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WO2000061114A1 - Fine particles targeting cells and process for producing the same - Google Patents

Fine particles targeting cells and process for producing the same Download PDF

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WO2000061114A1
WO2000061114A1 PCT/JP2000/002272 JP0002272W WO0061114A1 WO 2000061114 A1 WO2000061114 A1 WO 2000061114A1 JP 0002272 W JP0002272 W JP 0002272W WO 0061114 A1 WO0061114 A1 WO 0061114A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fine particles
cell
ligand
cells
water
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2000/002272
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Toshiaki Tagawa
Hisae Niki
Tomoko Saisho
Kazuo Maruyama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Chemical Corp
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Chemical Corp filed Critical Mitsubishi Chemical Corp
Priority to AU36735/00A priority Critical patent/AU3673500A/en
Publication of WO2000061114A1 publication Critical patent/WO2000061114A1/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention provides a microparticle having a function by combining ligands such as proteins, peptides, carbohydrates, hormones, and low molecular compounds. It relates to the particles and their manufacturing method.
  • the microparticles obtained by the present invention can be used for drug carriers, diagnostics, inspections, etc. c.
  • Lipids having a polar group or amphiphilic polymers, etc. can be formed by vesicles such as lipidic micelles, macromolecular micelles, ribosomes, etc. Used together with the component, it forms microparticles such as microemulsion. This is these key to that trial only for profit as the Ya Li Aichi such as fine-grain child the medicine agents and nuclear acid been Do rather than multi recent years Les, Ru c
  • a fat-soluble substance in the case of ribosome, can be sealed in the fat phase, and a water-soluble substance can be sealed in the internal aqueous phase.
  • DDS carriers such as proteins and nucleic acids.
  • liposomes in which ligands such as antibodies and sugar chains have been studied have been studied.
  • liposomes in which an antibody against a carcinoembryonic antigen has been conjugated can be mentioned.
  • ribosome By applying force to the cell surface, it is spread inside the cell.
  • the purpose of delivering the ribosome is to combine the interlocking leg with the ribosome or to be internalized.
  • Antibodies against identified antigens have been used, and ribosomes have been used-for example, targeting cancer cells.
  • anti-Her 2 antibody-binding ribosome (Cancer Lett. 118 (2) (1997) 153), anti-transferrin receptor Liposome conjugated with antibody (Br_J-Cancer.
  • trans-ferrin or an antibody against trans-ferrin is used, inter-cellularization of cells is expected.
  • trans-ferrin is highly expressed in only a limited number of cancer cells, and is also slightly expressed in many normal cells. In fact, the targets that could actually be applied were limited. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted research, and have found that, as a result of the research, target cells are bound to target cells on microparticles. Incorporation into the target cells of the cauldron The fine particles are transported into the cells by adding active ligands. Look at it.
  • the gist of the present invention is that the specific particles are targeted to the specific particles, and the fine particles are capable of binding to the specific cells.
  • a ligand capable of binding to the cell binds to the microparticles via a water-soluble polymer.
  • these are fine particles, and are particularly preferred.
  • the ligands that bind to the cells are separated by water-soluble polymers.
  • the fine particles are bonded to the fine particles by the method described above, and further, the water-soluble polymer is bonded to the fine particles.
  • another gist of the present invention is that a ligand capable of binding to a target cell is bound via a water-soluble polymer to form a target cell. And a specific cell that binds a ligand having a function to be taken into the cell and a water-soluble polymer.
  • This is a method for producing fine particles to be bound, and it is a method of combining a ligand and a water-soluble polymer that are capable of binding to target cells in advance.
  • the conjugate is manufactured, and the conjugate, a ligand capable of being incorporated into cells, and a water-soluble polymer are combined into fine particles. It is in the method of producing fine particles that is characterized in that they are combined.
  • Fig. 1 shows that the ligand (A) that binds to the cell is bound to the ribosome via the water-soluble polymer, and is taken into the cell.
  • Fig. 2 shows the liposomes in human gastric cancer cell line VIKN45 cells, and the fluorescence images of the ribosomes labeled with fluorescent light. It is true. After reacting each liposome to MKN 45 cells under ice-cooling for 1 hour, washing, and comparing the responsiveness at the point where the cells were further reacted for 371 hours, compare them.
  • a is the fluorescence image after reacting the 2 1 B 2 ribosome
  • b is the 2 1 B 2 -TF liposome
  • c is the TF liposome after the reaction. Indicates.
  • Fig. 3 shows the reactivity of each liposome to human gastric cancer cell line MKN45 cells and the internalization characteristics of each ribosome by fluorescence observation. This is the result (photograph) of the comparison.
  • a and b are 2 1 B 2 ribosomes (without washing with an acid buffer) and b are 2 1 B 2 ribosomes (with an acid buffer).
  • C is 21 B 2-TF ribosome (without washing with acid buffer)
  • d is 21 B 2-TF ribosome (with acid buffer)
  • E) indicates TF ribosome (without washing with an acid buffer)
  • f indicates TF ribosome (after washing with an acid buffer).
  • Fig. 4 shows the results of flow cytometer measurements showing the response of each ribosome to human osteoblastic tumor cell line K562.
  • the vertical axis in the figure shows the fluorescence shift (amount of ribosome bound to the cells) of the flowmeter, and the average value of the histogram.
  • Nega is the value of only those cells that do not react with the ribosome
  • TF — is the PEG unmodified TF ribosome
  • TF + is the PEG-modified TF ribosome.
  • 21B2TF— indicates PEG-unmodified 21 B2—TF liposome
  • 21B2TF + indicates PEG-modified 21B2—TF liposome.
  • microparticles are obtained by the association of amphipathic molecules containing a lyophilic part and a lyophobic part in the molecule.
  • Weights double-cell membrane vesicles such as micelles, macromolecular micelles, microspheres, emajoryons, ribosomes and ribosomes.
  • a polymer S preferably a micelle, in which the resulting polymer vesicles and the like are obtained.
  • Such micelles can take the form of small spheres, ellipsoids or long cylinders composed of amphiphiles. For example, those containing ribosomes, no Vasosomes, and non-active IJ vesicles, but which are more suitably used. It is a liposome.
  • the amphipathic molecules that make up the micelles contain a lyophilic and a lyophobic part, which is in a manner known per se and known in the art. Any substance that can form micelles can be used, and the preferred amphiphilic substance among these is lunar The power to raise quality.
  • the lipids that can constitute the micelles of the present invention include, for example, natural lecithin (eg, egg yolk lecithin, soy lecithin, etc.). ) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ D D D D D
  • lipids such as luamine (DOPE), sugar lipids such as glycosphingolipids, glycephalic lipids, etc., phosphorus lipids, cholesterol, Polyethylene glycol inducers, such as fatty acids, can be mentioned. These lipids may be used alone or in combination of two or more, or in combination with nonpolar substances such as cholesterol. .
  • the micelles and liposomes are made by such a method.
  • it can be manufactured by using a known manufacturing technique known in the art: for example, a thin grease attached to a glass wall.
  • Multi-lamellar vosor (MLV) which is formed by adding a water solution to the membrane and mechanically shaking it, as well as ultrasonic treatment and ethanol injection , Smo-Luni lamellar ribosome (SJV) obtained by the french-press method, removal of surfactant, and reverse-phase evaporation (Ribosome Sunamoto et al. 19988), an extruder that extrudes an MLV by pressing a membrane with a uniform bore diameter.
  • LUVs large-sized lamellar liposomes obtained from the Zion method or the like (Liposome Technology, Vol. 1 2 ndedition) c
  • microparticles of the present invention include a complex composed of a gene and a polypeptide, a gene composed of a polypeptide, a polypeptide, and a fatty acid. You can use a complex consisting of a complex, or a complex consisting of a gene, a polypeptide, and a ribosomal force.
  • the cell-bound ligand (A) has a binding property to a target molecule present on the cell surface. However, they are not actually taken up by cells that are actually targets, and specifically exist on the cell surface.
  • the antibody is selected from proteins such as EGF, VEGF, HGF, etc., folate, lectin, sugar chains, vitamins, etc., which are preferred. It is an antibody.
  • the anti-human chimera antibody, the humanized antibody, and the human anti-body strength are preferable to use.
  • Antibody fragments, such as F (ab ') 2 conjugated antibodies, obtained by pepsin treatment, etc., and scFV can be used as a whole.
  • Ligand (A) can be combined with fine particles via covalent bond and the force S can be any known bond bonding method. It is possible to use the carbodiimide method, maleimide method, periodate method, etc.
  • an active group such as a thiol group is introduced into the ligand (A), and a maleimid group or a pyridyl group is added to fine particles such as a ribosome.
  • a base such as a disulphide group
  • the ligand (A) may be directly bonded to the fine particles, or may be bonded to the fine particles through a part of the spacer, or may be connected to the fine particles. Normally, virtually all of the legs are joined together through a splicer, either by joining the types or by combining them.
  • These spacers are usually polyacrylamide, polyvinylpyrrolidone, polyamino acid, polylactic acid, and polylactic acid.
  • Water-soluble polymers such as glycerin, poly (colic acid), polysaccharides, or poly (alkylene glycol) derivatives are typical. As mentioned above, it is preferably a polyalkylene glycol, especially a polyethylene glycol (PEG) inducer. .
  • Japanese Patent Laid-Open Publication No. 6-126206 Use the methods disclosed in the 70 bulletin, BBA 1 239 (1995) 1 33, etc., in particular; This is a method using the PEG derivative shown in JP-A-11-152.
  • the molecular weight of the prober is about 500 to 500, but preferably about 100 to 100. Yes, more preferably about 20000 to 60000.
  • the ligand (A) can exert a force S that combines 0.1% to 20% (W / W) of the fat mass of the fine particles. Preferably, it is 0.5 to 10% and more preferably 1 to 5%.
  • an active ligand is a machine that is incorporated into a cell that is a target.
  • Any EGF receptor, transfucco: lin receptor, HGF receptor can be used as long as it has the function.
  • Antibodies to, etc., their antibody fragments, including some of them ⁇ Substances derived from antibodies, such as peptides, transphenylene, EGF , Proteins such as HGF, FGF, TGF, etc .; sugars of mannose sugar; complex saccharides such as LPS; lipids such as LDL; and low molecular compounds such as folic acid (preferred).
  • Ligand (B) can be bound to the microparticles in the same manner as the above-mentioned ligand (A), but via a spacer.
  • the direct binding to the microparticles, and the force S preferred, is from 0.1 % to 20 % of the lunar mass of the microparticles (B).
  • WZW can be combined with a force S, preferably from 0.5 to 10%, and more preferably from 1 to 5%.
  • Fine particles can be combined with a water-soluble polymer (C) in addition to a ligand.
  • This water-soluble polymer (C) is the same as the water-soluble polymer used as the aforementioned spacer, and is a polyacrylamide.
  • Polyvinylpyrrolidone, polyamino acid, polylactic acid, polyglycerin, polyglycolic acid, polysaccharides, polyphenols The ability to raise water-soluble polymers such as dielectric conductors; preferably, polyalkylene glycol, especially
  • the water-soluble polymer (c), which is a derivative of polyethylene glycol (PEG), is the same as the water-soluble polymer used as a spacer.
  • the water-soluble polymer used as a spacer must have a function that binds to both the ligand and the fine particles.
  • the water-soluble polymer (C) is used to disperse the ligand (A) into fine particles that need to be capable of binding to the ligand. Bonding through a child can effectively bind the fine particle-ligand complex to target cells, but it has the effect of using a ligand.
  • water-soluble polymer (C) By binding water-soluble polymer (C) to microparticles, which is not capable of binding to metal, it has the function of being incorporated into cells. Reduce non-specific binding of the ligand (B) As a result, an effect is produced, and improvement in stability in living organisms is expected.
  • the molecular weight of the water-soluble polymer (C) is in the range of about 500 to about 500,000, preferably about 100,000. It is about 0, and more preferably about 20000 to about 60000.
  • This water-soluble polymer (C) can be introduced either after the ligand is bonded to the fine particles or at the same time as the ligand. it can .
  • RevoSom is used as microparticles, as disclosed in the official gazette of Japanese Patent Publication No. 4-346991, After combining a ligand with a chonole group to a ribosome with a mid group, a polyalkyl with a further carbon group is bonded.
  • Compound containing len component PE
  • G inducer can be used to give the leg and PEG.
  • the lipid derivative of the ligand and the lipid derivative of PEG are used at the same time to form the liposome by the method of removing the surfactant. This makes it possible to create a liposome with a ligand and PEG.
  • the particles (A), which are capable of binding to cells, are bound to the cells via the water-soluble polymer, and are incorporated into the cells.
  • functionally capable ligands (B) and further modifying the microparticles with water-soluble polymers (C) it is no longer necessary.
  • the water-soluble polymer (C) is 2 to 100%, preferably 3 to 50%, more preferably 5 to 5, based on the fat mass of the fine particles.
  • the force S can be used at 10% of the force.
  • the microparticles of the present invention contain a drug or a diagnostic agent, but the microparticles can be introduced into the microparticles.
  • Pharmaceutical products include, for example, anti-adriamycin, downomycin, vinblastine, cis-bratin, and 5-FU.
  • Tumor agents such as Timol
  • high blood pressure drugs such as clodinine
  • antiemetic drugs such as proline, quinone mouth quinine, etc.
  • Anti-malarial agents, their pharmaceutically acceptable salts and derivatives, and toxic proteins such as ricin A chain and diphtheria toxin Quality and the genes that code for them, antisense such as k-ras, HSV—TK and P53,
  • TNF, GM Genes encoding CSF, etc., as well as complexes and inducers of such genes with polycations such as poly- lysines, etc. Radioactive isotopes such as de, linium, and yttrium, and compounds for neutron capture therapy, such as sodium borocaptate, are mentioned.
  • the present onset Ming range is c real not name a child that will be the implementation example limit constant of the following Examples
  • Anti-CEA mouse monoclonal antibody dissolved in 50 mM phosphoric acid buffer 1 mM EDTA (pH 7.0) 2
  • the PEG derivative (Ac-S-PEG-Sue) described in 22 3 4 was added with 30 mg / ml.
  • the PEG derivative (Ac-S-PEG-Suc) described in JP-A No. 1- 1 5 2 2 3 4 was synthesized by the following method.
  • SP Sepharose (2 mlbed) (equilibrated with 0.1 M acetic acid buffer (pH 4)) (After loading with this buffer and washing with the buffer, mM Myonic acid buffer 1 m MEDTA (p
  • 50 mM phosphoric acid buffer solution 1 M MEDTA (pH 7.0) was dissolved in human trans-ferrin (Sigma 5 mg / m 1). Acetylthioglycol dissolved in ethanol n-Monoleic acid N—Hydroxylsuccinimide ester (Sigma) 200 / After adding ig and reacting at 25 ° C for 1 hour, 50 mM phosphoric acid buffer 1 m MEDT The salt was desalted with PD-10 equilibrated with A (pH 7.0). A 1/9 volume of hydroxylene oleamine solution (0.5 M hydroxylene) was added to the modified trans phenylene solution collected in the void area.
  • RevoSom is Ginomi Toilet Foil Fat Collin (DPPC) / Cholesterol Z Male Mitsile Fossil Fuel Ethanol Amine (Publication No. 4-13461918 Publication) 18Z10Z0.5 (Mole ratio) It was made from a mixture of various fats, ie, 1 OmM of this mixture was mixed with 1 OmM of carboxyl fluorescein in water. A multi-lamellar liposome was prepared by hydrating 1 m1 of the liquid and then using an eX truder (Lipex Biomembranes) with a 0.1 ⁇ m The granules were sized with a poly-one membrane.
  • DPPC Ginomi Toilet Foil Fat Collin
  • Cholesterol Z Male Mitsile Fossil Fuel Ethanol Amine Publication No. 4-13461918 Publication
  • 18Z10Z0.5 Mole ratio
  • the human gastric carcinoma cell line MKN45 was cultured in 8-well tannin slide until partial pile-up, and the lipid concentration was determined. 1 mg Zm1 PEG-modified 2 1 B2 — TF liposome, PEG-modified 21 B2 ribosome, PEG-modified TF ribosome The reaction was carried out for 1 hour with ice cooling. After completion of the reaction, wash and remove the liposome solution, replace with 10% (V / V) FBS-added medium, and incubate at 37 ° C for 1 hour. It was uploaded. After incubating, the cells are washed with ice-cold PBS-Az, and ribosomes are more clearly identified inside and outside the cells.
  • TF liposomes shown in Example 1 and Example 2 human bone was used. The responsiveness of each ribosome to blastoma cell line K5662 was measured. TF and 2 1 B 2 The amount bound to the liposomes was comparable with or without PEG.
  • Human osteoblastic tumor cell line K562 (high expression of TF receptor, weak expression of CEA: confirmed by FACScan) was taken in a 1.5 ml tube, and oil was taken. Concentration of 1 mg Z ml 2 1 B2 — TF ribosome, PEG-modified 21 B2 — TF liposome, TF ribosome, PEG-modified TF ribo Each room was reacted for 1 hour with ice cooling under light shielding. After the reaction is completed, the cells are washed with PBS-Az and passed through a filter with a pore size of 35 ⁇ m. I used it to pray.
  • the PEG modification suppresses the binding activity of TF directly bound to the ribosome, while the TF is bound to the leading end of the PEG spacer.
  • the binding activity of the 21B2 antibody had almost no effect on the binding activity of the 21B2 antibody. This reflects the uniqueness of the ligand binding to the target via the PEG spacer to the liposome. It is shown that while it is possible to reduce the responsiveness of the transponder directly connected to the liposome. Trans-ferrin is also present in many normal cells, and this is to suppress undesired non-specific reactions. Show and review.
  • Ligand that binds to the target cell on the microparticles (A) and is active in its incorporation into the target cell By applying (B) to the target cell [1], it is possible to obtain a target cell with extremely low incorporation capability only with the ligand (B) alone. In addition, it was found that the uptake of the cells in both cells was high by giving both of them the ligand.

