WO2000053005A1

WO2000053005A1 - HETEROGENOUS AND HOMOGENEOUS MOUSE VARIANTS LACKING sno GENE

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Publication number: WO2000053005A1
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Inventors: Shunsuke Ishii
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Description

明細書 s n o遺伝子欠損へテロ及びホモ変異マゥス技術分野

本発明は、 s n o遺伝子が欠損したヒト以外の動物、好ましくはマウス、当該動物の細胞、好ましくは胚、又はそれらの動物又は細胞を用いた物質のスクリーニング方法に関する。背景技術

CB Pなどのコアクティべ一タ一、 N— C o Rなどのコリブレッサ一は「仲介因子」と呼ばれている。仲介因子はプロモーター上流のェンハンサー ' サイレンサ一に結合する転写制御因子とコアプロモーターに結合する T B Pなどの基本転写因子との間のプリッジ役の分子として同定された。仲介因子はヒストンをァセチル化する酵素（HAT ： histone acetyltransferase) や逆にァセチル基を除く酵素（ H D A C ： histone deacetylase) と複合体を形成することから、ヒストンのァセチル化を介してクロマチン構造を変化させ、遺伝子発現を制御すると考えられつつある。クロマチン構造変化による遺伝子発現制御は免疫 · 発生分化など多くの生命現象に関与していると推定されているが、そのメカニズムは不明な部分が多い。

当初、 T細胞特異的転写活性化因子と思われたイカロス（ I k a r o s ) は、英国のグループの最近の研究により、 T細胞特異的遺伝子を転写不活性領域であるへテロクロマチン領域にリクルートして、未分化状態の細胞で、これらの遺伝子の発現を抑制する役割を果たすことが明らかにされた。この例からも分かるように、クロマチン構造を介した遺伝子発現制御は免疫系の発生 · 分化にとっても大変重要であり、仲介因子の研究はその突破口となりつつある。

仲介因子の生理機能を考察する際に重要な事柄の一つに「Haploinsufficiency (半分では不充分の意）」がある。真核細胞は 2倍体のため、 2コピーの遺伝子を有し、ほとんどの遺伝子では 1コピーの遺伝子に変異が生じても、表現型としては現れない。しかし、本発明者らはこれまでの研究から、仲介因子の場合には、 1 コピーの遺伝子に変異が生じ、遺伝子産物の量が半減すると、それが異常な表現型に結びつく場合が多いことを知見している。

これは限られた種類の仲介因子が多くの転写制御因了-に共通に fflいられているため、 aの半減がそのまま異常な表現型につながってしまうためと考えられる。従って、仲介因子遗伝子の変異によって生じる疾病は、いわゆる「autosomal do minant (常染色体優性：常染色体上の遺伝子の 1コビ一の変異で発症するの意）」である場合が多く、疾病として現れる頻度が高いと考えられる。

N— C o Rは最初核内ホルモン受容体による転写抑制に必須のコリブレッサーとして同定され、 S i n 3や H D A Cなどの因子と大きな複合体を形成している。そこで、 N— C o Rコリブレッサ一複合休の構成因子 s k i /s n oの生理機能の解析を行うこととした。

s k i遺伝子は最初はニヮトリの胚繊維芽細胞を形質転換するオンコジーンとして見出された（Stavnezer, E. , et al. , Mol. Cell. Biol., 9,4038-4045 (19 89)) 。 c— s k i遺伝子及びその関連する s n o遺伝子（Nomura, N. , et al.. Nucleic Acids Res., 1 7, 5489-5500 ( 1989) ) がコードする蛋白質は、コリブレヅサー N— C o R/ S M R T (Hoerlein, A. J., et al., Nature, 377,397-404 ( 1995 )； Chen, J. D. , et al . , Nature, 377,454-457 ( 1995). ) 及び mS i n 3 (Ayer, D. E.， et al., Cell, 80, 767-776 (1995)； Screiber-Agus, N. , et al. , Cell, 80,777-786 ( 1995). ) に結合し、ヒストンデァセチラーゼ（H D A C ) と複合体を形成することを見出した。

