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WO2000044722A1 - Chondrongenesis promotors and indolin-2-one derivatives - Google Patents

Chondrongenesis promotors and indolin-2-one derivatives Download PDF

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WO2000044722A1
WO2000044722A1 PCT/JP2000/000381 JP0000381W WO0044722A1 WO 2000044722 A1 WO2000044722 A1 WO 2000044722A1 JP 0000381 W JP0000381 W JP 0000381W WO 0044722 A1 WO0044722 A1 WO 0044722A1
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WO
WIPO (PCT)
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group
substituent
lower alkyl
methylphenyl
alkyl group
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PCT/JP2000/000381
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Hidetomo Kitamura
Atsuhiko Kato
Toru Esaki
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/06—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms

Definitions

  • the present invention relates to a chondrogenesis promoter, a cartilage repair agent or a cartilage containing an indolin-2-one derivative or a salt thereof useful as a medicament, and an indolin-2-one derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a cartilage repair agent or a cartilage containing an indolin-2-one derivative or a salt thereof useful as a medicament and an indolin-2-one derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • cartilage In the living body, cartilage (cartilage) is generally composed of chondrocytes, fibrocytes, which are one of specialized connective tissues, and an amorphous' gel-like base material in which these cells are embedded. Is a part of
  • Cartilage forms skeletons, joints, trachea, pinna, nose, etc. in humans and other warm-blooded animals.
  • cartilage is indispensable for the survival of warm-blooded animals, such as bone type during growth (growth cartilage), smooth joint movement (articular cartilage), respiration (tracheal cartilage, nasal cartilage), and hearing (auricular cartilage). Plays a central role in various functions. Therefore, when these cartilage are degenerated or destroyed, various obstacles are caused to the living body depending on the site or degree of the degeneration or destruction.
  • a growth factor such as TGF- ⁇ (Transforming growth factor?), BMP-2 (J. Bone Joint Surg. 79-A (10): 1452-1346, 199 7) Lectin, concanavalin A (J. Biol. Chem., 265: 1101-101, 1991), or ostogenin (BMP-7), biminin D derivative (1 shed, 2 5- D 3) (Cancer Res, 4 9:. 543 5 ⁇ 544 2, 1 9 8 9), vitamin A derivatives (Rechinoin acid) (Dev Biol, 1 3 0 :..
  • TGF- which is expected to be the most useful therapeutic agent, is an isoform of TGF- /? Has been reported to promote cartilage formation when administered to rats (Lab. Invest. 71 (2): 279-290, 199 4).
  • this TGF- / ? inhibits the loss of proteoglycans of articular cartilage due to arthritis in model animals that have experimentally developed arthritis, in other words, assimilation into articular cartilage during intra-articular administration.
  • joints such as rheumatism It has been suggested that it may be a useful therapeutic agent for diseases (Lab. Invest. 78 (2): 133-142, 1998)
  • An object of the present invention is to provide a cartilage formation promoting agent or a cartilage repairing agent which can solve the above-mentioned disadvantages of the prior art and can promote cartilage formation or proliferate cartilage cells.
  • Another object of the present invention is to provide a reagent having a chondrogenesis-promoting effect, which is useful in studying cartilage biologically, physically and chemically.
  • Still another object of the present invention is to provide an indolin-2-one derivative useful as a cartilage formation promoter or the like.
  • the chondrogenesis promoter of the present invention has the general formula (I) ⁇
  • R 1 has a halogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a hydroxyl group, a nitro group, a trifluoromethyl group, a lower alkylthio group, an acyl group, a carboxyl group, a mercapto group, or a substituent.
  • R 2 represents a hydrogen atom, a lower alkyl group which may have a substituent, a lower alkenyl group which may have a substituent, or a substituent which may have a substituent;
  • R 3 represents a lower alkyl group which may have a substituent, a cycloalkyl group which may have a substituent, an aryl group which may have a substituent, Or have a substituent
  • R 4 represents a hydrogen atom, a lower alkyl group which may have a substituent, an aryl group which may have a substituent, or a substituent which may have a substituent;
  • X Y may be the same or different, one CH 2 -, shows an NH- or a 0-, n is an integer of 0-4.
  • the cartilage repair agent of the present invention contains the compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof as an active ingredient.
  • the reagent for biological, physical or chemical research of cartilage of the present invention contains the compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof.
  • indoline-1-one derivative of the present invention has the following general formula (IV)
  • R 12 represents a lower alkyl group in which two lower alkoxy groups (the lower alkoxy groups may be substituted with 1 to 5 halogen atoms) are substituted on the same carbon. ).
  • R 12 is a compound represented by the general formula (V):
  • FIG. 1A is a photomicrograph showing a hematoxylin and eosin double-stained tissue sample of the auricle when a vehicle control (3% gum arabic) was repeatedly orally administered to rats for 4 weeks.
  • FIG. 1B is a micrograph. 4 is a photomicrograph showing a hematoxylin-eosin double-stained tissue specimen of the auricle when compound A (2 g / kg) was orally administered repeatedly for 4 weeks.
  • FIG. 1A is a photomicrograph showing a hematoxylin-eosin double-stained tissue specimen of the auricle when compound A (2 g / kg) was orally administered repeatedly for 4 weeks.
  • FIG. 2A is a photomicrograph showing a hematoxylin and eosin double-stained tissue specimen of the trachea when a vehicle control (3% gum arabic) was repeatedly orally administered for 4 weeks to rats.
  • FIG. 2B is a rat photograph. 1 is a photomicrograph showing a hematoxylin and eosin double-stained tissue specimen of the trachea when compound A (2 g / kg) was orally administered repeatedly for 4 weeks.
  • Figure 3A is a photomicrograph showing hematoxylin and eosin double-stained tissue specimens of the sternal xiphoid process after repeated oral administration of a solvent control (3% gum arabic) to rats for 4 weeks. [Fig. 4] Fig.
  • FIG. 4 is a microscopic photograph showing a hematoxylin and eosin double-stained tissue specimen of the sternal xiphoid process when compound A (2 g / kg) was repeatedly orally administered to a rat for 4 weeks.
  • Figure 4A is a photomicrograph showing hematoxylin and eosin double-stained tissue specimens of the knee joint of the femur and the lower leg when a vehicle control (3% gum arabic) was orally administered to rats for 4 weeks.
  • FIG.4B is a photomicrograph showing a hematoxylin and eosin double-stained tissue specimen of the knee joint of the femur and the lower leg when compound A (2 g / kg) was orally administered to a rat for 4 weeks. .
  • Figure 5A is a photomicrograph showing hematoxylin and eosin double-stained tissue specimens of the lumbar vertebra (intervertebral disc) after repeated oral administration of a solvent control (3% gum arabic) to rats for 4 weeks.
  • FIG. 4 is a photomicrograph showing a hematoxylin and eosin double-stained tissue specimen of the lumbar vertebra (intervertebral disc) when a compound A (2 g / kg) was repeatedly orally administered to rats for 4 weeks.
  • Figure 6 shows the femoral knee joint when compound A (1. Ommo 1 / L) or a vehicle control (50% DMSO in saline) was repeatedly administered to rat knee joints at a dose of 501 / day for 3 weeks.
