N I BH)に寄託番号 FERM BP— 6485 として、 平成 10年 8月 17日から財団法人 ·発酵研究所 （ I FO) に寄託番号 I FO 16199として寄託されている。

以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキュ ラー .クローニング （_Moi_ecui_ar cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1 ラッ卜小脳由来の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコ一ドする c DNAのクローニングと塩基配列の決定

ラット小脳 c DN Aを铸型とし、 2個のプライマー、プライマー 1 (配列番号： 3) およびプライマ一 2 (配列番号： 4) を用いて PCR反応を行った。 該反応 における反応液の組成は上記 cDNAの 1 0分の 1量を铸型として使用し、 Ad v an t a g e c DNA P o l yme r a s e M i x (CLONTECH社） 1 50量、 プライマ一 1 (配列番号： 3) およびプライマー 2 (配列番号： 4) を 各 0. 2 M、 dNTP s 200 、 および酵素に添付のバッファ一を加 え、 25 1の液量とした。 PCR反応は、 ① 95°C · 30秒の後、 ② 94°C · 5秒、 70°C · 5分のサイクルを 5回、 ③ 94°C · 5秒、 68 °C . 5分のサイク ルを 5回、 ④ 94°C · 5秒、 65°C · 5分のサイクルを 35回繰り返し、 ⑤最 後に 65°C * 5分の伸長反応を行った。 該 PCR反応後の反応産物を TAクロー ニングキット（ I n V i t r 0 g e n社）の処方に従いプラスミドベクター p CR I I ( I n V i t r o g e n社）へ サブクロ一ニングした。これを大腸菌 DH 5 に導入し、 c DNAをもつクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択 した後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役型レセプター 蛋白質をコードする c DNA配列 （配列番号： 2) を得た。 この cDNAより導 き出されるアミノ酸配列 （配列番号： 1) を含有する新規 G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質を rCB7T084と命名した。

本発明のラッ卜小脳由来の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 r CB 7T084 をコードする cDNA (配列番号： 2) がサブクローニングされたプラスミド p AK— r CB 084を、 自体公知の方法に従い大腸菌 （Escherichia col i) DH 1 0Bに導入して、 形質転換体：大腸菌 （Escherichia col i) DH 10 B/p A K- r CB 084を得た。

また、 本発明のラット小脳由来の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 r CB 7T 084をコードする c DNA (配列番号： 2) がサブクロ一ニングされたプラス ミド pCR I I— r CB 7T084を、 自体公知の方法に従い大腸菌

(Escherichia col i)DH 5 αに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia col i) DH5a/p CR I I— r C B 7 T 084を得た。 実施例 2 r CB 7 T 084発現 CH〇細胞の作製

実施例 1で作製した形質転換体 E. coli DH5 α/ρ CR I I - r CB 7T0 84を培養後、 プラスミド · ミドキット （キアゲン社） を用いて pCR I I— r CB 7T084のプラスミド DNAを調製した。 このプラスミドから本発明の G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 r CB 7T 084をコードする cDNA をタンパク 発現用プラスミドベクタ一 PCDNA3.1/V5/His へクローニングしてタンパク発現用 プラスミド PCDNA3. l-rCB084を構築した。 このようにして得たプラスミドは、 プ ラスミド · ミドキット （キアゲン社） を用いて大量にプラスミド DNAを調製し た後、 これをセルフェクト · トランスフエクシヨンキット （アマシャムフアルマ シァバイオテク社） を用い添付のプロトコールに従って CHO dhfr—細胞に導入し た。 すなわち、 10mgの DNAをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、 24時間前 に 5 X 10⁵または 1 X 10⁶個の CHO dhfr—細胞を播種した 10 cmシャーレに 添加した後、 10 %ゥシ胎児血清を含む M E Mひ培地で 1日間培養し、 継代した 後、 選択培地である 0.4mg/ml の G418 (ギブコ BRL社） および 1 0%透析ゥシ胎 児血清を含む MEMひ培地で培養した。 選択培地中で増殖してくる形質転換細胞 (CHO/rCB084) のコロニーを選択することにより、 r C B 7 T 084発現 C H〇 細胞とした。

選択した r CB 7T 084発現 CHO細胞から常法に従い全 RNAを抽出した後、 TaqMan法により r C B 7 T 084の mRNA量を測定 · コピー数を算出した。 結果 を下表に示す。 クローン N o. 発現量 （コピー Zng 全 RNA)

1回目測定 2回目測定

3 18666 17486

18278 24369

4 181736 190185

159347 175345

17 50429 34503

44990 41239 産業上の利用可能性

本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩、 およびそれらをコードするポリヌクレオチド （例えば、 D N A、 R NAお よびそれらの誘導体） は、 ①リガンド （ァゴ二スト） の決定、 ②抗体および抗血 清の入手、 ③組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレ セプタ一結合アツセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的 に類似したリガンド · レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザインの実施、 ⑥遺伝子診断におけるプローブや P C Rプライマ一の作成のための試薬、 ⑦トラ ンスジエニック動物の作製または⑧遺伝子予防 ·治療剤等の医薬等として用いる ことができる。

Claims

ol 請求の範囲

1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはそ の塩。

2 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の部分ペプチドまたはその

3 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする塩基配列を有 するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。

4 . D N Aである請求項 3記載のポリヌクレオチド。

5 . 配列番号： 2で表される塩基配列を有する請求項 3記載のポリヌクレオチド。

6 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。

7 . 請求項 6記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。

8 . 請求項 7記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質を生成せしめることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共役型レセ プター蛋白質またはその塩の製造法。

9 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項 2記載の部 分べプチドまたはその塩に対する抗体。

1 0 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質のシグナル伝達を不活性 化する中和抗体である請求項 9記載の抗体。

1 1 . 請求項 9記載の抗体を含有してなる診断薬。

1 2 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 2記載の 部分ペプチドまたはその塩を用いることにより得られうる請求項 1記載の G蛋白 質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド。

1 3 . 請求項 1 2記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質のリガンドを含有して なる医薬。

1 4 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 2記載の 部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法。

1 5 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 2記載の 部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング方法。

1 6 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 2記載の 部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと請求項 1記載 の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング用キット。

1 7 . 請求項 1 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レ セプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。

1 8 . 請求項 1 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記載のスクリ一二 ング用キットを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有 してなる医薬。

1 9 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェン卜な条件下でハイ ブリダイズするポリヌクレオチド。

2 0 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列およびその一部を含 有してなるポリヌクレオチド。

2 1 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴とす る請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の m R N Aの定量方法。

2 2 . 請求項 9記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質の定量方法。

2 3 . 請求項 2 1または請求項 2 2記載の定量方法を用いることを特徴とする請 求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能が関連する疾患の診断方法。

2 4 . 請求項 2 1記載の定量方法を用いることを特徴とする、 請求項 1記載の G 蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスク リーニング方法。

2 5 . 請求項 2 2記載の定量方法を用いることを特徴とする、 細胞膜における請 求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質量を変化させる化合物またはその 塩のスクリーニング方法。

2 6 . 請求項 2 4記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 請求項 1記載 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩。

2 7 . 請求項 2 5記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、 細胞膜におけ る請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質量を変化させる化合物または その塩。