S k i /S n oは、甲状腺ホルモン受容体及び M a dによって仲介される転写抑制に必須であった。さらに、これらは直接 R bに結合し、そして R b—仲介抑制因子を必要としていた。

即ち、本発明者らは、がん遺伝子産物として同定されていた S k iやその関連遺伝子産物 S n oが N— C o Rや S i n 3 と直接結合し、 N— C o R複合体の構成因子として機能することを見い出した。興味深いことに、がん抑制遺伝子産物 Ma dや R bによる転写抑制に、 S k i /S n oは必須であった。そこで S n o 欠損へテロマウスを作製し、発がん実験を行ってみると、このマウスは高発がん性であることが分かり、 S k i / S n o逍伝 f ファミリ一はがん抑制遗伝子であることが初めて示された。また s n o欠損へテロマウスは種々の免疫系の異常を示した。このマウスはインタ一フエロンァなどの T h l 系のサイトカインの誘導レベルが異常に高く、そのため溃瘪性大腸炎などを起こしやすい。またこのマウスではジャーミナルセンタ一（Germinal Center ) が形成されず、 L P Sによる B 細胞増殖の誘導が見られない。このような S k iあるいは S n 0の量が半減したマウスで観察される種々の異常と疾病との関連、およびその分子メカニズムについて検討した。

本発明は、 s n o遺伝子の欠損したヘテロ又はホモ変異マウスを作成して、 s n o遺伝子の機能を解析し、 s n o遺伝子の欠損したへテロ又はホモ変異マウス及びその細胞を提供し、これらの動物又は細胞を用いたスクリーニング系を提供することを目的としている。発明の開示

本発明は、 s n o遺伝子が欠損したヒト以外の動物、好ましくはマウス、及びその細胞に関する。本発明の遺伝子の欠損した動物又はその細胞は、ヘテロ変異又はホモ変異のものを包含している。

また、本発明は、前記の動物又はその細胞を用いて、薬物の候補となる物質をスクリーニングする方法にも関する。図面の簡単な説明

第 1 図は、第 1図の（ a ) は本発明で使用したベクター及びアレル遺伝子の制限酵素地図を示す。第 1 図の（ b ) は、各遺伝子 ¾における現を確認した分析結果を示す図面に代わる写真である。

第 2図は、各遺伝子型における免疫染色の結果を示す図面に代わる写真である。第 3図は、（ a ) が各遗伝子型における細胞の増殖を示したグラフであり、 ( b ) が発癌ウィルスに感染させた後の、各遺伝子型のメチルセルロースゲルでのコロニー形成を数量化して示したものである。

第 4図は、（ a ) が発癌物質 D M B Aを投与した後の各遗伝子型の生存数をグラフ化したものである。第 4図（ b ) は、発癌したマウスのリンパ腫を示す図面に代わる写真である。第 4図（ c ) は、胸腺への転移を示す図面に代わる写真である。第 4図（ d ) は、抗 T C Rの 3 ( T細胞レセブターの α及び/? ) に陽性 ( p o s i t i v e ) の腫瘍を示す図面に代わる写真である。第 4図（ e ) は、腫瘍が B細胞マーカー I gM (B-cell marker IgM) には陽性でないことを示す図面に代わる写真である。 ¾4図（ f ) は、発癌したマウスの脬臓の腫瘍を示す図面に代わる写真である。第 4図（ g) 及び（ h) は、マウスの B型リンパ腫を T 細胞と B細胞特異的抗体を用いた免疫染色した結果を示す図面に代わる写真である。

第 5図は、（ a) がヒト s n o遺伝子の染色体上の位置を示すものである。第 5図（ b) は、 S a o s— 2、 H G 6 3、及び O S Tの 3種の細胞の s n o遺伝子の m— R NAの発現を測定した結果を示す図面に代わる写 Mである。発明を実施するための最良の形態