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Abstract

Fine particles wherein a ligand capable of binding to target cells is directly or indirectly bonded to another ligand capable of being incorporated into the cells. These fine particles are usable in delivering drugs, etc.

Description

明細書 細胞を タ ーゲテ ィ ン グす る微粒子及びそ の製造方法 技術分野  Description Microparticles for targeting cells and methods for producing the same

本発明 は、 蛋 白 質 、 ペ プ チ ド 、 糖 質 、 ホ ル モ ン 、 低 分 子 化 合 物 等 の リ ガ ン ド を 結 合 す る こ と で 機 能 性 を 付 与 し た 微 粒 子 及 び そ の 製 造 方 法 に 関 す る 。 本 発 明 で 得 ら れ る 微 粒 子 は 、 医 薬 品 運 搬 体 、 診 断 、 検 査 等 に 用 い る こ と 力； で き る c 背景技術 The present invention provides a microparticle having a function by combining ligands such as proteins, peptides, carbohydrates, hormones, and low molecular compounds. It relates to the particles and their manufacturing method. The microparticles obtained by the present invention can be used for drug carriers, diagnostics, inspections, etc. c.

極 性 基 を 有 す る 脂 質 や 両 親 媒性 ポ リ マ ー 等 は 、 脂 質 ミ セ ル 、 高 分 子 ミ セ ル 、 リ ボ ソ ー ム 等 の 小 胞 を 、 ま た オ イ ル 成 分 と 共 に 用 い る こ と で マ イ ク ロ エ マ ル ジ ョ ン 等 の 微 粒 子 を 形 成 す る 。 こ れ ら の 微 粒 子 を 薬 剤 や 核 酸 等 の キ ヤ リ ア 一 と し て 利 用 す る 試 み が 近 年 多 く な さ れ て き て レ、 る c Lipids having a polar group or amphiphilic polymers, etc., can be formed by vesicles such as lipidic micelles, macromolecular micelles, ribosomes, etc. Used together with the component, it forms microparticles such as microemulsion. This is these key to that trial only for profit as the Ya Li Aichi such as fine-grain child the medicine agents and nuclear acid been Do rather than multi recent years Les, Ru c

特 に リ ボ ソ ー ム で は 脂 質 相 に 脂 溶 性 物 質 を 、 内 部 水 相 に 水 溶 性 物 質 を 封 入 で き 、 薬 剤 等 の 低 分 子 化 合 物 の み な ら ず 蛋 白 質 、 核 酸 な ど の D D S 用 キ ャ リ ア 一 と し て 数 多 く の 研 究 が な さ れ て い る 。  In particular, in the case of ribosome, a fat-soluble substance can be sealed in the fat phase, and a water-soluble substance can be sealed in the internal aqueous phase. Numerous studies have been conducted on DDS carriers such as proteins and nucleic acids.

近 年 、 標 的 細 胞 に 効 率 よ く 薬 効 成 分 を デ リ バ リ ー す る こ と の 重 要 性 が 指 摘， さ れ て お り 、 そ の 為 リ ボ ソ ー ム 表 面 に 抗 体 、 糖 鎖 な ど の リ ガ ン ド を 結 合 し た リ ポ ソ 一 ム が 研 究 さ れ て レヽ る 。 例 え ば癌 胎 児 性 抗 原 に 対 す る 抗 体 を 結 合 し た リ ポ ソ 一 ム 等 が 挙 げ ら れ る 。  In recent years, it has been pointed out that the importance of delivering effective drug components to target cells with high efficiency has been pointed out, and therefore, the surface of ribosome has been pointed out. In addition, liposomes in which ligands such as antibodies and sugar chains have been studied have been studied. For example, liposomes in which an antibody against a carcinoembryonic antigen has been conjugated can be mentioned.

ま た 、 細 胞 表 面 へ の 結 合 に 力 tl え て 、 細 胞 内 部 に ま で リ ボ ソ ー ム を 送 達 す る 目 的 で 、 ィ ン タ ー ナ ラ イ ズ す る リ ガ ン ド を リ ボ ソ ー ム に 結 合 し た り 、 内 在 化 さ れ る こ と が 確 認 さ れ た 抗 原 に 対 す る 抗 体 等 を 用 レ、 た リ ボ ソ 一 ム が 用 い ら れ て き た - 例 え ば癌 細 胞 に 対 す る タ 一 ゲ テ ィ ン グ を 例 に す る と 、 抗 H e r 2 抗 体 結 合 リ ボ ソ ー ム （ Canc er Let t . 1 18 (2) ( 1997 ) 153 ) 、 抗 ト ラ ン ス フ ェ リ ン レ セ プ タ 一 抗 体 結 合 リ ポ ソ 一 ム （ Br_J-Can cer. 76 ( 1 ) ( 1997 ) 8 3) 、 ト ラ ン ス フ エ リ ン 結 合 リ ボ ソ ー ム （ 日 本 臨 床 5 6 ( 3 ) ( 1 9 9 8 ) 1 0 5 ) 等 力 研 究 さ れ て レ、 る = こ れ ら の リ ポ ソ 一 ム は 標 的 細 胞 に 結 合 す る だ け で な く 、 効 率 的 に 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る こ と で 、 よ り 効 率 的 な 薬 効 が 期 待 さ れ る 。 特 に 封 入 物 質 が 細 胞 内 に 送 達 さ れ て 始 め て 効 果 を 発 揮 す る も の 例 え ば 、 遺伝 子 導 入 に よ る 治 療 を 目 的 と し た 場 合 等 は こ の よ う な 細 胞 内 デ リ バ リ ー 力 s 重 要 と な る 。 し か し な が ら 細 胞 へ の 標 的 特 異 性 と イ ン タ ー ナ ラ イ ズす る 両 特 性 を 兼 ね 備 え た リ ガ ン ド を 検 索 す る こ と は 容 易 で は な く 、 リ ガ ン ド と し て 使 用 で き る も の も 限 ら れ た も の で あ っ た 。 In addition, by applying force to the cell surface, it is spread inside the cell. The purpose of delivering the ribosome is to combine the interlocking leg with the ribosome or to be internalized. Antibodies against identified antigens have been used, and ribosomes have been used-for example, targeting cancer cells. For example, anti-Her 2 antibody-binding ribosome (Cancer Lett. 118 (2) (1997) 153), anti-transferrin receptor Liposome conjugated with antibody (Br_J-Cancer. 76 (1) (1997) 83), ribosome conjugated with trans-ferrin (Japanese 3) (1 9 9 8) 1 0 5), and the like force research has been les, Ru = this is these re-Pozo one arm is only in rather than it you binding to target specific cells, efficiency More efficient by being taken up in the cell The effect is expected. In particular, when the encapsulated substance is delivered to the cell and starts to exert its effect, for example, when the treatment is for gene transfer. the Yo I Do cells within the de Li Bali over force s important capital ing of this. However, it is easy to search for a ligand that has both target and inter-specific characteristics for cells. However, there were only a limited number of things that could be used as a ligand.

つ ま り 、 例 え ば 、 癌 胎 児 性 抗 原 に 対 す る 抗 体 を リ ボ ソ ー ム 化 し た 場 合 、 癌 細 胞 へ の 選 択 性 や 発 現 量 が 高 く タ 一 ゲ ッ ト と し て は 良 好 な も の を 選 択 で き る が 、 そ の よ う な 抗 体 は 必 ず し も 細 胞 内 へ 取 り 込 ま れ な い 。 ま た ト ラ ン ス フ ェ リ ン や ト ラ ン ス フ ェ リ ン に 対 す る 抗 体 を 用 い た 場 合 、 細 胞 へ の イ ン タ ー ナ ラ イ ズ が 期 待 さ れ る が 、 ト ラ ン ス フ ェ リ ン は 限 ら れ た 癌 細 胞 の み の 高 発 現 で あ る こ と 、 ま た 多 く の 正 常 細 胞 に も 多 少 は 発 現 し て い る こ と カゝ ら 実 際 に 適 用 で き る 対 象 は 限 ら れ た も の で あ っ た 。 発明の開示 That is, for example, when an antibody against a carcinoembryonic antigen is ribosomized, the selectivity for cancer cells and the amount of expression are high, resulting in a high response rate. You can choose any good cut, but such antibodies are not necessarily incorporated into cells. In addition, if trans-ferrin or an antibody against trans-ferrin is used, inter-cellularization of cells is expected. However, trans-ferrin is highly expressed in only a limited number of cancer cells, and is also slightly expressed in many normal cells. In fact, the targets that could actually be applied were limited. Disclosure of the invention

上 記 の 問 題 点 を 解 決 す る 為 、 本 発 明 者 ら は 研 究 を 進 め た 結 果 、 微 粒 子 上 に タ 一 ゲ ッ ト 細 胞 に 結 合 性 の リ ガ ン ド に カ卩 ぇ タ ー ゲ ッ ト 細 胞 へ の 取 り 込 み 活 性 の あ る リ ガ ン ド を 付 カ卩 す る こ と に よ り 微 粒 子 を 細 胞 内 に 輸 送 す る こ と を 見 レ、 だ し た 。  In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted research, and have found that, as a result of the research, target cells are bound to target cells on microparticles. Incorporation into the target cells of the cauldron The fine particles are transported into the cells by adding active ligands. Look at it.

驚 く べ き こ と に 細 胞 へ の 取 り 込 み 活 性 の あ る リ ガ ン ド だ け で は 極 め て 取 り 込 み 能 の 低 い タ 一 ゲ ッ ト 細 胞 に ぉ レ、 て も 、 両 者 の リ ガ ン ド を 付 与 す る こ と で 高 い 細 胞 内 取 り 込 み が 見 い だ さ れ た 。  Surprisingly, incorporation into cells alone is only possible with highly active ligands, which can lead to very low incorporation into target cells. Nevertheless, high intracellular uptake was found with the addition of both ligands.

即 ち 、 本 発 明 の 要 旨 は 、 特 定 の 細 胞 を タ 一 ゲ テ ィ ン グす る 微 粒 子 で あ っ て 、 そ の 微 粒 子 に 該 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド 及 び 該 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド の 2 種 の リ ガ ン ド を 有 す る 事 を 特 徴 と す る 微 粒 子 に 存 す る 。  That is, the gist of the present invention is that the specific particles are targeted to the specific particles, and the fine particles are capable of binding to the specific cells. Microparticles that are characterized by having two types of ligands, one that has the function of being incorporated into the cell and the other that has the function of being incorporated into the cell. Exists.

