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WO2000057695A1 - Modele animal de maladies auto-immunes - Google Patents

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WO2000057695A1
WO2000057695A1 PCT/JP2000/002023 JP0002023W WO0057695A1 WO 2000057695 A1 WO2000057695 A1 WO 2000057695A1 JP 0002023 W JP0002023 W JP 0002023W WO 0057695 A1 WO0057695 A1 WO 0057695A1
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WO
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dsg3
mice
human mammal
mouse
autoimmune disease
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PCT/JP2000/002023
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masayuki Amagai
Takeji Nishikawa
Harumi Suzuki
Shigeo Koyasu
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Keio University
Original Assignee
Keio University
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a model animal for an autoimmune disease and a method for producing the same. ⁇ 3 ⁇ 4r
  • Pemphigus vulgaris is a sometimes fatal autoimmune blistering disease of the skin and mucous membranes, histologically characterized by blistering in the epidermis, and immunopathology It is characterized by an IgG autoantibody against the cell surface of keratinocytes (Stanley, JR Pemphigus. In Dermatology in General Medicine.I.Freedberg, AZ Eisen, K. Wolff, K. , and TB Fitzpatrick, eds. McGraw-Hill, New York, 654-666 (1998)). Clinically, patients with pemphigus vulgaris exhibit extensive flaccid blisters and erosions. These can occur in any stratified squamous epithelium.
  • pemphigus vulgaris can be fatal, because extensive skin lesions can cause fluid spills or secondary bacterial infections.
  • systemic corticosteroids and immunosuppressive therapy have improved the prognosis of pemphigus, the mortality rate is still fairly high due to deaths from treatment complications.
  • the target antigen for pemphigus vulgaris was initially identified as a 130 kD glycoprotein by immunoprecipitation of keratinocyte extracts (Stanley, JR et al., J. Clin. Invest. 70: 281-288 (1982 Stanley, JR et al., J. Clin. Invest. 74: 313-320 (1984)) c Afterwards, human keratinocytes were purified using affinity-purified autoantibodies specific for pemphigus vulgaris antigen. Immunoscreening of the current library As a result, the cDNA of the pemphigus vulgaris antigen was isolated (Amagai, M. et al., Cell 67: 869-877 (1991)).
  • pemphigus vulgaris antigen belongs to the cell indirect adhesion molecule force doherin supergene family.
  • Pemphigus vulgaris antigen is a desmosomal membrane protein (Karpati, S. et al., J. Biol.
  • rDsg3 Immunoabsorption with (rDsg3) eliminates serum pathogenicity and inhibits blistering in newborn mice (Amagai, M. et al., J. Clin. Invest. 94:59 -67 (1994 )). Finally, rDsg3 affinity-purified antibodies are pathogenic and form blisters in neonatal mice that make histological findings of normal I acne (A magai, M. et al., J. Clin. Invest. 90: 919-926 (1992); Amagai, M. et a 1., J. Clin. Invest. 102: 775-782 (1998)).
  • pemphigus vulgaris is one of the best characterized autoimmune diseases, especially in the post-autoantibody production process. Therefore, pemphigus vulgaris is now a good candidate for tissue-specific autoimmune diseases to study cellular mechanisms of autoantibody production or disruption of self-tolerance, and to develop disease-specific therapies. It is a disease model. The first step toward achieving these goals requires the development of an animal model of active disease of pemphigus vulgaris.
  • the present invention provides a model animal for an autoimmune disease and a method for producing the same. More specifically, the activation of T cells and B cells that respond to the antigen protein of an autoimmune disease and the consequent stable production of autoantibodies are induced, and nonhuman mammals exhibiting an autoimmune disease phenotype and their A method of making is provided.
  • the model animal is produced by transplantation of immunocompetent cells including B cells that produce antibodies against the antigen protein of the autoimmune disease and / or T cells that respond to the antigen protein.
  • mice In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors first attempted production of autoantibodies in mice by employing a commonly used repetitive injection method. Specifically, 3 strains of mice, BALB / c (H-2 d), C3H / HeJ (H - 2 ", and C57BL / 6N and (H-2 b) were immunized with Dsg3 protein of human or mouse. In the first immunization, complete Freund's adjuvant was used, and then booster immunization was performed 3 or 7 times using incomplete Freund's adjuvant.However, in this method, all mice responded to mouse Dsg3 protein. No antibody was produced (Table 1) and no phenotype of pemphigus vulgaris was expressed.
  • the present inventors hypothesized that the absence of pathogenic antibodies in the mouse was due to self-tolerance to the Dsg3 protein. Based on this hypothesis, it is considered that Dsg3-deficient mice produced by gene targeting do not have their immune system exposed to Dsg3 protein at the developmental stage and have not acquired self-tolerance to Dsg3 protein.
  • the present inventors immunized Dsg3-deficient mice with Dsg3 protein and examined whether or not to produce antibodies against Dsg3 protein.
  • immunization with Dsg3 protein is much more efficient in DSG3-/-mice deficient in the DSG3 gene than in DSG3 +/- mice deficient in the DSG3 gene.
  • Antibody production was detected (Fig. 1A).
  • anti-rest produced in DSG3-/-mice was similar to that of mouse Dsg3 on keratinocytes.
  • Antibody, but not the DSG3 +/ ⁇ mouse antibody (FIG. 1B). That is, in DSG3-/-mice, self-tolerance to DSG3 protein was not established, and it was found that the produced antibody recognized mouse Dsg3 protein as an antigen.
  • the present inventors next took out spleen cells (having the ability to produce an antibody against DSG3 protein) from DSG3-/-mice immunized with Dsg3 protein, and transferred them to RAG2-/-immunodeficient mice. After transfer, an attempt was made to produce antibodies against the Dsg3 protein in the mice and to develop a pemphigus vulgaris phenotype. Since RAG2-/-mice are unable to rearrange the genes for the force T cell receptor or immunoglobulin expressing the Dsg3 protein, these mice lack mature T or B cells (ie, Immunodeficiency).
  • mice exhibited mucosal erosive damage, suprabasal spinal melting of the skin, and loss of telogen hair (Figure 3).
  • the adoptive transfer of DSG3-/-spleen cells reproduced nearly identical phenotypes in G2-/-recipient mice, demonstrating that the antibodies produced were specific and pathogenic.
  • the present invention provides the first mouse model of pemphigus disease and a method for producing the same.
  • the method of the present invention can be widely applied to the production of other autoimmune disease model animals in which the target of the autoantibody has been identified. Therefore, the present invention relates to an autoimmune disease model animal and a method for producing the same, more specifically,
  • a non-human mammal exhibiting an autoimmune disease phenotype by producing an antibody that reacts with an antigen protein of the autoimmune disease or activating T cells;
  • the model animal of the present invention can exhibit an autoimmune disease phenotype by stable production of an antibody that reacts with an antigen protein of the autoimmune disease or by continuous activation of T cells.
  • the target disease for producing a model animal is not particularly limited as long as it is an autoimmune disease.
  • autoimmune diseases include, but are not limited to, myasthenia gravis, autoimmune hemolytic anemia, Basedow's disease, Hashimoto's disease, Goodpastia's syndrome, autoimmune diabetes, and multiple sclerosis.
  • the animal used to produce the model animal is preferably a non-human mammal.
  • the non-human mammal is not limited as long as it can produce a gene-deficient animal.
  • Suitable animals include rodents, eg, mice.
  • the model animal of the present invention is obtained by immunizing a non-human mammal deficient in an antigen gene with an antigen protein of an autoimmune disease, extracting an immunocompetent cell thereof, and exchanging the cell with another non-human mammal having the antigen protein.
  • An animal deficient in an antigen gene can be produced by transplantation into a mammal.
  • the antigen gene can be produced by a method known to those skilled in the art. If it is pox
  • DSG3 gene acetylcholine receptor gene for myasthenia gravis, TSH receptor gene for Basedow's disease and Hashimoto's disease, type IV collagen gene for Goodpastia's syndrome, myelin base for multiple sclerosis And the like, but are not limited to those exemplified above.
  • removal of immunocompetent cells can be performed from, but not limited to, the thymus, lymph nodes, spleen, liver, intestinal epithelium, peripheral blood, and the like.
  • the spleen which is rich in mature immunocompetent cells, is a preferred organ from which to remove immunocompetent cells.
  • the animals used to prepare the immunocompetent cells (donor) and the animals that receive the immunocompetent cell transplant (recipient) have lymphocytes derived from the transferred immunocompetent cells destroy the recipient's tissue. GVHD does not occur. For this reason, it is preferable that they are of the same species and have the same genetic background.
