WO2000002049A1

WO2000002049A1 - Immunologic test method and immunologic test kit

Info

Publication number: WO2000002049A1
Application number: PCT/JP1999/003539
Authority: WO
Inventors: Keisaku Okada; Takeshi Saika; Shuji Senda; Kenjiro Mori; Ken Sato
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1998-07-01
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2000-01-13
Anticipated expiration: 2001-01-01
Also published as: US6753190B1; EP1020726A1; EP1020726A4

Description

明細書免疫学的検査方法および免疫学的検査用キット技術分野

本発明は、被検試料中の検査対象物の検出を行い得る免疫学的検査方法およびそのためのキットに関する。より詳細には、本発明は検出シグナルを増幅させる工程を含む免疫クロマトグラフ法に関する。背景技術

生体試料等の免疫学的分析法において、迅速且つ簡便にその検査を行う方法として免疫クロマトグラフ法が挙げられる。この方法は、一般に以下のような工程を含む。すなわち、検査対象物と特異的に結合し得る抗体を固定化した固定相を有する吸水性基材からなる検査片の一端より、該検査対象物に特異的に結合し得る標識された抗体と被検液との混合物を吸収させて展開すると、該混合物中で形成された標識抗体一検査対象物複合体は固定化された抗体と結合して固定相上に捕捉される。したがって、該固定相に結合した標識抗体を測定することにより被検液中の検査対象物を測定することができる。

また、上記免疫クロマトグラフ法の検出シグナルをより高感度で得るための方法として、特開平 1 0— 0 6 2 4 1 9号において、二種の標識抗体を用いる方法が開示されている。つまり、検査対象物と特異的に結合し得る抗体を標識した第一標識抗体と、該抗体に特異的に結合し得る二次抗体を標識した第二標識抗体とを、検査片中の被検試料滴下部と固定相（該検査対象物と特異的に結合し得る別の抗体が固定化されている）の間に標識相としてそれぞれ設置した（吸収させた ) 構成である。試料中の検査対象物は、第一標識抗体と複合体を形成した後、さらに第二標識抗体が第一標識抗体に結合して（被検物 -第一標識抗体 -第二標識抗体）の複合体を形成する。該免疫複合体は固定相上に固定化された抗体により捕捉される。したがって、固定相上で第二標識抗体により増幅させたシグナルが検出される。

しかしながら、上記のシグナル増幅免疫クロマトグラフ法によってもまだ十分な検出感度が得られていないのが現状である。さらに、被検試料が糞便、尿、血液等の場合、前処理として試料を適当な緩衝液に懸濁する工程、および/または被検試料中の夾雑物質を分離除去する部分精製工程等の付加的な操作が必要となり、迅速性に欠けるという欠点を有する。

したがって、本発明の目的は、免疫クロマトグラフ法に関し、より迅速に、且つ高感度で検査対象物を検出することが可能な免疫学的検査方法およびそのためのキットを提供することである。発明の開示

本発明は下記の免疫学的検査方法およびそのためのキットを提供する：

〔 1〕検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材を用いて該検查対象物を検出する免疫学的検査方法であって、

(1) 該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）を含有する液と、

(2) 該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含有する液とを用いることを特徴とする免疫学的検査方法；

〔2〕吸水性基材の表面上の任意の領域に設けた固定相に固定化された、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しなレ、第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）とで、被検試料中の検査対象物をサンドィツチした免疫複合体を該固定相上に形成させて、固定相上の標識物質のシグナルを測定する免疫学的検査方法であつて、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）が、該介在物質を介して上記サンドイッチ型免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合した免疫複合体を形成させて標識物質のシグナルを増幅することを特徴とする方法；

C 3 ) 検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化した固定相で、該第一の免疫化学的成分および、該検査対象物と結合しうる第二の免疫化学的成分を標識物質に結合してなる標識体により該検査対象物を挟み込むサンドィツチ型免疫学的測定方法において、ピオチンとアビジンの結合を介して複合体を形成して検査対象物を検出することを特徴とする免疫学的測定方法；

〔4〕検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材、該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）および該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含むことを特徴とする免疫学的検査用キット；

〔 5〕検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しなレ、第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）、ならびに第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含む免疫学的検査キット；

〔 6〕検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化した固定相を有する免疫学的検査片、該検查対象物と結合しうる第二の免疫化学的成分およびピオチンを標識物質に結合してなる標識体ならびにアビジンを含有してなる免疫学的測定キット；

〔 7〕検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化した固定相を有する免疫学的検査片、該検査対象物と結合しうる第二の免疫化学的成分およびァビジンを第一標識物質に結合してなる標識体、ならびにピオチンと第二標識物質の結合体を含有してなる免疫学的測定キット；ならびに

〔 8〕検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化した固定相を有する免疫学的検査片、該検查対象物と結合しうる第二の免疫化学的成分およびビォチンを第一標識物質に結合してなる標識体、ならびにァビジンと第二標識物質の結合体を含有してなる免疫学的測定キット。図面の簡単な説明

図 1は本発明の免疫学的検査方法（A - 1の態様）の原理を説明する模式図であ 0。

図 1 A：被検液と第一標識免疫化学的成分液との混合液中での免疫複合体形成；図 1 B ：被検液と第一標識免疫化学的成分液との混合液の検査片への吸収 ·展開図 1 C ：固定相上での検査対象物の捕捉；

図 1 D ：第二標識免疫化学的成分液の検査片への吸収 ·展開；図 1 E ：固定相への第二標識免疫化学的成分の結合による検出シグナルの増幅。図 2は本発明の免疫学的検査方法（A - 2の態様）の原理を説明する模式図でめる。

図 2 A：被検液、第一標識免疫化学的成分液および第二標識免疫化学的成分液の混合物中での免疫複合体形成；

図 2 B ：被検液、第一標識免疫化学的成分液および第二標識免疫化学的成分液の混合物の検査片への吸収 ·展開；

図 2 C ：固定相上での検査対象物の捕捉および検出シグナルの増幅。

図 3は本発明の免疫学的検査方法（A - 3の態様）の原理を説明する模式図でめる。

図 3 A：被検試料の検査片への塗布および第一標識免疫化学的成分液の検査片への吸収 ·展開；

図 3 B ：被検試料中の検査対象物と第一標識免疫化学的成分との複合体形成；図 3 C ：固定相上での検査対象物の捕捉；

図 3 D ：第二標識免疫化学的成分液の検査片への吸収 ·展開；

図 3 E ：第二標識免疫化学的成分の固定相への結合および検出シグナルの増幅。図 4は本発明の免疫学的検査方法（A - 4の態様）の原理を説明する模式図でめる。

図 4 A：被検試料の検査片への塗布、ならびに第一標識免疫化学的成分液および第二標識免疫化学的成分液の混合液の検査片への吸収 ·展開；

図 4 B ：被検試料中の検査対象物、第一標識免疫化学的成分および第二標識免疫化学的成分からなる免疫複合体の形成；

図 4 C ：固定相上での標識免疫複合体の捕捉および検出シグナルの増幅。

図 5は、本発明の免疫学的検査キット（B— 1の態様）を用いたヒト H B s抗原の測定の各工程における抗原抗体反応の様子を示す模式図である。

図 6は、本発明の免疫学的検査キット（B - 2の態様）を用いたヒト H B s抗原の測定の各工程における抗原抗体反応の様子を示す模式図である。

図 7は、本発明の免疫学的検査キット（B - 3の態様）を用いたヒト H B s抗原の測定の各工程における抗原抗体反応の様子を示す模式図である。

図 8は、本発明の免疫学的検査キット（B— 4の態様）を用いたヒト H B s抗原の測定の各工程における抗原抗体反応の様子を示す模式図である。

図 9は、本発明の免疫学的検査キット（B— 5の態様）を用いたヒト H B s抗原の測定の各工程における抗原抗体反応の様子を示す模式図である。

図 1 0は、本発明の免疫学的測定方法（C - 1の態様）の 1つの態様を示す模式図である。

図 1 1は、本発明の免疫学的測定方法（C - 1の態様）の別の態様を示す模式図である。

図 1 2は、本発明の免疫学的測定方法（C - 2の態様）の 1つの態様を示す模式図である。

図 1 3は、本発明の免疫学的測定方法（C - 2の態様）の別の態様を示す模式図である。

図 1 4は、本発明の免疫学的測定方法（C一 3の態様）の 1つの態様を示す模式図である。

図 1 5は、本発明の免疫学的測定方法（C - 3の態様）の別の態様を示す模式図である。

尚、図中の符号は各図毎に付されたものである。発明を実施するための最良の形態

本発明の免疫学的検査方法には 3種の態様（態様 A、態様 B、態様 C ) がある。各態様での用語は、原則、各態様で定義される意味に解釈するものとする。

C 1〕態様 A

態様 Aは、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材を用いて該検査対象物を検出する免疫学的検査方法であって、

(2) 該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含有する液とを用いることを特徴とする免疫学的検査方法である。

この態様の実施に際しては、次の 4つの態様がある。

( 1 ) A— 1の態様

(1) 検査すべき被検液と第一標識免疫化学的成分含有液とを混合させると、被検液中に含まれる検査対象物は第一標識免疫化学的成分と結合し、第一標識免疫化学的成分と検査対象物の免疫複合体を形成する（図 1 A) 。吸水性基材の一端から上記混合物を吸収させ展開すると、混合物中で形成された上記免疫複合体は液の移動とともに吸水性基材中を移動する（図 1 B )。

(2) 移動してきた免疫複合体は、固定相上で固定相に固定化された第一の免疫化学的成分とさらに結合し、新たに第一標識免疫化学的成分一検査対象物一第一の免疫化学的成分からなる標識免疫複合体を形成して固定相上に捕捉される（図 1 C )

(3) 第二標識免疫化学的成分含有液を上記吸水性基材の一端から吸収させ展開すると、第二標識免疫化学的成分は液の移動とともに吸水性基材中を移動する（図 1 D) 。固定相に到達した第二標識免疫化学的成分は、固定相上に形成された上記標識免疫複合体中の第一標識免疫化学的成分と結合し、第二標識免疫化学的成分 -第一標識免疫化学的成分 -検査対象物 -第一免疫化学的成分からなる二重標識免疫複合体を形成する（図 1 E )。

(4) このように固定相に捕捉されることによって、第一および第二標識免疫化学的成分を構成する標識物質は一力所に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによつて検査対象物の存在をより高感度に検出することが可能となる（図

1 E ) o

( 2 ) A— 2の態様

(1) 検査すべき被検液、第一標識免疫化学的成分含有液および第二標識免疫化学的成分含有液とを混合させると、被検液中に含まれる検査対象物は第一標識免疫化学的成分と結合し、さらに第一標識免疫化学的成分に第二標識免疫化学的成分が結合して二重標識された免疫複合体を形成する（図 2 A) 。吸水性基材のー端から上記混合物を吸収させ展開すると、混合物中で形成された上記免疫複合体は液の移動とともに吸水性基材中を移動する（図 2 B )。

(2) 移動してきた免疫複合体は、固定相上で固定相に固定化された第一の免疫化学的成分とさらに結合し、新たに第二標識免疫化学的成分一第一標識免疫化学的成分 -検査対象物 -第一の免疫化学的成分からなる標識免疫複合体を形成して固定相上に捕捉される（図 2 C )。

(3) このように固定相に捕捉されることによって、第一および第二標識免疫化学的成分を構成する標識物質は一力所に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによつて検査対象物の存在をより高感度に検出することが可能となる（図 2 C ) o

( 3 ) A— 3の態様

(1) 検査すべき被検試料を、固定相の前方に吸収させるか塗布する（図 3 A) o

(2) 吸水性基材の一端（固定相よりも被検試料を吸収させるか塗布した箇所により近い方の端）から第一標識免疫化学的成分含有液を吸収させ展開すると（図 3 A) 、第一標識免疫化学的成分は液の移動とともに吸水性基材中を移動して、被検試料中の検査対象物と結合して免疫複合体を形成する（図 3 B )。 (3) 移動してきた免疫複合体は、固定相上で固定相に固定化された第一の免疫化学的成分とさらに結合し、新たに第一標識免疫化学的成分一検査対象物一第一の免疫化学的成分からなる免疫複合体を形成して固定相上に捕捉される（図 3 C

) 0

(4) さらに第二標識免疫化学的成分含有液を吸収させ展開すると（図 3 D) 、第二標識免疫化学的成分は液の移動とともに吸水性基材中を移動して、固定相上に捕捉された免疫複合体の第一標識免疫化学的成分と結合する（図 3 E )。

(5) このように固定相に捕捉されることによって、第一および第二標識免疫化学的成分を構成する標識物質は一力所に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによつて検査対象物の存在をより高感度に検出することが可能となる（図 3 E ) o

( 4 ) A - 4の態様

(1) 検査すべき被検試料を、固定相の前方に吸収させるか塗布する（図 4 A) ο

(2) 吸水性基材の一端（固定相よりも被検試料を吸収させるか塗布した箇所により近い方の端）から第一標識免疫化学的成分含有液および第二標識免疫化学的成分含有液の混合物を吸収させ展開すると（図 4 A) 、第一および第二標識免疫化学的成分は複合体を形成しつつ液の移動とともに吸水性基材中を移動して、被検試料中の検査対象物と結合して二重標識された免疫複合体を形成する（図 4 B

) o

(3) 移動してきた免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分とさらに結合し、新たに第二標識免疫化学的成分 -第一標識免疫化学的成分ー検査対象物—第一の免疫化学的成分からなる免疫複合体を形成して固定相上に捕捉される（図 4 C )。