  • 6 is a graph showing the width of the graph.
  • Figure 7A shows 0.3% safranin 0 staining of the knee joint of the femur when a vehicle control (50% DMSO physiological saline solution) was repeatedly administered at a dose of 50 ⁇ per day into the knee joint of a rat for 3 weeks.
  • Fig. 7B is a photomicrograph showing the tissue specimen, and Fig.
  • FIG. 7B shows the femoral knee when compound A (1.0 mmo1 / L) was repeatedly administered in a rat knee joint at a dose of 50 ⁇ per day for 3 weeks.
  • 4 is a micrograph showing a 0.3% safranin 0-stained tissue specimen of a joint. 8 when the compound A or vehicle control in rat primary culture articular chondrocytes (medium final concentration of 1% ethanol) was added, showed uptake into glycosaminoglycan of 35 S-labeled sulfate It is a graph.
  • FIG. 9 is a graph showing the uptake of 3 H-labeled thymidine when compound A or a solvent control (ethanol having a final concentration of 1% in the medium) was added to rat primary cultured articular chondrocytes.
  • Figure 10A shows a micrograph of double-stained Alcian Blue and Oil Red 0 when confluent CL-11 was added to a solvent control (ethanol at a final concentration of 1% in culture medium) and cultured for 7 days.
  • Fig.10B shows the two concentrations of Alcian blue and oil red 0 when compound A (final concentration in the medium was 10 ⁇ mo 1 / L) was added to confluent CL-1 and cultured for 7 days. This is a micrograph of a stained microscope.
  • FIG. 9 is a graph showing the amount of 35 S-labeled sulfuric acid incorporated into CL-11 during the last 24 hours when cultured in a medium containing 1% ethanol for 48 hours.
  • Figure 12 shows that compounds A, C, D, and G were cultured on CL-11 that had reached confluence for 48 hours in a medium containing ethanol at a final concentration of 10 ⁇ mo1 / L or ethanol at a final concentration of 1% as a solvent control.
  • 4 is a graph showing the amount of 35 S-labeled sulfuric acid incorporated into CL-1 during the last 24 hours.
  • FIG. 13A and 13B create a defect in the rat patella that extends to the bone marrow. After 7 days, the cartilage repair of the defect site was repeated when compound A (1.0 mmo 1 / L) or a solvent control (50% DMSO saline solution) was repeatedly administered at 50 L / day for 3 weeks. 7 is a graph showing the results of a theoretical study.
  • FIG. 13A shows the scores of Cell morphology, Matrice—staining, and Thickness ssofcarti 1 age
  • FIG. 13B shows the scores of Totalscore.
  • FIG. 14A shows a defect created in the patella of the rat femur to reach the bone marrow. Seven days after that, a vehicle control (50% DMSO saline solution) was repeatedly injected intra-articularly for 3 weeks at 50 L per day for 3 weeks.
  • FIG. 14B is a micrograph of a 0.3% safranin 0 stained specimen of the defect, and FIG. 14B shows that a defect reaching the bone marrow in the patella surface of the rat femur was created, and compound A (1.0 mmo 1 / L) was obtained 7 days later. 5) is a photomicrograph of a 0.3% safranin 0-stained specimen at the defective part after repeated intra-articular administration of) at 50 ⁇ L / day for 3 weeks.
  • FIG. 15A shows a scanning electron beam after repeated resection of a half-moon joint of a heron and a vehicle control (50% DMS 0 physiological saline solution) 500 l per day for 3 weeks after 7 days.
  • the micrograph is shown in FIG.15B, showing that when the male half-moon of the egret was partially resected, and 7 days later, compound A (3.Ommo 1 / L) was administered at 500 L per day for 3 weeks by repeated intra-articular administration. It is a scanning electron microscope image.
  • FIGS. 15A and 15B shows six individuals.
  • Figures 16A, 16B and 16C show a partial resection of the male crescent half moon
  • FIG. 17A shows the scores of L ossof sup rf iciall aye r, Ulceration or erosion, Fibrill at ion, and Cluster: fo rmat ion
  • FIG. 17B shows Glo ba l as Shows the score of ses sment.
  • the cartilage formation promoter and the cartilage repair agent of the present invention contain the compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof as an active ingredient.
  • the compound represented by the general formula (I) according to the present invention is described in WO 94/19322, which discloses that this compound is a CCK-B / gastrin receptor antagonist. Is described. On the other hand, the present inventors have found that the compound represented by the general formula (I) also unexpectedly has a cartilage formation promoting action, and completed the present invention based on such findings.
  • the compound represented by the general formula (I) according to the present invention can be obtained by the methods described in Examples described later in addition to the methods described in the above-mentioned International Publication.
  • the halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • lower alkyl group means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group and an i-propyl group. And n-butyl, s-butyl, t-butyl, pentyl and hexyl.
  • the lower alkenyl group is a linear or branched alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, and examples thereof include a vinyl group, an aryl group, a butenyl group, a pentenyl group, and a hexenyl group.
  • the lower alkynyl group refers to a linear or branched alkynyl group having 2 to 6 carbon atoms, such as an ethynyl group, a propynyl group, a butynyl group and the like.
  • the lower alkoxy group means a straight-chain or branched-chain alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, i-propoxy, n-butoxy, s-butoxy. Group, tert-oxy group, pentoxy group, hexoxy group and the like.
  • acyl group refers to a carbonyl group substituted with an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group, an amino group, or the like, which may have a hydrogen atom or a substituent, such as an acetyl group, a propionyl group, a vivaloyl group, And alkylcarbonyl groups such as cyclohexanecarbonyl group and arylcarbonyl groups such as benzoyl group, naphthoyl group and toluoyl group.
  • An aryl group is a monovalent group obtained by removing one hydrogen atom from an aromatic hydrocarbon, such as phenyl, tolyl, xylyl, biphenyl, naphthyl, anthryl, and phenanthryl. can give.
  • the lower alkylene group is a linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and examples thereof include a methylene group, an ethylene group, a propylene group, a butylene group, a pentylene group, and a hexylene group.
  • the cycloalkyl group refers to a cyclic saturated hydrocarbon group having 3 to 8 carbon atoms, for example, a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, and the like, having a substituent.
  • Examples of the cycloalkyl group include a menthyl group and an adamantyl group.
  • the heterocyclic group refers to an aromatic heterocyclic group having one or more hetero atoms, and examples thereof include a pyridyl group, a furyl group, a cyenyl group, an imidazolyl group, a virazinyl group, and a pyrimidyl group.
  • the lower alkyl group, lower alkenyl group, alkynyl group, lower alkoxy group, acyl group, aryl group, cycloalkyl group, and heterocyclic group may be substituted with one or more various substituents, if necessary. Good.
  • Examples of such a substituent include a halogen atom, a lower alkyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group (the lower alkoxy group may be substituted with a halogen atom), an aryloxy group, A lower alkylthio group, a heterocyclic group, a formyl group (the formyl group may be protected as an acetal), a lower alkylcarbonyl group, an arylcarbonyl group, a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, an amino group (the amino group The group may have a lower alkyl group or the like), an imino group, a thioacetal group, a nitro group, a nitrile group, a trifluoromethyl group and the like.
