WO2000073435A1

WO2000073435A1 - Gene 441 associe a la pollinose

Info

Publication number: WO2000073435A1
Application number: PCT/JP2000/003190
Authority: WO
Inventors: Takeshi Nagasu; Yuji Sugita; Tomoko Fujishima; Tadahiro Oshida; Masaya Obayashi; Shigemichi Gunji; Izumi Obayashi; Yukiho Imai; Nei Yoshida; Kaoru Ogawa; Keiko Matsui
Original assignee: Genox Research Inc
Current assignee: Genox Research Inc
Priority date: 1999-05-27
Filing date: 2000-05-18
Publication date: 2000-12-07
Anticipated expiration: 2001-11-27

Description

明細書花粉症関連遺伝子、 441 技術分野

本発明は、抗原刺激応答に関連する遺伝子、並びに該遺伝子の発現を指標としたアレルギー疾患の検査方法および T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。

背景技術

花粉症を含むアレルギ一疾患は多因子性の病気 (multifactorial diseases)と考えられている。これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難である。

またアレルギー疾患の発症には、抗原刺激に対する応答として発現する遺伝子の変異や欠陥、あるいは過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、抗原や薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。

近年の遺伝子発現の解析技術の発達により、多くの臨床試料で、遺伝子の発現を解析 '比較することが可能となった。このような方法としては、ディファレンシャルディスプレイ（DD)法が有用である。ディファレンシャルディスプレイ法は、ライアンおよびパディ一（Liang and Pardee)によって 1992 年に最初に開発された（Science, 1992, 257:967-971)。この方法を用いることによって、 1回に数十種類以上のサンプルをスクリーニングすることができ、それらのサンプル中で発現が変化した遺伝子を検出することが可能である。このような方法を用いて、変異が生じた遺伝子や、時間や環境とともに発現が変わるような遺伝子を調べることによって、病因遺伝子の解明のために重要な情報がもたらされることが期待される。これらの遺伝子には、環境要因によって発現に影響を受けるような遺伝子も含まれる。

花粉症等のアレルギー疾患は、近年多くの人に見られる疾患の一つである。花粉症の病因には、環境要因の一つである花粉によって発現が影響を受ける複数の遺伝子が関わっていると考えられる。このような事情から、花粉症をはじめとするアレルギー疾患に関連する遺伝子を単離することが望まれていた。発明の開示

本発明は、アレルギー疾患に関連する遺伝子を提供することを課題とする。さらに、本発明は該遺伝子の発現を指標とした、アレルギー疾患の検査方法および T 細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、既に確立された「蛍光 DD (F l uorescent DD)法」（T. I toら， 199 4, FEBS Le t t . 351 : 231-236) の手順に基づき、複数のヒトの血液から調製した T細胞 RNAサンプルを解析できる DDシステムを新たに開発した。このシステムを用いて、本発明者らは花粉症患者を含む複数の被験者について、花粉飛散の前後の血液から T細胞を採取し、スギ花粉特異的 IgE値の異なる被験者間や花粉飛散前後で発現量が変化する遺伝子のスクリーニングを行い、新規遺伝子（「441」遺伝子）を単離した。

本発明者らは、花粉飛散前後に被験者から分離したリンパ球で、単離した「44 1J遺伝子の発現量を比較解析した結果、該遺伝子がスギ花粉飛散後において有意に低値を示すことを見出した。このため、本発明者らは、該遺伝子の発現量を指標として、アレルギー疾患の検査、および T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能であることを見出した。

すなわち本発明は、花粉飛散後に低値を示す遺伝子、および該遺伝子の発現を指標としたァレルギ一疾患の検査方法、および T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。より具体的には、

〔1〕配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸分子。

〔2〕配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸分子。

〔3〕〔1〕または〔2〕に記載の核酸分子に特異的にハイブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する DNA。

〔4〕〔3〕に記載の DNAを用いることを特徴とする、〔1〕に記載の核酸分子の検出方法。

〔5〕アレルギー疾患の検査方法であって、

( a ) 被験者から T細胞を調製する工程、

( b ) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

( C ) 該 RNA試料に対して、標識した〔3〕に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダイゼーシヨンを行う工程、

( d ) 標識した〔3〕に記載の DNAにハイブリダィズする被験者由来の RNA量を測定し、対照（健常者の場合）と比較する工程、を含む方法。

〔6〕アレルギー疾患の検査方法であって、

( a ) 被験者から T細胞を調製する工程、

( b ) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

( c ) 該 RNA試料に対して逆転写反応を行い cDNAを合成する工程、

( d ) 該 cDNAを铸型に、〔3〕に記載の DNAをプライマーとして、ポリメラ一ゼ連鎖反応（PCR) を行う工程、

( e ) ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された DNA量を、対照（健常者の場合）と比較する工程、を含む方法。〔7〕ポリメラーゼ連鎖反応を PCR増幅モニター法により行う、〔6〕に記載の方法。

〔8〕 T細胞が被験者の末梢血から調製される、〔5〕から〔7〕のいずれかに記載の方法。

〔9〕アレルギー疾患がスギ花粉症である、〔5〕から〔8〕のいずれかに記載の方法。

〔10〕 T 細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) モデル動物に被検化合物の投与および花粉抗原による刺激を行う工程

(b) 該モデル動物から T細胞を調製する工程、

(c) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(d) 該 RNA試料に対して、標識した〔3〕に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダイゼーシヨンを行う工程、