4 C ) o

この態様 Aの方法により検出され得る検査対象物は、免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反応）により第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学的成分と結合してサンドィツチ免疫複合体を形成し得るものであれば特に制限されない。例えば、細菌およびその構成成分、細菌が産生する毒素、タンパク質（例えば、表面抗原などの微生物の構成タンパク質など）、腫瘍マーカー抗原などの生体試料中の抗原性ペプチド、ウィルス抗原および抗体、マイコプラズマ、放線菌、酵母ならびにかび等が挙げられる。細菌およびその構成成分としては、例えば、大腸菌〇 1 5 7、サルモネラ菌、ブドウ球菌（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌などの薬剤耐性菌を含む）、溶連菌、カンピロバクター菌、ウエルシュ菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコパクター · ピロリ菌、クラミジァ · トラコマティス菌およびその構成成分等が挙げられる。細菌が産生する毒素としては、例えば、ベロトキシン、ストレブトリシン 0等が挙げられる。タンパク質としては、例えば、ヒトトランスフェリン、ヒトアルブミン、ヒト免疫グロブリン、マイクログロブリンおよび C反応性タンパク質等が挙げられる。ウィルス抗原および抗体としては、 B型肝炎ウィルスの H B c、 H B eおよび H B s抗原ならびに抗体、 C型肝炎ウィルス抗原および抗体、ヒト免疫不全ウィルス抗原および抗体、ロタウィルス抗原および抗体ならびにアデノウイルス抗原および抗体等が挙げられる。

本発明の方法において、固定相に固定化される第一の免疫化学的成分と、第一標識免疫化学的成分として用いる第二の免疫化学的成分は、いずれも抗原抗体反応により検査対象物と特異的に結合し得る物質であれば特に制限はない。検査対象物が抗原（例えば、蛋白質、ペプチド、ハプテンなど）であれば、第一および第二の免疫化学的成分は、該抗原と特異的に結合し得る抗体である。該抗体はモノクローナル抗体であってもポリクロ一ナル抗体であってもよい。また本発明における抗体とは、検査対象物との特異的親和性を保持する抗体の断片物、例えば

H鎖、 L鎖、 Fab、 F (ab' ) ₂ , V_H V_L 等も含むものとする。一方、検査対象物が抗体である場合には、第一および第二の免疫化学的成分は、該抗体と特異的に結合し得る抗原もしくは該抗体を抗原として特異的に結合し得る二次抗体である。第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学的成分は、検査対象物に応じてサンドィツチ法などで用いられる自体公知のものを適宜選択すればよい。また、該免疫化学的成分が抗体であれば、単離された検査対象物を感作抗原として、公知の抗体作製技術を用いて調製することもできる。第一、第二および第三の免疫化学的成分がいずれも抗体の場合、第一の抗体および第二の抗体は、用いる抗体の種類や検査対象物によっても異なるが、同一の抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることも、また、異なる抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることもできる。より好ましくは、異なる抗原決定基を認識するものが使用される。第二標識免疫化学的成分として用いる第三の免疫化学的成分は、第一標識免疫化学的成分中の第二の免疫化学的成分に対して特異的に結合する免疫化学的成分であり、且つ固定化された第一の免疫化学的成分とは結合しなレ、免疫化学的成分である。第三の免疫化学的成分は、間接免疫測定法で二次抗体として用いられる従来公知のものを適宜選択することができる。また、第二の免疫化学的成分を感作抗原として、公知の抗体作製技術を用いて調製することもできる。第一、第二および第三の免疫化学的成分がいずれも抗体であり、第三の抗体に抗 I g G抗体を用いる場合には、第一の抗体と第二の抗体の由来動物種は互いに異なるものであることが好ましい。

本発明において用いられる吸水性基材は、検査対象物を含有する被検試料、例えば、食品から抽出した溶液やその培養上清、便懸濁（溶解）液、血漿、血清、、血液、尿、唾液などを液体試料、あるいはこれらを適当な緩衝液によって希釈してなる希釈液、ならびに第一標識免疫化学的成分、第二標識免疫化学的成分をそれぞれ含有する液を吸収できるものであれば特に限定されない。本発明においては、被検試料中の検査対象物が標識免疫化学的成分や固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と十分な反応を行うための時間を確保できるような吸水性基材が好ましく用いられる。

吸水性基材が吸水性に劣る場合には、後述するように被検試料が固定相に到達するのに長時間を要し、その結果、迅速な測定を行うことができない。一方、吸水性基材の吸水性があまりに高すぎる場合には、被検試料中の検査対象物が標識免疫化学的成分や固定相の第一免疫化学的成分と十分な反応を行うために必要な時間が不足するので、正確な測定を行うことが困難である。

したがって、本発明における吸水性基材の好ましい吸水性の程度は、 5 mm幅の短冊状に裁断した吸水性基材の片端部を水に浸漬し、 1分間経過後の吸水距離が 0 . 5〜5 c m程度である。

本発明の吸水性基材の好ましい具体例としては、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフィルタ一、多孔質材料などが挙げられる。これらの基材は適度な吸水速度を有するとともに、標識物質が着色粒子の場合、着色粒子が結合して発色した際の目視確認性に優れるなどの利点を有するものである。

また、これらの基材の吸水性を調整するために、基材の表面に親水性重合体や界面活性剤を被覆し、あるいは含浸させることもできる。さらに、本発明においては吸水性基材として同一材料からなる基材を用いてもよいし、あるいは異種の材料からなるものを任意の接着手段によって接合して得られる連続した基材を用いることもできる。

本発明において、吸水性基材の形状は、被検試料を展開できる形状であれば特に限定されるものではなく、例えば、矩形のシート状（片状）ゃロッド状などが好ましい。

本発明において、固定相とは、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分が吸水性基材上に固定化された領域を意味する。第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化する方法（固定化相の作製方法）も特に限定されるものではないが、従来から知られている物理吸着法や共有結合法によるのが好適であり、特に、該免疫化学的成分が基材から脱離しにくいという点で共有結合法によるのが好ましい。吸水性基材が上記共有結合法のための官能基を有しないときは、例えば適当な官能基を有する重合体を用いて基材を作製し、吸水性基材の吸水性を阻害しない程度に付着させることができる。また、第一の免疫化学的成分および親水性重合体を含む溶液を吸水性基材に塗布した後、上記親水性重合体を凝固させる凝固溶剤に浸漬することで固定相を作製することもできる。上記親水性重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシェチルセルロースなどが用いられる。また、上記凝固溶剤としては、アセトン、エタノール、メタノール、エーテルなどを用いることができる。本発明において、上記固定相と、被検試料液および第一標識免疫化学的成分含有液の混合物、ならびに第二標識免疫化学的成分含有液の吸収が開始される部位

(以下、吸液部という）との間の距離は特に限定されないが、好ましくは 1〜6 c m、より好ましくは 3〜4 c m程度である。距離があまりに遠すぎると、固定相まで被検試料が到達しなかったり、検出シグナル感度が強すぎたり、あるいは測定に時間がかかる等の問題を生じるおそれがある。一方、距離が近すぎると固定相の発色が均一ではなくまばらになったり、検出シグナル感度が低すぎるという問題を生じるおそれがある。

吸液部としては、被検試料や標識免疫化学的成分を含有する液の吸水性基材への移動を妨げるものでなければ特に限定されず、基材と兼用したものであっても、新たに不織布や織布等を該吸水性基材に接着させたものであってもよい。本発明において、検査対象物に特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分が固定化された固定相、ならびに吸液部を有する吸水性基材を、以下、本発明の免疫学的検查片または単に検査片という場合もある。

本発明の方法における第一標識免疫化学的成分は、検査対象物に特異的に結合し得る免疫化学的成分（第二の免疫化学的成分）に標識物質を結合させたものであり、また、第二標識免疫化学的成分は、該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る免疫化学的成分（第三の免疫化学的成分）に標識物質を結合させたものである。ここで用いられる標識物質は、免疫化学的測定法において常套的に使用されるいかなる標識物質であってもよく、例えば着色粒子、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼ等）、蛍光物質（F I T C、ローダミン等）などが挙げられるが、効率のよい検出シグナルの増幅を達成するためには、第一および第二標識免疫化学的成分に使用される標識物質は同一のものであることが好ましい。本発明の方法では、迅速な検出を行う意味で、標識物質として着色粒子が好ましく使用される。着色粒子は肉眼で検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、金、銀、銅などの金属からなるコロイド粒子、スダンブル一ゃスダンレッド IV、スダン I I I 、オイルオレンジ、キニザリングリーン等に代表される顔料や染料などでラテックスを着色してなる着色ラテックスなどを用いることができる。目視確認性の点からは、金コロイドや青、赤、綠もしくはオレンジ色に着色した着色ラテックスの使用が好ましく、また、分散安定性や検査対象物の検出感度の調節が容易であるなどの点を考慮すると、青色、赤色等に着色された水分散型高分子重合体からなる着色ラテックスを使用することがさらに望ましい。着色粒子の粒径は、検出の際の発色がよく且つ吸水性基材の吸水性を低下させない程度の該基材中での移動性を有するものであれば特に制限はないが、保存安定性や調製が容易であるなどの点から、好ましくは 0 . 0 l〜5 z m、より好ましくは 0 . 0 1〜3〃m、さらに好ましくは 0 . 0 5〜3 m、特に好ましくは 0 . 0 5〜0 . 5 mの範囲が例示される。粒怪があまりに小さすぎると、 1粒子あたりの着色の程度が少ないので、固定相に結合しても発色の程度が悪く目視確認性に劣るようになる。また、粒径が大きすぎると、着色粒子がわずかに凝集しただけで吸水性基材に目詰まりを起こして吸水性を低下させたり、非特異的発色を生じたりすることがある。免疫化学的成分を、このような着色粒子で標識する方法としては、従来公知の方法、例えば共有結合法、物理的吸着法、イオン結合法等を使用することができるが、免疫化学的成分からの着色粒子の脱離がなく安定であるという点から共有結合法がより好ましく用いられる。

本発明の方法において、被検試料中の複数の検査対象物を検出するために、対応する複数の免疫化学的成分をそれぞれ別の着色粒子で標識することができるが、この際に用いられる着色粒子は同一色であっても異なる色であってもよい。同一色の着色粒子を用レ、る場合、各検査対象物にそれぞれ特異的に結合し得る免疫化学的成分を固定化した固定相を識別可能な程度に離して設置することが望ましい。

標識物質が酵素や蛍光物質の場合には、固定相の標識物質の検出は、 E I Aや蛍光抗体法（F I A) で従来使用されている検出手段が適宜選択される。

第一標識免疫化学的成分含有液および第二標識免疫化学的成分含有液は、各標識免疫化学的成分を適当な分散媒（溶媒）中に分散（溶解）させることにより調製される。標識免疫化学的成分を分散させる分散媒は、検査対象物と第一標識免疫化学的成分および第一標識免疫化学的成分と第二標識免疫化学的成分の抗原抗体反応を阻害しないものであれば特に制限はないが、好ましくは該抗原抗体反応に適した p Hおよび塩濃度を有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を適宜選択して使用することができる。シグナル検出時の各標識免疫化学的成分濃度は 0 . 0 0 5〜 5 %、好ましくは 0 . 0 1〜0 . 5 %の範囲である。濃度があまりに低すぎると、固定相に結合する粒子数が少なく検出感度が悪くなる。また、濃度が高すぎると、不経済なばかりでなく過剰の標識物質が固定相以外に残留し、固定相のシグナルを不明瞭にする等の問題を生じる。なお、以下、標識免疫化学的成分含有液を単に標識免疫化学的成分液という。

態様 Aで用いられる本発明の免疫学的検査用キットは、本発明の免疫学的検査方法に好ましく用いることができる。該キットは、少なくとも下記の内容を含むものである。

(a) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上のある領域に設けた吸水性基材

(b) 該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）

(c) 該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）

該吸水性基材、第一および第二標識免疫化学的成分の好ましい態様は、上記したような本発明の免疫学的検査方法において好ましく用いられるものである。本発明のキットは、上記の内容物以外に、本発明の免疫学的検査方法において好ましく使用され得る付加的な内容物を含んでいてもよい。例えば、第一および第二標識免疫化学的成分を分散させるのに好ましく使用される上記の緩衝液などが挙げられる。

本発明のキットを用いた免疫クロマトグラフ法は、 A— 1の態様では、まず検査対象物と第一標識免疫化学的成分を予め固定相に結合させた後第二標識免疫化学的成分を結合させるので、二種の標識免疫化学的成分による立体障害のために検査対象物と固定相に固定化された第一の免疫化学的成分との結合効率、すなわち検査対象物の固定相での捕捉率が低下したり、あるいは吸水性基材上で二種の標識免疫化学的成分を含む免疫複合体が目詰まりを起こすといった、従来法において起こり得る検出上の問題を回避することができる。

本発明のキットを用いた免疫クロマトグラフ法は、 A— 2の態様では、被検液と、第一標識免疫化学的成分および第二標識免疫化学的成分を予め混合した後検査片に展開するので、（検査対象物 -第一標識免疫化学的成分 -第二標識免疫化学的成分）の二重標識された免疫複合体の形成に十分な時間が確保される。したがって、二重標識されないまま検査対象物が固定相に捕捉されるために検出シグナルの増幅が不十分であるといった従来法において起こり得る検出上の問題を回避することができる。

本発明のキットを用いた免疫クロマトグラフ法は、 A— 3の態様では、被検試料を予め検査片に吸収させるか塗布しておき、そこにまず第一標識免疫化学的成分液を展開して、形成される検査対象物と第一標識免疫化学的成分との免疫複合体を、固定相に固定化された該検査対象物に特異的な免疫化学的成分で捕捉した後、さらに第二標識免疫化学的成分液を検査片に展開して、固定相上に捕捉された免疫複合体に第二標識免疫化学的成分を結合させるので、二種の標識免疫化学的成分による立体障害や免疫複合体の目詰まりといつた従来法において起こり得る検出上の問題点を回避することができ、その結果、より高感度に検査対象物を検出することができる。また、本法によれば、被検試料の前処理を必要としないことから、従来よりも検出までに要する時間を短縮することができる。