  • R 1 is a halogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a hydroxyl group, a nitro group, a trifluoromethyl group, a lower alkylthio group, an acyl group, a carboxyl group, a mercapto group, or an amino group which may have a substituent
  • R 1 is preferably a halogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, or a nitro group.
  • n shows the integer of 0-4. n is preferably 0 or 1, and particularly preferably 0.
  • R 2 is a hydrogen atom, a lower alkyl group which may have a substituent, a lower alkenyl group which may have a substituent, a lower alkynyl group which may have a substituent, A lower alkoxy group which may have a substituent, an acyl group which may have a substituent, an aryl group which may have a substituent, or a group which may have a substituent It represents a heterocyclic group.
  • R 2 is preferably a hydrogen atom, a lower alkyl group which may have a substituent, a lower alkenyl group which may have a substituent, or an aryl group which may have a substituent.
  • a lower alkyl group which may further have a substituent this substituent may be substituted with a halogen atom
  • R 2 is two lower alkoxy groups (the lower alkoxy groups may be substituted by 1 to 5 halogen atoms) or 10—Z—0— groups (where Z is 1 to 1
  • a lower alkylene group which may be substituted with 0 halogen atoms) is preferably a lower alkyl group substituted on the same carbon;
  • R 1Q and R 11 may be the same or different and each represents a lower alkyl group optionally substituted with 1 to 5 halogen atoms, at least one of which is 1 to 5 halogen atoms.
  • Z represents a lower alkylene group which may be substituted with 1 to 10 halogen atoms.
  • R 2 is 2,2-diethoxyshethyl group, 2,2-dimethoxethyl group, 2,2-diisopropoxyshethyl group, 2,2-bis (2-fluoroethoxy)
  • An ethyl group or a 2,2-bis (2-chloroethoxy) ethyl group is preferred, and a 2,2-diethoxyethyl group or a 2,2-bis (2-fluoroethoxy) ethyl group is more preferred.
  • a 2-diethoxychelyl group is particularly preferred.
  • R 3 is a lower alkyl group which may have a substituent, a cycloalkyl group which may have a substituent, an aryl group which may have a substituent, or a group which has a substituent. Shows a good heterocyclic group.
  • R 3 is preferably a lower alkyl group which may have a substituent, a cycloalkyl group which may have a substituent, or an aryl group which may have a substituent.
  • An aryl group which may have the following is more preferred.
  • a lower alkyl group preferably has Yoi Amino group which may have a or a lower alkyl group, as said R 3 is , A 4-methylphenyl group is preferred.
  • R 4 is a hydrogen atom, a lower alkyl group which may have a substituent, an aryl group which may have a substituent, a heterocyclic group which may have a substituent, —OR 5 -SR 5 Or NR 6 R 7 .
  • R s , R 6 , and R 7 may be the same or different and each represents a hydrogen atom, a lower alkyl group optionally having a substituent, a cycloalkyl group optionally having a substituent.
  • R 6 , R 6 represents an aryl group which may have a substituent, a heterocyclic group which may have a substituent, a lower alkoxy group, or an amino group which may have a substituent; 7 is one (CH 2 ) m —, — (CH 2 ), N (CH 2 ) k one (where k, 1, and m each represent an integer of 1 to 8, and R 8 is a hydrogen atom Or a lower alkyl group).
  • R 4 is a lower alkyl group which may have a substituent, a aryl group which may have a substituent, a heterocyclic group which may have a substituent, one OR 5 , or one NR 6 R 7 (wherein, R 5 , R 6 , and R 7 are the same as defined above), and more preferably, NR 6 IT (wherein R 6 and R 7 are the same, Which may be different from each other, and each represents a hydrogen atom or an aryl group which may have a substituent).
  • R 4 is one NR 6 R 7 (wherein R 6 and R 7 may be the same or different and each is a hydrogen atom or an aryl group (the aryl group is a lower alkyl group) Or an amino group (this amino group may further have a lower alkyl group), and is preferably a group represented by NHR 7 (wherein R 7 Is particularly preferably a group represented by 4-methylphenyl group, 4-ethylphenyl group or 4- (N, N-dimethylamino) phenyl group.
  • X and Y may be the same or different and each represents —CH 2 —, one NH— or one 0—, X represents one CH 2 —, one NH— or one 0—, and Y represents —CH 2 — or It is preferable to indicate one NH— in each case.
  • X and Y may be the same or different, and more preferably represent —CH 2 — or 1 NH—, and X represents 1 NH— And Y is particularly preferably —CH 2 —.
  • the indolin-2-one derivative according to the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • a pharmaceutically acceptable salt examples include inorganic salts such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, and phosphate, succinate, malonate, acetate, and maleate.
  • organic salts such as fumarate, citrate, benzoate and salicylate, and metal salts such as sodium, potassium and magnesium salts.
  • the indolin-2-one derivative according to the present invention may be an optically active form thereof.
  • an optically active substance the one whose absolute configuration at the 3-position is R configuration Is preferred.
  • Examples of specific compounds of the indolin-1-one derivatives of the present invention include, for example, the compounds described in the examples of WO 94/19322 and the examples of JP-A 7-48349.
  • the compounds described, that is, the compounds of compound numbers 1 to 201 shown in the following (Table 1) to (Table 9) can be mentioned.
  • Examples of more preferable specific compounds of the cartilage formation promoting agent or the cartilage repair agent of the present invention include the following compounds.
  • Examples of in vivo metabolites of compound A include compounds H and I below.
  • the compounds described in Tables 1 to 9 can be synthesized by the method described in JP-A-7-48349. Further, among the above compounds A to G, compounds A to D can be synthesized according to the method described in JP-A-7-48349.
  • Compound H can be synthesized according to “Reaction Route 7” described in JP-A-7-48349.
  • the compound I can be obtained as a racemate or an optically active compound by the following method.
  • the racemic form of compound I uses an isocyanate in which a hydroxy group is protected with an appropriate protecting group (for example, a substituted silyl group such as a triethylsilyl group or a t-butyldimethylsilyl group). It can be synthesized according to “Reaction Route 5” in JP-A-7-48339.
  • an appropriate protecting group for example, a substituted silyl group such as a triethylsilyl group or a t-butyldimethylsilyl group.
  • the optically active compound I is an isocyanate in which a hydroxy group is protected with an appropriate protecting group (for example, a substituted silyl group such as a triethylsilyl group or a t-butyldimethylsilyl group). It can be synthesized according to Route B (corresponding to “Reaction Route 7” of JP-A-7-483039), or a stereoisomer mixture of Compound I can be prepared by a method known to those skilled in the art (for example, using an optically active column). The method can be used for optical resolution.
  • an appropriate protecting group for example, a substituted silyl group such as a triethylsilyl group or a t-butyldimethylsilyl group.
  • Identification, structure determination, and purity of the obtained compound can be performed by ordinary methods (spectroscopic methods such as NMR and IR, high performance liquid chromatography, and the like).