  • the recipient is preferably immunodeficient in order not to reject the lymphocytes derived from the transferred immunocompetent cells.
  • immunodeficient animals in addition to animals lacking the RAG2 gene, for example, SCID mice and nude mice can be used. It is also conceivable. It is also possible to use an MHC knockout mouse, a common chain knockout mouse, or the like, but it is not limited to these.
  • Immunization with a donor antigen protein, preparation of immunocompetent cells from a donor, and transplantation of immunocompetent cells into a recipient can be performed, for example, by the methods described in Examples.
  • the prepared model animal of the present invention can exhibit an autoimmune disease phenotype by stable production of an antibody that reacts with an antigen protein of the autoimmune disease or by sustained activation of T cells.
  • the main phenotypes include weight loss and reversible hair loss.
  • autoimmune diseases other than pemphigus vulgaris muscle weakness in myasthenia gravis, anemia in autoimmune hemolytic anemia, thyroid function hyperactivity in Basedow's disease, hypothyroidism in Hashimoto's disease, and Goodpastia's syndrome
  • phenotypes such as renal and pulmonary disorders, diabetes in autoimmune diabetes, and paralysis in multiple sclerosis are thought to be exhibited.
  • model animals can be used for the development of therapeutics and treatments for autoimmune diseases by administering a desired compound whose therapeutic effect is to be studied and observing its phenotype.
  • the model mouse of pemphigus vulgaris prepared in this example has a major phenotype of weight loss and reversible hair loss, and the phenotype persists for 6 months or more. It is possible to observe the mice without sacrifice and easily and objectively evaluate the effectiveness of each therapeutic agent or treatment method.
  • These model mice are also very useful in elucidating the cellular mechanism of antibody production against antigen proteins.
  • FIG. 1 is a diagram (A) and a photograph (B) showing the production of anti-Dsg3 IgG capable of binding in vivo in DSG3-/-mice.
  • A DSG3 ⁇ / ⁇ mice and their +/ ⁇ littermates were immunized with mouse rDsg3, and the titer of anti-Dsg3 IgG was temporarily measured by ELISA. Arrows indicate initial immunization with mouse rDsg3 using complete Freund's adjuvant, and arrows indicate booster immunization with mouse rDsg3 using incomplete Freund's adjuvant. DSG3-/-mice produced anti-Dsg3 IgG much more efficiently than +/- littermates.
  • B Sera from immunized DSG3-/-mice (a) stained cell-cell contact sites in cultured keratinocytes, but +/- littermate mice (b) did not stain with serum derived from . The bar represents.
  • FIG. 2 shows that anti-Dsg3 IgG was produced in recipient RAG2-/-mice after transfer of immunized DSG3-/-splenocytes.
  • RAG2-/-mice that received splenocytes of immunized DSG3-/-mice [RAG2-/-(DSG3-/-)] or RAG2-/-mice that received splenocytes of DSG3 +/- mice [RAG2-/-(DSG3 +/-)] was used to obtain an ELISA score for mouse rDsg3.
  • RAG2-/-mice with DSG3-/-splenocytes showed sustained anti-Dsg3 IgG production.
  • FIG. 3 is a photograph showing that RAG2 ⁇ / ⁇ mice to which immunized DSG3 ⁇ / ⁇ splenocytes were transferred showed expression of pemphigus vulgaris. Transfer of spleen cells? Around 14 days later, weight loss was observed in RAG2-/-mice with DSG3-/-splenocytes (A, bottom) compared to mice with DSG3 +/- splenocytes (A, top). Some developed crusted erosions around the nose and ⁇ ⁇ where the mice broke (B).
  • Figure 4 is a photograph showing that RAG2-/-mice transfected with immunized DSG3-/-tile cells exhibited a hair loss phenotype similar to that seen in DSG3-/-mice. .
  • RAG2-/-mice with DSG3-/-splenocytes showed partial hair loss (A, B).
  • RAG2-/-mice with DSG3-/-spleen cells had clumps of hair attached to the tape (C, left), but RAG2 with DSG3 +/- splenocytes. -/-Mice showed no hair (C, right).
  • the cDNA encoding the entire extracellular domain of mouse Dsg3 was ligated to the appropriate primer (5, -CCGAGATCTCCTATAAATATGACCTGCCTCTTCCCTAGA-3 '/ SEQ ID NO: 1, 5, -CGGGTCGACCCTCCAGGATGACTCCCCATA-3, / SEQ ID NO: 2).
  • a phage clone containing mouse Dsg3 cDNA (acquired by Dr. Jouni Uitto) was used as a template for PCR amplification, and the amplified fragment was pEVmod-Dsg3-His vector (Ishii, ⁇ ⁇ , et al., J Immunol.
  • Example 2 Immunization of mouse Dsg3 protein in DSG3 + / + wild-type mice First, it was attempted to produce antibodies against Dsg3 protein in various wild-type mouse strains by immunization of human or mouse with rDsg3 (see Table 2). 1)
  • mice are sensitized by intraperitoneal injection of 5 ⁇ g of mouse or human purified rDsg3 using Complete Freund's Adjuvant (CFA), followed by weekly, 3 or 7 incomplete Freund's Booster was boosted with mouse or human r Dsg3 using 'Adjuvant (IFA). Antibody production was tested by ELISA 3 days after each boost.
  • CFA Complete Freund's Adjuvant
  • IFA 'Adjuvant
  • mouse or human rDsg3 was used as a coating antigen. Specifically, a 96-well plate was coated with purified mouse or human rDsg3 at 100 ° C. and 5 ⁇ g / nil at 4 ° C.-overnight. All serum samples were diluted 50 to 5,000-fold and incubated on a 96-well ELISA plate for 1 hour at room temperature.
  • Mouse keratinocyte cell line PAM212 (Yuspa, SH e 3 Cancer Res. 40: 4694-4703 (1980)) or human keratinocyte cell line KU8 (Tsukamoto, T., Keio J. Med. 38: 277-293 (1989)) at 37 ° C. , in a humidified atmosphere containing 5% C0 2, 30 minutes, and incubated with mouse serum samples diluted 20-fold with DMEM containing 10% FCS.
  • mice When C57BL / 6N or BALB / c mice were immunized with human rDsg3 using complete Freund's adjuvant followed by incomplete Freund's adjuvant, these mice reacted only with human rDsg3, The production of unreacted IgG was determined by ELISA and immunofluorescent staining. Only C3H / HeJ mice produced IgG with weak cross-reactivity to mouse rDsg3 by ELISA. When these three strains of mice were immunized with mouse rDsg3, any of the mice could be immunized by any of the three methods used (ELISA, indirect immunofluorescence, and live keratinocyte staining).
  • IIF in the table indicates the results of indirect fluorescent antibody staining (IIF) of normal mouse skin ( ⁇ S) or normal human skin (NHS) using mouse serum (d).
  • Live cell staining in the table indicates the results of live cell staining of cultured mouse keratinocyte cell line (Pam) or human keratinocyte cell line (KU8) using mouse serum.
  • E "-" Indicates negative
  • DSG3-/-mice were obtained by crossing male DSG3-/-mice with female DSG3 +/- mice (och, PJ, et al., J. Cell Biol. 137: 1091-1102 (1997)).
  • B6.SJL-ptpr '] was bred for 10 ffi generations with RAG2-/-mice. nic) (German Town, NY) (Schulz, R.-J. et al., J. Immunol. 157: 4379-4389 (1996)).
  • DSG3 ⁇ / ⁇ mice did not have tolerance to Dsg3 protein
  • DSG3 ⁇ / ⁇ mice were immunized with mouse rDsg3, and the ELISA score against mouse rDsg3 was measured.
  • DSG3-/-and DSG3 +/- mice were sensitized (5 days) with purified Freund's adjuvant with 5 ⁇ g of purified mouse rDsg3 (day 0) and then on days 8, 15, 22, and 28 The mice were boosted with rDsg3 using incomplete Freund's adjuvant. Antibody production was measured by the same ELISA as in Example 2 using mouse rDsg3 as the antigen for coating.
  • mice To determine whether the anti-Dsg3 IgG force produced in these mice can bind to Dsg3 protein on keratinocytes in vivo, use the mouse keratinocyte cell line Pani212 and In the same manner, vital staining was performed. When sera from DSG3-/-mice were added to the culture medium, those sera bound to the intercellular adhesion sites of cultured keratinocytes, but sera from DSG3 +/- mice did not show any cell surface staining ( ( Figure 1B). No in vivo IgG deposition was seen in the epidermis of immunized DSG3 +/- mice.
  • DSG3-/-mice lack the target antigen, it was expected that anti-Dsg3 IgG would not alter the phenotype in DSG3-/-mice. Therefore, an experiment was performed in which splenocytes of immunized DSG3-/-mice or DSG3 +/- mice were transferred to RAG2-/-immunodeficient mice.
