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WO2000063355A1 - Procede de traitement d'un flux aqueux par electropulsation a champ parallele a l'ecoulement, chambre de pulsation et applications - Google Patents

Procede de traitement d'un flux aqueux par electropulsation a champ parallele a l'ecoulement, chambre de pulsation et applications Download PDF

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WO2000063355A1
WO2000063355A1 PCT/FR2000/000983 FR0000983W WO0063355A1 WO 2000063355 A1 WO2000063355 A1 WO 2000063355A1 FR 0000983 W FR0000983 W FR 0000983W WO 0063355 A1 WO0063355 A1 WO 0063355A1
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WO
WIPO (PCT)
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flow
cells
field
electrodes
electric field
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2000/000983
Other languages
English (en)
Inventor
Marie-Christine Vernhes
Pierre-André René CABANES
Justin Teissie
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Electricite de France SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Electricite de France SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication date
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Priority to JP2000612434A priority patent/JP2002541838A/ja
Priority to EP00920808A priority patent/EP1177280A1/fr
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Priority to US09/975,931 priority patent/US6623964B2/en
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    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2303/00—Specific treatment goals
    • C02F2303/04—Disinfection

Definitions

  • the present invention relates to a method of treating an aqueous flow colonized by cells by the application of an electric field parallel to the flow of the flow, a flow and electropulsing chamber as well as their application to cell processing. , in particular the destruction, the transmembrane transfer of molecules, the membrane fusion and the insertion of membrane proteins.
  • E the intensity of the applied electric field
  • f the form factor of the cell (1, 5 in the case of a sphere)
  • g ( ⁇ ) is a factor (of the membrane permeability ⁇ ) linked to the conductivities of the external and internal media and to that of the membrane
  • r the radius of the cell
  • ⁇ the angle between the macroscopic electric field vector and the normal to the plane of the membrane at the point considered M
  • ⁇ p is the charging time of the membrane capacity (of the order of a microsecond).
  • t application time of the field.
  • electro-waterproofing is an irreversible phenomenon which leads to cell death or electromortality [Hamilton and Sale (1967) :( 8); Sale and Hamilton (1967) :( 9), (1968) :( 10), Hulsheger et al., (1981) :( 11), (1983) :( 12); Mizuno and Hori (1988) :( 13); Kekez et al. (1996) :( 14), Grahl and Markl (1996) :( 15)].
  • the pulsation chamber is filled, the flow is stopped, the field is then applied then the chamber is emptied, then it is filled again.
  • the cells are stationary during the application of the field. There are therefore no hydrodynamic constraints.
  • the working conditions are therefore identical to those described for fixed bed experiments.
  • the flow rate is limited by the necessity of the downtime present during the application of the pulses. It is however possible to work on large volumes but for long periods.
  • the advantage of the flow system is that it can process large volumes.
  • the flow consists of an uninterrupted flow in the chamber and a synchronization of the pulse trains with the flow rate. It is then possible to apply a well-defined number of pulses to the cells during their residence time in the pulsation chamber.
  • the method of the invention allows a total eradication of the population, while the latter, whether in flow at perpendicular field or in fixed bed, is not possible with known methods and installations.
  • total permeabilization of the population of deformable spherical cells is possible, while a partial effect is obtained with known methods and installations.
  • this configuration can also be advantageous for non-spherical cellular systems, for example rod cell systems which undergo the forced orientation linked to the flow constraint.
  • the latter relates to a process for treating an aqueous flow colonized by cells by a pulsed electric field applied to the flow characterized in that the electric field is applied substantially parallel to the flow.
  • Another object of the invention relates to a flow and pulsation chamber.
  • Devices for treating aqueous flows by a field are known.
  • the chamber comprises at least two electrodes capable of creating a uniform field substantially parallel to the flow flowing between them.
  • One way of creating such a configuration of the field is to provide as electrodes capable of creating a uniform field parallel to the flow flowing between them, for example electrodes through which the flow flows.
  • Such electrodes can be perforated plates, grids, fabrics or bars for example.
  • the cross section of the pulsation chamber can have the shape in particular of a circle or a polygon or an elliptical shape. When they are of the grid or bar type, the electrodes are parallel. However, other configurations are possible which make it possible to create a uniform field parallel to the flux. Furthermore, the longitudinal section is not necessarily with parallel edges.
  • the colonized flow can be subjected to hydrodynamic stress before, after or during its passage through the chamber. It is possible to envisage more complex geometries in particular of the venturi where a hydrodynamic stress will be applied during the passage through the chamber.
  • Such constraints can be applied in a known manner by the choice of the configuration of the supply and outlet pipes from the flow of the chamber, as well as from the flow to the chamber, and the configuration of the chamber itself.
  • the invention relates to a cell destruction process in which an colonized aqueous flow is subjected to an electric field substantially parallel to its flow. It also relates to a membrane permeabilization process of cells of a colonized aqueous flow, by application of an electric field substantially parallel to the flow.