本発明のキットを用いた免疫クロマトグラフ法は、 A— 4の態様では、第一標識免疫化学的成分および第二標識免疫化学的成分を予め混合した後検査片に展開するので、（検査対象物 -第一標識免疫化学的成分 -第二標識免疫化学的成分）の二重標識された免疫複合体の形成に十分な時間が確保される。したがって、二重標識されないまま検査対象物が固定相に捕捉されるために検出シグナルの増幅が不十分であるといった従来法において起こり得る検出上の問題を回避することができ、その結果、より高感度に検査対象物を検出することができる。また、本法によれば、被検試料の前処理を必要としないことから、従来よりも検出までに要する時間を短縮することができ、より迅速な検査対象物の検出が可能となる。

〔2〕態様 B

態様 Bは、吸水性基材の表面上の任意の領域に設けた固定相に固定化された、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）とで、被検試料中の検査対象物をサンドィツチした免疫複合体を該固定相上に形成させて、固定相上の標識物質のシグナルを測定する免疫学的検査方法であって、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）力該介在物質を介して上記サンドイッチ型免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合した免疫複合体を形成させて標識物質のシグナルを増幅することを特徴とする方法である。

この態様の実施に際しては、次の 5つの態様がある。

( 1 ) B— 1の態様

以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）を水との接触によって脱離し得る形態で保持する標識相とを、表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の、固定相よりも標識相により近い方の一端から、被検試料を含有する液、第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）を含有する液および該介在物質を含有する液の混合物を展開し、

(2) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

(3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出"^る。

あるいは、次のような態様が挙げられる。

以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）を水との接触によって脱離し得る形態で保持する標識相とを、表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の、固定相と該固定相よりも標識相により近い方の一端との間の任意の領域に被検試料を供給し、

(2) 該吸水性基材の該一端から、第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）を含有する液と、該介在物質を含有する液との混合物を展開し、

(3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を固定相に固定化された第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。

この B— 1の態様では、各工程において以下の反応が行われる。すなわち、吸水性基材の一端（すなわち吸液部）から、被検試料を含有する液、第二標識体を含有する液、ならびに第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液の混合物（該混合物中で第二標識体中の第四の免疫化学的成分と介在物質が特異的に結合する）を滴下して展開すると、各成分は液の移動とともに吸水性基材上を移動する。液が標識相に到達すると、そこに保持されていた第一標識体は水との接触によって標識相から脱離する。さらに、第一標識体中の第二の免疫化学的成分が被検試料中の検査対象物と、また第三の免疫化学的成分が介在物質を介して第二標識体中の第四の免疫化学的成分とそれぞれ結合して、さらに吸水性基材上を移動する。そして、形成された免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。このようにして、第一および第二標識体を構成する標識物質が固定相上に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによつてより高感度に検査対象物の存在を検出することが可能となる。

本発明の方法の別の態様としては、上記の方法において、被検試料を吸液部から滴下する代わりに、吸液部と固定相との間に滴下または塗布した後、第二標識体を含有する液と介在物質を含有する液との混合物を吸液部に滴下して展開する方法が挙げられる。この場合、該混合液が被検試料を滴下または塗布した領域に達すると、被検試料中の検査対象物は、第二標識体と介在物質との複合体とともに吸水性基材上を移動する。液が標識相に到達すると、そこに保持されていた第 —標識体は水との接触によって標識相から脱離する。さらに、第一標識体中の第二の免疫化学的成分が被検試料中の検査対象物と、また第三の免疫化学的成分が介在物質を介して第二標識体中の第四の免疫化学的成分とそれぞれ結合して、さらに吸水性基材上を移動する。そして、形成された免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。

( 2 ) B - 2の態様

以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端から、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）を含有する液と被検試料を含有する液との混合物を展開し、該混合物中で形成される検査対象物と第一標識体との免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

(2) 第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液を該吸水性基材に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合させ、

(3) さらに第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）を含有する液を該吸水性基材に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の該介在物質に結合させた後、

(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出^ "る。

あるいは、次のような態様が挙げられる。

以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端と該固定相との間の任意の領域に被検試料を供給し、

(2) 該吸水性基材の該一端から検查対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）を含有する液を展開し、該吸水性基材上で形成される検査対象物と第一標識体との免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

(3) 第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液を該吸水性基材に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合させ、

(4) さらに第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）を含有する液を該吸水性基材に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の該介在物質に結合させた後、

(5) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出"^る。

この B— 2の態様では、各工程において以下の反応が行われる。すなわち、吸水性基材の一端（すなわち吸液部）から、被検試料を含有する液と第一標識体を含有する液との混合物（該混合物中で検査対象物と第一標識体中の第二の免疫化学的成分とが複合体を形成する）を滴下して展開すると、該免疫複合体は液の移動とともに吸水性基材上を移動し、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。次いで、第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液を該吸水性基材に滴下して展開することにより、該介在物質は固定相上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合する。さらに、第二標識体を含有する液を該吸水性基材に滴下して展開すると、固定相上に捕捉された免疫複合体中の該介在物質に第二標識体中の第四の免疫化学的成分が結合して、（固定化された第一の免疫化学的成分 -検査対象物 —第一標識体—介在物質一第二標識体）の複合体が形成される。このようにして、第一および第二標識体を構成する標識物質が固定相上に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによつてより高感度に検査対象物の存在を検出することが可能となる。

また、別の好ましい一態様として、上記の方法において、被検試料を吸液部から滴下する代わりに、吸液部と固定相との間に滴下または塗布した後、第一標識体を含有する液を吸液部に滴下して展開する方法が挙げられる。この場合、第一標識体を含有する液が被検試料を滴下または塗布した領域に達すると、被検試料中の検査対象物は、第一標識体中の第二の免疫化学的成分と結合して免疫複合体を形成し、液の移動とともに吸水性基材上を移動して固定相上で固定化された第一の免疫化学的成分に結合して捕捉される。

( 3 ) B - 3の態様

以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端から、被検試料を含有する液、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体 ) を含有する液、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）を含有する液および該介在物質を含有する液の混合物を展開し、

(2) 該混合物中で形成される検査対象物、第一標識体、該介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

(3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する。

あるいは、次のような態様が挙げられる。

以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に被検試料を供給し、

(2) 該吸水性基材の該一端から、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しなレ、第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）を含有する液、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）を含有する液および該介在物質を含有する液の混合物を展開し、

(3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物、第一標識体、該介在物質および第二標識体からなる免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出^る。

この B— 3の態様では、各工程において以下の反応が行われる。すなわち、吸水性基材の一端（すなわち吸液部）から、被検試料を含有する液、第一標識体を含有する液、第二標識体を含有する液ならびに第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液の混合物（該混合物中で検査対象物は第一標識体中の第二の免疫化学的成分と、第一標識体中の第三の免疫化学的成分は該介在物質を介して第二標識体中の第四の免疫化学的成分と結合して、検査対象物 -第一標識体 -介在物質 -第二標識体の免疫複合体を形成する）を滴下して展開すると、該免疫複合体は液の移動とともに吸水性基材上を移動し、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。このようにして、第一および第二標識体を構成する標識物質が固定相上に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによつてより高感度に検査対象物の存在を検出することが可能となる。

また、別の一態様として、上記の方法において、被検試料を吸液部から滴下する代わりに、吸液部と固定相との間に滴下または塗布した後、第一標識体を含有する液、第二標識体を含有する液および第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液の混合物を吸液部に滴下して展開する方法が挙げられる。この場合、該混合液が被検試料を滴下または塗布した領域に達すると、被検試料中の検査対象物は、混合液中に形成された（第一標識体 -介在物質 - 第二標識体）複合体中の第二の免疫化学的成分と結合し、液の移動とともに吸水性基材上を移動して固定相上で固定化された第一の免疫化学的成分に結合して捕捉される。

( 4 ) B - 4の態様

吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体が水との接触によつて脱離し得る形態で保持される標識相が設けられ、且つ以下の工程を含むことを特徴とする方法：

(1) 該吸水性基材の該一端から、被検試料を含有する液、第一標識体を含有する液および該介在物質を含有する液の混合物を展開し、

あるいは、次のような態様が挙げられる。

(1) 該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に被検試料を供給し、

(2) 該吸水性基材の該一端から、第一標識体を含有する液と該介在物質を含有する液との混合物を展開し、

(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出る。

この B— 4の態様では、各工程において以下の反応が行われる。すなわち、吸水性基材の一端（すなわち吸液部）から、被検試料を含有する液、第一標識体を含有する液、ならびに第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液の混合物（該混合物中で被検試料中の検査対象物が第一標識体中の第二の免疫化学的成分と、また第一標識体中の第三の免疫化学的成分が介在物質と特異的に結合して複合体を形成する）を滴下して展開すると、該複合体は液の移動とともに吸水性基材上を移動する。液が標識相に到達すると、そこに保持されていた第二標識体は水との接触によって標識相から脱離する。さらに、第二標識体中の第四の免疫化学的成分が介在物質を介して第一標識体中の第三の免疫化学的成分と結合して、さらに吸水性基材上を移動する。そして、形成された免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。このようにして、第一および第二標識体を構成する標識物質が固定相上に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによつてより高感度に検査対象物の存在を検出することが可能となる。

また、別の態様としては、上記の方法において、被検試料を吸液部から滴下する代わりに、吸液部と固定相との間に滴下または塗布した後、第一標識体を含有する液と介在物質を含有する液との混合物を吸液部に滴下して展開する方法が挙げられる。この場合、該混合液が被検試料を滴下または塗布した領域に達すると、被検試料中の検査対象物は、第一標識体と介在物質との複合体と結合して吸水性基材上を移動する。液が標識相に到達すると、そこに保持されていた第二標識体は水との接触によって標識相から脱離する。さらに、第二標識体中の第四の免疫化学的成分が介在物質を介して第一標識体中の第三の免疫化学的成分と結合して、さらに吸水性基材上を移動する。そして、形成された免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。

( 5 ) B - 5の態様

以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）ならびに該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相とを、表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の、固定相よりも標識相により近い方の一端から、被検試料を含有する液と該介在物質を含有する液との混合物を展開し、

あるいは、次のような態様が挙げられる。

以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）ならびに該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）が水との接触によつて脱離し得る形態で保持される標識相とを、表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の、固定相と該固定相よりも標識相により近レ、方の一端との間の任意の領域に被検試料を供給し、

(2) 該吸水性基材の該一端から、該介在物質を含有する液を展開し、

(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出"^る。

この B— 5の態様では、各工程において以下の反応が行われる。すなわち、吸水性基材の一端（すなわち吸液部）から、被検試料を含有する液と第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液との混合物を滴下して展開すると、各成分は液の移動とともに吸水性基材上を移動する。液が標識相に到達すると、そこに保持されていた第一および第二標識体は水との接触によつて標識相から脱離する。さらに、第一標識体中の第二の免疫化学的成分が被検試料中の検査対象物と、また第三の免疫化学的成分が介在物質を介して第二標識体中の第四の免疫化学的成分とそれぞれ結合して複合体を形成し、さらに吸水性基材上を移動する。そして、形成された免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。このようにして、第一および第二標識体を構成する標識物質が固定相上に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによつてより高感度に検査対象物の存在を検出することが可能となる。

また、別の態様としては、上記の方法において、被検試料を吸液部から滴下する代わりに、吸液部と固定相との間に滴下または塗布した後、介在物質を含有する液を吸液部に滴下して展開する方法が挙げられる。この場合、該混合液が被検試料を滴下または塗布した領域に達すると、被検試料中の検査対象物は介在物質とともに吸水性基材上を移動する。液が標識相に到達すると、そこに保持されてレ、た第一および第二標識体は水との接触によつて標識相から脱離する。さらに、第一標識体中の第二の免疫化学的成分が被検試料中の検査対象物と、また第三の免疫化学的成分が介在物質を介して第二標識体中の第四の免疫化学的成分とそれぞれ結合して複合体を形成し、さらに吸水性基材上を移動する。そして、形成された免疫複合体は、固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上に捕捉される。

これらの B— 1〜B— 5のいずれの態様においても、吸水性基材の該一端と該固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域 ) に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設けられていてもよい。

また、 B— 1、 B— 4および B— 5の態様においては、吸水性基材が、固定相と該固定相よりも標識相により近い方の一端との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設けたものであってもよい。この場合、例えば、分離相は、該吸水性基材の該一端と標識相との間の任意の領域に存在する。この態様 Bの方法により検出され得る検査対象物は、態様 Aの場合と同様である。第一の免疫化学的成分、第二の免疫化学的成分は、態様 Aの場合と同様である。第一および第二の免疫化学的成分がいずれも抗体の場合、第一の抗体および第二の抗体は、同一のものであっても異なるものであってもよい。また、異なる抗体としては、同一の抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることも、あるいは異なる抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることもできる。

本発明において、第一標識体として用いる第三の免疫化学的成分、および第二標識体として用いる第四の免疫化学的成分は、介在物質を介して特異的に結合し合える抗体（モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、 H鎖、 L鎖、 Fab、 F (ab' )₂、 V_H、 V _L 等の断片化された抗体であつてもよい）または抗原（例えば、蛋白質、ペプチド、ハプテンなど）であり、且つ検査対象物および固定化された第一の免疫化学的成分とは特異的親和性を有しないものである。好ましくは、これらの免疫化学的成分は、さらに第二の免疫化学的成分とも特異的親和性を有しないものである。

第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する本発明の介在物質は、第三および第四の免疫化学的成分に同時に結合して（第三の免疫化学的成分 -介在物質一第四の免疫化学的成分）の複合体を形成し得る物質であれば特に限定されないが、好ましくは、抗原抗体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的に結合し得る免疫化学的成分である。すなわち、第三の免疫化学的成分が抗体であれば、介在物質は該抗体により認識される抗原もしくは該抗体と特異的に結合し得る二次抗体であり、第四の免疫化学的成分は該抗原と特異的に結合し得る抗体もしくは該二次抗体により認識される抗原であることが好ましい。このとき、第三および第四の免疫化学的成分がともに抗体であれば、それらは同一の抗体であっても異なるものであってもよい。一方、第三の免疫化学的成分が抗原であれば、介在物質は該抗原と特異的に結合し得る抗体であり、第四の免疫化学的成分は該抗体により認識される抗原もしくは該抗体と特異的に結合し得る二次抗体である。第三および第四の免疫化学的成分がともに抗原であれば、それらは同一の抗原であっても、介在物質である抗体と交叉反応性のある異なる抗原であってもよい。第三および第四の免疫化学的成分、ならびに介在物質は、サンドイッチ法等で用いられている公知のものを適宜選択して使用することができる。