(e) 標識した〔3〕に記載の DNAにハイブリダィズする該 T細胞由来の RNA 量を測定する工程、

(f) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（e) において測定される RNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

〔1 1〕 T 細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) モデル動物に被検化合物の投与および花粉抗原による刺激を行う工程、

(b) 該モデル動物から T細胞を調製する工程、

(c) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(d) 該 RNA試料に対して逆転写反応を行い cDNAを合成する工程、

(e) 該 cDNAを铸型に、〔3〕に記載の DNAをプライマ一として、ポリメラ一ゼ連鎖反応（KR) を行う工程、

(f ) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（e) において増幅される DM量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

〔12〕 T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) 被検化合物をモデル動物に投与する工程、

(b) 該モデル動物からリンパ球を調製する工程、

(c) 該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、

( d ) 該抗原刺激を受けたリンパ球から T細胞を分離する工程、

(e) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

( f ) 該 RNA試料に対して、標識した〔3〕に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダイゼ一シヨンを行う工程、

(g) 標識した〔3〕に記載の DNAにハイブリダィズする該 T細胞由来の RNA 量を測定する工程、

(h) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（g) において測定される RNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

〔13〕 T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) 被検化合物をモデル動物に投与する工程、

(b) 該モデル動物からリンパ球を調製する工程、

(c) 該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、

(d) 該抗原刺激を受けたリンパ球から T細胞を分離する工程、

(e) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(f ) 該 RNA試料に対して逆転写反応を行い cDNAを合成する工程、

(g) 該 cDNAを铸型に、〔3〕に記載の DNAをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) を行う工程、

(h) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（g) において増幅される DNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。〔14〕 T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) モデル動物またはヒトカらリンパ球を調製する工程、

(b) 被検化合物の存在下、該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、

( c ) 該抗原刺激を受けたリンパ球から T細胞を分離する工程、

(d) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(e) 該 RNA試料に対して、標識した〔3〕に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダイゼーシヨンを行う工程、

( f ) 標識した〔3〕に記載の DNAにハイブリダィズする該 T細胞由来の RNA 量を測定する工程、

(g) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（f) において測定される RNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

〔15〕 T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) モデル動物またはヒトカ ^らリンパ球を調製する工程、

(d) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(e) 該 RNA試料に対して逆転写反応を行い cDNAを合成する工程、

( f ) 該 cDNAを铸型に、〔3〕に記載の DNAをプライマーとして、ポリメラ一ゼ連鎖反応（PCR) を行う工程、

(g) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（ί) において増幅される DNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

〔16〕 Τ細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) 被検化合物の存在下、株化 T細胞をリンパ球刺激物質で刺激する工程、 (b) 該刺激を受けた株化 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(c) 該 RNA試料に対して、標識した〔3〕に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダイゼーシヨンを行う工程、

(d) 標識した〔3〕に記載の DNAにハイブリダィズする該株化 T細胞由来の RNA量を測定する工程、

(e) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（d) において測定される RNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

〔1 7〕 T 細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) 被検化合物の存在下、株化 T細胞をリンパ球刺激物質で刺激する工程、

( b ) 該刺激を受けた株化 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(d) 該 cDNAを铸型に、〔3〕に記載の DNAをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) を行う工程、

(e) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（d) において増幅される DNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

〔1 8〕 T 細胞が、モデル動物の末梢血から調製される、〔1 0〕または〔1 1〕に記載の方法。

〔19〕リンパ球が末梢血から調製される、〔12〕から〔1 5〕のいずれかに記載の方法。

〔20〕抗原がスギ花粉抗原である、〔10〕から〔19〕のいずれかに記載の方法。

に関する。

本発明において、アレルギー疾患（allergic desease)とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって T細胞が免疫応答を示すことを意味する。代表的なアレルギ一疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（a l l ergi c d i athes i s)とは、アレルギー疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。

なお、本発明における「核酸分子」には、 DNAおよび RNAが含まれる。

【発明の実施の形態】

本発明は、スギ花粉抗原に対するリンパ球の応答に相関する新規な遺伝子「44 1」に関する。本発明者らにより見出された「441」 cDNAの塩基配列を配列番号： 1に示す。

本発明者らにより単離された「441」 cDNAの塩基配列は、「441」 cDNAの部分配列であるが、当業者においては、配列番号： 1に記載の「441」 cDNA の配列情報を基に、「441」の全長 cDNAを単離することは、通常行いうる。即ち、「441」由来の配列をプローブとして T細胞 cDNA ライブラリ一などをハイブリダィゼーションによってスクリーニングする方法や、「441」由来の配列をプライマ一として用い、 T細胞 cDNAライブラリ一などの DNAを铸型として、プライマーに特異的なサィズの増幅産物が得られることを指標としてライブラリーをスクリーニングして cDNAの全長を取得する方法がある。また、「441」由来の配列をプライマーとして用い、 T細胞などの mRNAを一本鎖 cDNAに変換し、末端にオリゴマーを付加してから PCRを行う RACE法（Frohman, M. A. et al .： Pro Nat l . Acad. Sc i . USA,

85 : 8992, 1988) によって「441」の配列を延長する方法がある。

本発明における「配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸分子」には、このように配列番号： 1に記載の「441」 cDNA の配列情報を基に単離しうる、「441」の全長 cDNAが含まれる。 5