  • the present invention relates to the application of the treatment method to the transfer of nucleic acids (RNA, DNA, oligonucleotides) in cells, to the transfer of proteins into cells, to the extraction of molecules and cytoplasmic macromolecules contained in cells, cell fusion and hybrid production and / or insertion of membrane proteins.
  • nucleic acids RNA, DNA, oligonucleotides
  • colonized flow any flow of domestic, natural, food or utility aqueous medium comprising undesirable cells.
  • These cells or microorganisms can generally be any single-celled organism developing or living in the aqueous stream. In certain cases, it is necessary to eradicate them for reasons of health or public hygiene, ecology or maintenance of industrial equipment. Thus, certain cells proliferate in certain environments and their presence or multiplication in the water and liquids to be treated is harmful to the operation of the facilities or to health or well-being.
  • the colonized flow can be an aqueous medium containing cells or microorganisms producing molecules of interest, the content of which it is desired to recover or to introduce effector molecules or macromolecules on its activity (genetic modification for example).
  • They may be deformable spherical cells but also any cellular system sensitive to the electric field, with a view to electromortality, and other applications of the methods of the invention, and in particular cellular systems having other configurations, such as sticks, bacteria or yeast can be treated.
  • FIG. 1 illustrates, for amoebas, the results in terms of percentage of viability of the cells, by the application of pulsed electric field where the field is applied respectively in parallel to a flow (1-black), in a manner perpendicular to a flow (2-gray) and discontinuously (batch - white).
  • FIGS. 2A and 2B illustrate, in terms of percentage of permeabilization of the amoeba cell membrane, the effectiveness of a field applied at intensity E (kV / cm) perpendicular to the flow (flux - • - 2A ) and that of a field applied parallel to the flow (flow - • - 2B), compared to that of a field applied discontinuously (batch: -o- 2A and 2B).
  • FIG. 3 represents a schematic view of a cell usable according to the invention.
  • the flow is continuous.
  • the method of the invention can also be implemented with a sequential flow.
  • the values defining the applied electric field depend on the installation and the application planned for the process. Thus the difference in electrical potential applied between the two electrodes is a function of the intended use. It is often under the control of the distance between the two electrodes. It must cover ranges of electric fields between a few V / cm and tens of kV / cm. The intensity of the applied electric field can be chosen between 0.1 and 100 kV / cm.
  • the pulse profile is optimized for the type of application. It can be of square wave, trapezoid, sinusoid, triangle or exponential decline. The pulses can be unipolar or bipolar.
  • the pulse frequency is optimized for the type of application but preferably remains below 1 MHz.
  • the pulsation system developed in the laboratory to implement the method of the invention comprises the following different elements: a cell reservoir provided in particular with an agitator, a peristaltic pump, a pulsation chamber and a discharge of the treated flow allowing the cells to be recovered, and means for conveying the flow from the reservoir to the chamber and from the chamber to the discharge.
  • a cell reservoir provided in particular with an agitator, a peristaltic pump, a pulsation chamber and a discharge of the treated flow allowing the cells to be recovered, and means for conveying the flow from the reservoir to the chamber and from the chamber to the discharge.
  • An example embodiment of the chamber will be described later in detail.
  • the peristaltic pump (pump, minipuls 3, Gilson) ensures an overpressure in the cell reservoir, which makes it possible to entrain the cell suspension towards the electropulsing chamber, without passage between the rollers of the pump.
  • This is equipped with a flow meter system which allows the flow to be adjusted precisely.
  • the flow Q used is based on the concept of residence time so that each cell which enters the pulsation chamber undergoes the same electrical conditions. It is defined by the frequency (F), the number (N) of the pulses and by the volume (V) of the pulse chamber by the following relation:
  • the throughput can be optimized for the type of application.
  • the flow rate is of the order of 0.5 ml / min at several m 3 / s.
  • the electrodes in both systems are connected to a high-voltage pulse generator (1.5 kV / cm, 8 Amp, programmable pulse duration from 5 ⁇ s to 24 ms, frequency from 0.1 to 10 and up to 2000 Hz in external control) connected to an oscilloscope (Enertec) thus making it possible to display the electrical parameters delivered.
  • the kinetic profile of the pulses delivered by the generator is said to be in square waves, the intensity of the field remaining constant throughout the duration of the pulses (T).
  • the flexibility of the electropulser allows you to modulate the voltage, duration, number and frequency of the pulses.
  • the experiments were carried out on amoebas, in vegetative form (Naegleria lovaniensis Ar9M1).
  • the cell size is 18.2 ⁇ m (8.5 ⁇ m - 31.5 ⁇ m) x 10.9 ⁇ m (4 ⁇ m - 21 ⁇ m). They are cultivated in axenic condition on plastic boxes at 37 ° C. and using the Chang culture medium.
  • the pulsation medium used is filtered river water and having a conductance of the order of 200 ⁇ S / cm.
  • the viability is evaluated 24 hours after the electrical treatment by the crystal violet staining technique.
  • the permeabilization of cells is quantified by flow cytometry by the use of a naturally non-permeable fluorescent marker, propidium iodide.
