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WO2000011161A1 - Novel collectin - Google Patents

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Publication number
WO2000011161A1
WO2000011161A1 PCT/JP1999/004552 JP9904552W WO0011161A1 WO 2000011161 A1 WO2000011161 A1 WO 2000011161A1 JP 9904552 W JP9904552 W JP 9904552W WO 0011161 A1 WO0011161 A1 WO 0011161A1
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WO
WIPO (PCT)
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asn
gly
pro
thr
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1999/004552
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nobutaka Wakamiya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Original Assignee
Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CA002340934A priority Critical patent/CA2340934C/en
Priority to AU53056/99A priority patent/AU751173B2/en
Priority to DK99938607T priority patent/DK1108786T3/da
Priority to DE69934415T priority patent/DE69934415T2/de
Priority to EP99938607A priority patent/EP1108786B1/en
Priority to JP2000566415A priority patent/JP4441118B2/ja
Application filed by Fuso Pharmaceutical Industries Ltd filed Critical Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Publication of WO2000011161A1 publication Critical patent/WO2000011161A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US11/526,445 priority patent/US20070020729A1/en
Priority to CY20071100234T priority patent/CY1106041T1/el
Priority to US12/730,647 priority patent/US20110065177A1/en
Priority to US13/370,575 priority patent/US20130230918A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4726—Lectins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel collectin which is useful for elucidation of a biological defense mechanism, is expected to have a physiological activity including an antiviral activity, and is considered to be applicable to pharmaceutical use.
  • Collectin is a collective term for proteins that have a sugar-recognizing structure-like region (CRD) and a collagen-like region that require Ca2 + , and is thought to be involved in basic immunity to various microorganisms, including bacteria and viruses. Have been.
  • Collectins that have been found to date include mannan binding protein (MBP), surfactant protein A (SP-A) and safifantant protein D (SP-D), conglutinin and the like. These collectins, as shown in Fig. 1 (a), contain the characteristic regions of (1) a sugar-recognizing structure-like region (CRD) that requires Ca2 + and (2) a collagen-like region. It is known that it is composed of a basic structure [Malhortra et al., European 'journal' ob '
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and has as its object to obtain a novel collectin that is expected to exhibit physiological activities such as antibacterial and antiviral activities in a human body.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown at positions 206 to 547 of SEQ ID NO: 2,
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown at positions 229 to 547 of SEQ ID NO: 2,
  • [5] can be hybridized with a probe which is an amplification product of a PCR reaction performed using a primer having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 under stringent conditions, And a polynucleotide encoding collectin,
  • the polynucleotide of [1] to [5] can be hybridized with the polynucleotide under stringent conditions, and the protein encoded by the polynucleotide is (1) a sugar requiring C a.
  • novel plasmid comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at positions 229 to 547 [10]
  • the amino acid sequence of the novel collectin according to any one of [7] to [9], which comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added, and
  • a novel collectin containing 1) a C-required sugar-recognizing structure-like region (CRD) and (2) a collagen-like region
  • the present invention provides a novel collectin gene and protein having a structure characteristic of collectin and different from those previously reported.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overview of the basic structures and proteins of major collectins that have been reported in the past.
  • FIG. 2 is a diagram showing the first half of an alignment of amino acid sequences of three types of collectins that have been reported conventionally.
  • FIG. 3 is a diagram showing the latter half of the alignment similar to FIG. 2.
  • FIG. 4 (b) shows the names and the names of the respective primers used for determining the nucleotide sequence of the novel collectin of the present invention.
  • FIG. 4 (a) is a diagram showing a base sequence read by a sequencer, and
  • FIG. 4 (a) is a diagram showing 0RF of the obtained novel collectin.
  • FIG. 5 is a diagram showing the first half of an alignment of the amino acid sequences of the three collectins reported hitherto and the novel collectin of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the second half of the same alignment as FIG. 5.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of genomic Southern analysis of the novel collectin of the present invention.
  • the restriction enzymes used in each lane were (1) EcoR I, JP99 / 04552
  • FIG. 8 shows the various tissues of humans showing the organ distribution of the novel collectin of the present invention, that is, 1) brain, (2) heart, (3) kidney, (4) spleen,
  • FIG. 9 is a view showing an analysis result of mRNA expression distribution in (5) liver, (6) small intestine, (7) muscle tissue, (8) testis, (9) placenta, or (10) large intestine.
  • FIG. 9 shows various vertebrates showing the conservation of the novel collectin of the present invention between species, namely, (1) human, (2) monkey, (3) rat, (4) mouse, ( FIG. 7 shows the results of genomic Southern analysis on 5) dogs, (6) puppies, (7) puppies, and (8) chicks.
  • FIG. 10 is a diagram showing a genetic phylogenetic tree of various collectins.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the structure of a vector expressing the novel collectin of the present invention.
  • the polynucleotides [1] to (: 6) are preferably cDNA.
  • the polynucleotide shown in the above [2] includes a nucleotide sequence encoding at least a protein consisting of the amino acid sequence shown at positions 229 to 547 of SEQ ID NO: 2, but upstream of the first methionine residue, Further base sequences, for example, positions 226-228 or 21i-228 of SEQ ID NO: 2, or positions 102-228, 91-228, 9-228, 1 of SEQ ID NO: 2 It may include a nucleotide sequence encoding a protein consisting of an amino acid sequence such as -228.
  • the polynucleotide shown in [4] above is located 5 'upstream of the nucleotide sequence at positions 730 to 738 or positions 685 to 738, or 358 to 738 of SEQ ID NO: 1. 325-738, 79-738, 55-738 or 1-738.
  • polynucleotide shown in the above [3] or [4] may further include a nucleotide sequence shown at positions 1696 to 2024 of SEQ ID NO: 1 downstream of 3 ′.
  • the protein of the present invention is intended to be a novel human-derived collectin.When various human biological tissues were examined, it was found that the novel collectin considered useful was expressed in human placenta and the like. Indicated.
  • novel collectin shown in the above [9] contains at least the amino acid sequence shown at positions 229 to 547 of SEQ ID NO: 2, but upstream of the first methionine residue, for example, SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence at positions 226 to 228 or positions 211 to 228 of SEQ ID NO: 2, or positions 102 to 228, positions 91 to 228, positions 9 to 228, and positions 1 to 228 of SEQ ID NO: 2 It can also be included.
  • the stringent hybridization conditions in the above [5] or [6] include, for example, 5 ⁇ SSC (20 ⁇ SSC (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate) diluted 4 times). Prepare XSSC), 1 ° /. Pre-hybridization solution in a solution of blocking agent (Boehringer's Mannheim), 0.1% N-lauroyl sarcosine, 0.02% SDS for 1 hour at 68 ° C; cDNA probe (10 ng / ml) in a solution of 5 x SSC, 1% blocking agent, 0.1% N-lauroyl sarcosine, 0.02% SDS for 16 hours at 55 ° C: 2x SSC / 0.1% SDS solution for 5 minutes twice; a series of 2 times at 55 ° C for 15 minutes with 0. ⁇ X SSC / 0.1% SDS solution
  • the hybridization including the above-mentioned processing steps is included, the conditions such as the solution concentration, the temperature, and the time can be appropriately changed
  • deletion, substitution, and Z or addition of one or more amino acids in the above [10] refer to the hydrophilicity 'hydrophobicity, acidity' basicity, and the contained group of the novel collectin without causing a significant change.
  • the present invention also provides a vector comprising the polynucleotide described above so as to allow expression of the novel collectin.
  • the vector into which the polynucleotide is introduced is a vector in which the novel collectin is replicated and expressed by incorporating the polynucleotide relating to the novel collectin into a replicon such as plasmid, phage, cosmid, or the like.
  • a replicon such as plasmid, phage, cosmid, or the like.
  • vectors that can clone DNA fragments longer than cosmids include Pi phage, F factor, and yeast artificial chromosome YAC.
  • the phage includes a substitution type vector and an insertion type vector, and these can be appropriately selected according to the length of the gene to be introduced.
  • vectors known to be capable of expressing animal cells include SV40-based vectors, sipapiroma virus vectors, henoresinores vectores, adeno-winores vectors, box virus vectors, and retrovirus vectors.
  • SV40-based vectors sipapiroma virus vectors, henoresinores vectores, adeno-winores vectors, box virus vectors, and retrovirus vectors.
  • Etc.-those that are commercially available PUC19, pTVH SN (Takara Shuzo), ⁇ 2 (Amersham), pGEX-4 ⁇ , ⁇ 233-2 (Pharmacia), pMAM-neo (Clontech), pGL2 (Promega), pDNA3.1 + (Invitrodinin) and the like.
  • the method for constructing such a vector is not particularly limited, and can be carried out by using a restriction enzyme, ligase or the like by a conventional method.
  • bacteria especially Escherichia coli
  • the vectors will usually contain at least a promoter region (including promoter, operator and Shine-Dalgar sequences). ), A start codon, a nucleotide sequence encoding a novel collectin, a stop codon, a terminator region, and the like.
  • the vector When a yeast or animal cell is used as a host, the vector preferably contains at least a promoter, an initiation codon, a signal peptide, a nucleotide sequence encoding a novel collectin, and a termination codon. Also, enhancer sequences, 5'- and 3'-untranslated regions of the novel collectin, splicing junctions, polyadenylation sites, and selectable markers can be inserted into the vector.
  • Promoters incorporated into the vector of the present invention include the well-known SV40 (Simian Virus 40), SRa, cytomegalovirus (CMV) promoter, actin promoter, and viral TR. (Long Terminal Repeat), for example, HTLV-1 LTR, HIV-LTR, Louth granulation virus LTR, Herpes simplex oral synkinase virus promoter and other strong promoters and weak promoters.
  • a common promoter is cytomegalovirus.
  • Thymidine kinase (TK) 3-actin
  • SV40 early gene promoter Enhancers are usually set with a promoter sequence So you can use it as it is.
  • a cell-specific promoter When cells and tissues in which a gene is to be introduced and expressed are specified, a cell-specific promoter can be selected. Furthermore, by combining these promoters in a homo or hetero form, high expression can be expected and the effect that a novel collectin can be obtained stably may be exerted.
  • promoters used in prokaryotic cells include PBAD, PL, trc, T7, SP6, ⁇ 3, and lac.
  • a promoter capable of highly expressing the novel collectin in these prokaryotic cells can be appropriately selected and used as the promoter of the present invention as long as it is compatible with the host.
  • a cell-specific promoter can be selected.
  • promoters used in yeast include GAL1, A0X1, CUPK PGK and the like.
  • Selection markers for incorporating only the desired vector into the vector described above include dihydrofolate reductase (hereinafter abbreviated as DHFR) gene (metretrexate resistance gene), neo gene (G418 resistance gene).
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • G418 resistance gene neo gene
  • the present invention is directed to transforming or transfecting the vector thus constructed.
  • host cells that are capable of expressing the novel collectin in transduced host cells, eg, animal cells, insect cells, and microbial cells (E. coli, Bacillus subtilis, yeast, etc.).
  • Animal cells as host cells of the present invention include, but are not particularly limited to, human-derived cells.
  • human-derived cells For example, CH0 cells, COS cells, BHK cells, Vero cells, mini-roma cells, HEK293 cells, HeLa cells, Jurkat cells, mouse L cells, mouse C127 cells, mouse FM3A cells, mouse fibroblasts, osteoblasts, chondrocytes Etc.
  • the microbial cells include, for example, bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and beer yeast.
  • a probe for screening a novel collectin-related molecular species containing the polynucleotide or a fragment thereof refers to a novel collectin molecular species having a characteristic structure as shown in FIG. 1 and not included in the known collectin shown in FIG.
  • the probe of the present invention uses the probe of the present invention, the ability to form a hybrid with genes obtained from tissue cells of various organisms is examined, and a gene that can hybridize under relatively stringent conditions is searched for.
  • a gene encoding a novel collectin-related molecular species of interest can be screened and expressed to express a new collectin-related molecular species.
  • the above polypeptides comprises a nucleotide sequence of at least 10 consecutive nucleotides or more, preferably 20 consecutive nucleotides or more of the sequence at positions 1291 to 1698 of SEQ ID NO: 1 including the sugar recognition structure-like region. Or a sequence consisting of at least 10 contiguous bases, preferably 2 contiguous bases of at least 2 consecutive bases among the sequences at positions 796 to 1236 of SEQ ID NO: 1 containing a collagen-like region, from the viewpoint of specificity. It is useful as a polynucleotide constituting a probe.
  • the present invention also provides an antibody that recognizes the novel collectin and / or derived molecule obtained by the present invention.
  • derived molecule refers to a fragment having the same characteristics as a new collectin (for example, a fragment containing a sugar chain recognition site and a Z or collagen region), a precursor of a novel collectin, and coding for them.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid capable of hybridizing under stringent conditions with a nucleic acid sequence and / or its complementary nucleic acid sequence is contained.
  • An antibody eg, polyclonal antibody, monoclonal antibody, monoclonal antibody, peptide antibody
  • antiserum against the novel collectin and Z or a derived molecule uses the novel collectin and / or derived molecule of the present invention or a fusion protein or the like containing the same as an antigen. It can be produced according to a known antibody or antiserum production method. That is, the novel collectin and / or derived molecule of the present invention or a fusion protein containing the same is used as an antigen and administered to a warm-blooded animal together with itself or a diluent or carrier at a site where antibody can be produced by administration.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered to increase antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 1 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, mor-bone, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used. Wister and SD rats are preferred for the rat, and BALB / c, C57BL / 6 and ICR mice are preferably used for the mouse.
  • monoclonal antibody-producing cells When preparing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and collect the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization and include the spleen or lymph node. Monoclonal antibody production by fusing antibody-producing cells with myeloma cells Hybridomas can be prepared. The antibody titer in the antiserum is measured, for example, by reacting the labeled novel collectin or the novel collectin described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • Known methods such as the method of Köhler and Milstein (Nature, 256, 495, 1975) and variants thereof (J. Immunol. Method, 39,
  • fusion promoter examples include polyethylene glycol (PEG), Sendai virus, etc., and preferably, PEG is used.
  • PEG polyethylene glycol
  • lectin poly-L-lysine or DMS O can be added as appropriate.
  • myeloma cells for example, SP2 / 0 cells, preferably X-63Ag8, NS_1, P3U1, SP2 / 0, AP-1 cells and the like are used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells used is 1:20 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1 000 to PEG 6000) is 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding at a concentration of about 10 to 40 and incubating at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used for screening of hybridomas that produce antibodies against novel collectin and amino acids or derived molecules.
  • a solid phase for example, a microphase in which the novel collectin antigen is adsorbed directly or together with a carrier is used.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme if the cells used for cell fusion are mice, use an anti-mouse immunoglobulin antibody
  • protein A method for detecting an anti-new collectin antibody bound to a solid phase adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, and labeling with a radioactive substance, enzyme, etc.
  • Selection and cloning of a monoclonal antibody against a novel collectin and / or a molecule derived therefrom can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. It is usually performed in a selective medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin and thymidine
  • any medium may be used as long as it can grow a hybridoma. For example, 1 to 20 ° / 0 , preferably 10 to 20. /. RPMI medium containing fetal calf serum, 1-10. /. GIT medium containing fetal calf serum, serum-free medium for hybridoma culture, etc.
  • the culture temperature is preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the cultivation is usually performed in the presence of air containing 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the anti-new collectin antibody titer in the antiserum described above. That is, as a measuring method, a radioimmunoassay (RIA) method, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, an FIA (fluorescent immunonoassay) method, a plaque measuring method, an agglutination reaction method, etc. can be used. Such an ELISA method is preferred.
  • the protein prepared by the same procedure as the immunizing antigen is immobilized on the surface of each well of the ELISA plate.
  • BSA mouse serum albumin
  • iMSA mouse serum albumin
  • OVA ovalbumin
  • gelatin or skim milk
  • the hybridoma culture supernatant is added to each well, and the mixture is left for a certain period of time to carry out an immune reaction. Wash each well using PBS (phosphate buffered saline) or the like as a washing solution. It is preferable to add a surfactant to the cleaning solution. Add enzyme-labeled secondary antibody and leave for a certain period of time You.
  • the labeling enzyme -galactosidase, alkaline phosphatase, peroxidase and the like can be used. After washing each well with the same washing solution, a substrate solution of the used labeling enzyme is added to carry out the enzyme reaction. If the target antibody is present in the added hybridoma culture supernatant, the enzymatic reaction proceeds and the color of the substrate solution changes.
  • Cloning can be usually performed by a method known per se such as a semi-solid agar method or a limiting dilution method. Specifically, after confirming the level of the antibody producing the target antibody by the above-mentioned method, cloning is performed. To obtain a single clone.
  • a cloning method a limiting dilution method or the like in which hybridoma cells are diluted and cultured so that one colony is formed per culture plate is preferably used.
  • cell growth factors such as interleukin 6 may be added by using feeder cells to enhance colony forming ability.
  • cloning can be performed using FACS (fluorescence-activated cell sorter) and single-cell manipulation.
  • the cloned hybridoma is preferably cultured in a serum-free medium, and an optimal amount of the antibody is added to the supernatant.
  • the single hybridoma obtained in this manner is cultured in the abdominal cavity of animals using the power of large-scale culture using flasks and cell culture devices (J. Immunol. Meth., 53, 313, 1982). )
  • a monoclonal antibody When culturing in a flask, use a cell culture medium (IMDM, DME, RPMI 164, MEM, etc.) containing 0 to 20% ⁇ 3 (fetal bovine serum). Can be.
  • IMDM IMDM, DME, RPMI 164, MEM, etc.
  • the myeloma cells used for cell fusion When culturing in the abdominal cavity of an animal, it is preferable to use an animal of the same species as the animal from which the myeloma cells used for cell fusion were derived, '' an animal of the same strain, or an athymic nude mouse, etc. Administer oil before transplanting the hybridoma. After 1-2 weeks, myeloma cells proliferate in the abdominal cavity, and ascites containing the monoclonal antibody can be obtained.
  • the monoclonal antibodies according to the present invention can be made non-cross-linked to other proteins by selecting those that recognize the novel collectin and / or the epitope specific to the molecule of origin.
  • Separation and purification of the monoclonal antibody against the novel collectin and the novel or derived molecule can be carried out according to the immunoglobulin separation and purification method in the same manner as ordinary polyclonal antibody separation and purification.
  • Known purification methods include, for example, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ammonium sulfate precipitation method, adsorption and desorption by ion exchanger (for example, DEAE (getylaminoethyl) Sepharose, etc.).
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance against a protein or a fragment thereof and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are different from those of hapten cross-linked to carrier.
  • Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced.
  • serum serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. are used in a weight ratio of about 0.1 to 1 for hapten.
  • a method of coupling at a rate of 1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for hapten and carrier coupling, such as glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, active ester reagent containing thiol group and dithiopyridyl group, etc. Is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal by itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • Polyclonal antibodies are immunized as described above.
  • the blood, ascites, etc. of a warm-blooded animal can be collected preferably from the blood.
  • an antigen can be prepared by using a fusion protein containing a novel collectin and / or a derived molecule and another protein or polypeptide fragment as an immunogen.
  • GST glutthione-S-transferase
  • CBP Calmodulin binding peptide
  • adsorption to nickel chelating resin can be used to isolate and purify the fused protein expressed by the gene recombination method. It can be dissociated from the resin by adding EDTA, imidazole or imidazole substances.
  • CBP CBP
  • the expressed fusion protein can be dissociated from the resin by performing affinity chromatography using Calmodulin Affinity Resin and then adding EGTA.
  • protein A was used, the expressed fusion protein was subjected to affinity chromatography using a ⁇ g G sepharose (eg, IgG Sepharose 6 FF) column, followed by pH variation. Can be dissociated from the resin.
  • protein or polypeptide fragment constituting the fusion protein include Xpress, Thioredoxin, c-tnyc, V5 and HA / c-myc, and these are recognized as epitopes.
  • Xpress Thioredoxin
  • c-tnyc c-tnyc
  • V5 HA / c-myc
  • a fusion protein with the desired novel collectin can be expressed and then isolated and purified using an antigen-antibody affinity column.
  • Monoclonal anti-monoclonal antibody using such a fusion protein as an immunogen (in the case of obtaining this book, a novel collectin may be used for antibody screening, but screening is performed using the fusion protein used as the immunogen) Is preferred in terms of selectivity.
  • a fusion protein comprising the preferred immunogen, GST, a novel collectin and a molecule derived from a GST gene is transformed or transfected into an expression vector containing the coding region of the GST gene and the code region of the novel collectin and the Z or derived molecule.
  • the cultured E. coli or animal cells can be suitably produced by culturing the isolated E. coli or animal cells and isolating the fusion protein from the culture solution and / or the cells.
  • the fusion protein thus obtained may be a carrier having glutathione, for example, purified by affinity to daltathione sepharose beads, and the fusion protein from the glutathione sepharose beads may be used.
  • the elution method can be performed by a known method. Thus, a purified fusion protein that is preferable as the desired immunogen can be obtained.
  • a novel collectin and z or a derived molecule may be used for antibody screening, but screening with the fusion protein used as the immunogen Is preferred in terms of selectivity.
  • Monoclonal and polyclonal antibodies against the novel collectin and z or derived molecules can be used for the diagnosis and treatment of diseases related to the novel collectin.
  • immunization against humans such as humanized antibodies or chimeric antibodies can be performed. It is preferable to use an antibody which has no or is minimal.
  • a mouse monoclonal antibody is administered to a human body, there is a risk that various side effects may occur because the human is a heterologous protein.
  • a human monoclonal antibody is desirable, but it has been difficult to obtain a hybridoma with low fusion efficiency and stable antibody production.
  • a chimeric antibody refers to a chimeric molecule of a mouse antibody and a human antibody. It is ethically impossible to immunize a human with any antigen to produce antibodies. Therefore, a mouse is immunized, an antibody variable region (V region) that binds to an antigen is cut out from the mouse monoclonal antibody gene, and the mouse constant region (C region) gene derived from human myeloma is ligated to produce a chimeric gene. I do. When this chimeric gene is expressed in host cells, a human 'mouse' monoclonal antibody can be produced.
  • V region antibody variable region
  • C region mouse constant region
  • the chimeric antibody Since the chimeric antibody has low antigenicity to humans, it can be used as a therapeutic antibody to be administered into a human body or as a monoclonal antibody for diagnostic imaging.
  • Known techniques related to chimeric antibodies include Japanese Patent Application Laid-Open No. 05-34989, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-330295, W09106649, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-036786. There are the inventions described in Japanese Patent Publication No. 06-98021.
  • humanized antibodies have been developed that are more useful than chimeric antibodies.
  • a humanized antibody is a method in which only the gene sequence of the antigen-binding site (CDR : complementarity determining region) of an antibody molecule is transplanted into a human antibody gene (CDR grafting), and the CDR of the antibody molecule is converted. This is an antibody in which all the molecules except the molecule have been converted to human. It is said that this antibody has less antigenicity and higher safety than the human 'mouse' chimeric antibody because it has fewer mouse antibody parts.
  • CDR complementarity determining region
  • a method for preparing a human monoclonal antibody includes a method of transforming with Epstein-Barr virus (EBV), and a method of fusing the transformed cell with a parent cell.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • a chimeric antibody is an antibody produced by linking immunoglobulin gene fragments of different animals, and a humanized antibody is a mouse or the like that is obtained by modifying a different antibody in humans to obtain H and L chains. Is an antibody in which the primary structure other than the complementarity determining portion (CDR) has been replaced with the corresponding primary structure of a human antibody.
  • CDR complementarity determining portion
  • the parental cells for the production of human monoclonal antibodies were human / mouse heterozygous SHM-D 33 strain (ATCC CRL 1668) or RF-S1 strain. High fusion efficiency can be obtained. Hybridomas obtained using these parental cells can be cloned without feeder cells, and can produce IgG-type antibodies relatively stably and in large quantities.
  • ERDF medium supplemented with 15% FCS is used, and the other procedures are the same as for mice.
  • human lymphocytes sufficiently sensitized with an antigen are preferably collected from peripheral blood and used.
  • the antibody of the present invention can be humanized by using the above-described methods and the like, and is very useful when administered to humans.
  • the present invention provides novel collectin-related molecular species.
  • This method is characterized in that it includes a step of obtaining the singlening.
  • the above antibodies are used to isolate and acquire novel collectin-related molecular species contained in body fluids, tissue cells, and the like of various organisms, or novel collectin and Z or a derived molecule, and immunoreactivity is used. Screen the proteins you have. In such screening, expression screening of the cDNA library is preferably used.
  • a method for quantifying a novel collectin and / or a derived molecule wherein the immunological binding of the new collectin and / or Z or a derived molecule contained in a test sample is carried out using the above antibody. Based on the above, a quantification method characterized by performing measurement is provided.
  • the antibody is preferably used in immunoblotting, immunoprecipitation, ELISA or the like to measure the amount of the novel collectin and Z or a derived molecule, and it is particularly convenient to carry out the ELISA method. preferable.
  • New collectin and Z or native molecules in it may be measured.
  • Insoluble carriers used in the measurement include, for example, synthetic resins such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyester, polyacrylic acid ester, nylon, polyacetal, and fluororesin; polysaccharides such as cellose and agarose; Examples include glass and metal.
  • synthetic resins such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyester, polyacrylic acid ester, nylon, polyacetal, and fluororesin
  • polysaccharides such as cellose and agarose
  • examples include glass and metal.
  • shape of the insoluble carrier various shapes such as a tray shape, a spherical shape, a fiber shape, a rod shape, a disc shape, a container shape, a cell, and a test tube can be used.
  • the antibody-adsorbed carrier is stored in a cold place in the presence of a preservative such as sodium azide as appropriate.
  • a known chemical bonding method or physical adsorption method can be used.
  • the chemical bonding method include a method using glutaraldehyde, ⁇ -succinimidyl 4- ((-maleidomethyl) cyclohexane-11-canoleboxylate and ⁇ -succinimidyl-l-maleimide
  • the maleimide method using acetate or the like, or the rubodiimide method using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminobutanol pill) hydrochloride hydrochloride or the like can be mentioned.
  • ком ⁇ онентs include the maleimidbenzoyl-1-hydroxysuccinimidyl ester method, the succimidyl-13- (2-pyridyldithio) propionic acid method, the bisdiazobenzidine method, and the dipalmityllidin method.
  • a complex formed by first reacting the target substance and two different antibodies with different epitopes can be formed by immobilizing a third antibody against the antibody by the above method. It is possible.
  • enzymes include, for example, peroxidase, alkaline phosphatase, 8-D-galactosidase, apple Acid dehydrogenase, staphylococcal nuclease Ichize, delta-5-steroid Doisomera Ichize, ⁇ - glycerolphosphocholine Hue one Todehi Dorogena one zero, door Rio one Suhosufue one Toisomera Ichize, horseradish Peruokishida Ichize, ⁇ Sno,: Ragina
  • the fluorescent substance include, but are not limited to, glucose, gnorecosoxidase, ribonuclease, urea-lase, lipase, gonoleose-1 6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase, and acetylcholinesterase.
  • the radioactive substance 1 2 5 1 2 7 1, 1 3 1 I, 1 4 C, 3 H, 3 2 P, 3 5 S and the like, but not particularly limited constant as long as it can be used in immunoassays not limited to these.
  • hapten such as piotin, dinitrophenyl, pyridoxal or fluorescamine may be bound to the antibody.
  • a low molecular weight hapten such as piotin, dinitrophenyl, pyridoxal or fluorescamine may be bound to the antibody.
  • horseradish beloxidase is used as the labeling enzyme. This enzyme can react with many substrates and can be easily bound to antibodies by the periodate method.
  • the labeling agent is an enzyme
  • use a substrate and, if necessary, a color former to measure its activity when using a Peruokishida one zero as enzymes, with H 2 ⁇ 2 as a substrate solution, 2 as coloring agent, 2 'single azino temporary - [3- E chill benz thiazoline sulfonic acid]
  • Anmoniumu salt (ABTS) 5 —Aminosalicylic acid, orthophenylenediamine, 4-aminoantipyrine, 3,3 ′, 5,5′—tetramethylbenzidine, etc. can be used, and when using enzyme phosphatase as the enzyme, Orthonito mouth phenyl phosphate, no, as.
  • Rani trophenyl phosphate etc.
  • fluorescein di- ( ⁇ -D-force lactopyranoside) and 4-methylpumbellifninyl are used as substrates.
  • 1- D-galactopyranoside can be used.
  • cross-linking agent examples include N, N'-ortho-phenylenediimide, 4- ( ⁇ -maleidomethyl) cyclohexanic acid, ⁇ -succinimide ester, 6-malemidhexanic acid, ⁇ -succinimide ester, 4, 4'-dithiopyridine and other known crosslinking agents can be used.
  • the reaction between these cross-linking agents and the enzyme or antibody may be performed according to a known method depending on the properties of each cross-linking agent. In some cases, a fragment thereof, for example, F ab ′, F ab, F (ab ′) 2 is used as the antibody.