「441」は、被験者のリンパ球において、花粉抗原曝露後の方が曝露前よりも統計学的に有意に低い発現を示した。従って、「441」の遺伝子の発現（mRNAへの転写およびタンパク質への翻訳を含む）を指標に、アレルギー疾患の検査、および T 細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能であると考えられる。「441」の発現低下は花粉等の抗原刺激に対する T細胞の応答を示しているので、アレルギー疾患の既往のある患者において、「441」の発現を指標としてその患者の特定抗原被曝に対する応答の推移をモニタ一することは、病気の状態の把握や治療への反応の検査に役立つ。

本発明において検査 ·治療の対象となるアレルギー疾患としては、特にスギ花粉症が好ましい。

本発明におけるアレルギー疾患の検査における「441」の遺伝子の発現の検出は、「441」遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダィズする DNAをプライマ一とした遺伝子増幅技術を利用して行うことが可能である。

本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーとしては、「441」遺伝子に特異的にハイブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する核酸分子が用いられる。ここで「特異的にハイブリダィズする」とは、通常のハイプリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイプリダイゼーシヨン条件下で、他の遺伝子をコードする DNAおよび Zまたは RNAとクロスハイブリダィゼ一シヨンが有意に生じないことを指す。たとえば、 Express Hybr i d i zat i on Solut i on (CL0NTECH社製）中でプローブと転写膜を 68ででハイブリダィゼ一ションし、最終的に 0. I X SS 0. 05 % SDS溶液にて、 50でで洗浄することにより、ストリンジェン卜な条件とすることができる。

本発明の検査に用いるこれら核酸分子は合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダィゼーシヨンに用いるプローブ DNAは、通常、標識したものが用いられる。標識としては、例えば、 DNA ポリメラーゼ Iを用いるニックトランスレ一シヨンによる標識、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識、クレノ一フラグメントによるフィルイン末端標識（Berger SL， Kimmel AR. (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Method in Enzymology, Academic P ress ; Hames BD, Higgins SJ (1985) Genes Probes： A Practical Approach. IR L Press ; Sambrook J， Fri tsch EF， Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press),廳ポリメラーゼを用いる転写による標識（Melton DA, Krieg, PA, Rebagkiati MR, Ma niatis T， Zinn K， Green MR. (1984) Nucleic Acid Res. , 12， 7035- 7056)、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドを DNAに取り込ませる方法（Kricka LJ. (1 992) Nonisotopic DNA Probing Techniques. Academic Press)等が挙けられる。ハイブリダィゼーシヨン技術を利用したアレルギー疾患の検査は、例えば、ノ —ザンハイブリダィゼ一シヨン法、ドットブロット法、 DNA マイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。

一方、遺伝子増幅技術を利用した方法としては、例えば、 RT - PCR法を用いることができる。 RT-PCR法においては、遺伝子の増幅過程において実施例 8に示すように PCR増幅モニター法を用いれば、「441」遺伝子の発現のより正確な定量を行うことができる。

PCR遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合う異なつた蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（DNAもしくは RNAの逆転写産物）にハイプリダイズさせる。 PCR反応が進んで Taqポリメラーゼの 5' -3'ェクソヌクレア一ゼ（exonuclease)活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、 PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Holland, P.M. et aし， 1991， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:72 76-7280; Livak, K. J. et al. , 1995, PCR Methods and Applications 4(6) :35 7-362 ; He i d, C. A. e t al . , Genome Research 6 : 986—994 ; Gi bson, E. M. U. e t al . , 1996, Genome Research 6 : 995 - 1001 )。 PCR 増幅モニター法においては、例えば、 ABI PRISM7700 (パーキンエルマ一社）を用いることができる。

また、本発明のアレルギー疾患の検査は、「441」によりコードされるタンパク質を検出することにより行うことも考えられる。このような検査方法としては、例えば、「441」によりコードされるタンパク質に結合する抗体を利用したウェス夕ンブロッテイング法、免疫沈降法、 EU SA法などを利用することができる。本発明の「441」によりコードされるタンパク質の抗体は、当業者に周知の技法を用いて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる (Mi l s t ei n C， et al . , 1983, Nature 305 (5934)： 537 - 40)。抗原に用いるタンパク質もしくはその部分ペプチドは、例えば「441」遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させ、発現させた組み換え夕ンパク質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。本発明におけるアレルギー疾患の検査の結果、本発明の遺伝子の発現が有意に低ければ、被験者はスギ花粉抗原のようなアレルゲンに対する免疫応答を生じた状態にあると判定することができる。花粉特異的抗体価や、症状などと併せて、本発明の遺伝子の発現レベルの測定を、アレルギー疾患の検査に用いることが可能である。

T細胞に発現する「441」遺伝子は花粉抗原曝露後に発現が低下している。「44 1」遺伝子はスギ花粉抗原刺激に対する生体の応答として発現量の減少する遺伝子であり、「441」遺伝子の発現をモニターすることによって花粉症治療薬のスクリ —ニングを行うことができる。「441」遺伝子は健常者、花粉症患者を問わず花粉抗原曝露により発現量が減少する。花粉症症状の有無は、抗原刺激に対する「44 1」遺伝子の応答以降の違いによるものと推測される。しかしこのようなケースでも「441」遺伝子の発現低下は T細胞の応答性の亢進に対応しており、従って「4 41」遺伝子の発現をモニタ一することによってアレルギー疾患治療薬のスクリーニングを行うことはできる。