  • the pulsation chamber consists of two electrodes with flat stainless steel blades held parallel by insulating shims.
  • the inter-electrode distance is 0.4 cm.
  • the stainless steel electrodes consist of two parallel blades separated by an inter-electrode distance of 0.4 cm.
  • the volume of the parallelepipedal pulsation chamber is 0.2 ml.
  • the electrodes used in steel are grids made up of a mesh (80 ⁇ m x 100 ⁇ m) through which the cells pass.
  • the inter-electrode distance is 0.93 cm and the volume of the pulsation chamber is 0.117 ml.
  • the colonized aqueous medium is pumped from a stirred tank.
  • the aqueous flow created is thus entrained in a pipe.
  • the pulsation chamber delimited by the two electrodes whatever the orientation of the field is constituted by a portion of the pipe delimited by two electrodes.
  • the electrodes are in the form of a grid and allow the flux to pass in the case of the parallel field.
  • the electrodes are connected to an electropulsator.
  • the two flow pulsation chambers have different volumes, which explains why the flow rates used to have the same electropulsing conditions are different.
  • the flow rate in the case where the field is perpendicular to the flow is 1.2 ml / min and that of the configuration of the field parallel to the flow is 0.71 ml / min.
  • the liquid supplied by a connector connected to a feed pump passes through the first electrode, crosses the chamber, then the second electrode before being recovered.
  • the body A cylindrical hole (diameter of the order of millimeters) is drilled in a plexiglass plate (thickness from 1 to 10 mm).
  • plexiglass which is an electrical insulator, any other insulating material can be envisaged, in particular those which are suitable for being molded.
  • the cross section was chosen for convenience of construction (a drill).
  • the longitudinal section has parallel edges, which ensures a criterion of good homogeneity of the field, therefore of cell processing.
  • Electrode mesh steel wire mesh (grid) or stainless steel needles (bar) were used.
  • the mesh was chosen with a fine pitch to ensure good compliance of the field. This allows cells to be treated more evenly. Any electrically conductive material can constitute the electrodes.
  • the electrodes are connected to the electric pulse generator.
  • the electrodes are placed against the body of the chamber.
  • the seal is obtained by O-rings and a deposit of silicone.
  • Figure 3 appears the flow supply pipe connected by a connector 6 to a connector holder 5. Between an external O-ring 4 and an internal O-ring 3 is held the electrode 2. The internal O-ring 3 provides sealing with the body 1. Another internal O-ring 3 'ensures the sealing with the body 1 and maintains the second electrode 2'. On the path of the flow, elements 4 ′, 5 ′, 6 ′, 7 ′ homologous to the elements 4, 5, 6, 7 above direct the flow towards the output of the device.
  • the electrodes 2, 2 ' are connected to the electric pulse generator (not shown). Results
  • FIGS. 2A and 2B compare the profiles of permeabilization obtained as a function of the intensity of the electric field for the two techniques in flux with respect to the profile of permeabilization obtained in batch.
  • the cells in the three cases, are electropulsed by ten pulses of 10 ms delivered with a frequency of 1 Hz.
  • the increase in the intensity of the electric field is correlated with an increase in the rate of permeabilization.
  • the use of a field parallel to the flow gives the best results.
  • the increase in the intensity of the field allows permeabilization of more than 90% of the population.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de traitement d'un flux aqueux colonisé par des cellules par un champ électrique pulsé appliqué au flux caractérisé en ce que le champ appliqué est sensiblement parallèle à l'écoulement du flux et son application au transfert d'acides nucléiques (ARN, ADN, oligonucléotides) dans les cellules, au transfert de protéines dans les cellules, à l'extraction de molécules et de macromolécules cytoplasmiques contenues dans les cellules, à la fusion cellulaire et la production d'hybrides et/ou à l'insertion de protéines membranaires. Elle concerne en outre une chambre d'électropulsation, ainsi qu'un procédé de destruction cellulaire et un procédé de perméabilisation membranaire.

Description

PROCEDE DE TRAITEMENT D'UN FLUX AQUEUX PAR ELECTROPULSATION A CHAMP PARALLELE A L'ECOULEMENT, CHAMBRE DE PULSATION ET APPLICATIONS.
La présente invention concerne un procédé de traitement d'un flux aqueux colonisé par des cellules par l'application d'un champ électrique parallèle à l'écoulement du flux, une chambre d'écoulement et d'électropulsation ainsi que leur application au traitement cellulaire, notamment la destruction, le transfert transmembranaire de molécules, la fusion membranaire et l'insertion de protéines membranaires.
Il est connu d'appliquer un champ électrique à des cellules : lorsque l'on place une cellule dans un champ électrique, les lignes de champ sont déviées par celle-ci, ce qui provoque une accumulation des charges à la surface de la cellule. Ainsi, il en résulte une différence de potentiel transmembranaire induite ΔV qui se superpose à la différence native ΔΨ Bernardt J. et Pauly H. (1973):(1)].