  • Enzyme-labeled products can be obtained by the same treatment regardless of whether the antibody is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. If the enzyme-labeled product obtained using the above-mentioned cross-linking agent is purified by a known method such as affinity chromatography, an immunoassay system with higher sensitivity can be obtained. The purified enzyme-labeled antibody is added with thimerosal or glycerin as a stabilizer or freeze-dried and stored in a cold place.
  • the sample to be measured in the above-described quantification method is limited as long as it is a sample containing a novel collectin and a novel or derived molecule or a sample containing a precursor thereof, such as plasma, serum, blood, urine, tissue fluid, body fluid such as cerebrospinal fluid, and the like.
  • the present invention provides a kit for quantifying a novel collectin and / or a molecule derived therefrom, which comprises the above antibody, and comprises a novel collectin and / or NO contained in a test sample by ELISA using the antibody.
  • This kit contains not only the antibody but also the reagents required for quantification as described above.
  • the present invention also provides a method for producing a novel collectin and Z or a derived molecule, comprising a step of isolating the novel collectin and Z or a derived molecule using the above antibody.
  • a sample is brought into contact with a carrier to which the antibody is bound to allow a specific interaction between antigen and antibody, and then the carrier is separated.
  • affinity chromatography by column method, batch method, or the like including the step of eluting the bound target protein, and immunoprecipitation may be performed.
  • the sample in this method may be, for example, a sample obtained by preparing from a placenta or a spleen derived from a human, or a sample prepared by expressing the novel collectin of the present invention from a polynucleotide encoding the above-described collectin. Since the sample can be supplied stably, an expression product is preferably used, and a method including such an expression step is contemplated in the present invention.
  • Also contemplated by the present invention is a method for confirming the presence of novel collectins and ⁇ or derived molecules in tissues, wherein immunohistological examination using the above antibodies is performed.
  • the immunohistological test employs a technique such as in situ immunohistochemical staining using a labeled antibody to detect a novel collectin and Z or a derived molecule.
  • transgenic non-human animal characterized in that the recombinant gene containing the polynucleotide of the present invention can be stably introduced into a chromosome and can express a novel collectin. Is done. Further provided are non-human animals containing a homolog of the novel collectin of the present invention so that the expression of the gene encoding the homolog can be modified (for example, by inhibiting or promoting the expression, Transgenic non-human cells that have been transfected. Animal. Mutations such as deletions, substitutions, additions, and Z or insertions occur at some of the important sites that normally regulate gene expression (enhancers, promoters, introns, etc.) in this non-human animal.
  • This mutation can be introduced by a known method (eg, Lesley, SA et al., Promega Notes Magazine. 46, 6-10, 1994; Kunkel, TA et al., Methods Enzymol? 154, 367). -382, 1987; Sayers, JR et al., Biotechniques, 13, 592-596, 1992; I to W., et al., Gene, 102, 67-70, 1991; Cormack, B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.5.1-8.5.9, 1987).
  • the gene includes cDNA, genomic DNA or synthetic DNA. Gene expression also includes both transcription and translation steps.
  • transgenic non-human animals can be used to study the function or expression regulation of novel collectin and / or derived molecules, elucidate the mechanisms of diseases in which novel collectin and / or derived molecules are expected to be involved, and Screening ⁇ Useful for the development of disease model animals for use in safety tests.
  • a transgenic animal is an animal in which a foreign gene has been artificially introduced into germ cells by genetic recombination in a narrow sense.In a broad sense, the function of a specific gene is suppressed using antisense RNA. Exogenous genes are stable in the early stages of somatic development, including antisense transgenic animals, animals in which specific genes have been knocked out using embryonic stem cells (ES cells), and animals in which a point mutation DNA has been introduced. An animal that can be transferred to the chromosome and transmitted to its offspring as a genetic trait.
  • ES cells embryonic stem cells
  • a transgenic animal is any spinal cord except human. In a broad sense, including vertebrates.
  • the transgenic animal of the present invention may be used for studying the function or expression regulation of a novel collectin and / or a derived molecule, elucidating the mechanism of a disease associated with a cell expressing in a human, screening a drug, and using it for a safety test. Useful for the development of model animals.
  • Transgenic animals are produced by a method in which a gene is directly introduced into the nucleus of a pronuclear stage egg with a micropipette under a phase-contrast microscope (microinjection method, US Pat. No. 4,873,191). ), Such as using embryonic stem cells.
  • a method of inserting a gene into a retrovirus vector or an adenovirus vector and infecting an egg and a method of introducing a gene into an egg via a sperm and a method using a sperm vector have been developed.
  • the sperm vector method is a genetic recombination method in which a foreign gene is introduced into sperm cells by attaching a foreign gene to sperm or by electroporation and then fertilizing the egg to introduce the foreign gene.
  • a foreign gene is introduced into sperm cells by attaching a foreign gene to sperm or by electroporation and then fertilizing the egg to introduce the foreign gene.
  • site-specific recombination in vivo by the cre / lox P recombinase system of bacteriophage P1 or the FLP recombinase system of Saccharomyces cerevisiae can be used.
  • a method for introducing a transgene of a target protein into a non-human animal using a retrovirus has been reported.
  • the method for producing a transgenic animal by the microinjection method is performed, for example, as follows.
  • a transgene consisting essentially of a promoter involved in the regulation of expression, a nucleotide sequence encoding a novel collectin, and a polyA signal is required.
  • Promoter activity affects the expression mode and amount of a specific molecule, and depends on the copy number of the introduced transgene and the introduced site on the chromosome. Since the transgenic animals produced differ between strains, confirm the expression mode and expression level between each strain. Untranslated region: Since it is known that the expression level is changed by splicing, the spliced into sequence may be introduced before the poly A signal .: Gene to be introduced into a fertilized egg It is important to use as pure as possible. Animals used include fertilized egg-collecting mice (5-6 weeks old), mating male mice, pseudopregnant female mice, and vasectomy male mice.
  • ovulation may be induced by gonadotropin or the like.
  • the fertilized egg is collected, and the gene in the injection pipet is injected into the male pronucleus of the egg by microinjection.
  • whether the transgene was introduced into the born mouse was determined by extracting genomic DNA from the tip of the tail and detecting the transgene by Southern or PCR methods, or homologous recombination. It can be confirmed by the positive crossing method in which a marker gene that is activated only at a certain time is inserted.
  • a transcript derived from the transgene is detected by the Northern method or the RT-PCR method.
  • western blotting may be performed using specific antibodies against the protein or a fragment thereof.
  • a gene encoding the homolog is modified so as to prevent the expression of the homolog, which is obtained.
  • the present invention provides a knockout mouse according to the present invention, which has been treated so that the functions of the novel collectin and the novel or derived gene transfer gene are lost.
  • knock out A mouse is a transgenic mouse in which any gene is disrupted by homologous recombination technology and its function is lost.
  • chimeric mice in which embryo-derived cells are mixed with cells derived from embryonic stem cells are obtained by injecting blastocysts of fertilized eggs or embryonic stem cells whose genes have been manipulated during the morula stage.
  • this chimeric mouse (a chimera is a single individual formed from somatic cells based on two or more fertilized eggs) and a normal mouse were bred, all of one allele was altered and destroyed.
  • Heterozygous mice can be generated.
  • homozygous mice can be produced by crossing heterozygous mice.
  • Homologous recombination refers to recombination that occurs between two genes having the same or very similar nucleotide sequences in the genetic recombination mechanism.
  • PCR can be used to select for cells that have undergone homologous recombination.
  • a PCR reaction using a part of the inserted gene and a part of the region expected to be inserted as primers, it can be seen that homologous recombination has occurred in the cells in which the amplification product was produced.
  • a neomycin resistance gene can be linked to the introduced gene, and the cells can be selected by neomycin resistance after introduction. It can be easily selected using known methods and their modifications (see Capecchi, Science, Vol. 24, pp. 1288-i 292 (1989)).
  • a fetal heart-derived clone (I.M.A.G.E. Consortium Clone ID 34472) was purchased from ATCC (American Type Culture Collection) and used to prepare the following screening probe for obtaining a new collectin.
  • the nucleotide sequence of the insert DNA of the above clone was determined using primers (Pharmacia, M13 Universal Primer (SEQ ID NO: 7, 5'-fluorescein-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3)) and M13 Reverse Primer.
  • the DIG label was prepared using the PCR DIG probe synthesis kit (Belinger, Mannheim). .
  • Example 3 Screening of Human Placenta-Derived cDNA Library
  • Escherichia coli Y1090r was cultured for 16 hours at 37 C in mLB medium (LB medium (1 g tryptone, 0.5 g list extract, 0.5 g NaCl / 100 ml) containing 10 mM MgSC and 0.2% maltose). and ml, SM buffer (5.8 g NaCl, 2 g MgS0 4 ⁇ 7H 2 0, 2 M Tris-HCl
  • Hybridization and detection of signals were performed as follows. Wet the filter with 2X SSC, remove excess water with Whatman 3MM paper, transfer to a hybridization screen, and use hybridization solution (5X SSC, 1% blocking agent, 0.1% N-lauroyl) (Sarcosine, 0.02% SDS) and prehybridization at 68 ° C for 1 hour.
  • hybridization solution was removed from the bag, and a hybridization solution prepared so that the DIG-labeled cDNA probe was adjusted to 10 ng / ml was added thereto, followed by hybridization at 55 ° C for 16 hours. Hybridization was performed. After hybridization, filters are washed twice with 2X SSC / O.1% SDS solution for 5 minutes at room temperature, and at 55 ° C for 15 minutes with 0.5X SSC / 0.1% SDS solution. Washed twice. Next, in DIG buffer I (100 mM Tris-HC1, 150 mi NaCl (pH7.5)) for 1 minute
  • the SDS was removed, and the filter was blocked with DIG buffer II (1% blocking agent, DIG buffer I) for 30 minutes. After washing with DIG buffer I for 1 minute, then adding a 5000-fold diluted anti-DIG alphophosphatase-labeled antibody (Boehringer Mannheim) with DIG buffer II, add the antibody reaction for 30 minutes at room temperature. After that, the plate was washed twice with DIG buffer I at room temperature for 15 minutes.
  • DIG buffer II 1% blocking agent, DIG buffer I
  • IG buffer III 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl (pH 9.5), 50 mM MgCl 2
  • NBT / BCIP manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • Example 4 Determination of the nucleotide sequence of a novel human lectin
  • a plaque of a clone considered to be appropriate among the positive clones obtained in the secondary screening was cut out from the plate, added to a tube containing 200 // 1 of distilled water, and stirred for 30 minutes at room temperature. The mixture was centrifuged at rpm for 5 minutes to obtain a supernatant.
  • the obtained supernatant was designated as type III, and the insert DNA was amplified by PCR using TaKaRa LA PCR Kit Ver.2 (Takara Shuzo).
  • the reaction composition of the PCR is as follows (supernatant: 27 ⁇ 1, 10X LA PCR buffer II)
  • each DNA fragment was inserted into a pUC18 vector, and transformed into XL1-Blue cells.
  • Transformants were cultured in LB medium (100 / zg / tnl ampicillin), and plasmid was extracted by alkaline SDS method.
  • HPP 2 5'—Funoleosin ttttatccatttgctgttcctc—3 '
  • HPP 3 5'-Funoleoresin-ctggcagtccccgaggtccag-3 '(SEQ ID NO:
  • HPP 5 5'-Funoleorescein gctggtcccccggagagcgt_3 '
  • FIG. 4 (a) shows the ORF of the obtained novel collectin, in which G_X-Y represents a collagen-like region.
  • Figure 4 (b) shows the names of the above primers, the nucleotide sequences read by the sequencer (represented by arrows), the M13 Universal Primer (represented by U), and the M13 Reverse Primer (represented by R). ).
  • the nucleotide sequence of the 5 ′ terminal region including the transcription start point of this sequence was determined.
  • the reaction mixture was mixed with LA PCR Buffer II (without Mg 2 ⁇ ), 2.5 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (Takara Shuzo) in a total volume of 50 ⁇ l.
  • LA PCR Buffer II without Mg 2 ⁇
  • 2.5 mM MgCl 2 200 ⁇ M each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (Takara Shuzo) in a total volume of 50 ⁇ l.
  • Cap Site cDNA Human Liver, 0.5 / i M1RC2 Primer (NIPPON GENE) and 0.5 M TGP1 Primer were included.
  • PCR consisted of 35 cycles of thermal denaturation at 95 ° C for 20 seconds, annealing at 60 ° C for 20 seconds, and extension reaction at 72 ° C for 20 seconds.
  • the program was performed with a program containing 5 minutes of heat denaturation at 95 2 C and 10 minutes at the end of the extension reaction 72.
  • nested PCR was performed.
  • the 1st PCR product ⁇ ⁇ was type ⁇ and the primers were 2RC2 Primer ( ⁇ '-gtacgccacagcgtatgatgc-3 '(system number: 17)) and synthetic TGP2 Primer (5'-cattcttgacaaacttcatag-3) '(SEQ ID NO: 18)
  • the purified DNA fragment was incorporated into Novagen's pTTBlue Vector, and the vector was transformed into competent cell XL1-Blue cells.
  • the transformant was cultured in LB medium (100 g / ml ampicillin), and plasmid was extracted by alkaline SDS method.
  • the nucleotide sequence was determined using the Sequencing Kit and A. and F. DNA Sequencer. As primers, M13 Universal Primer (SEQ ID NO: 7) and M13 Reverse Primer (SEQ ID NO: 8) attached to the AutoRead Sequencing Kit were used.
  • the novel collectin cDNA clone obtained in Example 3 contains 2024 bases, has 1026 bases of 0RF (transcription reading frame) (see SEQ ID NO: 1), and is shown in SEQ ID NO: 2. It was confirmed that it encoded 342 amino acids.
  • Genomic Southern analysis was performed to determine whether the gene of the novel collectin having the cDNA sequence identified in Example 4 was a Syndall copy gene or a multicopy gene.
  • 4 / ig equivalent of human genomic DNA (promega) derived from human blood was converted to restriction enzymes (1) ££ RI, (2) Xba I, (3) Hind III, (4) Pst I, (4) 5) Digested with BglII or (6) BamHI and electrophoresed on 0.8% agarose gel at 100 mA for 3 hours. After the electrophoresis, the membrane was transferred to a nylon membrane (Nytran 13N) to prepare a membrane for analysis.
  • the gel after electrophoresis was immersed in 100 ml of 0.25 N HC1 for 10 minutes, washed three times with distilled water, and then placed in 100 ml of denaturing solution (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) for 15 minutes. After immersion, depurination, denaturation and neutralization are performed by immersion in 100 ml of neutralization solution (0.5 M Tris-HC1, 3 M NaCl (pH 6.8)) for 30 minutes, and then a vacuum blotting system (Toyobo The image was transferred using VB-30) manufactured by Engineering Co., Ltd.
  • the membrane used was a membrane pre-treated by immersion in 2 ⁇ SSC for 5 minutes and then in 20 ⁇ SSC for 5 minutes, and the pad used was soaked with 20 ⁇ SSC. After the transfer, a fixing treatment was performed by UV irradiation.
  • a hybridization probe for Southern analysis a part of the 0RF of the cDNA sequence of the novel collectin obtained in Example 4 was used as a primer:
  • cagactcaga g (SEQ ID NO: 21) was used. Prior to hybridization, the probes were boiled for 10 minutes and snap frozen in dry ice Z-nitanol for 5 minutes.
  • the membrane after transfer was immersed in 2 ⁇ SSC for 5 minutes, and prehybridized in 10 ml of ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech) at 65 ° C. for 30 minutes.
  • the frozen probe was diluted with ExpressHyb Hybridization Solution to 10 ng / ml, and 2 ml of this solution was used for hybridization at 65 ° C for 1 hour.
  • the membrane was washed twice with 20 ml of 2 SSC and 0.1 ml of SDS solution for 5 minutes each at room temperature, and then at 65 ° C with 20 ml of 0.2 x SSC and 0.1 ml of 0.1 ° / oSDS solution. This was performed while shaking twice for 15 minutes each.
  • DIG buffer I 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl
  • the plate was washed twice with 50 ml at room temperature for 1 minute, and then subjected to blocking with 50 ml of DIG buffer solution (1.5% blocking agent, DIG buffer solution) for 1 hour at room temperature.
  • DIG buffer solution (1.5% blocking agent, DIG buffer solution)
  • the plate is treated with 10 ml of anti-DIG alkaline phosphatase-labeled antibody diluted 5000 times with DIG buffer I containing 0.2% Tween 20 for 30 minutes, and 50 ml of DIG buffer I containing 0.2% Tween 20 is added. Shake at room temperature for 20 minutes Washing was performed twice while washing.
  • the obtained novel collectin gene may be a single copy gene. Was guessed.
  • Example 6 Analysis of expression distribution of novel collectin in human tissues To examine the expression of mRNA of the novel collectin of the present invention in various tissues, analysis was performed by RT-PCR.
  • RNAs from various tissues (1) brain, (2) heart, (3) kidney, (4) spleen, (5) liver, (6) small intestine, (7) muscle tissue, (8) testis, ( 9) Placenta or (10) Large intestine (OriGene Technologies, Inc.)
  • RNA LA PCR Kit AMV Ver. 1.i (Takara Shuzo).
  • a reverse transcription reaction was performed with the following reaction composition. 5 mM MgCl 2 1 x RNA PCR Buffer, ImM dNTP Mixture, IU / ⁇ 1 RNase inhibitor, 0.25 U / ⁇ 1 reverse transcriptase, 0125 ⁇ ! ⁇ Oligo dT-Adapter Primer, RNA lig, total volume 20 ⁇ 1 It was adjusted with RNase-free distilled water so that At the same time, a reaction composition not containing reverse transcriptase was also prepared to obtain a negative control.
  • reaction solution was placed in a 0.2 ml tube, and PCR was performed with TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL (manufactured by Takara Shuzo) in one cycle of 42 ° C for 30 minutes, 99 ° C for 5 minutes, and 5 ° C for 5 minutes.
  • TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL manufactured by Takara Shuzo
  • LAPCR was performed using the following reaction composition.
  • RT-PCR was performed to amplify a part of the [3-actin gene in each tissue, and RNA was corrected.
  • the reverse transcription reaction and the PCR reaction were performed in the same manner as described above, and the determination was performed using 1% agarose gel electrophoresis in the same manner as described above.
  • the composition of the reverse transcription reaction includes 5 mM MgCl 2s 1 x RNA PCR Buffer, ImM dNTP Mixture, 1 U / ⁇ 1 RNase inhibitor, 0.25 U / 1 reverse transcriptase, 2.5 M random 9 mer, 10 ng RNA, It was adjusted to 60 ⁇ l with RNase-free distilled water.
  • PCR reaction was performed with the following reaction composition. 2.5 mM MgCl 2 , 1 x LA PCR Buffer II (without Mg 2 + ), 2 U TaKaRa and A Taq, 0.25 ⁇ M human actin 'sense primer ⁇ ' -caagagatggccacggctgct-3 ' ) And 0.2 ⁇ M human ⁇ -actin antisense 7-lammer ⁇ -tccttctgcatcctgtcggca-3 '(SEQ ID NO: 25)), and adjusted to a total volume of 40 / l with sterile distilled water. 94. 30 cycles of 15 seconds at C and 30 seconds at 68.
  • Genomic Southern analysis was performed to determine whether the novel collectin gene of the present invention is conserved in other animal species.
  • a probe for hybridization a portion corresponding to 0RF of the cDNA sequence of the above-mentioned novel collectin was DIG-labeled using a PCR DIG probe synthesis kit (Behringer 1. Mannheim).
  • the membranes were (1) human (promega), (2) monkey (clonetech), (3) rat (promega), and (4) mouse (promega) ), (5) dog (Clontech), (6) bird (Promega), (7) heron (Clontech) and (8) bird (Promega) genomic DNA was treated with a restriction enzyme EcoRI at a concentration of 5 / g, electrophoresed on an agarose gel, transferred to a Nitran 13N membrane, and fixed by UV irradiation.
  • hybridization was performed according to the following steps. First, immerse the membrane in 2X SSC for 5 minutes and 65 in 10 ml ExpressHyb Hybridization Solution.
  • the probe which had been frozen in the same manner as described above, was diluted to 10 ng / ml with ExpressHyb Hybridization Solution. Using 2 ml of the solution, hybridization was performed at 65 ° C. for 1 hour.
  • the collectins analyzed were proteins of various collectin families shown in Fig. 10 (in the figure, CL-L1 indicates a collectin derived from human liver recently isolated by the present inventors (Japanese Patent Application No. Based on the data obtained by searching each amino acid sequence from the GenBank database, a multiple alignment was created by the clustalw method using the region containing the lectin domain. Based on them, a genetic phylogenetic tree was created using the NJ method (neighbor-joiningiifej, Phyl ip Version 3.57c package).
  • Example 9 Preparation of monoclonal antibody against novel collectin 100 / ig of novel collectin dissolved in PBS (-) (PBS without calcium ions and magnesium ions) 1001 was mixed with complete Freund's adjuvant 1001, and emulsified.
  • a BALBZc mouse female, 8 weeks old is injected into the abdominal cavity of two mice. Three weeks later, a second immunization is performed in the same manner. However, use incomplete Freund's adjuvant instead of complete Freund's adjuvant. Two weeks later, serum is collected and the antibody titer is measured. The mouse with the highest antibody titer is selected, and one week later, the final immunization is performed in the same manner as the second time.
  • spleen Five days after the final immunization, the spleen is collected and a cell suspension is prepared. Cell fusion is performed myeloma cells NS- 1 cells 2 X 10 'pieces and prepared ⁇ cells IX 10 8 cells were mixed. The mixture was centrifuged at 1,600 rpm for 6 minutes at room temperature.
  • hybridomas The selection of hybridomas is performed as follows-One day after the start of culture, add HAT medium (hybridoma culture medium containing HAT) 150 / il to each well, and then culture for 2 days. After 2 days, remove 150 ⁇ l of the medium, add 150 ⁇ l of HAT medium, and replace the medium. After 3 and 7 days of culture, replace the medium in the same manner. Four days later, the culture supernatant LOO / I is collected and the antibody titer against the new collectin is measured for screening. Next, the antibody-positive cells are transferred from a 96-well plate to a 24-well multiplate using Pasteur pipettes.
  • HAT medium hybrida culture medium containing HAT
  • HT medium hybrida growth medium containing hypoxanthin and thymidine
  • HT medium hybrida growth medium containing hypoxanthin and thymidine
  • a portion of the medium is collected, and the antibody titer is re-measured.
  • cells that can be determined to be antibody positive are cloned and cryopreserved.
  • Clojung positive cells are subjected to limiting dilution with a thymocyte suspension solution to prepare 1 ml, and 0.2 ml is spread on a 96-well multiplate.
  • Antibody-positive cells are subsequently expanded in culture. First, transfer to a 24-well multiplate, culture for 3 days, transfer to a 25 cm 2 flask, and then transfer to a 225 cm 2 flask for another 3 days, continue the culture for another 3 days, and collect the culture supernatant. Prepare one null antibody.
  • monoclonal antibody production from ascites is performed by preparing 1 ⁇ 10 7 cloned hybridomas into Zml and injecting 1 ml per mouse intraperitoneally 3 weeks later.
  • An enlarged mouse is anesthetized with a catheter, and ascites is collected. Transfer to a coagulation-promoting centrifuge tube containing serum separating agent After leaving at room temperature for 30 minutes, centrifuge at 3,000 rpm for 5 minutes. The ascites in the upper part is collected and further purified by ammonium sulfate to obtain an antibody.
  • Example 10 ELISA using an anti-mouse anti-human novel collectin antibody
  • An anti-mouse anti-human novel collectin antibody was diluted to 10 ⁇ g Zml with a coating buffer (50 mM bicarbonate bicarbonate buffer, pH 9.6). Dispense 100 ⁇ l of the antibody solution into a 96-well ELISA plate. Then, incubate at 4 ° C. Washing solution (TBSZT solution (25 mM Tris-HC1, 0.14 M NaCl, 5 mM KC1, 0.05% Tween 20, pH 7.4)) 300 Wash 3 times with 1. The following cleaning is performed in the same manner.
  • TBSZT solution 25 mM Tris-HC1, 0.14 M NaCl, 5 mM KC1, 0.05% Tween 20, pH 7.4
  • mRNA is prepared from a mouse hybridoma that has been perturbed by the method described in Example 9, a cDNA library using a phage vector is prepared, and cDNA cloning is performed.
  • Mouse antibody cDNA cloned using the constant region cDNA as a probe cDNA inserted using restriction enzymes Analyze NA and determine the nucleotide sequence of antibody cDNA.
  • the chimeric antibody is expressed, the presence or absence of a mutation in the cloned antibody gene is checked from the antibody binding activity, and used as a positive control when examining the binding activity of the expressed humanized antibody.
  • a cassette-type expression vector in which the constant regions of the human antibody H and L chains are cloned on a vector is used. After confirming the binding activity of the chimeric antibody and determining that the cloned mouse antibody gene is correct, construct a humanized antibody gene. Unlike a chimeric antibody production method, in the case of a humanized antibody, the gene to be constructed must be designed.
  • a database is used to search for a highly homologous amino acid sequence of the human antibody variable region. Those having 70-80% homology except for the CDR sequence were found, and the mouse antibody CDR sequence was transplanted into the region (framework region) obtained by removing the CDR sequence from the thus selected human antibody variable region.
  • the gene is actually constructed. Cloned into a cassette-type expression vector containing the constant region genes for the humanized antibody H and L chains Then, transient expression is performed using COS cells or the like, and the antibody activity of the culture supernatant is confirmed using ELISA. Select several types with strong activity, establish an expression vector for constitutive expression and host cells such as COS cells, respectively, to establish cells that constantly express, and prepare purified antibodies from the culture supernatant.
  • Example 12 Construction of New Collectin Expression Vector pNOW hCL-Pl First, the start codon to the stop codon 3 of the novel collectin shown in SEQ ID NO: 1; 3 ⁇ 4T, aaggaaaaaa gcggccgcat gcaacaagat ttgatgagg salt Rooster self lj
  • amplification is carried out by Zymoreactor (manufactured by Atto).
  • the obtained cDNA of the novel collectin is digested with restriction enzymes Not I and Xbal to obtain a cDNA portion (see SEQ ID NO: 1) corresponding to 670 to 1698 bp of the cDNA of the novel collectin, which is inserted into the insert.
  • the expression vector pNOW / CMV-A was digested with the restriction enzymes No. 11 and XbaI, and downstream of the cytomegalovirus promoter (pCMV), , between P CMV (site cytomegalovirus early major antigens promoter I) and BGP poly a ( ⁇ shea growth hormone polyadenylation, single Shonshi Gunaru), using the aforementioned insert a DNA Raige one Chillon kit (Takara Shuzo) Insert.
  • the expression vector thus obtained was named plasmid pNOWl-hCL-Pl (hCL-Pl: a nucleotide sequence encoding a novel collectin), and a schematic diagram of the structure is shown in FIG.
  • Example 13 3 Selection of clones expressing novel collectin
  • fetal serum FCS, GIBC0
  • FCS Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • dhfr- DH44 gene-deficient DG44 CHO cell line was mixed to a volume of 1 x 10 5 cells Zml, and this was seeded on a dish with a diameter of 60 mm. Incubate for 24 hours under the condition of% carbon dioxide (co 2 ).
  • the culture supernatant is discarded, and instead, 5 ug of DNA (expression vector—pNOWl-hCL-Pl) is separately mixed with a lipofectin solution (DOTAP Liposomal Transfection Reagent; Boehringer Mannheim) in advance. 5% 10% syrup containing 100 ⁇ l of the solution obtained above was added to 11 to yield 6 [ 111], and hypoxanthine (final concentration 10 nM) (manufactured by GIBCO) and thymidine (final concentration ⁇ ) ( GIBC0 companies, Ltd.) was added, and cultured for 16 hours, the introduction of the expression vector pNOW Bok hCL-Pl to dhfr _ host CH0 cells. Then, discard the culture supernatant, add 6 ml of IMDM with 10% FCS, hypoxanthine, and thymidine, and incubate for another 24 hours.
  • DOTAP Liposomal Transfection Reagent Boehringer Mannheim
  • the amount of hCL-P1 produced was determined by comparing the hCL-Pl, collectin sugar recognition region (CRD) and neck region (expressed in E. coli using the same method) expressed in E. coli using the method of Suzuki et al. Suzuki, et al., Characterization of Recombinant Bovine Conglutinin Expressed in a Mammalian Cell ", using anti-Egret polyclonal antibody against Biochem.
  • the hC-P1 producing clone obtained in Example 13 (2) above is further subcultured and stabilized, and then gene amplification is performed by adding low-concentration methotrexate (MTX) to the medium. .
  • MTX low-concentration methotrexate
  • each selected cell clone was mixed with IMDM supplemented with 10% dialyzed FCS (manufactured by JRH Biosciences) supplemented with 5 ⁇ and 400 ⁇ g / ml of G418, and the amount of 0.1 ml / well was added to a 96-well microwell. Seed (dispense) 10 plates. In 37 ° C, it was cultured under conditions of 5% carbon dioxide (C0 2), to obtain the survival cells after two weeks as 5 nM MTX resistant cells (clone).