本発明の T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリーニング方法は、 in vivoで行なうことも in vi troで行なうこともできる。 in vivoでのスクリーニングにおいては、例えば、マウス等のモデル動物に、候補薬剤の投与および花粉抗原での刺激を行った後、末梢血より T細胞を分離し、「441」の転写産物を測定する。あるいは、マウス等のモデル動物に候補薬剤を投与した後、末梢血よりリンパ球を分離し、該リンパ球をスギ花粉抗原等で in vi t roで刺激する。該刺激後のリンパ球から T細胞を分離し、その「441」遺伝子の転写産物を測定する。これら測定の結果、対照（候補薬剤を投与しない場合）と比べて「441」遺伝子の転写量の低下を抑制する化合物を選択する。ここで花粉抗原による刺激は、 T 細胞において抗原特異的なアレルギー反応を惹起し、それに対する候補化合物の治療効果を判定することを目的として行うものである。なお本発明において、「4 41」遺伝子の転写量の低下を抑制するとは、抗原刺激を受けた T細胞と比較したときに、候補化合物との接触によってより高い水準の転写量が維持される場合を言う。したがって、候補化合物が抗原刺激を受ける前の「441」遺伝子の転写量を越える水準を誘導する場合（すなわち転写が増大するケース）、その化合物は本発明におけるスクリーニング方法において選択すべき化合物である。

また、 in vi t roでのスクリーニングにおいては、例えば、ヒトゃマウス等から末梢血リンパ球を採取し、スギ花粉抗原などで、該末梢血リンパ球を in vi t ro で刺激する。 in vi tro刺激の際に候補化合物を添加する。その後、刺激された末梢血リンパ球から T細胞を分離し、「441」の転写産物を測定する。この測定の結果、対照（候補薬剤を接触させない場合）と比べて「441」遺伝子の転写量の低下を抑制する化合物を選択する。

また、本発明の T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリーニングは、株化 T細胞を用いて行なうこともできる。例えば、 Mo l t4細胞、 Jurka t細胞などの株化 T細胞をリンパ球刺激物質で in vi t roで刺激する。リンパ球刺激物質としては、例えば、カルシウムィオノフォア（A23187)、 PMA、フイトへマグルチニン（PHA) などが挙げられる。 in vi t ro刺激の際に候補薬剤を添加する。その後、該株化 T細胞における「441」遺伝子の転写量を測定する。この測定の結果、対照（候補薬剤を接触させない場合）と比べて「441」遺伝子の転写量の低下を抑制する化合物を選択する。

本発明による T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリー二ングにおける「441」の遺伝子の発現の検出は、本発明のアレルギー疾患の検査と同様、「441」遺伝子にハイブリダィズする核酸をプローブとしたハイブリダィゼーシヨン技術、または本発明の遺伝子にハイブリダィズする DNAをプライマーとした遺伝子増幅技術を利用して行うことが可能である。

ハイブリダィゼ一シヨン技術を利用した方法としては、例えば、ノーザンハイブリダィゼ一シヨン法、ドットブロット法、 DNA マイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。一方、遺伝子増幅技術を利用した方法としては、 RT - PCR法を用いることができる。 RT- PCR法においては、遺伝子の増幅過程において実施例 8に示すような PCR増幅モニタ一法を用いれば、「441」遺伝子の発現のより正確な定量を行うことができる。

これらスクリーニングに用いる被検化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリァルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動 ·植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。本発明の T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリーニング方法により単離される化合物は、免疫応答を抑制する薬剤の候補になる。

本発明のスクリーニング方法により単離される化合物を、医薬品として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることが可能である。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）とともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。図面の簡単な説明

図 1は、血液を採取した被験者 10人、計 18の血液試料におけるスギ花粉特異的 IgE抗体の抗体価を表す図である。被験者 A〜：！（試料番号 1〜18) の各血液試料のスギ花粉特異的 IgE抗体の値を AU/mlで表した。花粉飛散前を左（白いカラム）、飛散後を右（黒いカラム）に対で表した。被験者 Aおよび Bは、花粉飛散後の血液のみ採取した。

図 2は、スギ花粉飛散時期前後によって群分けした場合の飛散前群および飛散後群における「441」の発現変化を示す図である。エラーバーは標準偏差を表す。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[実施例 1 ] 10人の成人ボランティアからの血液採取

花粉飛散前後の T細胞を採取するため、成人ポランティア 10名（A〜； I)から 10 mlの血液サンプルを、花粉飛散前および花粉飛散後に採取した。最初の血液サンプルは、日本のスギ花粉飛散の季節の前（1997年 1月および 2月）に採取し、 2回目は日本のスギ花粉飛散後（1997年 3、 4および 5月）に採取した。ボランティアのうち 8人については、 2つの時期のサンプルを得た。残る 2名のポランティアに関しては、花粉飛散後のサンプルのみ入手できた。これらの血液サンプルの一部を用いて、スギ花粉特異的 IgEの量を測定した。特異的 IgEの測定はペーパーディスクを固相とする RAST法（radi o al l ergo sorbent tes t, Wide, L. e t， al .： Lancet 2: 1105-1107, 1967) を改良した CAP RAST法（Pharmacia社）により行つた。 Pharmacia社製の標準の抗体価を含む血清を用いて、それを基準にしてそれぞれの検体の IgE抗体価（単位は Pharmacia RAST Unit, PRU、あるいは AU (a rbitrary unit) とも表示する）を決定した。