  • the cartilage formation-promoting agent of the present invention can be used in various applications without particular limitation as long as the cartilage formation-promoting effect of the drug can be effectively used. It is useful for cartilage disease with insufficiency, damage and resection of cartilage due to trauma and surgery, and treatment of congenital cartilage hypoplasia and malformation.
  • cartilage diseases include, for example, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, osteochondritis dissecans, damage to articular cartilage due to trauma, and herniated disc.
  • congenital hypoplasia and malformation of cartilage include, for example, autism and microtia.
  • the drug containing the compound of the present invention can be administered orally or parenterally, it is necessary to avoid unnecessary promotion of cartilage formation at the site other than the site of administration, or from the viewpoint of efficacy.
  • Parenteral administration is preferred. Upon administration, it can be prepared into a formulation suitable for each administration method.
  • the pharmaceutical composition containing the compound of the present invention as an active ingredient can be formulated using a conventional formulation technique.
  • the pharmaceutical composition can be used as various solid and liquid preparations such as capsules, granules, creams, powders, syrups, tablets, injections, and ointments depending on the use.
  • the carrier for the preparation and the excipient include a solid or liquid substance. Examples thereof include lactose, magnesium stearate, starch, talc, gelatin, agar, pectin, arabia gum, olive oil, sesame oil, ethylene glycol and the like, and other commonly used ones.
  • the content of the compound of the present invention in such a preparation varies depending on the dosage form, but is generally
  • the content is 0.001 to 80% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the compound of the present invention can vary widely depending on the type of warm-blooded animal including human being, the severity of symptoms, diagnosis of a doctor, etc.
  • the dose is 0.01 to 2 g / kg per day, and for parenteral administration, it is 0.001 to 0.01 g / kg per day.
  • the above dose can be administered once or several times per 1 to 7 days, collectively or separately. It can be changed as appropriate depending on the condition of the letter and the judgment of the doctor.
  • the drug of the present invention had a cartilage formation promoting effect when administered orally or parenterally to rats.
  • This fact indicates the usefulness of the drug of the present invention as a therapeutic drug for joint diseases.
  • chondrocytes (more Chondrocytes), its extracellular matrix or cartilage-like tissue.
  • chondrogenesis promoters of the present application the mechanism of chondrocyte extracellular matrix metabolism and differentiation into chondrocytes (above are biological items), analysis of components of extracellular matrix (chemical items), It can be used for analysis of physical properties (physical items) such as viscoelasticity.
  • the indolin-2-one derivative of the present invention having the chondrogenesis promoting action represented by the general formula (I) may possibly promote calcified cartilage formation by its chondrogenesis promoting action. In that case, it is possible to finally recall the action of the compound for promoting the treatment of fracture through endochondral ossification. That is, the compound is expected to be useful as a fracture repair promoter.
  • Example 1 A compound described in 74 (1), 18 2 mg) was dissolved in dichloromethane (10 mL), and 1-ethyl-3--3- (3-dimethylaminopropyl) -carposimid hydrochloride (96 mg: ), And paraethylaniline (61 mg) were added. The resulting mixture was stirred at 15-30 ° C for 15 hours.
  • reaction mixture was washed successively with 1N-dilute hydrochloric acid and saturated aqueous sodium hydrogencarbonate, dried over anhydrous sodium sulfate (15 to 30 ° C), and the solvent was removed under reduced pressure, followed by concentration.
  • Water (1 OmL) and concentrated hydrochloric acid (3 mL) were added to a solution of the compound described in "Example 1 74 (2)" of Kaihei 7-48349, 61 Omg) in acetone (3 OmL), and The mixture was heated at reflux for 2 hours. After allowing the reaction mixture to cool, the solvent was removed under reduced pressure and the mixture was concentrated. Dichloromethane was added to the residue, and the mixture was washed twice with brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate (15 to 30 ° C) and concentrated under reduced pressure to obtain 529 mg of the title compound as a crude product.
  • Retention time S body 24 minutes, 1 ⁇ body 40 minutes
  • 6-week-old male SD rats (manufactured by Nippon S.L.C., Ltd.—Nippon Charls, Riva, Inc.) were prepared by suspending Compound A obtained in Synthesis Example 1 above in a 3% gum arabic solution. Oral administration was performed at a dose of g / kg / day for 4 weeks.
  • the rat was necropsied, and the pinna, trachea, sternum, knee joint of femur and lower leg, and lumbar vertebra (disc) were immersed in 20% neutral buffered formalin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for one week and fixed.
  • the sternum, femur and knee joints, and lumbar spine (disc) were demineralized with a 20% EDTA4 sodium solution (pH 7.4, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) for 2 weeks. (Manufactured by EZA Corporation).
  • the observation site was cut out with a razor without demineralizing the pinna and trachea.
  • cut-out portions were used as paraffin-embedded blocks using an automatic embedding device (Sakura) and paraffin (a mixture of equal amounts of products manufactured by Domestic Chemical and Fisher Scientific).
  • the paraffin automatic dispenser The paraffin block was fixed to a tissue specimen cassette (TIS SUE—TEK) using — (Miles Scientific).
  • the paraffin block is cut into 2 mm thick sections, pasted on slide glass (manufactured by Matsunami Glass), and dried. did. After drying, the sections were immersed in xylene to remove paraffin, stored in water in a serial dilution series from ethanol to water. The sections were stained with 0.2% hematoxylin and 0.1% eosin (both from Merck), mounted with mounting media (Muto Kagaku) and cover glass (Matsunami Glass), and microscope (Japan).
  • FIGS. 1A to 5A and FIGS. 1B to 5B The results are shown in the photographs of FIGS. 1A to 5A and FIGS. 1B to 5B.
  • DMSO-physiological saline solution manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd. and Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
  • 50% DMSO-physiological saline solution manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd. and Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the rat was necropsied, the distance between the left and right collateral ligament attachment parts of the femur was measured with a caliper (Mitutoyo), and the width of the knee joint of the femur was measured.
  • Example 2 Thereafter, a tissue specimen was prepared in the same manner as in Example 1, stained with a 0.3% safranin-0 aqueous solution (manufactured by Merck), and observed under a microscope (manufactured by Nippon Kogaku; magnification: 10 ⁇ objective lens). did. The results are shown in FIGS. 6, 7A and 7B.
  • the width of the femoral knee joint was significantly larger in the compound A-administered group than in the vehicle-control group. Further, as shown in FIGS. 7A and 7B, promotion of formation of safranin 0-positive cartilage tissue was recognized histologically.
  • Articular chondrocytes were cut out from the femoral knee joint of a 6-week-old male SD rat (manufactured by Japan SLC) using a scalpel, digested with 0.3% collagenase (manufactured by WORTHINGTON), and separated and cultured. Calcif. Tissue Int. 19: 179-187, 1975). Using the isolated articular chondrocytes, the amount of 35 S-labeled sulfate (manufactured by Amersham) incorporated into glycosaminoglycans was measured in order to measure glycosaminoglycan synthesis even in the cartilage matrix.
  • articular chondrocytes were cultured on a 96-well plate for cell culture (FALCON) at a cell density of 10,000 cells per well.