La formule la plus complète retenue dans le cas d'un champ à cinétique en vague carrée et d'une cellule sphérique en suspension est la suivante [Kinosita et Tsong (1979) (2)] :
ΔV(t) = fg(λ) r E(t) cos θ (l-e^) éq 1
L'expression de cette différence de potentiel induite en un point M au temps t est fonction de : E : l'intensité du champ électrique appliqué, f : le facteur forme de la cellule (1 ,5 dans le cas d'une sphère), g (λ) : est un facteur (de la perméabilité membranaire λ) lié aux conductivités des milieux externe et interne et à celle de la membrane, r : le rayon de la cellule, θ : l'angle entre le vecteur champ électrique macroscopique et la normale au plan de la membrane au point considéré M, τp : est le temps de charge de la capacité membranaire (de l'ordre de la microseconde). t : temps d'application du champ.
Lorsque la durée des impulsions est très supérieure au temps de charge de la membrane (t » τp), le terme (1-e_t τp) devient très proche de 1 , on retrouve alors, à l'état stationnaire la formulation classique :
ΔV(t) = fg(λ) r E(t) cos θ éq 2
Le terme en cos θ indique que pour une valeur de champ donnée, l'amplitude de cette différence de potentiel n'est pas identique en tout point de la cellule. Elle est maximale aux points faisant face aux électrodes (pôles) et diminue le long de la surface cellulaire pour s'annuler à l'équateur.
Cette différence de potentiel généré par le champ s'ajoute à la différence de potentiel de repos ΔΨ0. Il en résulte une différence de potentiel résultante ΔVr.
ΔVr = ΔΨn + ΔV éq 3
Au niveau de l'hémisphère cellulaire situé face à l'anode, les valeurs numériques de ΔΨ0 et de ΔV s'additionnent pour tenir compte de la vectorialité de l'effet du champ, ce qui entraîne une hyperpolarisation de la membrane. En revanche, au niveau de l'hémisphère situé face à la cathode, les valeurs numériques de ΔΨ0 et de ΔV se retranchent, et la membrane subit une dépolarisation. Lorsque cette différence de potentiel membranaire résultante devient supérieure à une valeur seuil estimée à 200-250 mV [Teissié et Tsong (1981 ):(3)], il y a induction d'un phénomène de perméabilisation [Ho et Mittal (1996):(4)]. La structure membranaire responsable de cette perméabilité membranaire est inconnue à ce jour, et on emploie préférentiellement le terme de structure transitoire de perméabilisation (STP), ce qui est exprimé de façon usuelle par le terme de "pores".
Si les conditions d'électroperméabilisation sont contrôlées, ce phénomène de perméabilisation est transitoire et réversible, et affecte peu ou pas la viabilité cellulaire. Cette propriété induite par le champ permet d'avoir un accès direct au contenu cytoplasmique [Mir et al. (1988):(5) ; Tsong (1991 ):(6) ; Hapala, (1997):(7)]. Ceci permet de faire pénétrer dans la cellule des molécules étrangères et naturellement non perméantes et de modifier ainsi son contenu de façon soit transitoire, soit permanente (électrochargement, électrotransformation, électroinsertion).
En revanche, dans des conditions d'électropulsation particulières drastiques, l'électroperméabilisation est un phénomène irréversible qui conduit à la mort cellulaire ou électromortalité [Hamilton et Sale (1967):(8) ; Sale et Hamilton (1967):(9), (1968):(10), Hulsheger et al., (1981 ):(11 ), (1983):(12) ; Mizuno et Hori (1988):(13) ; Kekez et al. (1996):(14), Grahl et Markl (1996):(15)]. Cette propriété a été utilisée soit pour lyser des cellules afin de récupérer un métabolite d'intérêt, non excrété naturellement par la cellule, soit pour éradiquer des cellules en environnement (désinfection) ou dans les fluides alimentaires (stérilisation non thermique) [Jayaram et al. (1992):(16), Knorr et al. (1994):(17) ; Qin et al. (1996):(18) ; Qin et al. (1998):(19)].
Il existe dans l'art antérieur deux systèmes moyens d'appliquer un champ électrique puisé à un milieu liquide, et le choix dépend notamment du volume de milieu liquide à traiter. Ainsi, des systèmes de pulsation à lit fixe, encore appelé batch ont été décrits. Ces installations (chambres) et procédés ne permettent toutefois de traiter que de faibles volumes de l'ordre de la fraction de ml. La limite technique est associée à la puissance disponible sur les générateurs d'impulsions électriques pour un coût raisonnable. Outre les travaux de recherche, cette approche permet en milieu industriel l'obtention d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
Par ailleurs, on a décrit l'application d'un champ électrique puisé à un flux, qui permet de traiter une suspension cellulaire en écoulement. Pour le processus en écoulement ou flux, deux stratégies ont été décrites : le flux continu et le flux séquentiel.
