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WO2000016795A1 - Preventives and/or remedies for obesity - Google Patents

Preventives and/or remedies for obesity Download PDF

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WO2000016795A1
WO2000016795A1 PCT/JP1999/005080 JP9905080W WO0016795A1 WO 2000016795 A1 WO2000016795 A1 WO 2000016795A1 JP 9905080 W JP9905080 W JP 9905080W WO 0016795 A1 WO0016795 A1 WO 0016795A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
obesity
stanniocalcin
adipocytes
preventives
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1999/005080
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masaaki Goto
Akihiro Tomoyasu
Kyoji Yamaguchi
Masahiko Kinosaki
Nobuaki Nakagawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Snow Brand Milk Products Co Ltd
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Snow Brand Milk Products Co Ltd filed Critical Snow Brand Milk Products Co Ltd
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Priority to CA002342834A priority patent/CA2342834A1/en
Priority to DE69928685T priority patent/DE69928685T2/de
Priority to EP99943391A priority patent/EP1121936B1/en
Priority to AT99943391T priority patent/ATE311197T1/de
Priority to US09/787,397 priority patent/US6815417B1/en
Publication of WO2000016795A1 publication Critical patent/WO2000016795A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents

Definitions

  • the present invention relates to a novel agent for preventing and / or treating obesity.
  • the preparation of the present invention has an excellent preventive and / or therapeutic effect on obesity and is useful as a medicament.
  • Obesity is one of the risk factors, such as diabetes, hypertension and heart disease, and threatens the health of people in developed countries.
  • Obesity is a physical condition in which adipose tissue accumulates more than normal.
  • Adipose tissue is a special organ that stores excess energy in the body as fat, i.e., triglycerides, and is derived from fat cells, fibroblasts including their precursor cells, macrophages, perivascular cells, blood cells, etc. It is configured.
  • Adipocytes are said to occupy 1Z3 to 2Z3 of the cells present in adipose tissue, and accumulate fat, that is, triglyceride, in the cells.
  • Adipocytes include mesenchymal pluripotent stem cells, lipoblasts that have acquired the base of adipocytes, preadipocytes that have no adipocytes but have adipocyte early markers, and adipocytes It is said that immature adipocytes and mature adipocytes with a large amount of accumulated fat differentiate and mature. In a living body of a mildly obese adult, the amount of fat accumulated in individual fat cells, that is, triglyceride, is increased and the cells are enlarged. As the degree of obesity increases, so does the number of fat cells.
  • adipocyte differentiation in vivo is positively or negatively controlled by many factors derived from environmental factors such as food intake and exercise.
  • Tumor necrosis factor-1 As a cytokine that suppresses the differentiation of preadipocytes into adipocytes, Tumor necrosis factor-1; (TNF-: Torti FM et al., Science, Vol.
  • Cytokines such as C. M. et al., Cell, Vol. 73, p725 (1993) have been reported.
  • a recently cloned 0b gene translation protein, lebutin reduces food intake and adipose tissue weight, possibly via the central nervous system.
  • Redox American Home Products
  • Meridia Korean Home Products
  • Xenical Xenical
  • the therapeutic methods using these drugs are not always satisfactory in their effects and therapeutic results, and there has been a demand for the development of new therapeutic agents that are more effective and have fewer side effects.
  • an object of the present invention is to provide a prophylactic and / or therapeutic agent for obesity comprising a novel substance as an active ingredient.
  • the present invention relates to an agent for preventing and / or treating obesity, comprising stanniocalcin as an active ingredient.
  • the formulation of the present invention has excellent preventive and Z or therapeutic effects on obesity and is useful as a medicine.