まず、本発明の遺伝子の欠損したヒトを除く動物の作成方法について、マウスを例にして記載する。

胚幹細胞（E S細胞）における相同的組換えにより、 s n o変異マウスを作成した。副スブライシング（alternative splicing) により生成した複合 S n o蛋白質種のひとつである S n o Nの 1〜 3 6 2番目のアミノ酸をコードするェクソン領域における遺伝子標的べクタ一を、 n e o (ネオマイシン）カセットにより置換した（第 1図（ a) 参照）。相同的組換えは、 5 ' プローブを持つ 3. 3 k b E c o O 1 0 9 1 フラグメント及び 3，プローブを持つ 1 4. 4 k b B g 1 I フラグメントの出現により特徴づけられていた（第 1図（ a) 及び（b ) 参照）。キメラは 2つの独立した変異 E Sクローンから正常に ίΓられた。

F 1異型接合体変異マウスを得るために、これを C 5 7 B L/ 6又は B A L B /cの雌と交配させた。異型接合体マウスは、子の尾から単離されたゲノム D N Aの P C R及びサザンプロット分析により同定された（第 1図（ b ) 参照）。異型接合体マウスが異種交配され、 3週齢の子の遺伝子痤が決定された。 2つの独立した生殖系列のキメラから誘導された 2 1 1匹の子において、 s n 0— 同型接合体は検出されず、 s n o -ハと s n o ^-/ の遺伝子 ¾の比は 1 : 2であった。 s n 0 ^+/—と s n◦ ^/+との交配（雌か雄の）における子孫の s n o ハと s n 0 + 一の遺伝子 Sの比率が 1 ： 1であったという事実は、精子又は卵子の形成の間に生殖細胞の s n o—は脱離しないことが示された。

s n o ハのマウスの生長の停 Iヒする時期（死ぬ時期）を特定するために、妊娠した雌の子宮組織から異型接合変異体からの着床後の胚（ E 3. 5— E 1 6. 5 ) を外科的に生体から取り出し、 P C Rで遗伝子型を同定した。 E 3. 5後のものからは s n o ハの胚は得られなかった。

s n o の胚の着床前の生長を観察するために、異型接合体の異種交配から誘導される E 1. 5の時点の 2細胞の胚を回収し、各々を独立して培養し、 1 2時間、 2 4時間毎に生長をモニターした。各胚細胞の成長の程度は S n o蛋白質の存在と相関していた。この S n o蛋 ΰ質は、 S n o特異的钪体による免疫染色法で定量された。胚（ n = 2 0 ) の約 2 5 %は十分な染色を示さなかった。そして、これらは全て胚盤胞を形成しなかった（第 2図の右欄参照）。培養中、これらの胚は最初の 24時間で 8細胞の段階まで正常に分裂した。

しかし、続く第 2日目及び第 3 日目にはこれらはコンパクトではなくなり（ de compacted) 、大体 1 6細胞の段階以上には分裂しないか又は胞胚腔を形成することができなかった。残ったものは S n oで強力にラベルでき、正常な未分化胚芽細胞になった（第 2図の左欄参照）。この結果、 s n oは胞胚腔の形成に必要なものであることがわかった。 s k iが欠失したマウスは E 1 8. 5でも生きているので（Berk, M. , et al., Genes Dev. , 11,2029-2039 ( 1997)) s k i と s n oとは生長において異なる役割を演じていることになる。

細胞培養において S k iが過剰に発現されると、生長が抑制される（Colmenar es, C. , et al. , Cell, 59 293-303 ( 1989)) 。更に、通常の c— S k i S n oは、細胞増殖を抑制する M a dや R bによる転写抑制に必要である。 S n o力細胞増殖を抑制する可能性を研究するために、正常に s n oを発現する E 1 5. 5時点の胚から調製されたマウス胎児の線維素細胞（ME F s ) の成長初期の段階を険討した。