Dans le second modèle dit à flux séquentiel, la chambre de pulsation est remplie, le flux est arrêté, le champ est ensuite appliqué puis la chambre est vidée, puis elle est remplie à nouveau. Les cellules sont immobiles pendant l'application du champ. Il n'y a donc pas de contraintes hydrodynamiques. Les conditions de travail sont donc identiques à celles décrites pour des expériences à lit fixe. Le débit est limité par la nécessité des temps d'arrêt présents lors de l'application des impulsions. Il est cependant possible de travailler sur des volumes importants mais pour des durées longues. L'avantage du système en flux est en effet de pouvoir traiter des volumes importants. Le flux consiste en un écoulement sans interruption dans la chambre et en une synchronisation des trains d'impulsions avec le débit de l'écoulement. Il est alors possible d'appliquer un nombre bien défini d'impulsions sur les cellules lors de leur temps de résidence dans la chambre de pulsation. Les cellules sont alors en déplacement et soumises à des contraintes hydrodynamiques de déformation et d'orientation. Le débit peut être très élevé n'étant limité que par la fréquence des impulsions. Cette approche permet donc de travailler sur des volumes importants dans des temps courts. Ainsi, pour réaliser certains traitements de flux séquentiel et/ou continu et notamment pour traiter certains flux colonisés, il est connu d'utiliser des systèmes en flux en appliquant un champ perpendiculaire à l'écoulement [Teissié et Conte (1988):(20) ; Teissié et Rois, (1988):(21 ) ; Sixou et Teissié, (1990):(22) ; Teissié et al. (1992):(23), Rois et al. (1992):(24) ; Bruggeman et al. (1995):(25) ; Qin et al. (1996):(18)].
On a également proposé des systèmes où le flux et les électrodes sont coaxiaux, systèmes avec lesquels on applique un champ non uniforme mais toujours perpendiculaire à l'écoulement [Qin et al. (1996):(18) ; Qin et al. (1998):(19)]. Dans toutes les descriptions antérieures, le champ est appliqué de façon perpendiculaire à l'écoulement.
D'après Bruggeman et al. (1995):(25), pour une valeur de champ électrique donnée, la technique en flux résulte toutefois en une moins bonne efficacité que celle obtenue en batch, comme cela a été constaté pour l'électrochargement d'inositol hexaphosphate sur des globules rouges. Ainsi, selon ce procédé, une augmentation de l'intensité du champ électrique de 10% est nécessaire pour obtenir avec un flux continu des résultats similaires à ceux obtenus en batch. Il y a alors nécessité de travailler à intensité de champ plus intense, donc avec des coûts d'utilisation plus élevés. En termes d'efficacité de chargement, l'approche par écoulement permet de traiter un volume beaucoup plus considérable.
On a maintenant mis en évidence que l'application d'un champ électrique de façon sensiblement parallèle au flux peut permettre d'obtenir un meilleure efficacité des procédés de traitement en flux continu.
Avec certaines espèces, dans le cas de l'électromortalité, le procédé de l'invention permet une éradication totale de la population, alors que celle-ci, que ce soit en flux à champ perpendiculaire ou en lit fixe, n'est pas possible avec les procédés et installations connus. De plus, la perméabilisation totale de la population de cellules sphériques déformables est possible, alors qu'un effet partiel est obtenu avec les procédés et installations connus.
En outre, selon l'invention, il est possible de travailler avec des champs plus faibles, donc dans des conditions économiques de coût de fonctionnement plus rentables, par comparaison avec la technique batch (lit fixe).
Enfin, cette configuration peut également être intéressante pour les systèmes cellulaires non sphériques, par exemple les systèmes cellulaires en bâtonnet qui subissent l'orientation forcée liée à la contrainte de l'écoulement.
Ainsi, selon un premier objet de l'invention, celle-ci concerne un procédé de traitement d'un flux aqueux colonisé par des cellules par un champ électrique puisé appliqué au flux caractérisé en ce que le champ électrique est appliqué sensiblement parallèlement à l'écoulement.
Un autre objet de l'invention concerne une chambre d'écoulement et de pulsation. Des dispositifs de traitement des flux aqueux par un champ sont connus. Selon l'invention, la chambre comporte au moins deux électrodes susceptibles de créer un champ uniforme sensiblement parallèle au flux s'écoulant entre elles.
Un moyen de créer une telle configuration du champ consiste à prévoir comme électrodes susceptibles de créer un champ uniforme parallèle au flux s'écoulant entre elles, par exemple des électrodes au travers desquelles le flux s'écoule. De telles électrodes peuvent être des plaques trouées, des grilles, des toiles ou des barreaux par exemple.
La section transversale de la chambre de pulsation peut avoir la forme notamment d'un cercle ou d'un polygone ou encore une forme elliptique. Lorsqu'elles sont de type grille ou barreau, les électrodes sont parallèles. Toutefois, d'autres configurations sont envisageables qui permettent de créer un champ uniforme parallèle au flux. Par ailleurs, la section longitudinale n'est pas nécessairement à bords parallèles. Ainsi, le flux colonisé peut être soumis à une contrainte hydrodynamique avant, après ou pendant son passage dans la chambre. Il peut être envisagé des géométries plus complexes en particulier des venturi où une contrainte hydrodynamique sera appliquée lors du passage dans la chambre. De telles contraintes peuvent être appliquées de façon connue par le choix de la configuration des conduites d'amenée et de sortie du flux de la chambre, ainsi que du flux vers la chambre, et la configuration de la chambre elle-même. Parmi les applications du procédé et des chambres selon l'invention, on peut citer la destruction cellulaire des cellules indésirables présentes dans un milieu aqueux colonisé et l'extraction de métaboliques cytoplasmiques par perméabilisation des membranes, ainsi que la modification du contenu cytoplasmique par transfert de petites molécules ou de macromolécules (peptides, protéines, acides nucléiques oligonucleotides, ARN, ADN), la fusion de cellules et l'insertion de protéines transmembranaires.
