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WO2000071698A2 - Gemisch zur neutralisierung von enzyminhibitoren - Google Patents

Gemisch zur neutralisierung von enzyminhibitoren Download PDF

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WO2000071698A2
WO2000071698A2 PCT/EP2000/003933 EP0003933W WO0071698A2 WO 2000071698 A2 WO2000071698 A2 WO 2000071698A2 EP 0003933 W EP0003933 W EP 0003933W WO 0071698 A2 WO0071698 A2 WO 0071698A2
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WO
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antibody
mixture
mixture according
reaction
blood
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PCT/EP2000/003933
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French (fr)
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WO2000071698A3 (de
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Christian Reiter
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Connex Gesellschaft zur Optimierung von Forschung und Entwicklung mbH
Original Assignee
Connex Gesellschaft zur Optimierung von Forschung und Entwicklung mbH
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Publication date
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Publication of WO2000071698A3 publication Critical patent/WO2000071698A3/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a mixture of albumin and / or spermidine and at least one antibody, preferably a mixture of albumin, preferably bovine serum albumin, spermidine and an antibody or a solution containing this mixture.
  • This mixture can be used to produce a reaction buffer or to coat reaction vessels. This can neutralize substances that inhibit enzymes used for the manipulation of nucleic acids and are normally present in samples, thereby reducing the efficiency of enzymatically catalyzed nucleic acid modifications, e.g.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • nucleic acids for example genomic DNA
  • biological material for example to be able to amplify them by means of PCR
  • digest the sample which, for example, involves heating the sample and enriching and purifying the nucleic acid in order to thereby inhibit the enzymatic modification reaction to destroy or remove.
  • Common purification methods are, for example, ion exchange chromatography and digestion with proteases, for example proteinase K.
  • proteases for example proteinase K.
  • inhibitors of such reactions include hemin, humic acids, heparin, gall salts and certain sugar structures.
  • the cleaning methods described above have the disadvantage that they do not always remove the inhibitors to a sufficient extent, which is then a requires further purification of the nucleic acids.
  • the associated disadvantages include not only the high expenditure of time and money, but also the loss or degradation of the nucleic acid to be manipulated (especially with high molecular weight DNA or RNA).
  • the invention is therefore based on the object of providing means with which inhibitors of enzymes used in the manipulation of nucleic acids can be effectively neutralized.
  • antibody used here refers to both a polyclonal and monoclonal antibody.
  • the mixture can also contain more than one antibody.
  • the albumin used is preferably bovine serum albumin and the antibody used is an antibody of the IgG class.
  • the experiments carried out showed that the antibody has a clear inhibitory effect, regardless of its specificity, which exceeds that of a normal protein, for example BSA.
  • the observed effect (see Example 5) with regard to the individual components (spermidine, BSA, antibody) is not additive, but synergistic. IgG antibodies have proven to be particularly effective.
  • the invention further relates to a solution which contains the mixture according to the invention.
  • Solutions in which the concentration of albumin is 0.4 ⁇ g / ⁇ l, of spermidine 0.2 ⁇ g / ⁇ l and of the antibody 0.2 ⁇ g / ⁇ l are particularly preferred.
  • the mixture according to the invention or the solution containing it is advantageously to be used in the manipulation of nucleic acids contained in biological samples, in particular for use in routine diagnostic applications.
  • biological samples are materials which are known to contain high concentrations of inhibitors, for example blood, blood components, soil samples, tissue homogenates, fixed tissue, lavage, cerebrospinal fluid, stool for the detection of Helicobacter pylori and urine, preferably for the detection of chlamydia.
  • success can be achieved in various fields of medicine in which a diagnosis (based on the problems described above) was not possible at all via PCR, for example when detecting individual tumor cells in
  • the mixture according to the invention can be used in the detection of sepsis pathogens via PCR, which is thereby much faster and also more sensitive than the detection of the pathogens via cultivation.
  • the present invention thus also relates to the use of the mixture according to the invention or of the solution according to the invention for
  • Reaction vessels for neutralizing inhibitors of enzymes used in the manipulation of nucleic acids are Reaction vessels for neutralizing inhibitors of enzymes used in the manipulation of nucleic acids.
  • the term "enzymatic manipulation of nucleic acids” used here refers to any enzymatically catalyzed reaction in which nucleic acids, preferably DNA or RNA, are enzymatically changed. These include polymerization reactions, for example the polymerase chain reaction (PCR) or the ligase chain reaction (LCR), ligation reaction, phosphorylation reactions , Dephosphorylation reactions, coupling reactions, preferably labeling reactions of nucleic acids with detectable markers, for example the addition of radioactive or non-radioactive labels at the 5 ' or 3 ' end of an RNA or DNA, the fragmentation of DNA, for example via restriction reactions, the preferred enzymes Polymerases, ligases, kinases, nucleases, restriction endonucleases and transferases are preferably the mixture or solution according to the invention is used when carrying out a polymerase chain reaction moderate mixture or the solution for neutralizing inhibitors of thermostable DNA polymerases, for example Taq DNA polymerase, is used.
  • the present invention further relates to reaction vessels which are characterized in that they have a coating with the mixture according to the invention or have been coated with the solution according to the invention.
  • the reaction vessels according to the invention can consist of different materials, preferably those materials as are used for the production of reaction vessels that are used for the enzymatic manipulation of nucleic acids.
  • the reaction vessels preferably consist of polypropylene, polyethylene, polycarbonate, polystyrene or borosilicate.
  • reaction vessels according to the invention are preferably 0.2 ml-0.5 ml or 0.65 ml reaction vessels in the form known to the person skilled in the art (for example in the form of so-called “eppendorft tubes”), strips with 8 or 12 single-use reaction vessels connected to one another a '200 ⁇ l, for plates with 12, 24, 48, 96, 192, 384, 768 or 1536 cavities, for glass capillaries or for silicon “wafers” with up to several thousand reaction compartments.
  • the reaction vessels according to the invention are additionally containing enzymes such as. B. coated polymerases, ligases or nucleases, which are involved in the desired manipulation of the nucleic acid.
  • enzymes such as. B. coated polymerases, ligases or nucleases, which are involved in the desired manipulation of the nucleic acid.
  • the reaction vessels can, for example, already be coated with NTPs.
  • This is preferably a thermostable “hot start” Taq polymerase, the polymerase activity of which is reversibly inhibited by the occupation of the nucleotide binding region by antibodies or aptamers until the first heat denaturation.
  • reaction vessels with the coating described above can be carried out by a person skilled in the art using standard methods, depending on the material of the reaction vessel walls. So can for example, proceed as follows:
  • the antibody NF5E6 was deposited with the DMSZ on January 12, 2000 (accession number DSM ACC2436). With the same results, the antibody EDD1D9 can be used analogously to NF5E6. This antibody was also deposited on January 12, 2000 at the DSMZ with the accession number DSM ACC2435. example 1
  • PCR reaction tubes were used for coating: Advanced Biotechnologies LTD, Cat. #. AB-0350, 0.5 ml PCR reaction tubes.
  • Antibody NF5E6 of connex, 5 ⁇ g / 25 ⁇ l reaction volume spermidine: Sigma, order no. S-0266, 5 ⁇ g / 25 ⁇ l reaction volume BSA: Boehringer Mannheim, order no. 711,454, 10 ⁇ g / 25 ⁇ l
  • Reaction volume This mixture was applied to the bottom of the reaction vessels in the area of the usable space depending on the intended 25 ⁇ l reaction volumes.
  • the tubes were dried for 40 h in a "Weiss" climatic chamber at 38 ° C +/- 1 ° C. After 24 h there was a relative humidity of ⁇ 2%. Finally, the reaction vessels were closed and packed in a moisture-proof manner.
  • PCR reaction tubes were used: Advanced Biotechnologies LTD, Cat. #. AB-0350, 0.5 ml PCR reaction tubes
  • reaction tubes were coated as follows: Antibody: NF5E6 from Connex, 5 ⁇ g / 25 ⁇ l reaction volumespermidine: Sigma, order no. S-0266, 5 ⁇ g / 25 ⁇ l reaction volume
  • BSA Boehringer Mannheim, order no. 711454, 10 ⁇ g / 25 ⁇ l
  • Hp-R1284 (5 'CCT GTT AGC AAC TAA GAA AGG 3')
  • Each DNA sample was placed in reaction vessels with and without a coating
  • the amplified fragments were detected by means of electophoretic separation in an agarose gel (2%). This electrophoretic separation produces characteristic bands of the same fragment length. These bands were stained with ethidium bromide (Merck) and made visible in ultraviolet light .