この態様 Bの方法で用いる吸水性基材、固定相については、態様 Aの場合と同様である。また、被検試料含有液、第一標識体含有液、第二標識体含有液、介在物質含有液等の吸収が開始される部位（すなわち吸液部）についても態様 Aの場合と同様であり、被検試料、標識体、ならびに介在物質をそれぞれ含有する液の吸水性基材への移動を妨げるものでなければ特に限定されない。

また、この態様 Bの方法における第一標識体は、検査対象物に特異的に結合し得る免疫化学的成分（第二の免疫化学的成分）および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質を結合させたものであり、また、第二標識体は、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る免疫化学的成分（第四の免疫化学的成分）に標識物質を結合させたものである。ここで用いられる標識物についても態様 Aの場合と同様であり、第一および第二標識体に使用される標識物質は同一のものであることが好ましい。

第二および第三の免疫化学的成分の両方、ならびに第四の免疫化学的成分を着色粒子で標識する方法も、態様 Aの場合と同様である。

第一標識体含有液、第二標識体含有液および介在物質含有液は、標識体または介在物質を適当な分散媒（溶媒）中に分散（溶解）させることにより調製される。標識体または介在物質を分散させる分散媒は、検査対象物と第一標識体、第一標識体と介在物質および介在物質と第二標識体の特異的結合反応を阻害しないものであれば特に制限はないが、好ましくは該抗原抗体反応に適した p Hおよび塩濃度の有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を適宜選択して使用することができる。シグナル検出時の各標識体濃度は 0 . 0 0 5〜5 %、好ましくは 0 . 0 1〜0 . 5 %の範囲である。濃度があまりに低すぎると、固定相に結合する粒子数が少なく検出感度が悪くなる。また、濃度が高すぎると、不経済なばかりでなく過剰の標識物質が固定相以外に残留し、固定相のシグナルを不明瞭にする等の問題を生じる。

この態様 Bの方法において、標識相とは、吸水性基材の吸液部と固定相との間に設けられた、第一標識体および/または第二標識体を水との接触によつて脱離し得る形態で保持する領域を意味する。第一および第二標識体の両方を保持する場合、第一標識体を保持する第一標識相と第二標識体を保持する第二標識相を別個に作製しても、あるいは第一および第二標識体を混合して 1つの標識相に保持してもよい。

標識相の作製方法としては特に制限はないが、例えば、標識体を含有する液を吸水性基材の吸液部と固定相との間の任意の領域に塗布し、適当な条件下で乾燥させる（例えば、凍結乾燥）方法が挙げられる。また、水溶性重合体もしくはサッカロース溶液中に標識体を分散させ、該分散液を吸水性基材上に塗布して同様に乾燥させてもよい。この方法は、水溶性重合体またはサッカロースが容易に水溶化し、標識体が速やかに基材から脱離して被検試料中の検査対象物およびまたは介在物質を介してもう一方の標識体と反応し得るとともに、水溶性重合体やサッ力ロースの濃度を調整することにより吸水性基材の所定の領域に標識体を保持させるのに適当な粘度を得ることができ、さらに乾燥に際して標識体の凝集や変性を防ぎ、また乾燥後に標識体が吸水性基材から脱離しにくいという点で有利である。

上記水溶性重合体としては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、セルロースエステル（例えば、メチルセル口ース、ェチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシェチルセルロース、ォキシェチルセルロース、シアンェチルセルロース等）、ゼラチンなどが好ましく用いられる。

態様 Bで用いられる本発明の免疫学的検査用キットは、本発明の免疫学的検査方法に好ましく用いることができる。該キットは、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）、ならびに第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含む。

吸水性基材、第一および第二標識体、ならびに介在物質の好ましい態様は、上記したような本発明の方法において好ましく用いられるものである。

本発明のキットに用いられる吸水性基材の好ましい態様の 1つとして、その一端（すなわち吸液部）と固定相との間の任意の領域に、第一および第二標識体の少なくとも 1つが水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相がさらに設けられてもよい。

また、本発明のキッ卜に用いられる吸水性基材の好ましい態様の 1つとして、その一端（すなわち吸液部）と固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に滴下または塗布する場合はその領域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設けたものが挙げられる。

本発明のキットに用いられる吸水性基材の他の好ましい態様の 1つとして、固定相と該固定相よりも標識相により近い方の一端との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設けたものが挙げられる。この場合、分離相は、吸水性基材の一端と標識相との間の任意の領域に存在する。

本発明において、分離相は、分離しょうとする方向の孔径が検査対象物、各標識体、ならびに介在物質よりも大きく、分離除去しょうとする被検試料中の他の物質よりも小さいことが望ましい。また、分離方向としては、標識体が吸水性基材上を展開する方向であっても、あるいはその方向と垂直の方向であってもよく、さらに、検査対象物を被検試料中の他の物質から分離した後は、該分離相を除去して後の測定を行ってもよい。

分離相の材質としては、例えば、レーヨン、ポリエステル等の不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルタ一、ニトロセルロースフィル夕一、ポリスルホンフィルター、多孔質材料等が挙げられる。

本発明のキットは、上記の内容物以外に、本発明の免疫学的検査方法において好ましく使用され得る付加的な内容物を含んでいてもよい。例えば、第一および第二標識体、ならびに介在物質を分散（溶解）させるのに好ましく使用される上記の緩衝液などが挙げられる。

〔3〕態様 C

態様 Cは、検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化した固定相で、該第一の免疫化学的成分および、該検査対象物と結合しうる第二の免疫化学的成分を標識物質に結合してなる標識体により該検査対象物を挟み込むサンドィツチ型免疫学的測定方法において、ピオチンとアビジンの結合を介して複合体を形成して検査対象物を検出することを特徴とする免疫学的測定方法である。

この態様の実施に際しては、次の 3つの態様がある。

( 1 ) C— 1の態様標識物質にさらにピオチンが結合しており、該ビォチンと結合するアビジンを介して複合体〔例えば、吸水性基材-第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分一標識物質一ピオチン—アビジン—ピオチン—標識物質一第二の免疫化学的成分〕を形成し、該複合体中の標識物質により検査対象物を検出することを特徴とする免疫学的測定方法。

この場合、アビジンが、吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持されているものを用いてもよい。

( 2 ) C— 2の態様

標識体として第二の免疫化学的成分、第一標識物質およびァビジンからなる結合体を用い、これにさらにピオチンと第二標識物質の結合体を反応させて、該ァビジンと該ビォチンとの結合を介した複合体〔例えば、吸水性基材ー第一の免疫化学的成分一検査対象物一第二の免疫化学的成分 -第一標識物質一アビジンービォチン一第二標識物質〕を形成し、該複合体中の第一および第二標識物質により検査対象物を検出することを特徴とする免疫学的測定方法。

この場合、ピオチンと第二標識物質の結合体が、吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持されているものを用いてもよい。

( 3 ) C - 3の態様

標識体として第二の免疫化学的成分、第一標識物質およびピオチンからなる結合体を用い、これにさらにアビジンと第二標識物質の結合体を反応させて、該ビォチンと該ァビジンとの結合を介した複合体〔例えば、吸水性基材ー第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分 -第一標識物質 -ピオチン -ァビジン一第二標識物質〕を形成し、該複合体中の第一および第二標識物質により検査対象物を検出することを特徴とする免疫学的測定方法。この場合、アビジンと第二標識物質の結合体が、吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持されているものを用いてもよい。

この態様において検査対象物とは、態様 Aで述べた検査対象物と同様である。前記検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学的成分とは、態様 Aで述べた第一の免疫化学的成分、第二の免疫化学的成分と同様のものであり、測定対象の検査対象物と特異的に結合しうる物質であり、抗体または抗原が挙げられ（ここで、抗原としてはタンパク質、ペプチド、ハプテン等が含まれる）、測定対象の検査対象物に応じて、サンドイッチ法などで用いられる公知のものを適宜選択する。例えば検査対象物が抗原の場合は、対応する抗体を免疫化学的成分として用いることができる。この場合、固定相に固定化する第一の免疫化学的成分と標識体の構成要素として用いる第二の免疫化学的成分には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を使用することができ、一方の免疫化学的成分がモノクローナル抗体である場合には、もう一方の免疫化学的成分は当該モノクローナル抗体とは異なる抗原決定基を認識するものが好ましい。また、検査対象物が抗体の場合は、対応する抗原を免疫化学的成分として用いることができる。この場合、第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学的成分として、対応する抗原および検査対象物である抗体に対する抗抗体（抗免疫グロプリン抗体）をそれぞれ用いてもよい。

本発明における吸水性基材は、態様 Aで述べた吸水性基材と同様のものであり、検査対象物を含有する被検試料、例えば、血清、血液、尿、便、唾液等を吸収できるもの、前記被検試料を緩衝液によって希釈した希釈液を吸収するもの、標識体を含有する液を吸収するものであれば特に限定されない。ここで使用される緩衝液としては、特に限定されないが、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、 T r i s 一 H C 1緩衝液等が挙げられる。

本発明において固定相とは、前記第一の免疫化学的成分が前記吸水性基材上に固定化された領域をいう。第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化する方法（固定相の作製方法）は、特に限定されるものではないが、従来から知られてレ、る物理吸着法や共有結合法によるのが好適である。

固定化する第一の免疫化学的成分の量は、用いる免疫化学的成分の種類や特性によっても異なる力通常、 0 . 0 0 1〜 1 O m g Z c m ² 程度である。

また、固定相を形成した後の吸水性基材は、検査対象物または標識体の非特異的吸着を防ぐために、ポリオキシエチレン（2 0 ) ソルビタンモノラウレート（ Tw e e n ^TM 2 0 ) 、ポリオキシエチレン（2 0 ) ソルビ夕ンモノォレエ一ト（ Tw e e n™8 0 ) , ポリオキシエチレン（ 1 0 ) ォクチルフエ二ルェ一テル（ T r i t 0 n ^TMX— 1 0 0 ) 、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリゥム等の界面活性剤ゃゥシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン等のタンパク質や、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の水溶性高分子でプロックすることが好ましい。

本発明における標識体とは、 C - 1の態様では標識物質に前記第二の免疫化学的成分、さらにはピオチンを結合させたもの、 C一 2の態様では第二の免疫化学的成分、第一標識物質およびアビジンからなる結合体を、 C一 3の態様では第二の免疫化学的成分、第一標識物質およびピオチンからなる結合体をいう。ここで用いる標識物質あるいは第一標識物質としては特に限定されないが、検出の簡便性という観点から着色粒子が好ましい。着色粒子は、肉眼で着色が検出可能なものであれば制限はなく、態様 Aで述べた着色粒子と同様のものである。

ビォチンとしては、アビジンと特異的に結合するものであれば特に限定されるものではなく、ピオチンまたはその誘導体であってもよい。ピオチンの誘導体としては、例えば、ピオチンメチルエステル、ピオチノ一ル、ピオチニル ω—プロミド、ビオシチン、デスチオビォチン、ピオチン L—スルホキシド等が挙げられる。特に、ピオチン、ビオシチンが好ましい。

アビジンとしては、ピオチンと特異的に結合するものであれば、特に限定されない。アビジンは、卵白から単離したもの、 Streptomyces avidini i から単離したストレプトアビジンでもよい。特に、アビジンが好ましい。

前記着色粒子に第二の免疫化学的成分およびピオチンを結合する方法、あるいは前記着色粒子に第二の免疫化学的成分およびアビジンを結合する方法としては、従来からよく知られている方法、例えば共有結合法、物理吸着法、イオン結合法などを用いることができるが、結合後の第二の免疫化学的成分およびビォチン、または第二の免疫化学的成分およびァビジンの脱離がなく安定である点から共有結合法を採用することが好ましい。第二の免疫化学的成分およびピオチン、または第二の免疫化学的成分およびアビジンが結合した着色粒子の色は異なっても構わないが、同一であるのが好ましい。

こうして得られた標識体は、緩衝液に分散させて使用することができる。ここで使用する緩衝液としては、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、 T r i s— H C 1緩衝液等が挙げられ、抗原抗体反応を阻害しない p H及び塩濃度の緩衝液を適宜使用する。標識体の使用量は、本発明の各種の態様において適宜設定することができる。例えば、標識体を含有する緩衝液中の標識体濃度は、 0 . 0 0 5〜5重量 %、好ましくは 0 . 0 1〜0 . 5重量％の範囲とする。濃度があまりにも低すぎると、固定相に結合する着色粒子数が少なく、発色が悪くなる。また、濃度が高すぎると、不経済なばかりでなく、過剰の着色粒子が固定相以外に残留し、固定相の発色を不明瞭にする等の問題が発生する（以下、標識体を含有する緩衝液を標識体液ともいう）。

本発明の方法（C一 2の態様）に用いられるピオチンと第二標識物質の結合体は、前記第一標識物質と同様の標識物質にピオチンを結合したものである。第一標識物質および第二標識物質に好適に用いられる着色粒子の色は異なっても構わないが、同一であるのが好ましい。同様に、本発明の方法（C— 3の態様）に用いられるアビジンと第二標識物質の結合体は、前記第一標識物質と同様の標識物質にアビジンを結合したものである。第一標識物質および第二標識物質に好適に用いられる着色粒子の色は異なっても構わないが、同一であるのが好ましい。前記着色粒子にピオチン又はアビジンを結合する方法としては、従来からよく知られている方法、例えば共有結合法、物理吸着法、イオン結合法などを用いることができる力、結合後のピオチン又はアビジンの脱離がなく安定である点から共有結合法を採用することが好ましい。