  • RAG2-/-mice express Dsg3 protein but cannot mature T or B cells due to the inability to rearrange T cell receptor or immunoglobulin genes . Therefore, it is considered that the transferred spleen cells are not rejected and anti-Dsg3 IgG is produced in the recipient mouse.
  • DSG3-/-and DSG3 +/- mice were sensitized (5 days) with purified mouse rDsg3 using complete Freund's adjuvant (day 0), and then incomplete on days 7 and 14. The mice were boosted with rDsg3 using Freund's adjuvant. Antibody production was confirmed on day 18 by the same ELISA as in Example 2. Finally, mice were boosted without adjuvant with mouse rDsg3, and several days after the booster mice were sacrificed to prepare splenocytes as immunocompetent cells.
  • spleen cells For adoptive transfer of spleen cells, mononuclear cells were isolated from spleens of DSG3-/-or DSG3 +/- mice, and 10% fetal calf serum, 0.21% sodium bicarbonate solution (w / V), 2 mM The cells were resuspended in RPMI 1640 (Nisui Pharmaceuticals, Tokyo), a complete medium containing glutamine (GIBC0) and antibiotics. Approximately 7 splenocytes were suspended in PBS and transferred to RAG2 /-mice by intravenous injection into the tail vein. Antibody production was measured by the same ELISA as in Example 2 using mouse rDsg3 as the antigen for coating.
  • ELISP0T assay was performed as follows.
  • a 96-well microplate with PVDF bottom (Millipore-Amicon, Beverly, MA) was coated with 30 rg / ml mouse rDsg3.
  • the IgG bound to the membrane was visualized as a spot using an alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse IgG antibody (Zymed Laboratories Inc, San Francisco, CA).
  • the number of spot Bok counted under a stereomicroscope, the frequency of anti MDsg3 IgG-producing B cells, was determined as the number of mononuclear cells per 10 5. All experiments were performed in triplicate. Table 2 shows the number of anti-Dsg3 IgG-producing B cells detected as a result of Atsushi.
  • Anti-Dsg3 IgG-producing B cells were found to be mainly localized in the spleen and lymph nodes of recipient RAG2-/-mice both early (day 22) and late (day 117) during adoptive transfer.
  • Table 2 In the table, RAG2-/-mice to which splenocytes of immunized DSG3-/-mice were transferred are indicated by "+”, and mice not transferred are indicated by "-" (a). “Days” indicates the number of days from transfer to slaughter (b). The number of anti MDsg3 IgG-producing B cells is shown as the number of mononuclear cells per 10 5 (c). The frequency of same kind Dsg3 IgG-producing B cells in the spleen was 100 ranging from mononuclear cells 10 5 cells per 20. Table 2
  • IgG deposition was found on the surface of keratinocyte cells in the advanced squamous epithelium of recipient RAG2-/-mice, including the epidermis (Fig. 3G, around the nose), oral mucosa (Fig. 3F, hard palate), and esophageal mucosa was done.
  • IgG deposition was limited to the lower layers (Fig. 3G), but in the oral and esophageal epithelium IgG was found in all epithelial layers (Fig. 3F). In these mice, no IgG deposits were found in other tissues including heart, lung, liver, kidney, stomach, small intestine, and large intestine.
  • Adhesive tape is applied to the area adjacent to the bald spots and peeled off (hair pull test) (Koch, P ⁇ , et a., J. Cell Sci. 111: 2529 -2537 (1998)), the hairs became clumps and attached to the tape (Fig. 4C). These phenotypes persisted for more than 6 months as long as blood anti-Dsg3 IgG was present.
  • tissue-specific autoimmune diseases autoimmune diseases in which the relationship between target antigens and injurious antibodies or T cells is clear.
  • the model of the present invention is useful for elucidating cellular mechanisms such as production of antibodies against antigen proteins of autoimmune diseases and induction of cytotoxic T cells, particularly by manipulating lymphocytes before adoptive transfer. .
  • This model is also a valuable tool for developing new disease-specific therapies.
  • the main phenotype is weight loss and reversible hair loss, so that the disease activity can be monitored by observing the mice without sacrifice.
  • the ELISA titer of blood anti-Dsg3 antibody is also an objective indicator of disease activity.
  • the phenotype persists for more than six months. Therefore, the effectiveness of each treatment can be easily and objectively evaluated. More importantly, the methods of the present invention can be applied to develop mouse models of the active disease of other tissue-specific autoimmune diseases where the target antigen has been identified.

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Description

明細 自己免疫疾患モデル動物
技術分野
本発明は、 自己免疫疾患のモデル動物およびその作製方法に関する。 ぉ ¾r
尋常性天疱瘡 （pemphigus vulgaris; PV) は、 時として致命的となる皮膚及 び粘膜の自己免疫水疱形成疾患であり、 組織学的には表皮内の水疱形成により特 徴付けられ、 免疫病理学的にはケラチノサイ 卜の細胞表面に対する IgG自己抗 体により特徴付けられる (Stanley, J.R. Pemphigus. In Dermatology in Gene ral Medicine. I . . Freedberg, A. Z. Eisen, K. Wolff, K.F. Austen, L.A. Goldsmith, S.I. Katz, and T.B. Fitzpatrick, eds. McGraw-Hill, New Yor k, 654-666 (1998)) 。 臨床的には、 尋常性天疱瘡患者は、 広範な弛緩性の水疱 及びびらんを示す。 これらは、 あらゆる重層扁平上皮に生じうる。 適当な治療を 行わなければ、 広範囲の皮膚に生じた病巣が体液の病出又は二次的な細菌感染を 引き起こすため、 尋常性天疱瘡は致命的となることもある。 コルチコステロイ ド の全身投与及び免疫抑制療法を用いることにより、 天疱瘡の予後は改善されてい るが、 治療の合併症による死亡のため、 死亡率は依然としてかなり高い。
尋常性天疱瘡の標的抗原は、 最初、 ケラチノサイ 卜抽出物の免疫沈降により、 130kDの糖タンパク質として同定された （Stanley, J.R. et al., J. Clin. In vest. 70:281-288 (1982); Stanley, J.R. et al., J. Clin. Invest. 74:313 -320 (1984)) c その後、 尋常性天疱瘡抗原に特異的なァフィ二ティ精製自己抗 体を用いてヒ ト ·ケラチノサイ ト½現ライブラリーを免疫スクリーニングするこ とにより、 尋常性天疱瘡抗原の cDNAが単離された （Amagai, M. et al., Cell 67:869-877 (1991)) 。 塩基配列の解析により、 尋常性天疱瘡抗原は、 細胞間接 着分子の力ドヘリン ·スーパー遺伝子フアミリーに属することが示された。 尋常 性天疱瘡抗原は、 デスモソ一ムの膜タンパク質であり （Karpati, S. et al., J.
Cell Biol. 122:409-415 (1993)) 、 デスモグレイン 3 (desmoglein3/Dsg3) と名付けられた (Amagai, M. Adv. Dermatol. 11:319-352 (1996)) 。
Dsg3タンパク質に対する IgG自己抗体が尋常性天疱瘡の病因的役割を示す証 拠は多数存在する。 第一に、 経時的な疾患の活性が、 血中抗体力価と相関してい ることが、 間接蛍光抗体法 （Sams Jr， W.M. & Jordon, R.E., Br. J. Dermatol.