  • the inhibitor was used as follows:
  • Hemin Sigma, 1 ⁇ g in 25 ml reaction volume
  • the neutralizers were used as follows:
  • Antibody NF5E6 from Connex, 20 ⁇ g in 25 ⁇ l reaction volume (addition in liquid form)
  • BSA Boehringer Mannheim, order number 711454, 20 ⁇ g in 25 ⁇ l
  • Target DNA used Helicobacter pylori DNA
  • Hp-R1284 (5 ' CCT GTT AGC AAC TAA GAA AGG 3 ' )
  • the neutralizer spermidine shows no positive effect.
  • the neutralizers antibody and BSA show a positive effect.
  • the positive effect of the individual components is significantly exceeded by using the coating with the mixture according to the invention.
  • the inhibitor was used as follows:
  • the neutralizers were used as follows:
  • Antibody NF5E6 from Connex, 20 ⁇ g in 25 ⁇ l reaction volume (addition in liquid form)
  • BSA Boehringer Mannheim, order number 711454, 20 ⁇ g in 25 ⁇ l
  • Thermocycler used Biozym MJ, Research PTC 200 Target DNA used: Helicobacter pylori DNA Gene area: 16s rRNA gene
  • the use of BSA or antibodies alone shows no abolition of the inhibitory effect of heparin.
  • the inhibitory effect of heparin on the amplification can only be eliminated by adding spermidine or using the mixture according to the invention.
  • the use of the mixture according to the invention leads to a significantly stronger neutralization of the inhibitory effect of the heparin than the use of the single component spermidine.
  • Gall salts Sigma, order number: B8756, 10 ⁇ g in 25 ⁇ l reaction volume
  • the neutralizers were used as follows:
  • Antibody NF5E6 from Connex, 20 ⁇ g in 25 ⁇ l reaction volume (addition in liquid form)
  • BSA Boehringer Mannheim, order number 711454, 20 ⁇ g in 25 ⁇ l
  • Thermocycler used Biozym MJ, Research PTC 200
  • Target DNA used Helicobacter pylori DNA
  • BSA and spermidine show no neutralization of the inhibitory effect of gall salts.
  • the addition of antibody or the addition of the mixture according to the invention have a neutralizing effect on the inhibitory effect of the gall salts.
  • the neutralizing effect of the mixture according to the invention but is significantly stronger than the effect of the single component antibody.
  • PCR reaction tubes were used: Advanced Biotechnologies LTD, Cat. #. AB-0350, 0.5 ml PCR reaction tubes
  • the coating of the reaction vessels was as follows: Antibody: NF5E6 of connex, 05 ⁇ g / 25 ⁇ l reaction volume spermidine: Sigma, order no. S-0266, 05 ⁇ g / 25 ⁇ l reaction volume BSA: Boehringer Mannheim, order no. 711,454, 10 ⁇ g / 25 ⁇ l reaction volume
  • Thermo Cycler used Biometra - Personal Cycler, Vers. 3.01 bc, (c) Biotron
  • Hp-R1284 (5 'CCT GTT AGC AAC TAA GAA AGG 3') PCR components used:
  • the coating enables the target microorganism to be detected at lower DNA concentrations (two orders of magnitude earlier than without a coating).
  • the NF5E6 antibody in the mixture according to the invention is interchangeable with other IgG antibodies.
  • different IgG antibodies were mixed with BSA and spermidine in the same concentrations as in the 10 ⁇ mixture according to the invention and used in the PCR reaction.
  • a direct sex determination on human heparinized whole blood without previous DNA extraction was chosen as the test system, since whole blood contains a high concentration of inhibitors.
  • Molecular biological gender determination is based on the detection of a gender-specific gene, which is located on the X or Y chromosome. If only the female gene can be detected, it is a female individual (two X chromosomes), but if both genes are found, it is a male individual (one X and one Y in the male).
  • Antibodies NF5E6, Connex GmbH, 2mg / mL
  • PCR reaction vessels were used: Abgene LTD, Cat. # AB-0773, 0.2mL flat caps; Thermo Cycler used: Biometra - Personal Cycler, Vers. 3.01 bc, serial no .: 9510443; Sample material used for DNA amplification: human heparinized whole blood; Blood collection system used: Sarstedt Monovette, Li-Heparin 10-30IE / mL, order no. 06 / 1565.001, Sarstedt cannula, GX1, order no .: 85 / 1,160;
  • Amplified gene regions amplification of the X and Y-specific single copy gene amelogenin (AMG); Gene, 167 (1995) 327-332. Length of the amplified fragments: X chromosome 330 bp
  • AMG-Universal (AMG-univ., 5 ' -CAGCTTCCCAGTTTAAGCTCT-3 ' )
  • AMG-X (AMG-X, 5 ' -TCTCCTATACCACTTAGTCACT-3 ' )
  • AMG-Y (AMG-Y, 5 , -GCCCAAAGTTAGTAATTTTACCT-3 , )
  • the antibody NF5E6 in the mixture according to the invention was replaced by another IgG antibody.
  • the other IgG antibodies were used in the PCR reactions with BSA and spermidine in the same concentration as the antibody NF5E6.
  • the multiplex polymerase chain reaction is a PCR variant in which two or more loci are amplified simultaneously in one PCR reaction.
  • the current method is based on the amplification of the single copy amelogenin gene (AMG).
  • AMG single copy amelogenin gene
  • the gene of the Y allele has a deletion in the first intron compared to that of the X allele. This deletion enables specific PCR reactions to differentiate between X and Y alleles. Amplification with three primers, two of which are allele-specific, allows unique identification of both the X and Y alleles in a single PCR reaction.
  • the 5'-primer (HAMG-univ, 5'-CAGCTTCCCAGTTTAAGCTCT-3 ') an amplification of the X and the Y-AMG allele is possible.
  • the 3 'primers are specific for both the X and the Y allele.
  • the 3 'X-specific primer (HAMG-X, 5'-TCTCCTATACCACTTAGTCACT-3') is derived from the sequence deleted in the Y chromosome and the 3'Y-specific primer (HAMG-Y, 5'- GCCCAAAGTTAGTAATTTTACCT-3 ' ) covers the area that connects the two deletion endpoints.
  • the 330 bp (X chromosome) and the 218 bp (Y chromosome) PCR products are then analyzed using agarose gel electrophoresis. Usually three primers are used simultaneously in one reaction in a reaction vessel.
  • Heparinized whole blood (heparin concentration 10-30 IU / ml) was used for the PCR reaction.
  • the nucleated cells present in the blood served as a DNA resource; the heparinized blood was also a complex mixture of inhibitors (eg: hemoglobin, heme, heparin, etc.).
  • the blood was diluted with H 2 0 (0, 1: 5, 1: 10, 1: 20) and 1 ⁇ L of each was added to 19 ⁇ L master mix.
  • An approach without inhibitors served as a positive control; 10ng of human genomic DNA (male) were used as the template.

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Abstract

Beschrieben wird ein Gemisch aus Albumin und/oder Spermidin und mindestens einem Antikörper, vorzugsweise ein Gemisch aus Albumin, vorzugsweise Rinderserumalbumin, Spermidin und einem Antikörper bzw. eine dieses Gemisch enthaltende Lösung. Dieses Gemisch kann zur Herstellung eines Reaktionspuffers oder zur Beschichtung von Reaktionsgefässen verwendet werden, wodurch Stoffe, die für die Manipulation von Nucleinsäuren verwendete Enzyme hemmen und normalerweise in Proben vorhanden sind, neutralisiert werden. Die Effizienz enzymatisch katalysierter Nucleinsäuremodifikationen, beispielsweise der Polymerasekettenreaktion (PCR), wird dadurch stark erhöht bzw. bei bestimmten Proben werden derartige Reaktionen erst ermöglicht. Schliesslich wird auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Reaktionsgefässe beschrieben.

Description

Gemisch zur Neutralisierung von Enzyminhibitoren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gemisch aus Albumin und/oder Spermidin und mindesten einem Antikörper, vorzugsweise ein Gemisch aus Albumin, vorzugsweise Rinderserumalbumin, Spermidin und einem Antikörper bzw. eine dieses Gemisch enthaltende Lösung. Dieses Gemisch kann zur Herstellung eines Reaktionspuffers oder zur Beschichtung von Reaktionsgefäßen verwendet werden. Dadurch können Stoffe, die für die Manipulation von Nucleinsäuren verwendete Enzyme hemmen und normalerweise in Proben vorhanden sind, neutralisiert werden, wodurch die Effizienz enzymatisch katalysierter Nucleinsäuremodifikationen, beispielsweise der
Polymerasekettenreaktion (PCR), stark erhöht wird bzw. bei bestimmten Proben derartige Reaktionen erst ermöglicht werden. Die Erfindung betrifft schließlich auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße.