  • Stanniocalcin was first discovered in fish and later found to be present in mammals, including humans. Then, cDNA of human fetal embryo was isolated by genetic engineering based on the structural similarity. Humanstanniocalcin can be obtained by expressing the obtained cDNA in various cells using genetic engineering techniques. It is known that administration of suunniocalcin to fish reduces the amount of calcium in the body, and that administration to rats decreases the excretion of phosphate into urine (Pro Natl. Aca. Sci. USA., 93, 1792 (1996)). It is not known that stanniocalcin has an excellent preventive and therapeutic effect on obesity.
  • Stanniocalcin an active ingredient of the present invention, can be obtained by the method of 01sen HS et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, pl792 (1996)).
  • the cDNA sequence of stanniocalcin can be known by searching the above-mentioned literature or gene bank, etc., and based on the sequence information, the cDNA of stanniocalcin can be obtained by PCR or the like. be able to.
  • the expression vector containing the obtained cDNA is transfected into animal cells or the like to obtain stanniocalcin-expressing cells.
  • Stanniocalcin can be obtained by purifying from a culture solution obtained by culturing the obtained stanniocalcin-expressing cells by a conventional method. Adipocyte formation inhibitory activity was determined by the method of Kodama H. et al. (Journal of Cellular Physiology, Vol. 112, p83 (1982)), ie, using dexamethasone as a mouse preadipocyte cell line as a target cell. The suppression of adipocyte formation in the presence can be confirmed by evaluating the suppression of triglyceride accumulation. Stanniocalcin, an active ingredient of the present invention, is safely administered to humans and animals as a pharmaceutical composition for the purpose of preventing and / or treating obesity.
  • Stanniocalcin can be formulated and administered orally or parenterally.
  • examples of the form of the pharmaceutical composition include an injection composition, an infusion composition, a suppository, a nasal preparation, a sublingual preparation, a transdermal absorption agent and the like.
  • These preparations can be prepared according to known pharmaceutical manufacturing methods by using pharmacologically acceptable carriers, excipients, stabilizers, coloring agents, surfactants, and other additives. It can be used as a preparation.
  • an injectable composition a mixture with a pharmacologically effective amount of stanniocalcin, which is an active ingredient of the present invention, and a pharmaceutically acceptable excipient Z activator is used.
  • Excipients generally added to injectable compositions such as sugars, cellulose derivatives, and other organic / "inorganic compounds" may be used. If necessary, PH adjusters, buffers, Various injections can be prepared by a conventional method by adding a stabilizer, a solubilizing agent, and the like.
  • the dose is usually 10 g to 10 mg per kg of adult body weight divided orally or parenterally several times a day.
  • a particularly preferred mode of administration is intravenous.
  • PCR was performed under the following conditions. After pretreatment at 95 ° C for 3 minutes, a three-step reaction consisting of 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes was repeated 30 times, followed by incubation at 70 ° C for 5 minutes . A part of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, and it was confirmed that a uniform DNA fragment of about 900 bp was obtained. This fragment was sequenced by a conventional method, and it was confirmed that cDNA encoding stanniocalcin was obtained. The cDNA sequence is shown in SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the obtained DNA fragment of about 900 bp was purified using QIAEXII DNA extraction kit (QIAGEN). This DNA fragment was digested with restriction enzymes Xhol and Nhel (Takara Shuzo) and purified with QIAEXII DNA extraction kit (STC Xhol-Nhel fragment). The STC Xhol-Nhel fragment was ligated to pCEP4 (Invitrogen) cut with restriction enzymes Xhol and Nhel using ligation kit ver.2 (Takara Shuzo) to obtain plasmid pCEPSTC. This plasmid contains DNA encoding stanniocalcin.
  • Escherichia coli (DH5a; Gibco BRL) containing this plasmid was designated as DH5a / pCEP-STC. 1999 11 May 1-3 Tsukuba Higashi, Ibaraki Pref. Japan (Postal code 305-8566) Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Accession No. FERM BP-6736 Has been deposited. In addition, it was confirmed by DNA sequencing that there was no erroneous incorporation of bases during DNA synthesis into the PCR-derived DNA portion.