De plus, l'invention concerne un procédé de destruction cellulaire où l'on soumet un flux aqueux colonisé à un champ électrique sensiblement parallèle à son écoulement. Elle concerne aussi un procédé de perméabilisation membranaire de cellules d'un flux aqueux colonisé, par application d'un champ électrique sensiblement parallèle au flux.
Enfin, la présente invention concerne l'application du procédé de traitement au transfert d'acides nucléiques (ARN, ADN, oligonucleotides) dans les cellules, au transfert de protéines dans les cellules, à l'extraction de molécules et de macromolécules cytoplasmiques contenues dans les cellules, à la fusion cellulaire et la production d'hybrides et/ou à l'insertion de protéines membranaires.
Par flux colonisé, on entend tout flux de milieu aqueux domestique, naturel, alimentaire ou utilitaire comportant des cellules indésirables. Ces cellules ou microorganismes peuvent être de façon générale tout organisme monocellulaire se développant ou vivant dans le flux aqueux. Dans certains cas, il y a lieu de les éradiquer pour des raisons de santé ou d'hygiène publique, d'écologie ou d'entretien d'équipements industriels. Ainsi, certaines cellules prolifèrent dans certains milieux et leur présence ou leur multiplication dans les eaux et liquides à traiter est néfaste au fonctionnement des installations ou à la santé ou au bien-être. Le flux colonisé peut être un milieu aqueux contenant des cellules ou microorganismes producteurs de molécules d'intérêt dont on souhaite récupérer le contenu ou introduire des molécules ou macromolécules effectrices sur son activité (modification génétique par exemple).
Il peut s'agir de cellules sphériques déformables mais également de tout système cellulaire sensible au champ électrique, en vue de l'électromortalité, et des autres applications des procédés de l'invention, et notamment des systèmes cellulaires ayant d'autres configurations, comme des bâtonnets, des bactéries ou des levures peuvent être traités.
La présente invention sera mieux comprise au vu de la description détaillée et des dessins annexés.
La figure 1 illustre, pour des amibes, les résultats en terme de pourcentage de viabilité des cellules, par l'application de champ électrique puisé où le champ est appliqué respectivement de façon parallèle à un écoulement (1-noir), de façon perpendiculaire à un écoulement (2-grisé) et de façon discontinue (batch - blanc).
Les figure 2A et 2B illustrent, en terme de pourcentage de perméabilisation de la membrane cellulaire d'amibes, l'efficacité d'un champ appliqué à intensité E (kV/cm) de façon perpendiculaire à l'écoulement (flux -•- 2A) et celle d'un champ appliqué de façon parallèle à l'écoulement (flux -•- 2B), comparées à celle d'un champ appliqué de façon discontinue (batch : -o- 2A et 2B). La figure 3 représente une vue schématique d'une cellule utilisable selon l'invention.
Selon l'invention, de préférence, le flux est continu. Toutefois, le procédé de l'invention peut également être mis en oeuvre avec un flux séquentiel.
Les valeurs définissant le champ électrique appliqué dépendent de l'installation et de l'application prévue pour le procédé. Ainsi la différence de potentiel électrique appliquée entre les deux électrodes est une fonction de l'utilisation envisagée. Elle est souvent sous le contrôle de la distance entre les deux électrodes. Elle doit permettre de couvrir des gammes de champ électrique comprises entre quelques V/cm et des dizaines de kV/cm. L'intensité du champ électrique appliqué peut être choisie entre 0,1 et 100 kV/cm. Le profil des impulsions est optimisé pour le type d'application. Il peut être de type vague carrée, trapèze, sinusoïde, triangle ou à déclin exponentiel. Les impulsions peuvent être unipolaires ou bipolaires.
La fréquence des impulsions est optimisée pour le type d'applications mais reste de préférence inférieure au MHz.
Le système de pulsation mis au point au laboratoire pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention comporte les différents éléments suivants : un réservoir de cellules doté notamment d'un agitateur, une pompe péristaltique, une chambre de pulsation et une décharge du flux traité permettant de récupérer les cellules, et des moyens de convoyer le flux du réservoir à la chambre et de la chambre à la décharge. Un exemple de réalisation de la chambre sera décrit plus loin en détail.