Um Nucleinsäuren, beispielsweise genomische DNA, aus biologischem Material enzymatisch manipulieren, beispielsweise über PCR amplifizieren zu können, ist üblicherweise ein Aufschluß der Probe nötig, der beispielsweise ein Erhitzen der Probe und die Anreicherung und Aufreinigung der Nucleinsäure umfaßt, um dadurch mögliche Inhibitoren der enzymatischen Modifikationsreaktion zu zerstören bzw. zu entfernen. Gängige Aufreinigungsmethoden sind beispielsweise lonenaustauschchromatographie und der Verdau mit Proteasen, beispielsweise Proteinase K. Zu den bekannten Inhibitoren derartiger Reaktionen zählen Hämin, Huminsäuren, Heparin, Gallsalze und bestimmte Zuckerstrukturen. Darüber hinaus gibt es noch weitere, bisher noch nicht näher charakterisierte Inhibitoren. Die vorstehend beschriebenen Reinigungsmethoden haben jedoch den Nachteil, daß diese die Inhibitoren nicht immer in ausreichendem Maß entfernen, was dann eine weitere Aufreinigung der Nucleinsäuren erforderlich macht. Zu den damit verbundenen Nachteilen zählen jedoch nicht nur der hohe zeitliche und kostenmäßige Aufwand, sondern auch der Verlust bzw. die Degradierung der zu manipulierenden Nucleinsäure (vor allem bei hochmolekularer DNA oder RNA).
Eine weitere übliche Maßnahme besteht darin, nur einen Bruchteil des Ausgangsmaterials zu verwenden, um so die Inhibitoren auszuverdünnen. Dies kann jedoch dazu führen, daß für die enzymatische Reaktion nicht mehr ausreichend Nucleinsäuremoleküle in der Probe vorhanden sind. Kürzlich wurde beschrieben, daß die Anwesenheit von BSA oder Spermidin im Reaktionspuffer bei der PCR deren Effizienz steigern kann, allerdings war die beobachtete Wirkung noch nicht zufriedenstellend (Wan und Wilkins, PCR Methods and Applications (1993), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Seite 208-210; Deuter et al., Nucleic Acids Res.23 (1955), 3800-3801 ; Forbes und Hicks, J.Clin.Microbiol. 34 (1996), 2125-2128).
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mittel bereitzustellen, mit denen Inhibitoren von bei der Manipulation von Nucleinsäuren verwendeten Enzymen wirkungsvoll neutralisiert werden können.
Die Lösung der vorstehend beschriebenen Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß ein Gemisch aus Albumin und/oder Spermidin und mindestens einem Antikörper, vorzugsweise ein Gemisch aus Albumin, Spermidin und einem Antikörper Inhibitoren der bei der Manipulation von Nucleinsäuren verwendeten Enzyme sehr wirksam neutralisieren kann, wobei synergistische Effekte zu beobachten sind, wobei dieses Gemisch entweder einen Bestandteil des Reaktionspuffers darstellt oder in Form einer Beschichtung des Reaktionsgefäßes vorliegen kann. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, daß etablierte Protokolle für die gewünschte enzymatische Reaktion nicht angepaßt werden müssen, so daß für den Anwender kein zusätzlicher Aufwand entsteht. Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Gemisch aus Albumin, Spermidin und einem Antikörper. Der hier verwendete Begriff "Antikörper" betrifft sowohl einen polyklonalen als auch monoklonalen Antikörper. Dabei kann das Gemisch auch mehr als einen Antikörper enthalten. Vorzugsweise handelt es sich bei dem verwendeten Albumin um Rinderserumalbumin und bei dem verwendeten Antikörper um einen Antikörper der Klasse IgG. Bei den durchgeführten Versuchen zeigte sich, daß eine deutliche hemmende Wirkung des Antikörpers, unabhängig von seiner Spezifizität, vorhanden ist, die die eines normalen Proteins, beispielsweise, BSA, übersteigt. Dabei ist der beobachtete Effekt (siehe Beispiel 5) hinsichtlich der einzelnen Komponenten (Spermidin, BSA, Antikörper) nicht additiv, sondern synergistisch. Als besonders wirkungsvoll haben sich IgG-Antikörper erwiesen.
Die Erfindung betrifft ferner eine Lösung, die das erfindungsgemäße Gemisch enthält. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Lösungen, bei denen die Konzentration von Albumin 0,1 bis 2 μg/μl, von Spermidin 0,05 bis 1 μg/μl und des Antikörper 0,05 bis 1 μg/μl ist. Besonders bevorzugt sind Lösungen, bei denen die Konzentration von Albumin 0,4 μg/μl, von Spermidin 0,2 μg/μl und des Antikörpers 0,2μg/μl ist.
Das erfindungsgemäße Gemisch bzw. die dieses enthaltende Lösung ist vorteilhafterweise bei der Manipulation von Nucleinsäuren zu verwenden, die in biologischen Proben enthalten sind, insbesondere zur Anwendung bei diagnostischen Routineanwendungen. Besonders vorteilhaft kommen diese zum Einsatz, wenn es sich bei den biologischen Proben um Materialien handelt, die dafür bekannt sind, daß sie hohe Konzentrationen an Inhibitoren enthalten, beispielsweise Blut, Blutbestandteile, Bodenproben, Gewebehomogenate, fixiertes Gewebe, Lavagen, Liquor, Stuhl, bevorzugt zum Nachweis von Helicobacter pylori, und Urin, bevorzugt zum Nachweis von Chlamydien. Darüber hinaus können bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Gemisches auf verschiedenen Gebieten der Medizin Erfolge erzielt werden, bei denen bisher eine Diagnose (aufgrund der vorstehend beschriebenen Probleme) über PCR überhaupt nicht möglich war, beispielsweise beim Nachweis einzelner Tumorzellen in
Stammzellpräparationen bei autologen Knochenmarktransplantationen, bei der Früherkennung von Rezidiven bei Leukämien oder beim Nachweis einzelner Zellen von Dickdarmtumoren im Stuhl. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Gemisch beim Nachweis von Sepsiserregern über PCR verwendet werden, der dadurch wesentlicher schneller und auch empfindlicher ist als der Nachweis der Erreger über Kultivierung.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Gemischs oder der erfindungsgemäßen Lösung zur
Herstellung eines Reaktionspuffers oder zur Beschichtung von
Reaktionsgefäßen zur Neutralisierung von Inhibitoren von bei der Manipulation von Nucleinsäuren verwendeten Enzymen.
Der hier verwendete Begriff „enzymatische Manipulation von Nucleinsäuren" betrifft jede enzymatisch katalysierte Reaktion, bei der Nucleinsäuren, vorzugsweise DNA oder RNA, enzymatisch verändert werden. Zu diesen zählen Polymerisationsreaktion, beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder die Ligasekettenreaktion (LCR), Ligationsreaktion, Phosphorylierungsreaktionen, Dephosphorylierungsreaktionen, Kopplungsreaktionen, bevorzugt Markierungsreaktionen von Nucleinsäuren mit nachweisbaren Markern, beispielsweise die Anfügung von radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markierungen am 5'- oder 3'-Ende einer RNA oder DNA, die Fragmentierung von DNA, beispielsweise über Restriktionsreaktionen, wobei die bevorzugten Enzyme Polymerasen, Ligasen, Kinasen, Nucleasen, Restriktionsendonucleasen und Transferasen sind. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Gemisch bzw. die Lösung bei der Durchführung einer Polymerasekettenreaktion verwendet. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Gemisch bzw. die Lösung zur Neutralisierung von Inhibitoren thermostabiler DNA-Polymerasen, beispielsweise Taq-DNA- Polymerase, verwendet. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Reaktionsgefäße, die dadurch charakterisiert sind, daß sie eine Beschichtung mit dem erfindungsgemäßen Gemsich aufweisen bzw. mit der erfindungsgemäßen Lösung beschichtet wurden. Die erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße können aus verschiedenen Materialien bestehen, vorzugsweise solchen Materialien, wie sie zur Herstellung von Reaktionsgefäßen verwendet werden, die für die enzymatische Manipulation von Nucleinsäuren Verwendung finden. Vorzugsweise bestehen die Reaktionsgefäße aus Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Polystyrol oder Borosilikat.
Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßen um 0,2 ml- 0,5 ml oder 0,65 ml -Reaktionsgefäße in der dem Fachmann bekannten Form (beispielsweise in Form sogenannter „Eppendorftubes"), um Streifen mit 8 oder 12 miteinander verbundenen Einmalreaktionsgefäßen a' 200μl, um Platten mit 12, 24, 48, 96, 192, 384, 768 oder 1536 Kavitäten, um Glaskapillaren oder um Silizium-„wafer" mit bis zu mehreren tausend Reaktionskompartimenten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße zusätzlich mit Enzymen wie z. B. Polymerasen, Ligasen oder Nukleasen beschichtet, die an der gewünschten Manipulation der Nucleinsäure beteiligt sind. Dies bietet den zusätzlichen Vorteil, daß in vielen Fällen der Anwender lediglich die Probe, den Puffer und ggf. die erforderlichen dNTPs in das Reaktionsgefäß geben muß. Die Reaktionsgefäße können beispielsweise aber auch bereits mit NTPs beschichtet sein. Vorzugsweise handelt es sich dabei um thermostabile „hot start"-Taq-Polymerase, deren Polymeraseaktivität bis zur ersten Hitzedenaturierung reversibel durch die Besetzung der Nukleotid-Binderegion durch Antikörper oder Aptamere inhibiert ist.
Die Herstellung von Reaktionsgefäßen mit der vorstehend beschriebenen Beschichtung kann vom Fachmann nach Standardverfahren - in Abhängigkeit von dem Material der Reaktionsgefäßwände durchgeführt werden. So kann beispielsweise folgendermaßen vorgegangen werden:
β Mischen von Albumin, Spermidin und des Antikörpers in Reinstwasser.
. Auftragen des Gemisches auf die Innenwände der Reaktionsgefäße, beispielsweise am Boden der Reaktionsgefäße im Bereich des Nutzraumes in Abhängigkeit der vorgesehenen Reaktionsvolumina. Je nach Material des Reaktionsgefäßes kann es gegebenenfalls erforderlich sein, die Oberfläche des Reaktionsgefäßes zunächst mit einem adhäsionsverstärkenden Agens, z.B. Bindesilan, zu behandeln.
• Trocknung der Reaktionsgefäße, bespielsweise im Klimaschrank bei 38 °C +/-3°C ohne Vakuum bis eine Restfeuchte von 5% (vorzugsweise 2-10 %) unterschritten ist.
• Verpackung der Reaktionsgefäße (feuchtigkeitsgeschützt).
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Erläuterungen zu den Figuren ergeben sich aus den in den Beispielen dargestellten Tabellen.
Die Beispiele beziehen sich auf die Verwendung von Panscript DNA Polymerase für die PCR. Darüber hinaus wurden jedoch noch folgende Polymerasen in der PCR mit vergleichbar guten Ergebnissen eingesetzt:
Pan System Taq Oplymerase, PAN-Systems GmbH, Adolf-Braun-Str. 45, 90429 Nürnberg; Röche Taq Polymerase, Röche Diagnostics GmbH, Sandhofer Straße 1 1 6, 68305 Mannheim; Perkin Eimer AmpliTaq DNA Polymerase, PE Corporation, 761 Main Avenue, Norwalk, CT 06859, USA; MBI Fermentas, MBI Fermentas nativ mit BSA, MBI Fermentas (Rec), FERMENTAS AB, V. Graiciuno 8, Vilnius 2028, Litauen; Biometra Finnzymes. Finnzymes Oy; Riihitontuntie 14 B, P.O BOX 148, F1N-02201 ESPOO, FINLAND; Amersham Taq Polymerase, Amersham Pharmacia, Biotech AB, SE-751 84 Uppsala, Sweden, LTI Taq DNA Polymerase recombinant, Life Technologies Inc., 9800 Medical Centre Drive, Rockville, MD 20850, USA; Clontech Advantaq Plus Hotstart, Clontech Laboratories Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303 USA; Promega TaqStorage Buffer A, Promega Taq DNA Polymerase Buffer B, Promega Corporation, 2800
Woods, Hollow Road, Madison, Wl 5371 1 -5399, USA; Hybaid Proof
Sprinter (Taq/Pwo), Hybaid AGS-Gold-Taq, Hybaid Limited, Action Court,
Ashford Road, Ashford, Middlesex, TW1 5 1 XB, United Kingdom;
Eppendorf Taq (Rec), Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH,
Friedensstrasse 1 1 6, 51 145 Köln, Deutschland; Advanced
Biotechnologies Thermoprime Plus DNA-Polymerase, Advanced
Biotechnologies Ltd., ABgene House, Blenheim Road, Epsom, Surrey KT1 9
9AP, United Kingdom; Peqlab SAWADY Taq, peqlab Biotechnologie
GmbH, Am Weichselgarten 7, D-91058 Erlangen; TaKaRa Taq DNA
Polymerse (Rec), Takara Biomedical Europe S.A., Europarc des
Barbanniers, 6, Place du Village, 92230 Gennevilliers, France; Eurogentec
EuroTaq DNA Polymerase, Eurogentec SA, Parc scientifique du Sart-
Tilman, 4102 Seraing, Belgium; Qiagen HotStarTaq DNA Polymerase,
Qiagen (Rec) HotStarTaq DNA Polymerase mit Q-Solution, QIAGEN GmbH
- Germany, Max-Volmer-Straße 4, 40724 Hilden; Stratagene Taq,
Stratagene (Rec) Taq 2000, Stratagene Inc., 1 101 1 North Torrey Pines
Road, La Jolla, CA 92037, USA; Sigma (Rec) REDTAQ, Sigma (Rec) Taq,
Sigma Corp., 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103, USA; Eurobiotaq
(Rec) Taq; DNAmp (Rec) Taq, DNAmp Ltd, St. Alban's House, 40
Lynchford Road, Farnborough GU1 4 6EF, United Kingdom; Epicentre
Masteramp Taq, Epicentre Technologies Inc., 1402 Emil Street, Madison,
Wl 5371 3, USA, Appligene Taq, Appligene Oncor SA, Parc d Innovation,
B.P. 72, F-67402 lllkirch Cedex, Frankreich; MoBiTec Taq, MoBiTec
GmbH, Lotzestrasse 22a, D-37083 Göttingen, Deutschland;
Der Antikörper NF5E6 wurde am 12. Januar 2000 bei der DMSZ hinterlegt (Hinterlegungsnummer DSM ACC2436). Mit den gleichen Ergebnissen kann analog zu NF5E6 der Antikörper EDD1D9 verwendet werden. Dieser Antikörper wurde ebenfalls am 12. Januar 2000 bei der DSMZ mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2435 hinterlegt. Beispiel 1
Die Herstellung beschichteter Reaktionsgefäße
Es wurden folgende PCR-Reaktionsgefäße zur Beschichtung herangezogen: Advanced Biotechnologies LTD, Cat.#.AB-0350, 0,5 ml PCR- Reaktionsgefäße.
Die folgenden Komponenten wurden in Reinstwasser so gemischt, daß in den 0,5 ml Reaktionsgefäßen folgende Konzentration der Einzelkomponenten vorlagen:
Antikörper: NF5E6 von Connex, 5 μg/ 25μl Reaktionsvolumen Spermidin: Sigma, Best-Nr. S-0266, 5 μg/25 μl Reaktionsvolumen BSA: Boehringer Mannheim, Best-Nr. 711454, 10 μg/25 μl
Reaktionsvolumen Dieses Gemisch wurde am Boden der Reaktionsgefäße im Bereich des Nutzraumes in Abhängigkeit von den vorgesehenen 25 μl Reaktionsvolumina aufgetragen.
Die Trocknung der Gefäße erfolgte für 40 h in einer „Weiss"-Klimakammer bei 38 °C +/- 1 °C. Nach 24 h lag eine relative Luftfeuchte von < 2% vor. Abschließend wurden die Reaktionsgefäße verschlossen und feuchtigkeitsgeschützt verpackt.