  • the culture medium was Dulbecco's MEM and HamF containing 10% fetal serum (final concentration: 10%), 10 OU / mL penicillin (Meiji Seika), and 10 streptomycins (Manyu Pharmaceutical). — 12 equivalent mixed media (all manufactured by GIBCO) were used.
  • chondrocytes reach confluence, replace the medium with a serum concentration of 0.3% and culture overnight.Change the medium to the same medium containing 10 ⁇ mo 1 / L of Compound A, and 3 hours later.
  • 35 S-labeled sulfuric acid (manufactured by Amersham) was added at 0.5 ⁇ Ci per well, and the cells were cultured for 24 hours. Thereafter, the medium was collected in a 24-well plate and stored at 4 ° C. The cell layer was coated with 2 mg / mL of actinase E (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) at 0.1 lm / hole. L was added and digested at 37 ° C overnight (16 hours). And the next day digested cell layer were combined and medium saved, 0. 1 mg / mL chondroitin sulfate C (S i gm a Inc.) 0.
  • this sample was filtered through a glass fiber filter paper (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.), and the filter paper was washed three times with 2 mL of 1% cetylpyridinium chloride (20 mmol / L), and a vial for liquid scintillation counter was used.
  • PACKARD and add 1 OmL of Shinchire Ichiyo (Nacalai Tesque), and add a liquid scintillation counter (P
  • the radioactivity was measured using a method manufactured by ACKARD.
  • the uptake of 3 H-labeled thymidine was measured to measure cell proliferation.
  • the separated articular chondrocytes were cultured in a 96-well plate for cell culture (FALCON) at a cell density of 10,000 cells per well.
  • the culture medium was Dulbecco's MEM containing 100 fetal serum (final concentration: 10%), 100 U / mL penicillin (Meiji Seika), and 100 g / mL streptomycin (Banyu Pharmaceutical).
  • An equal volume mixed medium of Ham F-12 (all manufactured by GIB CO) was used. After the cells reached 60-70% confluence, the medium was replaced with one containing 0.3% fetal serum and cultured overnight.
  • the chondrogenesis-promoting agent represented by the general formula (I) is used as an agent for promoting the ability of chondrocytes to synthesize or grow extracellular matrix before and after transplantation in chondrocyte transplantation such as autologous chondrocyte transplantation. can do.
  • Example 4 (Effect of Compound A on Differentiation of a Common Progenitor Cell Line of Mouse-Derived Chondrocytes and Adipocytes (CL-1) into Chondrocytes)
  • a chondrocyte and adipocyte cell line CL-1 (International Publication No. 98/39414) established from a normal adult mouse was cultured in a 4-well chamber slide (Nunc) at a cell density of 5000 cells / cm 2 .
  • the culture medium contained 100 U / mL penicillin (Meiji Seika), 1 ⁇ 0 / g / mL streptomycin (Manyu Pharmaceutical) and 10% fetal fetal serum (INTERGEN).
  • MEM GI BCO
  • Compound A was added to a final concentration of 10 ⁇ mo 1 / L, and the medium was added three times a week, and cultured for 7 days.
  • a slide to which ethanol (manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd.) was added so that the final concentration in the medium was 1% was also provided. Seven days after confluence, the plates were collected and the CL-1 cell layer was double-stained with Alcian Blue and Oil Red 0, and each was observed to differentiate into chondrocytes or adipocytes.
  • the cell layer is fixed with a 4% paraformaldehyde solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 1 hour at room temperature, washed with 0.1 N hydrochloric acid, and washed with 1% Alcian Blue (manufactured by EM Science) Stained overnight with aqueous solution (H 1.0). Then wash with 0.1 N hydrochloric acid and distilled water,
  • Example 5 (Effect of Compounds A, B, C, D, E, F, and G on Uptake of 35 S-Labeled Sulfate by a Common Progenitor Cell Line of Mouse-Derived Chondrocytes and Adipocytes (CL-11))
  • One-one was cultured on a 96-well cell culture plate (Wa11ac) for a liquid scintillation counter (Wa11ac) at a cell density of 1000 cells per well.
  • the medium contained 10 OU / mL penicillin (Meiji Seika), 100 ⁇ g / mL streptomycin (Manyu Pharmaceutical) and 10% fetal calf serum (INTERGEN).
  • MEM manufactured by GIB CO
  • the cells were fixed with a buffer solution (pH 7.4), both manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. for 2 hours at room temperature. After discarding the fixative, wash once with the same solution. The washed liquid was discarded. 0.1 ml of scintillation (Wallac) was added to the cell layer, and the radioactivity was measured with a scintillation counter (Wallac) after stirring. The results are shown in FIGS.
  • chondrogenesis promoter represented by the general formula (I) can be converted from undifferentiated mesenchymal cells having pluripotency (eg, cells having a differentiation state similar to CL-11) to chondrocytes. It indicates that it can be used as a differentiating agent in the treatment of cartilage diseases such as chondrocyte transplantation.
  • Example 6 Cartilage repair effect of compound A on rat full thickness defect model
  • a 10-week-old male CD rat (Nippon Charles River Co., Ltd.) reaches the bone marrow with a 2.4 mm diameter Kirschner steel wire (Mizuho Medical Machine Co., Ltd.) on the outer surface of the right femoral knee. A 2.5 mm defect was made.
  • 50% dimethyl sulfoxide (DMSO) saline solution (DMSO: manufactured by Junsei Chemical Co., saline: Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) or 1.
  • Ommo 1 / L compound A The solution was administered once daily into the right knee joint daily for 3 weeks.
  • the daily dose of Compound A was 81.7 ⁇ .
  • the right femur was collected, immersed in 20% neutral buffered formalin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for one week and fixed, and a 20% EDTA4 sodium solution (pH 7.4, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) For 2 weeks, and the defective part was cut out with a razor (made by Feather).
  • the cut-out site was used as a paraffin in-block using an automatic embedding device (Sakura Co., Ltd.) and paraffin (equivalent mixture of Domestic Kagaku Co., Ltd. and Fisher Scientific Co., Ltd.).
  • a paraffin block was fixed to a tissue specimen cassette (TISSUE-TEK) using a paraffin automatic dispenser embedding sensor (MilesScientintic).
  • This paraffin block is used for microtome (manufactured by Daiwa Koiki Co., Ltd.) and microtome.
  • a cutting knife Flueza
  • 2 mm-thick sections were prepared, affixed to slide glass (Matsunami Glass), and dried. After drying, the sections were immersed in xylene to remove paraffin, and immersed in a serial dilution series from ethanol to water and stored in water.
  • the section was stained with 0.3% safranin 0 (manufactured by Merck), observed with a microscope (magnification: 10 ⁇ objective lens), and subjected to the method of Wak itani et al. (J. Bone Joint Surg. 76). -A, 579-592, 1 994) were modified to obtain histological scores.
  • the distal part of the right femur and the proximal part of the lower leg were collected, and the femur was placed in 2% paraformaldehyde-2.5% glutaraldehyde fixative (both manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the lower leg was fixed by immersion all day and night, and the lower leg was immersed and fixed in 20% neutral buffered formalin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for one week.
  • the distal part of the femur was post-fixed with 1% osmium solution (Wako Pure Chemical Industries), then dehydrated by immersion in an ascending ethanol series, replaced with isoamyl acetate, and then dried with a critical point dryer (manufactured by Hitachi, Ltd.). did.