  • FCS dialyzed FCS
  • Collectins are thought to play an important role in basal immunity.
  • novel collectin of the present invention is considered to form a genetically different cluster from the conventional collectin, new knowledge on immunity is obtained, and the action mechanism of the novel collectin is elucidated.
  • transgenic non-human animals of this novel collectin to provide important tools in the field.
  • a plasmid capable of expressing a novel collectin derived from a human of the present invention in a mouse is constructed.
  • a mammalian expression vector Niwa, H. et al .; Gene, 108, 193-200, 1991
  • the 3 kb fragment was excised by digestion with Sal I / Pst I, and inserted into the Sal I / Pst I site of a cloning vector—pBluescript (Stratagene) to construct a pBsCAG-2 vector.
  • This 2.3 kb fragment contains the above-mentioned enhancer promoter and a part of the heron ⁇ -globin gene (second intron, third exon, 3 ′ untranslated region).
  • the hCL-P1 cDNA (positions 670 to 1698 of SEQ ID NO: 1) is inserted into the EcoRI site of the third exon to construct a plasmid pj3A / hCL-PI for expression of a transgenic mouse.
  • plasmid pj8 AZhCL-Pl is prepared by the alkali-SDS method, and purified by CsCI equilibrium density gradient ultracentrifugation. Isolate the gene digested with 5 & .1 I Bam HI from / 8 ⁇ -1 and cut off the vector. Then, the DNA fragment is separated from the vector DNA fragment by agarose gel electrophoresis, the transfected DNA fragment is excised from the gel, and the DNA fragment is purified using GeneClean II Kit.
  • DNA lysis solution for induction 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.25 mM EDTA), centrifuge at 15, OOOrpm (20,000 xg) for 5 minutes, and collect the supernatant. Measure the absorbance using a spectrophotometer, calculate the DNA concentration, prepare 500 DNA molecules Zpl, and — Dispense 50 ml aliquots and store at 20 ° C until DNA transfer into cell-stage embryos. Next, a fertilized mouse egg for DNA injection is prepared. First, in order to induce superovulation in female mice for fertilized egg collection, pregnancy horse serum gonadotropin and human chorionic gonadotropin were administered intraperitoneally at an interval of 48 hours with 5 IU body.
  • BWW- Hepes medium NaCl 102. 2m, KC1 4. 7 8mM, ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 0 4 1. 19mM, CaCh 1. 17mM, MgSO ⁇ 1. 19mM, aHCOs 4.76 mM, Hepes l 5 mM, sodium lactate 25 mM, sodium pyruvate 0.25 mM, gnorecos 5.56 mM, BSA 4 mg / mL, EDTA 0. ImM and phenol red 0.00025%) Later, containing 300mg / ml Hyal mouth nidase BWW- Hepes medium (NaCl 102. 2m, KC1 4. 7 8mM, ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 0 4 1. 19mM, CaCh 1. 17mM, MgSO ⁇ 1. 19mM, aHCOs 4.76 mM, Hepes l 5 mM, sodium lactate 25 mM, sodium pyruvate 0.25 mM, gnore
  • DNA injection into the pronucleus of the fertilized egg is performed.
  • the DNA solution is sucked into the injection pipette, the injector is adjusted so that the pressure becomes very slight, and the DNA solution is continuously discharged from the tip.
  • the eggs are aspirated with a holding pipet so that the male pronuclei come to the injection pipe side, the magnification of the objective lens is set to 40x, and the pronucleus is focused. Adjust so that the tip is flush with the pronucleus.
  • the fertilized eggs are transplanted into the fallopian tubes.
  • Nembutal injection is diluted 10-fold with a diluent (final concentration 5 mg / ml) and administered intraperitoneally 0.01 ml per ig body weight to anesthetize pseudopregnant mice.
  • transgenic mice Screening of transgenic mice is performed by dot blot hybridization as follows. The obtained pups are weaned 4 weeks after birth, and about 1 cm of the tail end is cut under anesthesia and placed in a 1.5 ml eppendorf tube. 0.5 Add 0.5 ml of STE buffer (50 mM Tris-HC1, 100 mM EDTA (pH 7.5), 0.5% (w / v) SDS) containing Stng / tnl proteinase K, and incubate at 55 ° C. Shake overnight.
  • STE buffer 50 mM Tris-HC1, 100 mM EDTA (pH 7.5), 0.5% (w / v) SDS
  • the neomycin resistance gene which is a selectable marker gene, was incorporated into a part of the exon of the target gene encoding the novel collectin mouse homologue of the present invention in ES cells derived from C57BL / 6J strain mice, and targeting was performed. Build DNA for use.
  • electroporation of this DNA into ES cells is performed as follows. Replace the exponentially growing ES cells (90-band petri dish) with fresh ES medium (80% DMEM medium containing 20% FCS, ImM pyruvate solution, 0. ImM non-essential amino acid solution and ImM 2-mercaptoethanol).
  • Germ-line chimera mice are prepared by a sandwich method in which two 2.5-day embryos (8-cell embryos) of mice prepared with the ES cell mass into which the gene has been introduced are prepared as follows.
  • BWW- Hepes medium ring 2. 5 days embryos (8-cell embryo and morula) were collected, embryos were transferred to a drop of BWW medium, C0 2 incubator (5 ° / o C0 2, 37 ° C ) are cultured in. Collect the eggs and transfer the embryos to a drop of acidic Tyrode's solution (200 ⁇ ) for 1 to 2 minutes. Immediately wash with BWW-Hepes medium 6 times and use for adhesion to ES cells.
  • ES cells Preparation of ES cells is performed as follows. On the day of the adhesion, the ES cells cultured on the feeder cells were washed twice with PBS (-). / 0 Trypsin solution is allowed to act for 2 minutes, and is stripped from the Petri dish so as to form tens of cells. Add ES medium (-G4I8) to inactivate trypsin, centrifuge, and suspend in ES medium. 0.1% gelatin were seeded coated Petri dish, allowed to stand in 15 minutes C0 2 Inkyube one coater. The cells that do not adhere to the petri dish are collected and used for the production of an assembly chimera.
  • Adhesion of the 5-day embryo and ES cells is performed as follows. First, make a small hole with a dollar on the bottom of the dish for cultivating bacteria. Cover the hole with a 20 // 1 drop of BWW medium and cover with mineral oil. Placed in a C0 2 ink Yubeta one, previously equilibrated medium to this condition, a good shape under a stereoscopic microscope, sorting ES cell mass consisting of 10 to 20. Put the ES cell mass one by one into the hole created earlier. 2. Remove the zona pellucida and insert two 5 day embryos into the wells to adhere to the ES cell mass.
  • the present invention provides a novel collectin having a structure characteristic of a collectin, which has been confirmed to have antibacterial and antiviral activities, and different from the conventionally reported collectins and a gene encoding the same.
  • the sequence information obtained by the present invention is useful for elucidating a biological defense mechanism, and can provide a drug and a tool for an experiment using a biological activity of a novel collectin.
  • a vector capable of expressing the novel collectin, a host cell capable of expressing the vector, an antibody against the novel collectin, and a probe for screening a novel collectin-related molecular species are provided.
  • a novel transgenic non-human animal and a knockout non-human animal are provided by the present invention.

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Description

新規コ 〔技術分野〕
本発明は、 生体防御機構の解明に有用であり、 また抗ウィルス活性な どを含む生理活性を有する明ことが期待され、 医薬品用途への応用が可能 であると考えられる、 新規コ レクチンに関する。 〔背景技術〕 書
コレクチンは、 C a 2 +要求性の糖認識構造様領域 （CRD) 及びコラー ゲン様領域を有するタンパク質の総称であり、 細菌、 ウィルスを始め様 々な微生物に対する基礎免疫に関与していると考えられている。
これまでに見出されているコレクチンとして、 マンナン結合タンパク 質 （MBP) 、 サーファクタン トタンパク質 A (SP-A) およびサ一ファタ タントタンパク質 D (SP-D) 、 コングルチニンなどを挙げることができ る。 これらのコ レクチンは、 図 1 ( a ) に示すような、 （ 1 ) C a 2 +要 求性の糖認識構造様領域 （CRD) 、 及び （2 ) コラーゲン様領域の特徴 的な領域を含む基本構造から構成されていることが知られており 〔Malhortraら、 ョ一ロピアン ' ジャーナル ' ォブ ' ィムノロジ一
(Eur. J. Immuno l. ) 、 22卷、 1437〜1445頁、 1992年〕 、 この基本構造 3 個がコラーゲン様領域においてトリプルヘリ ックスを構成することによ りサブユニッ トを形成し、 さらにこのサブユニッ トが 3量体、 4量体、 6量体等のオリゴマー構造を形成している。
脊椎動物では、 細胞を介する免疫応答および特異的抗体反応によるメ 力ニズムが、 病原菌、 ウィルスなどの侵入に対する最大の生体防御シス テムと考えられている。 最近になって、 コングルチニン等のレクチンに よる非特異的な免疫応答への関与が示唆され、 例えば、 母親の移行抗体 や特異的防御システムが充分に発達していない小児に対し、 種々の微生 物の中和作用や排除に重要な役割を果たしているとの報告がなされてい る CSuperら、 ランセッ ト (Lancet) 、 2卷、 1236〜1239頁、 1989年〕 。 さらに、 宿主の生体防御におけるこれらレクチンの役割について、 例え ば、 MBPの遺伝子上の変異に起因した MBPの血中濃度の低下によって、 宿 主が感染を受けやすくなるという研究結果が報告されている 〔Sumi yaら 、 ランセッ ト、 337巻、 1569〜1570頁、 1991年〕 。
本発明者らのグループは、 以前に、 コングルチニンおよびマンナン結 合タンパク質が、 HIおよび H3タイプのィンフルェンザ Aウィルスの感染 や赤血球凝集活性を阻害することを見出した 〔Wakami yaら、 グライココ ンジュゲイ ト . ジャーナル (Gl ycoconjugate J. ) 、 8卷、 235頁、 1991年； Wakamiyaら、 バイオケミカル ' アン ド 'バイオフィジカル · リ サ1 ~~チ ' コ ュニグイシヨンズ (Bi ochem. Bi ophys. Res. Comm. ) 、 187卷、 1270〜1278頁、 1992年〕 。
その後さらに、 コングルチニンをコ一ドする c D N Aクローンを取得 し、 コングルチニンと種々のサ一ファクタントタンパク質 D遺伝子との 間の強い関連性も見出されている [Suzukiら、 バイオケミカル 'アンド ·バイオフィジカル · リサ一チ · コミュニケィションズ、 191巻、 335〜 342頁、 1993年〕
このように、 コレクチンは、 生体防御機構の解明における有用性及び 生理活性医薬物質としての有用性などが期待される物質であり、 このフ ァミリーに属する新規分子種の発見は、 感染症の治療の他種々の医療分 野 そして生物学の分野にも寄与するところ大である。 P T/JP99/04552
〔発明の開示〕
本発明は、 かかる現状に鑑みてなされたものであり、 特にヒ 卜の体内 で抗細菌、 抗ウィルス活性などの生理活性を発揮することが期待される 新規コレクチンを得ることを目的とするものである c
すなわち、 本発明は、
[ 1] 配列番号： 2の第 206〜547位で示されるアミノ酸配列からなるタン パク質をコ一ドする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
[2] 配列番号： 2の第 229〜547位で示されるアミノ酸配列からなるタン パク質をコ一ドする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
[3] 配列番号： 1の第 670〜1695位で示される塩基配列を含むポリヌク レオチド、
[4] 配列番号： 1の第 739〜1695位で示される塩基配列を含むポリヌク レオチド、
[5] 配列番号： 4及び配列番号： 5で示される塩基配列を有するプライ マ一を用いて行った P C R反応の増幅産物であるプローブと、 ス トリン ジェントな条件下でハイブリダィズすることができ、 且つコレクチンを コードするポリヌクレオチド、
[6] [ 1 ]乃至 [5]に記載のポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件下 でハイブリダイズでき、 該ポリヌクレオチドによってコ一ドされるタン パク質が、 （ 1 ) C a 要求性の糖認識構造様領域 （CRD) 、 及び （2 ) コラーゲン様領域を含む、 ヒ トコレクチンであるポリヌク レオチド、 [7] [3]乃至 [6]に記載のポリヌクレオチドによってコ一ドされる新規コ
[8] 配列番号： 2の第 206〜547位で示されるアミノ酸配列を含む新規コ
[9] 配列番号： 2の第 229〜547位で示されるアミノ酸配列を含む新規コ [ 10] [7]乃至 [9]のいずれかに記載の新規コレクチンのァミノ酸配列に おいて、 1または複数のアミノ酸が欠失、 置換及びノまたは付加された アミノ酸配列からなり、 且つ、 （1 ) C a 要求性の糖認識構造様領域 (CRD) 、 及び （2 ) コラーゲン様領域を含む、 新規コレクチンをその 要旨とし、
コ レクチンに特徴的な構造を有し、 従来報告されているものとは異なる 新規のコレクチン遺伝子及びタンパク質を提供するものである。
〔図面の簡単な説明〕
第 1図は、 従来報告されている主なコレクチンの基本構造及びタンパ ク質の概観を示す図である。
第 2図は、 従来報告されている 3種のコレクチンのアミノ酸配列のァ ラインメントの前半部分を示す図である。
第 3図は、 第 2図と同様のアラインメン トの後半部分を示す図である 第 4図 （b ) は、 本発明の新規コ レクチンの塩基配列を決定するため に使用した各プライマーの名称と、 シーケンサ一により読み取られた塩 基配列を示す図であり、 第 4図 （a ) は、 得られた新規コレクチンの 0RFを示す図である。
第 5図は、 従来報告されている 3種のコレクチンと、 本発明の新規コ レクチンのアミノ酸配列のァラインメントの前半部分を示す図である。 第 6図は、 第 5図と同様のァラインメン卜の後半部分を示す図である 第 7図は、 本発明の新規コレクチンのゲノ ミックサザン分析の結果を 示す図である。 各レーンで使用された制限酵素は、 （1 ) EcoR I、 JP99/04552
5
(2) Xba I、 (3) Hind III、 (4 ) Pst I、 （5) Bgl Π及び （6) Bam HIである。
第 8図は、 本発明の新規コレクチンの臓器分布を示す、 ヒ トの種々の 組織、 すなわち、 1 ) 脳、 （2) 心臓、 （3) 腎臓、 （4) 脾臓、
(5) 肝臓、 （6) 小腸、 （7) 筋組織、 （8) 精巣、 （9) 胎盤、 ま たは （ 1 0) 大腸における mRNAの発現分布の分析結果を示す図であ る。
第 9図は、 本発明の新規コレクチンの種間での保存性を示す、 種々の 脊椎動物、 すなわち、 （ 1 ) ヒ ト、 （2) サル、 （3) ラッ ト、 （4) マウス、 （5) ィヌ、 （6) ゥシ、 （7) ゥサギ及び （8) ニヮ トリに おけるゲノミックサザン分析の結果を示す図である。
第 1 0図は、 種々のコレクチンの遺伝的系統樹を示す図である。
第 1 1図は、 本発明の新規コレクチンを発現するべクタ一の構造を示 す模式図である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
如上の本発明において、 前記ポリヌク レオチド [1]〜(： 6]は、 好ましく は c D N Aである。
上記 [2]に示されるポリヌク レオチドは、 少なくとも配列番号： 2の 第 229〜547位で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコ一ドする 塩基配列を含むが、 第一メチォニン残基の上流に、 さらなる塩基配列、 例えば、 配列番号： 2の第 226〜228位もしくは第 21i〜228位、 または配 列番号： 2の第 102〜228位、 第 91〜228位、 第 9〜228位、 第 1〜228位な どのァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含みうる ものである。
また、 上記 [4]に示されるポリヌクレオチドは、 塩基配列の 5'上流に 配列番号： 1の第 730〜738位もしくは第 685〜738位、 または第 358〜738 位、 第 325〜738位、 第 79〜738位、 第 55〜738位もしくは第 1〜738位で示 される塩基配列をさらに含みうる。
さらに、 上記 [3]または [4]に示されるポリヌクレオチドはの 3'下流に は、 配列番号： 1の第 1696〜2024位で示される塩基配列をさらに含みう ο o
なお、 本発明の上記タンパク質 [7]〜[ 10]はヒ ト由来であることが、 ヒ トの体内で抗細菌、 ウィルス活性などを発揮できることが期待され、 生理活性医薬物質としての有用性に鑑みて好ましい。 従って、 本発明の タンパク質は、 ヒ ト由来の新規コレクチンを企図するものであり、 様々 なヒ ト生体組織を検討したところ、 有用と考えられる新規コレクチンが ヒ ト胎盤等に発現されていることが示された。
そして、 上記 [9]に示される新規コレクチンは、 少なく とも配列番号 ： 2の第 229〜547位で示されるアミノ酸配列を含むものであるが、 その 第一メチォニン残基の上流に、 例えば、 配列番号： 2の第 226〜228位も しくは第 211〜228位、 または配列番号： 2の第 102〜228位、 第 91〜228 位、 第 9〜228位、 第 1〜228位などのアミノ酸配列をさらに含みうるもの である。
上記 [5]または [6]におけるス トリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件としては、 例えば、 5 X SSC (20 X SSC (3 M NaCl、 0. 3 Mクェン 酸ナトリウム） を 4倍希釈することにより 5 X SSCを調製） 、 1 °/。ブロッ キング剤 （ベーリンガー ' マンハイム社製） 、 0· 1 % N-ラウロイルサル コシン、 0. 02% SDSの溶液中で、 68°Cにて 1時間プレハイブリダイゼ一 シヨン ； c D N Aプロ一ブ （10 ng/ml ) を含む 5 x SSC、 1 %ブロッキン グ剤、 0. 1 % N-ラウロイルサルコシン、 0. 02 % SDSの溶液中で、 55°Cに て 16時間ハイブリダィゼーシヨン ： 2 X SSC/ 0. 1 % SDS溶液で 5分間 2回 洗浄； 55°Cにて、 0. δ X SSC/0. 1 % SDS溶液で 15分間 2回洗浄を行う一連 の処理工程を含むハイブリダィゼ一シヨンが含まれるが、 当該技術分野 における知識に基づき、 溶液濃度や温度、 時間等の条件を適宜に変更す ることができる。
そして、 上記 [ 10]における、 1または複数のアミノ酸の欠失、 置換及 び Zまたは付加とは、 新規コレクチンの親水性 '疎水性、 酸性 '塩基性 、 含有基などに大幅な変化をきたさず、 （ 1 ) C a 要求性の糖認識構 造様領域 （CRD) 及び （2 ) コラーゲン様領域の有する各々の特徴を変 えることが少ない範囲でのアミノ酸の欠失、 置換及び または付加を称 する。 これまでに報告されているコレクチンフアミ リ一のタンパク質の アミノ酸配列とその構造に基づき、 例えば （ 1 ) C a 2 +要求性の糖認識 構造様領域 （CRD) において 1〜10程度、 （2 ) コラーゲン様領域にお いて 1〜100程度、 好ましくは 1〜15のアミノ酸の欠失、 置換及びノま たは付加が許容されると考えられる。
本発明はまた、 上記のポリヌク レオチドを、 新規コレクチンの発現を 許容するように含むベクターを提供する。
このポリヌク レオチ ドが揷入されるベクターは、 プラスミ ド、 えファ —ジ、 コス ミ ド等のようなレブリコンに、 上記新規コレクチンにかかる ポリヌクレオチドを組み込んで、 新規コレクチンが複製 ·発現されるよ うにしたものを言う。 例えば、 コスミ ドよりもさらに長い D N A断片を クロ一エングできるベクタ一として、 Piファージ、 F因子および酵母の 人工染色体 YAC等がある。 また、 えファ一ジには置換型べクタ一および 挿入型べクタ一が含まれ、 これらは導入する遺伝子の長さに応じて適宜 選択することができる。 また、 例えば動物細胞発現可能なベクターとし て公知のものに、 SV40系ベクター、 ゥシパピローマウィルスベクタ一、 へノレぺスゥイノレスべクタ一、 アデノ ウイノレスべクタ—、 ボックスウィル スベクタ—、 レトロウイルスベクタ一等がある- 市販されているものと しては、 pUC19、 pTVH SN (寳酒造社製） 、 ρϋΕΧ2 (アマシャム製） 、 pGEX- 4Τ、 ρΚΚ233-2 (フアルマシア社製） 、 pMAM- neo (クロンテック社 製） 、 pGL2 (プロメガ社製） 、 pDNA3. 1+ (ィンビトロジニン社製） 等が 挙げられる。 かかるベクタ一の構築方法は、 特に限定されるものではな く常法により制限酵素、 リガ一ゼ等を利用して行うことができる。 上記ベクターが形質転換またはトランスフエク トされる宿主細胞とし て細菌、 特に大腸菌を使用する場合には、 ベクターは普通少なく ともプ 口モータ一領域 （プロモータ一、 オペレータ一及びシャインダルガ一 ノ配列を含む） 、 開始コ ドン、 新規コレクチンをコードする塩基配列、 終始コ ドン、 ターミネータ一領域等から構成される。 酵母または動物細 胞を宿主として用いる場合、 ベクターは、 少なく ともプロモータ一、 開 始コ ドン、 シグナルペプチド、 新規コレクチンをコードする塩基配列及 び終始コ ドンを含むことが好ましい。 また、 ェンハンサー配列、 新規コ レクチンの 5' -及び 3' -非翻訳領域、 スプライシング接合部、 ポリアデニ レ一ション部位及び選択マーカーをべクタ一に挿入することもできる。 本発明のべクタ一に組み込まれるプロモーターとしては、 従来よりよ く知られている SV40 (Si mian Virus 40)、 SR a、 サイ トメガロウィルス (CMV) プロモーター、 ァクチンプロモータ一、 ウィルス性し TR (Long Terminal Repeat) 、 例えば HTLV- 1 LTR、 HI V-LTR, ラウス肉芽種ウィル ス LTR、 単純ヘルぺスチ口シンキナーゼウィルスプロモータ一等の強力 なプロモータ一、 弱いプロモーターに関わらず使用できる。