Beispiel 2
Nachweis eines Mikroorganismus in Stuhlproben bei Verwendung von beschichteten Reaktionsgefäßen im Vergleich zu unbeschichteten
Reaktionsgefäßen
Es wurden folgende PCR-Reaktionsgefäße verwendet: Advanced Biotechnologies LTD, Cat.#.AB-0350, 0,5 ml PCR- Reaktionsgefäße
Die Beschichtung der Reaktionsgefäße war wie folgt: Antikörper: NF5E6 von Connex, 5 μg/ 25μl Reaktionsvolumen Spermidin: Sigma, Best-Nr. S-0266, 5 μg/25 μl Reaktionsvolumen
BSA: Boehringer Mannheim, Best-Nr. 711454, 10 μg/25 μl
Reaktionsvolumen
Verwendeter Thermo Cycler: Biometra - Personal Cycler, Vers. 3,01 bc, (c)
Biotron 1995, Serien-Nr.: 9510443
Verwendeter Ziel-Mikroorganismus: Helicobacter pylori
Genbereich: 16s rRNA-Gen
Länge des amplifizierten Fragments : 330 bp
Verwendete Primer: Hp-R994 (5' GTT GGA GGG CTT AGT CTC TCC 3')
Hp-R1284 (5' CCT GTT AGC AAC TAA GAA AGG 3')
Verwendete PCR-Komponenten:
Figure imgf000010_0001
Bedingungen für die PCR-Amplifikation:
94°C 2 min 1 x
94°C 1 min
58°C 30 sec |> 35 x 72°C 45 sec
72°C 5 min 1 x
4°C ∞
Durchführung:
Acht verschiede Humanstuhlproben (20 mg) wurden mit 40 μl Natriumchloridlösung (0,9%) und 10 μl Helicobacter pylori-Suspension (entpricht 5 x 105 Zellen) versetzt. Anschließend wurde mittels eines Qiagen- Kits („QIAamp Tissue Kit", Kat.Nr. 293004) eine DNA-Extraktion durchgeführt. Die Exraktion beruhte auf dem Qiagen-Protokoll "Isolation of genomic DNA from faeces". Die Elution erfolgte in 50 μl Reinstwasser (autoklaviert). Von den Extraktionsproben wurden 2μl pro 25μl PCR-Reaktionsvolumen eingesetzt. Um den Ziel-Mikroorganismus (Helicobacter pylori) nachzuweisen wurde eine PCR mit spezifischen Primern durchgeführt. Jede DNA-Probe wurde in Reaktionsgefäßen mit und ohne Beschichtung amplifiziert und die Wirkung der Beschichtung überprüft. Mittels elektophoretischer Auftrennung im Agarosegel (2%ig) erfolgte der Nachweis der amplifizierten Fragmente. Durch diese elekrophoretische Auftrennung entstehen charakteristische Banden gleicher Fragmentlänge. Diese Banden wurden mit Ethidiumbromid (Merck) angefärbt und im ultravioletten Licht sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Figur 1 dargestellt:
Tabelle 1
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
Ergebnis:
Alle Stuhlproben wurden mit beschichteten Reaktionsgefäßen nachgewiesen (100 %), bei Verwendung von Reaktionsgefäßen ohne Beschichtung war dies nicht möglich.
Beispiel 3
Nachweis der DNA eines Mikroorganismus
Vergleich mehrer Stoffe zur Neutralisation von Enzyminhibitoren in Anwesenheit und
Abwesenheit des Inhibitors Hemin
Es wurden folgende PCR Reaktionsgefäße verwendet:
Advanced Biotechnologies LTD, Cat#. AB-0350, 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäße
Der Inhibitor wurde wie folgt eingesetzt:
Hemin: Sigma, 1 μg in 25 ml Reaktionsvolumen
Die Neutralisatoren wurden in wie folgt eingesetzt:
Antikörper: NF5E6 von Connex, 20 μg in 25 μl Reaktionsvolumen (Zugabe in flüssiger Form) BSA: Boehringer Mannheim, Bestellnr.711454, 20 μg in 25 μl
Reaktionsvolumen (Zugabe in flüssiger Form) Spermidin: Sigma, Bestelinr. S-0266, 20 μg in 25 μl Reaktionsvolumen (Zugabe in flüssiger Form) Gemisch: Antikörper:Spermidin:BSA im Verhältnis 1 :1 :2, insgesamt 20μg in 25 μl
Reaktionsvolumen (Beschichtung) Verwendeter Thermocycler: Biozym MJ, Research PTC 200
Verwendete Ziel DNA: Helicobacter pylori DNA
Genbereich: 16s rRNA-Gen
Länge des amplifizierten Fragments: 330 bp
Verwendete Primer: Hp-R994 (5'GTT GGA GGG CTT AGT CTC TCC 3')
Hp-R1284 (5'CCT GTT AGC AAC TAA GAA AGG 3')
Verwendete PCR Komponenten:
Stocklsg. Hersteller Konz. Pro 25 μl
Reaktionsvolumen
10xPCR Puffer PAN- 1 xPCR-Puff er
SystemsGmbH
MB-1 101000
MgCI2 [50 M] PAN- 3 mM
SystemsGmbH
MB-9120001 dNTPs [1 2,5mM] PAN-Systems 0,5 mM
GmbH
MB-9145001
Hp-R994 [1 pmol/μl] MWG-Biotech 3pmol
GmbH
Hp-R1284 [1 pmol/μl] MWG-Biotech 3 pmol
GmbH
Panscript DNA [5E/A I] PAN- 1 E Polymerase SystemsGmbH
MB-1 101000
Bedingungen für die PCR Amplifikation:
94°C 2min 1x
94°C 1 min
58°C 30sec 35x
72°C 45sec
72°C 5min 1x
4°C unendlich Durchführung:
Pro PCR Reaktion wurden 3 ng DNA, welche mit Hilfe des „High Pure PCR Template Preparation" Kits von Boehringer Mannheim aus einer Helicobacter pylori Kultur isoliert wurden, jeweils mit den Einzelkomponenten des erfindungsgemäßen Gemisches bzw. mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Gemisch in Anwesenheit und Abwesenheit des Inhibitos Hemin getestet. Für die Reaktion wurden die Einzelkomponenten jeweils in flüssiger Form zugesetzt. Das erfindungsgemäße Gemisch wurde in Form der im voraus beschichteten Reaktionsgefäße eingesetzt. Zur Amplifikation des Zielbereiches auf der H.p. DNA wurden spezifische Primer eingesetzt. Mittels elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel (2%ig) erfolgte der Nachweis der amplifizierten Fragmente Durch diese elektrophoretische Auftrennung entstehen charakteristische Banden gleicher Fragmentlänge. Diese Banden wurden mit Hilfe von Ethidiumbromid (Merck) angefärbt und im ultravioletten Licht sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und Figur 2 dargestellt:
Tabelle 2
Figure imgf000014_0001
Ergebnis:
Bei einer Amplifikation von H.p. DNA in Gegenwart des Inhibitors Hemin zeigt der Neutralisator Spermidin keinen positiven Effekt. Die Neutralisatoren Antikörper und BSA zeigen einen positiven Effekt. Der positive Effekt der Einzelkomponenten wird durch den Einsatz der Beschichtung mit dem erfindungsgemäßen Gemisch noch deutlich übertroffen.
Beispiel 4
Nachweis der DNA eines Mikroorganismus
Vergleich mehrer Stoffe zur Neutralisation von Enzyminhibitoren in Anwesenheit und
Abwesenheit des Inhibitors Heparin
Es wurden folgende PCR Reaktionsgefäße verwendet:
Advanced Biotechnologies LTD, Cat#. AB-0350, 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäße
Der Inhibitor wurde wie folgt eingesetzt:
Heparin: Ratiopharm, Heparin-Natrium-25000 Ratiopharm, 1/3 I.E. in 25 μl Reaktionsvolumen
Die Neutralisatoren wurden wie folgt eingesetzt:
Antikörper: NF5E6 von Connex, 20 μg in 25 μl Reaktionsvolumen (Zugabe in flüssiger Form) BSA: Boehringer Mannheim, Bestellnr.711454, 20 μg in 25 μl
Reaktionsvolumen (Zugabe in flüssiger Form) Spermidin: Sigma, Bestellnr.S-0266, 20 μg in 25 μl Reaktionsvolumen (Zugabe in flüssiger Form) Gemisch: Antikörper:Spermidin:BSA im Verhältnis 1 :1 :2, insgesamt 20μg in 25 μl
Reaktionsvolumen (Beschichtung)
Verwendeter Thermocycler: Biozym MJ, Research PTC 200 Verwendete Ziel DNA: Helicobacter pylori DNA Genbereich: 16s rRNA-Gen
Länge des amplifizierten Bereichs: 330 bp
Verwendete Primer: HPR 994/HPR 1284
Verwendete PCR Komponenten: siehe Beispiel 3
Bedingungen für die PCR Amplifikation: siehe Beispiel 3
Durchführung:
Pro PCR Reaktion wurden 3 ng DNA, welche mit Hilfe des „High Pure PCR Template Preparation" Kits von Boehringer Mannheim aus einer Helicobacter pylori Kultur isoliert wurden, jeweils mit den Einzelkomponenten des erfindungsgemäßen Gemisches bzw. mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Gemisch in Anwesenheit und Abwesenheit des Inhibitors Heparin getestet. Für die Reaktion wurden die Einzelkomponenten jeweils in flüssiger Form zugesetzt. Das erfindungsgemäße Gemisch wurde in Form der im voraus beschichteten Reaktionsgefäße eingesetzt. Zur Amplifikation des Zielbereiches auf der H.p. DNA wurden spezifische Primer eingesetzt. Mittels elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel (2%ig) erfolgte der Nachweis der amplifizierten Fragmente. Durch diese elektrophoretische Auftrennung entstehen charakteristische Banden gleicher Fragmentlänge. Diese Banden wurden mit Hilfe von Ethidiumbromid (Merck) angefärbt und im ultravioletten Licht sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und Figur 3 dargestellt: Tabelle 3:
Figure imgf000017_0001
Ergebnis:
Der Einsatz von BSA oder Antikörper alleine zeigt keine Aufhebung des inhibierenden Effekts von Heparin. Die inhibierende Wirkung des Heparins auf die Amplifikation kann nur durch Zugabe von Spermidin oder den Einsatz des erfindungsgemäßen Gemisches aufgehoben werden. Durch den Einsatz des erfindungsgemäßen Gemisches kommt es zu einer deutlich stärkeren Neutralisation der inhibierenden Wirkung des Heparins als durch den Einsatz der Einzelkomponente Spermidin.