  • Example 11 Escherichia coli DH5 harboring pCEPSTC obtained in 1ii) was mixed with 2 ml of Teriffic Broth (Life Technologies) containing 50 g / ml ampicillin (Sigma) and 4.7% glycerol. The cells were cultured at 37 ° C with shaking, and the plasmid DNA was purified from the cells using a QIAWELL kit (QIAGEN). 293-EBNA cells (Invitrogen) were seeded on each well of a 24-well plate in IMDM (Life Technologies, Inc.) containing 10% fetal calf serum at a concentration of 2 ⁇ 10 5 / ⁇ ⁇ / ml, and incubated at 37 ° C.
  • IMDM Life Technologies, Inc.
  • pCEPSTC or pCEP4 was transfected into 293-EBNA cells using Fugene6 (Behringer-Mannheim). DNA was used in an amount of 0.5 ⁇ g each, and Fugene 6 was used in an amount of 1 ⁇ l. After transflector We transfection, 3 days at 37 ° C (0 2 Inkyu base Isseki one (5% CO,) were cultured in. The obtained culture adipogenesis inhibitory activity was measured by the following method.
  • Adipocyte formation inhibitory activity was measured by the following method according to the method of odama H. et al. (Journal of Cellular Physiology, Vol. 112, p83 (1982)). That is, the mouse preadipocyte cell line MC3T3-G2 / PA6 cells (RIKEN GENE BANK, RCB1127) were used as target cells, and the formation of adipocytes in the presence of dexamethasone was tested using triglyceride accumulation as an index. The inhibitory activity was measured.
  • microplate containing 10% fetal bovine serum-culture solution obtained from a sample diluted with MEM (Gibco BRL) (Example 1-iii), culture solution of cells into which only vector was introduced, and 293- EBNA cell only culture medium) Add 50/1, and add 3 x 10 3 mouse preadipocyte cell lines MC3T3-G2 / PA6 cells containing 50 1 2 x 10 7 M dexamethasone and 10% fetal bovine serum -Suspended in MEM It was seeded with, and cultured for one week at 5% C0 2, 37 ° C , 100% humidity.
  • the culture medium After 7 days of culture, the culture medium is removed by suction, diluted with air, air-dried, and the triglyceride accumulated in fat cells is measured using a triglyceride measurement kit (Triglyceride G—Test Co., Code No. 274-69802, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Was used for the measurement.
  • a triglyceride measurement kit Teriglyceride G—Test Co., Code No. 274-69802, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Table 1 As a result, it was confirmed that stanniocalcin in the obtained culture solution had an adipocyte formation inhibitory activity.
  • mice preadipocyte cell line 3T3-L1 cells (ATCC Depositary Accession No.CL173) as target cells, the formation of adipocytes in the presence of dexamethasone and 1-methyl-3-isobutylxanthine is indicated by triglyceride accumulation
  • the adipocyte formation inhibitory activity was evaluated by measuring the inhibitory activity.
  • Example 2 diluted with ⁇ - ⁇ (Gibco BRL) containing 10% fetal bovine serum was placed in a 96-well microphone plate, and mouse preadipocyte cell line 3 ⁇ 3-LI cells 5 ⁇ 10 4 three of 50 ⁇ 1 X 10- 7 ⁇ dexamethasone, 2 X 10- 5 Micromax 1-methyl - seeded suspended in 3 Isobuchirukisan Chin and carry one MEM containing 1 0% fetal calf serum, 5 % C0 2, 37 ° C, and one week cultured in 100% humidity.
  • ⁇ - ⁇ Gibco BRL
  • Example 1 1 mg of stanniocalcin obtained in Example 1 and 50 mg of human serum albumin were dissolved in 100 ml of 0.01 M phosphate buffer (PBS, pH 7.0), and after sterilization, dispensed 2 ml into vials. The lyophilized product was lyophilized and sealed.