  • the dried tissue surface is coated with gold using an ion sputtering coating device (manufactured by Eiko), and the surface of the femoral epicondylar cartilage is observed using a scanning electron microscope (manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • the diameter of the exposed collagen fibers is 10 m or less.
  • Severe collagen fibers are lost, and calcified cartilage or subchondral bone is exposed.
  • the proximal part of the lower leg is cut out with a bando (EXAKT) and then 20% EDT A4 sodium solution (pH 7.4, manufactured by Wako Pure Chemical) For 4 weeks.
  • the cut out part was used as a paraffin block using an automatic embedding device (Sakura) and paraffin (equivalent mixture from Domestic Chemical and Fisher Sentifick).
  • a paraffin block was fixed to a tissue specimen cassette (TISSUE-TEK) using a paraffin automatic dispenser embedding center (MilesScinettifc).
  • the paraffin block was cut into 2 ⁇ m-thick sections, and slide glass was prepared. (Matsunami Glass Co., Ltd.) and dried. After drying, the sections were immersed in xylene to remove paraffin, and immersed in a serial dilution series from ethanol to water and stored in water. The sections were stained with 0.3% safranin 0 (manufactured by Merck), observed with a microscope (magnification: 10 ⁇ objective lens), and subjected to the method of Kikuchi et al. (Osteoarthritis. Cartilage). Histological scores were collected based on the following criteria (Table 12), which were modified from 4, 99-110, 1996).
  • a cartilage formation-promoting agent or a cartilage repair agent comprising an indrin-1-one derivative having a specific structure or a salt thereof as an active ingredient.
  • the chondrogenesis promoter is expected to promote cartilage formation in humans and other warm-blooded animals and to be an excellent therapeutic agent for cartilage diseases such as rheumatism, osteoarthritis, and cartilage damage due to trauma. You.
  • indolin-1-one derivative having a chondrogenesis promoting action of the present invention is also useful as a reagent for biological, physical and chemical studies on cartilage.

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Description

曰月糸田 β 軟骨形成促進剤およびィンドリンー 2—オン誘導体 技術分野
本発明は、 医薬として有用なインドリン一 2—オン誘導体またはその塩、 およ びィンドリンー 2—オン誘導体またはその製薬学的に許容される塩を含有する軟 骨形成促進剤、 軟骨修復剤または軟骨研究用試薬に関する。 背景技術
軟骨 （cartilage ) は、 生体において、 一般に、 特殊化した結合組織の一つで ある軟骨細胞 （ chondrocyte )、 繊維細胞、 およびこれらを埋め込んだ無定形 ' ゲル状の礎質からなり、 生体の支持組織の一部をなすものである。
軟骨は、 ヒトを始めとする温血動物においては、 骨格、 関節、 気管、 耳介、 鼻 などを形成している。 すなわち、 軟骨は成長時の骨の錡型 （成長軟骨）、 円滑な 関節の運動 （関節軟骨)、 呼吸 （気管軟骨、 鼻軟骨)、 聴覚 （耳介軟骨） など、 温 血動物の生存上不可欠な機能において中心的役割を果たしている。 したがって、 これらの軟骨が変性あるいは破壊された場合、 変性あるいは破壊の部位ないし程 度に応じて、 生体に種々の障害がもたらされることとなる。
例えば、 軟骨が関与する上記した機能 （成長、 関節、 呼吸、 聴覚等） の中でも、 特に、 円滑な関節の運動は、 慢性関節リウマチや変形性関節症などの疾患におい て関節軟骨が変性あるいは破壊されることで損なわれる傾向がある。 この関節軟 骨の変性あるいは破壊は、 これらの疾患による歩行困難の重要な原因であると考 えられている。
他方、 慢性関節リウマチや変形性関節症などの疾患の治療法として、 関節の変 性 -破壊の抑制や、 軟骨形成の促進が採用可能であることが指摘されている （J. Rheum. 2 2 ( 1 ), Suppl. 4 3 : 1 3 6〜 1 3 9 , 1 9 9 5 , Lab. Invest. 78 (2) : 1 3 3〜1 42)。
軟骨形成を促進、 あるいは軟骨細胞を増殖する効果がある物質としては、 種々 の生体由来物質ないし低分子物質が知られている。 従来より、 例えば、 TGF— β (Transforming growth factor ? )などの成長因子、 B M P— 2 (J. Bone Joint Surg.79—A ( 1 0) : 1 45 2〜 1 46 3， 1 9 9 7 )、 レクチンの 1種であ るコンカナバリン A (J. Biol. Chem., 2 65 : 1 0 1 2 5〜 1 0 1 3 1， 1 99 0)、 あるいはォステオゲニン （BMP— 7)、 ビ夕ミン D誘導体 （ 1ひ， 2 5— D3) (Cancer Res. , 4 9 ： 543 5〜 544 2， 1 9 8 9 )、 ビタ ミン A 誘導体 （レチノィン酸） （Dev. Biol., 1 3 0 : 7 6 7〜 7 73 , 1 9 8 8 )、 ヴアナデート （J. Cell Biol.， 1 04 : 3 1 1〜 3 1 9， 1 9 87 )、 ベンズァ ミ ド （J. Embryol. Exp. Morphol. , 8 5 : 1 63〜 1 7 5， 1 9 85 )、 ベ ンジル ?— D—キシロサイ ド （Biochem. J., 2 24 : 9 7 7〜 9 8 8 , .1 9 84)、 ト リョ一ドサイロニン （T 3) (Endocrinology, 1 1 1 ： 4 6 2〜 4 6 8， 1 9 8 2 )、 プロスタグランジン誘導体 （ P G E2， U 4 4 0 6 9 )