真核細胞において、 線維芽細胞、 神経細胞、 血液細胞および実質細胞 等の正常細胞から、 癌細胞に至る多くの細胞種に発現を期待する場合、 一般的なプロモータ一としては、 サイ トメガロウィルス、 チミジンキナ —ゼ （TK) 、 3—ァクチンおよび SV40初期遺伝子プロモータ一等が挙げ られる。 ェンハンサ一は通常、 プロモーター配列とセッ トになっている のでそのまま利用することができる。
また、 遺伝子を導入し発現させる細胞および組織が特定されている場 合には、 細胞に特異的なプロモーターを選択することができる。 さらに 、 これらプロモーターをホモあるいはヘテロに組合せることにより、 高 発現が期待でき、 安定に新規コレクチンが得られるという効果が奏され る場合がある
一方、 原核細胞において使用されるプロモ一ターとして、 PBAD、 PL, trc、 T 7、 SP 6、 Τ 3、 l ac等がある。
主として、 これらの原核細胞由来の細胞内で新規コレクチンを高発現 させることができるプロモーターは宿主に適合する限り、 本発明のプロ モータ一として適宜選択して用いることができる。 また、 遺伝子を導入 し発現させる細胞および組織が特定されてレ、る場合には細胞に特異的な プロモータ一を選択することができる。 さらに、 これらプロモーターを ホモあるいはヘテロに組合せることにより、 さらに高発現が期待でき、 安定に新規コレクチンが得られるという効果が奏される場合がある。 一方、 酵母において使用されるプロモータ一としては、 GAL1、 A0X1、 CUPK PGK等がある。
上記べクタ一に組み込み、 目的とするベクタ一のみを回収するための 選択マ一カーとしては、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下 DHFRと略す） 遺伝 子 （メ ト トレキサ一ト耐性遺伝子） 、 neo遺伝子 （G418耐性遺伝子） 等 が挙げられ、 例えば、 DHFR遺伝子が欠損している CH0細胞を用いて、 DHFR遺伝子を選択マ一力一として使用する場合、 チミジンを含まない培 地によっても選択できる。 また、 メ ト トレキサ一卜の濃度を上げて培養 し、 耐性細胞を選択することにより遺伝子を細胞內で発現させ、 さらに 高発現の細胞株を得ることもできる。
本発明は、 この様に構築されたベクターで形質転換またはトランスフ ュク 卜された宿主細胞、 例えば、 動物細胞、 昆虫細胞および微生物細胞 (大腸菌、 枯草菌、 酵母等） で、 新規コレクチンを発現することができ る宿主細胞も企図するものである。
本発明の宿主細胞たる動物細胞としては、 ヒ ト由来の細胞が挙げられ るが特に限定されるものでない。 例えば、 CH0細胞、 COS細胞、 BHK細胞 、 Vero細胞、 ミニローマ細胞、 HEK293細胞、 HeLa細胞、 Jurkat細胞、 マ ウス L 細胞、 マウス C127細胞、 マウス FM3A細胞、 マウス繊維芽細胞、 骨 芽細胞、 軟骨細胞等がある。 また、 微生物細胞としては、 例えば大腸菌 および枯草菌等の細菌類ならびにサッカロマイセス ·セレピシェおよび 麦酒酵母等の酵母類等が含まれる。
また本発明によって、 上記ポリヌクレオチドまたはその断片を含む、 新規コレクチン関連分子種をスク リ一ユングするためのプローブが提供 される。 新規コレクチン関連分子種とは、 図 1に示したような特徴的な 構造を有し、 図 1 0に示す既知コ レクチンに包含されない新規コ レクチ ンの分子種を言う。 本発明のプローブを用いて、 種々の生物の組織細胞 等から得た遺伝子との間のハイプリッ ド形成能を調べ、 比較的ス トリン ジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子を探索する ことによって目的とする新規コレクチン関連分子種をコードする遺伝子 をスクリーユングし、 これを発現することにより新規コレクチン関連分 子種を取得することが可能となる。 上記ポリペプチドの断片のうち、 糖 認識構造様領域を含む配列番号： 1の第 1291〜1698位の配列のうち少な く とも連続 1 0塩基以上、 好ましくは連続 2 0塩基以上の塩基配列から なるもの、 またはコラーゲン様領域を含む配列番号： 1の第 796〜1236 位の配列のうち少なく とも連続 1 0塩基以上、 好ましくは連続 2◦塩基 以上の塩基配列からなるものが、 特異性の点からプローブを構成するポ リヌクレオチドとして有用である。 本発明はまた、 本発明によって得られた新規コレクチン及び または 由来分子を認識する抗体を提供する。 本明細書で言う由来分子とは、 新 規コレクチンと同様の特徴を有する断片 （例えば、 糖鎖認識部位及び Z またはコラーゲン領域を含む断片） 、 新規コレクチンの前駆体及びそれ らをコ一ドする核酸配列及び/またはその相補的な核酸配列とス トリジ ェン卜な条件下にてハイブリダイズすることができる核酸によってコ一 ドされるアミノ酸配列からなるポリぺプチド等が含有される。
新規コレクチン及び Zまたは由来分子に対する抗体 （例えばポリク口 —ナル抗体、 モノクローナル抗体、 ペプチド抗体） または抗血清は、 本 発明の新規コレクチン及び または由来分子あるいはそれらを含む融合 タンパク質等を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造 法に従って製造することができる。 すなわち、 本発明の新規コレクチン 及び もしくは由来分子またはそれらを含む融合タンパク質を抗原とし て、 投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体または希釈剤、 担体と 共に温血動物に対して投与される。 投与に際して抗体産生を高めるため に、 完全フロイン トアジュバントゃ不完全フロイン トアジュバン トを投 与しても良い。 投与は通常 1〜6週毎に 1回づつ、 計 2〜1 0回程度行 われる。 用いられる温血動物としては、 例えばサル、 ゥサギ、 ィヌ、 モ ルモッ ト、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮ トリ等が挙げられるが 、 マウス及びラッ トが好ましくは用いられる。 ラッ 卜には W i s t a r 及び S D系ラッ ト等が好ましく、 マウスには B A L B / c、 C 5 7 B L / 6及び I C R系マウス等が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温 血動物、 例えばマウスから抗体価の認められる個体を選択し、 最終免疫 の 2〜5 日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産 生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生 ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば後記の標識化新規コ レクチンまたは新規コレクチンと抗血清とを 反応させた後、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなさ れる- 融合操作は既知の方法、 例えばケ一ラーとミルスタインの方法 (Nature, 256, 495, 1975) やその変法 (J. Immunol. Method, 39,
285, 1980、 Eur. J. Biochem. , 118, 437, 1981、 Nature, 285, 446, 1980) に従い実施できる。 融合促進剤としてはポリエチレングリコール (P EG) やセンダイウィルス等が挙げられるが、 好ましくは P EGが 用いられる。 さらに融合効率を高めるために、 適宜レクチン、 ポリ一 L 一リジンもしくは DMS Oを添加することもできる。
骨髄腫細胞としては例えば X— 63 A g 8、 NS_ 1、 P 3 U 1、 S P 2/0、 A P— 1細胞等が挙げられる力' 好ましくは S P 2/0細 胞が用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞 数との好ましい比率は 1 ： 20〜20 ： 1であり、 P EG (好ましくは P EG 1 000〜P EG 6000) を 1 0〜 80 %程度の濃度で添加し 、 20〜40°C、 好ましくは 30〜 3 7 で 1〜 1 0分間ィンキュベ一 卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。 新規コレクチン及び ノまたは由来分子に対する抗体を産生するハイプリ ド一マのスクリー二 ングには種々の方法が使用できるが、 例えば、 新規コレクチン抗原を直 接または担体と共に吸着させた固相 （例えば、 マイクロブレート） にハ イブリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した 抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗 マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロティン Aを加え、 固相に結合した抗新規コレクチン抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリ ン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清 を添加し、 放射性物質や酵素等で標識した新規コレクチンを加え、 固相 に結合した抗新規コレクチンモノクローナル抗体を検出する方法等が挙 げられる。
新規コレクチン及び または由来分子に対するモノク口一ナル抗体の 選別及びクローニングは、 自体公知またはそれに準じる方法に従って行 うことができる。 通常 H A T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン及びチ ミジン） を添加した動物細胞用選択培地で行われる。 選別、 クロ一ニン グ及び育種用培地としては、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばど のような培地を用いても良い。 例えば、 1 〜 2 0 °/0、 好ましくは 1 0 〜 2 0。/。の牛胎児血清を含む R P M I培地、 1 〜 1 0。/。の牛胎児血清を含 む G I T培地、 またはハイプリ ドーマ培養用無血清培地等を用いること ができる。 培養温度は、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭 酸ガスを含む空気の存在下で行われる。 ハイブリ ドーマ培養上清の抗体 価は、 上記の抗血清中の抗新規コレクチン抗体価の測定と同様にして測 定できる。 すなわち、 測定方法としてはラジオィムノアッセィ （R I A ) 法、 酵素免疫測定法 （E L I S A ) 法、 F I A (蛍光ィムノアッセィ ) 法、 プラーク測定法、 凝集反応法等を用いることができるが、 以下に 示すような E L I S A法が好ましい。
免疫抗原と同様の操作で調製したタンパク質を E L I S Aプレー卜の 各ゥエルの表面に固定化する。 次に、 非特異的吸着を防止する目的で、 B S A (ゥシ血清アルブミン） 、 iM S A (マウス血清アルブミン） 、 O V A (オボアルブミン） 、 ゼラチンもしくはスキムミルク等を各ゥェ ルに固定化する。 この各ゥエルにハイブリ ドーマ培養上清液を添加し、 一定時間放置し免疫反応を行わせる。 P B S (リン酸緩衝性生理食塩水 ) 等を洗浄液として各ゥエルを洗浄する。 この洗浄液中には界面活性剤 を添加することが好ましい。 酵素標識二次抗体を添加し一定時間放置す る。 標識酵素としては、 —ガラク トシダ一ゼ、 アルカリフォスファタ ーゼ、 ペルォキシダ一ゼ等を用いることができる。 同じ洗浄液で各ゥェ ルを洗浄後、 使用した標識酵素の基質溶液を添加し酵素反応を行わせる 。 添加したハイプリ ドーマ培養上清液中に目的とする抗体が存在する場 合は酵素反応が進行し基質溶液の色が変化する。
クローニングは、 通常半固体ァガ一法や限界希釈法等のそれ自体公知 の方法で行うことができ、 具体的には前記の方法で目的とする抗体を産 生するゥエルを確認した後、 クローニングを行いシングルクローンを得 る。 クローニング法としては、 培養ブレート 丄 ゥエル当たりに 1個のコ ロニーが形成するようにハイブリ ドーマ細胞を希釈して培養する限界希 釈法等を用いると良い。 限界希釈法によるクロ一ニングには、 コロニー 形成能を高めるために支持細胞を用レ、る力 、 インターロイキン 6などの 細胞増殖因子を添加しても良い。 その他、 F A C S (蛍光標示式細胞分 取器） 及びシングルセルマ二プレーション法を用いてクローニングする ことができる。 クローン化されたハイブリ ド一マを、 好ましくは無血清 培地中で培養し、 至適量の抗体をその上清に加える。 この様にして得ら れた単一のハイプリ ドーマは、 フラスコや細胞培養装置を用いて大量培 養を行う力 、 動物の腹腔内で培養する (J. Immunol. Meth. , 53， 313， 1982) ことにより、 モノクローナル抗体を得ることができる。 フラスコ 内で培養を行う場合は、 0〜 2 0 %の 〇 3 (胎児ゥシ血清） を含む細 胞培養用培地 （IMDM、 DME , RPMI 1 6 4 0及び MEM等） を用いて行うこ とができる。 動物の腹腔内で培養する場合は、 細胞融合に使用した骨髄 腫細胞の由来となった動物と同種、' 同系統の動物または胸腺欠損ヌード マウス等を使用することが好ましく、 予めプリスタン等の鉱物油を投与 してからハイプリ ドーマを移植する。 1〜 2週間後腹腔内に骨髄腫細胞 が増殖し、 モノクローナル抗 ί本を含む腹水を得ることができる。 本発明によるモノクローナル抗体は、 新規コレクチン及び/または由 来分子に特異的なェピトープを認識するものを選択することによって、 他のタンパク質と交差しないものとすることができる。 一般的にそのタ ンパク質を構成するアミノ酸配列の中から、 連続する少なく とも 3以上 のアミノ酸残基、 望ましくは 7〜2 0アミノ酸のアミノ酸配列によって 提示されるェピト一プは、 そのタンパク質に固有のェピトープを示すと 言われている。 従って、 新規コ レクチン及びノまたは由来分子のいずれ かに記載されたァミノ酸から選択され、 かつ連続する少なくとも 3アミ ノ酸残基から成るアミノ酸配列を持つぺプチドによって構成されるェピ トープを認識するモノクローナル抗体は、 本発明における新規コ レクチ ン及び/ ^または由来分子特異的なモノクローナル抗体といえる。 新規コ レクチン及び Zまたは由来分子に記載されたァミノ酸配列の間で保存さ れたァミノ酸配列を選べば、 新規コレクチンファミ リ一に共通のェピト ープを選択することができる。 あるいは各配列に特異的なァミノ酸配列 を含む領域であれば、 それぞれのタンパク質の識別が可能なモノクロ一 ナル抗体を選択することができる。
新規コレクチン及びノまたは由来分子に対するモノクローナル抗体の 分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブ リンの分離精製法に従って行うことができる。 公知の精製法としては、 例えば、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 硫安 沈殿法、 イオン交換体 （例えば D E A E (ジェチルアミノエチル） セフ ァロース等） による吸脱着法、 超遠心法、 ゲル濾過法、 抗原結合固相ま たはプロティン Aもしくはプロテ ン G等の活性吸着剤により抗体のみ を採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を施 すことができる。 精製過程において凝集物の形成や抗体価の低下を防止 する目的で、 例えばヒ ト血清アルブミンを◦ . 0 5〜2 %の濃度で添加 する。 その他、 グリシン、 α —ァラニン等のアミノ酸類、 特にリジン、 アルギニン及びヒスチジン等の塩基性ァミノ酸、 ダルコ一スゃマンニト ール等の糖類または塩化ナトリゥム等の塩類を添加しても良い。 I g M 抗体の場合、 特に凝集しやすいことが知られているため、 —プロピオ ニラク トン及び無水酢酸で処理しても良い。
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる 方法に従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗 原） 自体、 あるいはそれとキャリア一タンパク質との複合体を作り、 上 記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、 該免 疫動物から本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体含有物を採 取して、 抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。 温血 動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリア一タンパク質との 複合体に関し、 キヤリァータンパク質の種類及びキヤリァ一とハプテン との混合比は、 キヤリァ一に架橋させて免役したハプテンに対し て抗体が効率よくできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させて も良いが、 例えばゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシ ァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 1 〜 5の割合でカップリングさせる方法が用いられる。 また、 ハプテン とキヤリァ一の力ップリングには、 種々の縮合剤を用いることができる 力；、 グルタルアルデヒ ドやカルボジイミ ド、 マレイミ ド活性エステル、 チォ一ル基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬などが用い られる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそ れ自体あるいは担体、 希釈剤と共に投与される。 投与に際して抗体産生 能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジ ュバントを投与しても良い。 投与は、 通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行われる。 ポリクロ一ナル抗体は上記の方法で免役され た温血動物の血液、 腹水等、 好ましくは血液から採取することができる 。 抗血清中のボリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記血清中の抗体価の測 定と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記の モノク口一ナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に 従って行うことができる。
また、 新規コレクチン及び/または由来分子とその他のタンパク質ま たはポリぺプチド断片とを含む融合タンパク質を免疫原として用いるこ とによって抗 ί本を調製することができる。 係る融合タンパク質を構成す る、 その他のタンパク質またはポリペプチド断片として、 特に G S T ( グルタチオン- S-トランスフェラ一ゼ） が好適であるが、 他にも、 ポリ ヒスチジン （好ましくは 6個のヒスチジン） 、 カルモジュリン結合ぺプ チド （C B P ) 、 プロテイン Α等を用いてもよい。
尚、 ポリヒスチジンを用いた場合、 遺伝子組換え法にて発現させた融 合タンパク質を単離精製するためには、 ニッケルキレ一ティング樹脂へ の吸着を利用することができ、 p H変動の他、 E D T Aまたはイミダゾ —ル物質を添加することによって当該樹脂から解離することができる。 C B Pを用いた場合、 発現させた融合タンパク質はカルモジュリンァフ ィニティ一樹脂を用いてァフィ二ティークロマトグラフィ一を行い、 そ の後 E G T Aを加えることにより当該樹脂から解離することができる。 また、 プロテイン Aを用いた場合、 発現させた融合タンパク質は ί g G セファロ一ス （例えば、 I g Gセファロ一ス 6 F F ) カラムを使用した ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一を行い、 その後 p H変動によって当 該樹脂から解離することができる。
さらに前記融合タンパク質を構成するタンパク質またはポリべプチド 断片の別の例として、 Xpress , Thioredoxin , c-tnyc、 V5及び HA/c - myc等 を挙げることができ、 これらをェピト一プとして認識することができる 抗体を用いて、 目的とする新規コレクチンとの融合タンパク質を発現し た後に抗原一抗体ァフィ二ティ一カラムにより単離 ·精製することがで さる。
このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノク口一ナル抗 (本 を取得する場合、 抗体のスク リーニングには新規コレクチンを用いても よいが、 免疫原として用いた融合タンパク質でスク リーニングを実施す ることが選択性の点で好ましい。
好ましい免疫原である G S Tと新規コレクチン及びノまたは由来分子 を含む融合タンパク質は、 G S T遺伝子のコード領域ならびに新規コレ クチン及び Zまたは由来分子のコ一ド領域を含む発現ベクターを形質転 換またはトランスフエク トした大腸菌または動物細胞を培養し、 その培 養液及び または菌体から融合タンパク質を単離することによって好適 に製造することができる。 さらにこう して得られた融合タンパク質は、 グルタチオンを有する担体、 例えば、 ダルタチオンセファロ一スビーズ へのァフィ二ティ一によって精製されたものであるとよく、 当該グルタ チオンセファロ一スビーズからの融合タンパク質の溶出方法は公知の方 法によって行うことができる。 こうして、 目的の免疫原として好ましい 精製された融合タンパク質を、 得ることができる。
このような融合タンパク質を免疫原として用いてモノクローナル抗体 を調製する方法において、 抗体のスクリーニングには新規コレクチン及 び zまたは由来分子を用いてもよいが、 免疫原として用いた融合タンパ ク質でスクリーニングを実施することが選択性の点で好ましい。
新規コレクチン及び zまたは由来分子に対するモノクローナル抗体及 びポリクロ一ナル抗体は、 新規コレクチンに関連する疾病の診断や治療 に利用することが可能である。 なお、 抗体を特にヒ トに投与することが 意図される場合、 ヒ ト化抗体もしくはキメラ抗体等のヒ トに対して免疫 原性を有さないあるいは極力抑えた抗体を用いるのが好ましい。 マウス モノクローナル抗体をヒ 卜の体内に投与すると、 ヒ トにとっては異種タ ンパクであるので種々の副作用が起こる危険性がある。 そこで、 ヒ トモ ノクローナル抗体が望ましいが、 融合効率が悪くまた抗体産生が安定な ハイブリ ド一マを得ることは難しかった。 しかし、 現在技術は進歩しヒ トモノクローナル抗体またはキメラ抗体を作製することが可能となって レヽる。
キメラ抗体とはマウス抗体とヒ ト抗体のキメラ分子をいう。 ヒ トに任 意の抗原を免疫して抗体を製造することは倫理上不可能である。 ゆえに 、 マウスに免疫し、 そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と 結合する抗体可変部 （V領域） を切り出し、 ヒ ト骨髄腫由来の抗体定常 部 （C領域） 遺伝子と結合してキメラ遺伝子を作製する。 このキメラ遺 伝子を宿主細胞で発現させれば、 ヒ ト 'マウス 'モノクロ一ナル抗体が 産生できる。 キメラ抗体はヒ トに対する抗原性が少ないため、 ヒ ト体内 に投与する治療用や画像診断用モノクローナル抗体等として利用できる 。 公知のキメラ抗体の関連技術として、 特開平 0 5— 3 0 4 9 8 9号、 特開平 0 4— 3 3 0 2 9 5号、 W09106649、 特開昭 6 3— 0 3 6 7 8 6 号、 特公平 0 6— 9 8 0 2 1号に記載の発明等がある。
しかし、 最近キメラ抗体よりも有用であるといわれるヒ ト化抗体が開 発された。 ヒ ト化抗体とは抗体分子の抗原結合部位 （CDR : Comp l ementary determining region, 相補性決定領域） の遺伝子配列のみをヒ ト抗 体遺伝子に移植 （CDRグラフティング） し、 抗体分子の CDRを除いた全分 子をヒ ト化した抗体である。 本抗体はヒ ト 'マウス 'キメラ抗体より、 マウスの抗体部分が少ないため、 抗原性が少なく安全性が高いと言われ ている。 我が国では現在、 成人性 T細胞白血病に対するヒ 卜化抗体の臨 床試験が行われている。 ヒ ト化抗体の製造方法及びその関連技術につい ては、 米国 Genentech社（W09222653、 W098 332、 W09404679 , W09S37200 、 W09404679) 及び英国 Cel l tech社 (W0942945 U W0942935 U W09413805 、 W0930623 W09201059、 W091 16927 , W091 16928, W09109967 ,
W08901974, W08901783) 等の特許出願がある：
ヒ トモノクローナル抗体の作製方法には細胞融合法以外にも、 ェプス タイン .バール （Epste in- Barr) ウィルス （EBV) で形質転換する方法 、 さらにはその形質転換した細胞を親細胞と融合させる方法、 遺伝子ェ 学を利用しキメラ抗体、 ヒ ト化抗体を作製する方法などがある。 キメラ 抗体とは異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片をつなげて作製された 抗体であり、 ヒ ト化抗体とはマウスなどにヒ トにとつて異種の抗体を改 変して、 H鎖と L鎖の相補性決定部 （CDR) 以外の一次構造をヒ トの抗 体の対応する一次構造に置換した抗体をいう。 ヒ トモノクローナル抗体 作製用の親細胞は、 ヒ 卜/マウスのへテ.ロミエ口一マである SHM-D 33株 (ATCC CRL 1668) または RF - S 1株を用いるとマウスの親細胞と同等の高 い融合効率が得られる。 これらの親細胞を用いて得られたハイブリ ド一 マはフィーダ一細胞なしでク口一ニングが可能であり、 I gGタイプの抗 体を比較的安定にしかも大量に産生することができる。 親細胞の培養に は、 15%FCSを加えた ERDF培地を用い、 その他の操作はマウスの場合と同 様である。 また、 IgGタイプのヒ トモノクロ一ナル抗体を作製するには 抗原で充分に感作されたヒ 卜リンパ球を末梢血から採取して用いるのが 好ましい。
充分に抗原で感作されたリンパ球の取得が困難な場合には in v i troで 抗原感作を行うこともできる。 上記示した方法等を用いることにより、 本発明の抗体をヒ ト化することができ、 ヒ トに投与する場合には非常に 有用である。
さらに本発明によって提供されるのは、 新規コレクチン関連分子種ま たは新規コレクチン及び Zもしくは由来分子を取得するための方法であ つて、 上記の抗体を使用してタンパク質のスク リーニングを行い、 新規 コレクチン関連分子種、 または新規コレクチン及び/もしくは由来分子 をスク リ一ニングを得る工程を含むことを特徵とする方法である。 この 方法では、 種々の生物の体液、 組織細胞等に含まれる新規コレクチン関 連分子種、 または新規コレクチン及び Zもしくは由来分子を単離 ·取得 すべく、 上記の抗体を使用して免疫反応性を有するタンパク質をスクリ —ニングする。 かかるスクリーニングにおいて、 c D N Aライブラリ一 の発現スク リ一二ングが好適に利用される。
本発明のさらなる特徴において、 新規コレクチン及び または由来分 子の定量方法であって、 上記抗体を使用して、 被検試料中に含まれる新 規コレクチン及び Zまたは由来分子の免疫学的な結合性に基づき、 測定 を行うことを特徴とする定量方法が提供される。
この方法において新規コ レクチン及び Zまたは由来分子の量を測定す るために、 前記抗体をィムノブロッテイング、 免疫沈降または E L I S A等において使用するとよく、 特に E L I S A法を行うことが至便であ り好ましい。 そして、 例えば不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体 とにより新規コレクチン及び/または由来分子を反応させて生成したサ ンドイッチ錯体を検出するサンドイッチ法、 また、 標識化新規コ レクチ ン及び/または由来分子と検体中の新規コレクチン及びノまたは由来分 子を抗体と競合的に反応させ、 抗体と反応した標識抗原量から検体中の 新規コレクチン及びノまたは由来分子を測定する競合法を利用して検体 中の新規コレクチン及び Zまたは ώ来分子を測定するとよい。
サンドィツチ法による新規コレクチン及び Ζまたは由来分子の測定に おいては、 まず、 試料中の固定化抗体と新規コレクチン及び または由 来分子とを反応させた後、 未反応物を洗浄によって完全に除去し、 標識 化抗体を添加する 2ステップ法もしくは固定化抗体、 標識化抗体及び新 規コレクチン及び/または由来分子を同時に混合する 1ステップ法など を用いることができる。
測定に使用される不溶性担体は、 例えばボリスチレン、 ポリエチレン 、 ポリプロピレン、 ボリ塩化ビニル、 ポリエステル、 ポリアク リル酸ェ ステル、 ナイロン、 ポリアセタール、 フッ素樹脂等の合成樹脂、 セル口 ース、 ァガロース等の多糖類、 ガラス、 金属等が挙げられる。 不溶性担 体の形状としては、 例えばトレィ状、 球状、 繊維状、 棒状、 盤状、 容器 状、 セル、 試験管等の種々の形状を用いることができる。 抗体を吸着し た担体は、 適宜アジ化ナトリゥム等の防腐剤の存在下、 冷所に保存する 抗体の固層化には、 公知の化学的結合法または物理的吸着法を用いる ことができる。 化学的結合法としては例えばグルタルアルデヒ ドを用い る方法、 Ν—スクシンィ ミジル一 4— ( Ν—マレイ ミ ドメチル） シクロ へキサン一 1 —カノレボキシレ一ト及び Ν—スクシンィ ミジル一 2—マレ イ ミ ドアセテートなどを用いるマレイ ミ ド法、 1—ェチル一 3— ( 3— ジメチルァミノブ口ピル） 力ルポジィミ ド塩酸などを用いる力ルボジィ ミ ド法が挙げられる。 その他、 マレイミ ドベンゾィル一Ν—ヒ ドロキシ スクシンイ ミ ドエステル法、 Ν—スクシミジル一 3— ( 2—ピリジルジ チォ） プロピオン酸法、 ビスジァゾ化べンジジン法、 ジパルミチルリジ ン法が挙げられる。 あるいは、 先に被検出物質とェピト一ブの異なる 2 種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、 抗体に対する第 3の抗体 を上記の方法で固層化させておい Τ捕捉することも可能である。