La pompe péristaltique (pompe, minipuls 3, Gilson) assure une surpression dans le réservoir de cellules, ce qui permet d'entraîner la suspension cellulaire vers la chambre d'électropulsation, sans passage entre les galets de la pompe. Celle-ci est dotée d'un système débimétrique qui permet de régler le débit de manière précise. Le débit Q utilisé est basé sur la notion de temps de résidence de sorte que chaque cellule qui rentre dans la chambre de pulsation subisse les mêmes conditions électriques. Il est défini par la fréquence (F), le nombre (N) des impulsions et par le volume (V) de la chambre de pulsation par la relation suivante :
fréquence (Hz) x 60 x Volume de la chambre (ml) Q(ml/minute) = nombre d'impulsions appliquées
Selon l'invention, le débit peut être optimisé pour le type d'applications. Le débit est de l'ordre de 0,5 ml/min à plusieurs m3/s.
Les électrodes dans les deux systèmes sont connectées à un générateur de haute tension impulsionel (1 ,5 kV/cm, 8 Amp, durée des impulsions programmables de 5 μs à 24 ms, fréquence de 0,1 à 10 et jusqu'à 2000 Hz en pilotage externe) relié à un oscilloscope (Enertec) permettant ainsi de visualiser les paramètres électriques délivrés. Le profil cinétique des impulsions délivrées par le générateur est dit en vague carrée, l'intensité du champ demeurant constante durant toute la durée des impulsions (T). La flexibilité de l'électropulsateur permet de moduler la tension, la durée, le nombre et la fréquence des impulsions.
Exemple
Méthode de mesure Les expériences ont été réalisées sur des amibes, sous forme végétative (Naegleria lovaniensis Ar9M1 ). La taille des cellules est de 18,2 μm (8,5 μm - 31 ,5 μm) x 10,9 μm (4 μm - 21 μm). Elles sont cultivées en condition axénique sur des boîtes plastiques à 37°C et en utilisant le milieu de culture de Chang. Le milieu de pulsation utilisé est de l'eau de rivière filtrée et ayant une conductance de l'ordre de 200 μS/cm. La viabilité est évaluée 24 heures après le traitement électrique par la technique de coloration au crystal violet.
La perméabilisation des cellules est quantifiée en cytométrie de flux par l'utilisation d'un marqueur fluorescent naturellement non perméant, l'iodure de propidium.
1) Descriptif du système de pulsation à lit fixe
La chambre de pulsation est constituée de deux électrodes à lames en acier inoxydable planes maintenues parallèles par des cales isolantes. La distance interélectrode est de 0,4 cm.
2) Descriptif des électrodes en écoulement pour un champ perpendiculaire à l'écoulement (comparatif).
Les électrodes en acier inoxydable sont constituées par deux lames parallèles séparées par une distance interélectrode de 0,4 cm. Le volume de la chambre de forme parallélépipédique de pulsation est de 0,2 ml.
3) Descriptif des électrodes en écoulement pour un champ parallèle
Les électrodes utilisées en acier sont des grilles constituées d'un maillage (80 μm x 100 μm) au travers duquel les cellules transitent. La distance interélectrode est de 0,93 cm et le volume de la chambre de pulsation est de 0,117 ml.
Dans les deux cas, le milieu aqueux colonisé est pompé à partir d'un réservoir agité. Le flux aqueux créé est ainsi entraîné dans une conduite. La chambre de pulsation délimitée par les deux électrodes quel que soit l'orientation du champ est constituée par une portion de la conduite délimitée par deux électrodes. Les électrodes sont en forme de grillage et laissent passer le flux dans le cas du champ parallèle. Les électrodes sont reliées à un electropulsateur. Les deux chambres de pulsation en flux ont des volumes différents, ce qui explique pourquoi les débits utilisés pour avoir les mêmes conditions d'électropulsation sont différents. Le débit dans le cas où le champ est perpendiculaire à l'écoulement est de 1 ,2 ml/min et celui de la configuration du champ parallèle à l'écoulement est de 0,71 ml/min.
Le liquide amené par une connectique reliée à une pompe d'alimentation passe à travers la première électrode, traverse la chambre, puis la seconde électrode avant d'être récupéré.
1 - Le corps : Un trou cylindrique (diamètre de l'ordre des millimètres) est percé dans une plaque de plexiglas (épaisseur de 1 à 10 mm).
Matériau : plexiglas, qui est un isolant électrique, tout autre matériau isolant peut être envisagé, en particulier ceux qui sont aptes à être moulés. La section transverse a été choisie pour une commodité de réalisation (un coup de foret).
La section longitudinale est à bords parallèles, ce qui assure un critère de bonne homogénéité du champ donc de traitement des cellules.
2 - Les électrodes :
De la toile métallique en acier (grille) ou des aiguilles en acier inoxydable (barreau) ont été utilisées. Pour la toile, la maille a été choisie avec un pas fin pour assurer une bonne conformité du champ. Cela permet de traiter de façon plus homogène les cellules. Tout matériau conducteur de l'électricité peut constituer les électrodes.