84:7-13 (1971)) 又は ELISA (Ishii, K.， et al., J. Immunol. 159:2010-20 17 (1997); Amagai, M.， et al., Br. J. Dermatol. 140:351-357 (1999)) に より報告されている。 第二に、 尋常性天疱瘡を患う母親の新生児は、 胎盤を介し て移行した母親由来の IgGのために一時的に疾患を有する （Merlob， P. et al.,
Pediatrics 78:1102-1105 ( 1986)) 。 母親由来の IgGが異化されるにつれ、 症 状は軽快する。 第三に、 尋常性天疱瘡患者由来の IgGは、 組織培養された皮膚 において、 補体又は炎症細胞なしに水疱形成を誘導することができる （Schiltz,
J.R., & Michel, B., J. Invest. Dermatol. 67:254-260 (1976); Hashimoto,
K. et al., J. Exp. Med. 157:259-272 (1983)) 。 第四に、 患者の血清由来の IgGを新生マウスに受動移入すると、 典型的な組織学的所見を伴う表皮内水疱形 成が起こる (Anhalt, G.J. et al., N. Engl. J. Med. 306:1189-1196 (198 2)) 。 第五に、 患者の血清を、 細胞外ドメインからなる組換え Dsg3タンパク質
(rDsg3) を用いて免疫吸収除去すると、 血清の病原性が除去され、 新生マウス における水疱形成が阻害される (Amagai, M. et al., J. Clin. Invest. 94:59 -67 (1994)) 。 最後に、 rDsg3でァフィ二ティ精製された抗体は、 病原性を有し、 新生仔マウスにおいて 常' I 天 瘡の組織学的所見を作う水疱を形成させる (A magai , M. et al.， J. Clin. Invest. 90:919-926 (1992); Amagai, M. et a 1., J. Clin. Invest. 102:775-782 (1998)) 。
これらの研究から、 尋常性天疱瘡は、 特に自己抗体生成後の過程に関しては、 最もよく特徴が決定された自己免疫疾患の一つとなっている。 従って、 尋常性天 疱瘡は、 現在では、 自己抗体産生又は自己寛容の破壊の細胞メカニズムを研究す るため、 また、 疾患特異的な治療法を開発するための、 組織特異的自己免疫疾患 の良い疾患モデルである。 これらの目標に達するための第一段階として、 尋常性 天疱瘡の活性疾患動物モデルの開発が必要である。
実験的自己免疫疾患動物モデルの大部分は、 様々なアジュバン卜を用いて自己 抗原を繰り返し注射することにより作製されている。 しかし、 重症筋無力症の場 合のように、 アセチルコリン ' レセプ夕一 （T.カリフォルニ力 （T.californic a) ) で免疫されたマウスに活性な疾患が発生する頻度は系統により極めて異な るため、 この方法は、 非常に経験に頼ったものである （Berman, P.W. et al.， Ann. N.Y. Acad. Sci. 377:237-57 (1981)) 。
過去に、 重症複合免疫不全 （SCID) マウスを尋常性天疱瘡患者由来の PBMCで 再構築することにより、 尋常性天疱瘡のインビボ実験モデルが開発された （Juh asz, I. et al. , J. Clin. Invest. 92:2401-7 (1993)) 。 このモデルでは、 患 者由来のリンパ球が低力価の血中自己抗体を産生したが、 マウス皮膚にヒト IgG 沈着を伴う自発的な表皮内水疱が見られることは稀であった。 ヒ卜の皮膚を SCI Dマウスに移植した場合には、 移植された皮膚に尋常性天疱瘡様の水疱が見られ たが、 このモデルにおける水疱発生の原因は、 ヒトの PBMC及び皮膚の組織不適 合による炎症反応である可能性も否定できていない。 このように、 確実な尋常性 天疱瘡の活性疾患モデルは存在していなかった。 明の開示 本発明は、 自己免疫疾患のモデル動物およびその作製方法を提供する。 より詳 しくは、 自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する T細胞や B細胞の活性化と それに伴う自己抗体の安定的な産生が誘導され、 自己免疫疾患の表現型を示す非 ヒト哺乳動物およびその作製方法を提供する。 好ましい態様において、 該モデル 動物は、 自己免疫疾患の抗原タンパク質に対する抗体を産生する B細胞、 およ び/または抗原タンパク質に反応する T細胞を含む免疫担当細胞の移植により作 製される。
本発明者らは、 上記課題を解決するために、 まず、 従来一般的に用いられてき た反復注射法を採用して、 マウス内における自己抗体の産生を試みた。 具体的に は、 3系統のマウス、 BALB/c (H-2d ) 、 C3H/HeJ (H - 2" 、 及び C57BL/6N (H-2 b ) をヒト又はマウスの Dsg3タンパク質で免疫した。 初回免疫においては完全 フロイント ·アジュバントを用い、 その後は、 不完全フロイント ·アジュバント を用いて 3又は 7回追加免疫を行った。 しかしながら、 この方法では、 いずれ のマウスもマウス Dsg3タンパク質に反応することができる抗体を産生せず （表 1 ) 、 尋常性天疱瘡の表現型を全く発現しなかった。
この結果に基づき、 本発明者らは、 マウス体内において病原性抗体が産生され ないのは、 Dsg3タンパク質に対する自己寛容のためであるとの仮説をたてた。 この仮説に基づけば、 遺伝子夕ーゲティング技術により作製した Dsg3欠損マウ スは発生段階で免疫系が Dsg3タンパク質に曝されず、 Dsg3タンパク質に対する 自己寛容を獲得していないと考えられる。
本発明者らは、 この仮説を証明するために、 Dsg3欠損マウスに対して Dsg3夕 ンパク質を免疫して、 Dsg3タンパク質に対する抗体を産生するか否かの検討を 行った。 その結果、 Dsg3タンパク質の免疫により、 DSG3遗伝子をホモで欠損し ている DSG3- /-マウスでは、 DSG3遺伝子をへテロで欠損している DSG3+/-マウス と比較して、 はるかに効率的な抗体の産生が検出された （図 1A) 。 また、 DSG3- /-マウスにおいて産生された抗休は、 ケラチノサイ 卜上のマウス Dsg3夕 質に結合することができたが、 DSG3+/-マウスの抗体は結合できなかった （図 1 B) 。 即ち、 DSG3- /-マウスにおいては、 DSG3タンパク質に対する自己寛容が成 立しておらず、 産生された抗体がマウス Dsg3タンパク質を抗原として認識する ことが判明した。
そこで、 本発明者らは、 次に、 Dsg3タンパク質で免疫した DSG3-/-マウスか ら脾細胞 （DSG3タンパク質に対する抗体の産生能を有する） を取り出し、 これ を RAG2-/-免疫不全マウスに養子移入して、 該マウス内での Dsg3タンパク質に 対する抗体の産生および尋常性天疱瘡の表現型の発現を試みた。 RAG2- /-マウス は、 Dsg3タンパク質を発現している力 T細胞レセプ夕一又は免疫グロブリン の遺伝子を再編成することができないため、 これらのマウスには成熟 T又は B 細胞が存在しない （即ち、 免疫不全となっている） 。
その結果、 DSG3- /-マウスの脾細胞が移植された RAG2-/-マウスでは、 脾細胞 に含まれる Dsg3タンパク質に特異的なリンパ球が内因性の Dsg3タンパク質に 結合し、 これにより Dsg3タンパク質に対する抗体が永続的に産生された （図 2 A) 。 また、 免疫された DSG3-/-脾細胞をもつ RAG2- /-マウスは、 DSG3- /-マウス とほぼ同一の表現型を示すことが見出された （Koch, P.J., et al.， J. Cell S ci. 111:2529-2537 (1998); Koch, P.J., et al.， J. Cell Biol. 137:1091-1 102 (1997)) 。 いずれのマウスも、 粘膜のびらん性損傷、 皮膚の基底上棘融解、 休止期毛の消失を示した （図 3) 。 DSG3- /-脾細胞の養子移入により G2- / -受 容マウスにおいてほぼ同一の表現型が再現したことは、 産生された抗体が特異的 かつ病原性であることを証明するものである。
この抗体の特異性は、 Dsg2タンパク質を允現している他の単層上皮 （Schafer, S. et al., Exp. Cell Res. 211:391-9 ( 1994)) 、 乂は Dsglタンパク質を発 現している表皮の上部 （図 3G) (Amagai, M. et al., J. Invest. Dermatol. 106:351-355 ( 1996)) には、 インビボの沈着が見られないことからも裏付けら れる。 このように、 本発明は、 天疱瘡の最初の疾患マウスモデルおよびその作製方法 を提供するものである。 本発明の方法は、 その性質上、 自己抗体の標的が同定さ れている他の自己免疫疾患のモデル動物の作製に広く応用することが可能である。 従って、 本発明は、 自己免疫疾患のモデル動物およびその作製方法に関し、 よ り具体的には、