標識物質としては、 酵素、 蛍光物質、 発光物質、 放射性物質及び金属 キレート等を使用するのが好ましい。 酵素としては、 例えばペルォキシ ダ一ゼ、 アルカリホスファターゼ、 ；8— D—ガラク トシダ一ゼ、 リンゴ 酸デヒ ドロゲナーゼ、 ブドウ球菌ヌクレア一ゼ、 デルター 5—ステロイ ドイソメラ一ゼ、 α—グリセロールホスフエ一トデヒ ドロゲナ一ゼ、 ト リオ一スホスフエ一トイソメラ一ゼ、 西洋わさびペルォキシダ一ゼ、 ァ スノ、 :ラギナ一ゼ、 グノレコ一スォキシダ一ゼ、 リボヌク レア一ゼ、 ゥレア —ゼ、 力タラ一ゼ、 グノレコース一 6—ホスフェートデヒ ドロゲナーゼ、 グルコアミラーゼ、 アセチルコ リンエステラーゼ等が挙げられ、 蛍光物 質としては、 例えばフルォレセインイソチアネート、 フィコピリプロテ イン、 口一ダミン、 フィコエリ ト リン、 フィコシァニン、 ァロフィコシ ァニン、 オルトフタルアルデヒ ド等が挙げられ、 発光物質としてはイソ ノレミノール、 ルシゲニン、 ルミノール、 芳香族アタ リジニゥムエステル 、 イミダゾ一ル、 アタリジニゥム塩及びその修飾エステル、 ルシフェリ ン、 ルシフェラーゼ、 ェクオリン等が挙げられ、 放射性物質としては 1 2 5 1 2 7 1、 1 3 1 I、 1 4 C、 3 H、 3 2 P、 3 5 S等が挙げられるが、 これ らに限らず免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限 定されない。 さらに、 抗体にピオチン、 ジニトロフエニル、 ピリ ドキサ —ルまたはフルォレサミンの様な低分子ハプテンを結合させても良い。 好ましくは西洋わさびベルォキシダーゼを標識化酵素として用いる。 本 酵素は多くの基質と反応することができ、 過ョゥ素酸法によって容易に 抗体に結合させることができる。
標識化剤が酵素である場合には、 その活性を測定するために基質、 必 要により発色剤を用いる。 酵素としてペルォキシダ一ゼを用いる場合に は、 基質溶液として H 2〇2を用い、 発色剤として 2， 2 ' 一アジノ一ジ ― [ 3—ェチルベンズチアゾリンスルホン酸] アンモニゥム塩 （A B T S ) 、 5—ァミノサリチル酸、 オルトフエ二レンジァミン、 4ーァミノ アンチピリン、 3， 3 ' ， 5 , 5 ' —テトラメチルベンジジン等を使用 することができ、 酵素にアル力リ フォスファタ一ゼを用いる場合は基質 としてオルトニト口フエニルフォスフエ一ト、 ノ、。ラニ トロフエニルリン 酸等を使用することができ、 酵素に /3 — D—ガラク トシダ一ゼを用いる 場合は基質としてフルォレセイン一ジ一 ( β — D—力'ラク トピラノシド ) 、 4—メチルゥンベリフニニル一 — D—ガラク トピラノシド等を使 用することができる。
架橋剤としては、 N， N ' —オルトフエ二レンジマレイミ ド、 4一 ( Ν—マレイミ ドメチル） シク口へキサン酸 · Ν—スクシンイミ ドエステ ノレ、 6—マレイ ミ ドへキサン酸 · Ν—スクシンイ ミ ドエステル、 4， 4 ' 一ジチォピリジン、 その他公知の架橋剤が利用可能である。 これらの 架橋剤と酵素及び抗体との反応は、 それぞれの架橋剤の性質に応じて既 知の方法に従って行えばよい。 また、 抗体としては、 場合によっては、 そのフラグメント、 例えば F a b ' 、 F a b , F ( a b ' ) 2を用いる 。 また、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体にかかわらず同様の 処理により酵素標識体を得ることができる。 上記架橋剤を用いて得られ る酵素標識体をァフィ二ティークロマトグラフィ一等の公知の方法にて 精製すれば、 更に感度の高い免疫測定系が可能となる。 精製した酵素標 識化抗体は、 安定剤としてチメ口サールもしくはグリセリン等を加えて 、 あるいは凍結乾燥して冷喑所に保存する。
上記定量方法における測定対象試料は、 血漿、 血清、 血液、 尿、 組織 液、 脳脊髄液等の体液等、 新規コレクチン及びノまたは由来分子を含む 試料あるいはその前駆体を含む試料であれば限定されなレ、。
さらに本発明は、 新規コレクチン及び/または由来分子を定量するた めのキッ トであって、 上記抗体を含み、 この抗体を用いた E L I S A法 によって被検試料中に含まれる新規コ レクチン及びノまたは由来分子の 量が測定されることを特徴とするキッ トを提供する。 このキッ トには抗 体のほか、 上記のような定量に必要な試薬類が含まれる。 本発明はまた、 新規コレクチン及び Zまたは由来分子を生産するため の方法であって、 上記抗体を用いて新規コレクチン及び Zまたは由来分 子を単離する工程を含む方法を提供する。 かかる方法において新規コ レ クチン及び Zまたは由来分子を単離するために、 前記抗体を結合させた 担体に試料を接触させて抗原一抗体問の特異的な相互作用を許容し、 次 いで担体を洗浄した後、 結合された目的タンパク質を溶出する工程を含 む、 カラム法、 バッチ法等によるァフィ二ティ一クロマトグラフィー及 び ζまたは免疫沈降が実施されるとよい。
この方法における試料は、 例えば、 ヒ ト由来の胎盤、 脾臓等より調製 して得られたものでも、 また、 前記した本発明の新規コレクチンをコ一 ドするポリヌクレオチドから発現させることによって調製したものでも よいが、 安定に試料を供給可能であるので、 発現産物が好適に用いられ 、 かかる発現工程を含む方法が本発明において企図される。
また、 本発明でさらに企図されるのは、 新規コ レクチン及び Ζまたは 由来分子の組織内における存在を確認するための方法であり、 この方法 において、 如上の抗体を用いて免疫組織学的検査が行われる。 免疫組織 学的検査とは、 例えば、 標識抗体を用いた in si tu免疫組織染色などの 技術が採用され、 新規コレクチン及び Zまたは由来分子を検出するもの である。
さらには、 本発明により、 上記本発明のポリヌク レオチドを含む組換 え遺伝子が安定して染色体に導入され、 且つ新規コレクチンを発現する ことができることを特徴とする トランスジエニック非ヒ ト動物が提供さ れる。 さらに提供されるのは、 本発明の新規コ レクチンの相同体を含む 非ヒ ト動物において、 該相同体をコードする遺伝子の発現を修飾するよ うに （例えば、 発現を阻止、 促進、 あるいは所定条件のみで発現するよ うに） 遺伝子導入がなされたことを特徵とする トランスジ ニック非ヒ ト動物である。 この非ヒ ト動物において遺伝子の発現を正常に調節して いるいくつかの重要な部位 （ェンハンサー、 プロモータ一、 イントロン 等） の一部に欠失、 置換、 付加及び Zまたは挿入などの変異を起こさせ ることにより、 本来の遺伝子の発現レベルと比較して上昇または下降す るように人工的に修飾することができる。 この変異の導入は、 公知の方 法により行うことができる （例えば、 Lesley, S. A. et al. , Promega Notes Magazine. 46， 6 - 10, 1994; Kunkel, T. A. et al. , Methods Enzymol? 154, 367-382, 1987; Sayers, J. R. et al. , Biotechniques , 13, 592—596， 1992; I to W. , et al. , Gene, 102, 67-70, 1991; Cormack, B. , Current Protocols in Molecular Biology, 8.5.1-8.5.9 , 1987) 。 ここで遺伝子としては、 c DNA、 ゲノム DNAあるいは合 成 DNAを含む。 また、 遺伝子の発現には転写と翻訳のいずれのステツ プも含まれる。
これら本発明による トランスジエニック非ヒ ト動物は、 新規コレクチ ン及び または由来分子の機能あるいは発現調節の研究、 新規コレクチ ン及び/ /または由来分子が関与すると予想される疾患のメカニズム解明 、 医薬品のスクリーユング ·安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発 に有用である。
トランスジエニック動物とは狭義には遺伝子組換えにより、 外来遺伝 子が生殖細胞に人為的に導入された動物のことをいい、 広義にはアンチ センス RN Aを用いて特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス · トラ ンスジエニック動物や、 胚性幹細胞 （E S細胞） を用いて特定の遺伝子 をノックアウ トした動物、 点突然変異 DN Aを導入した動物を含み、 個 体発生の初期に外来遺伝子が安定して染色体に導入され、 その子孫に遺 伝形質として伝達され得る動物のことをいう。
本明細書中でいう トランスジエニック動物とはヒ ト以外のすべての脊 椎動物を含む広義の意味に解する。 本発明における トランスジ ニック 動物は、 新規コレクチン及び/または由来分子の機能あるいは発現調節 の研究、 ヒ トにおいて発現している細胞に関連する疾患のメカニズムの 解明、 医薬品のスクリーニング ·安全性試験に用いる疾患モデル動物の 開発に有用である。
卜ランスジュニック動物の作製方法は、 位相差顕微鏡下で前核期卵子 の核に、 微小ピペッ トで遺伝子を直接導入する方法 （マイクロインジェ クション法、 米国特許第 4 8 7 3 1 9 1号） 、 胚性幹細胞を使用する方 法などがある。 その他、 レトロウイルスベクタ一またはアデノウイルス ベクタ一に遺伝子を挿入し、 卵子に感染させる方法、 また、 精子を介し て遺伝子を卵子に導入する精子べクタ一法等が開発されている。
精子べクタ一法とは、 精子に外来遺伝子を付着またはエレク トロポレ —ション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、 卵子に受精させる ことにより、 外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である （M. Lav i tr- anoet ら、 Ce l l , 57， 717, 1989) 。 あるいはバクテリオファージ P 1 の cre/lox Pリコンビナ一ゼ系やサッカロマイセス · セレビシァェ (Saccharomyces cerevi siae) の F L Pリコンビナ一ゼ系等による in vi voにおける部位特異的遺伝子組換えを用いることもできる。 また 、 レトロウイルスを使用して、 非ヒ ト動物へ目的タンパク質のトランス ジーンを導入する方法も報告されている。
マイクロインジェクション法による トランスジエニック動物作製方法 は、 例えば、 以下に示すようにして行われる。
まず、 発現制御に関わるプロモーター、 新規コレクチンをコードする 塩基配列、 ポリ Aシグナルから基本的に構成される トランスジーンが必 要である。 プロモータ一活性により特定分子の発現様式や発現量が左右 され、 また、 導入トランスジーンのコピー数や染色体上の導入部位によ り作製されたトランスジ ニック動物が系統間で異なるため、 各系統間 で発現様式 ·発現量を確認する。 非翻訳領域ゃスプライシングにより発 現量が変化することが判明しているため、 予めポリ Aシグナルの前にス プライシングされるイント口ン配列を導入してもよい.： 受精卵に導入す る遺伝子はできるだけ純度の高いものを使用することが重要である。 使 用する動物としては、 受精卵採取用マウス （ 5〜 6週齢） 、 交配用雄マ ウス、 偽妊娠雌マウス、 輸精管結紮雄マウス等が用いられる。
効率よく受精卵を得るために、 ゴナドトロピン等により排卵を誘発し てもよい。 受精卵を回収し、 マイクロインジェクション法にて卵子の雄 性前核にインジェクションピペッ ト中の遺伝子を注入する。 注入した卵 子を輸卵管に戻すための動物 （偽妊娠雌マウス等） を用意し、 一匹に対 して約 1 0〜 1 5個を移植する。 その後、 誕生したマウスにトランスジ ーンが導入されているか否かを、 尾の先端部からゲノム D N Aを抽出し 、 サザン法あるいは P C R法により トランスジーンを検出する力 、 ある いは相同組み換えが起こったときのみに活性化するマーカ一遺伝子を挿 入したポジティブクロ一ユング法により確認することができる。 さらに 、 トランスジーンの発現を確認するため、 ノザン法もしくは R T— P C R法により トランスジーン由来転写産物を検出する。 または、 タンパク 質またはその断片に対する特異的抗体によって、 ウェスタンプロッティ ングを行ってもよレ、。
さらに本発明によって、 上記本発明の新規コレクチンの相同体を含む 非ヒ ト動物において、 該相同体の発現を阻止するように該相同体をコー ドする遺伝子が改変されて得られることを特徴とするノックアウ ト非ヒ ト動物を提供する- 本発明のノックアウ トマウスは、 新規コレクチン及びノまたは由来分 子遣伝子の機能が失われるように処理されたものである。 ノックアウ ト マウスとは相同組換え技術により任意の遺伝子を破壊し、 機能を欠損さ せたトランスジヱニックマウスをいう。 E S細胞を用いて相同組換えを 行い、 一方の対立遺伝子を改変 ·破壊した胚性幹細胞を選別し、 ノック アウ トマウスを作製することができる。 例えば、 受精卵の胚盤胞や桑実 胚期に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、 胚性幹細胞由来の細胞 と胚由来の細胞が混ざったキメラマウスを得る。 このキメラマウス （キ メラとは、 2個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体を いう） と正常マウスを交配すると、 一方の対立遺伝子の全てが改変'破 壊されたヘテロ接合体マウスを作製することができる。 さらに、 ヘテロ 接合体マウス同士を交配することで、 ホモ接合体マウスが作製できる。 相同組換えとは、 遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、 または非常に 類似している 2つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。 相同組換え を起こした細胞の選別には P C Rを使用することができる。 挿入遺伝子 の一部と挿入が期待される領域の一部をプライマーとして用いる P C R 反応を行い、 増幅産物ができた細胞で相同組換えを起こしていることが 判明できる。 また、 胚幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起 こさせる場合には、 導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を結合させて おき、 導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択するこ とができる等、 公知の方法及びそれらの変法を用いて容易に選択するこ とができる （Capecch i、 Science, 2 4卷、 1288〜i 292頁（1989)等を参照 されたい）
以下に、 本発明の新規コレクチンに関して、 実施例に沿って詳細に説 明するが、 これら実施例の開示によって、 本発明が限定的に解釈される べきでないことは勿論である。
すなわち、 ESTデータベースの検索 （実施例 1 ) 、 スク リーニング用 プローブの作製 （実施例 2 ) 、 ヒ ト胎盤由来 c D N Aライブラリーのス ク リーニング （実施例 3) 、 新規コレクチンの塩基配列の決定 （実施例 4) 、 新規コレクチンのゲノミックサザン分析 （実施例 5) 、 新規コレ クチンのヒ トの種々の組識に対するノーザン分析 （実施例 6) 、 新規コ レクチンの種々の動物種の組織についてのゲノミックサザン分折 （実施 例 7) ならびに新規コ レクチンの遺伝学的解析 （実施例 8) 、 新規コ レ クチンに対するモノクローナル抗体の調製 （実施例 9) 、 抗マウス抗ヒ ト新規コ レクチン抗体を用いた E L I S Α法 （実施例 1 0) 、 ヒ トに対 する免疫原性を低下させた抗体の調製 （実施例 1 1 ) 、 新規コレクチン の発現べクタ一 pNOWl- hCL- P1の構築 （実施例 1 2) 、 新規コレクチンを 発現するクローンの選択 （実施例 1 3) 、 トランスジエニックマウスの 作製 （実施例 1 4 ) 及びノックアウ トマウスの作製 （実施例 1 5 ) につ いて以下に説明する。
実施例 1 ： ESTデータベースの検索
既知のコレクチンすなわち、 ヒ ト MBP、 ヒ ト SP- A及びヒ ト SP- Dのアミ ノ酸配列 （図 2及び 3参照、 図中、 相同と認められるアミノ酸残基部分 に囲みを付した） を比較することにより、 分子間に保存性の高い領域の 検索を行った。 この結果、 ヒ ト MBPのアミノ酸配列における第 220番目か ら 246番目までの 27アミノ酸 （図 3、 白抜文字部分、 配列番号： 6) に 保存性が高いことが明かとなったので、 この領域に相当するコンセンサ ス酉己歹 IJをレヽくつ力、作成し、 EST (Expressed Sequence Tags) データべ一 スの検索を行った。 ESTデータベースは、 1996年 10月 11日に、 676750件 の配列を含むものを使用した。
その結果、 上記 27アミノ酸の配列と相同性の高いアミノ酸配列を含む データがいくつか得られた。 得られたデータのァミノ酸配列について GenBank/ESTデータベースの検索を行い、 既知または未知物質のいずれ であるかを判定した結果、 コンセンサス配列として、 Glu— Lys— Cys— Val— Glu— Met— Tyr— Thr— Asp— Gly—し ys— Trp— Asn— Asp_Arg— Asn— Cys-し eu- Gin - Ser - Arg - Leu - Ala - lie- Cys - Glu_Phe (配列番号： 3) で示 されるアミノ酸配列を用いて検索したときに得られたデータの中に、 相 同性は高いが未知の塩基配列を含む 2種のデータ （登録番号： W72977及 び R74387) を得ることができた。 これらは、 それぞれ、 胎盤由来及び胎 児心臓由来であり、 新規コレクチンの塩基配列の一部を示すクローンで あった。
そこで、 このうち、 胎児心臓由来のクローン （I.M.A.G.E. Consortium Clone ID 34472) を ATCC (American Type Culture Collection) より購 入して、 以下の新規コレクチン取得のためのスクリーニング用プローブ 作製に利用した。
実施例 2 ： スクリーニング用プローブの作製
上記クローンのインサート DNAの塩基配列を、 プライマー （フアル マシア社製、 M13 Universal Primer (配列番号： 7、 5'-フルォレセィ ン- cgacgttgtaaaacgacggccagt - 3 ) 及び M13 Reverse Primer 列番 ： 8、 5'ーフノレォレセイン— caggaaacagctatgac一 3' ) ) で決定した 0 この塩基配列から読取枠をコレクチンのアミノ酸配列に合わせて、 そ こから読み取ることができるアミノ酸配列に相当する塩基配列を抽出し 、 この一部分に相当するジゴキシゲニン （DIG) ラベル c DNAプロ一 ブ用プライマー (Reverse プライマ一、 caatctgatgagaaggtgatg ( C歹 lj 番号： 4； 及び Forward プライマ一、 acgaggggctggatgggacat (酉己歹 IJ番 号： 5) を、 アプライ ドバイオシステムズ社製 392A DNA/RNAシンセサイ ザ一を用いて作製した。 DIGラベルは、 PCR DIGプロ一ブ合成キッ ト （ベ 一リンガー .マンハイム社製） を用いて行った。 反応組成は以下のとお りである （プラスミ ド DNA (クローン W72977、 50 ng/ 1) ： 2μ 1 ( 100 ng) 、 10 x 緩衝液： 5μ 1、 25 mM MgCl2 ： 5μ 1、 dNTP (PCRラベリ ングミ ックス） ： 20 μ M Reverseプライマ一 ： 2. 5μ 1、 20 μ Μ Forward プライマー ： 5μ 1、 Η20 ： 28 μ 1, Taq ポリメラ一ゼ ： 0.5 μ 1) 。 P C R反応は、 ア ト一社製ザィモリアクタ一を用いて、 92°C 1 分、 55CC 1分、 72。C 2分のサイクルを 35回行った。
実施例 3 ： ヒ ト胎盤由来 c D NAライブラリーのスクリ一ニング 先ず、 以下のようにヒ ト胎盤由来ファージ c D NAライブラリーのタ ィ トレ一シヨンを行った。 mLB培地 (10 mM MgSC 及び 0.2%マルトース を含む LB培地 （1 gトリプトン、 0.5 gィ一ス トエキス トラク ト、 0.5 g NaCl/100 ml) で 37。Cにて 16時間培養した Escherichia coli Y1090r一 0.2 mlと、 SM 緩衝液 （5.8 g NaCl、 2 g MgS04 · 7H20、 2 M Tris-HCl
(pH 7.5) 25 ml, 5 ml 2%ゼラチン/ L) で段階希釈した c D N Aライ ブラリー 0. 1 mlを 37°C15分インキュベートし、 その後 2.5 mlの LB- TOP ァガロース （0.75%ァガロース/し B培地） に加え均一とし、 9Omm0 LB培 地プレート （岩城硝子社製） （1.5%ァガ一 /LB培地） にまいた。 分間 室温で固化させ、 42。Cにて 5時間インキュベーショ ンした。 各プレート のプラークを計数後、 ファージのタイタ一を計算により求めた。 その結 果、 タイタ一は 2. 1 X 101。 pfu/mlであった。 このようにタイ トレ一シ ョンを行った c D NAライブラリーにつき、 実施例 2で作製したプロ一 ブを用いて以下の通りにスクリ一ニングを行った。
mLB培地で 37°Cにて 16時間培養した Escherichia coli Y1090r一 0.6ml と SM 緩衝液で希釈した c D NAライブラリー 1 x 10s pfuを、 37°Cにて 15分間インキュベートし、 その後 7. 5 ml LB-T0P ァガロース （0. 75<½ァ ガロース） に加えて均一とした。 とれを 140 mm2のし B培地角プレート （ 日水製薬社製） にまいたものを 1 0枚作製し、 15分間室温で固化させ、 42。Cにて 5時間インキュベーションした。 プラーク形成を確認後、 次に 、 ナイロンメンブレンへの転写を行った。 転写は、 ナイ トラン （Nytran ) 13N (シュライヒヤーアンドシユウエル社製 （Schleicher and Schuell Co.) ) を用いて行った。 12.5 cm x 9.0 cmのフィルタ一を蒸 留水に浸けて 10分間湿らせた後、 ヮッ トマン 3顯紙上において余分な水 分を除去し、 プラークを形成したプレート上にフィルタ一を置いた。 2 分間放置した後、 フィルタ一を剥がし、 10分間風乾させた。 0.2 M NaOH /1.5 NaClにより 2分間ファージ D N Aを変性させ、 0.4 M Tris-HCl
(pH7.6) / 2 x SSCで 2分間中和し、 2 x SSCで 2分間洗浄を行った。 その後、 GS GENE LINKER (バイオラッ ド社製） で紫外線照射することに よりファージ DN Aをメンブレンに固定した。 ハイブリダイゼーション 及びシグナルの検出は以下の様に行った。 フィルタ一を 2 X SSCで湿ら せ、 余分な水分をワットマン 3MM紙で除去し、 ハイブリダィゼ一シヨ ン ノくックに移しハイブリダイゼ一ション溶液 （5 X SSC、 1 %ブロッキング 剤、 0.1% N-ラウロイルサルコシン、 0.02% SDS) と 68°Cにて 1時間プ レハイブリダィゼーシヨ ンを ί亍った。 続いて、 バックからハイブリダィ ゼ一シヨ ン溶液を除き、 そこへ DIGでラベルした c DNAプローブを 10 ng/mlになるように調製したハイブリダイゼ一ショ ン溶液を加え、 55°C にて 16時間ハイブリダイゼーションを行った。 ハイブリダイゼ一ション 終了後、 フィルタ一は室温にて 2 X SSC/O.1%SDS溶液で 5分間、 2回洗 浄し、 55°Cにて、 0.5 X SSC/0.1%SDS溶液で 15分間 2回洗浄した。 次に DIG緩衝液 I (100 mM Tris- HC1、 150 mi NaCl (pH7.5) ) で 1分間、
SDSを除去し、 DIG緩衝液 II (1%ブロッキング剤、 DIG緩衝液 I ) で 30分 間、 フィルターのブロッキングを行った。 DIG緩衝液 Iで 1分間洗浄し 、 次いで DIG緩衝液 IIで抗 DIGアル リフォスファタ一ゼ標識抗体 （ベー リンガー .マンハイム社製） を 5000倍希釈した溶液を加えて、 30分間抗 体反応を室温で行った後、 室温で DIG緩衝液 Iで 15分間 2回洗浄した。 IG緩衝液 III (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl (pH 9.5) 、 50 mM MgCl2) で 3分間処理することにより M g ^の濃度を高め、 NBT/BCIP ( 和光純薬社製） を DIG緩衝液 IIIに加えた溶液で発色させたところ、 1 0 個の陽性クローンが得られた。 これらのクローンに相当するプラークを プレートから切り出し、 SM緩衝液 1 mlを入れたチューブに加え、 10分間 撹拌した後 SM緩衝液で段階希釈し、 この希釈液 0. 1 mlと mLB培地で 37°C 16時間培養した Escherichia coli Y1090r"0.2 mlを混ぜ、 37°Cにて 15分 間インキュベートした。 その後、 混合液を 2.5 ml LB-TOPァガロースに 加えて均一とし、 90mm 0LB培地プレートにまいたものを 1 0枚作製し、 15分間室温で固化させ、 42°Cにて 5時間インキュベーションし、 いくつ かのブラ一クを得、 一次スクリーニングと同様にして二次スクリーニン グを行った。
実施例 4 ：新規ヒ トコレクチンの塩基配列の決定
二次スクリ一ニングで得られた陽性クローンのうち適切と考えられる クローンのプラークをプレートから切り出し、 蒸留水 200// 1を入れた チューブに加えて 3 0分間室温で撹拌した後、 15, 000 rpmで 5分間遠心 分離し、 上清を得た。
得られた上清を鐯型とし、 TaKaRa LA PCR Kit Ver.2 (宝酒造社製） を用い、 P C Rによりインサート DN Aを増幅させた。 P C Rの反応組 成は以下のとおりである （上清 ： 27μ 1、 10 X LA PCR 緩衝液 II
(Mg 2 +不含） ： 5μ 1、 25 mM MgClz ： μ 1、 dNTPミ ックス ： 8 1、 20 μ M λ gtll Reverseプライマ一 （配列番号： 9、 δ' -ttgacaccagaccaa ctggtaatg-3' ) ： 2.5μ 1、 20 Μ λ gtll Forwardプライマー （配列番 号： 1 0、 5' -ggtggcgacgactcctggagcccg-3 ) ： 2. ο μ 1, し A Taq リ メラ一ゼ ： 0.5 1、 H2O ： 全容量 50 μ 1になるように添加） 。 P C R反 応は、 アプライ ドバイオシステムズ社製ジ一ン Amp PCRシステム 9600を 用いて、 98CC20秒、 68°C 5分のサイクルを 30回行った。 P C R産物は、 1%ァガロースゲル電気泳動にて確認後、 ゲルからの切り出しにより精 製した。 精製には、 フアルマシア社製 Sephaglas BandPrep Kitを用いた 切り出した D N A断片は、 インビトロジェン社製 TAクローニングキッ トの pCR2.1ベクタ一に組み込んだ。 組換えたベクターは、 インビトロジ ェン社製 TAク口一ニングキッ 卜に含まれる TOP10F'細胞に形質転換した 。 形質転換体を LB培地 （lOO g/ml アンピシリン） で培養し、 アルカリ SDS法により各クローンにっき 3種類のプラスミ ド DN Aを抽出した。 得られた DNAを適当と考えられる制限酵素で切断し、 各 DNA断片 を pUC18ベクターに組込み、 XL1— Blue cellに形質転換した。 形質転換 体を LB培地 （lOO/zg/tnl アンピシリン） で培養し、 アルカリ SDS法によ りプラスミ ドを抽出した。 CL- P1- 2- 1からは、 ^££R I-Hind IIIフラグメ ント、 III-EcoR Iフラグメントを含むプラスミ ド、 CL-P1-3 - 4から は、 EcoR I-BamH Iフラグメント、 BamH I-Sma Iフラグメント、 ^ I— Hind IIIフラグメント、 ]^ I~Sau3A Iフラグメント、 ^3A I -EcoR I フラグメン ト、 EcoR I-Kpn'Iフラグメント、 EcoR I-Sma Iフラグメント を含むプラスミ ド、 CL- P1 - 3 - 7からは、 ££R I-BamH Iフラグメント、 BamH I-Sma Iフラグメント、 ^ I一 Hind IIIフラグメント、 ]^ I- Sau3A Iフラグメント、 Sau3A I -EcoR Iフラグメント、 EcoR I-Kpn Iフ ラグメント、 i^ I -EcoR Iフラグメントを含むプラスミ ドを得た。 ブラ イマ一は AutoRead Sequencing Kit (ファノレマシア社製） 添付の
Universal Primer (配列番号： 7) 、 Ml 3 Reverse Primer (配列番号： 8) 及び FITC (フアルマシア社製 luorePrime) にてラベルした以下の ブライマ一を DNA/RNAシンセサイザ一を用いて作成し、 フアルマシア社 製オートリード ' シ一クェンシング 'キッ ト及び A. し F.ォ一トシ一ケ ンサ一で全領域の塩基配列を決定した。 HPP 1 ： 5'—フノレ才レセイン一 cgtgaaaatgaatggaagtgg— 3' (酉己歹 lj番号：
1 1 ) 、
HPP 2 ： 5'—フノレォレセイン一 ttttatccattgctgttcctc— 3' (酉己歹 lj番号：
1 2) 、
HPP 3 ： 5' -フノレォレセイン - ctggcagtccccgaggtccag - 3' (配列番号：
1 3) 、
HPP 5 ： 5'ーフノレォレセイン一 gctggtccccccggagagcgt_3' (酉己歹 lj番号： 1 4)
以上実施した塩基配列決定における概略は、 図 4に示す通りである。 図 4 (a ) に、 得られた新規コレクチンの ORFが示され、 この中の G_X- Y はコラーゲン様領域を表すものである。 また、 図 4 (b) に、 上記各プ ライマー名、 シーケンサ一により読み取られた塩基配列 （矢印により表 される） ならびに M13 Universal Primer (Uで表される） 及び M13 Reverse Primer (Rで表される） を示す。