測定された各被験者における花粉飛散前後でのスギ花粉特異的 IgE値を図 1に示す。図に示されるように、 10人の被験者の大半で、花粉被曝後にスギ花粉特異的 IgEの血清中の濃度が増加した。アトピー素因を有するかどうかは、スギ花粉特異的 IgEの CAP RAST試験の値が 2より大きいかどうかで判断した。すなわち、被験者 A〜Gおよび Iの 8人の被験者をアトピー素因群（以後「患者」とも記す）、被験者 H、〗の 2人を健常者（以後「正常群」とも記す）とした。 8人のアトピー素因を有する被験者のうち 7人が、花粉飛散後にアレルギー性鼻炎の症状を示した。 '

[実施例 2 ] 血液試料からのリンパ球画分の調製

血液 10 mlから T細胞を調製する場合は、以下のようにした。まずノポ社製等のへパリン 1 mlで注射筒壁を万遍なく処理し、最終濃度 50 unit/mlのへパリンを含む 10 ml注射筒に採血した。このとき一人の採血に 22G針を 2本準備した。注射針をはずし、 50 mlの遠心チューブ（ポリプロピレン製）に移した。 1500 rp m、室温で 5分間遠心し、できるだけ表面近くから 1.1 ml を採取し、 15000 rpm で 5分間、 4でで遠心して上清 1 mlを血漿 (plasma)として回収した。血漿を回収した残りに 3%のデキストラン（ナカライ社製）を含む 0.9% NaClを等量（9 ml) 加え、静かに数回転倒させて混和した。その後 30分間室温で静置した。 PRP(Pla telet rich plasma，血小板に富む血漿）を別の 15 ml遠心チューブに移し、 1200 rpm (トミー社製の遠心機で 150Xgに相当する）で 5分間、室温で遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細胞をギブコ社等から入手した Ca、 Mg 不含の HBSS 5 mlに懸濁した。これを、パスツールピぺットを用いて Ficol Paqu e (フアルマシア社製）が 5 mlが入ったチューブ（ファルコンチューブ： 2006または 2059；ポリプロピレン製） 1本に上層した。 1200 rpmで 5分間遠心後、 1500 rpm (Tomy社製の遠心機で 400Xgに相当する）で 30分間室温で遠心した。その結果、顆粒細胞（granulocyte)、赤血球（erythrocyte)が沈殿し、フイコール層を挟んで中間層にリンパ球（lymphocyte)、単球 (monocyte)、血小板（platelet)が含まれた。パスツールピペットで中間層を回収し、 2〜3倍の容量の BSA/PBS(0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH7.2；使用直前に脱気した）を添加し、 1200 rpm, 4でで 5分間遠心した。沈殿を回収し、 BSA/PBSで 2回洗浄した。 2回目の洗浄後、細胞を 5 mlに懸濁し、その一部をトリパンブルーで 2倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約 IX 10⁷であった。これをリンパ球画分とした。

[実施例 3] リンパ球画分からの T細胞の分離

実施例 2で得たリンパ球画分を 1200 ι·ριηで 4で、 5分間遠心し、 100^1あたり 10⁸になるように BSA/PBSに懸濁した。容量は約 20 1になった。これをエツペンドルフチューブ（1.5 ml) に移し、 CD3マイクロビーズ液を添加した。その後、 3 0分間 4〜10 に放置した（このとき氷上には置かなかった）。この試料をマグネチックセルソー夕一（MACS) (Miltenyi Biotech Inc.製）で以下のように処理した。

MS+/RS+カラムを Mini MACSまたは Vario MACSセパレ一シヨンュニッ卜に装着した（針は付けなかった）。 500 1 の BSA/PBSをカラムに静かにアプライし、バッファーは流し出した。次に CD3マイクロビーズ標識した細胞をカラムにァプラィした。カラムを 500 1で 3回洗浄した（B細胞画分）。カラムをセパレーションュニッ卜からはずし、溶出液を集めるチューブ上に置いた。 1 mlの BSA/PBSをカラムにアプライし、カラム添付のプランジャーを用いポジティブ細胞を急速に流し出した。これを T細胞画分とした。

得られた T細胞画分について、 1200 rpm、 5分間 4でで遠心した。沈殿を BSA/P BSで 2回洗浄した。 2回目の洗浄後、細胞を 1 mlに懸濁し、その一部をトリパンブルーで 2倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約 4X10⁶であった。