s n 0 と s n 0 の培養は、低密度では形態学的に区別することができな

- δ - いけれども、 s n o ^— M E F sは野生型 M E F sより甲く成長した（第 3図 ( a ) 参照））。更に s n 0 -ハ M E F単層細胞は、より密な細胞を形成した（第 3図（ a) 参照）。増殖力増加の原因を解明するために、野生型と s n o * — ME F sの細胞周期 (cell-cycle) を検討した。

s n o —サンプルでは、増殖能力の増加に比例しての細胞周期の G 1期からの発現の増加が見られた（データは示していない。）。形質転換に対する感受性をさらに調べるために、オンコジーン（発癌遺伝子） V K i r a sのキャリア —であるウィルスに感染させた後、メチルセルロース中でのコロニー形成を調べた。

s n o 'ハ M E F sは、 1 0 ^β細胞に対し 3 2〜 8 5のコロニーを形成したが、野生型の M E Fはコロニーを全く形成しなかった（第 3図（ c ) 参照）。

この様に s n o遺伝子のひとつのコビ一を欠損させることにより、細胞培養で r a sが仲介する形質転換を活性化させることがわかった。

次に、野生型と s n o +/ のマウスの腫瘍感受性を比較するために、発癌物質 9， 1 0—ジメチル一 1， 2—ベンズアントラセン（DMB A) を週毎に投与した。 8 0曰の観察で、野生型マウス（ n = 4 0 ) のほとんどはこの処置でも生き残ったが、 s n o ^+/ マウスでは 3 0 %の s n o ^+/ 雌マウス（ n = 2 0 ) 、 5 0 %の s n o ^+/ 雄マウス（n = 2 0 ) が生き残つたに過ぎず、残りのものには腫瘍がみられた（第 4図（ a) 参照。 P = 0. 0 0 4。）。観察された腫瘍の多くは悪性のリンパ腫であり、線維腫も低頻度で観察された。 s n o ' マウスのリンパ腫は悪性の転移がみられ、胸腺にも腫瘍が発生していた（第 4図（b ) 及び ( c ) 参照）。これらが T細胞に由来する腫瘍であることは、腫瘍細胞が I gM マーカーではなく、 T C Rひ /?を均一に発現したことが見られたからである（第 4図（ d ) 及び（ e ) 参照）。

さらに、発癌物質を使用せずに異型接合体の s n o ⁺ の腫瘍の発現をモニターした。低い頻度で、これら異型接合体での腫癟の傾向がみられた。一匹の 4月令のマウスは衰弱の症状を呈した後に死んだ。このマウスの各組織の組織学的分析の結果、すい臓に腫瘍が見られた（第 4図（ f ) 参照）。 T細胞と B細胞特異的抗体を用いた免疫染色法により B リンパ腫であることが示された（第 4図（ g ) 及び（ h) 参照）。リンパ腫の発生は、 c— s k i発現ベクターの導入が造血細胞の分化に関係していること（Namciu, S. , et al. , Oncogene, 9, 1407-1416 (1 994)) 、及び ν— s k iは鳥類の造血細胞の生長に影響している（Larsen, J.， et al. , Oncogene, 8,3221-3228 ( 1993)) 、という事実とよく一致している。ヒトの s n o遺伝子の位置が腥癟の抑制の位置に包含されていることの可能性を研究するために、ヒ卜の染色体における s n 0遺伝子の位置をジーンプリッジ 4放射性ノヽイブリツドノネノレ（GeneBridge 4 radiation— hybrid panel) (こより決定した。この結果、 s n o遺伝子は 3 q 2 6. 3 1 - 3 q 2 6. 3 2の位置で、 W I— 3 8 4 7 と W I — 6 8 9 4マ一カーの間に位置していた（第 5図（ a ) 参照）。 2つのマーカーの距離は約 1 5 0 0 k bであると推定される。興味あることに、ヒ卜の骨肉腫の異型接合の構造の欠損が高頻度で起こるひとつが、 D 3 S 1 2 1 2と D 3 S 1 2 4 6マ一カーの間（Kruzelock, R. P., et al. , Cancer R es.， 57, 106-109 ( 1997)) であるこの領域である（第 5図（ a) 参照）。