本 発 明 の 好 ま し い 態 様 と し て は 、 該 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド が 水 溶 性 高 分 子 を 介 し て 該 微 粒 子 に 結 合 し て レ、 る 微 粒 子 で あ っ て 、 特 に 好 ま し レ、 態 様 と し て は 、 該 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド が 水 溶 性 高 分 子 を 介 し て 微 粒 子 に 結 合 し 、 更 に 該 微 粒 子 に 水 溶性 高 分 子 が 結 合 し て い る 微 粒 子 で あ る 。  In a preferred mode of the present invention, a ligand capable of binding to the cell binds to the microparticles via a water-soluble polymer. These are fine particles, and are particularly preferred. In some embodiments, the ligands that bind to the cells are separated by water-soluble polymers. The fine particles are bonded to the fine particles by the method described above, and further, the water-soluble polymer is bonded to the fine particles.

さ ら に 本 発 明 の 別 の 要 旨 は 、 タ ー ゲ ッ ト 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド を 水 溶 性 高 分 子 を 介 し て 結 合 し 、 さ ら に 、 該 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド 及 び 水 溶 性 高 分 子 を 結 合 し た 特 定 の 細 胞 を タ 一 ゲ テ ィ ン グす る 微 粒 子 の 製 造 方 法 で あ っ て 、 あ ら か じ め タ ー ゲ ッ ト 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド と 水 溶 性 高 分 子 の 複 合 体 を 製 造 し て お き 、 こ の 複 合 体 、 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド 、 水 溶 性 高 分 子 を 各 々 微 粒 子 に 結 合 さ せ る こ と を 特 徴 と す る 微 粒 子 の 製 造 方 法 に 存 す る 。 図面の簡単な説明 Further, another gist of the present invention is that a ligand capable of binding to a target cell is bound via a water-soluble polymer to form a target cell. And a specific cell that binds a ligand having a function to be taken into the cell and a water-soluble polymer. This is a method for producing fine particles to be bound, and it is a method of combining a ligand and a water-soluble polymer that are capable of binding to target cells in advance. The conjugate is manufactured, and the conjugate, a ligand capable of being incorporated into cells, and a water-soluble polymer are combined into fine particles. It is in the method of producing fine particles that is characterized in that they are combined. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

第 1 図 は 、 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド （ A ) 力 S 水 溶性 高 分 子 を 介 し て リ ボ ソ ー ム に 結 合 し 、 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド （ B ) が 直 接 リ ポ ソ ー ム に 結 合 し た 微 粒 子 の 概 念 図 。  Fig. 1 shows that the ligand (A) that binds to the cell is bound to the ribosome via the water-soluble polymer, and is taken into the cell. Schematic diagram of fine particles in which a ligand (B) having the following functions is directly bonded to a liposome.

第 2 図 は 、 ヒ ト 胃 癌 細 胞 株 VI K N 4 5 細 胞 に 各 リ ポ ソ 一 ム を 、 蛍 光 ラ ベ ル し た リ ボ ソ ー ム の 蛍 光 像 に よ り 示 し た 写 真 で あ る 。 M K N 4 5 細 胞 に 各 リ ボ ソ ー ム を 氷 冷 下 1 時 間 反 応 し 洗 浄 後 、 さ ら に 3 7 1 時 間 反 応 さ せ た 時 点 で の 反 応 性 を 比 較 し た 。 図 中 、 a は 2 1 B 2 リ ボ ソ ー ム を 、 b は 2 1 B 2 — T F リ ボ ソ ー ム を 、 c は T F リ ポ ソ ー ム を 反 応 さ せ た 後 の 蛍 光 像 を 示 す 。  Fig. 2 shows the liposomes in human gastric cancer cell line VIKN45 cells, and the fluorescence images of the ribosomes labeled with fluorescent light. It is true. After reacting each liposome to MKN 45 cells under ice-cooling for 1 hour, washing, and comparing the responsiveness at the point where the cells were further reacted for 371 hours, compare them. Was In the figure, a is the fluorescence image after reacting the 2 1 B 2 ribosome, b is the 2 1 B 2 -TF liposome, and c is the TF liposome after the reaction. Indicates.

第 3 図 は 、 ヒ ト 胃 癌 細 胞株 M K N 4 5 細 胞 に 各 リ ポ ソ ー ム の 反 応 性 及 び各 リ ボ ソ ー ム の 内 在 化 特 性 を 、 蛍 光観 察 に よ り 比 較 し た 結 果 （ 写 真 ） で あ る 。 細 胞 に リ ポ ソ 一ム を 氷 冷 下 1 時 間 反 応 し 洗 浄 後 、 さ ら に 3 7 °C 1 時 間 反 応 さ せ た 時 点 で の 蛍 光 観 察 像 、 並 び に さ ら に 酸性 緩 衝 液 で 洗 浄す る こ と で 細 胞 表 面 に 結 合 し た リ ボ ソ 一 ム を 除 去 し 、 細 胞 内 に 移 行 し た リ ボ ソ ー ム を 蛍 光 観 察 し た 像 を 示 す 。 図 中 、 a 〖ま 2 1 B 2 リ ボ ソ ー ム （ 酸 性 緩 衝 液 非 洗 浄 ） 、 b は 2 1 B 2 リ ボ ソ ー ム （ 酸 性 緩 衝 液 洗 浄 後 ） 、 c は 2 1 B 2 — T F リ ボ ソ ー ム （ 酸 性 緩 衝 液 非 洗 浄 ） 、 d は 2 1 B 2 — T F リ ボ ソ ー ム （ 酸 性 緩 衝 液 洗 浄 後 ） 、 e は T F リ ボ ソ ー ム （ 酸 性 緩 衝 液 非 洗 浄 ） 、 f は T F リ ボ ソ ー ム （ 酸 性 緩 衝 液 洗 浄 後 ） を 示 す 。 Fig. 3 shows the reactivity of each liposome to human gastric cancer cell line MKN45 cells and the internalization characteristics of each ribosome by fluorescence observation. This is the result (photograph) of the comparison. After the liposome was reacted with the cells under ice-cooling for 1 hour, washed, and then further reacted at 37 ° C for 1 hour, the fluorescence observation images at the point when the cells were further reacted at 37 ° C for 1 hour, Further, the ribosome bound to the cell surface is removed by washing with an acidic buffer, and the ribosome transferred into the cell is subjected to fluorescence. The observed image is shown. In the figure, a and b are 2 1 B 2 ribosomes (without washing with an acid buffer) and b are 2 1 B 2 ribosomes (with an acid buffer). C is 21 B 2-TF ribosome (without washing with acid buffer), d is 21 B 2-TF ribosome (with acid buffer) E) indicates TF ribosome (without washing with an acid buffer), and f indicates TF ribosome (after washing with an acid buffer).

第 4 図 は 、 ヒ ト 骨 芽 細 胞 系 腫 瘍 細 胞 株 K 562へ の 各 リ ボ ソ ー ム の 反 応 性 を 表 す フ ロ ー サ イ ト メ 一 タ ー 測 定 結 果 を 表 す 図 図 中 縦 軸 は フ ロ ー サ イ ト メ 一 タ ー の 蛍 光 シ フ ト （ 細 胞 に 結 合 し た リ ボ ソ ー ム 量 ） ヒ ス ト グ ラ ム の 平 均 値 を 示 す n e g a は リ ボ ソ ー ム と 反 応 さ せ て い な い 細 胞 の み の 値 を 、 T F — は P E G 非 修 飾 T F リ ボ ソ ー ム を 、 T F + は P E G 修 飾 T F リ ボ ソ ー ム を 、 2 1 B 2 T F — は P E G 非 修 飾 2 1 B 2 — T F リ ポ ソ — ム を 、 2 1 B 2 T F + は P E G 修飾 2 1 B 2 — T F リ ポ ソ 一 ム を 示 す 。 発 明 を 実 施 す る た め の 最 良 の 形 態  Fig. 4 shows the results of flow cytometer measurements showing the response of each ribosome to human osteoblastic tumor cell line K562. The vertical axis in the figure shows the fluorescence shift (amount of ribosome bound to the cells) of the flowmeter, and the average value of the histogram. Nega is the value of only those cells that do not react with the ribosome, TF — is the PEG unmodified TF ribosome, TF + is the PEG-modified TF ribosome. 21B2TF— indicates PEG-unmodified 21 B2—TF liposome, and 21B2TF + indicates PEG-modified 21B2—TF liposome. You Best form to carry out the invention

本 明 細 書 に お い て 、 微 粒 子 と は 分 子 中 に 親 水 性 部 分 及 び 疎 水 性 部 分 を 含 む 両 親 媒 性 分 子 の 会 合 に よ っ て 得 ら れ る ミ セ ル 、 高 分 子 ミ セ ノレ 、 マ イ ク ロ ス フ ェ ア 、 ェ マ ル ジ ヨ ン 、 リ ボ ソ ー ム 、 リ ボ ソ ー ム な ど の 二 分 子 膜 小 胞 体 を 重 合 し て 得 ら れ る 高 分 子 べ シ ク ル 等 が 挙 げ ら れ る カ S 、 好 ま し く は ミ セ ル で あ る 。  In this specification, microparticles are obtained by the association of amphipathic molecules containing a lyophilic part and a lyophobic part in the molecule. Weights double-cell membrane vesicles such as micelles, macromolecular micelles, microspheres, emajoryons, ribosomes and ribosomes. A polymer S, preferably a micelle, in which the resulting polymer vesicles and the like are obtained.

こ の よ う な ミ セ ル は 、 両 親 媒 性 物 質 か ら 構 成 さ れ る 小 球 、 楕 円 体 ま た は 長 い 円 筒 形 の 形 態 を 取 り う る 。 例 え ば 、 リ ボ ソ ー ム 、 n o V a s o m e 、 非 界 面 活 性 斉 IJ べ シ ク ル を 包 含 す る も の で あ る が 、 さ ら に 好 適 に 用 レヽ ら れ る の は リ ポ ソ ー ム で あ る 。 ミ セ ル を 構 成 す る 両 親 媒性 分 子 は 親 水 性 部 分 及 び 疎 水 性 部 分 を 含 み 、 そ れ 自 体 既 知 の 通 常 用 い ら れ る 方 法 に よ り ミ セ ル を 形 成 し 得 る も の で あ れ ば 如 何 な る も の で あ っ て も よ く 、 そ れ ら の 中 で 好 適 な 両 親 媒 性 物 質 と し て は 月旨 質 を 挙 げ る こ と 力； で き る 。 Such micelles can take the form of small spheres, ellipsoids or long cylinders composed of amphiphiles. For example, those containing ribosomes, no Vasosomes, and non-active IJ vesicles, but which are more suitably used. It is a liposome. The amphipathic molecules that make up the micelles contain a lyophilic and a lyophobic part, which is in a manner known per se and known in the art. Any substance that can form micelles can be used, and the preferred amphiphilic substance among these is lunar The power to raise quality.

本 発 明 に 係 る ミ セ ル を 構 成 し 得 る 脂 質 と し て は 、 例 え ば 天 然 レ シ チ ン （ 例 え ば 、 卵 黄 レ シ チ ン 、 大 豆 レ シ チ ン 等 ）ゃ ジ ノ ノレ ミ ト イ ル フ ォ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン （ D The lipids that can constitute the micelles of the present invention include, for example, natural lecithin (eg, egg yolk lecithin, soy lecithin, etc.). ) ゃ ゃ レ レ レ フ フ フ D D D D

P P C ) 、 ジ ミ リ ス ト イ ル フ ォ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン （ D M P C ) 、 ジ ス テ ア ロ イ ル フ ォ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン （ DPPC), Jimly Listed Firthile Collin (DMPC), Ghostly Foiled Fatigue Collin (D

S P C ) 、 ジ ォ レ オ イ ル フ ォ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン （ DSP C), Geo-oil Oil Fatigue Collin (D

〇 P C ) 、 ジ ノヽ ° ノレ ミ ト イ ル フ ォ ス フ ァ チ ジ ル ェ タ ノ 一 ル ァ ミ ン （ D P P E ) 、 ジ ォ レ オ イ ル フ ォ ス フ ァ チ ジ ル ェ タ ノ 一 ル ァ ミ ン （ D O P E ) 等 の リ ン 月旨 質 、 ス フ イ ン ゴ糖脂 質 、 グ リ セ 口 糖脂 質 等 の 糖 脂 質 、 リ ン 脂 質 、 コ レ ス テ ロ ー ル 、 旨 肪 酸 等 の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 誘 導 体 等 を 挙 げ る こ と が で き る 。 こ れ ら の 脂 質 は 単 独 ま た は 二 種 以 上 、 あ る い は こ れ ら と コ レ ス テ ロ ー ル 等 の 非 極 性 物 質 と 組 み 合 わ せ て 用 い ら れ る 。 さ ら に ス テ ァ リ ル ァ ミ ン 、 ジ セ チ ル フ ォ ス フ エ 一 ト 、 DC- Choiな ど の 荷 電性 物 質 、 マ レ イ ミ ド 基 を 有 す る リ ン 脂 質誘 導 体 ( 特 開 平 6 — 1 5 7 5 5 9 号 公 報 ） や P E G 先 端 に マ レ イ ミ ド 基 を 有 す る リ ン 脂 質 誘 導 体 （ 特 開 平 6 — 2 2 0 0 7 0 号公 報 ） 等 を 含 ん で レ、 て も 良 レ、 。 ま た 、 融 合 リ ボ ソ ー ム と し て 知 ら れ る リ ボ ソ ー ム と セ ン ダ イ ウ イ ノレ ス を 融 合 し た リ ボ ソ ー ム の ご と く ウ ィ ル ス の 一 部 あ る い は 全 部 を 組 み 込 ん だ も の で あ っ て も 良 レ、 。 〇PC), ヽ ヽ レ レ レ レ レ レ レ レ DP DP DP DP (DPPE), ォ オ フ フ フ DP 〇 DP DP Lumin substances such as luamine (DOPE), sugar lipids such as glycosphingolipids, glycephalic lipids, etc., phosphorus lipids, cholesterol, Polyethylene glycol inducers, such as fatty acids, can be mentioned. These lipids may be used alone or in combination of two or more, or in combination with nonpolar substances such as cholesterol. . In addition, charged substances such as stearamines, diacetyl phosphates, DC-Choi, etc., and phosphorus fats with maleimide groups Derivatives (Japanese Patent Publication No. 6-1575759) and Linoleic derivatives having a maleimide group at the end of PEG (Japanese Patent Publication No. 6-220) 070 public announcement), etc., and even better. In addition, most of the ribosomes, which are known as fused ribosomes, are combined with Sendai's Innoreless. It is okay if some or all of them are incorporated.