( 1 ) 自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生または T細胞の 活性化により、 自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物、
(2) 自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物の免疫担当細 胞が移植されている、 （ 1 ) に記載の非ヒト哺乳動物、
(3) 自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物を抗原タンパ ク質で免疫し、 その免疫担当細胞が移植されている、 （ 1 ) に記載の非ヒト哺乳 動物、
(4) 免疫担当細胞の移植が、 免疫不全非ヒト哺乳動物に対して行われている、 (2) または （3) に記載の非ヒト哺乳動物、
(5) 免疫不全非ヒ卜哺乳動物が、 RAG2遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動 物である、 （4) に記載の非ヒ卜哺乳動物、
( 6) 免疫担当細胞が脾細胞である、 （2) から （ 5 ) のいずれかに記載の非 ヒト哺乳動物、
(7) 自己免疫疾患が尋常性天疱瘡である、 （ 1 ) から （ 6) のいずれかに記 載の非ヒト哺乳動物、
(8) 抗原タンパク質がデスモグレイン 3タンパク質である、 （7) に記載 の非ヒ卜哺乳動物、
( 9 ) げっ歯類である、 （ 1 ) から （ 8 ) のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物、 ( 1 0) マウスである、 （ 9 ) に記載の非ヒ ト哺乳 カ物、 ( 1 1) 自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生または T細胞 の活性化により、 自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物の作製方法であつ て、
(a) 自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物を自己免疫疾患 の抗原夕ンパク質で免疫する工程、
(b) 該非ヒト哺乳動物から免疫担当細胞を調製する工程、 および
( c) 該免疫担当細胞を抗原タンパク質を有する非ヒト哺乳動物に移植する工程、 を含む方法、
( 12) 免疫担当細胞の移植が、 免疫不全非ヒト哺乳動物に対して行われてい る、 （ 1 1) に記載の方法、
( 13) 免疫不全非ヒト哺乳動物が、 RAG2遺伝子を欠損している非ヒト哺乳 動物である、 （ 12) に記載の方法、
( 14) 免疫担当細胞が脾細胞である、 （ 1 1) から （ 13) のいずれかに記 載の方法、
( 15) 自己免疫疾患が尋常性天疱瘡である、 （ 1 1) から （ 14) のいずれ かに記載の方法、
( 16) 抗原タンパク質がデスモグレイン 3タンパク質である、 （ 15) に 記載の方法、
( 17) 非ヒト哺乳動物がげつ歯類である、 （ 1 1 ) から （ 1 6 ) のいずれか に記載の方法、
( 18) げっ歯類がマウスである、 （ 17) に記載の方法、 に関する。
本発明のモデル動物は、 自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の安定 的な産生、 または T細胞の持続的な活性化により、 自己免疫疾患の表現型を示 すことができる。
本発明においてモデル動物の作製を行うための対象疾患としては、 己免疫疾 患であれば特に制限はない。 s己免疫疾患としては、 冽えば、 常性天疱瘡、 症筋無力症、 自己免疫性溶血性貧血、 バセドー病、 橋本病、 グッ 卜パスチヤ一症 候群、 自己免疫性糖尿病、 多発性硬化症などが挙げられるが、 これらに制限され ない。
モデル動物の作製に用いられる動物は、 好ましくは非ヒト哺乳動物である。 非 ヒト哺乳動物としては、 遺伝子欠損動物を作製しうるものであれば制限はない。 好適な動物としては、 げっ歯類、 例えば、 マウスが挙げられる。
本発明のモデル動物は、 抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物を自己免疫 疾患の抗原タンパク質で免疫し、 その免疫担当細胞を摘出し、 これを該抗原タン パク質を有する他の非ヒ卜哺乳動物に移植することにより作製することができる 抗原遺伝子を欠損した動物の作製は、 当業者に公知の方法で行うことができる 欠損させる抗原遺伝子としては、 例えば、 自己免疫疾患が尋常性天疱瘡であれば
DSG3遺伝子、 重症筋無力症であればアセチルコリン受容体遺伝子、 バセドー病 や橋本病であれば TSH受容体遺伝子、 グッ トパスチヤ一症候群であれば IV型コ ラーゲン遺伝子、 多発性硬化症であればミエリン塩基性蛋白質遺伝子などが挙げ られるが、 これら例示したものに制限されない。
また、 免疫担当細胞の摘出は、 胸腺、 リンパ節、 脾臓、 肝臓、 腸管上皮、 抹消 血などから行なうことができるが、 これらに制限されない。 成熟した免疫担当細 胞が多く含まれる脾臓は、 免疫担当細胞を摘出するための好適な臓器である。 免疫担当細胞を調製するための動物 （ドナー） と免疫担当細胞の移植を受ける動 物 （レシピエント） は、 移入される免疫担当細胞由来のリンパ球がレシピエント の組織を破壊する GVHDが発症しないようにするために、 同種であり、 遺伝子背 景が同じであることが好ましい。
また、 レシピエン卜は、 移入された免疫担当細胞由来のリンパ球を拒絶しない ようにするために、 免疫不全であることが好ましい。 免疫不全動物としては、 R AG2遺伝子が欠損した動物以外に、 例えば、 SCIDマウス、 ヌードマウスを用い ることも考えられる。 また、 MHCノックアウトマウスや共通ァ鎖ノ ヅクアウトマ ウスなどを用いることも考えられるが、 これらに制限されない。
ドナーの抗原タンパク質での免疫、 ドナーからの免疫担当細胞の調製、 および レシピエントへの免疫担当細胞の移植は、 例えば、 実施例に記載の方法により行 うことができる。
調製された本発明のモデル動物は、 自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する 抗体の安定的な産生、 または T細胞の持続的な活性化により、 自己免疫疾患の 表現型を示すことができる。 尋常性天疱瘡のモデル動物においては、 主要な表現 型として体重減少及び可逆的な脱毛などを示す。 また、 尋常性天疱瘡以外の自己 免疫疾患では、 重症筋無力症では筋力低下、 自己免疫性溶血性貧血では貧血、 バ セドー病では甲状腺機能亢進、 橋本病では甲状腺機能低下、 グットパスチヤ一症 候群では腎障害や肺障害、 自己免疫性糖尿病では糖尿、 多発性硬化症では神経麻 痺などの表現型を示すと考えられる。
これらのモデル動物は、 自己免疫疾患の治療効果を検討したい所望の化合物を 投与し、 その表現型を観察することにより、 該疾患に対する治療薬や治療法の開 発に用いることができる。 特に、 本実施例において作製された尋常性天疱瘡のモ デルマウスは、 その主要な表現型が体重減少及び可逆的な脱毛であり、 また表現 型が 6か月以上に亘つて持続するため、 該マウスを屠殺することなく観察してそ れそれの治療薬や治療法の有効性を容易かつ客観的に評価することが可能である。 また、 これらのモデルマウスは、 抗原タンパク質に対する抗体産生の細胞メカ二 ズムを解明する上でも非常に有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 DSG3-/-マウスにおける、 インビボで結合できる抗 Dsg3 IgGの産生 を示す図 （A) および写真 （B) である。 （A) DSG3- /-マウス及びその +/-同腹マ ウスをマウス rDsg3で免疫し、 抗 Dsg3 IgGの力価を絰時的に ELISAで測定した。 矢印は、 完全フロイント ·アジュバントを用いたマウス rDsg3による最初の免 疫を示し、 矢尻は不完全フロイン卜 ·アジュバント用いたマウス rDsg3による 追加免疫を示す。 DSG3- /-マウスは、 +/-同腹マウスよりもはるかに効率よく抗 D sg3 IgGを産生した。 （B) 免疫された DSG3- /-マウス （a) 由来の血清により、 培養ケラチノサイ 卜の細胞間接触部位が染色されたが、 +/-同腹マウス （b) 由 来の血清では染色されなかった。 バーは を表す。