[実施例 4 ] T細胞からの全 RNAの調製 T細胞からの全 RNAの調製は RNeasy Mini (Qi agen製）を用い、原則として添付のマニュアルに従い行った。操作はすべて手袋を着用して、室温で行った。またゥォッシュバッファ一 RPEに 4倍量のエタノールを加えた。リシスバッファー R LTには 10 w 1/mlの 2-メルカプトエタノールを加えた。細胞浮遊液を 1000〜1200 rpmで 5分間遠心し、上清をァスピレ一シヨンで除いた。沈殿に 350 1のリシスバッファー RLT (2-メルカプトエタノールを含む）溶液を加えた。この段階で、 R LT バッファ一中の細胞のライセートは、 _70°Cで保存可能であった。細胞のライセ一トを冷凍保存していた場合は、 37でで 10〜15分間ィンキュベー卜して、不溶物が見えるようなら最大速度で 3分間遠心し、上清のみを回収した。このライセ —トを 20Gの力テラン針を付けた注射筒でホモゲナイズ後、キアシュレッダー（Q IAshredder)で処理した。（即ち、通常の細胞のライセートをキアシュレツダ一ュニットにピぺットマンを用いてアプライした。これを 1500 i"pmで 2分間遠心し、流出液を回収した。） 350 1の 70%エタノールを加え、ピペッティングしてよく混ぜた。 RNeasyスピンカラムを添付の 2 ml チューブに装着し、細胞のライセート混合物をアプライし、 8000 X g(11500 rpm)で 1分間遠心し、流出液は捨てた。ゥォッシュバッファ一 RW1 700 ^ 1をカラムにアプライし、 5分間フタをした形で立てた。 11500 n>mで 15秒間遠心し、流出液は捨てた。カラムを新しい 2 ml チューブに装着し、ゥォッシュバッファ一 RPE (エタノールを含む） 500 1 をカラムにアプライした後、 11500 rpmで 15秒間遠心し、流出液は捨てた。ゥォッシュバッファー RPE 500 1をカラムにアプライし、最大速度で 2分間遠心した。カラムを新しい 1. 5 mlチューブに装着し、 DEPC処理した水をアプライし、フタをして 10分間立てた。 11500 rpmで 10分間遠心し、全 RNAを得た。濃度を測定し、量が少ないようなら、再度カラムを新しい 1. 5 mlチューブに装着し、 D EPC処理した水 30 をアプライし、フタをして 10分間立て、 11500 rpmで 10 分間遠心した。

[実施例 5 ] 全 RNAの DNas e処理 T細胞から調製した全 RNAから DNAを除くため、 DNase処理を行った。反応は 2 ユニットの DNase (二ツボンジーン社）および 50ユニットの RNaseインヒビター

(フアルマシア社）を含む 100 1の lXDNaseバッファー（二ツボンジーン社）中で行った。これを 37°C15分間インキュベートした後、等量の PCI (フエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール = 25:24:1)を加え、ボルテックスした。 12 000 i"pmで室温、 10分間遠心し、上層（水層）を新しい 1.5 mlチューブに移した。 1/10量の 3M酢酸ナトリウム（pH 5, 2)を加え、 2.5倍量の 100%エタノールおよびエタ沈メイト 1 1を加えて、転倒混和させた。 -20でで 15分間静置させた後、 1 2000 卬 mで 4°C、 15分間遠心し、上清を除去し、 70%エタノールを加えた。沈殿がはがれる程度にタッピングした後、上清をきれいに除去した。 3分間乾燥させ、 10〜20 zl の DDW (DNaseおよび RNase不含）に溶解させた。濃度を測定し、使用まで- 80でに保存した。

[実施例 6] T細胞から調製した全 RNAを用いたディファレンシャルディスプレイ（DD) 解析

T細胞から調製した全 RNAを用いた蛍光ディファレンシャルディスプレイ（F1 uorescent Differential Display, 「DD」と略記する）解析は文献（T. Itoら， 19 94， FEBS Lett. 351: 231-236) に記載の方法に準じて行った。 T細胞から調製した全 RNAを逆転写し、 cDNAを得た。第一次 DD-PCR反応用には 3種のアンカープライマーの各々について全 RNAの各 0.2jtigを用いて cDNAを調製した。第二次 DD - PCR反応用には、 3種のアンカ一プライマ一の各々について RNA 0.4 gを用いて cDNAを調製した。いずれの cDNAも、 0.4ng//_il RNA相当の最終濃度に希釈し、実験に用いた。 1反応あたり 1 ng RNA相当の cDNAを用いて DD-PCR反応を行った。反応液の組成は表 1の通りである。

表 1 cDNA(0.4ng/ zl RNA相当） 2.5μ1 任意プライマー（2 \0 2.5 zl

lOXAmpliTaq PCRバッファ一 1.0 1

2.5mM dNTP 0.8^ 1

50^M アンカ一プライマー 0.1 1

(GT15A, GT15C, GT15G)

Gene Taq (5U/ 1) 0.05/ 1

Am liTaq (5U/ 1) 0.05 / 1

dH₂0 3.0 z 1

10.0 z

PCRの反応条件は、「95で3分、 40で5分、 72 5分」を 1サイクル、続いて、「9 Π5秒、 40で2分、 72で 1分」を 30サイクルの後、 72で 5分、その後連続的に 4でにした。使用したプライマ一対はアンカ一プライマ一である GT15A (配列番号： 2)、 GT15C (配列番号： 3)、および GT15G (配列番号： 4) に対して任意プライマーをそれぞれ AG 1〜110、 AG 111〜199、および AG 200〜287を組み合わせ、計 287組の反応をおこなった。なお、任意プライマーとしては GC含量 50%の 10ヌクレオチドからなるオリゴマーを設計し、合成して用いた。

ゲル電気泳動は、 6%変性ポリアクリルアミドゲルを作製し、 2.5 1 の試料をアプライし、 40Wで 210分間泳動した。その後、日立製蛍光イメージアナライザ -FMBI0 IIを用いてゲル板をスキャンし、蛍光検出によって泳動画像を得た。