ミ セ ル 、 リ ポ ソ 一 ム は レ、 か な る 方 法 で 作 製 し た も の で も 良 い が 、 自 体 既 知 の 通 常 用 い ら れ る 製 造 技 術 を 用 い て 製 造 で き る ：: 例 え ば 、 ガ ラ ス 壁 に 付 着 さ せ た 脂 質 薄 膜 に 水 溶 液 を 加 え 機 械 的 震 と う を 加 え 形 成 す る マ ル チ ラ メ ラ リ ボ ソ ー ム （ M L V ) や 、 超 音 波 処 理 、 エ タ ノ ー ル 注 入 法 、 フ レ ン チ プ レ ス 法 に よ り 得 ら れ る ス モ — ル ュ ニ ラ メ ラ リ ボ ソ ー ム （ S じ V ) 、 界 面 活性 剤 除 去 法 、 逆 相 蒸 発 法 （ リ ボ ソ ー ム 砂 本 ら 南 江 堂 1 9 8 8 ) 、 M L V を 均 一 ボ ア 径 を 有 す る メ ン ブ ラ ン を 加 圧 し て 押 し 出 す イ ク ス ト ル ゥ 一 ジ ョ ン 法 等 か ら 得 ら れ る ラ ー ジ ュ 二 ラ メ ラ リ ポ ソ 一 ム （ L U V ) を 用 レヽ る こ と 力 で さ る ( L i po some Techno l ogy , Vo l . 1 2 n d e d i t i o n ) c The micelles and liposomes are made by such a method. However, it can be manufactured by using a known manufacturing technique known in the art: for example, a thin grease attached to a glass wall. Multi-lamellar vosor (MLV), which is formed by adding a water solution to the membrane and mechanically shaking it, as well as ultrasonic treatment and ethanol injection , Smo-Luni lamellar ribosome (SJV) obtained by the french-press method, removal of surfactant, and reverse-phase evaporation (Ribosome Sunamoto et al. 19988), an extruder that extrudes an MLV by pressing a membrane with a uniform bore diameter. It is possible to use the large-sized lamellar liposomes (LUVs) obtained from the Zion method or the like (Liposome Technology, Vol. 1 2 ndedition) c

さ ら に 本 発 明 の 別 の 微 粒 子 の 形 態 と し て 、 遺伝 子 と ポ リ ぺ プ チ ド か ら な る 複 合 体 、 遺 伝 子 と ボ リ べ プ チ ド と 脂 質 カゝ ら な る 複 合 体 、 あ る い は 遺 伝 子 と ポ リ べ プ チ ド と リ ボ ソ ー ム 力 ら な る 複 合 体 を 用 レ、 る こ と 力 S で き る 。  In addition, other microparticles of the present invention include a complex composed of a gene and a polypeptide, a gene composed of a polypeptide, a polypeptide, and a fatty acid. You can use a complex consisting of a complex, or a complex consisting of a gene, a polypeptide, and a ribosomal force.

本 発 明 に お い て 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド（ A ) と は 、 細 胞 表 面 に 存 在 す る タ 一 ゲ ッ ト 分 子 に 結 合 性 を 有 し 、 且 つ 、 実 質 的 に タ 一 ゲ ッ ト と す る 細 胞 へ は 取 り 込 ま れ る こ と の な い も の で あ り 、 具 体 的 に は 、 細 胞 表 面 に 存 在 す る 抗 原 に 対 す る 抗 体 、 E G F 、 V E G F 、 H G F 等 の 蛋 白 質 、 葉 酸 、 レ ク チ ン 、 糖 鎖 、 ビ タ ミ ン 等 カゝ ら 選 択 さ れ る が 、 好 ま し く は 抗 体 で あ る 。 ヒ ト に 治 療 に 用 レ、 る 場 合 、 ヒ ト キ メ ラ 抗 体 、 ヒ ト 化 抗 体 、 ヒ ト 抗 体 力 よ り 好 ま し く 用 レ、 ら れ る ：： 抗 体 は そ の 全 体 を 用 い て も よ く 、 ま た ペ プ シ ン 処 理 等 に よ っ て 得 ら れ る F ( a b ' ) 2 化 抗 体 等 の 抗 体 フ ラ グ メ ン ト 、 s c F V 等 の 抗 体 部 分 を 含 む ぺ プ チ ド を 用 レ、 て も 良 い ：： リ ガ ン ド （ A ) は 共 有 結 合 を 介 し て 微 粒 子 と 結 合 す る こ と 力 S で き る こ の 結 合 は い か な る 既 知 の リ ガ ン ド 結 合 法 を 用 い て も 良 く カ ル ポ ジ イ ミ ド 法 、 マ レ イ ミ ド 法 、 過 ヨ ウ 素 酸 法 、 等 を 用 レ、 る こ と 力 で き る 。 In the present invention, the cell-bound ligand (A) has a binding property to a target molecule present on the cell surface. However, they are not actually taken up by cells that are actually targets, and specifically exist on the cell surface. The antibody is selected from proteins such as EGF, VEGF, HGF, etc., folate, lectin, sugar chains, vitamins, etc., which are preferred. It is an antibody. When used for treatment in humans, it is more preferable to use the anti-human chimera antibody, the humanized antibody, and the human anti-body strength :: Antibody fragments, such as F (ab ') 2 conjugated antibodies, obtained by pepsin treatment, etc., and scFV can be used as a whole.ぺ You may use a peptide containing an antibody part such as: Ligand (A) can be combined with fine particles via covalent bond and the force S can be any known bond bonding method. It is possible to use the carbodiimide method, maleimide method, periodate method, etc.

リ ボ ソ ー ム 、 ミ セ ノレ 等 に 組 み 込 む 場 合 は リ ガ ン ド ( A ) に 脂 質 を 導 入 し そ の 部 分 を 介 し て 導 入 す る 方 法 ( P N A S 8 7 ( 1 9 9 0 ) 5 7 4 4 ) 等 を 用 レヽ て も 良 レヽ 。  When installing in a ribosome, miso-nore, etc., a method of introducing fat into the ligand (A) and introducing it through that part (PNAS 87 (199 0) 5 7 4 4) and so on.

ま た 、 リ ガ ン ド （ A ) に チ オ ー ル 基 等 の 活 性 基 を 導 入 し 、 他 方 リ ボ ソ ー ム 等 の 微 粒 子 に マ レ イ ミ ド 基 、 ピ リ ジ ル ジ ス ル フ ィ ド 基 等 の 基 を 導 入 後 、 両 者 を 反 応 す る こ と で 固 定 化 す る 方 法 （ 特 開 平 4 一 3 4 6 9 1 8 号 公 報 、 特 開 昭 5 8 — 1 3 4 0 3 2 号公 報 、 C a n c e r R e s . 4 7 4 4 7 1 ( 1 9 8 7 ) ) 等 を 用 レヽ る こ と も で き る 。  Also, an active group such as a thiol group is introduced into the ligand (A), and a maleimid group or a pyridyl group is added to fine particles such as a ribosome. After introducing a base such as a disulphide group, a method of fixing the two by reacting them (Japanese Patent Publication No. Heisei 4-3146918) It is also possible to use publications such as the public notice of No. 58-134 3 32, Cancer Res. 4 7 4 4 7 1 (1 987)).

リ ガ ン ド （ A ) は 直 接 微 粒 子 に 結 合 さ せ る か 、 ス ぺ — サ 一 部 分 を 介 し て 微 粒 子 に 結 合 さ せ る か 、 又 は 、 そ の 両 タ イ プ の 結 合 に よ る も の 、 の い ず れ で も よ い が 、 通 常 、 実 質 的 に 全 て の リ ガ ン ド が ス ぺ 一 サ 一 を 介 し て 結 合 し た も の 力'； 好 ま し レ、 。 こ の ス ぺ ー サ 一 と し て は 、 通 常 、 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド 、 ポ リ ビ ニ ル ピ ロ リ ド ン 、 ポ リ ア ミ ノ 酸 、 ポ リ 乳 酸 、 ボ リ グ リ セ リ ン 、 ポ リ ダ リ コ 一 ル 酸 、 多 糖 類 、 ま た は 、 ポ リ ア ル キ レ ン グ リ コ 一 ル の 誘 導 体 等 の 水 溶 性 高 分 子 が 代 表 的 に 挙 げ ら れ る が 、 好 ま し く は ボ リ ア ル キ レ ン グ リ コ ー ル 、 特 に 、 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル （ P E G ) 誘 導 体 で あ る 。 リ ガ ン ド ( A ) を 水 溶 性 高 分 子 を 介 し て 微粒 子 に 結 合 さ せ る こ と に よ り 、 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド （ A ) の 標 的 細 胞 へ の 結 合 性 を 十 分 に 保 持 で き る 。 The ligand (A) may be directly bonded to the fine particles, or may be bonded to the fine particles through a part of the spacer, or may be connected to the fine particles. Normally, virtually all of the legs are joined together through a splicer, either by joining the types or by combining them. The power of '; These spacers are usually polyacrylamide, polyvinylpyrrolidone, polyamino acid, polylactic acid, and polylactic acid. Water-soluble polymers such as glycerin, poly (colic acid), polysaccharides, or poly (alkylene glycol) derivatives are typical. As mentioned above, it is preferably a polyalkylene glycol, especially a polyethylene glycol (PEG) inducer. . By binding the ligand (A) to the microparticles through a water-soluble polymer, the ligand (A) having a binding property to the cells can be obtained. Mark The binding to target cells can be sufficiently maintained.

ス ぺ 一 サ 一部 分 を 介 し て 結 合 す る 方 法 と し て は 、 例 え ば 、 特 開 平 6 — 1 2 6 1 5 2 号 公 報 、 特 開 平 6 — 2 2 0 0 7 0 号 公 報 、 B B A 1 2 3 9 ( 1 9 9 5 ) 1 3 3 等 に 開 示 さ れ る 方 法 を 用 レ、 る こ と 力； で き る 特 に 好 ま し く は 特 開 平 1 1 一 1 5 2 2 3 4 号 に 示 さ れ る P E G 誘 導 体 を 用 い た 方 法 で あ る 。 ス べ 一 サ 一 の 分 子 量 は 5 0 0 カゝ ら 5 0 0 0 0 程 度 が 用 い ら れ る が 、 好 ま し く は 1 0 0 0 力 ら 1 0 0 0 0 程 度 で あ り 、 よ り 好 ま し く は 2 0 0 0 力 ら 6 0 0 0 程 度 で あ る 。  As a method of joining through a part of the spacer, for example, Japanese Patent Laid-Open Publication No. 6-126206, Japanese Patent Publication No. 6-220 Use the methods disclosed in the 70 bulletin, BBA 1 239 (1995) 1 33, etc., in particular; This is a method using the PEG derivative shown in JP-A-11-152. The molecular weight of the prober is about 500 to 500, but preferably about 100 to 100. Yes, more preferably about 20000 to 60000.

リ ガ ン ド （ A ) は 、 微 粒 子 の 脂 質 重 量 の 0 . 1 % か ら 2 0 % ( W / W ) を 結 合 す る こ と 力 S で き る 。 好 ま し く は 0 . 5 力 ら 1 0 % で あ り 、 よ り 好 ま し く は 1 力 ら 5 % で あ  The ligand (A) can exert a force S that combines 0.1% to 20% (W / W) of the fat mass of the fine particles. Preferably, it is 0.5 to 10% and more preferably 1 to 5%.

本 発 明 で タ ー ゲ ッ ト 細 胞 へ の 取 り 込 み 活 性 の あ る リ ガ ン ド （ B ) と は 、 タ — ゲ ッ ト と す る 細 胞 へ 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る も の で あ れ ば 如 何 な る も の で も 良 い が 、 E G F レ セ プ タ ー 、 ト ラ ン ス フ コ： リ ン レ セ プ タ 一 、 H G F レ セ プ タ ー 等 に 対 す る 抗 体 、 そ の 抗 体 フ ラ グ メ ン ト 、 そ の 一 部 を 含 む ぺ プ チ ド 等 の 抗 体 由 来 物 質 、 ト ラ ン ス フ エ リ ン 、 E G F 、 H G F 、 F G F 、 T G F 等 の 蛋 白 質 、 マ ン ノ ー ス 糖 の 糖 、 L P S 等 の 複 合 糖 質 、 L D L 等 の 脂 質 、 葉 酸 等 の 低 分 子 化 合 物 （ 好 ま し く は 分 子 量 4 0 0 程 度 ） 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン 、 ガ ス ト リ ン 、 メ ラ ノ サ ィ ト 刺 激 ホ ル モ ン 等 の ホ ル モ ン 、 E G F 、 H G F 、 F G F 、 イ ン シ ュ リ ン 等 の 増 殖 因 子 等 が 挙 げ ら れ る カ 、 好 ま し く は 抗 体 由 来 物 質 あ る レヽ ίま ト ラ ン ス フ エ リ ン で あ り 、 更 に 好 ま し く は ト ラ ン ス フ ヱ リ ン で あ る 。 Incorporation into target cells In the present invention, an active ligand (B) is a machine that is incorporated into a cell that is a target. Any EGF receptor, transfucco: lin receptor, HGF receptor can be used as long as it has the function.ー Antibodies to, etc., their antibody fragments, including some of them ぺ Substances derived from antibodies, such as peptides, transphenylene, EGF , Proteins such as HGF, FGF, TGF, etc .; sugars of mannose sugar; complex saccharides such as LPS; lipids such as LDL; and low molecular compounds such as folic acid (preferred). Is a molecular weight of about 400), estrogen, gastrin, melanosite stimulating hormone, etc., hormones, EGF, HGF, FGF, Insi It is a mosquito in which the growth factors such as urin are listed, and is preferably a trans-ferrin with a substance derived from an antibody, and is even more preferable. Is a translator .