C一 1の態様におけるアビジンの適用方法、 C一 2の態様におけるピオチンと第二標識物質の結合体の適用方法、あるいは C一 3の態様におけるアビジンと第二標識物質の結合体の適用方法としては、吸水性基材上の一端と第一の免疫化学的成分を固定化した固定相との間の任意の領域に水との接触によつて脱離しうる状態で保持されていてもよく、標識体液に混合させて用いてもよい。また、緩衝液に混合させて用いてもよい。ここで用いられる緩衝液は、前記標識体を分散させるのに用いられるものと同様のものが挙げられる。

本発明においては、 C一 1の態様ではアビジンを被検試料や緩衝液などの水との接触によつて吸水性基材から脱離しうるように、 C一 2の態様ではビォチンと第二標識物質の結合体を被検試料や緩衝液などの水との接触によつて吸水性基材から脱離しうるように、あるいは C一 3の態様ではァビジンと第二標識物質の結合体を被検試料や緩衝液などの水との接触によつて吸水性基材から脱離しうるように、吸水性基材上に塗布することが好ましい。塗布方法としては、例えば C— 1の態様ではアビジンの溶液を、 C一 2の態様ではピオチンと第二標識物質の結合体の溶液を、あるいは C一 3の態様ではアビジンと第二標識物質の結合体の溶液を吸水性基材に塗布したのち、適当な条件にて乾燥させる。乾燥の一態様として凍結乾燥させることもできる。水溶性重合体もしくはサッ力ロース溶液中に標識物質を分散させ、該分散液を吸水性基材上に塗布して同様に乾燥させてもよい。この方法は、水溶性重合体またはサッカロースが容易に水溶化し、標識物質が速やかに基材から脱離して被検試料中の検査対象物および Zまたは介在物質を介してもう一方の標識物質と反応し得るとともに、水溶性重合体ゃサッカロースの濃度を調整することにより吸水性基材の所定の領域に標識物質を保持させるのに適当な粘度を得ることができ、さらに乾燥に際して標識物質の凝集や変性を防ぎ、また乾燥後に標識物質が吸水性基材から脱離しにくいという点で有利である。本発明のサンドィッチ型免疫学的測定方法は、前記ァビジンと前記ピオチンとの間の高いァフィニティーとアビジン 1分子に対して複数のビォチン分子が結合し得るため、 C一 1の態様では固定相での検査対象物と第一の免疫化学的成分との複合体に、ピオチンの結合した標識体がァビジンを介して多数結合することによりさらに高次の複合体が形成され、その結果、検査対象物と第一の免疫化学的成分との結合シグナルが増幅され、着色した標識体の検出が容易になるという効果を奏する。同様に C - 2、 3の態様では、固定相での検査対象物と第一の免疫化学的成分との複合体に標識体が結合する際にビォチンと第二標識物質又はァビジンと第二標識物質の結合体を介してさらに高次の複合体が形成され、その結果、検査対象物と第一の免疫化学的成分との結合シグナルが増幅され、着色した標識体および第二標識物質による目視検出が容易になるという効果を奏する。即ち、本発明における複合体は、最もシンプルな結合様式として C一 1の態様では、吸水性基材 -第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分 -標識物質—ピオチン—アビジン一ピオチン—標識物質一第二の免疫化学的成分で表現することができるが、アビジンに結合する一ピオチン—標識物質一第二の免疫化学的成分は同一のアビジン分子に複数個結合することができるので、吸水性基材 -第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分 -標識物質 —ピオチン一アビジン一（ピオチン—標識物質—第二の免疫化学的成分） n で表現することができる。

また、前記複合体の末端にある第二の免疫化学的成分には、さらに検査対象物が結合可能であるため、その第二の免疫化学的成分にさらに検査対象物が結合し、次いで一第二の免疫化学的成分一標識物質一ピオチン一アビジン一（ピオチン一標識物質一第二の免疫化学的成分） n が結合することもできる。即ち、吸水性基材 -第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分 -標識物質—ピオチン一アビジン— （ピオチン—標識物質一第二の免疫化学的成分） n 一〔検査対象物一第二の免疫化学的成分一標識物質 -ピオチン一アビジン一（ビォチン一標識物質一第二の免疫化学的成分） n 〕 n

のように複雑な複合体となる。

本発明におけるこれらの複合体は一例であり、ピオチン—ァビジン結合を介した種々の複雑な複合体が含まれる。

また、 C一 2の態様では、最もシンプルな結合様式として、吸水性基材—第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分 -第一標識物質 -ァビジンーピオチン一第二標識物質で表現することができるが、アビジンに結合する一ビォチンー第二標識物質は同一のァビジン分子に複数個結合することができるので、例えば、吸水性基材-第一の免疫化学的成分-検査対象物 -第二の免疫化学的成分一第一標識物質一アビジン一（ピオチン—第二標識物質） n で表現することができる。

また、前記複合体の末端にある第二標識物質には、多数のピオチンが結合しており、そのそれぞれのビォチンにもさらに別の第一標識物質と結合したァビジンが結合し、ピオチン—アビジン結合を介した種々の複雑な複合体が形成される。また、 C一 3の態様では、最もシンプルな結合様式として、吸水性基材—第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分 -第一標識物質 -ビォチンーアビジン—第二標識物質で表現することができる。また、アビジンに結合するピオチン一第一標識物質一第二の免疫化学的成分は同一のアビジン分子に複数個結合することが可能であり、さらに、前記第一標識物質には、多数のピオチンが結合しているので、そのそれぞれのピオチンにもさらに別の第二標識物質と結合したァビジンが結合し、ピオチン—ァビジン結合を介した種々の複雑な複合体が形成される。

また、本発明においては、被検試料、標識体液、被検試料および標識体液の混合物、緩衝液などの吸液が開始される部位（以下、滴下部とも称する）と固定相との間の距離は、 1〜6 c m、好ましくは 2〜4 c m程度とする。距離があまりに遠すぎると、固定相まで検査対象物と標識体が到達しなかったり、発色感度が強すぎたり、測定に時間がかかつたりするという問題点を生じる恐れがあり好ましくない。一方、距離が近すぎると固定相での発色が均一でなく、まばらになつたり、発色感度が低すぎるという問題が生じる恐れがある。

本発明の免疫学的測定方法の態様を以下に説明する。

C一 1の態様では、次の 2つの態様が例示される。第 1の態様は、図 1 0に示すように、被検試料を、標識体 4を含有する緩衝液およびアビジン 8と混合し、混合液を吸水性基材 1上の滴下部 1 1から展開して、第一の免疫化学的成分 2が固定化されている固定相 3に移動させる。この間に、標識体 4中の第二の免疫化学的成分 6と検査対象物 9との結合や、標識体 4中のピオチン 7とアビジン 8との結合が起こる。固定相 3に到着すると、吸水性基材 1上に固定化された第一の免疫化学的成分 2と検査対象物 9とが結合し、複合体〔吸水性基材-第一の免疫化学的成分 -検査対象物一第二の免疫化学的成分 -標識物質ービォチン -ァビジンー標識物質〕 1 0を形成する。

第 2の態様は、図 1 1に示すように、吸水性基材 1上の滴下部 1 1から、被検試料を、標識体 4を含有する緩衝液と共に展開して、第一の免疫化学的成分 2が固定化されている固定相 3に移動させる。この途中に、アビジン 8が塗布されている相（アビジン相）に到着し、水との接触によりアビジン 8が脱離する。さらに、吸水性基材 1上を移動して第一の免疫化学的成分 2が固定化されている固定相 3に到達する間に、標識体 4中の第二の免疫化学的成分 6と被検試料中の検査対象物 9との結合や、標識体 4中のピオチン 7と吸水性基材 1上に固定されていたが水との接触により脱離したァビジン 8との結合が起こる。固定相 3に到着すると、吸水性基材上に固定化された第一の免疫化学的成分 2と検査対象物 9とが結合し、複合体〔吸水性基材-第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分一標識物質ービォチン一アビジン一標識物質〕 1 0を形成する。

こうして形成された複合体 1 0は、免疫標識体を構成する標識物質 5としての着色粒子がアビジン一ピオチンを介する高次結合により集合して発色が明瞭となり、目視確認することができる。

C一 2の態様では、次の 2つの態様が例示される。第 1の態様は、図 1 2に示すように、被検試料を、標識体 4を含有する緩衝液およびピオチンと第二標識物質の結合体 8と混合し、混合液を吸水性基材 1上の滴下部 1 3から展開して、第一の免疫化学的成分 2が固定化されている固定相 3に移動させる。この間に、標識体 4中の第二の免疫化学的成分 6と検査対象物 9との結合や、標識体 4中のァビジン 7とピオチンと第二標識物質の結合体 8中のピオチン 1 0との結合が起こる。固定相 3に到着すると、吸水性基材 1上に固定化された第一の免疫化学的成分 2と検査対象物 9とが結合し、複合体〔吸水性基材ー第一の免疫化学的成分 - 検査対象物―第二の免疫化学的成分一第一標識物質一アビジン一ピオチン—第二標識物質〕 1 1を形成する。

第 2の態様は、図 1 3に示すように、吸水性基材 1上の滴下部 1 3力、ら、被検試料を、標識体 4を含有する緩衝液と共に展開して、第一の免疫化学的成分 2が固定化されている固定相 3に移動させる。この途中に、ピオチンと第二標識物質の結合体 8が塗布されている標識相 1 2に到着し、水との接触によりピオチンと第二標識物質の結合体 8が脱離する。さらに、吸水性基材 1上を移動して第一の免疫化学的成分 2が固定化されている固定相 3に到達する間に、標識体 4中の第二の免疫化学的成分 6と被検試料中の検査対象物 9との結合や、標識体 4中のァビジン 7と吸水性基材 1上に固定されていたが水との接触により脱離したビォチンと第二標識物質の結合体 8中のピオチン 1 0との結合が起こる。固定相 3に到着すると、吸水性基材上に固定化された第一の免疫化学的成分 2と検査対象物 9 とが結合し、複合体〔吸水性基材-第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分一第一標識物質一アビジン一ピオチン一第二標識物質〕 1 1を形成する。

こうして形成された複合体 1 1は、第一標識物質 5および第二標識物質 5としての着色粒子がァビジン一ピオチンを介する高次結合により集合して発色が明瞭となり、目視確認することができる。

C— 3の態様では、次の 2つの態様が例示される。第 1の態様は、図 1 4に示すように、被検試料を、標識体 4を含有する緩衝液およびアビジンと第二標識物質の結合体 8と混合し、混合液を吸水性基材 1上の滴下部 1 3から展開して、第 —の免疫化学的成分 2が固定化されている固定相 3に移動させる。この間に、標識体 4中の第二の免疫化学的成分 6と検査対象物 9との結合や、標識体 4中のビォチン 7とアビジンと第二標識物質の結合体 8中のアビジン 1 0との結合が起こる。固定相 3に到着すると、吸水性基材 1上に固定化された第一の免疫化学的成分 2と検査対象物 9とが結合し、複合体〔吸水性基材-第一の免疫化学的成分一検査対象物一第二の免疫化学的成分一第一標識物質一ピオチン一アビジン—第二標識物質〕 1 1を形成する。

第 2の態様は、図 1 5に示すように、吸水性基材 1上の滴下部 1 3から、被検試料を、標識体 4を含有する緩衝液と共に展開して、第一の免疫化学的成分 2が固定化されている固定相 3に移動させる。この途中に、アビジンと第二標識物質の結合体 8が塗布されている標識相 1 2に到着し、水との接触によりアビジンと第二標識物質の結合体 8が脱離する。さらに、吸水性基材 1上を移動して第一の免疫化学的成分 2が固定化されている固定相 3に到達する間に、標識体 4中の第二の免疫化学的成分 6と被検試料中の検査対象物 9との結合や、標識体 4中のビォチン 7と吸水性基材 1上に固定されていたが水との接触により脱離したァビジンと第二標識物質の結合体 8中のアビジン 1 0との結合が起こる。固定相 3に到着すると、吸水性基材上に固定化された第一の免疫化学的成分 2と検査対象物 9 とが結合し、複合体〔吸水性基材-第一の免疫化学的成分 -検査対象物 -第二の免疫化学的成分一第一標識物質一ピオチン一アビジン—第二標識物質〕 1 1を形成する。

こうして形成された複合体 1 1は、第一標識物質 5および第二標識物質 5としての着色粒子がアビジン一ピオチンを介する高次結合により集合して発色が明瞭となり、目視確認することができる。

本発明において、第一の免疫化学的成分が固定化された固定相を有する吸水性基材を本発明の免疫学的検査片ともいう。

さらに、本発明は、 C一 1の態様では前記免疫学的検査片、前記標識体ならびにアビジンを含有する免疫学的測定キットを提供する。 C一 2の態様では、前記免疫学的検査片、前記標識体および前記ピオチンと第二標識物質の結合体を含有する免疫学的測定キットを提供する。 C - 3の態様では、前記免疫学的検査片、前記標識体および前記アビジンと第二標識物質の結合体を含有する免疫学的測定キットを提供する。これらの本発明のキットは、本発明の免疫学的測定方法に好適に用いられるものである。

本発明のキットに含有される免疫学的検査片および標識体は、前記本発明の免疫学的測定方法で定義した通りである。

本発明のキットに含有される C一 1の態様におけるアビジン、 C一 2の態様におけるピオチンと第二標識物質の結合体、 C一 3の態様におけるアビジンと第二標識物質の結合体は、前記本発明の免疫学的測定方法で定義した通りであるが、免疫学的検査片の吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持されていることが好ましい。以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例 A - 1 免疫学的検査用キッ卜の作製