さらに Cap site c DNAを用いて、 この配列の転写開始点を含む 5' 末端領域の塩基配列を決定した。
Cap Site cDNA, Human Liver ( NIPPON GENE 社製） により、 添付の 1RC2 Primer (5' -caaggtacgccacagcgtatg-3' (酉己歹 II番号： 1 5) ) 及び Applied Biosystems 社製 392A DNA/RNA シンセサイザ一により合成し た TGP1 Primer (5' -tcttcagtttccctaatccc-3' (配列番号： 1 6) ) を 用いて第 1回 P C Rを行った。 反応混液は、 総液量 50 1にて、 LA PCR Buffer II ( Mg2÷ 不含 ）、 2.5 mM MgCl2、 それぞれ 200 μ Mの dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTP ( 以上 宝酒 社製 ）を Ιμ ΐ ： Cap Site cDNA Human Liver, 0.5 /i M 1RC2 Primer (以上 NIPPON GENE 社製 ）、 ならび に 0.5 M TGP1 Primerを含むものとした。 P C Rは、 熱変性 95°Cにて 20 秒、 アニーリング 60°Cにて 20秒、 伸長反応 72°Cにて 20秒を 35サイクル、 また繰り返し反応前に熱変性 95 2Cにて 5分、 最後に伸長反応 72 にて 10 分を含むプログラムで行った： 第 1回 P C R終了後、 nested PCR を行 つた。 第 1回 P CR産物 Ιμ ΐ を铸型と し、 プライマ一は添付の 2RC2 Primer (δ' -gtacgccacagcgtatgatgc-3' (配歹リ番号： 1 7) ) 及び合成 TGP2 Primer (5' -cattcttgacaaacttcatag-3' (配列番号： 1 8) )
(TGP1 Primer と同様にして合成したもの） を用い、 第 1回 P C Rと同 様の反応組成、 プログラム （但し、 サイクル数は 25サイクル） で行った 。 以上の P C R反応は宝酒造社製 TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 に より行った。 得られた P C R産物をァガロースゲル電気泳動により確 認後、 バンドをゲルより切り出し、 -80 。C， 10 min. 凍結し、 15000 rpm, 10 min. 遠心分離後、 上清をエタノール沈澱することにより精製 した。
精製した DNA断片は、 Novagen 社製 pTTBlue Vector に組み込み 、 このべクタ一をコンビテントセル XL1- Blue 細胞に形質転換した。 形 質転換体を LB 培地 （lOO g/ml アンピシリン） で培養し、 アルカリ SDS 法によりプラスミ ドを抽出し、 Pharmacia 社製 AutoRead
Sequencing Kit 及び A. し F. DNA Sequencer で塩基配列の決定を行 つた。 プライマ一は AutoRead Sequencing Kit 添付の M13 Universal Primer (配列番号： 7) 及び M13 Reverse Primer (配列番号： 8) を 用いた。
この結果、 実施例 3で取得された新規コレクチンの c DNAクローン は、 2024塩基を含み、 1026塩基の 0RF (転写解読枠） を有し （配列番号 ： 1参照） 、 配列番号： 2に示される 342のアミノ酸をコードしている ことが確認できた。
次いで、 GenBankデータベースで DNA及びアミノ酸についての相同 性の検索を行った結果、 得られたアミノ酸配列は、 従来見出されている コレクチンのいずれとも異なる新規タンパク質の配列であることが明ら かとなつた。
また、 従来報告されている 3種のコ レクチンのアミノ酸配列と、 本発 明の新規コレクチンのアミノ酸配列を比較した。 そのアラインメントを 図 5及び 6に示す。 図 2及び 3と同様に、 相同性を有するアミノ酸残基 部分に囲みを付した。 このアラインメントにより、 得られた新規タンパ ク質は既知コレクチンと相同性を有し、 コレクチンフアミ リーに属して いることが示される。
実施例 5 ：新規コレクチンのゲノミックサザン分析
実施例 4において明らかにされた c DN A配列を有する新規コ レクチ ンの遺伝子が、 シンダルコピ一遺伝子であるかまたはマルチコピー遺伝 子であるかを明らかにするために、 ゲノミックサザン分析を行った。 ヒ ト血液由来のヒ トゲノム DNA (プロメガ社製） の 4/ig相当量を、 制限酵素の （1 ) ££R I、 (2) Xba I, (3) Hind III、 (4) Pst I 、 (5) Bgl IIまたは （6) BamH Iで消化し、 0.8%ァガロースゲルに て、 100 mAで 3時間電気泳動した。 泳動終了後、 ナイロンメンブレン （ ナイ トラン 13N) に転写して、 分析用のメンブレンを作製した。 転写は 、 先ず、 電気泳動後のゲルを 100 mlの 0.25 N HC1に 10分間浸し、 蒸留水 で 3回洗浄した後、 100 mlの変性液 （1.5 M NaCl、 0.5 M NaOH) に 15分 間 2回浸し、 100 mlの中和液 （0.5 M Tris- HC1、 3 M NaCl (pH 6.8) ) に 30分間浸すことによって脱プリン化、 変性及び中和の処理を施し、 次 いでバキュームブロッティングシステム （東洋紡エンジニアリング社製 、 VB-30) を用いて転写した。 こめ際、 メンブレンは、 2 X SSCに 5分間 、 次に 20 X SSCに 5分間浸漬して前処理したものを用い、 パッ ドは、 20 X SSCをしみこませておいたものを用いた。 転写終了後、 UV照射により 固定処理を施した。 サザン分析のためのハイブリダイゼーション用ブローブとしては、 実 施例 4で得られた新規コレクチンの c DNA配列の 0RFの一部分を、 プ ライマー ：
5' -gaagacaagtcttcaactcttg-3' (目 [：歹 (j番号： 1 9リ 及び
5' -ctctgagtctgtgaggccgatc-3' (配列番号： 2 0) と、 前記の PCR DIG プロ一ブ合成キッ トを用いて DIGラベルした DNAプローブ： gaagacaagt cttcacatct tgttttcata aacactagag aggaacagca
atggataaaa aaacagatgg tagggagaga gagccactgg atcggcctca
cagactcaga g (配列番号： 2 1 ) を用いた。 ハイブリダィゼ一シヨンの 前に、 プローブは 10分間煮沸し、 5分間ドライアイス Zニタノールで急 速凍結処理しておいた。
先ず、 転写後のメンブレンを 2 X SSCに 5分間浸し、 ExpressHyb Hybridization Solution (クロ一ンテック社製） 10 ml中で 65°Cにて 30 分間プレハイブリダィゼーシヨンを行った。 次いで、 前記凍結処理後の プロ一ブを ExpressHyb Hybridization Solutionで 10 ng/mlとなるよう に希釈し、 この溶液 2 mlを用いて、 65°Cにて 1時間ハイブリダィゼ一シ
3ンを行った。
ハイブリダィゼ一シヨン後のメンブレンの洗 は、 2 SSC、 0.1% SDS溶液 20 mlで室温にて 5分間ずつ 2回振盪し、 続いて 0.2 x SSC、 0.1 °/oSDS溶液 20 mlで 65°Cにて 15分間ずつ 2回振盪しながら行った。 SDSを 除去するために、 DIG緩衝液 I (100 mM Tris- HC1、 150 mM NaCl
(pH 7.5) ) 50 mlで室温にて 1分間 2回洗浄し、 次に DIG緩衝液 ΙΓ ( 1.5%ブロッキング剤、 DIG緩衝液 Ϊ ) 50 mlで室温にて 1時間プロツキ ングを行った。 次いで、 0.2%Tween20を含む DIG緩衝液 Iで 5000倍に希 釈しておいた抗 DIGアルカリホスファタ一ゼ標識抗体 10 mlで 30分間処理 し、 0.2%Tween20を含む DIG緩衝液 Iを 50 ml用い室温にて 20分間、 振盪 しながら洗浄を 2回行った。 10 mlの DIG緩衝液 IIIに室温にて 3分間 2 回浸した後、 メンブレンをハイプリバックに移し、 DIG緩衝液 IIIで 100 倍に希釈しておいた CSPD (登録商標、 ベ一リンガー 'マンハイム社製、 化学発光基質） を全体にゆきわたるように延ばし、 インスタン トフィル ム T612 (ボラロイ ド社製） 上で感光させた。
この結果、 図 7の各レーンに示されるように、 各制限酵素で処理した ゲノム DNAより、 それぞれ 1 〜 2個のシグナルしか検出されないので 、 得られた新規コレクチン遺伝子がシングルコピー遺伝子であることが 推測された。
実施例 6 ：新規コレクチンのヒ トの組織における発現分布解析 本発明の新規コレクチンの m RN Aの種々の組織における発現を調 ベるため、 RT— P C Rにより解析を行った。
種々の組織由来の RN A ( ( 1 ) 脳、 （2 ) 心臓、 （3 ) 腎臓、 ( 4 ) 脾臓、 （5 ) 肝臓、 （6 ) 小腸、 （7 ) 筋組織、 （8 ) 精巣、 ( 9 ) 胎盤、 または （1 0 ) 大腸 （ OriGene Technologies, Inc.製 ）
) を铸型と し、 RNA LA PCR Kit (AMV) Ver. 1. i (宝酒造社製） を用いて R T- P C Rを実施した。 まず以下の反応組成で逆転写反応を行った。 5mM MgCl2 1 x RNA PCR Buffer, ImM dNTP Mixture, IU/ μ 1 RNaseィ ンヒビター、 0.25 U / μ 1 逆転写酵素、 0· 125μ!Μ Oligo dT - Adaptor Primer, RNA l i gを含み、 全量 20 μ 1 になるように RNase不含の蒸 留水で調節した。 同時に逆転写酵素を含まない反応組成も調製して、 ネ ガティブコン トロールとした。 上記反応液を 0.2 ml チューブに入れ、 TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造社製） で 42°Cで 30分間 、 99°Cで 5分間、 5°Cで 5分間の 1サイクルで P C Rを行った。 得られた P C R産物を用いて、 続いて以下の反応組成で L A P C Rを行った。 2. δπιΜ MgCl2、 1 x LA PCR Buffer II ( Mg2 +不含） 、 2U TaKaRa LA Taq ， 得られた新規コレクチンの c DNA配列のネック領域から糖認識構造 様領域を増幅できるようなプライマ一 2種類 （RT-PCR Primer U： 5' - gtgcccctggccctgcagaatg-3' (配列番号： 22) 、 RT-PCR Primer R： 5' -gcatatcaccctggggaacattttag-3' (配列番号： 2 3) を 0·2μΜカロえ、 全量 80μ 1 になるように滅菌蒸留水で調節した。 P CRは、 94°Cで 2分 間を 1 サイクル、 94Cで 30秒間、 60°Cで 30秒間、 723Cで 1分 30秒間を 50 サイクル行った。 反応生成物を 1 % ァガロースゲル電気泳動により分離 し、 ェチジゥムブ口マイ ド溶液 （0.1/ig/ml) で染色を行い、 トランス イルミネーターで泳動パターンを確認し、 発現組織を同定した。
また各組織での発現量を比較するために、 各組織で ]3-ァクチン遺伝 子の一部分を増幅させる RT— P C Rを行い、 RN Aの補正を行った。 方法は上記同様、 逆転写反応、 PCR反応を行い、 上記と同様に 1%ァ ガロースゲル電気泳動を用いて判定を行った。 逆転写反応の組成は、 5mM MgCl2s 1 x RNA PCR Buffer, ImM dNTP Mixture, 1U / μ 1 RNaseィ ンヒ ビター、 0.25 U / 1逆転写酵素、 2.5 M ランダム 9 mer、 RNA 10 ngを含み、 全量 60μ 1 になるように RNase不含の蒸留水で調節した 。 P C Rは 30°Cで 10分間、 42°Cで 15分間、 99でで 5分間、 5°Cで 5分間の 1サイクルを行った。 得られた P CR産物を用いて、 続いて以下の反 応組成で P CR反応を行った。 2.5mM MgCl2、 1 x LA PCR Buffer II ( Mg2 +不含） 、 2U TaKaRa し A Taq, 0.25 μ M ヒ ト ァクチン 'センスプ ライマー δ' -caagagatggccacggctgct-3' (酉己歹リ¾" ： 24) 、 0.2δ μ M ヒ 卜 β -ァクチン · アンチセンス 7ラ マー δ -tccttctgcatcctgtcggca -3' (配列番号： 25) ) を加え、 全量 40 / l になるように滅菌蒸留水 で調節した。 P C Rは 94。Cで 15秒間、 68でで 30秒間を 30サイクル行つ た。
この結果を図 8に示すが、 本発明の新規コレクチンの mRNAが、 胎 盤 （レーン 9) 、 脾臓 （レーン 4) 、 腎臓 （レーン 3) で発現している ことが明らかとなった。 特に胎盤での発現が高いことが明らかである。
実施例 7 ：新規コレクチンの種々の動物についてのゲノ ミックサザン 分析
本発明の新規コレクチンの遺伝子が、 他の動物種において保存されて いるか否かを明らかにするために、 ゲノミックサザン分析を実施した。 ハイプリダイゼ一ション用プローブとしては、 前記の新規コレクチン の c DN A配列の 0RFに相当する部分を、 PCR DIGプロ一ブ合成キッ ト （ ベ一リンガ一 .マンハイム社製） を用いて DIGラベルした DNAプロ一 ブを用い、 メンブレンは、 （1 ) ヒ ト （プロメガ社製） 、 （2) サル （ クローンテック社製） 、 （3) ラッ ト （プロメガ社製） 、 （4) マウス (プロメガ社製） 、 （5) ィヌ （クローンテック社製） 、 （6) ゥシ (プロメガ社製） 、 （7) ゥサギ （クローンテック社製） 及び （8) 二 ヮ トリ （プロメガ社製） のゲノム DNAをそれぞれ 5 / gずつ、 制限酵素 EcoR Iで処理し、 ァガロースゲルで電気泳動した後に、 ナイ トラン 13N メンブレンに転写し、 UV照射により固定処理を施したものを用いた。 以上のプローブとメンブレンを用いて、 下記の工程に従ってハイブリ ダイゼ一シヨンを行った。 先ず、 2 X SSCにメンブレンを 5分間浸し、 10mlの ExpressHyb Hybridization Solution中で 65。C (こて 30分 プレノヽ イブリダィゼーシヨ ンを行った。 次いで、 前記と同様に凍結処理された プロ一ブを ExpressHyb Hybridization Solutionで 10 ng/mlとな oよつ に希釈し、 この溶液 2 mlを用いて、 65°Cにて 1時間ハイブリダィゼ一シ ョンを行った。
ハイブリダィゼーシヨ ン後のメンブレンの洗浄は、 2 X SSC, 0.1% SDS溶液 20 mlで室温にて 5分間 2回振盪し、 続いて 0.2 x SSC, 0.1 % SDS溶液 20 ralで 68でにて 15分間ずつ 2回振盪しながら行った。 SDSを除 去するために、 D IG緩衝液 Iで室温にて 1分間 2回洗浄し、 次に 50 mlの D IG緩衝液 Ι Γ で、 室温にて 1時間ブロッキングを行った。 次いで、 0. 2 °/oTween20を含む DIG緩衝液 Iで 5000倍に希釈しておいた抗 DIGアル力リ ホスファタ一ゼ標識抗体を 10 ml用いて 30分間処理し、 0. 2% Tween20を 含む DI G緩衝液 I を 50 ml用い室温にて 20分間、 振盪しながら洗浄を 2回 行った。 10 mlの DIG緩衝液 I I Iに室温にて 3分間 2回浸した後、 メンブ レンをハイブリバックに移し、 D I G緩衝液 111で 100倍に希釈しておいた CSPDを全体にゆきわたるように延ばし、 インスタン トフイルム T612上で 感光させた。
この結果を図 9に示すが、 ニヮ トリ （レーン 8 ) を除くすべての動物 種において明瞭なシグナルが認められることから、 本発明の新規コレク チン遺伝子は、 哺乳類におレ、て保存されていることが明らかとなつた。
実施例 8 ：新規コレクチンの遺伝学的解析
得られだ新規コレクチンの D N A配列に基づき、 既知のコレクチンと の遺伝的位置付けを明らかにするために解析を行い、 遺伝的系統樹を作 成した。
解析の対象としたコレクチンは、 図 1 0に示す各種コレクチンフアミ リーのタンパク質 （図中、 CL- L1は本発明者らが最近単離したヒ ト肝臓 由来のコレクチンを示す （特願平 10- 1 1281号明細書参照） ） であり、 GenBankデータベースからそれぞれのァミノ酸配列を検索して得られた データをもとにレクチンドメインを含む領域を用いて clustalw法でマル チプル . アラインメントを作成し、 それらをもとに N- J法 （neighbor - joiningiifej しヽ、 Phyl ip Version 3. 57c packageプ σクフム ¾；· レヽ て遺伝的系統樹を作成した。
その結果を図 1 0に示すが、 SP- D、 ゥシ CL- 43及びゥシコングルチニ ンで 1つのクラスターを形成し、 さらに MBP及び SP - Aでそれぞれ別々に クラスターを形成していたが、 本発明の新規コレクチン遺伝子は CL- L1 と同様これらのいずれのクラスタ一にも属していないことが示された。 また、 本発明の新規コレクチンは CL - Liとも異なる、 従来報告されてい るコレクチンとは遺伝的に別のクラスターを形成するものと推測された a
実施例 9 ：新規コレクチンに対するモノクローナル抗体の調製 新規コレクチン 100 /i gを P B S (—） （カルシウムイオン及びマグネシ ゥムイオン不含の P B S ) 100 1に溶解したものと完全フロイン トアジ ュバンド 100 1を混合し、 ェマルジヨンを作成し、 BALBZcマウス （雌 性、 8週齢） 2匹の腹腔內に注射する。 3週間後、 同様にして 2回目の 免疫を行う。 但し、 完全フロイントアジュバンドのかわりに不完全フロ イントアジュバンドを用いる。 さらに 2週間後、 血清を採取し抗体価を 測定する。 一番抗体価の高いマウスを選び、 一週間後、 2回目と同様に して最終免疫を行う。 最終免疫の 5日後、 脾臓を採取し、 細胞浮遊液を 調製する。 細胞融合は、 骨髄腫細胞 NS— 1細胞 2 X 10'個と調製した脾細 胞 I X 108個を混合して行う。 混液を 1， 600rptn、 6分間室温で遠心後、 上 清を除去し、 残った細胞をほぐしたところにポリエチレンダリコ一ル
(PEG) を lml、 1分間をかけて添加し、 室温で 1分間攪拌する。 その後 、 あらかじめ 37°Cで保温しておいた基本培地 （イスコフ培地、 0 /oFCS 、 2mM L—グルタミン溶液、 0. 05mM 2—メルカプトエタノール） 1mlを 1 分間かけて滴下しながら軽く混ぜる。 この操作をもう一度繰り返した後 、 今度は 8mlを 3分間かけて同様の操作を行う。 その後、 l , 000rpm、 5分 間、 室温で遠心することにより PEGを除去する。 ペレッ トをほぐし、 そ こへ 5 X 10δ個 Zmlの胸腺細胞浮遊液 （ハイブリ ドーマ形成率を高めるフ ィーダ一細胞として使用、 HATを含むハイプリ ドーマ増殖培地に浮遊さ せたもの） 100mlを加えて浮遊液を作製する。 この浮遊液を 96穴プレー トに 0. lmlずつまきこみ、 C02インキュベータ一にて、 37CC、 5 %C02で培 養を行う。
ハイプリ ドーマの選択は以下のようにして行う- 培養開始 1 日後、 各 ゥエルに HAT培地 （HATを含むハイブリ ドーマ增殖培地） 150 /i lを添加し た後、 引き続き、 2日間培養する。 2日後培地の 150 μ 1を除去し、 そこ へ HAT培地 150 μ 1を添加して培地交換を行い、 さらに 3 日および 7日培 養後も、 同様に培地交換を行う。 その 4日後、 培養上清 LOO / Iを採取し 新規コレクチンに対する抗体価を測定してスクリーニングを行う。 次に 、 抗体陽性細胞をパスツールピペッ トを用いて、 96穴プレートから 24穴 マルチプレートに移す。 この時、 各ゥエルにあらかじめ HT培地 （ヒポキ サンチン及びチミジンを含むハイブリ ドーマ増殖用培地） 0. 5mlを添加 しておく。 3 日間培養後、 培地を一部採取し、 抗体価を再測定した結果 、 抗体陽性と判断できる細胞をクローニングおよび凍結保存する。 クロ 一ユングは陽性細胞を胸腺細胞浮遊液で限界希釈して 1個 mlに調製し 、 96穴マルチプレートに 0. 2mlずつまきこむ。 10日間培養後、 1 ゥエル に 1個だけコロニーを形成しているものの抗体価を測定し、 高い抗体価 が示されたもの 2個を選択する。 この 2コロニーについて再クローニン グを行う。 方法は 1回目のクロ一ニングと同様の方法で行う。 抗体陽性 細胞は続いて培養拡大を行う。 まず、 24穴マルチプレートに移した後、 3 日間培養後、 25cm2フラスコに移し、 さらに 3 日後、 225cm2フラスコに 移して培養をさらに 3 日間続け、 培養上清を回収することによってモノ ク口一ナル抗体を調製する。
また、 腹水からのモノクローナル抗 ί本の製造は、 クローニング済みの ハイブリ ドーマを 1 X 107個 Zmlに調製し、 マウス 1匹当たり lmlを腹腔 内に注射することにより行う 3 1週間後、 腹部の肥大したマウスをェ一 テルで麻酔し、 腹水を採取する。 血清分離剤入り凝固促進型遠心管に移 し、 室温 30分問放置後、 3,000rpm、 5分間遠心する。 上部の腹水を回収 、 さらに硫安塩折で精製して抗体を得る。
実施例 1 0 ：抗マウス抗ヒ ト新規コレクチン抗体を用いた E L I S A 抗マウス抗ヒ ト新規コレクチン抗体をコーティングバッファ一 （50mM 炭酸一炭酸水素バッファ一、 pH9.6) で 10μ gZmlに希釈し、 この抗体液 を 96穴 E L I S Aプレートに 100μ 1ずつ分注する。 その後、 4°Cでー晚 インキュベートする。 洗浄液 （TBSZT液 （25mM Tris— HC1, 0.14M NaCl , 5mM KC1, 0.05% Tween 20， pH7.4) ) 300 1で 3回洗浄する。 以下の 洗浄は同様にして行う。 5%スキムミルク/ TBSZT液 300μ 1を分注し、 37°C、 1時間静置する。 洗浄後、 被験試料および新規コレクチン標準品 を 100 1分注し、 37°Cにて 1時間静置する。 このとき被験試料は適当に 希釈を行い、 標準品は 0. OS gZralを最高濃度とし 2倍連続希釈列を用い る。 洗浄後、 i gZmlピオチン化抗ゥサギ抗ヒ ト新規コレクチン抗体 100 / 1を分注し、 37°C、 1時間静置する。 洗浄後、 ピオチンス トレプト アビジン液 100μ 1を分注し、 37eC、 30分間静置する。 さらに洗浄後、 3, 3' ， 5, 5' —テトラメチルベンチジン溶液 100μ 1を分注し、 30分間 室温にて放置後、 1N リン酸 100μ 1を添加することにより、 反応を停止 し、 波長 450 nmで吸光度を測定を行う。
この方法を用いて標準品により検量線を作成し、 新規コレクチンを定 量する。
実施例 1 1 ： ヒ トに対する免疫原性を低下させた抗体の調製
まず、 実施例 9に記載の方法で獰られたマウスハイプリ ドーマから m RNAを調製し、 ファージベクターを用いた c DN Aライブラリ一を作 製、 c DNAクロ一ニングを行う。 定常領域 c DN Aをプローブとした マウス抗体 c DNAクローニングし、 制限酵素を用いて挿入された c D N Aの解析を行い、 抗体 c D N Aの塩基配列の決定する。
次に、 キメラ抗体を発現させ、 クロ一ニングした抗体遺伝子における 変異の有無などを抗体結合活性から確認し、 また、 発現させたヒ ト化抗 体の結合活性を検討するときのポジティブコントロールとして使用する 。 キメラ抗体を発現する際には、 ヒ ト抗体 H鎖、 L鎖の定常領域遺伝子 が一^ ^のべクタ一上にクローニングされているカセッ トタイプの発現べ クタ一を用いる。 キメラ抗体の結合活性を確認し、 クロ一ニングしたマ ウス抗体遺伝子に間違いがないと判断できたところで、 ヒ ト化抗体遺伝 子の構築を行う。 キメラ抗体作製法とは異なり、 ヒ ト化抗体の場合は構 築する遺伝子の設計を行わなければいけない。 決定されたマウスの抗体 可変領域遺伝子の塩基配列をもとに、 データベースを利用して相同性の 高いヒ ト抗体可変領域のアミノ酸配列を検索する。 CDR配列を除いて 70 〜80%の相同性を有するものを見いだし、 このように選択したヒ ト抗体 可変領域から CDR配列を除いた領域 （フレームワーク領域） にマウス抗 体 CDR配列を移植して、 蛋白構造解析ソフ トにより分子モデリングを行 う。 モデリングにより抗原と結合する H鎖、 L鎮上の合計 6個の CDRが三 次元構造上最もオリジナルのマウスモノクローナル抗体のものに近くな るように、 ヒ トフレームワーク領域の配列を H鎖、 L鎖それぞれ数アミ ノ酸ずつをマウス型に戻す。 この場合、 マウス型に戻す数が少なければ 少ないほど、 よりヒ ト抗体に近い抗体が得られるので理想的である。 こ のような分子モデリングでは、 一つのモデルから出発したヒ ト化抗体が マウスモノクローナル抗体に等しい活性を 100 %再現できる確立は低い ため 10種類以上のバ一ジョンのヒ ト化抗体遺伝子を設計、 発現して活性 を比べる。
遺伝子設計終了後、 実際に遺伝子の構築を行う。 ヒ ト化抗体 H、 L鎖 の定常領域遺伝子を含むカセッ トタイプの発現べクターにクローニング し、 COS細胞などを用いて一過性発現を行い培養上清の抗体活性を E L I S A法を用いて確認する。 活性の強かった数種類を選択して、 それぞ れ恒常発現用の発現ベクターと COS細胞などの宿主細胞を用いて恒常発 現する細胞を確立し、 培養上清から精製抗体を調製する。
実施例 1 2 ：新規コレクチンの発現べクタ一 pNOW卜 hCL-P lの構築 まず、 配列番号： 1に示す新規コレクチンの開始コ ドンから終止コ ド ン 3;で ¾T、 aaggaaaaaa gcggccgcat gcaacaagat ttgatgaggの塩 酉己歹 lj
(配列番号： 2 6 )力 らなるプライマ一と、 gctctagatt ataatgcaga tgacagtacの塩基配列 （配列番号： 2 7 )からなるプライマ一を用いて、 ザィモリアクタ一 （アト一社製） で増幅させる。
得られた新規コレクチンの c D N Aを制限酵素 Not Iと Xbalで消化して 、 新規コレクチンの c D N Aの 670〜1698 bpに対応する c D N A部分 （ 配列番号： 1参照） を得、 これを挿入体とする。
次に、 発現べクタ一 pNOW/CMV-A (特開平 10-179169号明細書参照） を 、 制限酵素 No 11と Xba Iで消化して、 サイ トメガロウィルスプロモータ一 (pCMV)の下流、 すなわち、 P C M V (サイ トメガロウィルス初期主要抗原 プロモータ一） と BGPポリ A (ゥシ成長ホルモンポリアデニレ一ションシ グナル） の間に、 前述の挿入体を D N Aライゲ一シヨンキット （宝酒造 製） を用いて挿入する。 このようにして得られた発現べクタ一をプラス ミ ド pNOWl - hCL-Pl (hCL-Pl：新規コレクチンをコードする塩基配列） と 命名し、 その構造の模式図を第 1 1図に示す。
実施例 1 3 ：新規コレクチンを発現するクローンの選択
( 1 ) ジヒ ドロ葉酸還元酵素欠損（dhfr_ )のチャイニーズハムスター 卵巣 (CH0)細胞への発現べクタ一 pNOWl - hCL- P1の導入
ゥシ胎児血清（FCS、 GIBC0社）を 10%添加した（ヒポキサンチン、 チミ ジンを含まなレヽ） Iscove' s Modifi ed Dulbecco' s Medium (IMDM、 GIBCO 社）を調製し、 これに DHFR遺伝子が欠損した（dhfr—) DG44 CHO細胞株を、 1 X 105細胞 Zmlになるように混合し、 これを直径 60mmのディッシュに 播種し、 r cで、 5 %炭酸ガス（co2)の条件下で、 24時間培養する。 培 養上清を廃棄し、 その代わりに別途予め、 5 u gのD N A (発現べクタ — pNOWl-hCL-P l ) をリポフエクチン溶液 (DOTAP Liposomal Transfect- i on Reagent ;ベーリンガーマンハイム社製） に混合して得た溶液 100 μ 1 を含む10%卩じ5添加11\«¾1を加ぇて6 [111とし、 さらにヒポキサンチン（終濃 度 10nM) (GIBC0社製）とチミジン（終濃度 ΙΟΟηΜ) (GIBC0社製）を加え、 16時 間培養し、 dhfr_の宿主 CH0細胞への発現べクター pNOW卜 hCL-Plの導入を 行う。 その後、 培養上清を廃棄し、 10 %FCS、 ヒポキサンチン、 チミジ ン添加 IMDMの 6 mlを加え、 さらに 24時間培養を行う。
( 2 ) ネオマイシン（G418)耐性 CH0細胞の取得
発現べクタ一 pNOW卜 h -Piが導入された細胞を 24時間培養した後、 こ れをトリプシン処理してディッシュより回収し、 細胞数を計測した後、 1 X 105細胞/ mlになるように 400 g/mlの濃度のネオマイシン（G418)を 含む 10°/o FCS添加 IMDMで細胞を懸濁したものを、 0. 1ml/ゥエルの量で 96 ゥエルのマイクロプレート 10枚に播種 （分注） する。 37°Cで、 5 %炭酸 ガス（C02)の条件下培養し、 2週間後の生存細胞を G418耐性細胞 （クロ ーン） として取得する。
これら G418耐性クローンを、 hCL-Plの産生性について確認する。 hCL -
P 1の産生が確認されたクローンの中からいくつかを選択し、 各クローン を、 25cm2のカルチヤ一フラスコに播種する。 細胞が密集するまで （お よそ 3 X 10e細胞 /25cm2カルチャーフラスコ） 培養を行う。 それぞれの カルチヤ一フラスコの培養上清を廃棄し、 前出のものと同じ組成の 10% 卩 5添加1 ¾«¾を2 1111加ぇ、 4日間培養し、 その培養上清を回収する。 回 収した培養上清中の hCL - Pl (rha- P1 ：組換えヒ ト新規コレクチン）の産 生量を測定する。 なお、 hCL- P1の産生量は、 対照として下記鈴木らの方 法を用いて大腸菌で発現させた hCL- Pl、 コレクチンの糖認識領域（CRD) とネック領域 （同様の方法を用いて大腸菌で発現させたもの） に対する 抗ゥサギポリクロ一ナル抗体および h - P1 (定量対象） を用いて、 鈴木 らの方 Ϊ¾(Υ· Suzuki, et al. , Characterization of Recombinant Bovine Conglut inin Expressed in a Mammalian Cell", Biochem.