リ ガ ン ド （ B ) は 上 述 リ ガ ン ド ( A ) と 同 様 に し て 微 粒 子 に 結 合 す る こ と が で き る が 、 ス ぺ ー サ ー を 介 す る こ と な く 直 接 微 粒 子 に 結 合 す る こ と 力 S 好 ま し レヽ ΰ リ ガ ン ド （ B ) は 、 微 粒 子 の 月旨 質 重 量 の 0 . 1 % か ら 2 0 % ( W Z W ) を 結 合 す る こ と 力 S で き 、 好 ま し く は 0 . 5 力 ら 1 0 % で あ り 、 よ り 好 ま し く は 1 力 ら 5 % で あ る じ Ligand (B) can be bound to the microparticles in the same manner as the above-mentioned ligand (A), but via a spacer. The direct binding to the microparticles, and the force S preferred, is from 0.1 % to 20 % of the lunar mass of the microparticles (B). WZW) can be combined with a force S, preferably from 0.5 to 10%, and more preferably from 1 to 5%.

微 粒 子 に は リ ガ ン ド に カ [1 え て 水 溶 性 高 分 子 （ C ) を 結 合 さ せ る こ と 力； で き る 。 こ の 水 溶 性 高 分 子 （ C ) と し て は 、 前 記 ス ベ ー サ 一 と し て 用 い ら れ る 水 溶 性 高 分 子 と 同 様 に 、 ボ リ ア ク リ ル ア ミ ド 、 ポ リ ビ ニ ル ピ ロ リ ド ン 、 ポ リ ア ミ ノ 酸 、 ポ リ 乳 酸 、 ポ リ グ リ セ リ ン 、 ポ リ グ リ コ ー ル 酸 、 多 糖 類 、 ポ リ ア ノレ キ レ ン グ リ コ ー ノレ の 誘 導 体 等 の 水 溶性 高 分 子 が 挙 げ ら れ る 力； 、 好 ま し く は ポ リ ア ル キ レ ン グ リ コ 一 ノレ 、 特 に 、 ボ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル （ P E G ) 誘 導 体 で あ る , 水 溶 性 高 分 子 （ c ) は 前 記 ス ぺ 一 サ 一 と し て 用 い る 水 溶 性 高 分 子 と 同 一 種 類 の 高 分 子 で も 異 な る 種 類 の 高 分 子 で も よ レ、 。 た だ し 、 ス ぺ ー サ 一 と し て 用 い る 水 溶 性 高 分 子 は リ ガ ン ド 及 び 微 粒 子 の 両 方 に 結 合性 を 有 す る 機 能 が 必 要 な の に 対 し 水 溶 性 高 分 子 （ C ) は リ ガ ン ド と 結 合 性 を 有 さ な レヽ こ と が 必 要 で あ る 微 粒 子 に リ ガ ン ド （ A ) を 水 溶 性 高 分 子 を 介 し て 結 合 さ せ る と 微 粒 子 リ ガ ン ド 複 合 体 を 効 率 よ く 標 的 細 胞 に 結 合 す る こ と が で き る 効 果 が あ る が リ ガ ン ド と 結 合 性 を 有 さ な レ、 水 溶性 高 分 子 （ C ) を 微 粒 子 に 結 合 さ せ る こ と に よ り 、 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド （ B ) の 非 特 異 的 結 合 を 低 減 す る と レ、 う 効 果 が 生 じ 、 生 体 内 で の 安 定 性 の 改 善 が 期 待 さ れ る 。 Fine particles can be combined with a water-soluble polymer (C) in addition to a ligand. This water-soluble polymer (C) is the same as the water-soluble polymer used as the aforementioned spacer, and is a polyacrylamide. , Polyvinylpyrrolidone, polyamino acid, polylactic acid, polyglycerin, polyglycolic acid, polysaccharides, polyphenols The ability to raise water-soluble polymers such as dielectric conductors; preferably, polyalkylene glycol, especially The water-soluble polymer (c), which is a derivative of polyethylene glycol (PEG), is the same as the water-soluble polymer used as a spacer. It is possible to use the same kind of macromolecules or different kinds of macromolecules. However, the water-soluble polymer used as a spacer must have a function that binds to both the ligand and the fine particles. On the other hand, the water-soluble polymer (C) is used to disperse the ligand (A) into fine particles that need to be capable of binding to the ligand. Bonding through a child can effectively bind the fine particle-ligand complex to target cells, but it has the effect of using a ligand. By binding water-soluble polymer (C) to microparticles, which is not capable of binding to metal, it has the function of being incorporated into cells. Reduce non-specific binding of the ligand (B) As a result, an effect is produced, and improvement in stability in living organisms is expected.

水 溶 性 高 分 子 （ C ) の 分 子 量 は 5 0 0 力 ら 5 0 0 0 0 程 度 が 用 い ら れ る 力； 、 好 ま し く は 1 0 0 0 力 ら 1 0 0 0 0 程 度 で あ り 、 よ り 好 ま し く は 2 0 0 0 力 ら 6 0 0 0 程 度 で あ る 。  The molecular weight of the water-soluble polymer (C) is in the range of about 500 to about 500,000, preferably about 100,000. It is about 0, and more preferably about 20000 to about 60000.

こ の 水 溶 性 高 分 子 （ C ) は 、 リ ガ ン ド を 微 粒 子 に 結 合 後 導 入 す る こ と も 、 ま た リ ガ ン ド と 同 時 に 導 入 す る こ と ち で き る 。 例 え ば 、 微 粒 子 と し て リ ボ ソ ー ム を 用 い る 場 合 、 特 開 平 4 — 3 4 6 9 1 8 号 公 報 に 開 示 さ れ て レヽ る よ う に マ レ イ ミ ド 基 を 導 入 し た リ ボ ソ ー ム に チ ォ ー ノレ 基 を 導 入 し た リ ガ ン ド を 結 合 後 、 さ ら に チ ォ ー ル 基 を 有 す る ポ リ ア ル キ レ ン 部 分 を 含 む 化 合 物 （ P E This water-soluble polymer (C) can be introduced either after the ligand is bonded to the fine particles or at the same time as the ligand. it can . For example, if RevoSom is used as microparticles, as disclosed in the official gazette of Japanese Patent Publication No. 4-346991, After combining a ligand with a chonole group to a ribosome with a mid group, a polyalkyl with a further carbon group is bonded. Compound containing len component (PE

G 誘 導 体 ） を 結 合 す る こ と で リ ガ ン ド と P E G を 付 与 す る こ と 力 で き る 。 ま た 、 リ ガ ン ド の 脂 質 誘 導 体 及 び 、 P E G の 脂 質 誘 導 体 を 同 時 に 用 い 界 面 活 性 剤 除 去 法 に よ り リ ポ ソ 一 ム を 形 成 す る こ と で リ ガ ン ド と P E G を 付 与 し た リ ポ ソ 一ム を 作 製 す る こ と も で き る 。 G inducer) can be used to give the leg and PEG. In addition, the lipid derivative of the ligand and the lipid derivative of PEG are used at the same time to form the liposome by the method of removing the surfactant. This makes it possible to create a liposome with a ligand and PEG.

微 粒 子 に 水 溶 性 高 分 子 を 介 し て 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド （ A ) を 結 合 さ せ 、 カゝ つ 、 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド （ B ) を 結 合 さ せ 、 さ ら に 、 微 粒 子 を 水 溶 性 高 分 子 （ C ) で 修 飾 す る 場 合 は 、 あ ら カゝ じ め リ ガ ン ド （ A ) と 水 溶 性 高 分 子 の 複 合 体 を 製 造 し て お き 、 こ の 複 合 体 、 リ ガ ン ド （ B ) 、 及 び 水 溶 性 高 分 子 （ C ) を 各 々 微 粒 子 に 結 合 さ せ る こ と が 好 ま し レヽ ま た 、 こ の リ ガ ン ド （ A ) と 水 溶 性 高 分 子 の 複 合 体 、 リ ガ ン ド （ B ) 、 及 び 水 溶性 高 分 子 （ C ) を 微 粒 子 に 結 合 さ せ る 場 合 は 、 前 記 複 合 体 の 高 分 子 部 分 、 リ ガ ン ド （ B ) 、 及 び 水 溶 性 高 分 子 （ C ) に 微 粒 子 と 結 合 し 得 る 官 能 基 を 導 入 し た 後 、 こ れ ら と 微 粒 子 を 反 応 さ せ る こ と が 好 ま し レ、 = 特 に 、 微 粒 子 が リ ボ ソ ー ム で あ る 場 合 に 、 こ の 方 法 が 好 ま し レ、 c The particles (A), which are capable of binding to cells, are bound to the cells via the water-soluble polymer, and are incorporated into the cells. When combining functionally capable ligands (B) and further modifying the microparticles with water-soluble polymers (C), it is no longer necessary. First, a complex of the ligand (A) and the water-soluble polymer is manufactured, and the complex, the ligand (B), and the water-soluble polymer ( It is preferable to bind each of the C) to the microparticles, and it is preferable that the ligand (A) and a complex of the water-soluble polymer and the ligand ( In the case where B) and the water-soluble polymer (C) are bound to the fine particles, the polymer component of the above-mentioned complex must be used. After introducing a functional group capable of binding to the fine particles into the ligand (B) and the water-soluble polymer (C), the fine particles are reacted with the fine particles. so that this and is good or Shi Le, = in particular, to Oh Ru If fine-grain child is in Li Bo source over-time, people of this method is Shi good or Les, c

水 溶 性 高 分 子 （ C ) は 微 粒 子 の 脂 質 重 量 に 対 し て 2 力 ら 1 0 0 % 、 好 ま し く は 3 力 ら 5 0 % 、 よ り 好 ま し く は 5 力 ら 1 0 % で 用 レ、 る こ と 力 S で き る 。  The water-soluble polymer (C) is 2 to 100%, preferably 3 to 50%, more preferably 5 to 5, based on the fat mass of the fine particles. The force S can be used at 10% of the force.

本 発 明 の 微 粒 子 中 に は 、 通 常 、 医 薬 品 又 は 診 断 用 薬 剤 を 包 含 す る こ と が 望 ま し レ、 が 、 こ の 微 粒 子 に 導 入 で き る 医 薬 品 と し て は 、 例 え ば 、 ア ド リ ア マ イ シ ン 、 ダ ウ ノ マ イ シ ン 、 ビ ン ブ ラ ス チ ン 、 シ ス ブ ラ チ ン 、 5 — F U 等 の 抗腫 瘍 剤 、チ モ ー ル 等 の ァ ド レ ナ リ ン 遮 断 薬 、 ク ロ 二 ジ ン 等 の 高 血 圧 剤 、 プ ロ 力 イ ン 等 の 制 吐剤 、 ク 口 口 キ ニ ー ネ 等 の 抗 マ ラ リ ァ 剤 、 並 び に そ の 薬 学 的 に 許 容 し う る 塩 及 び誘 導 体 、 リ シ ン A 鎖 や ジ フ テ リ ア ト キ シ ン 等 の 毒 素 蛋 白 質 及 び こ れ ら を コ ー ド す る 遺 伝 子 、 k - r a s 等 の ア ン チ セ ン ス 、 H S V — T K や P 5 3 、 Usually, it is desired that the microparticles of the present invention contain a drug or a diagnostic agent, but the microparticles can be introduced into the microparticles. Pharmaceutical products include, for example, anti-adriamycin, downomycin, vinblastine, cis-bratin, and 5-FU. Tumor agents, adrenerin-blocking drugs such as Timol, high blood pressure drugs such as clodinine, antiemetic drugs such as proline, quinone mouth quinine, etc. Anti-malarial agents, their pharmaceutically acceptable salts and derivatives, and toxic proteins such as ricin A chain and diphtheria toxin Quality and the genes that code for them, antisense such as k-ras, HSV—TK and P53,

T N F 、 G M — C S F 等 を コ ー ド す る 遺 伝 子 並 び に そ の 遺 伝 子 と ボ リ リ ジ ン 等 の ボ リ カ チ オ ン と の 複 合 体 及 び誘 導 体 、 ョ 一 ド 、 レ ニ ウ ム 、 イ ッ ト リ ウ ム 等 の 放 射 性 同 位 元 素 、 Sodium Borocaptate等 の 中 性 子 捕 捉 療 法 用 化 合 物 が 挙 げ ら れ る 。 TNF, GM — Genes encoding CSF, etc., as well as complexes and inducers of such genes with polycations such as poly- lysines, etc. Radioactive isotopes such as de, linium, and yttrium, and compounds for neutron capture therapy, such as sodium borocaptate, are mentioned.

微 粒 子 に 導 入 し 得 る 診 断 用 薬 剤 と し て は 、 例 え ば 、 ョ 一 ド 、 イ ン ジ ュ 一 ム 、 テ ク ネ シ ュ 一 ム 等 の 放 射 性 同 位 元 素 、 ガ ド リ ニ ュ 一 ム 等 の 造 影 剤 、 ユ ー ロ ピ ュ ー ム 等 の 蛍 光 体 等 が 挙 げ ら れ る 。  Examples of diagnostic agents that can be introduced into microparticles include radioactive isotopes such as, for example, rods, indiums, and technicians. And contrast agents such as gadolinium, and phosphors such as europium.

こ れ ら 医 薬 品 及 び診 断 用 薬 剤 の 微 粒 子 へ の 導 入 は 、 そ れ 自 体 既 知 の 通 常 用 い ら れ る 方 法 で 行 う こ と が で き る = 例 え ば 、 リ ボ ソ ー ム で あ る 場 合 は 、 リ ボ ソ ー ム 形 成 時 に 水 溶 液 と し て 添 力 B し て 封 入 し て も 良 く 、 ま た リ ポ ソ 一 ム 形 成 後 べ シ ク ル 内 外 に p H 勾 配 等 の 濃 度 勾 配 を 形 成 さ せ 、 こ の ポ テ ン シ ャ ル を 駆 動 力 と し て イ オ ン 化 可 能 な 薬 剤 を 取 り 込 ま せ る 方 法 （ Cancer Res. 49_ 5 922 ( 1989 ) , BBA45.5, 269 ( 1976 ) ) を 用 レヽ て ち 良 レヽ 。 The introduction of these drugs and diagnostic agents into the microparticles can be carried out in a manner known per se and used in the usual manner. That = For example if, Oh Ru If in Li Bo Seo over-time is to seal entry and added force B as a water soluble liquid when Li Bo source over the domed formed also rather good, or Li Po After the formation of the som, it is possible to form a concentration gradient such as a pH gradient inside and outside the bicycle, and use this potential as a driving force to ionize. A method for incorporating a variety of drugs (Cancer Res. 49_5 922 (1989), BBA 45.5, 269 (1976)).