( 1 ) 第一標識免疫化学的成分液の作製青色着色力ルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分散液（固形分濃度 5重量％、平均粒子径 0. l zm、 0. 0 1Mホウ酸緩衝液（pH8) 中） 3mlに、水溶性カルポジイミド（ 1 mg/m 1、 0. 0 1 Mホウ酸緩衝液（pH 8) 中 ) 1 m 1および 1 mgZm 1ャギ I gG抗大腸菌◦ 1 57 ： H 7抗体（Kirkegaa rd & Perry Laboratories Inc.製、 0. 0 1Mホウ酸緩衝液（ρΗ8) 中） lm 1を加えて 1 0°Cで 3時間反応させた後、洗浄液としてホウ酸緩衝液（pH8) を用いて遠心分離洗浄を行い、青色着色ラテックス粒子標識抗大腸菌 01 57 : H 7抗体を作製した。得られたラテックス粒子標識抗体は、 0. 0 1M—ホウ酸緩衝液（pH8) に、固形分濃度 2重量％となるように懸濁した。

( 2 ) 第二標識免疫化学的成分液の作製

上記（1) と同様にして、青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分散液（固形分濃度 5重量％、平均粒子径 0. l /m、 0. 0 1Mホウ酸緩衝液（PH8) 中） 3mlに、水溶性カルポジイミド（lmg/ml、 0. 0 1 M ホウ酸緩衝液（PH8) 中） 1mlおよび 2mgZmlゥサギ抗ャギ I gG抗体

(Kirkegaard & Perry Laboratories In 製、 0. 0 1Mホウ酸緩衝液（pH8 ) 中） 1mlを加えて 1 0°Cで 3時間反応させた後、洗浄液としてホウ酸緩衝液

(pH8) を用いて遠心分離洗浄を行い、青色着色ラテックス粒子標識抗ャギ I gG抗体を作製した。得られたラテックス標識抗体は、 0. 0 1M—ホウ酸緩衝液（PH8) に、固形分濃度 2重量％となるように懸濁した。

( 3 ) 検査片の作製

二トロセルロースメンブレン（孔径 8〃m、 6 mmx 60 mm) の一端から 3 0 mmの箇所に、 lmg/mlゥサギ I gG抗大腸菌 01 57 ： H7抗体（Capr icorn社製、 0. 1 Mリン酸緩衝液（ p H 7. 4 ) 中） 0. 5// 1を、ディスぺンサーを用いてライン状に塗布した。このメンブレンを 1重量％ゥシ血清アルブミンおよび 0. 1重量％ポリオキシエチレン（1 0) ォクチルフヱニルエーテル (和光純薬工業社製）からなる水溶液中に 1 0分間浸潰させた後、 40°Cで 2時間乾燥させた。

次いで、このメンブレンの裏側（抗体塗布面の反対側）に、ポリエステルフィルム（ 1 0 0 m厚）をスプレー糊を用いて貼り合わせた。さらに、抗体塗布箇所反対端から 0〜8 mmの箇所にポリエステル不織布（ 6mmx 8mm, 厚さ 2 . 5mm) を貼り合わせて検査片を作製した。実施例 A— 2 免疫学的検査用キットによる大腸菌 01 57 : H7の検出

0. 9重量％NaC l含有 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH7. 4) に大腸菌 01 5 7 ： !17株を表八— 1に示した各濃度で分散させた被検試料液を調製した。この被検液に、実施例 A— 1の（ 1 ) で作製した第一標識抗体液を、固形分濃度 0 . 02重量％となるように混合、攪拌した後、混合液 6 0 p.1を実施例 A— 1の (3) で作製した検査片のポリエステル不織布部に滴下した。混合液が検査片に展開した後、実施例 A - 1の（2) で作製した第二標識抗体液を固形分濃度 0. 0 2重量％となるように 0. 9重量％Na C l含有 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH 7. 4) で希釈した液 6 0 / 1を、上記ポリエステル不織布部に滴下し、 20分後の固定相上での発色の有無を目視観察した。その結果を表 A - 1に示す。比較として、第二標識抗体を用いず、第一標識抗体のみを使用した場合の測定結果を並べて示している。実施例 A— 3 免疫学的検査用キットによる大腸菌 01 5 7 : H7の検出

0. 9重量％NaC l含有 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH7. 4) に大腸菌〇 1 57 ： H7株を表A— 1に示した各濃度で分散させた被検試料液を調製した。この被検液に、実施例 A— 1の（ 1 ) で作製した第一標識抗体液と実施例 A— 1の (2) で作製した第二標識抗体液とを、各固形分濃度 0. 02重量％となるように混合、攪拌した後、該混合液 6 0 i 1を実施例 A— 1の（3) で作製した免疫学的検査片のポリエステル不織布部に滴下した。 20分後に固定相上での発色の有無を目視観察した。その結果を表 A— 1に示す。比較として、第二標識抗体を用いず、第一標識抗体のみを使用した場合の測定結果を並べて示している。実施例 A - 4 免疫学的検査用キットによる大腸菌 01 5 7 : H7の検出

0. 9重量 Na C l含有 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH7. 4) に大腸菌 01 5 7 ： H 7株を表 A— 1に示した各濃度で分散させた被検試料を調製した。この被検試料 2 1を実施例 A— 1の（ 3) で作製した免疫学的検査片の表面側に、抗体塗布箇所の反対側から 1 2〜2 Ommの部分に吸収させた。次いで、実施例 A— 1の（ 1 ) で作製した第一標識抗体液を、固形分濃度 0. 0 2重量％となるように 0. 9重量％Na C l含有 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH 7. 4) で希釈した後、該希釈液 60 1を、検查片のポリエステル不織布部に滴下した。第一標識抗体液が被検試料と接触しさらに展開した後、実施例 A— 1の（2) で作製した第二標識抗体液を、固形分濃度 0. 02重量％となるように 0. 9重量％Na C 1含有 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH7. 4) で希釈した液 6 0 1を、上記ポリエステル不織布部に滴下し、 20分後に固定相上での発色の有無を目視観察した。その結果を表 A— 1に示す。比較として、第二標識抗体を用いず、第一標識抗体のみを使用した場合の測定結果を並べて示している。実施例 A— 5 免疫学的検査用キットによる大腸菌 01 5 7 : H7の検出

0. 9重量％Na C l含有 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH7. 4) に大腸菌 01 5 7 ： H 7株を表 A— 1に示した各濃度で分散させた被検試料液を調製した。この被検試料 2 1を実施例 Α - 1 © (3) で作製した免疫学的検査片の表面側に、抗体塗布箇所の反対側から 1 2〜2 Ommの部分に吸収させた。次いで、実施例 A— 1の（ 1 ) で作製した第一標識抗体液と実施例 A— 1の（2) で作製した第二標識抗体液とを混合、各固形分濃度 0. 0 2重量％となるように 0. 9重量 %NaC l含有0. 1 Mリン酸緩衝液（pH7. 4 ) で希釈した後、該混合希釈液 6 0 1を実施例 A— 1の（3 ) で作製した免疫学的検査片のポリエステル不織布部に滴下した。 2 0分後に固定相上での発色の有無を目視観察した。その結果を表 A— 1に示す。比較として、第二標識抗体を用いず、第一標識抗体のみを使用した場合の測定結果を並べて示している。

表 A— 1 実施例 0 1 5 7 ： H 7菌体密度（cfu/ml)

測定法 10⁸ 10⁷ 10⁶ 10⁵ 10⁴ 10³ 10²

A - 2 第一標識抗体のみ使用 + + + +

第一 ·第二標識抗体使用 + + + + +

A— 3 第一標識抗体のみ使用 + + + +

第一 ·第二標識抗体使用 + + + + +

A - 4 第一標識抗体のみ使用 + + + —

第一 ·第二標識抗体使用 + + + +

A - 5 第一標識抗体のみ使用 + + +

第一 ·第二標識抗体使用 + + + +

+ ：固定相にライン上の発色が見える

一：固定相にライン上の発色が見られない

実施例 B - 1 免疫学的検査用キット構成物の作製

( 1 ) 水分散型高分子重合体粒子からなる着色ラテックスの作製

スチレンモノマー 50 g、アクリル酸 0. 5 g、トリエチレングリコールジメタクリレート 0. 2 g、及び蒸留水 440 gを窒素気流下で温度 75°Cにて攪拌しながら、これに過硫酸カリウム 0. 25 gを水 1 0 gに溶解した水溶液を加え、 1 0時間重合させて、平均粒子径 0. 22 zmの水分散型高分子重合体粒子の水分散液を得た。この重合体粒子分散液をアルカリ、酸、蒸留水の順序にて遠心洗浄した後、固形分濃度 1 0重量％に調整した（担体粒子分散液）。スダンプル一 0. 2 gをトルエン 2 Omlに溶解し、これにドデシル硫酸ナトリウム 0. 2 g、及び蒸留水 1 00mlを加え、超音波分散機でこの混合液を乳化した。この液に上記担体粒子分散液（固形分濃度 1 0重量 30mlを加え、室温にて 2 4時間攪拌した。この液をエバポレー夕にてトルエンを除去した後、 0. 0 1M ホウ酸緩衝液（pH7. 5) にて遠心洗浄を行い、固形分濃度 5重量％となるように調整した。この液 50mlに、 1ーェチルー 3— （3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド塩酸塩水溶液（ 1 Omg/m 1 ) 5ml、及び 0. 03M m—キシレンジァミン水溶液 5 Om 1を加え、室温にて 5時間反応させた。この液を 75でにて 5時間加熱処理した後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄を行い、固形分濃度 1重量％となるように調整した（スダンブル一染色キシレンジアミンスぺーサ化粒子分散液）。

( 2 ) 第一標識体含有液の作製

上記（1) で調製したスダンブルー染色キシレンジァミンスべ一サ化粒子分散液 1 Om 1にグルタルアルデヒド水溶液（0. lmg/ml) 1 m 1を加え、室温にて 2時間反応させた後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％の分散液に調整した。この分散液 1 Om 1に第三の免疫化学的成分として抗ヒトヘモグロビン抗体（ゥサギ I gG, 1 Omg/m 1 ) を 1 m 1、第二の免疫化学的成分として抗ヒト HB s抗体（ゥサギ I gG， 5mg/m 1 ) を lml、それぞれ加え、 1 0°Cにて 24時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％となるように再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンブルー染色粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体—抗ヒト HB s抗体（第一標識体）含有液を得た。

( 3 ) 第二標識体含有液の作製

上記（ 1 ) で調製したスダンブルー染色キシレンジァミンスぺーサ化粒子分散液 1 Om 1にグルタルアルデヒド水溶液（ 0. lmgZml) 1 m 1を加え、室温にて 2時間反応させた後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％の分散液に調整した。この分散液 1 Om lに、第四の免疫化学的成分として抗ヒトヘモグロビン抗体（ゥサギ I gG, 1 Omg/m 1 ) 2m 1、を加え、 1 0°Cにて 24時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％となるように再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンブル一染色粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体（第二標識体）含有液を得た。

( 4 ) 免疫学的検査片の作製

第一の免疫化学的成分として抗ヒト HB s抗体（ゥサギ I gG) を、 0. 1 M リン酸緩衝液（pH 7. 4) にて希釈し、最終濃度 lmgZmlの水溶液に調整した。この水溶液に、ニトロセルロースメンブランフィルター（東洋ろ紙、 5 x 1 0 Omm) の一端から 5 0 mm部位に 1 0 1塗布した後、直ちに 37でで 1 時間静置した後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出し、 0. 1 % ゥシ血清アルブミン、 0. 1 %Twe e n 20の水溶液に 1時間浸漬させた。その後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出し、室温で 3時間静置し、抗ヒト HB s抗体を有するニトロセルロースメンブランフィルターを得た。次に、上記の抗ヒト HB s抗体固定化ニトロセルロースメンブランフィルターの試験片の一端（吸液部）の近傍に血球分離相（東洋ろ紙 No. 2, 5 x 1 0 mm) を設け、固定相および血球分離相を有するニトロセルロースメンブランフィルタ一からなる検査片を得た。 (5) 標識相を設けた免疫学的検査片の作製

5重量％ポリビニルピロリドン（粘度平均分子量 25000 ) 水溶液 lmlに、実施例 B - 1の（ 2 ) で作製した第一標識体含有液 0. lmlを加えて十分混合した後、この溶液 1 0 1を上記検査片の固定相の位置から 20〜30mmの位置に塗布し、これをデシケ一夕一内で 2日間乾燥して、標識相を設けた免疫学的検査片を得た。実施例 B— 2 免疫学的検査用キットによるヒト HB s抗原の検出

実施例 B— 1の（5) で作製した検査片の血球分離相に、ヒト HBs抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液 1 を滴下した。その後、直ちにへモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度 20 Ong/ml) および実施例 B— 1の（3) で作製した第二標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量％) の混合液 1 00 1を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後の固定相上での発色を目視観察した（図 5)。その結果を表 B— 1に示す。

表 B— 1

- ：発色なし土：弱い発色 +：強い発色比較例 Β - 1

実施例 Β - 1の（4) で作製した検査片の血球分離相に、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液 1 0 1を滴下した。その後、直ちに実施例 B 一 1の（2) で作製した第一標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量 5 0 / 1 を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後、ヘモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度 2 0 O ng/m l ) 1 0 0〃 1を吸液部に滴下して展開した。さらに 1 0分後、実施例 B - 1の（3) で作製した第二標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量 5 0 1を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後の固定相上での発色を目視観察した。その結果を表 Β— 2に示す。表 B— 2

一：発色なし土：弱い発色 + ：強い発色実施例 Β— 3 免疫学的検査用キットによるヒト HB s抗原の検出

実施例 Β— 1の（4) で作製した検査片の血球分離相に、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液 1 0 1を滴下した。その後、直ちに実施例 B 一 1の（2) で作製した第一標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量％) 5 0 1 を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後、ヘモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度 2 0 0 n g/m 1 ) 1 0 0 1を吸液部に滴下して展開した。さらに 1 0分後、実施例 B - 1の（3) で作製した第二標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量 5 0 1を吸液部に滴下して展開した（図 6) 1 0分後の固定相上での発色を目視観察した。その結果を表 B— 3に示す。表 B— 3