Biophvs. Res. Commun. , 238, pp.856-863 (1997) )に準じて定量する。
(3) メ ト トレキセ一ト耐性の CH0細胞の取得
上記実施例 1 3 (2) で得られる hCし- P1産生クローンをさらに継代培 養して安定化させた後、 低濃度のメ ト トレキセ一ト （MTX) を培地に加 えて遺伝子増幅を行う。
まず、 5ηΜ ΜΤΧ、 400μ g/mlの G418を加えた 10%透析済 FCS(JRHバイオ サイエンス社製）添加 IMDMに、 選択した各細胞クローンを混合し、 0.1ml /ゥエルの量を 96ゥエルのマイクロプレート 10枚に播種 （分注） する。 37°Cで、 5 %炭酸ガス（C02)の条件下で培養を行い、 2週間後の生存細 胞を 5nM MTX耐性細胞 （クローン） として取得する。
これら 5nM MTX耐性のクローンを、 hCL- P1産生性について確認する。 hCL- P1の産生が確認されたクローンの中からいくつかのクローンを任意 に選択し、 それぞれを 25cm2のカルチヤ一フラスコに播種し、 細胞が密 集するまで 2週間培養する。 培養上清を廃棄し、 前出のものと同じ組成 の 10。/。FCS添加 IMDM(5nM MTX、 400 g/ml G418を加えたもの） を 2 ml加 え、 4 日間培養し、 その培養上清を回収し、 h -Plの産生レベルを確認 する。 なお、 hCし- P1の産生量の定量は、 実施例 1 0に記載の E L I S A 法に準じて行う。
実施例 1 4 ： トランスジエニックマウスの作製
コレクチンは基礎免疫に重要な役割を担っていると考えられている。 また、 本発明の新規コレクチンは従来のコレクチンとは遺伝的に別のク ラスタ一を形成するものと考えられるので、 免疫に関する新たな知見を 得、 また当該新規コレクチンの作用機序を解明する上で重要なツールを 提供するために、 この新規コレクチンの トランスジエニック非ヒ ト動物 を作製する。
本発明のヒ 卜由来の新規コレクチンをマウスで発現させることのでき るプラスミ ドを構築する。 まず、 ニヮ トリー 3—ァクチンプロモータ一 とその上流にサイ トメガロウィルスェンハンサ一を有する哺乳動物発現 ベクター （Niwa, H. et al. ； Gene, 108, 193—200, 1991) より 2. 3 kb断片を Sal I/Pst I消化により切り出し、 これをクローニングべクタ — pBluescript (Stratagene社製） の Sal I/Pst I部位へ挿入し、 pBsCAG— 2ベクタ一を構築する。 この 2. 3 kb断片中には、 上記ェンハ ンサ一 プロモーターおよびゥサギ一 β—グロビン遺伝子の一部 （第 2 イン トロン、 第 3ェクソン、 3 ' 非翻訳領域） が含まれている。 hCL - P1 の c DNA (配列番号： 1の第 670〜1698位） を上記第 3ェクソンの Eco RI部位に揷入し、 トランスジエニックマウス発現用プラスミ ド pj3A/h CL - PIを構築する。
次に、 アルカリ- SDS法により大量のプラスミ ド pj8 AZhCL-Plを準備し 、 CsCI平衡密度勾配超遠心法により精製を行う。 /8 ノ^し-?1を5&.1 I ノ Bam HI消化した遺伝子を単離し、 ベクター部分を切り離す。 その後、 ァガロースゲル電気泳動によりべクタ一 DN A断片と分離し、 導入 DN A断片をゲルから切り出し、 GeneClean II Kitを用いて D N A断片を精 製する。 エタノール沈殿の後、 インジヱクシヨン用 DNA溶解液 （10mM Tris-HCl (pH7.5), 0.25mM EDTA) に溶解し、 15, OOOrpm (20,000 xg) 、 5分間の遠心後、 上清を回収する。 分光光度計で吸光度を測定して D NA濃度を計算し、 500 DNA分子 Zplになるように調製し、 マウス第 —細胞期胚への D N A導入まで、 50mlずつ分注して一 20°Cに保存する。 次に D N Aを注入するためのマウス受精卵を調製する。 まず、 受精卵 採取用雌性マウスを過排卵誘起を施すため、 妊馬血清性性腺刺激ホルモ ンおよびヒ ト絨毛性性腺刺激ホルモンを 4 8時間間隔で 5 I Uノ bodyを腹 腔内に投与し、 雄性マウスと同居させる。 膣栓が形成されているマウス の腹腔を開き、 卵管を取り出し BWW- Hepes培地 （NaCl 102. 2m 、 KC1 4. 7 8mM、 Κ¾Ρ04 1. 19mM、 CaCh 1. 17mM、 MgSO^ 1. 19mM、 aHCOs 4. 76mM、 Hepes l 5mM、 乳酸ナトリウム 25mM、 ピルビン酸ナトリウム 0. 25mM、 グ ノレコ一ス 5. 56mM、 BSA 4mg/mL, EDTA 0. ImM及びフエノールレツ ド 0. 00 025%含有） で洗浄した後、 300mg/mlのヒアル口ニダーゼを含む BWW -
Hepes培地に入れる。 実体顕微鏡下に卵管膨大部を時計用ピンセッ トで 引き裂き、 受精卵を培地中に取り出した後、 受精卵をガラスピペッ トで 拾い上げ、 BWW- Hepes培地で 5回洗浄する。 その後、 受精卵をミネラル オイルで覆われた BWW培地のドロップの中に入れ、 37。C、 5% C02インキ ュベータ一で培養する。
引き続き、 受精卵前核への D N A注入を行う。 60 剛のシャーレに BWW -Hepes培地と D N A溶液 （500 D N A分子/ p i ) のドロップを作り、 その 上をミネラルオイルで覆った後、 インジェクションピぺッ トとホ一ルデ イングピぺッ トをそれぞれのインジェクターに取りつけ、 BWW-Hepes培 地の上のドロップに受精卵を入れる。 インジェクションピペッ トに D N A溶液を吸引し、 ごくわずか陽圧になるようにィンジェクタ一を調節し 、 先端から持続的に D N A溶液を流出させておく。 インジェクションピ ぺッ 卜側に雄性前核がくるようにホ一ルディングピべッ トで卵を吸引し 、 対物レンズの倍率を 40倍にして前核に焦点を合わせた後、 インジェク シヨンピぺッ トの先端が前核と同じ平面にくるように調節する。
その後、 インジェクショ ンピペッ トの先端を前核の中に突き刺し、 D N A溶液を注入する。 核の膨化を確認した後、 ピベッ ドをすばやく抜き 取り、 インジェクションした卵は下のドロップに移動させ、 未処理の卵 と混ざらないように操作する。 一度に約 30個の卵をィンジェクションし 、 その後 BWW培地のドロップに移して、 37 ：、 δ% C02インキュベータ一 で培養する。
培養後、 受精卵の卵管への移植を行う。 ネンブタール注射液を希釈液 で 10倍に希釈し （終濃度 5mg/ml) 、 体重 igあたり 0. 01ml腹腔内に投与し て偽妊娠マウスに麻酔をかける。 約 30個の卵をできるだけ少量の培地 (0. 5〜1. 0ml) とともに吸い上げておいたトランスファーピべッ トを用 いて、 卵管開口部に注入する。 卵巣と卵管を体内に戻して切り口を縫合 する。 その後飼育を続けて、 およそ 19日後に出産する仔を得る。
トランスジエニックマウスのスク リ一ニングはドッ トブロッ トハイブ リダイゼーションにより以下のようにして行う。 得られた仔は生後 4週 間で離乳させ、 尾部の先端部分約 1 cmを麻酔下で切断し、 1. 5mlのエツ ペンドルフチューブに入れる。 0. Stng/tnlのプロティナーゼ Kを含む STE buffer (50mM Tris- HC1， lOOmM EDTA (pH7. 5) , 0. 5% (w/v) SDS )を 0. 5 ml加え、 55°Cのインキュベータ一中で一晩振盪する。 尾部溶解液のうち 100mlを新しいチューブに取り、 TE飽和フエノール 200mlと TE buffer 1 10mlを加え、 ボルテックスミキサーに 5分間かけた後、 15，000rpm (20, 000 xg) 、 5分間、 室温で遠心する。 得られた水層 200mlを新しい チューブに取り、 フエノール Zクロロホルムを 200ml加えて 5分間ボルテ ックスミキサ一にかけた後、 I5, 000rptn (20, 000 xg) 、 5分間、 室温で 遠心する。 上清を新しいチューブに取り、 3M 酢酸ナトリウム 20mlとェ タノ一ル 500mlを加え、 D N Aの糸状沈殿物が目視可能となるまで十分 混合するように振り、 i 5，000rpm (20, 000 xg) 、 5分問、 4。Cで遠心する 。 上清を除いて 70%エタノールで洗浄の後、 5分問乾燥させ、 D N A沈 殿を 100mlの 2M NaCl、 0. 1M NaOH溶液に溶解する。 沸騰水浴中で 5分間加 温後、 氷水中で急冷し、 D N Aを変性させる- 96穴マ二ホールドをセッ トし、 D N Aをナイロンメンブレン上にスポッ トし、 メンブレンを風乾 した後、 80。C、 2時間加熱する。 導入した D N Aのうちマウス由来の配 列を含まない部分をプローブに用いて、 通常の方法でハイブリダィゼ一 シヨンを行う。 この結果、 シグナルが確認できたものの個体をトランス ジェニックマウスとして同定する。
このようにして受精卵に遺伝子注入操作を行うと、 受精卵のうち約 9 割が生存し続ける。 この生存卵全てを 1匹当たり 2 5個程度となるよう レシピエントに移植してレシピエントが妊娠するようにし、 妊娠およそ 1 9日目生まれる仔を得る。 これらの仔の遺伝子解析を行って導入遺伝 子の存在を確認する。 さらに、 これらのトランスジエニックマウスより F1マウスを得、 トランスジーンの伝達性を調べる。
実施例 1 5 ： ノックァゥ トマウスの作製
まず、 C57BL/6J系マウス由来の E S細胞において本発明の新規コレク チンマウス相同体をコ一ドする目的遺伝子の一部のェクソン部分に、 選 択マーカー遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子を組み込んで、 ターゲ ッティング用 D N Aの構築を行う。 次にこの D N Aの E S細胞へのェレ ク トロポレーシヨンを以下のように実施する。 対数増殖期の E S細胞 (90匪シャーレ 文） を新鮮な E S培地 （20% FCS、 ImMピルビン酸溶液 、 0. ImM非必須アミノ酸溶液及び ImM 2-メルカプトエタノールを含む 80% DMEM 培地） に交換して 4時間さらに培養し、 培地を除去後、 PBS (—） でよく洗浄した後、 0. 1 %トリプシン溶液 0. 5ιτι1で 3分間処理する。 培地 を lml加えて単一細胞に分散させ、 600rpm、 4で、 5分間遠心し、 上澄み を捨て、 PBS (—） 5mlに懸濁し、 細胞数を測定する。 再度、 600rpm、 で、 5分間遠心し、 上澄みを捨て、 1. 1 X 107細胞/ mlになるように PBS (一）に懸濁する。 1. IX 107細胞 Zmlの懸濁液うち 0.9mlをキュべッ トへ 移し、 1 μ g/ μ 1の DNA溶液 （タ一ゲッティング用） 25 1(25 §) をキュベットに加えて、 室温で、 5分間静置する。 ジーンパルサ一を用 いて、 500yuF 230Vの条件で、 エレク トロポレーシヨンを行い、 5分間 放置後、 E S培地 （― G418) に懸濁し、 フィーダ一細胞が敷かれている シャーレ （ 90mm ) 4枚に 1ノ4ずつ播く。 エレク トロポレーシヨン後、 24時間培養したら、 150/ g/ml G418 (活性型）含有 E S培地に交換し、 その後毎日、 培地交換を行う。 7日後に以下のとおりにクローニングを 行う。
コロニーの出現した 90 シャーレより培地を除去し、 PBS (―)を 10ml 分注する。 実体顕微鏡の下で形態が良好なコロニーをチップで 1つずつ 搔取し、 吸い上げ、 それぞれのコロニーは、 あらかじめ 0.1%トリプシン 溶液 70μ 1 が入れられた 96穴プレートへ移す。 そのまま 37°Cに 4 5分間 放置し、 トリプシン処理を行い、 8連ピペットマンを用いて充分にピぺ ッティング後、 あらかじめ 75 yug ml G418含有 E S培地を 0.8 ml入れた 24穴プレート （フィーダ一細胞付き） の 4穴へ播く。 24時間培養後、 75 μ Ε/ l G418含有 E S培地と交換する。 3日後、 対数増殖期になったク ローンに、 0.1%トリプシン 100μ 1を加え、 E S培地を 100;/ 1加えてピぺ ッティング後、 丸底 96穴プレートへ移す。 48クローンのすべてを処理し たら、 培養用に 20μ 1とり、 残り 180μ 1は P C R用に用いる。
P C R用のクローンを 96穴プレートごと 1200rpm 4°C 5分間遠心し た後、 培地を除去し、 PBS (—）で 3回洗浄する- 8連ピペッ トマンを用い て溶解用溶液 （lOOmM Tris-HCl (pH8.0), lOmM EDTA, 0.2% (w/v) SDS, lOOmM NaCl, 100 μ g/mLプロティナ一ゼ K) 100 1を加え、 55°C 1時間 プロティナ一ゼ K処理を行う。 テープでブレートの回りに封をして、 さ らに 95°C、 分間保温してプロティナ一ゼ Kを完全に失活させる。 4°C にて 5分間冷却し、 2〜3 ;U 1を P C R用サンプルとして採取し、 第 1回目 のスクリーニングに用いる （残りは一 20°Cで保存する） c サンプルは 4 ク口一ンを 1グノレープとしてセンスプライマ一 ： atgcaacaagatttgatgagg (酉己列番号： 2 8 ) 及びアンチセンスプライマー ： cctacccggtagaattga cc (配列番号： 2 9 ) を用いた P C Rを行い、 電気泳動法によって目的 遺伝子を確認することにより陽性グループの同定を行う。 — 20°Cで保存 しておいた残りのサシプルのうち、 陽性グループに属する各クローンに ついて、 同様に P C Rを行い、 陽性クローンを同定する。 次に培養用ク ローンのスクリーニングを行う。 培養用のクローン 20 μ 1を、 24穴プレ —ト （フィーダ一細胞付き） の 4穴ノ列へ播き、 全部が埋まったら C02ィ ンキュベータ一へ入れて培養し、 最終的に 1ク口一ンを 3穴に分けて 6 穴プレー ト （フィーダ一細胞付き） に植え継ぐ。
遺伝子を導入した E S細胞隗を下記のとおりに調製したマウスの 2. 5 日胚 （8細胞期胚） 2個で挟み込むサンドイッチ法により生殖系列キメ ラマウスの作成を行う。
2. 5日胚の調製は、 以下の様に行う。 2. 5日胚 E S細胞の接着の 6日前 に 5 I Uの PMSG (妊馬血清性腺刺激ホルモン） を採卵用の C57BL/6J系雌性 マウスの腹腔内に投与する。 4日前さらに 5 IUの hCG (ヒ ト絨毛性性腺刺 激ホルモン） を腹腔内に投与し、 雄と交配させる。 3日前、 膣栓により 交尾を確認し、 自然発情している偽妊娠用雌マウスを精管結紮雄マウス と交配させる。 膣栓により交尾を確認し、 偽妊娠マウスとする。 接着当 日採卵用雌マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、 卵管および子宮を摘出 する。 卵管と子宮を BWW— Hepes培地で環流し、 2. 5日胚 （8細胞期胚およ び桑実胚） を採取し、 胚を BWW培地のドロップに移し、 C02インキュベー ター （5°/o C02， 37°C) 中で培養する。 採卵し 2. 5日胚を酸性タイロード 液のドロップ （200 μ Ι ) に移し、 1〜2分間静置し、 透明帯が溶解したら すぐに BWW— Hepes培地で 6回洗浄して E S細胞との接着に使用する。
E S細胞の調製は以下のようにして行う。 接着当日、 フィーダ一細胞 上に培養している E S細胞を PBS (—）で 2回洗浄し、 0. 05。/0トリブシン 液を 2分間作用させ、 数十細胞の塊となるようにシャーレから剥取する 。 E S培地 （― G4 I 8) を加え、 トリプシンを不活化し、 遠心後、 E S培 地に懸濁する。 0. 1 %ゼラチンを被覆したシャーレに播き、 15分間 C02 ィンキュベ一ター中に静置する。 シャーレに接着しなかった細胞を集め 、 これを集合キメラ作製に使用する。
2. 5日胚と E S細胞の接着は、 以下のようにして行う。 先ず、 細菌培 養用のシャーレの底に-—ドルで小さな穴を開ける。 穴を 20 // 1の BWW培 地のドロップで覆い、 さらにミネラルオイルでカバ一する。 C02インキ ュベータ一に入れ、 培地をこの条件に平衡化しておき、 実体顕微鏡下に 良好な形状を有する、 10〜20個からなる E S細胞塊を選別する。 先に作 製した穴の中に、 E S細胞塊を 1つずつ入れる。 透明帯を除去しておい た 2. 5日胚を 2個ずつ穴の中に入れ、 E S細胞塊と接着させる。 C02イン キュベータ一でー晚培養し、 2個分の大きさからなる 1つの胚盤胞を得る 次に、 3. 5日胚を子宮へ移植する。 偽妊娠マウス （交尾後 2. 5日） の腹 腔内にネンブタール注射液を投与し （体重 l g当たり 50 g) 、 麻酔をか ける。 麻酔のかかったマウスの後背部を開き、 脂肪塊を摘んで子宮を引 き出す。 一晩培養してできた胚盤胞もしくは桑実胚を、 10〜15個ずっ少 量の培地 （0. 5〜1. 0 /z l ) とともにピペッ トで吸いあげ、 実体顕微鏡下 で、 注射針で子宫壁の卵管に近い部分に穴を開け、 その穴にピペッ トを 挿入して、 胚を子宫内に移植する。 子宮を体内に戻して切り口を縫合し 、 およそ 18日後に出産する仔を得る。
生殖系列への伝達を確認後、 ヘテロ同士のマウスをかけ合わせること によりホモ化し、 目的とする本発明の新規コレクチンの相同体を発現し ないノックァゥ トマウスを得る。
〔産業上の利用可能性〕
以上説明したように本発明によって、 抗菌性、 抗ウィルス活性が確認 されているコレクチンに特徴的な構造を有し、 従来報告されているもの とは異なる新規コレクチン及びそれをコードする遺伝子が提供される。 本発明によって得られる配列情報は、 生体防御機構の解明に有用であ り、 また新規コレクチンが有する生物学的活性を利用した医薬、 実験用 途のツールを提供することができる。 例えば、 この新規コレクチンを発 現できるベクター、 このべクタ一を発現可能に含む宿主細胞、 新規コレ クチンに対する抗体の他、 新規コレクチン関連分子種をスクリーニング するためのプローブが提供される。
さらに、 新規コレクチン及び または由来分子の機能あるいは発現調 節の研究、 ヒ トにおいて発現している細胞に関連する疾患のメカニズム の解明、 医薬品のスクリ一ニング ·安全性試験に用いる疾患モデル動物 として有用なトランスジエニック非ヒ ト動物、 ノックァゥ ト非ヒ ト動物 が本発明によって提供される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下のアミノ酸配列すなわち、
Met— Gin— Gin— Asp—し eu— Met— Arg—) er— Arg— Leu— Asp— Thr—J I U— Val— Ala— Asn— し eu— Ser— Val— l ie— Met— Glu— Glu— Met—し ys— Leu— Val— Asp— Ser—し ys— His— Gly— Gin—し eu— l ie—し ys— Asn— Phe— Thr— l i e—し eu— Gin— Gly— Pro— Pro— iy— Pro— Arg— Gly一 Pro— Arg— Gly— Asp— Arg— Gly一) er— Gin— Gly— Pro— Pro— ir丄 y— Pro— Thr一 Gly— Asn—し ys— Gly— Gin—し ys— Gly— Glu—し ys— Gly— Glu— Pro~Gly— Pro— Pro— Gly— Pro— Ala - Gl y-Glu - Arg - Gly - Pro - l ie- Gly- Pro - Ala- Gly - Pro- Pro - Gly - Glu - Arg - Gly— Gly—し ys— Gly— Ser—し ys— Gly— Ser— Gin— Gly— Pro—し ys— Gly— Ser— Arg— Gly— Ser - Pro - Gly—し ys— Pro - Gly - Pro— Gin - Gly - Pro - Ser^Gly - Asp - Pro - Gly— Pro - Pro— Gly— Pro— Pro— Gly—し ys— Glu— Gly—し eu— Pro— Gly— Pro— Gin— Gly— Pro— Pro— Gly-Phe- Gin- Gly-Leu- Gln-Gly- Thr- Val- Gly- Glu- Pro-Gly-Val- Pro- Gly - Pro- Arg- Gly- Leu - Pro - Gly - Leu - Pro - Gly - Val - Pro~Gly - Met- Pro - Gly - Pro - Lys- Gly - Pro- Pro - Gly - Pro - Pro - Gl y - Pro - Ser- Gly - Ala-Val - Val - Pro -し eu - Ala -し eu - Gin- Asn - Glu - Pro - Thr - Pro - Ala - Pro - Glu - Asp - Asn - Gly - Cys - Pro - Pro— His— Ττρ—し ys— Asn— Phe— Thr— Asp—し ys— Cys— Tyr— Tyr— Phe— Ser— Val— Glu— し ys— Glu— l ie— Phe— Glu— Asp— Ala—し ys—し eu— Phe— Cys~Glu— AspHLys— Ser— Ser— His—し eu— Val— Phe— l ie— Asn— Thr— Arg— Glu— Glu— Gln~Gln—丁 rp— l ie— Lys—し ys— Gin- Met-Val- Gly- Arg- Gl u- Ser- Hi s- Trp- l ie- Gly-Leu-Thr- Asp- Ser- Glu - Arg— Glu— Asn— Glu— Trp—し ys— Trp—し eu— Asp— Gly— Thr— Ser— Pro— Asp— Tyr—し ys— Asn - Trp -し ys- Ala - Gly - Gin - Pro - Asp - Asn - Trp - Gly - Hi s - Gly - His - Gly - Pro - Gly— Glu— Asp— Cys— Ala—ily—し eu— l ie— Tyr— Ala— ly~Gln— Trp— Asn— Asp— Phe— Gin - Cys- Glu - Asp - Val- Asn - Asn - Phe - l ie - Cys - Glu- Lys - Asp- Arg- Glu- Thr- Val-し eu- Ser- Ser-Ala-し eu (配列番号： 2 第 206〜547位)
からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む単離されたポリヌク レオチド
2 . 以下のアミノ酸配列すなわち、
Met—し ys—し eu— Val— Asp_Ser— Lys— Hi s— Gly— Gin—し eu— l ie—し ys— Asn— Phe— Thr— 11 e -し eu - G 1 n - G 1 y - Pro - Pro - G 1 y-Pro-Arg-G 1 y-Pro-Arg-G l y-Asp-Arg-Gly- Ser- Gin- Gly- Pro- Pro- Gly- Pro- Thr- Gly- Asn- Lys- Gly-Gln- Lys- Gly- Glu- し ys - Gl y— Glu - Pro - Gly - Pro - Pro - Gl y - Pro - Ala - Gly- Glu - Arg - Gly - Pro - l ie - Gly—PΓO—Ala—Gly—PΓo—PΓo—Gly—Glu—ΛΓg—υ丄y—^Jly—しys—Gly—SeΓ—しys—Gly— Ser - Gin— Gly - Pro - Lys - Gly - Ser - Arg - Gly -;) er - Pro~Gly -し ys - Pro - Gly - Pro - Gin - Gly - Pro - Ser - Gly - Asp - Pro - Gly - Pro - Pro - Gly - Pro - Pro - Gl y-し ys - Glu - Gly—し eu— Pro— Gly— Pro— Gin— Gl y— Pro— Pro—Gly— Phe— Gin— Gly—し eu— Gin— Gly— Thr-Val-G 1 y- Gl u - Pro- G 1 y-Va 1 -Pro-G 1 y-Pro-Arg-G 1 y-Leu-Pro-G 1 y - Leu- Pro - G ly-Val -Pro-G 1 y - Me t - Pro-Gl y - Pro -し y s - G 1 y - Pro - Pro - G 1 y - Pro - Pro - Gly— Pro— Ser— Gly— Ala— Val— Val— Pro—し eu— Ala—し eu— Gin— Asn— Glu— Pro— Thr— Pro - Ala - Pro - Glu - Asp - Asn - Gly - Cys - Pro - Pro - Hi s - Trp -し ys - Asn - Phe— Thr - Asp—し ys— Cys— Tyr— Tyr— Phe— Ser— Val— Glu—し ys— υ丄 u— l ie— Phe— Glu— Asp— Ala— し ys— Leu— Phe— Cys— Glu— Asp—し ys— Ser— Ser— His— Leu— Val— Phe— l ie— Asn— Thr— Arg- Glu - Gl u-Gln- Gin- Trp-I le- Lys-Lys- Gin - Met- Vaト Gly- Arg-Glu-Ser- His— Trp— l i e— Gly—し eu— Thr— Asp— Ser— Glu— Arg— Glu— Asn— Glu_Trp—し ys— Trp— し eu— Asp— Gly— Thr— Ser— Pro— Asp— T r— Lys— Asn— Trp—し ys— Ala— Gly— Gin— Pro— Asp - Asn - Trp-Gly - His - Gly - His - Gly - Pro - Gly-Glu— Asp - Cys - Ala - Gly -し eu - I le-Tyr-Ala-Gly-Gln-Trp-Asn-Asp-Phe-Gln-Cys-Glu-Asp-Val-Asn-Asn- Phe— l ie— Cys— GIu—し ys— Asp— Arg— Gl u— Thr— Val—し eu— Ser— Ser— Ala—し eu (g己歹 U番号 ： 2、 第 229〜547位）
からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む単離されたポリヌクレオチド
3 . 前記タンパク質が、 第一メチォニン残基 （配列番号： 2、 第 229位） の 上流に以下のァミノ酸配列：
Met- Glu- Glu (配列番号： 2、 第 226〜228位) または
Met— Arg— Ser— Arg—し eu— Asp_ i'hr IJI U Val— Ala— Asn—し eu—;) er— Val— l ie—! Met— Glu— Glu (配列番号： 2、 第 211〜228位）
をさらに含む請求の範囲第 2項記載のポリヌクレオチド。
4 . 前記タンパク質が、 第一メチォニン残基 （配列番号： 2、 第 229位） の 上流に以下のアミノ酸配列：
Met-Gl u-Asn-I le_Thr-Thr-I le—i>er-Gln-Ala-Asn~Glu-ijin-Asn-Leu-Lys- Asp—し eu— Gin— Asp—し eu— Hi s— Lys— Asp— Ala— Glu— Asn— Arg— Thr— Ala— l ie—し ys— Phe— Asn— Gin—し eu_Glu— Glu— Arg_Phe— Gin—し eu— Phe— Glu— Thr— Asp— l ie— Val— Asn— I l e— l i e— Ser— Asn— l ie— ser— Tyr— Thr— Ala— his— Hi s—し eu— Arg— Thr—し eu— Thr - Ser - Asm - Leu - Asn - Glu - Val - Arg - Thr - Thr - Cys— Thr - Asp - Thr - Leu - Thr - Lys— Hi s— Thr— Asp— Asp—し eu— Thr— Ser—し eu— Asn— Asn— Thr—し eu— Ala— Asn— l ie— Are—し eu— Asp— Ser—Val— Ser—し eu— Arg— Met— In— Gin— Asp—し eu— Met— Arg— Ser— Arg- Leu- Asp- Thr- Glu- Vai- Ala- Asn- Leu- Ser- Val- l ie- Met- Glu- Glu (配列番号 ： 2、 第 102〜228位） 、
Met— Asn— Ser— Gin—し eu— Asn— Ser— Phe— Thr— ly—tiln— Met— Glu— Asn— I le_Thr— Thr— I le—Ser— Gin— Ala— Asn_Glu— Gin— Asn—し eu—し ys— Asp—し eu— Gin— Asp— Leu— Hi s -し ys - Asp - Ala - Glu - Asm - Arg - Thr - Ala - l ie - Lys - Phe - Asn - Gin - Leu - Glu - Glu - Arg - Phe - Gin -し eu - Phe - Glu- Thr - Asp- l ie - Val - Asn - l i e - l i e - Ser - Asn- 11 e-Ser-Tyr-Thr-Ala-Hi s— Hi s—し eu— Arg— ι hr—し eu— Thr— Ser— Asn—し eu— Asn— Glu - Val - Arg - Thr - Thr - Cys - Thr - Asp - Thr -し eu - Thr - Lys - His - Thr - Asp - Asp - し eu— Thr_Ser— Leu— Asn— Asn— Thr— Leu— Ala— Asn— lie— Arg—し eu— Asp— Ser— Val— Ser—し eu— Arg— Met— Gin— Gin— Asp—し eu— Met— Arg— Ser— Arg—し eu— Asp— Thr— Glu— Val-Ala-Asn- Leu- Ser- Val-I le- Met-Glu- Glu (配列番号： 2、 第 9ト 228位) 、 Met— Asn—し eu— Asn— Asn—し eu— Asn— Leu— Thr— Gin— Val—jln_G In— Arg— Asn—し eu— l i e- Thr- Asn-し eu - Gin- Arg - Ser - Vaト Asp - Asp - Thr - Ser - Gin- Al a - I l e Gln - Arg - l i e - Lys- Asn - Asp - Phe - Gin- Asn - Leu - Gin - Gin- Val- Phe - SLeu - Gin- Ala - し ys— Lys— Asp— Thr— Asp— Trp—し eu— Lys— Gl u—し ys— Val— Gin— Ser し eu— Gin— Thr— Leu— A la— Ala— Asn— Asn— Ser— Ala—し eu— Ala—し ys— Ala— Asn— Asn— Asp— Thr—し eu— Glu - Asp - Met- Asn - Ser - Gin - Leu- Asn - Ser - Phe- Thr- Gly- Gin- Met- Glu - Asn— l ie— Thr— Thr— l ie— Ser— Gin— Ala— Asn— Glu— Gin— Asn—し eu—し ys— Asp—し eu— Gin— Asp - Leu - Hi s- Lys - Asp - Ala - Glu- Asn- Arg Thr- Ala— l ie - Lys- Phe - Asn - Gin - し eu- Gl u- Glu- Arg- Phe- Gin - Leu- Phe- Glu - Thr-Asp-I le- Val Asn- l ie-He- Ser— Asn— l i e— Ser— Tyr— Thr— Ala— Hi s— Hi s—し eu— Arg— Thr—し eu— Thr— Ser— Asn— し eu— Asn— Glu— Val— Arg— Thr— Thr— Cys— Thr— Asp— Thr—し eu— Thr—し ys— His— Thr— Asp— Asp—し eu— Thr— Ser—し eu— Asn— Asn— Thr— Leu— Ala— Asn— l ie— Arg—し eu— Asp— Ser - Val - Ser - leu- Arg - Met- Gin - Gin- Asp-し eu - Met - Arg- Ser- Arg - Leu— Asp - 丁 hr- Glu- Val - Ala- Asn -し eu-Ser- Val- l ie- Met- Glu- Glu (配列番号： 2、 第 9〜 228位） 、 または
Met— Tyr— Ser— His— Asn— Val— Val— l i e—Met— Asn— Leu— Asn— Asn—し eu— Asn—し eu— Thr- Gin - ト Gin - Gin - Arg- Asn-し eu - l ie - Thr - Asn - Leu - Gin- Arg - Ser - ト Asp - Asp - Thr - Ser- Gin- Ala - l ie- Gin - Arg- l i e -し ys - Asn - Asp - Phe - Gin - Asn - し eu— Gin— Gin— Val— Phe— Leu— Gin— Ala—し ys—し ys— Asp— Thr— Asp— Trp—し eu—し ys— Glu— Lys— Val— Gin— Ser—し eu— Gin— Thr—し eu— Ala— Ala— Asn— Asn— Ser— Ala—し eu— Ala—し ys— Ala— Asn— Asn— Asp— Thr—し eu— Glu— Asp— Met— Asn— Ser— Gin—し eu— Asn— Ser - Phe - Thr - Gly - Gin - Met - Glu- Asn - l ie - Thr- Thr - l ie - Ser- Gin - Ala- Asn - Gl u— Gin— Asn—し eu—し ys— Asp—し eu— Gin— Asp— Leu— Hi s—し ys— Asp— Ala— Glu— Asn— Arg— Thr— Ala— l ie—し ys— Phe— Asn— Gin— Leu— Glu— Glu— Arg— Phe— Gin—し eu— Phe— Glu-Thr-Asp-I le-Val-Asn-I le-I l e-Ser-Asn-I le-Ser-Tyr-Thr-Ala-His- Hi s—し eu— Arg— Thr—し eu— Thr— Ser— Asn—し eu— Asn— Glu— Val— Arg— Thr— Thr— Cys— Thr— Asp— Thr—し eu— Thr— Lys— Hi s— Thr— Asp— Asp—し eu— Thr— Ser—し eu— Asn— Asn— Thr— Leu— Ala— Asn— l ie— Arg—し eu— Asp— Ser— Val— Ser—し eu— Arg— Met— Gin— Gin— Asp -し eu - Met - Arg - Ser - Arg- Leu - Asp - Thr - Glu- Val - Ala - Asn- Leu - Ser- Val - l i e- Met-Glu- Glu (配列番号： 2、 第ト 228位)
をさらに含む請求の範囲第 2項記載のポリヌクレオチド。
5 . 以下の塩基配列すなわち、