実 施 例 Example

以 下 、 実 施 例 に よ り 本 発 明 を さ ら 具 体 的 に 説 明 す る が 、 本 発 明 の 範 囲 は 以 下 の 実 施 例 限 定 さ れ る こ と は な い c 実 施 例 Hereinafter, but you are al tool body to explain the Ri this onset Akira by the implementation of example, the present onset Ming range is c real not name a child that will be the implementation example limit constant of the following Examples

5 0 m M リ ン 酸 緩 衝 液 1 m M E D T A ( p H 7 . 0 ) に 溶 解 し た 抗 C E A マ ウ ス モ ノ ク ロ ナ 一 ル 抗 体 2 Anti-CEA mouse monoclonal antibody dissolved in 50 mM phosphoric acid buffer 1 mM EDTA (pH 7.0) 2

1 B 2 ( I g G 1 F ( a b ' ) 2 ) 2 . 8 6 m g / m 1 2 . 1 5 m l 6 . l m g に 特 開 平 1 1 1 51 B 2 (Ig G 1 F (ab ') 2) 2.86 mg / m 1 2.15 m l 6.

2 2 3 4 号 記 載 の P E G 誘 導 体 （ A c — S — P E G — S u e ) 3 0 m g / m l を 添 力 tl し た 。 特 開 平 1 1 — 1 5 2 2 3 4 号 記 載 の P E G 誘 導 体 （ A c 一 S — P E G — S u c ) は 、 以 下 の 方 法 で 合 成 し た 。The PEG derivative (Ac-S-PEG-Sue) described in 22 3 4 was added with 30 mg / ml. The PEG derivative (Ac-S-PEG-Suc) described in JP-A No. 1- 1 5 2 2 3 4 was synthesized by the following method.

< A c - S - P E G — S u e の 製 造 方 法 〉 <Manufacturing method of Ac-S-PEG-Sue>

塩 化 メ チ レ ン 1 0 m 1 に 溶 解 し た ボ リ （ エ チ レ ン グ リ コ ー ル ） 一 ビ ス - - ω ア ミ ノ 一 ひ 一 カ ル ボ キ シ ル（ Ρ Polyethylene (ethylene glycol) dissolved in 10 ml of salted methyl chloride One-vis--ω Amino one-carboxyl (（

E G 平 均 分 子 量 3 4 0 0 、 S h e a r w a t e r p oE G average molecular weight 3 4 0 0, S he a r w a t e r p o

V m e r s , I n c ) 1 g に S ァ セ チ ル チ オ ダ リ コ ノレ 酸 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド エ ス テ ル （ SV m ers, Inc) 1 g of S acetylthiodolinic olenoic acid N — hydroxysuccinimide ester (S

1 g m a 社 ） 7 4 . 8 m g 及 び ト リ ェ チ ル ァ ミ ン 4 1 μ 1 を 添 力 Q し た ：， 撹 拌 し 溶 解 後 、 さ ら に 1 0 m g の S — ァ セ チ ル チ オ グ リ コ ー ル 酸 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド を 添力 B し 室 温 で 3 . 5 時 間 撹 拌 し 反 応 し た 。 反 応 進 行 は T L C ( ク ロ 口 ホ ル ム Z メ タ ノ 一 ノレ = 8 5 Z 1 5 、 ョ 一 ソ 発 色 、 以 下 T L C は 同 様 の 条 件 で 行 っ た ） で 添カ卩 し た ポ リ （ エ チ レ ン グ リ コ 一 ル ） 一 ビ ス 一 ω _ ァ ミ ノ 一 α — 力 ノレ ボ キ シ ル の 低 R f の ス ポ ッ 卜 が 高 R f ( 約 0 . 6 ) に シ フ ト す る こ と で 確 認 し た 。 74.8 mg and Triethylamine 41 μ 1 was added Q: After stirring and dissolving, an additional 10 mg of S—acetylthioglycolic acid N—hydroxysuccinyl ion was added. The medium was added to the mixture and stirred at room temperature for 3.5 hours to react. The reaction proceeded by TLC (cloth holm Z methano-no-no = 85 Z15, color development, hereinafter TLC was carried out under the same conditions). the Po Li (d Ji Les in g Li co-one Lumpur) one bi scan one ω _ § Mi Roh one α - force Norre ball key Shi Le of low R f of the scan pop I high R f (about 0. It was confirmed by shifting to 6).

窒 素 下 に 溶 媒 を 留 去 し た 反 応 物 に ク 口 口 ホ ル ム 1 0 m 1 を 添カ卩 し 溶 解 し た 。 ク ロ 口 ホ ル ム で 膨 潤 し た s e p - p a k ( S I L I C A P L U S W a t e s 社 ） に 添 力卩 し ク 口 口 ホ ル ム / メ タ ノ 一 ル （ 4 Z l ( v Z v ) ) で 溶 出 す る こ と で サ ン プ ル を 前 処 理 し た 。 再 び 窒 素 下 に 溶 媒 を 留 去 し ク ロ ロ ホ ル ム に 溶 解 後 、 シ リ カ ゲ ル 力 ラ ム ( ロ ー ノく 一 カ ラ ム L i C h r o p r e p S i 6 0 2 5 X 3 1 0 m m 関 東 化 学 ） に 添 カ卩 し た 。 ク ロ ロ ホ ル ム で 洗 ^" 後 、 ク ロ 口 ホ ル ム Z メ タ ノ ー ル （ 8 5 / 1 5 ( V / V ) ) で 展 開 溶 離 し T L C の R f が 約 0 . 6 の 主 生 成 物 を ブ ー ル し 精 製 し た = 窒 素 下 に 溶 媒 を 留 去 し 5 8 3 m g を 得 た 。 5 4 3 m g を 約 2 m l の 脱 水 し た 塩 化 メ チ レ ン に 溶 解 し ジ ェ チ ル ェ 一 テ ル を 加 え 沈 殿 化 し 濾 取 し 真 空 ポ ン プ で 減 圧 乾 燥 し た 。 脱 水 し た 塩 化 メ チ レ ン 5 m 1 に 溶 角 ¥ し た の ち 、 N — ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド （ S i g m a 社 ） 1 7 . 8 m g を カロ え 1 0 分 間 撹 拌 し た 。 The reaction mixture from which the solvent had been distilled off under nitrogen was added with 10 ml of porcine mouth and dissolved in the mixture. Apply to sep-pak (SILICAPLUSWates) swollen with black mouth holm and elute with black mouth holm / metanol (4Zl (vZv)) Pre-processed the sample. After distilling off the solvent under nitrogen again and dissolving it in chloroform, the silica gel power ram (Rho-no-Chararam Li Chroprep S i 60 250) X 310 mm (Kanto Kagaku). After washing with chloroform ^ ", it is spread and eluted with chromium mouth Z metal (85/15 (V / V)), and the Rf of TLC is about 0. and Bed Lumpur 6 of the main raw formed product Shi distilled off the solvent medium under a = nitrogen was made fine to give a 5 8 3 mg. 5 4 3 mg of dehydrated salt of menu about 2 ml Dissolved in styrene, added dimethyl ether, precipitated, collected by filtration, reduced in pressure with a vacuum pump, and dried to dryness. After melting angle of 1, 17.8 mg of N-hydroxysuccinimide (Sigma) was calorie and stirred for 10 minutes.

さ ら に N ， N ' — ジ シ ク ロ へ キ シ ル カ ル ボ ジ イ ミ ド 3 1 . 9 m g を 添 加 し 窒 素 雰 囲 気 下 、 撹 拌 しつ つ 室 温 で 一 夜 反 応 し た 。 沈 殿 物 を 濾 別 後 、 窒 素 下 に 溶 媒 を 留 去 し 少 量 の 脱 水 塩 化 メ チ レ ン に 溶 解 し た ： ェ チ ル ェ 一 テ ル を 加 え 析 出 し た 沈 殿 を 濾 取 し 真 空 ポ ン プ で 減 圧 乾 燥 し T L C で 単 一 な 下 記 構 造 式 の 目 的 物 3 3 7 m g を 取 得 し た 。 1 H — N M R に よ り 目 的 物 生 成 を 確 認 し た 。 Further, add N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (31.9 mg) and stir at room temperature with stirring under a nitrogen atmosphere. I responded. After filtering off the precipitate, the solvent was distilled under nitrogen. Dissolved in a small amount of dehydrated methylated methylene: added ethyl acetate, filtered the precipitate, dried under reduced pressure with a vacuum pump, and dried. By TLC, 3337 mg of a single target substance having the following structure was obtained. 1 H - it was a by Ri eyes mono students become NMR to confirm.

Figure imgf000017_0001
、い- 刖 述 抗 C E A 抗 体 に 本 P E G 誘 導 体 を 力 D え 、 2 5 =C で 1 時 間 反 応 後 0 . 1 M 酢 酸 3 . 2 m 1 を 添カ卩 し た 。 0 . 1 M 酢 酸 緩 衝 液 （ p H 4 ) で 平 衡 化 し た S P セ フ ァ ロ ■ "~ ス （ 2 m l b e d ノ (こ 負 荷 し 、 同 緩 衝 液 で 洗 浄 後 、 5 0 m M y ン 酸 緩 衝 液 1 m M E D T A ( p
Figure imgf000017_0001
The PEG derivative was added to the anti-CEA antibody described above, reacted with 25 = C for 1 hour, and added with 3.2 ml of 0.1 M acetic acid. SP Sepharose (2 mlbed) (equilibrated with 0.1 M acetic acid buffer (pH 4)) (After loading with this buffer and washing with the buffer, mM Myonic acid buffer 1 m MEDTA (p

H 7 . 5 ) で 溶 出 し た 。 P D — 1 0 カ ラ ム で 緩 衝 液 をH 7.5). Absorb buffer solution with P D — 10 column

5 0 m M リ ン 酸 緩 衝 液 1 m M E D T A ( p H 7 . 0 ) に 交 換 し た 後 、 1 Z 9 容 量 の ヒ ド ロ キ シ ル ァ ミ ン 溶 液 （ 0 . 5 M ヒ ド ロ キ シ ル ア ミ ン 、 0 . 5 M H E P E S 、 2 5 m M E D T A 、 ( P H 7 . 0 ) ) を 加 え 2 5 。C 1 0 分 間 反 応 し 脱 ァ セ チ ル す る こ と で チ ォ ー ル 基 を 付 加 し た 抗 体 を 作 製 し た 。 再度 P D _ 1 0 で 緩 衝 液 を 0 . ： L M リ ン 酸 緩 衝 液 L m M E D T A ( p H 6 . 0 ) に 交 換 し リ ポ ソ 一 ム へ の 結 合 に 供 し た c After replacing with a 50 mM phosphoric acid buffer solution (1 mM MEDTA (pH 7.0)), add 1Z9 volume of a hydroxylamine solution (0.5M solution). 25 plus Droxylamine, 0.5 MHEPES, 25 mMEDTA, (PH 7.0)). By reacting for 10 minutes and deacetylating, an antibody to which a thiol group was added was produced. 0 gentle shock fluid in PD _ 1 0 again:. LM-phosphate loose opposition liquid L m MEDTA (. P H 6 0) in exchange with c subjected to binding to Li Pozo one arm

5 0 m M リ ン 酸緩 衝 液 1 m M E D T A ( p H 7 . 0 ) に 溶 解 し た ヒ ト ト ラ ン ス フ エ リ ン （ シ グ マ 社 5 m g / m 1 ) に 脱 水 メ タ ノ ー ル に 溶 解 し た ァ セ チ ル チ ォ グ リ n 一 ノレ 酸 N — ヒ ド ロ キ シ ル ス ク シ ン ィ ミ ド エ ス テ ル （ シ グ マ 社 ） 2 0 0 /i g を 添カロ し 2 5 °C で 1 時 間 反 応 し た 後 、 5 0 m M リ ン 酸 緩 衝 液 1 m M E D T A ( p H 7 . 0 ) で 平 衡 化 し た P D — 1 0 で 脱 塩 し た 。 ボ イ ド 部 分 に 回 収 さ れ た 修 飾 ト ラ ン ス フ エ リ ン 溶 液 に 1 / 9 容 の ヒ ド ロ キ シ ノレ ア ミ ン 溶 液 ( 0 . 5 M ヒ ド ロ キ シ ノレ ア ミ ン 、 0 . 5 M H E P E S 、 2 5 m M E D T A 、 （ ？1 7 . 0 ) ) を カ卩 ぇ 2 5 ¾： 1 0 分 間 反 応 し 脱 ァ セ チ ル す る こ と で チ ォ 一 ル 基 を 付 力 [1 し た ト ラ ン ス フ ヱ リ ン を 作 製 し た 。 再 度 P D — 1 0 で 緩 衝 液 を 0 . 1 M リ ン 酸 緩 衝 液 1 m M E D T A ( p H 6 . 0 ) に 交 換 し リ ボ ソ ー ム へ の 結 合 に 供 し た 。 50 mM phosphoric acid buffer solution 1 M MEDTA (pH 7.0) was dissolved in human trans-ferrin (Sigma 5 mg / m 1). Acetylthioglycol dissolved in ethanol n-Monoleic acid N—Hydroxylsuccinimide ester (Sigma) 200 / After adding ig and reacting at 25 ° C for 1 hour, 50 mM phosphoric acid buffer 1 m MEDT The salt was desalted with PD-10 equilibrated with A (pH 7.0). A 1/9 volume of hydroxylene oleamine solution (0.5 M hydroxylene) was added to the modified trans phenylene solution collected in the void area. Noreamin, 0.5 MHEPES, 25 mMEDTA, (? 17.0)) was reacted for 10 minutes and deacetylated. A trans-plane with one unit applied [1] was produced. At PD-10, the buffer solution was replaced with 0.1 M phosphoric acid buffer solution, 1 mM MEDTA (pH 6.0), and used for binding to ribosome.