  • PBS phosphate buffer
  • Example 1 50 mg of stanniocalcin, 80 lmg of Tween, and 50 mg of human serum albumin obtained in Example 1 were dissolved in 100 ml of 0.01M phosphate buffer (PBS, pH 7.0), and sterilized vials. The 5 ml aliquots were lyophilized and sealed afterwards.
  • PBS phosphate buffer
  • Example 1 100 mg of stanniocalcin obtained in Example 1, 50 mg of human serum albumin, and 4 g of sorbitol were dissolved in 20 ml of 0.01 M phosphate buffer (PBS, pH 7.0), sterilized, and then 2 ml in a vial bottle. Each one was freeze-dried and sealed.
  • PBS phosphate buffer
  • a novel agent for preventing and / or treating obesity containing stanniocalcin as an active ingredient is provided.
  • the preparation of the present invention has excellent preventive and Z or therapeutic effects on obesity and is useful as a medicament.

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Description

明 細 書
肥満予防及び Z又は治療剤 技術分野
本発明は、 新規な肥満予防及び/又は治療剤に関する。
本発明製剤は、 肥満に対する優れた予防及び/又は治療効果を有し、 医薬とし て有用である。
背景技術
肥満は、 糖尿病、 高血圧症、 心臓病などのリスクファクタ一であり、 先進国の 国民の健康を脅かす存在である。 肥満とは、 脂肪組織が普通以上に蓄積した身体 状況のことを言う。 脂肪組織は、 生体内の余剰エネルギーを脂肪、 即ち卜リグリ セライ ドとして備蓄している特殊な器官であり、 脂肪細胞、 その前駆細胞を含む 線維芽細胞、 マクロファージ、 血管周囲細胞、 血液細胞などから構成されている。 脂肪細胞は、 脂肪組織に存在する細胞の 1 Z 3から 2 Z 3を占めると言われてお り、 その細胞内に脂肪、 即ちトリグリセライ ドを蓄積している。 脂肪細胞は、 間 葉系の多能性幹細胞から、 脂肪細胞としての素地を獲得した脂肪芽細胞、 脂肪滴 は出現していないが脂肪細胞の初期マーカーを有する前駆脂肪細胞、 脂肪滴を有 する未成熟脂肪細胞、 脂肪が多量に蓄積した成熟脂肪細胞へと分化 ·成熟してい くとされている。 軽度の肥満成人の生体内では、 個々の脂肪細胞が蓄積している 脂肪、 即ちトリグリセライ ド量が増加し細胞が肥大化している。 肥満の程度が大 きくなると脂肪細胞の数も増加する。 従って、 脂肪細胞への分化，成熟を抑制し 脂肪細胞の数を減少させることや、 成熟脂肪細胞の肥大化を抑制することにより、 蓄積脂肪量の増加を抑制し肥満の進行を止め、 肥満を治療することが期待される。 生体内における脂肪細胞の分化制御は、 食物摂取や運動などの環境因子などから 派生する数多くの因子によって、 正あるいは負に行われていることが明らかにさ れてきた。 前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制するサイ トカインとして、 腫瘍壊死因子一 ； (TNF- ： Torti F. M. et al.， Science, Vol.229， p867 (1985)) 、 トランスフォーミ ング増殖因子一 3 (transforming growth factor - β ； I notz R. A. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p8530 (1985)) 、 プレアディボサイ トファクタ—— 1 (Pref 1， Preadipocyte factor-1 ： Smas