一：発色なし土：弱い発色 +：強い発色比較例 B— 2

実施例 B— 1の（4) で作製した検査片の血球分離相に、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液 1 0 1を滴下した。その後、直ちに実施例 B 一 1の（2) で作製した第一標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量 5 0 1 を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後の固定相上での発色を目視観察した。その結果を表 B— 4に示す。

表 B— 4

一：発色なし土：弱い発色 +：強い発色実施例 Β— 4 免疫学的検査用キットによるヒト HB s抗原の検出

実施例 Β - 1の（4) で作製した検査片の血球分離相に、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液 1 を滴下した。その後、直ちに実施例 B 一 1の（2) で作製した第一標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量％) 、へモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度 200 n g/m 1 ) および実施例 B - 1の（3) で作製した第二標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量％) の混合液 1 00 1を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後の固定相上での発色を目視観察した（図 7) 。その結果を表 B— 5に示す。表 B— 5

- ：発色なし土：弱い発色 +：強い発色比較例 B - 3

実施例 B - 1の（4) で作製した検査片の血球分離相に、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液 1 0 1を滴下した。その後、直ちに実施例 B 一 1の（2) で作製した第一標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量％) 5 0 / 1 を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後、ヘモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度 2 0 0 n g/m 1 ) 1 0 0 1を吸液部に滴下して展開した。さらに 1 0分後、実施例 B - 1の（3) で作製した第二標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量％) 5 0 1を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後の固定相上での発色を目視観察した。その結果を表 B— 6に示す。表 B— 6

一：発色なし土：弱い発色 +：強い発色実施例 B 5 標識相を設けた免疫学的検査片の作製

5重量％ポリビニルピロリドン（粘度平均分子量 25 0 0 0 ) 水溶液 l m lに、実施例 B - 1の（ 3 ) で作製した第二標識体含有液 0. l m lを加えて十分混合した後、この溶液 1 0 / 1を実施例8— 1の（4) の検査片の固定相の位置から 20〜 30 mmの位置に塗布し、これをデシケ一夕一内で 2日間乾燥して、標識相を設けた免疫学的検査片を得た。実施例 B— 6 免疫学的検査用キットによるヒト HB s抗原の検出

実施例 B - 5で作製した検査片の血球分離相に、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液 1 0 / 1を滴下した。その後、直ちにヘモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度 20 0 n g/m 1 ) および実施例 B— 1の（2) で作製した第一標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量％) の混合液 1 0 0 1を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後の固定相上での発色を目視観察した（図 8) 。その結果を表 B— 7に示す _c 表 B— 7

一：発色なし土：弱い発色 + ：強い発色比較例 B - 4

実施例 B - 1の（2 ) で調製した第一標識体だけを用い、第二標識体および介在物質であるヘモグロビン抗原を用いない以外は実施例 B— 6と同様にヒト H B s抗原の測定を行った。すなわち、実施例 B - 5で作製した検査片の血球分離相に、ヒト H B s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液 1 0 1を滴下した後、直ちに第一標識体含有液（固形分濃度 0 . 2重量 5 0 ^ 1を吸液部に滴下して展開し、 1 0分後の固定相での発色を目視観察した。その結果を表 B— 8に示す。表 B— 8

一：発色なし土：弱い発色 +：強い発色実施例 Β - 7 標識相を設けた免疫学的検査片の作製

5重量％ポリビニルピロリドン（粘度平均分子量 25 0 0 0 ) 水溶液 l m lに、実施例 B - 1の（2) で作製した第一標識体含有液および実施例 B - 1の（3 ) で作製した第二標識体含有液をそれぞれ 0. lm l加えて十分混合した後、この溶液 1 0 1を実施例 B— 1の（4) の検査片の固定相の位置から 4 0〜5 0 mmの位置に塗布し、これをデシケ一ター内で 2日間乾燥して、標識相を設けた免疫学的検査片を得た。実施例 B— 8 免疫学的検査用キットによるヒト HB s抗原の検出

実施例 B— 7で作製した検査片の血球分離相に、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液 1 を滴下した。その後、直ちにヘモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度 20 0 n g/m 1 ) 1 0 0 1を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後の固定相上での発色を目視観察した（図 9) 。その結果を表 B - 9に示す c 表 B— 9

一：発色なし土：弱い発色 + ：強い発色比較例 Β— 5

実施例 Β - 7で作製した検査片の血球分離相に、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検波 1 0 1を滴下した。その後、直ちに実施例 Β— 1の（ 2) で作製した第一標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量 5 0 1を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後、ヘモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度 2 0 0 n g / 1 ) 1 0 0〃 1を吸液部に滴下して展開した。さらに 1 0分後、実施例 B— 1の（3) で作製した第二標識体含有液（固形分濃度 0. 2重量％) 5 0 / 1を吸液部に滴下して展開した。 1 0分後の固定相上での発色を目視観察した。その結果を表 B— 1 0に示す。表 B— 1 0

一：発色なし土：弱い発色 + :強い発色実施例 C一 1

〔水分散型高分子重合体粒子の作製〕

スチレンモノマー 5 0 g、アクリル酸 0. 5 g、トリエチレングリコールジメタクリレート 0. 2 g、及び蒸留水 44 0 gを窒素気流下で温度 75°Cにて攪拌しながら、これに過硫酸カリウム 0. 25 gを水 1 0 gに溶解した水溶液を加え、 1 0時間重合させて、平均粒径 0. 22 /mの水分散型高分子重合体粒子の水分散液を得た。

得られた重合体粒子分散液をアルカリ、酸、蒸留水の順序にて遠心洗浄した後、固形分濃度 1 0重量％に調整した（担体粒子分散液）。

スダンブル一 0. 2 gをトルエン 20m 1に溶解し、これにドデシル硫酸ナトリウ厶 0. 2 g及び蒸留水 1 0 0m lを加え、超音波分散機でこの混合液を乳化した。得られた乳化液に前記担体粒子分散液（固形分濃度 1 0重量％) 3 Om 1を加え、室温にて 24時間攪拌した。この液をエバポレー夕にてトルエンを除去した後、 0. 0 1 Mホウ酸緩衝液（pH7. 5) にて遠心洗浄を行い、固形分濃度 5 重量％に調整した。

この液 5 Om 1に 1ーェチルー 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド塩酸塩水溶液（ 1 OmgZm 1 ) 5m 1および 0. 0 3M m—キシレンジァミン水溶液 5 Om 1を加え、室温にて 5時間反応させた後、 75 °Cにて 5時間加熱処理し、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄を行い、固形分濃度 1重量％になるように調整した（スダンブル一染色キシレンジアミンスぺ一サ化粒子分散液） ο

〔標識体の作製〕

前記スダンブル一染色キシレンジァミンスぺーサ化粒子分散液 1 Om 1にグルタルアルデヒド水溶液（ 0. lmgZml) 1 m 1を加え、室温にて 2時間反応させた後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％の分散液に調整した。得られた分散液 1 Om lに、ビオシチン lmgと抗ヒト HB s抗体（ゥサギ I gG、 5mg/m 1 ) 1 m 1 とを加え、 1 0 °Cにて 24時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％となるように再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンブル一染色粒子標識ビオシチン -抗ヒト H B s抗体（標識体）を得た。

〔固定相の作製〕

抗ヒト HB s抗体（ゥサギ I gG) を、 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH7. 4) にて希釈し、最終濃度 lmgZmlの水溶液を調製した。この水溶液をニトロセルロ一スメンブランフィルター（東洋濾紙、 5 x 1 0 Omm) の一端から 2 cm 部位に 1 0 / 1塗布した後、直ちに 37 °Cで 1時間静置した後、ニトロセル口一スメンブランフィルターを取り出し、 0. 1 %ゥシ血清アルブミンおよび 0. 1 %Twe e n 20の水溶液に 1時間浸漬させた。その後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出し、室温で 3時間風乾静置し、ニトロセルロースメンブランフィルタ一の一端に不織布（ 5mmx 1 Omm) の滴下部を有し、抗ヒト HB s抗体を固定化した固定相を有するニトロセルロースメンブランフィルター（免疫学的検査片）を得た。

〔ヒト HBsの検出〕

ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検試料、標識体およびアビジン混合溶液（固形分濃度 0. 2重量％) を混合し、この液 1 00 1を、前記免疫学的検査片の一端（滴下部）から滴下して展開し、 20分後の固定相の発色を観察した。結果を表 C— 1に示す。実施例 C一 2

実施例 C一 1と同様にして、スダンブルー染色粒子標識ビオシチン—抗ヒト H B s抗体（標識体）を得た。

〔固定相とアビジン相の作製〕

抗ヒト HB s抗体（ゥサギ I gG) を、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 4) にて希釈し、最終濃度 1 mg/m 1の水溶液を調製した。この水溶液に、ニトロセルロースメンブランフィルタ一（東洋濾紙、 5 X 1 00 mm) の一端から 2 c m部位に 1 0〃 1塗布した後、直ちに 37°Cで 1時間静置した後、ニトロセル口 —スメンブランフィルターを取り出し、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン、 0. 1% Twe e n 20の水溶液に 1時間浸漬した。

その後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出し、室温で 3時間静置し、ニトロセルロースメンブランフィルタ一の一端に不織布（5mmx 1 0m m) の滴下部を有し、抗ヒト HB s抗体が固定化された固定相を有するニトロセルロ一スメンブランフィルター（免疫学的検査片）を得た。その後、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 4) に溶解したアビジン（lmgZml) を、前記免疫学的検査片の固定相と滴下部の間に 1 0 1塗布した後、直ちに 37 °Cで 1時間静置し、アビジン相を有する免疫学的検査片を得た。

〔ヒト HB sの検出〕

前記免疫学的検査片のアビジン相側の一端から、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検試料と標識体（固形分濃度 0. 2重量の混合液 1 0 0 1を滴下部に滴下して展開し、 2 0分後の固定相の発色を観察した。

結果を表 C一 1に示す。表 C— 1

一：発色なし土：弱い発色 + :強い発色表 C一 1より、本発明の免疫学的方法によるヒト HB s抗原の検出感度は、約 0. 2 5 n g/m 1であった。比較例 C一 1

実施例 C一 1と同様にして抗ヒト HB s抗体を固定化したニトロセルロースメンブランフィルター、スダンブルー染色粒子標識抗ヒト HB s抗体（標識体）を得た。

前記ニトロセルロースメンブランフィルターからなる試験片の一端から、ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検試料と標識体（固形分濃度 0. 2 重量％) の混合液 1 0 0 1を滴下させ、 20分後の固定相の発色を観察した。結果を表 C一 2に示す。表 C一 2

一：発色なし土：弱い発色 + :強い発色

表 C一 2より、比較例の方法によるヒト HB s抗原の検出感度は、約 1 O n g Zm lであった。本発明の免疫学的方法は、従来法に比較して約 4 0倍感度が上昇することがわかる。実施例 C一 3 〔標識体の作製〕

実施例 C一 1と同様にして得られたスダンブル一染色キシレンジァミンスぺ一サ化粒子分散液 1 Om 1にグルタルアルデヒド水溶液（0. lmgノ ml) 1 m 1を加え、室温にて 2時間反応させた後、実施例 C一 1と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％の分散液に調整した。得られた分散液 1 Omlに、ァビジン 1 mgと抗ヒト HB s抗体（ゥサギ I gG、 5mg/m 1 ) 1 m 1とを加え、 1 0°Cにて 24時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度 1重量となるように再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンプル一染色粒子標識アビジン一抗ヒト HB s抗体（標識体）を得た。

〔ピオチンと第二標識物質の結合体の作製〕

実施例 C一 1と同様にして得られたスダンブル一染色キシレンジアミンスぺ一サ化粒子分散液 1 0mlにグルタルアルデヒド水溶液（ 0. 1 m gZm 1 ) 1 m

1を加え、室温にて 2時間反応させた後、実施例 C— 1と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％の分散液に調整した。この分散液 1 Omlに、ビォチン lmgを加え、 1 0°Cにて 24時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％となるように再分散させ、共有結合でビォチンを結合したスダンブルー染色粒子標識ピオチン（ピオチンと第二標識物質の結合体）を得た。

〔固定相の作製〕

実施例 C一 1と同様にしてニトロセルロースメンブランフィル夕一の一端に不織布（5 X 1 Omm) の滴下部を有し、抗ヒト H B s抗体を固定化した固定相を有する二ドロセルロースメンブランフィルター（免疫学的検査片）を得た。〔ヒト HB sの検出〕

ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検試料、標識体（固形分濃度 0. 2重量およびピオチンと第二標識物質の結合体（固形分濃度 0. 2重量 %) を混合し、この液 1 00 1を、前記免疫学的検査片の一端（滴下部）から滴下して展開し、 20分後の固定相の発色を観察した。結果を表 C一 3に示す。実施例 C一 4

実施例 C一 3と同様にして、スダンブルー染色粒子標識アビジンー抗ヒト HB s抗体（標識体）を得た。また、実施例 C一 3と同様にして、スダンブルー染色粒子標識ピオチン（ピオチンと第二標識物質の結合体）を得た。

〔固定相の作製〕

抗ヒト HB s抗体（ゥサギ I gG) を、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 4) にて希釈し、最終濃度 lmgZmlの水溶液を調製した。この水溶液をニトロセルロ一スメンブランフィルター（東洋濾紙、 5 x 1 00 mm) の一端から 2 cm 部位に 1 0〃 1塗布した後、直ちに 37°Cで 1時間静置した後、ニトロセルロースメンブランフィル夕一を取り出し、 0. 1 %ゥシ血清アルブミンおよび 0. 1 %Twe e n™20の水溶液に 1時間浸漬させた。

その後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出し、室温で 3時間風乾静置し、このニトロセルロースメンブランフィルタ一の一端に不織布（5 X 1 0 mm) の滴下部を有し、抗ヒト HB s抗体を固定化した固定相を有するニトロセルロースメンブランフィルター（免疫学的検査片）を得た。

〔標識相の作製〕

0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 4) に溶解したピオチンと第二標識物質の結合体（固形分濃度 0. 02%) を前記ニトロセルロースメンブランフィルタ一の固定相と滴下部の間 1. 5 cm部位に 1 0 1塗布した後、直ちに 37でで1時間静置し、標識相をさらに有する免疫学的検査片を得た。