リ ボ ソ ー ム は ジ ノ ル ミ ト イ ル フ ォ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン （ D P P C ) / コ レ ス テ ロ ー ル Zマ レ イ ミ ド カ プ ロ イ ノレ ジ ノヽ " ル ミ ト イ ル フ ォ ス フ ァ チ ジ ル エ タ ノ ー ル ァ ミ ン （ 特 開 平 4 一 3 4 6 9 1 8 号 公 報 ） 1 8 Z 1 0 Z 0 . 5 ( モ ル 比 ） カゝ ら な る 混 合 脂 質 よ り 作 製 し た 。 す な わ ち 、 本 混 合 脂 質 1 0 O m g に 1 O m M カ ル ボ キ シ フ ル ォ レ ツ セ イ ン 水 溶 液 1 m 1 を 力 B え て 水 和 し マ ル チ ラ メ ラ リ ポ ソ 一 ム を 作 製 し た 。 さ ら に e X t r u d e r ( L i p e x B i o m e m b r a n e s ) を 用 レヽ 0 . 1 μ m の ポ リ 力 一 ボ ネ 一 ト メ ン ブ ラ ン で 整 粒 し た 。  RevoSom is Ginomi Toilet Foil Fat Collin (DPPC) / Cholesterol Z Male Mitsile Fossil Fuel Ethanol Amine (Publication No. 4-13461918 Publication) 18Z10Z0.5 (Mole ratio) It was made from a mixture of various fats, ie, 1 OmM of this mixture was mixed with 1 OmM of carboxyl fluorescein in water. A multi-lamellar liposome was prepared by hydrating 1 m1 of the liquid and then using an eX truder (Lipex Biomembranes) with a 0.1 μm The granules were sized with a poly-one membrane.

得 ら れ た リ ボ ソ ー ム を 0 . 1 M リ ン 酸 緩 衝 液 l m The obtained ribosome was added to a 0.1 M phosphoric acid buffer lm

M E D T A ( p H 6 . 0 ) で 希 釈 し 2 5 m g Z m l ( 脂 質 濃 度 ） 調 整 し た 。 It was diluted with MEDTA (pH 6.0) and adjusted to 25 mg Zml (lipid concentration).

上 記 リ ボ ソ ー ム に 脂 質 重 量 の 2 % の 、 チ オ ー ル 基 を 付 カ卩 し た 2 1 B 2 抗 体 を 添 カ卩 し 2 5 "C で 1 時 間 反 応 し た 。 さ ら に 脂 質 重 量 の 2 % の 、 チ ォ 一 ル 基 を 付力 B し た ト ラ ン ス フ エ リ ン を 添 力 B し 2 5 。C で 1 時 間 反 応 し た 。 得 ら れ た リ ガ ン ド 結 合 リ ポ ソ 一 ム を 生 食 で 平 衡 化 し た セ フ ァ ロ 一 ス C L 6 B ( フ ア ル マ シ ア 社 ） カ ラ ム に 負 荷 し 、 生 食 で 展 開 す る こ と で 精 製 し た = 抗 体 及 び ト ラ ン ス フ エ リ ン の 結 合 は S D S — P A G E で 確 認 し た 。 蛍 光 感 度 を 増 強 す る 為 に さ ら に 退 光 し に く い 緑 色 蛍 光 色 素 P K H 2 ( ザ イ ナ シ ス 社 ） で リ ボ ソ ー ム を 標 識 し 観 察 に 用 い た （ 2 1 B 2 — T F リ ボ ソ ー ム ） 一 The above ribosome was supplemented with a 2 1 B2 antibody with a thiol group and 2% of the fat mass, and reacted for 1 hour at 25 "C. In addition, 2% of the fat mass, trans-ferrin, which had a titanium group applied thereto, was applied, and the reaction was performed at 25.C for 1 hour. Negative to the CL6B (Pharmacia) column obtained by equilibrating the obtained ligone-bonded liposome with saline. Load, and binding of refining the = anti-body及beauty door run-scan full-et-Li emissions at a child you open exhibition in raw food is SDS - was confirmed by PAGE. In order to increase the fluorescence sensitivity, the ribosome is marked with a green fluorescent pigment, PKH 2 (Zynasis), which is difficult to dim and used for observation. (2 1 B 2 — TF ribosome)

対 照 と し て 抗 体 に 換 え て 0 . 1 M リ ン 酸 緩 衝 液 1 m M E D T A ( p H 6 . 0 ) を 用 レヽ る こ と で ト ラ ン ス フ エ リ ン の み を 結 合 し た リ ボ ソ ー ム （ T F — リ ポ ソ — ム ） を 作 製 し た 。 ま た 、 ト ラ ン ス フ ェ リ ン に 換 え て 0 . 1 M リ ン 酸 緩 衝 液 I m M E D T A ( p H 6 . 0 ) を 用 レ、 る こ と で 抗 体 の み を 結 合 し た リ ポ ソ ー ム （ 2 1 B 2 リ ボ ソ ー ム ） を 作製 し た 。  As a control, use only 0.1 M phosphoric acid buffer solution 1 m MEDTA (pH 6.0) instead of the antibody to connect only trans-ferrin. A combined ribosome (TF-liposome) was created. In addition, use only 0.1 M phosphoric acid buffer ImMDTA (pH 6.0) instead of trans-ferrin to bind only the antibody. A liposome (21B2 ribosome) was prepared.

ヒ ト 胃 癌 細 胞 株 MKN45 ( TF受 容 体 弱 発 現 、 CEA 高 発 現 ： F A C S c a n で 確 認 済 み ） を 部 分 的 に パ イ ル ア ッ プす る ま で 8ウ エ ル チ ヤ ン ノ 一 ス ラ イ ド 中 で 培 養 し 、 脂 質 濃 度 と し て l m g / m 1 の 2 1 B 2 — T F 結 合 リ ポ ソ ー ム 、 2 1 B 2 リ ボ ソ ー ム 、 T F リ ボ ソ ー ム と そ れ ぞ れ 遮 光 下 氷 冷 で 1時 間 反 応 さ せ た 。 反 応 終 了 後 リ ポ ソ — ム 液 を 洗 浄 除 去 し 、 10 % ( V / V ) F B S を 添 カ卩 し た メ デ ィ ゥ ム に 置 換 し て 37。C で 1時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 イ ン キ ュ ベ ー ト 後 、 氷 冷 し た PBS_Az で 細 胞 を 洗浄 し て 風 乾 し 、 励 起 波 長 490 n m に お け る 504 n m の 蛍 光 を 観 察 し た 。  Up to 8 wells until partial uptake of human gastric cancer cell line MKN45 (weak expression of TF receptor, high expression of CEA: confirmed by FACS can) Cultivated in Jannoslide, and expressed as fat concentration of lmg / m 1 in 21B2—TF-bound liposomes, 21B2 ribosomes, Each was reacted for 1 hour with TF ribosome and ice cooling under light shielding. After the reaction is completed, the liposome solution is washed and removed, and replaced with a medium supplemented with 10% (V / V) FBS. Incubated with C for 1 hour. After incubation, the cells were washed with ice-cold PBS_Az, air-dried, and 504 nm of fluorescence at an excitation wavelength of 490 nm was observed.

そ の 結 果 、 第 2 図 に 示 す よ う に 、 2 1 B 2 リ ポ ソ 一 ム を 反 応 さ せ た 細 胞 で は 、 細 胞 表 面 や 外 周 に 大 部 分 の 蛍 光 が 観 察 さ れ た の に 対 し 、 TFリ ボ ソ ー ム を 反 応 さ せ た 細 胞 で は ご く 弱 レ、 な 力 S ら も 細 胞 内 に リ ポ ソ 一 ム の 取 り 込 み に よ る 蛍 光 の ド ッ ト が 観 察 さ れ た 。 一 方 、 2 1 B 2 — T F 結 合 リ ポ ソ 一 ム を 反 応 さ せ た 細 胞 で は 、 細 胞 内 に T F リ ボ ソ ー ム よ り も 明 ら カゝ に 多 数 の 蛍 光 ド ッ ト 力 確 認 さ れ た 。 実 施 例 2 As a result, as shown in Fig. 2, in the cells reacted with the 21B2 liposome, most of the fluorescent light was on the cell surface and the outer periphery. In spite of the observation, the cells that reacted with the TF ribosome were very weak, and even the strong forces S incorporated the liposomes into the cells. A dot of fluorescent light was observed. On the other hand, 2 1 B 2 — TF-coupled liposomes react in cells with a much higher number of fluorescent dots in the cells than in TF ribosomes. It has been certified . Example 2

抗 体 、 及 び Z ま た は ト ラ ン ス フ ェ リ ン を 結 合 後 、 さ ら に そ の リ ポ ソ 一 ム 反 応 液 に 分 子 量 6 0 0 0 の P E G を 用 い 作 製 し た チ オ ー ル 化 ポ リ エ チ レ ン ダ リ コ ー ル ( 特 開 平 4 一 3 4 6 9 1 8 号 公 報 ） を 脂 質 1 O m g に 対 し て 0 . 2 /i m o l 添 力 tl し 1 0 eC で 一 夜 反 応 す る こ と 以 外 は 実 施 例 1 と 同 様 に し て 抗 体 及 び Z ま た は ト ラ ン ス フ エ リ ン に カ卩 ぇ P E G を 結 合 し た リ ポ ソ 一ム を 作 製 し た 。 After binding the antibody and Z or trans-ferrin, further use PEG with a molecular weight of 600 in the liposome reaction solution. The obtained thiolated polyethylene glycol (Japanese Patent Publication No. Hei 4-1346918) was added with 0.2 / imol to 1 mg of fat. the power tl and 1 0 e this and other than you reaction one night in C is an anti-body及beauty was Z or in the implementation example 1 the same like DOO run-scan full-et Li on to the mosquito卩tut PEG To create a liposome that combines the two.

ヒ ト 胃 癌 細 胞 株 M K N 45を 部 分 的 に パ イ ル ア ッ プ す る ま で 8ウ エ ル チ ヤ ン ノく 一 ス ラ イ ド 中 で 培養 し 、 脂 質 濃 度 と し て 1 m g Z m 1 の P E G 修 飾 2 1 B 2 — T F リ ポ ソ 一 ム 、 P E G 修 飾 2 1 B 2 リ ボ ソ ー ム 、 P E G 修 飾 T F リ ボ ソ ー ム と そ れ ぞ れ 遮 光 下 氷 冷 で 1時 間 反 応 さ せ た 。 反 応 終 了 後 リ ポ ソ 一 ム 液 を 洗 浄 除 去 し 、 10 % ( V / V ) F B S を 添 カ卩 し た メ デ ィ ウ ム に 置 換 し て 37°C で 1時 間 ィ ン キ ュ ベ 一 ト し た 。 ィ ン キ ュ ベ 一 ト 後 、 氷 冷 し た PBS- Az で 細 胞 を 洗 浄 し 、 リ ボ ソ ー ム が 細 胞 内 外 の ど ち ら に 存 在 す る カゝ を よ り 明 確 に す る た め に 、 半 数 の ゥ エ ル に っ レ、 て 細 胞 を 0. 2M グ リ シ ン 塩 酸 緩 衝 液 （ pH 2. 8 ) に 室 温 で 1分 間 浸 す こ と を 3 回 行 い 、 細 胞 表 面 に 結 合 し た も の を 除 去 し た 。 細 胞 を 洗 浄 後 風 乾 し 、 励 起 波 長 490 nm に お け る 504 nm の 蛍 光 を 観 察 し た 。  The human gastric carcinoma cell line MKN45 was cultured in 8-well tannin slide until partial pile-up, and the lipid concentration was determined. 1 mg Zm1 PEG-modified 2 1 B2 — TF liposome, PEG-modified 21 B2 ribosome, PEG-modified TF ribosome The reaction was carried out for 1 hour with ice cooling. After completion of the reaction, wash and remove the liposome solution, replace with 10% (V / V) FBS-added medium, and incubate at 37 ° C for 1 hour. It was uploaded. After incubating, the cells are washed with ice-cold PBS-Az, and ribosomes are more clearly identified inside and outside the cells. To achieve this, immerse the cells in a half of the gel in 0.2 M glycin hydrochloride buffer (pH 2.8) for 1 minute at room temperature. Was performed three times to remove those bound to the cell surface. After washing the cells, they were air-dried, and 504 nm fluorescence at an excitation wavelength of 490 nm was observed.