Beispiel 5
Nachweis der DNA eines Mikroorganismus
Vergleich mehrere Stoffe zur Neutralisation von Enzyminhibitoren in Anwesenheit und Abwesenheit des Inhibitors Gallsalze
Es wurden folgende PCR Reaktionsgefäße verwendet:
Advanced Biotechnologies LTD, Cat#. AB-0350, 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäße Der Inhibitor wurde wie folgt eingesetzt:
Gallsalze: Sigma, Bestellnummer: B8756, 10 μg in 25 μl Reaktionsvolumen
Die Neutralisatoren wurden in wie folgt eingesetzt:
Antikörper: NF5E6 von Connex, 20 μg in 25 μl Reaktionsvolumen (Zugabe in flüssiger Form) BSA: Boehringer Mannheim, Bestellnr.711454, 20 μg in 25 μl
Reaktionsvolumen (Zugabe in flüssiger Form) Spermidin: Sigma, Bestellnr.S-0266, 20 μg in 25 μl Reaktionsvolumen (Zugabe in flüssiger Form) Gemisch: Antikörper:Spermidin:BSA im Verhältnis 1 :1 :2, insgesamt 20μg in 25 μl
Reaktionsvolumen (Beschichtung)
Verwendeter Thermocycler: Biozym MJ, Research PTC 200
Verwendete Ziel DNA: Helicobacter pylori DNA
Genbereich: 16s rRNA-Gen
Länge des amplifizierten Bereichs: 330 bp
Verwendete Primer: HPR 994/HPR 1284
Verwendete PCR Komponenten: siehe Beispiel 3
Bedingungen für die PCR Amplifikation: siehe Beispiel 3
Durchführung:
Pro PCR Reaktion wurden 3 ng DNA, welche mit Hilfe des „High Pure PCR Template Preparation" Kits von Boehringer Mannheim aus einer Helicobacter pylori Kultur isoliert wurden, jeweils mit den Einzelkomponenten des erfindungsgemäßen Gemisches bzw. mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Gemisch in Anwesenheit und Abwesenheit des Inhibitors Gallsalze getestet. Für die Reaktion wurden die Einzelkomponenten jeweils in flüssiger Form zugesetzt. Das erfindungsgemäße Gemisch wurde in Form der im voraus beschichteten Reaktionsgefäße eingesetzt.
Zur Amplifikation des Zielbereiches auf der H.p. DNA wurden spezifische Primer eingesetzt. Mittels elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel (2%ig) erfolgte der Nachweis der amplifizierten Fragmente. Durch diese elektrophoretische
Auftrennung entstehen charakteristische Banden gleicher Fragmentlänge. Diese
Banden wurden mit Hilfe von Ethidiumbromid (Merck) angefärbt und im ultravioletten
Licht sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und Figur 4 dargestellt:
Tabelle 4:
Figure imgf000019_0001
Ergebnis:
BSA und Spermidin zeigen als Einzelkomponenten keine Neutralisierung des inhibierenden Effekts von Gallsalzen. Die Zugabe von Antikörper bzw. die Zugabe des erfindungsgemäßen Gemisches wirken neutralisierend auf den inhibierenden Effekt der Gallsalze. Der neutralisierende Effekt des erfindungsgemäßen Gemisches ist aber deutlich stärker als der Effekt der Einzelkomponente Antikörper.
Beispiel 6
Auswirkung der Beschichtung in Abhängigkeit von der Konzentration der in der Probe vorliegenden Nucleinsäure
Es wurde eine Nullstuhlprobe mit einem Ziel-Mikroorganismus versetzt, so daß nach der DNA-Extraktion und bei 2 μl Probeneinsatz pro 25 μl PCR-Ansatz entsprechend 0,1 bis 10000 Genome für die PCR-Reaktion zur Verfügung stehen. Es wurde untersucht, welchen Einfluß das erfindungsgemäße Gemisch bzw. die Beschichtung auf diese steigende DNA-Konzentration hat.
Es wurden folgende PCR-Reaktionsgefäße verwendet: Advanced Biotechnologies LTD, Cat.#.AB-0350, 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäße
Die Beschichtung der Reaktionsgefäße war wie folgt: Antikörper: NF5E6 von Connex, 05 μg/ 25μl Reaktionsvolumen Spermidin: Sigma, Best-Nr. S-0266, 05 μg/25 μl Reaktionsvolumen BSA: Boehringer Mannheim, Best-Nr. 711454, 10 μg/25 μl Reaktionsvolumen
Verwendeter Thermo Cycler: Biometra - Personal Cycler, Vers. 3,01 bc, (c) Biotron
1995, Serien-Nr.: 9510443
Verwendeter Ziel-Mikroorganismus : Helicobacter pylori
Genbereich: 16s rRNA-Gen
Länge des amplifizierten Fragments : 330 bp
Verwendete Primer: Hp-R994 (5' GTT GGA GGG CTT AGT CTC TCC 3')
Hp-R1284 (5' CCT GTT AGC AAC TAA GAA AGG 3') Verwendete PCR-Komponenten:
Figure imgf000021_0001
Bedingungen für die PCR-Amplifikation:
94°C 2 min 1 x
94°C 1 min
58°C 30 sec ^ 35 x
72°C 45 sec
72°C 5 min 1 x
4°C CO
Durchführung:
Sechs Humanstuhlproben (je 5 mg) wurden mit je 15 μl Natriumcloridlösung (0,9%) und je 10 μl Helicobacter pylori-Suspension (Es wurde eine Helicobacter pylori-Verdünnungsreihe von 1 x 101 bis 1 x 106 Zellen erstellt) versetzt. Anschließend wurde mittels eines Qiagen-Kits („QIAamp Tissue Kit", Kat.Nr. 293004)) eine DNA-Extraktion durchgeführt. Die Exraktion beruhte auf dem Qiagen Protokoll "Isolation of genomic DNA from faeces" Die Elution erfolgte in 50 μl AE-Puffer (Qiagen). Von den Extraktionsproben wurde 2μl pro 25μl Reaktionsvolumen eingesetzt. Nach der DNA-Extraktion und nach dem Einsatz in der PCR er gab sich folgende Helicobacter pylori Genomzahl:
0,1 Genom / 25 μl PCR-Reaktionsvolumen 1 Genom / 25 μl PCR-Reaktionsvolumen
10 Genom / 25 μl PCR-Reaktionsvolumen 100 Genom / 25 μl PCR-Reaktionsvolumen 1000 Genom / 25 μl PCR-Reaktionsvolumen 10000 Genom / 25 μl PCR-Reaktionsvolumen
Um den Ziel-Mikroorganismus (Helicobacter pylori) nachzuweisen wurde eine PCR mit spezifischen Primern durchgeführt. Jede DNA-Probe wurde in Reaktionsgefäßen mit und ohne Beschichtung amplifiziert und die Wirkung der Beschichtung überprüft. Der Nachweis der amplifizierten Fragmente erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Figur 5 dargestellt.
Tabelle 5
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Ergebnis:
Die Beschichtung ermöglicht es, schon bei niedrigeren DNA-Konzentrationen (zwei Zehnerpotenzen früher als ohne Beschichtung) entsprechend den Ziel- Mikroorganismus nachzuweisen.
Beispiel 7 Verwendung von jeweils einem Antikörper einer anderen Sub-Klasse in dem erfindungsgemäßen Gemisch
In diesem Experiment wurde gezeigt, daß der Antikörper NF5E6 im erfindungsgemäßen Gemisch durch andere IgG-Antikörper austauschbar ist. Dazu wurden jeweils verschiedene IgG-Antikörper mit BSA und Spermidin in den gleichen Konzentrationen wie im 10 x erfindungsgemäßen Gemisch gemischt und in die PCR-Reaktion eingesetzt.