(Prostaglandin, 1 9 : 3 9 1〜 406 , 1 980)、 d b c AMP (J. Cell. Physil.， 1 00 : 63〜 7 6 , 1 9 79 )、 8 -B r- c AMP (J. Cell. Physil. , 1 00 : 63〜 76 , 1 9 7 9 ) 等の低分子物質が、 軟骨形成促進効果を有する ことが報告されている。
上記した生体由来物質ないし低分子物質のうち、 最も有用な治療薬となること が期待された TGF— に関して、 TGF—/?のアイソフォームの一つである T GF— ^は、 これを関節内に投与した際に軟骨形成を促進することが報告され ている （Lab. Invest.7 1 (2) : 2 7 9〜 290， 1 9 94 )。 また、 この TG F— /? ,は、 実験的に関節炎を生じさせたモデル動物において、 関節炎による関 節軟骨のプロテオグリカンの消失を抑制する、 換言すれば、 関節内投与時の関節 軟骨への同化的作用により関節軟骨の破壊を抑制するため、 リゥマチなどの関節 疾患の有用な治療薬としての可能性が示唆されている （Lab. Invest.78 ( 2) : 1 33〜 142 , 1 9 98)o
しかしながら、 このように最も有用な治療薬となることが期待された TGF— においても、 該物質は軟骨形成を促進する一方で顕著な滑膜炎を惹起すること が報告されており、 前述した軟骨疾患の治療薬として大きな問題点を有している ため （Lab. Invest.7 1 (2) : 2 79〜 2 90, 1 9 94 )、 該疾患の治療薬と して実用化されるに至っていない。 すなわち、 軟骨形成の促進に基づく実用的な 治療薬は、 現在のところ存在しない。 発明の開示
本発明の目的は、 上記した従来技術の欠点を解消し、 軟骨形成を促進あるいは 軟骨細胞を増殖させることが可能な軟骨形成促進剤ないし軟骨修復剤を提供する ことにある。
本発明の他の目的は、 軟骨を生物学的、 物理学的ならびに化学的に研究する際 に有用な、 軟骨形成促進作用を有する試薬を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、 軟骨形成促進剤等として有用なィンドリン— 2—ォ ン誘導体を提供することにある。
さらに、 本発明の目的は、 骨折修復促進剤として有用なインドリン一 2—オン 誘導体を提供することにある。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、 特定の構造を 有するインドリン一 2—オン誘導体が、 軟骨形成促進作用を有することを見いだ し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明の軟骨形成促進剤は、 一般式 （ I ) 〇
Figure imgf000006_0001
{式中、 R 1はハロゲン原子、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 水酸基、 二 トロ基、 トリフルォロメチル基、 低級アルキルチオ基、 ァシル基、 カルボキシル 基、 メルカプト基、 または置換基を有していてもよいアミノ基を示し ； R2は水 素原子、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよい 低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基を有し ていてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよいァシル基、 置換基を 有していてもよいァリール基、 または置換基を有していてもよい複素環基を示 し； R 3は置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよ ぃシクロアルキル基、 置換基を有していてもよいァリール基、 または置換基を有 していてもよい複素環基を示し； R4は水素原子、 置換基を有していてもよい低 級アルキル基、 置換基を有していてもよいァリール基、 置換基を有していてもよ い複素環基、 一 O R 5、 一 S R 5、 または一 N R6R 7 (式中、 R 5, R6, R7は同一 でも異なっていてもよく、 それぞれ水素原子、 置換基を有していてもよい低級ァ ルキル基、 置換基を有していてもよいシクロアルキル基、 置換基を有していても よいァリール基、 置換基を有していてもよい複素環基、 低級アルコキシ基、 また は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、 R6, R7は一緒になつて一 （C H 2) m―、 ― ( C H2) !N R8 ( C H 2) k- (式中 k， 1， mはそれぞれ 1〜8の整 数を示し、 R8は水素原子または低級アルキル基を示す） で表される基を構成し てもよい） で表される基を示し； X， Yは同一でも異なっていてもよく、 一 C H 2—、 一 N H—または一 0—を示し、 nは 0〜4の整数を示す。 } で表される化合 物、 またはその塩を有効成分とするものである。 また、 本発明の軟骨修復剤は、 上記一般式 （ I ) で表される化合物またはその 塩を有効成分とするものである。
更にまた、 本発明の軟骨の生物学的、 物理学的、 または化学的研究用の試薬は、 上記一般式 （I ) で表される化合物またはその塩を含有するものである。
更にまた、 本発明のインドリン一 2—オン誘導体は、 下記一般式 （IV)
Figure imgf000007_0001
R12
(式中、 R 12は低級アルコキシ基 （この低級アルコキシ基は、 1〜5個のハロゲ ン原子で置換されていてもよい） が 2つ同一炭素上に置換されている低級アルキ ル基を示す） で表されるものである。
更にまた、 本発明のインドリン— 2—オン誘導体は、 前記 R 12が一般式 （V )
Figure imgf000007_0002
(式中 R 13， R 14は同一でも異なっていてもよく、 それそれ 1〜 5個のハロゲン 原子で置換されていてもよい低級アルキル基を示す） で表されるものである。 図面の簡単な説明 図 1Aは、 ラットに溶媒対照 （3%アラビアゴム） を 4週間経口反復投与した 際の耳介のへマトキシリン ·ェォジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真であ り、 図 1Bは、 ラヅ トに化合物 A (2 g/kg) を 4週間経口反復投与した際の 耳介のへマトキシリン ·ェォジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真である。 図 2 Aは、 ラヅ トに溶媒対照 （3%アラビアゴム） を 4週経口反復投与した際 の気管のへマトキシリン ·ェォジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真であり 、 図 2Bは、 ラットに化合物 A (2 g/kg) を 4週経口反復投与した際の気管 のへマトキシリン ·ェォジン二重染色組織標本を示した顕微鏡写真である。 図 3 Aは、 ラットに溶媒対照 （3%アラビアゴム） を 4週間経口反復投与した 際の胸骨剣状突起のへマトキシリン 'ェォジン二重染色組織標本を示した顕微鏡 写真であり、 図 3Bは、 ラヅ トに化合物 A (2 g/kg) を 4週間経口反復投与 した際の胸骨剣状突起のへマトキシリン ·ェォジン二重染色組織標本を示した顕 微鏡写真である。
図 4 Aは、 ラットに溶媒対照 （3%アラビアゴム） を 4週間経口反復投与した 際の大腿骨 ·下腿骨の膝関節部のへマトキシリン ·ェォジン二重染色組織標本を 示した顕微鏡写真であり、 図 4Bは、 ラットに化合物 A (2 g/kg) を 4週間 経口反復投与した際の大腿骨 ·下腿骨の膝関節部のへマトキシリン ·ェォジン二 重染色組織標本を示した顕微鏡写真である。