そ の 結 果 、 P E G 修 飾 21 B 2リ ポ ソ 一 ム を 反 応 さ せ た 細 胞 で は 、細 胞 表 面 や 外 周 に 大 部 分 の 蛍 光 が 観 察 さ れ 、 こ の 蛍 光 は 細 胞 を 0. 2 M グ リ シ ン 塩 酸 緩 衝 液 で 洗 浄 す る こ と に よ っ て ほ と ん ど 消 失 し た （ 第 3 図 a b ) 。 P E G 修 飾 T Fリ ポ ソ ー ム を 反 応 さ せ た 細 胞 で は ご く 弱 レヽ な 力； ら も 細 胞 内 に リ ボ ソ ー ム の 凝 集 に よ る ド ッ ト カ S 観 察 さ れ 、 細 胞 を 0. 2 M グ リ シ ン 塩 酸 緩 衝 液 で 洗 浄 し て も 大 き な 変 化 は 見 ら れ な カゝ つ た （ 第 3 図 e f ) = 一 方 、 21B2- TF 結 合 リ ボ ソ ー ム を 反 応 さ せ た 細 胞 で は 、 細 胞 内 に TF リ ボ ソ ー ム よ り も 明 ら 力 に 多 数 の ド ッ ト が 確 認 さ れ 、 細 胞 を 0. 2 M グ リ シ ン 塩 酸 緩 衝 液 で 洗 浄 し て も 大 き な 変 化 は 見 ら れ な カゝ つ た （ 第 3 図 c d ) 0 し た が っ て 、 細 胞 表 面 抗 原 C E Aに 対 す る 抗 体 で あ る 21 B2 の み を 結 合 し た リ ボ ソ ー ム は 、 MKN45の 細 胞 表 面 に 結 合 す る こ と は で き る 力 、 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る こ と 〖ま 少 な く 、 大 部 分 が 膜 上 に と ど ま る こ と が 示 さ れ た 。 一 方 、 T Fリ ボ ソ ー ム は M K N 45に 作 用 し て 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る 力 、 そ の 量 は わ ず カゝ で し か な い こ と が 示 さ れ た 。 こ れ ら に 対 し て 2 1 B 2 — T F 結 合 リ ポ ソ 一 ム は 、 TFリ ポ ソ ー ム ょ り も 明 ら カゝ に 多 量 の リ ポ ソ 一 ム が 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ て お り 、 21 B 2抗 体 の タ 一 ゲ ッ テ イ ン グ 効 果 と T F の イ ン タ 一 ナ ラ イ ズ 効 果 が 相 乗 的 に 機 能 し た と 考 え ら れ た 。 実 施 例 3 As a result, the PEG-modified 21B2 liposome was reacted. In the cells, most of the fluorescence is observed on the cell surface and on the outer periphery, and this fluorescence is used to wash the cells with 0.2 M glycine hydrochloride buffer. Almost all of them were lost (Fig. 3 ab). PEG-modified TF Liposome reacts very weakly in cells that react with them; they also observe Dotka S in cells by aggregation of ribosomes. Even when the cells were washed with 0.2 M glycin hydrochloride buffer, no significant change was observed (Fig. 3 ef) = 21B2 -In a cell with a TF-bonded ribosome, a larger number of dots are clearly identified in the cell than in the TF ribosome. be washing with 0. 2 M grayed the vesicles re thin hydrochloric acid gentle shock solution large deal of change is seen et re a mosquitoゝone was (FIG. 3 cd) 0 was but in Tsu, cells A ribosome to which only 21B2, an antibody against the surface antigen CEA, is bound, is capable of binding to the cell surface of MKN45. What is taken into the cell It was shown that, to a lesser extent, most remained on the membrane. On the other hand, it was shown that the TF RiboSome could act on MKN45 and be incorporated into the cells, and the amount of TF was only small. On the other hand, the 2 1 B 2 -TF-bonded liposomes, as well as the TF liposomes, obviously contain a large amount of liposomes inside the cells. It is considered that the targeting effect of the 21B2 antibody and the interleaving effect of TF functioned synergistically. Was Example 3

実 施 例 1 及 び 実 施 例 2 で 示 し た P E G 修 飾 及 び 非 修 飾 の TFリ ポ ソ 一 ム 及 び 2 1 B 2 — T F リ ポ ソ 一 ム を 用 い て 、 ヒ ト 骨 芽 細 胞 系 腫 瘍 細 胞 株 K 5 6 2 へ の 各 リ ボ ソ 一 ム の 反 応 性 を 測 定 し た 。 尚 、 T F 及 び 2 1 B 2 の リ ポ ソ ー ム へ の 結 合 量 は P E G 有 無 に 関 わ ら す 同 等 で あ っ た 。 Using the PEG-modified and non-modified TF liposomes and 21B2—TF liposomes shown in Example 1 and Example 2, human bone was used. The responsiveness of each ribosome to blastoma cell line K5662 was measured. TF and 2 1 B 2 The amount bound to the liposomes was comparable with or without PEG.

ヒ ト 骨 芽 細 胞 系 腫 瘍 細 胞 株 K 562 ( TF受 容 体 高 発 現 、 CEA 弱 発 現 ： FACScan で 確 認 済 み ) を 1. 5 ml チ ュ ー ブ に 取 り 、 脂 質 濃 度 と し て 1 m g Z m l の 2 1 B 2 — T F リ ボ ソ ー ム 、 P E G 修 飾 2 1 B 2 — T F リ ポ ソ 一 ム 、 T F リ ボ ソ ー ム 、 P E G 修 飾 T F リ ボ ソ ー ム と そ れ ぞ れ遮 光 下 氷 冷 で 1時 間 反 応 さ せ た 。 反 応 終 了 後 、 細 胞 を PBS- Az で 洗 浄 し 、 ポ ァ サ イ ズ 35 μ m の フ ィ ル タ ー を 通 し て FACScanに よ る 角？ 祈 に 用 レ、 た 。  Human osteoblastic tumor cell line K562 (high expression of TF receptor, weak expression of CEA: confirmed by FACScan) was taken in a 1.5 ml tube, and oil was taken. Concentration of 1 mg Z ml 2 1 B2 — TF ribosome, PEG-modified 21 B2 — TF liposome, TF ribosome, PEG-modified TF ribo Each room was reacted for 1 hour with ice cooling under light shielding. After the reaction is completed, the cells are washed with PBS-Az and passed through a filter with a pore size of 35 μm. I used it to pray.

そ の 結 果 （ 第 4 図 ） 、 T F の み を 結 合 し た リ ポ ソ 一 ム を 反 応 さ せ た 細 胞 で は 、 P E G 修 飾 に よ っ て 細 胞 当 た り の リ ポ ソ 一 ム 結 合 量 が 大 き く 減 少 し た 。 一 方 、 2 1 B 2 及 び T F を 結 合 し た リ ポ ソ ー ム を 反 応 さ せ た 細 胞 で は 、 P E G 修 飾 に よ る リ ポ ソ ー ム 結 合 量 の 減 少 は わ ず か で あ つ た 。  As a result (Fig. 4), the liposome reacted with the liposome combined with TF alone showed that the liposome per cell was modified by PEG modification. The amount of bonding has been greatly reduced. On the other hand, in the cells in which liposomes in which 21B2 and TF were combined were reacted, the amount of liposomes bound by PEG modification was not significantly reduced. It was quiet.

す な わ ち P E G 修 飾 す る こ と で リ ボ ソ ー ム に 直 接 結 合 し た T F の 結 合 活性 を 抑 制 す る 一 方 、 P E G ス ぺ 一 サ 一 の 先 端 に 結 合 し た 2 1 B 2 抗 体 の 結 合 活性 に は ほ と ん ど 影 響 を 与 え て レ、 な レヽ こ と 力 S 示 さ れ た 。 こ の こ と は タ 一 ゲ ッ ト へ の 結 合 性 が P E G ス ぺ ー サ 一 を 介 し て リ ポ ソ ー ム に 結 合 し た リ ガ ン ド の 特 異 性 を よ り 反 映 す る こ と 力 で き る 一 方 で 、 リ ポ ソ 一 ム に 直 接 結 合 し た ト ラ ン ス フ ヱ リ ン に よ る 反 応 性 を 抑 制 で き る こ と を 示 す 。 ト ラ ン ス フ ェ リ ン は 多 く の 正 常 細 胞 に も 発 現 し て お り 、 こ の こ と は 好 ま し く な い 非 特 異 的 反 応 を 抑 制 し う る こ と を 示 し て レヽ る 。  In other words, the PEG modification suppresses the binding activity of TF directly bound to the ribosome, while the TF is bound to the leading end of the PEG spacer. The binding activity of the 21B2 antibody had almost no effect on the binding activity of the 21B2 antibody. This reflects the uniqueness of the ligand binding to the target via the PEG spacer to the liposome. It is shown that while it is possible to reduce the responsiveness of the transponder directly connected to the liposome. Trans-ferrin is also present in many normal cells, and this is to suppress undesired non-specific reactions. Show and review.

実 施 例 2 に 示 す よ う に P E G 修飾 2 B 2 T F リ ポ ソ 一 ム は 良 好 な 細 胞 へ の 取 り 込 み 活 性 を 維 持 す る こ と ；^ で き る こ と 力 ら 、 P E G 修 飾 に よ り マ ス ク さ れ た ト ラ ン ス フ エ リ ン が 抗 体 を 介 し 細 胞 表 面 に 保 持 さ れ る こ と で ト ラ ン ス フ エ リ ン の 取 り 込 み 活性 が 局 所 で 発 揮 さ れ る と 考 え ら れ る - 産 業 上 の 利 用 可 能 性 As shown in Example 2, PEG-modified 2B2TF The Possom has to maintain good uptake activity in good cells; ^ The ability to mask the transpired mask By retaining suferin on the cell surface via an antibody, it is considered that transferrin uptake activity is locally exerted. Yes-industrial availability

微 粒 子 上 に タ 一 ゲ ッ ト 細 胞 に 結 合 性 の リ ガ ン ド（ A ) に 力卩 ぇ タ 一 ゲ ッ ト 細 胞 へ の 取 り 込 み 活 性 の あ る リ ガ ン ド （ B ) を 付 力 [1 す る こ と に よ り 、 リ ガ ン ド （ B ) だ け で は 極 め て 取 り 込 み 能 の 低 い タ ー ゲ ッ ト 細 胞 に ぉ レ、 て も 、 両 者 の リ ガ ン ド を 付 与 す る こ と で 高 レ、 細 胞 内 取 り 込 み が 見 い だ さ れ た 。  Ligand that binds to the target cell on the microparticles (A) and is active in its incorporation into the target cell By applying (B) to the target cell [1], it is possible to obtain a target cell with extremely low incorporation capability only with the ligand (B) alone. In addition, it was found that the uptake of the cells in both cells was high by giving both of them the ligand.

ま た 、 微粒 子 に リ ガ ン ド に 結 合性 を 有 さ な い 水 溶 性 高 分 子 （ C ) を 結 合 す る こ と で 、 リ ガ ン ド （ B ) に よ る 非 特 異 的 な 反 応 を 低 減 し 、 生 体 内 で の 安 定性 の 改 善 が 期 待 さ れ る 。  In addition, by combining a water-soluble polymer (C) having no binding property with the ligand to the fine particles, the non-specificity of the ligand (B) is increased. Therefore, it is expected that stable reactions in living organisms will be improved by reducing specific reactions.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims 1 . 特 定 の 細 胞 を タ 一 ゲ テ ィ ン グす る 微 粒 子 で あ っ て 該 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド 及 び 該 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド の 2 種 の リ ガ ン ド を 有 す る 事 を 特 徴 と す る 微 粒 子 。 1. A microparticle that targets a specific cell and that is bound to the cell and is taken up by the cell and a ligand that binds to the cell. A microparticle characterized by having two types of ligands, one having a function to function. 2 . 微 粒 子 、 ミ セ ル ま た は リ ボ ソ ー ム で あ る こ と を 特 徴 と す る g青 求 項 1 に 記 載 の 微 粒 子 。  2. The fine particles described in claim 1 which are characterized as being fine particles, micelles or ribosomes. 3 . 細 胞 八 性 を 有 す る リ ガ ン ド が 、 抗 体 ま た は 抗 体 フ ラ グ メ ン ト で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 1 ま た は 2 に 記 載 の 微 粒 子 。  3. Claims 1 or 2, which feature that the octagonal ligand is an antibody or an antibody fragment. The fine particles mentioned. 4 . 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド が 、 タ ン パ ク 質 、 抗 体 、 増 殖 因 子 、 ト ラ ン ス フ ェ リ ン 、 糖 質 、 ホ ノレ モ ン 、 ま た は 低 分 子 化 合 物 で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 1 乃 至 3 の い ず れ か に 記 載 の 微 粒 子 。  4. Ligand that has the function of being taken up by cells is composed of proteins, antibodies, growth factors, trans-ferrin, carbohydrates, and proteins. A fine particle described in any one of claims 1 to 3 which is characterized by being a noremon or a low molecular compound. 5 . 該 微 粒 子 に 水 溶 性 高 分 子 力 S 結 合 し て い る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 1 乃 至 4 の い ず れ か に 記 載 の 微粒 子 。  5. A microparticle according to any one of claims 1 to 4, which is characterized in that the microparticle has a water-soluble high molecular weight S bond. 6 . 該 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド が 水 溶 性 高 分 子 を 介 し て 該 微 粒 Ί に ロ ノロ' し て レ、 る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 1 乃 至 4 の い ず れ か に 記 載 の 微 粒 子 。  6. A characteristic of the method is that a ligand capable of binding to the cells is ronoro'd to the microparticles via a water-soluble polymer. A microparticle according to any of claims 1 to 4. 7 . 該 細 胞 ί 合性 を 有す る リ ガ ン ド が 水 溶性 高 分 子 を 介 し て 微粒 子 ( p 口' し 、 更 に 該 微 粒 子 に 水 溶性 高 分 子 が 結 合 し て い る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 1 乃 至 4 の い ず れ か に 記 載 の 微 粒 子 。  7. The cell-compatible ligand is ligated into fine particles (p-mouth) via the water-soluble polymer, and the water-soluble polymer is further bound to the fine particles. A fine particle described in any one of claims 1 to 4 which features the following. 8 . 細 胞 が 腫 瘍 細 胞 で あ る δ冃 求 項 1 乃 至 7 の い ず れ 力 に 記 載 の 微 粒 子  8.The microparticles listed in the δ force equation 1 to 7 of the cell where the cell is a tumor cell 9 . 微粒 子 内 に 抗 腫 瘍 剤 が 封 入 さ れ て い る 請 求 項 1 乃 至 8 の い ず れ か に 記 載 の 微 粒 子 。 9. Fine particles according to any one of claims 1 to 8 wherein the antitumor agent is sealed in the fine particles. 1 0 . タ 一 ゲ ッ ト 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド を 水 溶性 高 分 子 を 介 し て 結 合 し 、 さ ら に 、 該 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド 及 び 水 溶 性 高 分 子 を 結 合 し た 特 定 の 細 胞 を タ 一 ゲ テ ィ ン グす る 微 粒 子 の 製 造 方 法 で あ っ て 、 あ ら カゝ じ め タ ー ゲ ッ ト 細 胞 に 結 合 性 を 有 す る リ ガ ン ド と 水 溶 性 高 分 子 の 複 合 体 を 製 造 し 、 こ の 複 合 体 、該 細 胞 に 取 り 込 ま れ る 機 能 を 有 す る リ ガ ン ド 、 及 び 水 溶 性 高 分 子 を 該 微 粒 子 に 結 合 さ せ る こ と を 特 徴 と す る 微 粒 子 の 製 造 方 法 。 Ligand capable of binding to the target cell is bound via a water-soluble polymer, and is further taken up by the cell. This is a method for producing fine particles that target specific cells that combine functionalized ligands and water-soluble polymers. Then, a complex of a ligand and a water-soluble polymer having a property to bind to the target cell is manufactured in advance, and the complex and the complex are produced. A ligand having a function of being incorporated into cells, and a fine particle which is characterized in that a water-soluble polymer is bound to the fine particle. Production method . 1 1 . 該 微 粒 子 が リ ボ ソ ー ム で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 1 0 記 載 の 微 粒 子 の 製 造 方 法 。  11. A method for producing fine particles according to claim 10, characterized in that the fine particles are ribosomes.
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