s n o遺伝子と骨肉腫の腫瘍抑制を含むこの 2つの領域は、互いに重複している。

骨肉腫から誘導される細胞は s n oの発現が失われているか否かを調べるために、 S a o s— 2、 H G 6 3、及び O S Tの 3種の増殖可能な細胞の s n oの m — RNAの発現を測定した。 S a o s— 2細胞では s n oの m— RNAは検出されなかった（第 5図（b ) の左側のパネル参照）が、他の 2つの細胞からは、線維芽細胞列とほぼ同じ位の発現が見られた。サザンプロット分析によれば、 S a o s— 2細胞内で s n o遺伝子の大きな再編成はみられなかった（第 5図（ b) の右側のパネル参照）力、小さな削除や、狭い領域での再編成、又はポイントミユーテーシヨンなどによる s n oの発現の欠失が見られた。 p 5 3や R b Iなどの 2つの特徴的な腫瘍抑制遺伝子の同型接合変換により骨肉腫がしばしば発生すること、及び、 S o a s— 2が機能的な R b蛋白質を欠失していることはよく知られている（Pompetti, F. , et al., J. Cell. Biochem. , 63,37-50 ( 1996 )) 。

これまで s kや i s n oは発癌遺伝子と考えられていたが、前述してきた結果はこれら遺伝子が腫瘍抑制であることを示している。 V — S k iは、 m S i n 3 が結合する c一 S k iの C末端を欠いており、これは V — S k iが活性のない型である事を示している。 V— s k iのみならず c— s k iの過剰な発現もチキンの胎生線維芽細胞を形質転換する（Colmenares, C. , et aし， J. Virol. , 65,49 29-4935 (1991)) 。

c一 S k iの過剰な発現は N— C o R— S k i複合体の核内の点状の分布（nu cler dot-like distribution) を乱すという本発明者らの観察によれば（この結果はここには示していない。）、 c一 S k iの過剰な発現はコリブレッサー複合体の各成分間のバランスをくずし、転写抑制を妨げるものと考えられる。しかし S k i及び S n oは、 R bや ma d ( Ayer, D. E.， et al.， Genes Dev. , 7, 21 10-2119 (1993)； Schreiber- Agus, N. , et al.， Nature, 393,483-487 (1998)) という 2つの異なった腫瘍抑制遺伝子によってコードされる蛋白質により仲介される転写抑制に必要であるから、これらの蛋 ώ質の転写抑制活性は s n o異型接合変異体において減少し、 R b及び M a dの標的遺伝子のグループの発現の增加が腫瘍への傾向を引き起こすことができる。

本発明者らは最近、 ME F sの s k i遺伝子のコビーの一つが失われると変異の傾向が増加し、そしてヒト c— s k i遺伝子が 1 p 3 6に位置しており（この結果はここには示していない。）、そこには神経芽腫に対する多数の腫瘍抑制遺伝子も位置しており（Cheng, N. C. , et al.， Oncogene, 10,291-297. ) 、 c一 s k iもまた腫瘍感受性に重要な存在であることが推測されるということを見出した。 s n oが腫瘍抑制因子として働く ¾見は、 s k i / s n o遺伝子ファミリ一の生理学的な役割を理解する手がかりとなる。

本発明の前記してきた方法はマウスのみならず他の動物（ヒトを除く）にも応用することができる。さらに本発明の方法によれば、 s n o遺伝子の位置及びその作用が解明されたことにより、通常の遗伝子操作により臨床に応用することができる。実施例

次に、本発明の方法を実施例により、より具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例 1 ( s n o欠損変異マウスの発生）

T T 2細胞由来のライブラリーを用いて、通常のブラ一クハイブリダィゼ一シヨン法により、 s n oゲノムのクローンを単離した。

1 5. O k bの H i n d III— E c o R Iゲノム D NAのサブフラグメントが標的べクタ一に挿入されるために使用された。 S n oの N末端 X X X —アミノ酸領域をコードするェクソンを含んでいる 1 . 5 k bの N c o I — E c o R I フラグメントが、 H i n d III— E c o R I フラグメントから削除され、そしてリン脂質キナーゼ遺伝子プロモータ一を用いて誘導されるネオマイシン（n e o ) 力セットと置換した。