[実施例 7 ] D D解析で切り出したバンドの増幅と配列決定

多数の任意プライマーを用いて 2回の DD解析を行った。花粉飛散前後または患者と健常者のグループの間で差のあるバンドを選択し、 2回の実験で再現性のあるバンドをゲルから切り出した。

切り出したバンドの 1つ（「441」と称する）についてさらに解析を進めた。「4 41」のバンドはアンカ一プライマーとして GT15A (配列番号： 2 ) を、任意ブライマ一として AG54 (CCTCTTAGTCZ配列番号： 5 ) を用いた D D解析によって見出された。

「441」の塩基配列を決定するために、「441」のバンドを含むゲルを切り出し、 TE溶液に保存し 60で、 10分加温して DNAをゲルから溶出させた。この TE溶液を铸型として DD-PCRと同条件で PCRを行い、約 250bpの DNA断片を増幅した。アンカープライマ一として、 GT15Aを、任意プライマーとして AG54を用いた。増幅した DNA断片をプラスミドベクター pCR2. 1 (Invi t rogen社）にてクローニングし、約 250bpの DNA断片を保持するプラスミド p44卜 13を得た。プラスミド DNAを用いて常法に従い DNA断片の塩基配列を決定した。「441」塩基配列を配列番号： 1に示す

[実施例 8 ] ABI-7700による定量

ABI- PRISM7700を用いた TaqMan法により、「441」の発現量の定量を行った。この方法は PCR増幅された DNA鎖を蛍光色素を用いてリアルタイムに定量検出するシステムである。定量のために新たに 1998年春にスギ花粉飛散前'後の血液試料を 22名のポランティアから採取し、 T細胞を調製して全 RNAを抽出した。計 44 種の全 RNA試料を用いて目的の遺伝子の発現量を定量した。

実施例 1と同様にしてスギ花粉、ヒノキ花粉、ャケヒヨウダニ、およびコナヒヨウダニの特異的 IgE値、並びに総 IgE値を測定した（表 2 )。

表 2

実施例 7において決定した DDバンドの塩基配列を基にしてプライマー 44Π (C TTCTCTATGGACCAATTCAACTTTGZ配列番号： 6)、 441 r (AAGGGCCATTTTTACCATAATCAA /配列番号： 7)、および TaqManプローブ P441 (TCTGGATAATTAGTAGGATTTAAGCTG TGTTACAAGGCAZ配列番号： 8) を設計、合成し定量反応に用いた。 TaqManプロ一ブ P441は、 5' 端を FAM (6- carboxyf luorescein)で、 3' 端を TAMRA (6-carbo xy-tetramethy卜 rhodamine)で蛍光標識して用いた。铸型には 44種の全 RNAからポリ T(12〜18マ一）をプライマーとして逆転写した cDNAを用いた。コピー数を算出する標準曲線のために実施例 7で得たプラスミド p44卜 13の段階希釈液を銬型として反応を行った。 PCR増幅のモニタリングのための反応液の組成は表 3に示した。また、試料中の cDNA濃度の差を補正するため、 β-ァクチン ( 3-actin) 遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子（441) のコピー数を算出した。

表 3

ABI -PRISM 7700の反応組成（ 1ゥエルあたりの反応量）滅菌蒸留水 25.66 (ill)

10x TaqManバッファー A 5

25mM MgCl₂ 7

dATP(lOmM) 1.2

dCTP(lOmM) 1.2

dGTP(lOmM) 1.2

dUTP(lOmM) 1.2

Forward Primer (100 M) 0.15

Reverse Primer (lOO^M) 0.15

441 TaqMan プローブ（6.7 M) 1.49

Am liTaq Gold (5U/ /L) 0.25

AmpErase UNG (1U/ L) 0.5 テンプレート溶液 5

50

)3 -ァクチンのコピー数で補正した各試料中の「441」の存在数（コピー数）を表 4に示す。補正は全試料における 3 -ァクチンの平均コピーを求め、それを 1としたときの各試料中の -ァクチンの相対値で各試料中の「441」のコピー数を除した。

表 4

ABI7700による定量 fit (copy/ngRNA) beta一 actin補正 data 被験者血液採取時期ノくンド ID

441

A 飛散前 21 飛散後 24

B 飛敗前 39 飛散後 9

C 飛散前 1 3 飛敗後 7

D 飛敗前 27 飛散後 1 1

E 飛散前 1 8 飛敗後 8

F 飛敗前 1 7 飛敗後 26

G ίΐΐβί前 1 2 飛 IB [後 1 3

H 飛 1K前 1 1 飛敗後 9

1 1 2 飛敗後 1 1

J 飛 IK前 1 9 飛散 ¾ 1 2

K τϋιΐχΐυ 1 7 飛 1Κ¾ 6 し飛散 StJ 1 1 0 飛 tt¾ 50

Mmim 2

9

N •30 ftMxi*

0 飛 IK前

飛 IK後 3

-*

P 飛前 7

Q 飛敗前 30 飛敗後 29

R 飛散前 33 飛散後 4

S 飛散前 28 飛敗後 21

T 飛敗前 20 飛散後 1 9 u 飛敗前 28 飛散後 1 9

V 飛散前 23 飛散後 1 3 この値を用いて対応のある t-検定を行った。検定には S tatVi ewソフトウェア (Abacuus Concepts, Inc. ) を用いた。その結果、スギ花粉飛散前後で群分けすると、「441」の発現は飛散前グループにおいて飛散後グループよりも有意に高い (P値 =0. 0176)ことが示された（図 2 )。花粉飛散前グループおよび飛散後グループにおける「441」の発現量は、それぞれ 25. 6土 20· 7および 17. 1 ± 10. 2コピー ng RNA (平均土標準偏差）であった。産業上の利用の可能性