atgcaacaag at ttgatgag gtcgaggtta gacactgaag tagccaactt atcagtgat t atggaagaaa tgaagctagt agactccaag catggtcagc tcatcaagaa ttttacaata ctacaaggtc caccgggccc caggggtcca agaggtgaca gaggatccca gggaccccct ggcccaactg gcaacaaggg acagaaagga gagaaggggg agcc tggacc acctggccct gcgggtgaga gaggcccaat tggaccagct ggtccccccg gagagcgtgg cggcaaagga tctaaaggct cccagggccc caaaggctcc cgtggttccc ctgggaagcc cggccctcag ggccccagtg gggacccagg ccccccgggc ccaccaggca aagagggact ccccggccct cagggccctc ctggcttcca gggact tcag ggcaccgttg gggagcctgg ggtgcctgga cctcggggac tgccaggctt gcctggggta ccaggcatgc caggccccaa gggccccccc ggccctcctg gcccatcagg agcggtggtg cccctggccc tgcagaatga gccaaccccg gcaccggagg acaatggc tg cccgcctcac tggaagaac t tcacagacaa atgctactat ttttcagttg agaaagaaat ttttgaggat gcaaagcttt tctgtgaaga caagtcttca catcttgttt tcataaacac tagagaggaa cagcaatgga taaaaaaaca gatggtaggg agagagagcc actggatcgg cc tcacagac tcagagcgtg aaaatgaatg gaagtggctg gatgggacat c tccagacta caaaaattgg aaagc tggac agccggataa ctggggtcat ggccatgggc caggagaaga ctgtgctggg ttgatttatg ctgggcagtg gaacgatttc caatgtgaag acgtcaataa ct tcatttgc gaaaaagaca gggagacagt actgtcatct gcatta (配列番号 ： 1、 第 670〜1695位）
で示される塩基配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
6 . 以下の塩基配列すなわち、
atgaagctag tagactccaa gcatggtcag ctcatcaaga attt tacaat ac tacaaggt ccaccgggcc ccaggggtcc aagaggtgac agaggatccc agggaccccc tggcccaact ggcaacaagg gacagaaagg agagaagggg gagcctggac cacctggccc tgcgggtgag agaggcccaa t tggaccagc tggtcccccc ggagagcgtg gcggcaaagg atctaaaggc tcccagggcc ccaaaggctc ccgtggt tcc cctgggaagc ccggccctca gggccccagt ggggacccag gccccccggg cccaccaggc aaagagggac tccccggccc tcagggccct cctggcttcc agggacttca gggcaccgtt ggggagcc tg gggt gcctgg acctcgggga ctgccaggct tgcctggggt accaggcatg ccaggcccca agggcccccc cggccctcct ggcccatcag gagcggtggt gcccctggcc ctgcagaatg agccaacccc ggcaccggag gacaatggct gcccgcctca ct ggaagaac ttcacagaca aatgctac ta tttttcagtt gagaaagaaa t ttttgagga tgcaaagctt ttctgtgaag acaagtcttc acatc ttgtt ttcataaaca c tagagagga acagcaatgg ataaaaaaac agatggtagg gagagagagc cactggatcg gcctcacaga ctcagagcgt gaaaatgaat ggaagtggct ggatgggaca tctccagact acaaaaattg gaaagctgga cagccggata actggggtca tggccatggg ccaggagaag actgtgctgg gt tgatttat gctgggcagt ggaacgattt ccaat gtgaa gacgtcaata acttcatttg cgaaaaagac agggagacag tactgtcatc tgcatta (配列番号 ： 1、 第 739〜1695位）
で示される塩基配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
7 . 前記塩基配列の 5 '上流に以下の配列すなわち、
atggaagaa (配列番号： 1、 第 730〜738位） または
atgaggtcga ggttagacac tgaagtagcc aacttatcag tgattatgga agaa
(配列番号： 1、 第 685〜738位）
で示される塩基配列をさらに含む請求の範囲第 6項記載のポリヌクレオチド3
8 . 前記塩基配列の 5'上流に以下の配列すなわち、
atggagaaca tcaccactat ctctcaagcc aacgagcaga acctgaaaga cctgcaggac ttacacaaag atgcagagaa tagaacagcc atcaagttca accaactgga ggaac gcttc cagc tc tttg agacggatat tgtgaacatc at tagcaata tcagttacac agcccaccac 6δ
ctgcggacgc tgaccagcaa tc taaatgaa gtcaggacca cttgcacaga tacccttacc aaacacacag atgatctgac ctccttgaat aataccctgg ccaacatccg tttggattct gtttctctca ggatgcaaca agatttgatg aggtcgaggt tagacactga agtagccaac ttatcagtga ttatggaaga a (配列番号： 1、 第 358〜738位） 、
atgaacagcc agctcaactc attcacaggt cagatggaga acatcaccac tatctctcaa gccaacgagc agaacctgaa agacctgcag gacttacaca aagatgcaga gaatagaaca gccatcaagt tcaaccaact ggaggaacgc ttccagctct ttgagacgga tattgtgaac atcattagca atatcagtta cacagcccac cacctgcgga cgctgaccag caatctaaat gaagtcagga ccacttgcac agataccctt accaaacaca cagatgatct gacctccttg aataataccc tggccaacat ccgtttggat tctgtttctc tcaggatgca acaagatttg atgaggtcga ggttagacac tgaagtagcc aacttatcag tgattatgga agaa (酉己列番 号： 1、 第 325〜738位） 、
atgaacctca acaacctgaa cctgacccag gtgcagcaga ggaacctcat cacgaatctg cagcggtctg tggatgacac aagccaggct atccagcgaa tcaagaacga ctttcaaaat ctgcagcagg tttttcttca agccaagaag gacacggatt ggctgaagga gaaagtgcag agcttgcaga cgctggctgc caacaactct gcgttggcca aagccaacaa cgacaccctg gaggatatga acagccagct caactcattc acaggtcaga tggagaacat caccactatc tctcaagcca acgagcagaa cctgaaagac ctgcaggact tacacaaaga tgcagagaat agaacagcca tcaagttcaa ccaactggag gaacgcttcc agctctttga gacggatatt gtgaacatca ttagcaatat cagttacaca gcccaccacc tgcggacgct gaccagcaat ctaaatgaag tcaggaccac ttgcacagat acccttacca aacacacaga tgatctgacc tccttgaata ataccctggc caacatccgt ttggattctg tttctctcag gatgcaacaa gatttgatga ggtcgaggtt agacactgaa gtagccaact tatcagtgat tatggaagaa (配列番号： 1、 第 79〜738位） 、
atgtattctc ataatgtggt catcatgaac ctcaacaacc tgaacctgac ccaggtgcag cagaggaacc tcatcacgaa tctgcagcgg tctgtggatg acacaagcca ggctatccag cgaatcaaga acgactttca aaatctgcag caggtttttc ttcaagccaa gaaggacacg gattggctga aggagaaagt gcagagcttg cagacgctgg ctgccaacaa ctctgcgttg gccaaagcca acaacgacac cctggaggat atgaacagcc agctcaactc attcacaggt cagatggaga acatcaccac tatctctcaa gccaacgagc agaacctgaa agacctgcag gacttacaca aagatgcaga gaatagaaca gccatcaagt tcaaccaact ggaggaacgc ttccagctct ttgagacgga tattgtgaac atcattagca atatcagtta cacagcccac cacctgcgga cgctgaccag caatctaaat gaagtcagga ccacttgcac agataccctt accaaacaca cagatgatct gacctccttg aataataccc tggccaacat ccgtttggat tctgtttctc tcaggatgca acaagatttg atgaggtcga ggttagacac tgaagtagcc aacttatcag tgattatgga agaa (配列番号： 1、 第 55〜738位） または、 gtcacgaatc tgcagcaaga taccagcgtg ctccagggca atctgcagaa ccaaatgtat tctcataatg tggtcatcat gaacctcaac aacctgaacc tgacccaggt gcagcagagg aacctcatca cgaatctgca gcggtctgtg gatgacacaa gccaggctat ccagcgaatc aagaacgact ttcaaaatct gcagcaggtt tttcttcaag ccaagaagga cacggattgg ctgaaggaga aagtgcagag cttgcagacg ctggctgcca acaactctgc gttggccaaa gccaacaacg acaccctgga ggatatgaac agccagctca actcattcac aggtcagatg gagaacatca ccactatctc tcaagccaac gagcagaacc tgaaagacct gcaggactta cacaaagatg cagagaatag aacagccatc aagttcaacc aactggagga acgcttccag ctctttgaga cggatattgt gaacatcatt agcaatatca gttacacagc ccaccacctg cggacgctga ccagcaatct aaatgaagtc aggaccactt gcacagatac ccttaccaaa cacacagatg atctgacctc cttgaataat accctggcca acatccgttt ggattctgtt tctctcagga tgcaacaaga tttgatgagg tcgaggttag acactgaagt agccaactta tcagtgatta tggaagaa (酉己歹【J番号： 、 第 1〜738位）
で示される塩基配列をさらに含む請求の範囲第 6項記載のポリヌクレオチ 9. 請求の範囲第 5項乃至第 8項のいずれかに記載のポリヌクレオチドの 3 ，下流に以下の配列すなわち、 taacggactg tgatgggatc acatgagcaa attttcagct ctcaaaggca aaggacactc ctttctaatt gcatcacctt ctcatcagat tgaaaaaaaa aaaagcactg aaaaccaatt actgaaaaaa aattgacagc tagtgttttt taccatccgt cattacccaa agacttggga actaaaatgt tccccagggt gatatgctga ttttcattgt gcacatggac tgaatcacat agattctcct ccgtcagtaa ccgtgcgatt atacaaatta tgtcttccaa agtatggaac actccaatca gaaaaaggtt atcatcccg (酉己歹 K番号： 1、 1696〜2024位) で示さ れる塩基配列をさらに含むポリヌクレオチド。
1 0. 以下の塩基配列すなわち、
caatctgatgagaaggtgatg (酉己歹リ番 ： 4 ) 及び
acgaggggctggatgggacat (ø [歹リ番 ： 5
で示される塩基配列を有するプライマ一を用いて行った P CR反応の増幅産物 であるプローブと、 ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズすることがで き、 且つ新規コレクチンをコードする単離されたポリヌクレオチド。
1 1. 請求の範囲第 1項乃至第 1 0項のいずれかに記載のポリヌクレオチドと ス トリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、 該ポリヌクレオチドによつ てコードされるタンパク質が、 （1 ) C a 2 +要求性の糖認識構造様領域 （CRD ) 、 及び （2) コラーゲン様領域を含む、 新規コレクチンであるポリヌクレオ チド。
1 2. 前記ポリヌクレオチドが、 c DNAである請求の範囲第 1項乃至第 1 1 項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
1 3. 請求の範囲第 5項乃至第 1 2項のいずれかに記載のポリヌクレオチドに よってコードされるアミノ酸配列を含む新規コレクチン。
1 4. 以下のアミノ酸配列すなわち、
Met— Gin— Gin— Asp—し eu— Met— Arg— Ser— Arg—し eu— Asp— Thr— Glu— Val— Ala— Asn— Leu_Ser— Val— lie— Met— Glu— Glu— Met—し ys—し eu— Val— Asp— Ser—し ys— His_Gly— Gin—し eu— lie—し ys_Asn— Phe— Thr— lie—し eu— Gin— Gly— Pro— Pro— Gly— Pro— Arg— Gly- Pro - Arg - Gl y - Asp - Arg - Gly - Ser— Gin - Gly - Pro - Pro - Gly - Pro - Thr - Gl y - Asn—し ys— Gl y— Gin—し ys— Gly— Gl u—し ys— Gly— Glu— Pro— Gly— Pro— Pro— Gly— Pro— Ala- Gl y- Glu-Arg-Gly- Pro- l ie- Gl y-Pro-Ala-Gly-Pro- Pro- Gl y-Glu-Arg- Gly- Gl y - Lys - Gly - Ser - Lys - Gly - Ser - Gin- Gly- Pro -し ys - Gly - Ser - Arg - Gly - δ Ser - Pro - G 1 y-し y s - Pro - G 1 y-Pro-G 1 n - G 1 y - Pro— Ser - G 1 y - Asp- Pro - G 1 y - Pro- Pro— Gly— Pro— Pro— Gly—し ys— Gl u— Gl y—し eu— Pro— Gly— Pro— Gin— Gly— Pro— Pro— Gly- Phe- Gln-Gly-し eu-Gln- Gly- Thr- Val- Gly-Glu- Pro- Gly- Val-Pro- Gly - Pro— Arg— Gly—し eu— Pro— Gly—し eu— Pro— Gly— Val— Pro— Gly— Met— Pro— Gly— Pro— し ys— Gly— Pro— Pro— Gly— Pro— Pro— Gl y— Pro— Ser— Gly— Ala— Val— Val— Pro—し eu— Ala - Leu - Gin - Asn - Glu- Pro - Thr - Pro- Ala - Pro - Glu - Asp - Asn - Gly - Cys - Pro - Pro- His- Trp - Lys-Asn - Phe- Thr - Asp - Lys- Cys- Tyr - Tyr - Phe- Ser - Val - Glu - し ys— Glu— l ie— Phe— Glu— Asp— Ala—し ys—し eu— Phe— Cys— Gl u— Asp—し ys— Ser— Ser— Hi s—し eu— Val— Phe— l ie— Asn— Thr— Arg— iu— Glu— Gin— Gin— Trp— l ie—し ys—し ys— Gin - Met - Val - Gly - Arg - Glu - Ser - Hi s - Trp- l i e - Gly -し eu - Thr - Asp - Ser- Glu - Arg— Glu— Asn— Glu— Trp—し ys— Trp—し eu— Asp— Gly— Thr— Ser— Pro— Asp— Tyr—し ys— Asn - Trp -し ys - Ala - Gly - Gin - Pro - Asp - Asn - Trp - Gly - Hi s - Gly - His - Gly - Pro - Gly-Glu-Asp-Cys-Ala-Gly-leu-I l e—Tyr—Ala-Gly-Gln-Trp-Asn-Asp-Phe— Gin - Cys - Glu - Asp - Vaト Asn - Asn - Phe - l i e - Cys - Glu -し ys- Asp - Arg - Glu - Thr- Val- Leu- Ser- Ser- Ala-Leu (配列番号： 2、 第 206〜547位)
で示されるアミノ酸配列を含む新規コレクチン。
1 5 . 以下のアミノ酸配列すなわち、
Met— Lys—し eu— Val— Asp— Ser—し ys— Hi s— Gl y— Gin—し eu— l i e—し ys— Asn— Phe— Thr— l i e -し eu- Gin - Gly- Pro - Pro - Gl y- Pro - Arg - Gly- Pro - Arg - Gly- Asp - Arg - Gly - Ser— Gin— Gly— Pro— Pro— Gly— Pro Thr Gly— Asn—し ys— Gly— Gin—し ys— Gly— Glu— し ys - Gly - Glu - Pro - Gly - Pro- Pro- Gl y- Pro- Ala - Gl y - Glu - Arg - Gly - Pro - l ie - Gly- Pro- Ala- Gly- Pro-Pro- Gly- Gl u- Arg-Gl y-Gly- Lys- Gly- Ser- Lys- Gly- Ser— G in— Gly— Pro—し ys— Gl y— Ser— Arg— Giy— Ser— Pro— Gl y—し ys— Pro— Gl y— Pro— Gln_Gl y- Pro - Ser - CUy - Asp - Pro- Gl y - Pro - Pro - Gl y- Pro - Pro - Gly -し ys - Glu - Gl y- Leu- Pro- Gly- Pro- Gin- Gly- Pro- Pro- Gly- Phe- Gin- Gly- Leu- Gin- Gl y - Thr— Val— Gly— Glu— Pro— Gly— Val— Pro— Giy— Pro— Arg— Gly_し eu_Pro_Gly—し eu— δ Pro - G 1 y-Val-Pro-G 1 y - Me t - Pro - G 1 y - Pro -し y s - G 1 y - Pro - Pro - G 1 y - Pro - Pro - Gly - Pro- Ser - Gly - Ala_Vaト Vaト Pro - Leu- Ala -し eu~Gln - Asn - Glu - Pro - Thr - Pro-Ala-Pro-Glu-Asp-Asn-Gly-Cys-Pro-Pro-His-Trp-Lys-Asn-Phe-Thr- Asp -し ys - Cys - T r_Tyr - Phe - Ser - Val - Glu - Lys - Glu - l i e - Phe - Glu - Asp - Ala - し ys—し eu— Phe— Cys— Glu— Asp_し ys— Ser_Ser— Hi s—し eu— Val— Phe— l ie— Asn— Thr— Arg - Gl u - Glu - Gin - Gin - Trp - l ie - Lys -し ys— Gin-Met - Val - Gl y—Arg - Glu - Ser- Hi s_Trp— l i e— Gly—し eu— Thr_Asp_Ser— Glu— Arg— Glu— Asn— Glu— Trp—し ys— Trp— し eu_Asp— Gly— Thr— Ser— Pro— Asp— Tyr—し ys— Asn— Trp—し ys— Ala— Gly_Gln— Pro— Asp - Asn - Trp- Gly - His - Gly_His- Gl y - Pro - Gly - Glu - Asp - Cys - Ala - Gly -し eu_ I le-Tyr-Ala-Gly-Gln-Trp-Asn-Asp-Phe-Gln-Cys-Glu-Asp-Val-Asn-Asn- Phe - 1 le - Cys - Glu— Lys—Asp - Arg— Glu - Thr—Val -し eu - Ser - Ser - Ala - Leu (配列番号 ： 2、 第 229〜547位）
で示されるアミノ酸配列を含む新規コ レクチン。
1 6 . 前記新規コ レクチンが、 第一メチォニン残基 （配列番号： 2、 第 229位 ) の上流に以下のァミノ酸配列：
Met- Glu- Glu (配列番号： 2、 第 226〜228位） または
Met— Are— Ser— Arg—し eu— Asp— Thr— tjlu— Val— Ala— Asn—し eu— Ser—ゾ al— l ie— Met— lu— Glu (配列番号： 2、 第 21 1〜228位）
をさらに含む請求の範囲第 1 5項記載の新規コ レクチン。
1 7 . 前記新規コ レクチンが、 第一メチォニン残基 （配列番号： 2、 第 229位 ) の上流に以下のァミノ酸配列：
Met— Glu— Asn_I l e— Thr— Thr— l ie— Ser— Gin— Ala— Asn— Glu— Gin— Asn—し eu—し ys— Asp— Leu— Gin— Asp—し eu— His—し ys— Asp— Ala— Glu— Asn— Arg— Thr— Ala— l i e— Lys— Phe- Asn - Gin - Leu - Glu - Glu- Arg - Phe - G】n -し eu- Phe~Glu - Thr - Asp- l i e- Val- Asn- l i e - l ie - Ser - Asn - l ie - Ser-Tyr - Thr- Ala - His - Hi s- Leu-Arg-Thr- Leu - Thr— Ser— Asn—し eu— Asn— Gl u— Val— Arg— Thr— Thr— Cys— Thr— Asp— Thr—し eu— Thr— し ys— Hi s— Thr— Asp— Asp— Leu— Thr— Ser—し eu— Asn— Asn— Thr— Leu— Ala— Asn— l ie— Arg—し eu— Asp— Ser— Val— Ser—し eu— Arg— Met— Gin— Gin— Asp—し eu— Met— Arg— Ser— Arg- Leu- Asp- Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-I le-iViet- Gin- Glu (配列番号 ： 2、 第 102〜228位） 、
Met - Asn - Ser - Gin-し eu - Asn - Ser - Phe - Thr - Gly- Gin - Met- Glu - Asn - l i e- Thr - Thr— I le— Ser— Gin— Ala— Asn— 丄 u— Gin— Asn— Leu— Lys Asp—し eu— Gin— Asp— Leu— His—Lys—Asp—Ala—Glu—Asn—Arg—Thr—Ala—I le—Lys—Phe—Asn—Gln—Leu—Glu— Glu - Arg - Phe - Gin -し eu - Phe - Glu - Thr - Asp - l ie - Val— Asn- l ie - l ie - Ser-Asn - l ie— Ser— T r— Thr— Ala— His— Hi s—し eu— Arg— Thr—し eu— Thr— Ser— Asn—し eu— Asn— Glu— Val— Arg— Thr— Thr— Cys— Thr— Asp— Thr—し eu— Thr—し ys— His— Thr— Asp— Asp— し eu— Thr— Ser—し eu— Asn— Asn— Thr—し eu— Ala— Asn— l ie— Arg—し eu— Asp— Ser— Val— Ser— ILeu— Arg— Met— Gin— Gin— Asp—し eu— Met— Arg— Ser— Arg—し eu— Asp— Thr— Glu— Val- Ala- Asn- Leu-Ser- Val- l i e- Met-Glu- Glu (酉己列番号： 2、 第 91〜228位） 、 Met—Asn—Leu—Asn—Asn—Leu—Asn—Leu—Thr—vjin—Val—Gln— ln—Arg—Asn—Leu— l ie - Thr - Asn -し eu - Gin - Arg - Ser - Val - Asp - Asp - Thr - Ser - Gin - Ala - l ie- Gin - Arg— l ie—し ys— Asn— Asp— Phe— Gin— Asn—し eu— Gi n— Gin— Val— Phe—し eu— Gin— Ala— し ys—し ys— Asp— Thr— Asp— Trp—し eu—し ys— Glu—し ys— Val~Gln— Ser—し eu— Gin— Thr— し eu— Ala— Ala— Asn— Asn— Ser— Ala—し eu— Ala—し ys— Ala— Asn— Asn— Asp— Thr—し eu— Glu - Asp- Met - Asn - Ser - Gin-し eu— Asn - Ser - Phe - i'hr~uly— Gin - IViet - Glu - Asn - l ie— Thr— Thr— l ie— Ser— Gin— Ala— Asn— Glu— Gin— Asn—し eu—し ys— Asp—し eu— Gin— Asp—し eu— Hi s—し ys— Asp— Ala— Glu— Asn— Arg— Thr— Ala— l ie—し ys— Phe— Asn— Gin— し eu— Glu— Gl u— Arg— Phe— Gin—し eu— Phe— Glu— Thr— Asp— l ie— Val— Asn— l ie— l i e— Ser— Asn— l i e— Ser— Tyr— Thr— Ala— Hi s— Hi s—し eu— Arg— Thr—し eu— Thr— Ser— Asn— し eu - Asn - Glu Val - Arg - Thr - Thr - Cys - Thr - Asp - Thr - Leu- Thr - Lys - His - Thr - Asp— Asp—し eu— Thr_Ser— Leu— Asn— Asn— Thr— Leu— Ala— Asn—丄丄 e— Arg— Leu— Asp— Ser_Val - Ser - Leu - Arg - Met - Gln_Gln - Asp - Leu_Met_Arg - Ser - Arg -し eu - Asp - Thr- Glu- Val- Ala- Asn-Leu- Ser- Val- l i e- Met- Glu~Glu (配列番号： 2、 第 9〜 — 228位） 、 または
Met— Tyr— Ser— His— Asn_Val— Val— l i e— Met_Asn— Leu— Asn— Asn—し eu_Asn—し eu— Thr— Gin— Val— Gin— Gin— Arg— Asn_し eu— l ie— Thr— Asn—し eu— Gin— Arg— Ser— Val— Asp - Asp - Thr - Ser Gin- Ala - l ie - Gin - Arg_I l e -し ys - Asn - Asp - Phe - Gin - Asn - し eu— Gin— Gin— Val— Phe— Leu— Gin— Al a— Lys—し ys— Asp— Thr— Asp— Trp—し eu— Lys— Glu—し ys— Val— Gin— Ser— Leu— Gin— Thr—し eu— Ala— Ala— Asn— Asn_Ser— Ala—し eu— Ala—し ys— Ala— Asn— Asn— Asp— Thr—し eu— iu— Asp— Met— Asn— Ser— Gin—し eu— Asn— Ser- Phe- Thr- Gly- Gin- Met-Glu- Asn- l ie- Thr- Thr- l ie- Ser- Gin- Ala- Asn- Glu— Gin— Asn— Leu— Lys_Asp—し eu— Gin— Asp—し eu— His—し ys— Asp— Ala— Glu— Asn— Arg— Thr_Ala_Ile— Lys— Phe— Asn— Gin—し eu— Glu— Glu— Arg— Phe— Gin—し eu— Phe— Glu- Thr- Asp- l i e- Val- Asn- l ie- I l e_Ser-Asn- l ie- Ser- Tyr- Thr- Ala- Hi s - Hi s—し eu— Arg— Thr—し eu— Thr— Ser— Asn—し eu— Asn— lu— Val— Arg_Thr— Thr— Cys— Thr— Asp— Thr— Leu— Thr— Lys— Hi s— Thr— Asp— Asp—し eu— Thr— Ser—し eu— Asn— Asn— Thr—し eu— Ala— Asn— l ie— Arg—し eu— Asp— Ser— Val— Ser—し eu— Arg—Met— Gln~Gln— Asp—し eu— Met— Arg— Ser— Arg—し eu— Asp— Thr— Glu— Val— Ala— Asn—し eu— Ser— Val— l i e- Met- Glu- Glu (配列番号： 2、 第 1〜228位)
をさらに含む請求の範囲第 1 5項記載の新規コレクチン。
1 8 . 前記新規コレクチンが、 ヒ ト由来の新規コレクチンである請求の範囲第 1 3項乃至第 1 7項のいずれかに記載の新規コレクチン。
1 9 . 請求の範囲第 1 3項乃至第 1 8項のいずれかに記載の新規コレクチンの アミノ酸配列において、 1または複数のアミノ酸が欠失、 置換及びノまたは付 加されたアミノ酸配列からなり、 且つ、 （1 ) C a 2 +要求性の糖認識構造様領 域 （CRD) 、 及び （2 ) コラーゲン様領域を含むことを特徴とする新規コレク チン。
2 0 . 請求の範囲第 1乃至 1 2項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを、 新 規コレクチンの発現を許容するように含むベクター。
2 1 . 請求の範囲第 2◦項記載のベクタ一を発現可能に含む宿主細胞。
2 2 . 請求の範囲第 1乃至 1 2項のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは その断片を含む、 新規コレクチン関連分子種をスクリ一ニングするためのプロ ーブ。
2 3 . 請求の範囲第 1 3乃至 1 9項のいずれかに記載の新規コレクチンに対し て特異的な免疫反応性を有する抗体。
2 4 . モノクローナル抗体である請求の範囲第 2 3項記載の抗体。
2 5 . ヒ 卜に対する免疫原性を低下させた請求の範囲第 2 3または 2 4項記載 の抗体。
2 6 . 新規コレクチン関連分子種を取得するための方法であって、
請求の範囲第 2 3乃至 2 5項のいずれかに記載の抗体を使用してタンパク質を スクリーニングする工程を含むことを特徵とする方法。
2 7 . 新規コレクチン及び または由来分子を取得するための方法であって、 請求の範囲第 2 3乃至 2 5項のいずれかに記載の抗体を使用してタンパク質を スクリーニングする工程を含むことを特徴とする方法。
2 8 . 前記スクリーニングが、 c D N Aライブラリーの発現スクリーニングで ある請求の範囲第 2 6または 2 7項記載の方法。
2 9 . 新規コレクチン及び Zまたは由来分子の定量方法であって、 請求の範囲 第 2 3乃至 2 5項のいずれかに記載の抗体を使用して、 被検試料中に含まれる 新規コレクチン及び/または由来分子の量を測定することを特徴とする定量方 法。
3 0 . 前記抗体が、 E L I S A法において使用される請求の範囲第 2 9項記載 の定量方法。
3 1 . 新規コレクチン及び/または由来分子を定量するためのキットであって 、 請求の範囲第 2 3乃至 2 5項のいずれかに記載の抗体を含み、 該抗体を用い た E L I S A法によって被検試料中に含まれる新規コレクチン及び/または由 来分子の量が測定されることを特徴とするキット。
3 2 . 新規コレクチン及び Zまたは由来分子を取得するための方法であって、 請求の範囲第 2 3乃至 2 5項のいずれかに項記載の抗体を用いて新規コレクチ ン及び または由来分子を単離する工程を含む方法。
3 3 . 前記単離工程において、 前記抗体を結合させた担体によるァフィ二ティ 一クロマトグラフィ一および または免疫沈降が用いられる請求の範囲第 3 2 項記載の方法。
3 4 . 請求の範囲第 1乃至 1 2項のいずれかに記載のポリヌクレオチドより新 規コレクチンを発現させる工程を前記単離工程の前に含む請求の範囲第 3 2ま たは 3 3項記載の方法。
3 5 . 請求の範囲第 1乃至 1 2項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む 組換え遺伝子が安定して染色体に導入され、 且つ新規コレクチンを発現するこ とができることを特徴とするトランスジエニック非ヒ ト動物。
3 6 . 請求の範囲第 1 3乃至 1 9項記載のいずれかに記載の新規コレクチンの 相同体を含む非ヒ ト動物において、 該相同体をコードする遺伝子の発現を修飾 するように遺伝子導入がなされたことを特徴とするトランスジエニック非ヒ ト 動物。
3 7 . 請求の範囲第 1 3乃至 1 9項記載のいずれかに記載の新規コレクチンの 相同体を含む非ヒ ト動物において、 該相同体の発現を阻止するように該相同体 をコ一ドする遺伝子が改変されて得られることを特徴とするノックァゥト非ヒ ト動物。
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