遺伝子の標的の頻度を増加するために、ネガチブセレクションのために D T— A (ジフテリア毒一ポリ（A) シグナル（diphtheria toxin- poly(A) signal) ) カセットをショートアームに縮合させた（Yagi, T. et al . Anal . Biochem. 214, 77-86 (1993)) 。

使用された E S細胞は、 C 5 7 B L/ 6マウスと C B Aマウスの交配により得られた F 1胎生から誘導された T T 2細胞であつた（Yagi, T. et al. Anal. Bi ochem. 214, 70-76 ( 1993)) 。 s n o変異体を含む E Sクローンの単離、キメラの生成、及び異型接合の製造は前記してきた方法により行った（Tanaka, Y. et al. Proc. Natl . Acad. Sci. USA 94, 10215-10220 ( 1997)) 。組換えのホモロガスな性質は、いくつかの制限酵素や前記した標的べクラ一の内側又は外側に位置するいくつかのプローブを用いたサザンブロット分析により確認した。第 1図 ( a) に示される 3種のブライマーを、野生型のアレル遺伝子からの 2 40 b p フラグメント又は変異型のアレル遺伝子からの 1 2 O b pフラグメントを増幅するために用いた。マウスは理化学研究所の動物実験研究施設で飼育された。実施例 2 ( s n o蛋白質の検出）

脾臓細胞を P B Sで洗浄し、 4 5 mM T r i s— H c l ( p h 7. 4 ) ， 1 3 5 mM N a c l , 0. 9 T r i t o n X - 1 0 0 , 0. 9 %デォキシコ一ル酸 N a、 0. 0 9 % S D S , 2 2 mME D T A, 1 % トラシロール（ Trasylo 1) を含有する細胞溶解用緩衝液 x m 1中に再? g濁させた。 ^心分離後、 Xm lの溶解液に、 1 5 0 mMN a c 1を含む Xm 1の N E T/N P 4 0緩衝液 [ 5 0 m M T r i s - H c l ( p h 7. 5 ) ， 5 mM E D T A , 0. 5 % N P 4 0 , 1 m g/m l B S A] が混合された。更に、 l O O mM PM S Fが xm l及びブ口ティン Gセファロース xm lが加えられ、溶解液を氷上に 1 5分放置した後、遠心分離した。上澄液に、 S n o特異的モノクローナル抗体（ 5 m g I g G) を混合し、氷上に 2時間放置した。 2 0 m 1のプロテイン Gセファロ一スを用いて免疫複合体を集め、 0. 5及び 0. 2 5 Mの食塩を含む N E T/N P 4 0バヅファーで洗い、さらに 0. 1 5 MN a C lを含む N E Tノ、'ヅファー [ 5 0 mM T r i s - H C l ( p h 7. 5 ) ， 5 mM E D T A] で洗った後、 1 0 % S D S— P A G Eゲルに展開した。蛋白はニトロセル口一スフィルターで分離され、 s n oは a n t i— s n oモノクロナル抗体（Tokitou, F. et al . J. Biol . Ch em. 274, 4485-4488( 1999)) と E C L試薬（アマ一シャム社製）で検出した。実施例 3 ( 2細胞杯のインビトロでの培養と免疫染色）