Als Testsystem wurde eine direkte Geschlechtsbestimmung an humanem heparinisiertem Vollblut ohne vorhergehende DNA-Extraktion gewählt, da Vollblut eine hohe Konzentration an Inhibitoren enthält. Die molekularbiologsche Geschlechtsbestimmung basiert auf dem Nachweis eines geschlechtsspezifischen Genes, welches auf dem X- bzw. Y-Chromosom lokalisiert ist. Kann nur das weibliche Gen nachgewiesen werden so handelt es sich um ein weibliches Individuum (zwei X-Chromosomen), werden aber beide Gene gefunden, so handelt es sich um ein männliches Individuum (ein X und ein Y beim Mann).
Komponenten des erfindungsgemäßen Gemischs mit dem Antikörper NF5E6: Die folgenden Komponenten wurden in Reinstwasser so gemischt, daß im 10 X erfindungsgemäßen Gemisch (PCR-Reaktionsvolumen: 20μl) folgende
Konzentrationen der Einzelkomponenten vorlagen:
Antikörper: NF5E6, Connex GmbH, 2mg/mL
Spermidin: Sigma, Best-Nr. S-0266, 2mg/mL
BSA: Boehringer Mannheim, Best-Nr., 711454, 4mg/mL
Komponenten für die PCR-Reaktion:
Es wurden folgende PCR-Reaktionsgefäße verwendet: Abgene LTD, Cat.# AB- 0773, 0.2mL flat caps; verwendeter Thermo Cycler: Biometra - Personal Cycler, Vers. 3,01 bc, Serien-Nr.: 9510443; verwendetes Probenmaterial zur DNA- Amplifikation: Humanes heparinisiertes Vollblut; verwendetes Blutabnahmesystem: Sarstedt Monovette, Li-Heparin 10-30IE/mL, Best-Nr. 06/1565.001 , Sarstedt Kanüle, GX1 , Best-Nr.: 85/1.160;
Amplifizierte Genbereiche: Amplifikation des X und Y spezifischen Single copy Gens Amelogenin (AMG); Gene, 167 (1995) 327-332. Länge der amplifizierten Fragmente: X-Chromosom 330bp
Y-Chromosom 218bp Verwendete Primer:
AMG-Universal (AMG-univ., 5'-CAGCTTCCCAGTTTAAGCTCT-3') AMG-X (AMG-X, 5'-TCTCCTATACCACTTAGTCACT-3')
AMG-Y (AMG-Y, 5,-GCCCAAAGTTAGTAATTTTACCT-3,)
PCR-Mastermix: Komponente Hersteller Endkonzentration
10xKCI-PCR-Buffer (PAN-System GmbH MB-1101000) 1 X MgCI2 (50mM) (PAN-System GmbH MB-1101000) 2.5mM dNTPs (12.5mM) (PAN-System GmbH MB- 9140001 ) 300μM AMG-U.(1pmol/μL) (Metabion GmbH) 100nM AMG-X (1pmol/μL) (Metabion GmbH) 50nM AMG-Y (1 pmol/μL) (Metabion GmbH) 50nM
10 X Erfindungsgemäßes Gemisch (Connex GmbH) 1 X
Pan DNA Polymerase (PAN-System GmbH MB-1101000) 0.033U/μL
In diesem Experiment wurde der Antikörper NF5E6 im erfindungsgemäßen Gemisch jeweils durch einen anderen IgG-Antikörper ersetzt. Die anderen IgG-Antikörper wurden mit BSA und Spermidin in gleicher Konzentration wie der Antikörper NF5E6 in die PCR-Reaktionen eingesetzt.
Mischung „4H5" (Endkonzentration im PCR-Ansatz):
Antikörper lgG1 4H5 #DA990517-1, Connex GmbH (0.2μg/μl)
Spermidin Sigma, Best-Nr. S-0266 (0.2μg/μl)
BSA Boehringer Mannheim, Best-Nr., 711454 (0.4μg/μl)
Mischung „F4" (Endkonzentration im PCR-Ansatz):
Antikörper lgG2a F4#DA981110-3, Connex GmbH (0.2μg/μl)
Spermidin Sigma, Best-Nr. S-0266 (0.2μg/μl)
BSA Boehringer Mannheim, Best-Nr., 711454 (0.4μg/μl)
Mischung „1 B5" (Endkonzentration im PCR-Ansatz):
Antikörper lgG1 1B5 #AR991220, Connex GmbH (0.2μg/μl)
Spermidin Sigma, Best-Nr. S-0266 (0.2μg/μl)
BSA Boehringer Mannheim, Best-Nr., 711454 (0.4μg/μl)
Mischung „2H10" (Endkonzentration im PCR-Ansatz):
Antikörper lgG2a 2H10 #CL000202-1 Connex GmbH (0.2μg/μl)
Spermidin Sigma, Best-Nr. S-0266 (0.2μg/μl)
BSA Boehringer Mannheim, Best-Nr., 711454 (0.4μg/μl)
Bedingungen für die PCR-Amplifikation
95°C 4 30 min 1x
94°C 45 min
50°C 45 min 8X
72°C 1 00 min
93°C 30 min 54°C :40 min }> 32X
72°C :45 min J
6°C oo
Primersystem:
Die Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion ist eine PCR-Variante, bei der zwei oder mehr loci in einer PCR-Reaktion gleichzeitig amplifiziert werden. Die gegenwärtige Methode basiert auf der Amplifikation des Single copy-Amelogenin Gens (AMG). Das Gen des Y-Allels weist im Vergleich zu dem des X-Allels eine Deletion im ersten Intron auf. Diese Deletion ermöglicht spezifische PCR-Reaktionen zur Unterscheidung von X- und Y-Allelen. Die Amplifikation mit drei Primern, von denen zwei Allel-spezifisch sind, erlaubt eine eindeutige Identifizierung sowohl des X- als auch des Y-Allels in einer einzigen PCR-Reaktion.
Mit dem 5'-Primer (HAMG-univ, 5'-CAGCTTCCCAGTTTAAGCTCT-3') ist eine Amplifikation des X- und des Y-AMG-Allels möglich. Die 3'-Primer hingegen sind sowohl für das X- als auch das Y-Allel spezifisch. Der 3' X-spezifische Primer (HAMG-X, 5'-TCTCCTATACCACTTAGTCACT-3') ist von der im Y-Chromosom deletierten Sequenz abgeleitet und der 3'Y-spezifιsche Primer (HAMG-Y,5'- GCCCAAAGTTAGTAATTTTACCT-3') deckt den Bereich ab, der die beiden Deletions-Endpunkte verbindet. Die 330 bp (X-Chromosom) und die 218 bp (Y- Chromosom) PCR-Produkte werden dann anhand von Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Gewöhnlich werden gleichzeitig drei Primer in einer Reaktion in einem Reaktionsgefäß eingesetzt.
Testdurchführung:
Für die PCR-Reaktion wurde heparinisiertes Vollblut (Heparinkonzentration 10-30 lE/ml) verwendet. Die im Blut vorhandenen kemhaltigen Zellen dienten dabei als DNA-Resource; das heparinisierte Blut stellte auch gleichzeitig eine komplexe Inhibitorenmischung dar (z.B.: Hämoglobin, Häm, Heparin, u.a.). Das Blut wurde mit H20 verdünnt (0, 1 :5, 1 :10, 1 :20) und jeweils 1μL davon zu 19 μL Master-Mix zugegeben. Als Positivkontrolle diente ein Ansatz ohne Hemmstoffe; als Matritze wurden 10ng humane genomische DNA (männlich) eingesetzt. Pro PCR- Reaktion wurde jeweils ein direkter Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Gemisch, H2O (ohne erfindungsgemäßes Gemisch) und einer der oben aufgeführten Mischungen mit weiteren IgG-Antikörpern durchgeführt. Der Nachweis der amplifizierten Fragmente erfolgte mittels elektrophoretischer Auftrennung im Agarose-Gel (2%). Das charakteristischen Bandenmuster wurde mit Ethidiumbromid (Merck) gefärbt.
Ergebnisse:
Direkter Vergleich von erfindungsgemäßem Gemisch mit Antikörper NF5E6 und Mischung „4H5":
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Gemischs mit Antikörper NF5E6 zeigte sich bei Einsatz einer 1 :1 und einer 1 :5 Blutverdünnung eine vollständige Inhibierung der PCR-Reaktion. Bei einer 1 :10 Blutverdünnung wurde nur das DNA- Fragment amplifiziert, welches dem Y-chromosomalen Allel zugeordnet wird. Bereits bei einer 1 :20 Blutverdünnung konnte eine Amplifikation beider Allele erreicht werden.
Bei Verwendung der Mischung 4H5 zeigte sich ebenfalls bereits eine Amplifikation bei einer 1 :10 Blutverdünnung und eine vollständige Amplifikation beider Allele bei einer 1 :20 Blutverdünnung.