C. M. et al., Cell, Vol.73, p725 (1993) ) などのサイ トカインが報告されて いる。 又、 近年クローニングされた 0 b遺伝子の翻訳蛋白質レブチンは、 おそら くは中枢神経を介して摂食量や脂肪組織重量を減少させることが報告されている
(Levin N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93. pl726, 1996) 。 さ らには、 強力な摂食促進作用を有する脳内べプチド ·ニューロべプチド Yとその レセプターも肥満を抑制する医薬品開発の強力なツールとして注目されている （ Sainsburg A. et al. Diabetologia, Vol. 39， p353, 1996)。 これらのサイ トカ ィンは、 脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用による肥満の治療剤となることが期 待され、 レブチンなど上記のサイ ト力インの一部については、 肥満の治療剤又は 予防薬として臨床試験が進められている。
また現在、 肥満の治療薬又は予防薬として、 米国では既にレダックス （ァメ リ カンホームプロダクツ社） が上市されている。 又、 メ リディア （クノール社） や キセニカル （ロッシュ社） なども、 米国において肥満の治療薬又は脂肪の吸収抑 制薬として認可される見通しである。 しかし、 これらの薬剤を用いた治療法はそ の効果並びに治療結果において必ずしも満足できるものではなく、 これらに代わ るより有効性が高く副作用の少ない新しい治療薬の開発が望まれていた。
発明の開示
本発明者らは、 上述の状況に鑑み抗肥満作用あるいは肥満の改善作用を有する 物質を求め鋭意探索の結果、 従来ミネラル代謝を調節する蛋白質として知られて いるスタンニォカルシン （Stanniocalcin ； S T C ： Olsen H. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.93, pl792 (1996))が、 脂肪細胞形成抑制活性、 即 ち脂肪細胞の分化及び又は成熟を抑制する活性を有するというスタンニォカルシ ンの全く予想しなかった生理活性を見い出すに至った。 従って本発明は、 新規な 物質を有効成分とする肥満予防及び Z又は治療剤を提供することを課題とする。 本発明は、 スタンニォカルシンを有効成分とする、 肥満予防及び Z又は治療剤に 関する。 本発明製剤は、 肥満に対する優れた予防及び Z又は治療効果を有し、 医 薬として有用である。
スタンニォカルシンは最初魚類で発見され、 その後ヒ トを含む哺乳類にも存在 することが明らかとなった。 そして、 構造の類似性を基に遺伝子工学的にヒ ト胎 児胚の c D N Aが単離された。 ヒ トスタンニォカルシンは、 得られた c D N Aを 遺伝子工学的手法を用いて各種細胞に発現させることにより得ることができる。 ス夕ンニォカルシンを魚に投与すると生体内のカルシウム量が低下すること、 及びラッ 卜に投与するとリン酸の尿への排泄量が低下することが知られている (Pro Nat l. Aca. Sci. USA. , 93， 1792 (1996)) 。 し力、し、 スタンニォカルシ ンが肥満に対して優れた予防及び治療効果を有することは知られていない。
発明を実施するための最良の形態