M 2及び M l 6培地を調製した（Hogan, B. et al. "Manipulating the Mouse Embryo： A Laboratory Manual -" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprin g Harbor, NY.) 。胚は s n o ^+/—異型接合の雄と雌を交配して得た。交配（ d p c ) 後、膣栓（vaginal plug) が見られた日を 0日とする。胚は卵管から M 2溶剤を用いて 1 . 5 d p cの時洗い出された。胚は個々にパラフィン油による M 1 6培地中で、 3 7° (：、 5 %の C 0₂を含む湿った空気の環境下で培養された。胚は定期的に解剖顕微鏡で検査された。免疫染色のために、胚を、調製されたばかりの 2. 5 %パラフォルムアルデヒドを含む生理食塩水バッファ一（ p H 7. 5 ) で室温 3 0分で固定し、さらにメタノールで 3 0分間、 4 %過酸化水素水で 3 0 分間処理した。抗— s n oモノクローナル抗体が用いられ、抗体抗原複合体がパ —ォキシダ一ゼコンジュゲート杭一マウス I g G (D a k o ) により検出された。実施例 4 (組織学上の分析、免疫組織化学）

いろいろな組織が 4 %バラフオルムアルデヒドで固定され、脱水後パラフィンに固定された。断片（ 5 m) を通常の手順でハエマトキシリン（haematoxyli n) とェォシン（eosin ) で染色した。 4〃 mに切断されたパラフィン断片が免疫組織化学に使用された。抗ー T細胞受容体 α及び/?、抗ー I gM、抗ー B 2 2 0、並びに、抗ー C D 3抗体が免疫染色に用いられた。実施例 5 ( s n o ^—の胚繊維芽細胞及び脾臓細胞の分析）

1 3. 5又は 1 5. 5 d p cの時点で、胚からマウス胚繊維芽細胞を単離した。生長曲線の実験のために、ゥエル当たり 1 0⁵個の細胞を 2 0 %ゥシ胎児血清を含む D M E M培地で 6ゥエルプレートに移植し、カウントした。 3種の異なった M E F調製物に基づいて、 9回の独立した実験が行われた。 ME F細胞にキルステンネズミ肉腫ウイレス ( Kirsten murine sarcoma virus; ( K i - M u S V ) を感染させ、 4 8時問に亘つて活性化 K一 r a sオンコジーン（mo i = 1 0 ) を移植した。細胞（ 1 0⁵個）を 1. 3 %メチルセルロースゲルに愁濁し、培地に溶解させ、 0. 5 3 %ァガロース及び培地からなるァガロースベットに重ねた。ブレーティングから 3週間コロニー数を数えた。実施例 6 (発癌物質 9， 1 0—ジメチルー 1， 2—べンズアントラセン（DMB A) による処理）

DMB Aの処理は、妊娠 2 ~ 5 日から始めて、毎週続けて、背面よりアセトン l m l当たり 1 . 2 5 m gDMB Aを含む溶液 5 0〃 1を投与することにより行つた。定期的にマウスをモニターし、健康状態が悪化したときに殺した。

各コホート（一定数の渠団）に最初 8〜 1 0匹のマウスを組織学上の収集のために使用し、その後、詳細な病理学的分析により腫瘍の部位及び転移した部位の器官を特定した。産業上の利用可能件

本発明は s n o遺伝子の新たな機能を見出し、発癌性の s n o遺伝子欠損動物を提供することにより、発癌性物質のスクリーニングや腫瘪の発生や抑制の機構を解明する有力な手がかりを提供するものである。また、 s n o遺伝子又はその相補鎖を用いて新たな腫瘍の予防や治療方法を提供するものである。

Claims

請求の範囲

1 . s n ο遺伝子が欠損したヒト以外の動物。

2 . 動物が、マウス請求項ある請求の範囲第 1項に記載の s η 0遺伝子欠損動物。

3 . s n o遺伝子の欠損が、ヘテロ変異である請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の s n o遺伝子欠損動物。

4 - 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載のヒト以外の動物の s n o遺伝子が欠損したヒト以外の動物の細胞。

5 . s n o遺伝子の欠損が、ホモ変異である請求の範囲第 4項に記載の細胞。

6 . 細胞が、胚である請求の範囲第 4項又は第 5項に記載の細胞。

7 . 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに記載のヒト以外の動物又はその遺伝子を有する細胞を用いて、薬物の候補となる物質をスクリ一ニングする方法。