本発明により、スギ花粉のような抗原刺激に対する T細胞の応答の指標とすることができる新規遺伝子が提供された。本発明の遺伝子の発現を指標に、花粉抗原に対する T細胞の応答の有無に関する検査、あるいは抗原刺激に対する T細胞の応答を抑制する治療薬候補化合物のスクリーニングを行うことが可能となった。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸分子。

2. 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸分子。

3. 請求項 1または 2に記載の核酸分子に特異的にハイブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する DNA。

4. 請求項 3に記載の DNAを用いることを特徴とする、請求項 1に記載の核酸分子の検出方法。

5. アレルギー疾患の検査方法であって、

( a ) 被験者から T細胞を調製する工程、

(b) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(c) 該 RNA試料に対して、標識した請求項 3に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダィゼーシヨンを行う工程、

(d) 標識した請求項 3に記載の DNAにハイプリダイズする被験者由来の RNA 量を測定し、対照（健常者の場合）と比較する工程、を含む方法。

6. アレルギー疾患の検査方法であって、

(a) 被験者から T細胞を調製する工程、

(b) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(c) 該 RNA試料に対して逆転写反応を行い cDNAを合成する工程、

(d) 該 cDNAを铸型に、請求項 3に記載の DNAをプライマ一として、ポリメラ —ゼ連鎖反応（PCR) を行う工程、

(e) ポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅された DNA量を、対照（健常者の場合）と比較する工程、を含む方法。

7. ポリメラーゼ連鎖反応を PCR増幅モニター法により行う、請求項 6に記載の方法。

8. T 細胞が被験者の末梢血から調製される、請求項 5から 7のいずれかに記載の方法。

9. アレルギー疾患がスギ花粉症である、請求項 5から 8のいずれかに記載の方法。

1 0. T 細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(b) 該モデル動物から T細胞を調製する工程、

( c ) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(d) 該 RNA試料に対して、標識した請求項 3に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダイゼ一シヨンを行う工程、

( e ) 標識した請求項 3に記載の DNAにハイブリダイズする該 T細胞由来の RN A量を測定する工程、

(f ) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（e) において測定される RNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

1 1. T 細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

( b ) 該モデル動物から T細胞を調製する工程、

( c ) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(e) 該 cDNAを铸型に、請求項 3に記載の DNAをプライマーとして、ポリメラ —ゼ連鎖反応（PCR) を行う工程、

(f ) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（e) において増幅される DNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

12. T 細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、 (a) 被検化合物をモデル動物に投与する工程、

(b) 該モデル動物からリンパ球を調製する工程、

(c ) 該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、

(e) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

( f ) 該 RNA試料に対して、標識した請求項 3に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダイゼーションを行う工程、

( g ) 標識した請求項 3に記載の DNAにハイブリダイズする該 T細胞由来の RN A量を測定する工程、

13. T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

( a ) 被検化合物をモデル動物に投与する工程、

(b) 該モデル動物からリンパ球を調製する工程、

(c ) 該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、

(e) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

( f ) 該 RNA試料に対して逆転写反応を行い cDNAを合成する工程、

(g) 該 cDNAを铸型に、請求項 3に記載の DNAをプライマ一として、ポリメラ —ゼ連鎖反応（PCR) を行う工程、

(h) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程 (g) において増幅される DNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

14. T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) モデル動物またはヒトからリンパ球を調製する工程、 (b) 被検化合物の存在下、該リンパ球を花粉抗原で刺激する工程、

(c) 該抗原刺激を受けたリンパ球から T細胞を分離する工程、

(d) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(e) 該 RNA試料に対して、標識した請求項 3に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダイゼーシヨンを行う工程、

( f ) 標識した請求項 3に記載の DNAにハイプリダイズする該 T細胞由来の RN A量を測定する工程、

15. T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(a) モデル動物またはヒ卜からリンパ球を調製する工程、

(d) 該 T細胞から RNA試料を調製する工程、

( f ) 該 cDNAを铸型に、請求項 3に記載の DNAをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) を行う工程、

(g) 対照（被検化合物非投与の場合）と比較して、工程（f) において増幅される DNA量の低下を抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

16. T細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(b) 該刺激を受けた株化 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(c) 該 RNA試料に対して、標識した請求項 3に記載の DNAをプローブとして、ハイブリダイゼ一シヨンを行う工程、 ( d ) 標識した請求項 3に記載の DNAにハイプリダイズする該株化 T細胞由来の RNA量を測定する工程、

1 7. T 細胞の抗原刺激応答を抑制する治療薬候補化合物をスクリーニングする方法であって、

(b) 該刺激を受けた株化 T細胞から RNA試料を調製する工程、

(d) 該 cDNAを铸型に、請求項 3に記載の DNAをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) を行う工程、

18. T 細胞が、モデル動物の末梢血から調製される、請求項 1 0または 1 1 に記載の方法。

19. リンパ球が末梢血から調製される、請求項 1 2から 1 5のいずれかに記載の方法。

20. 抗原がスギ花粉抗原である、請求項 10から 1 9のいずれかに記載の方法。