本発明の有効成分であるスタンニォカルシンは、 01 sen H. S.らの方法 （Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, vol. 93， pl792 (1996)) により得ることができる。 具体 的には、 上述の文献あるいはジーンバンク等を検索することにより、 スタンニォ カルシンの cDNA配列を知ることができ、 その配列情報に基づいて、 PCR 法等を用 いてスタンニォカルシンの cDNAを得ることができる。 得られた cDNAを揷入した発 現べクタ一を動物細胞等にトランスフヱク 卜して、 スタンニォカルシン発現細胞 を得ることができる。 得られたスタンニォカルシン発現細胞を培養した培養液か ら常法により精製することにより、 スタンニォカルシンを得ることができる。 脂肪細胞形成抑制活性は、 Kodama H. らの方法 (Journal of Cel l u lar Phys i ol o gy, Vo l. 112， p83 (1982))、 即ち、 マウス前駆脂肪細胞株を標的細胞として用い、 デキサメタゾン存在下での脂肪細胞形成の抑制を、 トリグリセライ ドの蓄積抑制 で評価することにより確認できる。 本発明の有効成分であるスタンニォカルシンは、 肥満の予防及び Z又は治療を 目的とした医薬組成物として、 ヒ 卜及び動物に対して安全に投与されるものであ る。 スタンニォカルシンは、 製剤化して経口的あるいは非経口的に投与すること ができる。 医薬組成物の形態としては、 注射用組成物、 点滴用組成物、 坐剤、 経 鼻剤、 舌下剤、 経皮吸収剤などが挙げられる。 これらの製剤は、 公知の製剤学的 製法に準じ、 製剤として薬理学的に許容され得る担体、 賦形剤、 安定剤、 着色剤、 界面活性剤、 その他添加剤などを用いることにより、 目的とする製剤とすること ができる。 注射用組成物の場合は、 本発明の有効成分であるスタンニォカルシン の薬理学的有効量及び製剤学的に許容し得る賦形剤 Z賦活剤との混合物とし、 そ の中にアミノ酸、 糖類、 セルロース誘導体、 及びその他の有機 /"無機化合物など の一般的に注射用組成物に添加される賦形剤ノ賦活剤を用いても良い。 必要に応 じて P H調整剤、 緩衝剤、 安定化剤、 可溶化剤などを添加し、 常法によって各種 注射剤とすることができる。
投与は、 通常成人体重 kg当たり 10 g 〜10mgを一日数回に分けて経口的あるい は非経口的に投与する。 特に好ましい投与形態は静脈内に投与することである。
実施例
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、 これらは単に例示する のみであり、 これらによって本発明はなんら限定されるものではない。
実施例 1
スタンニォカルシンの製造
0 IMR- 90細胞 （ヒ ト胎児肺繊維芽細胞 ATCC CCL-186 ) からのポリ（A) + RN A の単離
ファスト トラック mRNAアイソレーションキッ ト （I nv i t rogen社） を用い、 その マニュアルに従って 1 x io8 個の IMR- 90細胞より約 10〃g のポリ（A) + RNA を単 離した。
i i ) ヒ トスタンニォカルシン発現ベクターの構築 単離したポリ（A) + RNA 、 1 〃g を铸型としてスーパースクリプト IlcDNA合成 キッ ト （ギブコ BRL社） を用いて、 同社のプロ トコールに従って一本鎖 cDNAを合 成し、 この cDNAと、 ヒ トスタンニォカルシンの塩基配列よりデザインしたプライ マー STCF1N (配列表配列番号 1 ) 及びプライマ一 STCRlXh (配列表配列番号 2 ) を 用いて、 PCR を行い、 スタンニォカルシン（STC)cDNA 断片を取得した。 以下に PC R の条件を示す。
10X Ex Taqバッファ一 （宝酒造社） 10
2.5 mM dNTP 8 \
cDNA溶液 1 il l
Ex Taq (宝酒造社） 0.5
蒸留水 74.5
プライマー STCF1N 5
lOO M プライマ一 STCRlXh 1
上記の溶液を微量遠心チューブ中で混合後、 以下の条件で PCR を行った。 95°C で 3分前処理後、 95°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 2分間の 3段階の反応を 30回繰り返した後、 70°Cで 5分間保温した。 反応液の一部をァガロース電気泳動 し約 900bp の均一な DNA断片が得られたことを確認した。 この断片を常法により シークェンスし、 スタンニォカルシンをコードする cDNAが得られたことを確認し た。 cDNA配列を配列表配列番号 3に、 アミノ酸配列を配列番号 4にそれぞれ示す。 