図 2は、 免疫された DSG3-/-脾細胞の移入後、 受容 RAG2- /-マウスにおいて抗 Dsg3 IgGが産生されたことを示す図である。 （A) 免疫された DSG3- /-マウスの 脾細胞を受容した RAG2- /-マウス [RAG2- /- (DSG3- /- ) ] 又は DSG3+/-マウスの脾 細胞を受容した RAG2- /-マウス [RAG2-/- (DSG3+/- ) ] で、 マウス rDsg3に対する ELISAスコアを得た。 DSG3-/-脾細胞をもつ RAG2- /-マウスは、 持続的な抗 Dsg3 IgG産生を示した。 矢印は、 脱毛表現型が出現した日を示す。 対照的に、 DSG3+/ -脾細胞をもつ RAG2-/-マウスに関する EL ISAは、 いずれの時点においても陰性 のままであった。 （B) 受容 RAG2-/-マウスの体重変化を経時的にプロットした。 DSG3- /-脾細胞をもつ RAG2- /-マウスでは、 10〜14日目に、 DSG3+/-脾細胞をも つマウスと比較して体重増加が遅れ始め、 その後体重が減少し続けた。 数匹は死 亡し （†) 、 数匹は生き残り、 その後体重を増やした。
図 3は、 免疫された DSG3- /-脾細胞を移入された RAG2- /-マウスは、 尋常性天 疱瘡の表現が見られたことを示す写真である。 脾細胞の移入の？〜 14日後付近 に、 DSG3- /-脾細胞をもつ RAG2- /-マウス （A、 下） では、 DSG3+/-脾細胞をもつ マウス （A、 上） と比較して体重減少が認められた。 数匹は、 マウスが搔破する 鼻及び頰の周辺に、 痂皮のあるびらんを発症した （B) 。 DSG3- /-脾細胞をもつ R AG2-/-マウスの組織診により、 粘膜上皮の基底層直上に表皮内水疱形成が明ら かになつた （ 硬口蓋； D、 食道上部） 。 びらん病巣の下には炎症性浸潤物が 認められた （E、 食道上部） 。 直接蛍光抗体法により、 粘膜上皮 （F、 硬口蓋） 及び皮膚 （G、 鼻周辺） に、 ケラチノサイ ト細胞表面上のインビボの IgG沈着が 認められた （図の白い部分） 。 バーは 50〃mを示す。
図 4は、 免疫された DSG3 -/-牌細胞を移入された RAG2- /-マウスは、 DSG3-/- マウスに見られるのと同様な、 脱毛表現型が見られたことを示す写真である。 移 入の 15〜25日後付近に、 DSG3- /-脾細胞をもつ RAG2- /-マウスは部分的な脱毛を 示した （A、 B) 。 粘着テープによるヘア · プル ·テス卜で、 DSG3- /-脾細胞をも つ RAG2-/-マウスでは毛の集塊がテープに付着したが （C、 左） 、 DSG3+/-脾細胞 をもつ RAG2-/-マウスでは毛が付着しないことが示された （C、 右） 。 その後、 無毛領域に新たな毛がモザイク状に再生した （D、 矢印） 。 組織診により、 毛球 部の細胞と、 外毛根鞘上皮の基底層との間の棘融解 （E、 矢印） 、 及び空の膨張 した休止期毛包 、 矢印） が示された。 直接蛍光抗体法、 毛根部のケラチノサ ィ 卜の細胞表面にはインビボの IgG沈着が見られた （G、 H) (図の白い部分） 。 バーは 50 mを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
[実施例 1 ] 組換えマウス Dsg3タンパク質の製造
マウス Dsg3の全細胞外ドメインをコードする cDNA (Genbank U86016) を、 適 当なプライマ一 （5， -CCGAGATCTCCTATAAATATGACCTGCCTCTTCCCTAGA-3' /配列番 号： 1、 5， - CGGGTCGACCCTCCAGGATGACTCCCCATA- 3， /配列番号： 2 ) を用いて、 マウス Dsg3 cDNAを含むファージクローン （Dr . Jouni Uittoより譲り受けた） を銪型として PCR増幅し、 増幅断片を pEVmod- Dsg3- Hisベクタ一 ( Ishi i , Κ·， et al .， J. Immunol . 159 : 2010-2017 ( 1997) ) 中のヒ卜 Dsg3 cDNAと入れかえ ることによりサブクロ一ニングした （pEVmod- mDsg3-His ) 。 組換えバキュ口夕 ンパク質、 マウス rDsg3は、 以前の記載のようにして調製した （Amagai , M. et al.， J. Clin. Invest. 94:59-67 (1994); Amagai, M. et al.， J. Invest. Dermatol. 104:895-901 (1995)) 。
[実施例 2 ] DSG3+/+野生型マウスにおけるマウス Dsg3タンパク質の免疫 まず、 ヒト又はマウスの rDsg3の免疫により、 様々な野生型マウス系統にお いて Dsg3タンパク質に対する抗体を産生させようと試みた （表 1) 。
マウスを、 完全フロイン卜 ·アジュバント （CFA) を用いて、 5〃gのマウス又 はヒトの精製 rDsg3を腹腔内注射することにより感作し、 その後毎週、 3回また は 7回、 不完全フロイント 'アジュバント （IFA)を用いて、 マウス又はヒトの r Dsg3で追加免疫した。 抗体産生は、 それそれの追加免疫の 3日後に ELISAによ り試験した。
マウスにおけるマウス Dsg3夕ンパク質（mDsg3)またはヒト Dsg3夕ンパク質（h Dsg3)に対する血中 IgGの ELISAによる測定は、 マウスまたはヒト rDsg3をコ一 ティング用抗原として用いた。 具体的に説明すると、 マイクロ夕イタ一 96穴プ レー卜を、 4°Cで-一晩、 100〃1の 5〃g/nilの精製マウスまたはヒト rDsg3でコー ティングした。 全ての血清試料を 50から 5,000倍に希釈し、 室温で 1時間、 96 穴 ELISAプレート上でインキュベートした。 ペルォキシダ一ゼ結合ャギ抗マウ ス IgG抗体 （MBL, Nagoya, Japan) と共に室温で 1時間インキュベートした後、 lmMのテトラメチルベンジジンをペルォキシダーゼの基質として用い、 発色させ た (Ishii K et al.,J Immunol 159: 2010-2017, 1997、 Amagai M et al., B r J Dermatol 140:351-357, 1999) 。 各試料をデュプリケートで分析した。 マ ウス rDsg3で免疫された DSG3-/-マウスから得られた単一の血清試料を陽性対照 として用い、 免疫されていないマウス由来の血清を陰性対照として用いた。 ELI SAスコアは、 [ (試料の 0D—陰性対照の 0D) / (陽性対照の 0D—陰性対照の◦ D) χΙΟΟ]で計算される指数として得た （表 1 ) 。
さらに、 Dsg3タンパク質に対する抗体産生を、 培養ケラチノサイ 卜の免疫蛍 光染色により試験した。 マウス 'ケラチノサイ ト細胞株 PAM212 (Yuspa, S.H. e t al . 3 Cancer Res. 40 :4694-4703 ( 1980 ) ) 又はヒト ·ケラチノサイ ト細胞株 KU8 (Tsukamoto, T.， Keio J. Med. 38 :277-293 ( 1989) ) を、 37°Cで、 5%C02 を含む加湿空気中で、 30分間、 10%FCSを含む DMEMで 20倍に希釈したマウス 血清試料と共にインキュベートした。 次に、 PBS ( -)で洗浄した後、 — 20°Cで 20 分間、 細胞を 100%メタノールで固定化し、 フルォレセイン 'イソチオシァネ一 ト （FITC) 結合ャギ抗マウス IgG抗体 （DAKO, Copenhagen, Denmark) と共に室 温で 30分間インキュベートした。 染色は、 蛍光顕微鏡 （Nikon, Ecl ipse E800) で観察した。
C57BL/6Nマウス又は BALB/cマウスを、 完全フロイン ト 'アジュバント、 次に 不完全フロイント ·アジュバントを用いてヒト rDsg3で免疫した場合、 これら のマウスは、 ヒト rDsg3とのみ反応し、 マウス rDsg3とは反応しない IgGを産 生することが、 ELISA及び免疫蛍光染色により決定された。 C3H/HeJマウスのみ が ELISAでマウス rDsg3に対する弱い交叉反応性を示す IgGを産生した。 これ らの 3系統のマウスをマウス rDsg3で免疫した場合には、 いずれのマウスも、 用いた 3つの方法 （ ELISA、 間接蛍光抗体法、 生ケラチノサイ 卜染色（l iving k eratinocyte staining) ) いずれによっても、 マウス又はヒトの rDsg3を認識す る IgGを産生しなかった。 これらの知見から、 DSG3+/+野生型マウスは Dsg3に 対する免疫寛容を有しており、 DSG3+/+野生型マウスにマウス Dsg3に対する抗 体を産生させるのは困難であることが示唆された。
表 1 マウス系統 n 抗原 a CFA IFAb ELISAC IIFd 生細胞染色 e raDsg3 hDsg3 画 S NHS Pam KU8
C57BL/6N 2 hDsg3 1 3 18.4 93.4 - + 一 +
BALB/c 3 hDsg3 1 3 6.3 85.4 - + 一 +
C3H/HeJ 2 hDsg3 1 3 47.5 167.7 一 + - +
C57BL/6N 3 mDsg3 1 7 10.6 10.1
BALB/c 3 mDsg3 1 7 1.7 2.3