Ohne Zusatz des erfindungsgemäßen Gemischs mit Antikörper NF5E6 oder der Mischung 4H5 zum Reaktionsgemisch wurde die PCR-Reaktion bei jeder der verwendeten Blutkonzentrationen komplett inhibiert. Die Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt:
M Marker
1 Neg. Kontrolle mit erfindungsgemäßem Gemisch
2 Pos. Kontrolle mit erfindungsgemäßem Gemisch
3 1 μl heparinisiertes Blut mit erfindungsgemäßem Gemisch
4 1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
5 1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
6 1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
7 Neg. Kontrolle ohne erfindungsgemäßem Gemisch. 8: Pos. Kontrolle ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
9: 1 μl heparinisiertes Blut ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
10 1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch. 11 1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch. 12 1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch. 13 Neg. Kontrolle mit Antikörper 4H5 14 Pos. Kontrolle mit Antikörper 4H5 15 1 μl heparinisiertes Blut mit Antikörper 4H5 16 1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) mit Antikörper 4H5 17 1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) mit Antikörper 4H5 18 1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) mit Antikörper 4H5
Direkter Vergleich von erfindungsgemäßem Gemisch mit Antikörper NF5E6 und Mischung „F4":
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Gemisch mit Antikörper NF5E6 zeigte sich bei Einsatz einer 1 :1 , 1 :5 und einer 1:10 Blutverdünnung eine vollständige
Inhibierung der PCR-Reaktion. Ab einer 1 :20 Blutverdünnung konnte eine
Amplifikation beider Allele erreicht werden.
Bei Verwendung der Mischung F4 zeigte sich ab einer 1 :10 Blutverdünnung eine vollständige Amplifikation beider Allele.
Ohne Zusatz des erfindungsgemäßen Gemischs mit Antikörper NF5E6 oder der
Mischung F4 zum Reaktionsgemisch wurde die PCR-Reaktion bei jeder der verwendeten Blutkonzentrationen komplett inhibiert. Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt:
M: Marker
Neg. Kontrolle mit erfindungsgemäßem Gemisch.
Pos. Kontrolle mit erfindungsgemäßem Gemisch.
1 μl heparinisiertes Blut mit erfindungsgemäßem Gemisch
1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch. 7 Neg. Kontrolle ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
8 Pos. Kontrolle ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
9 1 μl heparinisiertes Blut ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
10 1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
11 1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
12 1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
13 Neg. Kontrolle mit Antikörper F4.
14 Pos. Kontrolle mit Antikörper F4.
15 1 μl heparinisiertes Blut mit Antikörper F4.
16 1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) mit Antikörper F4.
17 I μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) mit Antikörper F4.
18 1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) mit Antikörper F4.
Direkter Vergleich von erfindungsgemäßem Gemisch mit Antikörper NF5E6 und Mischung „1B5":
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Gemischs mit Antikörper NF5E6 zeigte sich bei Einsatz einer 1:1 und einer 1:5 Blutverdünnung eine vollständige
Inhibierung der PCR-Reaktion. Bereits bei einer 1 :10 Blutverdünnung konnte eine
Amplifikation beider Allele erreicht werden.
Bei Verwendung der Mischung 1B5 zeigte sich ebenfalls bereits eine Amplifikation bei einer 1 :5 Blutverdünnung und eine vollständige Amplifikation beider Allele ab einer 1 :10 Blutverdünnung.
Ohne Zusatz des erfindungsgemäßen Gemischs mit Antikörper NF5E6 oder der
Mischung 1 B5 zum Reaktionsgemisch wurde die PCR-Reaktion bei jeder der verwendeten Blutkonzentrationen komplett inhibiert. Die Ergebnisse sind in Figur 8 dargestellt:
M: Marker
Neg. Kontrolle mit erfindungsgemäßem Gemisch
Pos. Kontrolle mit erfindungsgemäßem Gemisch
1 μl heparinisiertes Blut mit erfindungsgemäßem Gemisch
1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch. 5: 1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
6: 1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
7: Neg. Kontrolle ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
8: Pos. Kontrolle ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
9: 1 μl heparinisiertes Blut ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
10: 1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
11 : I μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
12: 1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
13: Neg. Kontrolle mit Antikörper 1 B5
14: Pos. Kontrolle mit Antikörper 1B5
15: 1 μl heparinisiertes Blut mit Antikörper 1 B5
16: 1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) mit Antikörper 1 B5
17: 1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) mit Antikörper 1 B5
18: 1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) mit Antikörper 1 B5
Direkter Vergleich von erfindungsgemäßem Gemisch mit Antikörper NF5E6 und Mischung „2H10":
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Gemischs mit Antikörper NF5E6 zeigte sich bei Einsatz einer 1 :1 Blutverdünnung eine vollständige Inhibierung der PCR- Reaktion. Bei einer 1 :5 Blutverdünnung wurde nur das DNA-Fragment amplifiziert, welches dem Y-chromosomalen Allel zugeordnet wird. Bereits ab einer 1 :10 Blutverdünnung konnte eine Amplifikation beider Allele erreicht werden. Bei Verwendung der Mischung 2H10 zeigte sich ab einer 1 :10 Blutverdünnung eine vollständige Amplifikation beider Allele.
Ohne Zusatz des erfindungsgemäßen Gemischs mit Antikörper NF5E6 oder der Mischung 2H10 zum Reaktionsgemisch wurde die PCR-Reaktion bei jeder der verwendeten Blutkonzentrationen komplett inhibiert. Die Ergebnisse sind in Figur 9 dargestellt:
M: Marker
1 : Neg. Kontrolle mit erfindungsgemäßem Gemisch
2: Pos. Kontrolle mit erfindungsgemäßem Gemisch 1 μl heparinisiertes Blut mit erfindungsgemäßem Gemisch
1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) mit erfindungsgemäßem Gemisch.
Neg. Kontrolle ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
Pos. Kontrolle ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
1 μl heparinisiertes Blut ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) ohne erfindungsgemäßem Gemisch.
Neg. Kontrolle mit Antikörper 2H10
Pos. Kontrolle mit Antikörper 2H 10
1 μl heparinisiertes Blut mit Antikörper 2H10
1 μl aus 1 :5 Verdünnung (Blut) mit Antikörper 2H 10
1 μl aus 1 :10 Verdünnung (Blut) mit Antikörper 2H 10
1 μl aus 1 :20 Verdünnung (Blut) mit Antikörper 2H10

Claims

Patentansprüche
1. Gemisch, das Albumin und/oder Spermidin und mindestens einen Antikörper enthält.
2. Gemisch nach Anspruch 1 , das Albumin, Spermidin und einen Antikörper enthält.
3. Gemisch nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Albumin Rinderserumalbumin ist.
4. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper ein IgG- Antikörper ist.
5. Lösung, die das Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
6. Lösung nach Anspruch 5, wobei die Konzentration von Albumin 0,1 bis 2 μg/μl, von Spermidin 0,05 bis 1 μg/μl und die des Antikörpers 0,05 bis 1 μg/μl ist.
7. Lösung nach Anspruch 6, wobei die Konzentration von Albumin 0,4 μg/μl, von Spermidin 0,2 μg/μl und die des Antikörpers 0,2μg/μl ist.
8. Verwendung des Gemischs nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder der Lösung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Herstellung eines Reaktionspuffers oder zur Beschichtung von Reaktionsgefäßen zur Neutralisierung von Inhibitoren von bei der Manipulation von Nucleinsäuren verwendeten Enzymen.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei es sich bei der Manipulation von Nucleinsäuren um Polymerisationsreaktionen, Ligationsreaktionen, Phosphorylierungsreaktionen, Dephosphorylierungsreaktionen, Restritions- reaktionen und Kopplungsreaktionen handelt und wobei die verwendeten Enzyme Ligasen, Kinasen, Nucleasen, Restriktionsendonucleasen und Transferasen sind.
10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei es sich bei dem verwendeten Enzym um eine thermostabile DNA-Polymerase handelt.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die DNA-Polymerase Taq-DNA- Polymerase ist.
12. Reaktionsgefäß, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Beschichtung mit einem Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist oder mit einer Lösung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 beschichtet wurde.
13. Reaktionsgefäß nach Anspruch 12, wobei das beschichtete Material des Reaktionsgefäßes Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Polystyrol oder Borosilikat ist.
14. Reaktionsgefäß nach Anspruch 12 oder 13, das zusätzlich mit Enzymen beschichtet ist.
15. Verfahren zur Herstellung eines Reaktionsgefäßes nach einem der Ansprüche 12 bis 14, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
(a) Mischen von Albumin und/oder Spermidin und von mindestens einem Antikörper in einer Lösung;
(b) Auftragen des Gemisches auf die Innenwände des Reaktionsgefäßes; und
(c) Trocknung des Reaktionsgefäßes.
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