Les électrodes sont reliées au générateur d'impulsions électriques. Les électrodes sont placées contre le corps de la chambre. L'étanchéité est obtenue par des joints toriques et un dépôt de silicone. 3 - Connecteurs d'alimentation en fluide :
Ils sont insérés dans des plaques de plexiglas maintenues en contact intime avec les électrodes. Des joints toriques et un dépôt de silicone assurent l'étanchéité.
A la figure 3 apparaît le tuyau d'amenée du flux raccordé par un raccord 6 à un porte-raccord 5. Entre un joint torique externe 4 et un joint torique interne 3 se trouve maintenue l'électrode 2. Le joint torique interne 3 assure l'étanchéité avec le corps 1. Un autre joint torique interne 3' assure l'étanchéité avec le corps 1 et maintient la seconde électrode 2'. Sur le trajet du flux, des éléments 4', 5', 6', 7' homologues des éléments 4, 5, 6 ,7 ci-dessus conduisent le flux vers la sortie du dispositif.
Les électrodes 2, 2' sont connectées au générateur d'impulsion électrique (non représenté). Résultats
Pour les trois techniques d'électropulsation (batch, champ parallèle au flux, champ perpendiculaire au flux) on a mesuré l'efficacité pour la destruction des amibes. Les cellules ont été électropulsées, dans tous les cas, par dix impulsions de 10 ms délivrées avec une fréquence d'1 Hz. Les résultats concernant l'évolution de la viabilité avec l'intensité du champ électrique sont présentés sur la figure 1.
On obtient dans la configuration en flux avec le champ parallèle à l'écoulement, un profil de chute de la viabilité, où la viabilité est d'autant plus affectée que l'intensité du champ électrique augmente.
L'utilisation en flux d'un champ parallèle à l'écoulement donne les plus faibles taux de viabilité pour chaque intensité du champ électrique étudiée, et s'avère donc être une technique très efficace pour éradiquer des amibes. Pour une valeur de champ de 1 ,5 kV/cm, on observe une élimination totale des amibes. Par ailleurs, les résultats obtenus avec un champ perpendiculaire à l'écoulement montrent que dans ce type de configuration, pour des valeurs de champ élevées (= 1 kV/cm), l'augmentation de l'intensité du champ électrique ne se traduit pas par un accroissement du taux de mortalité. 25% de la population n'est pas affecté par l'effet lytique du champ.
Les figures 2A et 2B comparent les profils obtenus de perméabilisation en fonction de l'intensité du champ électrique pour les deux techniques en flux par rapport au profil de perméabilisation obtenu en batch. Les cellules, dans les trois cas, sont électropulsées par dix impulsions de 10 ms délivrées avec une fréquence de 1 Hz.
Dans la configuration où le champ est perpendiculaire à l'écoulement (2A), sur une gamme d'intensité de champ électrique allant de 0 à 0,75 kV/cm, l'augmentation de l'intensité du champ électrique se traduit par une augmentation du taux de perméabilisation. L'augmentation de l'intensité du champ n'entraîne pas un accroissement du nombre de cellules perméabilisées. Un plateau de seulement 40% est obtenu.
Dans le cas où le champ est parallèle à l'écoulement (2B), sur toutes les valeurs de champ utilisées, l'augmentation de l'intensité du champ électrique est corrélée à une augmentation du taux de perméabilisation. En terme d'efficacité de perméabilisation en flux, l'utilisation d'un champ parallèle à l'écoulement donne les meilleurs résultats. L'augmentation de l'intensité du champ permet de perméabiliser plus de 90% de la population.
Par ailleurs, la perméabilisation en flux, avec champ parallèle à l'écoulement, est déclenchée pour des valeurs inférieures à la valeur critique en batch (0,25 kV/cm). REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de perméabilisation membranaire de cellules dans lequel un flux aqueux colonisé par les cellules est soumis à un champ électrique puisé appliqué au flux de façon sensiblement parallèle à l'écoulement du flux.
2. Procédé selon l'une des revendications 1 , caractérisé en ce que le flux est séquentiel.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 , caractérisé en ce que le flux est continu.
4. Procédé selon la revendication 1 , 2 ou 3, caractérisé en ce que le champ électrique appliqué est de l'ordre de 0,1 à 100 kV/cm.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les pulsations ont un profil en vague carrée, en vague triangulaire, en vague sinusoïdale, en vague trapézoïdale.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les impulsions sont délivrées par une fréquence inférieure au MHz.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le flux est soumis à une contrainte hydrodynamique.
8. Chambre d'écoulement et de pulsation comportant au moins deux électrodes susceptibles de créer un champ uniforme parallèle au flux s'écoulant entre elles, les électrodes étant des grilles ou des barreaux disposés de façon sensiblement parallèles entre eux, dans un plan sensiblement perpendiculaire au flux qui traverse les électrodes.
9. Application des procédés selon les revendications 1 à 6, au transfert d'acides nucléiques (ARN, ADN, oligonucleotides) dans les cellules, au transfert de protéines dans les cellules, à l'extraction de molécules et de macromolécules cytoplasmiques contenues dans les cellules, à la fusion cellulaire et la production d'hybrides et/ou à l'insertion de protéines membranaires.
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