得られた約 900bp の DNA断片を、 QIAEXII DNA extraction kit (QIAGEN社） に よって精製した。 この DNA断片を制限酵素 Xholおよび Nhel (宝酒造社） で切断し、 QIAEXII DNA extraction kitにより精製した （STC Xhol- Nhel 断片） 。 この STC Xhol -Nhel 断片を制限酵素 Xholおよび Nhelで切断した pCEP4 (Invi trogen社） に、 ligation kit ver.2 (宝酒造社） により結合させてプラスミ ド pCEPSTC を得た。 このプラスミ ドは、 スタンニォカルシンをコードする DNAを含んでいる。 このプ ラスミ ドを含む大腸菌 （DH5 a ； ギブコ BRL社） は、 DH5 a /pCEP- STC として平 成 11年 （1999年） 5月 31日に日本国茨城県つくば東 1丁目 1 一 3 (郵便番号 305 -8566) 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP- 6736 として寄託されている。 尚、 PCR 由来の DNA部分に、 DNA合成時における塩基の 誤った取り込みがないことを、 DNAシークェンシングにより確認した。
iii) ヒ トスタンニォカルシンの発現
実施例 1 一 ii) で得られた pCEPSTC を持つ大腸菌 DH5ひを、 50 g/mlのアンピ シリ ン （シグマ社） および 4.7%のグリセロールを含む Teriffic Broth (ライフテ クノロジ一ズ社） 2 ml中で 37°C—晚振盪培養し、 菌体からプラスミ ド DNAを QIAW ELL kit (QIAGEN社） により精製した。 293-EBNA細胞 （ Invi trogen社） を 10%牛 胎児血清を含む IMDM (ライフテクノロジ一ズ社） 中 2 X 105/ゥヱル /ml となるよ うに 24ゥヱルプレートの各ゥヱルに播種し、 37°C—晚、 C02 インキュベーター （ 5% C02) 中で培養した。 pCEPSTC あるいは pCEP4 を Fugene6 (ベ一リンガ一マン ハイム社） を用いて、 293-EBNA細胞にトランスフヱク 卜した。 DNAは各 0.5〃g 、 Fugene6 は 1 〃 1 用いた。 トランスフヱクション後、 37°Cで 3 日間 （02ィンキュ ベ一夕一 （5% CO,) 中で培養した。 得られた培養液の脂肪細胞形成抑制活性を、 以下の方法により測定した。
iv) 脂肪細胞形成抑制活性の測定
脂肪細胞形成抑制活性測定は、 odama H. らの方法 (Journal of Cellular Ph ysiology, Vol.112, p83 (1982))に従い、 以下の方法により行った。 即ち、 マウ ス前駆脂肪細胞株 MC3T3-G2/PA6細胞 (RIKEN GENE BANK, RCB1127) を標的細胞と して用い、 デキサメタゾン存在下での脂肪細胞の形成を卜リグリセライ ドの蓄積 を指標として試験し、 その抑制活性を測定した。 96ゥヱルマイクロプレートに 10 %牛胎児血清を含む - MEM (ギブコ BRL社） で希釈したサンプル （実施例 1- iii) で得られた培養液、 ベクタ一のみを導入した細胞の培養液、 及び 293- EBNA細胞の みの培養液） 50 / 1を入れ、 マウス前駆脂肪細胞株 MC3T3- G2/PA6細胞 3 X 103 個 を 50 1の 2 X 10 7Mデキサメタゾン及び 10%牛胎児血清を含む - MEMに懸濁さ せて播種し、 5 %C02 、 37°C、 湿度 100%にて一週間培養した。 培養 7日後に培 地を吸引除去希し、 風乾後、 脂肪細胞中に蓄積したトリグリセライ ドをトリグリセ ラィ ド測定キッ ト （トリグリセライ ド G—テストヮコ一、 コ一ド番号 274-69802 、 和光純薬工業社） を率用いて測定した。 この時、 0D510nm の減少を脂肪細胞形成 抑制活性として評価した。 結果を第 1表に示す。 この結果、 得られた培養液中の スタンニォカルシンが、 脂肪細胞形成抑制活性を有することが確認された。
第 1表
1/4 1/8 1/16 1/32
STC 遺伝子導入細胞培養液 0.061 0.060 0.057 0.054