C3HHeJ 3 mDsg3 】 7 5.4 7.5 D ND
表 1中、 抗原の欄には、 組換えヒト Dsg3を用いた場合は 「hDsg3」 、 組換え マウス Dsg3を用いた場合は 「mDsg3」 で示した （a)。 「CFA」 は、 完全フロイン ト ·アジュバント（CFA)を用いた精製マウスまたはヒト組換え Dsg3の免疫回数 を、 また、 「IFA」 は、 その後毎週行った、 不完全フロイン卜 'アジュバント（I FA)を用いた追加免疫 （ブースト） の回数 （3回または 7回） を表す （b)。 ELIS Aスコアはヒト組換え Dsg3(hDsg3)またはマウス組換え Dsg3(mDsg3)に対して算 出した （c)。 20.0より大きければ陽性と判断される。 表中の 「IIF」 は、 マウス 血清を用いて、 正常マウス皮膚 （丽 S)または正常ヒ卜皮膚 （NHS)の間接蛍光抗 体染色 （IIF)を行った結果を示す （d)。 また、 表中の 「生細胞染色」 は、 マウ ス血清を用いて、 培養マウス ·ケラチノサイ ト細胞株 (Pam)またはヒト ·ケラチ ノサイ ト細胞株 （KU8) の生細胞染色を行った結果を示す （e)。 「-」 は陰性を、
「十」 は陽性を表す。 「ND」 は試験していないことを示す。
[実施例 3] DSG3-/-マウスおよび DSG3+/-マウスにおけるマウス Dsg3タンパ ク質の免疫
DSG3- /-マウスは、 雄 DSG3- /-マウスと雌 DSG3+/-マウスの交配により得た ( och, P.J., et al.， J. Cell Biol. 137:1091-1102 (1997)) 。 また、 B6.SJL- ptpr'〕に 10 ffi代にわたり j し交配させた RAG2- /-マウスは、 夕コニック礼 (Taco nic) (German Town, NY) より入手した （Schulz, R.-J. et al.， J. Immunol. 157:4379-4389 (1996)) 。
DSG3- /-マウスには Dsg3タンパク質に対する免疫寛容がないことを確認する ため、 DSG3- /-マウスをマウス rDsg3で免疫し、 マウス rDsg3に対する ELISAス コアを測定した。
DSG3- /-マウス及び DSG3+/-マウスを、 完全フロイント 'アジュバントを用い て、 5〃gの精製マウス rDsg3で感作し （0日目） 、 その後、 8、 15、 22、 および 28日目に、 不完全フロイント 'アジュバントを用いて、 マウス rDsg3で追加免 疫した。 抗体産生は、 マウス rDsg3をコーティング用抗原として用いて、 実施 例 2と同様の ELISAにより測定した。
DSG3- /-マウス （n二 4) では、 早くも 11 日目に抗 Dsg3 IgGの産生が観察され、 その後その力価は増加し続けた （図 1A) 。 DSG3+/-マウスを繰り返し免疫すると. 最終的には ELISA力価が増加したが、 その力価は 32日目の DSG3- /-マウスの力 価より有意に低かった （p<0.0001) 。
これらのマウスで産生された抗 Dsg3 IgG力 インビボでケラチノサイ ト上の Dsg3夕ンパク質に結合することができるか否かを決定するため、 マウス ·ケラ チノサイ ト細胞株 Pani212を用いて実施例 2と同様に生体染色を行った。 DSG3 -/ -マウス由来の血清を培養培地に添加すると、 それらの血清は培養ケラチノサイ 卜の細胞間接着部位に結合したが、 DSG3+/-マウス由来の血清は細胞表面の染色 を全く示さなかった （図 1B) 。 免疫された DSG3+/-マウスの表皮にはインビボ の IgG沈着は見られなかった。 従って、 DSG3+/-マウスで産生された抗体は、 精 製マウス rDsg3中の微量混入成分、 マウス rDsg3の C末端のタグ、 又はインビ ボの条件では到達できないマスキングされた Dsg3ェピトープに対して産生され たものである可能性が極めて高い。 これらの結果から、 DSG3- /-マウスには Dsg3に対する免疫寛容がなく、 マウ ス rDsg3で DSG3-/-マウスを免疫することにより、 Dsg3の接着機能を阻害する 病原性 IgGが産生されることが示唆された。
[実施例 4 ] 受容 RAG2- /-マウスにおける病原性抗 Dsg3 IgGの永続的な産生
DSG3-/-マウスは標的抗原を欠損しているため、 DSG3-/-マウスでは抗 Dsg3 Ig Gにより表現型が変化しないと予想された。 そこで、 免疫された DSG3- /-マウス 又は DSG3+/-マゥスの脾細胞を RAG2- /-免疫不全マウスに移入する実験を行つた。 RAG2- /-マウスは、 Dsg3タンパク質を発現しているが、 T細胞レセプ夕一又は免 疫グロプリンの遺伝子を再編成することができないため、 これらのマウスには成 熟 T又は B細胞が存在しない。 そのため、 移入した脾細胞が拒絶されず、 受容 マウスで抗 Dsg3 IgGが産生されると考えられる。
DSG3- /-マウス及び DSG3+/-マウスを、 完全フロイント ·アジュバントを用い て、 5〃gの精製マウス rDsg3で感作し （0日目） 、 その後、 7日目及び 14日目 に、 不完全フロイント 'アジュバントを用いて、 マウス rDsg3で追加免疫した。 抗体産生は、 18日目に実施例 2と同様の ELISAにより確認した。 最後に、 アジ ュバントを用いずにマウス rDsg3で追加免疫し、 追加免疫の数日後に、 免疫担 当細胞として脾細胞を調製するためマウスを屠殺した。
脾細胞の養子移入にあたっては、 単核細胞を、 DSG3- /-マウス又は DSG3+/ -マ ウスの脾臓から単離し、 10%ゥシ胎児血清、 0.21%重炭酸ナトリウム溶液 （w/ V) 、 2mM いグルタミン （GIBC0) 、 及び抗生物質を含む完全培地 RPMI 1640 (Nis sui Pharmaceuticals, Tokyo) に再懸濁させた。 約 ΙχΙ Ο 7個の脾細胞を PBSに懸 濁させ、 尾静脈への静脈注射により RAG2 /-マウスに移入した。 抗体産生は、 マ ウス rDsg3をコーティング用抗原として用いて、 実施例 2と同様の EL ISAによ り測定した。
DSG3-/ -脾細胞を移人してから早くも 4曰目には受容 RAG2-/-マウスの血中に 抗 Dsg3 IgGが険出された。 抗体産生は迅速に ¾加し、 21 近でブラ トーに 達し、 その後永続的に持続した （n = 13) (図 2A) 。 持続的な抗体産生は、 6ケ 月以上にわたり、 マウスが生存している限り観察された。 対照的に、 DSG3+/ -マ ウス脾細胞を移入された RAG2-/-マウスの血中には、 いずれの時点においても抗 Dsg3 IgGが検出されなかった （n = 5) (図 2A) 。
抗 Dsg3 IgG産生 B細胞の局在を調べるため、 以下のようにして ELISP0Tアツ セィを行った。 PVDF底 96穴マイクロ夕イタ一 · プレート （Mil l ipore- Amicon，B everly,MA) を、 30〃g/mlのマウス rDsg3でコーティングした。 再構築された R AG2- /-マウスの末梢血、 脾臓、 骨髄、 及びリンパ節から調製された単核細胞を、 37°Cで、 5 %C02を含む加湿空気中で、 4時間、 プレート上でインキュベートした。 アルカリホスファタ一ゼ結合抗マウス IgG抗体 （Zymed Laboratories Inc , San Francisco, CA) を用いて、 メンブレンに結合した IgGをスポットとして可視化 した。 スポッ 卜の数を実体顕微鏡下で計数し、 抗 mDsg3 IgG産生 B細胞の頻度 を、 単核細胞 105個当たりの数として決定した。 全ての実験はトリプリケートで 行った。 アツセィの結果検出された、 抗 Dsg3 IgG産生 B細胞の数を表 2に示す。 抗 Dsg3 IgG産生 B細胞は、 養子移入の初期 （22日目） にも後期 （117日目） にも受容 RAG2- /-マゥスの脾臓及びリンパ節に主に局在していることが判明した (表 2) 。 表中、 免疫された DSG3-/-マウスの脾細胞を移入された RAG2-/-マウ スは 「+」 で、 移入されていないマウスは 「-」 で表した（a)。 また、 「日数」 は 移入から屠殺までの日数を表す（b)。 また、 抗 mDsg3 IgG産生 B細胞の数は、 単 核細胞 105個当たりの数として示されている（c )。 脾臓における伉 Dsg3 IgG産生 B細胞の頻度は、 単核細胞 105個当たり 20から 100個の範囲であった。 表 2
マウス ―移 日数 b 脾臓 Jンパ節 骨髄 PB C
RAG#466 - 0.0±0.0C 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 RAG#514 + 22 86.5±29.9 13.5±13.6 0.0+0.0 3.8±5.4 RAG#212 + 33 102.1 ± 14.7 47.8±8.8 0.0±0.0 0.0+0.0 RAG#134 1 1 7 20.8±5.9 1 6.5±5.9 2. 2.9 0.0±0.0 RAG#135 + 1 1 7 3 1 .3±8.8 27.1 ±2.9 0.0±0.0 0.0±0.0