〔ヒト HB sの検出〕

ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液と標識体溶液（固形分濃度 0. 2重量との混合液 1 00 / 1を、滴下部に滴下して展開させ、 20分後の固定相の発色を観察した。結果を表 C - 3に示す。表 C— 3

発色なし土：弱い発色 + :強い発色表 C一 3より、本発明の免疫学的方法によるヒト HB s抗原の検出感度は、約 0. 2 5 n gZm lであった。本発明の免疫学的方法は、比較例 C— 1の方法に比較して約 4 0倍感度が上昇することがわかる。実施例 C一 5

〔標識体の作製〕

実施例 C一 1と同様にして得られたスダンブル一染色キシレンジアミンスぺ一サ化粒子分散液 1 0m 1にグルタルアルデヒド水溶液（0. l mg/m l ) 1 m 1を加え、室温にて 2時間反応させた後、実施例 C - 1 と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％の分散液に調整した。得られた分散液 1 Om lに、ビォチン l mgと抗ヒト HB s抗体（ゥサギ I gG mg/m 1 ) 1 m 1 とを加え、 1 0°Cにて 24時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％となるように再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンブル —染色粒子標識ピオチン一抗ヒト HB s抗体（標識体）を得た。

〔ァビジンと第二標識物質の結合体の作製〕

実施例 C一 1と同様にして得られたスダンブルー染色キシレンジアミンスぺ一サ化粒子分散液 1 Om 1にグルタルアルデヒド水溶液（0. lmgZml) 1 m 1を加え、室温にて 2時間反応させた後、実施例 C一 1と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％の分散液に調整した。この分散液 1 Omlに、ァビジン lmgを加え、 1 0°Cにて 24時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度 1重量％となるように再分散させ、共有結合でアビジンを結合したスダンブルー染色粒子標識ァビジン（アビジンと第二標識物質の結合体）を得た。

〔固定相の作製〕

実施例 C一 1と同様にしてニトロセルロースメンブランフィルタ一の一端に不織布（5 X 1 Omm) の滴下部を有し、抗ヒト H B s抗体を固定化した固定相を有するニトロセルロースメンブランフィルター（免疫学的検査片）を得た。〔ヒト HB sの検出〕

ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検試料、標識体（固形分濃度 0. 2重量およびアビジンと第二標識物質の結合体（固形分濃度 0. 2重量 %) を混合し、この液 1 00 1を、前記免疫学的検査片の一端（滴下部）から滴下して展開し、 20分後の固定相の発色を観察した。結果を表 C一 4に示す。実施例 C— 6

実施例 C— 5と同様にして、スダンブルー染色粒子標識ピオチン—抗ヒト HB s抗体（標識体）を得た。また、実施例 C— 5と同様にして、スダンブルー染色粒子標識アビジン（アビジンと第二標識物質の結合体）を得た。

〔固定相の作製〕

抗ヒト HB s抗体（ゥサギ I gG) を、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH7. 4) にて希釈し、最終濃度 l mg/m lの水溶液を調製した。この水溶液をニトロセルロースメンブランフィルター（東洋濾紙、 5 X 1 0 0 mm) の一端から 2 cm 部位に 1 0 1塗布した後、直ちに 3 7°Cで 1時間静置した後、ニトロセル口一スメンブランフィルターを取り出し、 0. 1 %ゥシ血清アルブミンおよび 0. 1 %Twe e n™20の水溶液に 1時間浸漬させた。

その後、ニトロセルロースメンブランフィルタ一を取り出し、室温で 3時間風乾静置し、このニトロセルロースメンブランフィルタ一の一端に不織布（5 X 1 0 mm) の滴下部を有し、抗ヒト HB s抗体を固定化した固定相を有するニトロセルロースメンブランフィルター（免疫学的検査片）を得た。

〔標識相の作製〕

0. 1 Mリン酸緩衝液（pH7. 4) に溶解したアビジンと第二標識物質の結合体（固形分濃度 0. 02%) を前記ニトロセルロースメンブランフィルタ一の固定相と滴下部の間 1. 5 cm部位に 1 0 / 1塗布した後、直ちに 37でで1時間静置し、標識相をさらに有する免疫学的検査片を得た。

〔ヒト HB sの検出〕

ヒト HB s抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液と標識体溶液（固形分濃度 0. 2重量との混合液 1 0 0 1を、滴下部に滴下して展開させ、 20分後の固定相の発色を観察した。結果を表 C - 4に示す。

表 C— 4

表 C一 4より、本発明の免疫学的方法によるヒト HB s抗原の検出感度は、約 0. 25 n g/m lであった。本発明の免疫学的方法は、比較例 C— 1の方法に比較して約 4 0倍感度が上昇することがわかる。産業上の利用可能性

本発明により、迅速かつ簡便で、高感度な免疫学的検査方法およびそれに用いられるキットが提供される。

Claims

請求の範囲

1 . 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材を用いて該検査対象物を検出する免疫学的検査方法であって、

(1) 該検查対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）を含有する液と、

(2) 該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含有する液とを用いることを特徴とする免疫学的検査方法。

2 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1記載の免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端から、該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）を含有する液と被検液との混合物を吸収させて展開し、

(2) 該混合物中で形成される検査対象物と第一標識免疫化学的成分との免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後

(3) 該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含有する液を該吸水性基材に吸収させて展開し、該固定相上に捕捉された免疫複合体の第一標識免疫化学的成分に第二標識免疫化学的成分を結合させ、

(4) 該固定相上の標識物質を測定することにより該検査対象物を検出する。

3 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1記載の免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端から、被検液、該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）を含有する液および該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含有する液の混合物を吸収させて展開し、

(2) 該混合物中で形成される検査対象物、第一標識免疫化学的成分および第二標識免疫化学的成分からなる免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

(3) 該固定相上の標識物質を測定することにより該検査対象物を検出する。

4 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1記載の免疫学的検査方法：

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端と、該固定相との間の任意の領域に被検試料を吸収させるかまたは塗布し、

(2) 該吸水性基材の該一端から、該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）を含有する液を吸収させて展開し、

(3) 該吸水性基材上で形成される検出対象物と第一標識免疫化学的成分との免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

(4) 該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含有する液を該吸水性基材に吸収させて展開し、該固定相上に捕捉された免疫複合体の第一標識免疫化学的成分に第二標識免疫化学的成分を結合させ、

(5) 該固定相上の標識物質を測定することにより該検査対象物を検出する。

5 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1記載の免疫学的検査方法：

(2) 該吸水性基材の該一端から、該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）を含有する液および該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含有する液の混合物を吸収させて展開し、

(3) 該吸水性基材上で形成される検出対象物、第一標識免疫化学的成分および第二標識免疫化学的成分からなる免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

6 . 第一および第二標識免疫化学的成分中の標識物質が同一のものである請求項 1〜 5いずれか記載の方法。

7 . 該標識物質が着色されたラテックス粒子である請求項 1〜6いずれか記載の方法。

8 . 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材、該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）およぴ該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含むことを特徴とする免疫学的検査用キット。

9 . 第一および第二標識免疫化学的成分中の標識物質が同一のものである請求項 8記載のキット。

1 0 . 該標識物質が着色されたラテックス粒子である請求項 8または 9記載のャッ卜 o

1 1 . 請求項 2〜 7いずれか記載の免疫学的検査方法に使用される請求項 8〜 1 0いずれか記載のキット。

1 2 . 吸水性基材の表面上の任意の領域に設けた固定相に固定化された、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）とで、被検試料中の検査対象物をサンドィツチした免疫複合体を該固定相上に形成させて、固定相上の標識物質のシグナルを測定する免疫学的検査方法であつて、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）力、該介在物質を介して上記サンドイッチ型免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合した免疫複合体を形成させて標識物質のシグナルを増幅することを特徴とする方法。

1 3 . 該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体が水との接触によつて脱離し得る形態で保持される標識相が設けられ、且つ以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の方法：

(3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出^る。

1 4 . 該吸水性基材の一端と固定相との間に、第二標識体が水との接触によつて脱離し得る形態で保持される標識相が設けられ、且つ以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の方法：

1 5 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の免疫学的検査方法

1 6 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の免疫学的検査方法

(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出する <

1 7 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の免疫学的検査方法

1 8 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の免疫学的検査方法

(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端と該固定相との間の任意の領域に被検試料を供給し、 (2) 該吸水性基材の該一端から検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）を含有する液を展開し、該吸水性基材上で形成される検査対象物と第一標識体との免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、

(3) 第三およぴ第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含有する液を該吸水性基材に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に結合させ、

(5) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検査対象物を検出^る。

1 9 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の免疫学的検査方法

2 0 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の免疫学的検査方法

2 1 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の免疫学的検査方法

(3) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検查対象物を検出^る。

2 2 . 以下の工程を含むことを特徴とする請求項 1 2記載の免疫学的検査方法

(1 ) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相と、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）ならびに該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）が水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相とを、表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の、固定相と該固定相よりも標識相により近い方の一端との間の任意の領域に被検試料を供給し、

(4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検查対象物を検出する <

2 3 . 該吸水性基材の該一端と該固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相がさらに設けられていることを特徴とする請求項 1 2記載の免疫学的検査方法。

2 4 . 該吸水性基材が、固定相と該固定相よりも標識相により近い方の一端との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設けたものであることを特徴とする請求項 1 3〜1 6、 2 1および 2 2いずれか記載の免疫学的検査方法。

2 5 . 該分離相が、該吸水性基材の該一端と標識相との間の任意の領域に存在する請求項 2 4記載の免疫学的検査方法。

2 6 . 該介在物質が、抗原抗体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質である請求項 1 2〜2 5いずれか記載の免疫学的検査方法

2 7 . 該標識物質が着色されたラテックス粒子である請求項 1 2〜2 6いずれか記載の免疫学的検査方法。

2 8 . 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体）、該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識体（第二標識体）、ならびに第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物質を含む免疫学的検査キット。

2 9 . 該吸水性基材が、その一端と固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設けたものであることを特徴とする請求項 2 8記載のキット。

3 0 . 該吸水性基材の一端と固定相との間に、第一および第二標識体の少なくとも 1つが、水との接触によって脱離し得る形態で保持される標識相が設けられていることを特徴とする請求項 2 8記載のキット。

3 1 . 該吸水性基材が、固定相と該固定相よりも標識相により近い方の一端との間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の該一端と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設けたものであることを特徵とする請求項 3 0記載のキット。

3 2 . 該分離相が、該吸水性基材の該一端と標識相との間の任意の領域に存在する請求項 3 1記載のキット。

3 3 . 該介在物質が抗原抗体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質である請求項 2 8〜3 2いずれか記載のキット。

3 4 . 該標識物質が着色されたラテックス粒子である請求項 2 8〜3 3いずれか記載のキット。

3 5 . 請求項 1 2〜2 7いずれか記載の免疫学的検査方法に使用される請求項

2 8〜3 4いずれか記載のキット。

3 6 . 検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化した固定相で、該第一の免疫化学的成分および、該検査対象物と結合しうる第二の免疫化学的成分を標識物質に結合してなる標識体により該検査対象物を挟み込むサンドイッチ型免疫学的測定方法において、ピオチンとアビジンの結合を介して複合体を形成して検査対象物を検出することを特徴とする免疫学的測定方法。'

3 7 . 該標識物質にさらにピオチンが結合しており、該ビォチンと結合するァビジンを介して複合体を形成し、該複合体中の標識物質により検査対象物を検出することを特徴とする請求項 3 6記載の免疫学的測定方法。

3 8 . アビジンが、吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持されている、請求項 3 7記載の免疫学的測定方法。

3 9 . 該標識体として第二の免疫化学的成分、第一標識物質およびアビジンからなる結合体を用い、これにさらにピオチンと第二標識物質の結合体を反応させて、該ァビジンと該ビォチンとの結合を介した複合体を形成し、該複合体中の第一および第二標識物質により検査対象物を検出することを特徴とする請求項 3 6 記載の免疫学的測定方法。

4 0 . 該ビォチンと第二標識物質の結合体が、吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持されている、請求項

3 9記載の免疫学的測定方法。

4 1 . 該標識体として第二の免疫化学的成分、第一標識物質およびピオチンからなる結合体を用い、これにさらにアビジンと第二標識物質の結合体を反応させて、該ビォチンと該ァビジンとの結合を介した複合体を形成し、該複合体中の第一および第二標識物質により検査対象物を検出することを特徴とする請求項 3 6 記載の免疫学的測定方法。

4 2 . 該ァビジンと第二標識物質の結合体が、吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持されている、請求項 4 1記載の免疫学的測定方法。

4 3 . 検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化した固定相を有する免疫学的検査片、該検査対象物と結合しうる第二の免疫化学的成分およびビォチンを標識物質に結合してなる標識体ならびにァビジンを含有してなる免疫学的測定キット。

4 4 . アビジンが、免疫学的検査片の吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持されている、請求項 4 3記載の免疫学的測定キット。

4 5 . 検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化した固定相を有する免疫学的検査片、該検査対象物と結合しうる第二の免疫化学的成分およびァビジンを第一標識物質に結合してなる標識体、ならびにビォチンと第二標識物質の結合体を含有してなる免疫学的測定キット。

4 6 . 該ビォチンと第二標識物質の結合体が、免疫学的検査片の吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によつて脱離しうる状態で保持されている、請求項 4 5記載の免疫学的測定キット。

4 7 . 検査対象物と結合しうる第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化した固定相を有する免疫学的検査片、該検査対象物と結合しうる第二の免疫化学的成分およびピオチンを第一標識物質に結合してなる標識体、ならびにアビジンと第二標識物質の結合体を含有してなる免疫学的測定キット。

4 8 . 該ァビジンと第二標識物質の結合体が、免疫学的検査片の吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に水との接触によって脱離しうる状態で保持されている、請求項 4 7記載の免疫学的測定キット。