ベクター導入細胞培養液 0.036 0.021 0.009 0.007
293- EBNA細胞培養液 0.032 0.017 0.014 0.011 実施例 2
マウス前駆脂肪細胞株 3T3/LI細胞を用いた脂肪細胞形成抑制活性の測定
マウス前駆脂肪細胞株 3T3-L1細胞 （ATCC寄託一受託番号 CL173)を標的細胞とし て用い、 デキサメタゾンと 1ーメチルー 3—イソプチルキサンチン存在下での脂 肪細胞の形成を卜リグリセライ ドの蓄積を指標として試験し、 その抑制活性を測 定することによって、 脂肪細胞形成抑制活性を評価した。 即ち、 96ウェルマイク 口プレー卜に 10%牛胎児血清を含む α-ΜΕΜ (ギブコ BRL社） で希釈した実施例 1 と同様のサンプル 1を入れ、 マウス前駆脂肪細胞株 3Τ3- LI細胞 5 X 103 個を 50 ζ 1の 4 X 10— 7Μデキサメタゾン、 2 X 10— 5Μ 1-メチル- 3- ィソブチルキサン チン及び 1 0 %牛胎児血清を含むひ一 MEMに懸濁させて播種し、 5 %C02 、 37 °C、 湿度 100%にて一週間培養した。 培養 7日後に培地を吸引除去し、 風乾後、 脂肪細胞中に蓄積したトリグリセライ ドをトリグリセライ ド測定キッ ト （トリグ リセライ ド G—テストヮコ一、 コード番号 274- 69802 、 和光純薬工業社） を用い て測定した。 この時、 0D510nm の減少を脂肪細胞形成抑制活性として評価した。 結果を第 2表に示す。 この結果、 3T3-L 1細胞を標的細胞として用いた場合にも、 実施例 1 と同様希に、 培養液中のスタンニォカルシンが、 脂肪細胞形成抑制活性を 有することが確認された。 率 第 2表
1/4 1/8 1/16 1/32
STC 遺伝子導入細胞培養液 0. 081 0. 083 0. 082 0. 083 ベクター導入細胞培養液 0. 026 0. 017 0. 012 0. 011
293- EBNA細胞培養液 0. 021 0. 004 0. 006 0. 016 実施例 3
製剤例
製剤例 1 ：注射剤の製造
実施例 1で得られたスタンニォカルシン lmg とヒ ト血清アルブミ ン 50mgを 0. 01 Mリン酸緩衝液 （PBS 、 pH7. 0 ) 100ml に溶解し、 滅菌後バイアル瓶に 2ml ず つ分注したものを凍結乾燥後密封した。
製剤例 2 ：注射剤の製造
実施例 1で得られたスタンニォカルシン 50mg、 ツイーン 8 0 lmg, 及びヒ ト血 清アルブミ ン 50mgを 0. 01M リン酸緩衝液 （PBS 、 pH7. 0 ) 100ml に溶解し、 滅 菌後バイアル瓶に 5ml ずつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
製剤例 3 ：注射剤の製造
実施例 1で得られたスタンニォカルシン 100mg、 ヒ ト血清アルブミ ン 50mg、 及 びソルビトール 4gを 0. 01M リン酸緩衝液 （PBS 、 pH7. 0 ) 20mlに溶解し、 滅菌 後バイアル瓶に 2mlずつ分注したものを凍結乾燥後密封した。 産業上の利用可能性
本発明により、 スタンニォカルシンを有効成分とする新規な肥満予防及び/又 は治療剤が提供される。 本発明製剤は、 肥満に対する優れた予防及び Z又は治療 効果を有し、 医薬として有用である。 寄託された微生物への言及
ィ. 当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名
名 称： 日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名： 日本国茨城県つくば東 1丁目 1 -3 (郵便番号 305-8566)
口. ィの機関に寄託した日付
平成 11年 5月 31日 （平成 10年 8月 11日に寄託された微ェ研菌寄第 P-16933 号より移管）
ハ. ィの機関の寄託について付した寄託番号
FERM BP - 6736

Claims

請 求 の 範 囲
1. スタンニォカルシン （Stanniocalcin)を有効成分とする、 肥満予防及び Z又 は治療剤。
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