[実施例 5 ] 免疫された DSG3- /-脾細胞をもつ RAG2-/-マウスは尋常性天疱瘡 の表現型を発現した
免疫された DSG3-/-脾細胞をもつ受容 RAG2-/-マウスにおいて最初に認められ た症状として、 養子移入の？〜 14日後付近で、 DSG3+/-脾細胞をもつマウス （n = 5) と比較して体重減少が認められた （n = 13) (図 2B及び 3A) 。 その後、 こ れらのマウスでは体重が減少し続け、 数匹は実際に死亡した。 これらのマウスの うち生き残つたものは、 後に体重を増やし始めた （図 2B) 。 体重減少の表現型 は、 調べた RAG2受容-/-マウス全てに観察された （n二 13) 。 受容 RAG2-/-マウ スのうちの数匹 （n二 5 ) は、 搔破を通常行う部位である鼻周辺の皮膚に痂皮の あるびらんを発症した （図 3B) 。
表皮 （図 3G、 鼻周辺） 、 口腔粘膜 （図 3F、 硬口蓋） 、 及び食道粘膜を含め、 受容 RAG2-/-マウスの進層扁平上皮のケラチノサイ ト細胞表面には、 インビボの IgG沈着が見られた。 数層のケラチノサイ 卜が見られる表皮では、 IgG沈着は下 方の層に限定されていたが （図 3G) 、 口腔及び食道の上皮では上皮全層に IgG が見られた （図 3F) 。 これらのマウスにおいて、 心臓、 肺、 肝臓、 ^臓、 胃、 小腸、 及び大腸を む他の組織には IgG沈 が見られなかった。 免疫された DSG 3 -/ -脾細胞をもつ RAG2-/-マウスにおける糾織^により、 M粘股、 硬口. (図 3 C) 、 口腔咽頭領域、 及び食道上部 （図 3D) に、 基底層直上の上皮内分裂、 即ち、 典型的な尋常性天疱瘡所見である基底層直上の棘融解が示された。 水疱形成の初 期病巣には、 有意な炎症細胞浸潤物は本質的に見られなかった （図 3C) 。 炎症 性浸潤物は、 古いびらん病巣に主に認められた （図 3E) 。 そこでは、 上皮の障 壁機能の消失により食物による刺激及び急性炎症が二次的に引き起こされていた。 これらの損傷が、 おそらく、 これらのマウスの成長阻害をもたらす程に食物摂取 を減少させたものと考えられる。
対照的に、 免疫された DSG3+/-脾細胞をもつ RAG2- /-マウスには、 表現型の変 化または病理学的な変化は認められなかった。 これらの知見から、 免疫された D SG3- /-脾細胞をもつ RAG2-/-マウスは、 尋常性天疱瘡の表現型を発現することが 示された。
[実施例 6 ] 免疫された DSG3-/-脾細胞をもつ RAG2- /-マウスは、 脱毛表現型 を示した
養子移入の 15〜25日後付近に、 13匹の RAG2- /-マウスのうち 11匹において、 部分的な脱毛が認められた （図 2A、 矢印参照、 図 4A、 B) 。 典型的には、 脱毛 は小さなスポッ トとして発生し、 次の 2から 3週間で次第に周囲へと拡大した。 受容 RAG2-/-マウスが 12週齢以下のとき、 額で脱毛が開始し、 後方へと進展し た。 数匹のマウスにおいては、 脱毛斑に新たな毛がモザイク状に再生したが、 脱 毛斑が同一スポッ トとして 1ヶ月以上残存したマウスや、 明確な脱毛斑を形成 せずに脱毛が広がったマウスもいた （図 4 D) 。 脱毛斑の隣接領域に粘着テープ を貼付し、 それを剥離すると （ヘア · プル ·テスト （hair pul l test) ) (Koc h， P丄， et aし， J . Cel l Sc i . 111 : 2529-2537 ( 1998 ) ) 、 毛が塊となりテ一 プに付着した （図 4C) 。 これらの表現型は、 6ヶ月以上にわたり、 血中抗 Dsg3 IgGが存在する限り持続した。
RAG2-/-受容マウスの皮膚の生検により、 毛球部 （hair c lub) 周辺のケラチ ノサイ 卜の細胞表面に強い IgG沈 が示された （図 4G、 H) 。 毛包の IgG結合の 強度は、 表皮よりもはるかに大きかった （図 4G) 。 皮膚の組織診により、 休止 期の毛球部周辺の細胞と外毛根鞘の基底層との間の棘融解が示された （図 4E、 H、 矢印） 。 脱毛斑には、 休止期毛の消失と一致して、 空の膨張した休止期毛包が存 在した （図 4F) 。 損傷のない表層の表皮には明白な棘融解はなかった。 棘融解 を起こした毛包の周辺に、 明らかな炎症細胞浸潤は認められなかった （図 4E、 F) 。
対照的に、 DSG3+/-脾細胞を移入された RAG2- /-マウスは、 いずれの時点にお いても、 脱毛斑を示さなかった。 産業上の利用の可能性
このモデルの開発により、 組織特異的な自己免疫疾患 （標的抗原と傷害を起こ す抗体あるいは T細胞の関係が明快になっている自己免疫疾患） に関する研究の 新たな方向性が開かれた。 本発明のモデルは、 特に養子移入の前にリンパ球を操 作することにより、 自己免疫疾患の抗原タンパク質に対する抗体産生や細胞障害 性 T細胞の誘導などの細胞メカニズムを解明するために有用である。 また、 こ のモデルは、 新規な疾患特異的な治療法の開発のための貴重な道具ともなる。 本 発明の尋常性天疱瘡モデル動物においては、 主要な表現型が体重減少及び可逆的 な脱毛であるため、 屠殺することなくマウスを観察することにより、 疾患の活性 をモニターすることができる。 血中抗 Dsg3抗体の ELISA力価も、 疾患の活性の 客観的な指標である。 さらに、 表現型は、 6ヶ月以上にわたり持続する。 従って、 それそれの治療法の有効性を容易に、 客観的に評価することができる。 さらに重 要なことには、 本発明の方法は、 標的抗原が同定されている、 他の組織特異的自 己免疫疾患の活性疾患マウスモデルを開発するために応用できる。

Claims

請求の範囲
1 . 自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生または T細胞の活 性化により、 自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物。
2 . 自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物の免疫担当細胞 が移植されている、 請求項 1に記載の非ヒト哺乳動物。
3 . 自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物を抗原タンパク 質で免疫し、 その免疫担当細胞が移植されている、 請求項 1に記載の非ヒト哺乳 動物。
4 . 免疫担当細胞の移植が、 免疫不全非ヒト哺乳動物に対して行われている、 請求項 2または 3に記載の非ヒト哺乳動物。
5 . 免疫不全非ヒト哺乳動物が、 RAG2遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物 である、 請求項 4に記載の非ヒト哺乳動物。
6 . 免疫担当細胞が脾細胞である、 請求項 2から 5のいずれかに記載の非ヒト 哺乳動物。
7 . 自己免疫疾患が尋常性天疱瘡である、 請求項 1から 6のいずれかに記載の 非ヒト哺乳動物。
8 . 抗原タンパク質がデスモグレイン 3タンパク質である、 請求項 7に記載 の非ヒト哺乳動物。
9 . げっ歯類である、 請求項 1から 8のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
1 0 . マウスである、 請求項 9に記載の非ヒト哺乳動物。
1 1 . 自己免疫疾患の抗原タンパク質に反応する抗体の産生または Τ細胞の 活性化により、 自己免疫疾患の表現型を示す非ヒト哺乳動物の作製方法であって、
( a ) 自己免疫疾患の抗原遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動物を自己免疫疾患 の抗原タンパク質で免疫する工程、
( b ) 該非ヒ ト哺乳動物から免疫担当細胞を調製する工程、 および (c) 該免疫担当細胞を抗原タンパク質を有する非ヒト哺乳動物に移植する工程、 を含む方法。
12. 免疫担当細胞の移植が、 免疫不全非ヒト哺乳動物に対して行われている、 請求項 1 1に記載の方法。
13. 免疫不全非ヒト哺乳動物が、 RAG2遺伝子を欠損している非ヒト哺乳動 物である、 請求項 12に記載の方法。
14. 免疫担当細胞が脾細胞である、 請求項 1 1から 13のいずれかに記載の 方法。
15. 自己免疫疾患が尋常性天疱瘡である、 請求項 1 1から 14のいずれかに 記載の方法。
16. 抗原タンパク質がデスモグレイン 3タンパク質である、 請求項 15に 記載の方法。
17. 非ヒト哺乳動物がげつ歯類である、 請求項 1 1から 16のいずれかに記 載の方法。
18. げっ歯類がマウスである、 請求項 17に記載の方法。
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