図 5 Aは、 ラットに溶媒対照 （3%アラビアゴム） を 4週間経口反復投与した 際の腰椎 （椎間板） のへマトキシリン ·ェォジン二重染色組織標本を示した顕微 鏡写真であり、 図 5 Bは、 ラットに化合物 A (2 g/kg) を 4週間経口反復投 与した際の腰椎 （椎間板） のへマトキシリン .ェォジン二重染色組織標本を示し た顕微鏡写真である。
図 6は、 化合物 A (1. Ommo 1/L) または溶媒対照 （50% DM SO 生理食塩水溶液） をラッ ト膝関節内に一日あたり 50 1を 3週間反復投与した 際の大腿骨膝関節の幅を示したグラフである。 図 7 Aは、 溶媒対照 （50%DMSO生理食塩水溶液） をラット膝関節内に一 日あたり 50〃1を 3週間反復投与した際の大腿骨膝関節部の 0. 3%サフラ二 ン 0染色組織標本を示した顕微鏡写真であり、 図 7 Bは、 化合物 A ( 1. 0mm o 1/L) をラヅト膝関節内に一日あたり 50〃 1を 3週間反復投与した際の大 腿骨膝関節部の 0. 3%サフラニン 0染色組織標本を示した顕微鏡写真である。 図 8は、 ラット初代培養関節軟骨細胞に化合物 Aまたは溶媒対照 （培地中最終 濃度が 1 %のエタノール） を添加した際の、 35 S標識硫酸のグリコサミノグリカ ンへの取り込み量を示したグラフである。
図 9は、 ラット初代培養関節軟骨細胞に化合物 Aまたは溶媒対照 （培地中最終 濃度が 1 %のエタノール） を添加した際の、 3H標識チミジンの取り込み量を示 したグラフである。
図 10Aは、 コンフルェントに達した C L一 1に、 溶媒対照 （培地中最終濃度 が 1 %のエタノール） を添加して 7日間培養した際の、 アルシアンブル一とオイ ルレッド 0の二重染色した顕微鏡写真であり、 図 10Bは、 コンフルェントに達 した CL— 1に、 化合物 A (培地中最終濃度が 10〃mo 1/L) を添加して 7 日間培養した際の、 アルシアンブルーとオイルレツド 0の二重染色した顕微鏡写 真である。
図 1 1は、 コンフルェントに達した CL— 1に化合物 A, Fを最終濃度 1， 5 , 10〃mo 1/L、 化合物 B， Eを最終濃度 10〃mo 1/Lまたは溶媒対照 の最終濃度 1 %のエタノールを含む培地で 48時間培養した際の、 最後の 24時 間の 35 S標識硫酸の C L一 1への取り込み量を示したグラフである。
図 1 2は、 コンフルェントに達した C L一 1に化合物 A， C, D, Gを最終濃 度 10〃mo 1/Lまたは溶媒対照の最終濃度 1 %のエタノールを含む培地で 4 8時間培養した際の、 最後の 24時間の 35S標識硫酸の CL— 1への取り込み量 を示したグラフである。
図 13 Aおよび図 13 Bは、 ラッ ト大腿骨膝蓋面に骨髄に達する欠損部を作成 し、 その 7日後から化合物 A ( 1. Ommo 1/L) または溶媒対照 （50%D MSO生理食塩水溶液） を 1日あたり 50 L、 3週間反復投与した際の、 欠損 部の軟骨修復を組織学的に検討した結果を示すグラフである。 なお、 図 13Aは 、 Ce l l mo rpho l o gy, Mat r ix— s t a i n i ng, T h i ckne s s o f c a r t i 1 a g eのスコアを、 図 1 3 Bは To t a l s c o r eのスコアを示すものである。
図 14Aは、 ラット大腿骨膝蓋面に骨髄に達する欠損部を作成し、 その 7日後 から溶媒対照 （50%DMSO生理食塩水溶液） を 1日あたり 50〃L、 3週間 反復関節内投与した際の、 欠損部の 0. 3%サフラニン 0染色標本の顕微鏡写真 であり、 図 14Bは、 ラット大腿骨膝蓋面に骨髄に達する欠損部を作成し、 その 7日後から化合物 A ( 1. Ommo 1/L) を 1日あたり 50〃L、 3週間反復 関節内投与した際の、 欠損部の 0. 3%サフラニン 0染色標本の顕微鏡写真であ る。
図 15 Aは、 ゥサギの関節半月を部分切除し、 その 7日後から溶媒対照 （50 %DMS 0生理食塩水溶液） を 1日あたり 500〃L、 3週間反復関節内投与し た際の走査型電子顕微鏡像であり、 図 1 5 Bは、 ゥサギの関節半月を部分切除し 、 その 7日後から化合物 A (3. Ommo 1/L) を 1日あたり 500 L、 3 週間反復関節内投与した際の走査型電子顕微鏡像である。 なお、 図 1 5 Aおよび 図 1 5 Bのいずれも 6例の個体を示す。
図 1 6A、 図 16 Bおよび図 1 6 Cは、 ゥサギの関節半月を部分切除し、 その
7日後から化合物 A (3. Ommo 1/L) または溶媒対照 （50%DMSO生 理食塩水溶液） を 1日あたり 500 L、 3週間反復関節内投与した際の走査型 電子顕微鏡像での損傷した関節軟骨表面の面積を示すグラフである。 なお、 図 1 6 Aは M i 1 dな病変部の面積の平均値を、 図 1 6 Bは Me d i umな病変部の 面積の平均値を、 図 1 6 Cは M i 1 dと Me d i umの面積を和した病変部総面 積の平均値をそれそれ示す。 図 17Aおよび図 1 7 Bは、 ゥサギの関節半月を部分切除し、 その 7日後から 化合物 A (3. Ommo 1/L) または溶媒対照 （ 50 % D M S◦生理食塩水溶 液） を 1日あたり 500〃L、 3週間反復関節内投与した際の病変部の 0. 3% サフラニン 0染色標本を、 組織学的に検討した結果を示すグラフである。 なお、 図 1 7Aは、 L o s s o f sup e rf i c i a l l aye r, U l c e r a t i o n o r e r o s i on, F i br i l l at i on, C l u s t e r ： f o rmat i onのスコアを、 図 1 7 Bは、 G l o ba l as s e s sme n tのスコアを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明する。 以下の 記載において量比を表す 「部」 および 「％」 は、 特に断らない限り重量基準とす る。
本発明の軟骨形成促進剤および軟骨修復剤は、 上記一般式 （I ) で表される化 合物またはその塩を有効成分とするものである。
本発明にかかる一般式 （I ) で表される化合物は、 国際公開 94/1 9322 号公報に記載されており、 同公報にはこの化合物が C CK— B/ガストリン受容 体拮抗薬であることが記載されている。 これに対して、 本発明者は、 一般式 （ I ) で表される化合物が、 意外にも軟骨形成促進作用をも有することを見出し、 かか る知見に基づき本発明を完成した。 本発明にかかる一般式 （I ) で表される化合 物は、 上記した国際公開公報に記載された方法に加えて、 後述する実施例に記載 された方法によっても得ることができる。
本発明においてハロゲン原子とは、 フッ素原子、 塩素原子、 臭素原子、 ヨウ素 原子を意味する。
本発明において低級アルキル基とは、 直鎖または分岐鎖状の、 炭素数 1〜6の アルキル基を示し、 たとえばメチル基、 ェチル基、 n—ブロピル基、 i一プロピ ル基、 n—ブチル基、 s—ブチル基、 t—ブチル基、 ペンチル基、 へキシル基等 があげられる。
低級アルケニル基とは、 直鎖または分岐鎖状の炭素数 2〜 6のアルケニル基を 示し、 たとえばビニル基、 ァリル基、 ブテニル基、 ペンテニル基、 へキセニル基 等があげられる。
低級アルキニル基とは、 直鎖または分岐鎖状の炭素数 2〜 6のアルキニル基を 示し、 たとえばェチニル基、 プロピニル基、 プチニル基等があげられる。
低級アルコキシ基とは、 直鎖または分岐鎖状の炭素数 1〜6のアルコキシ基を 示し、 たとえばメ トキシ基、 エトキシ基、 n—プロポキシ基、 i一プロポキシ基、 n—ブトキシ基、 s—ブトキシ基、 tープトキシ基、 ペントキシ基、 へキソキシ 基等があげられる。
ァシル基とは水素原子や置換基を有していてもよい、 アルキル基、 ァリール基、 アルコキシ基、 アミノ基等で置換されたカルボ二ル基を示し、 たとえばァセチル 基、 プロピオニル基、 ビバロイル基、 シクロへキサンカルボニル基等のアルキル カルボニル基およびベンゾィル基、 ナフトイル基、 トルオイル基等のァリール力 ルボニル基があげられる。
ァリール基とは、 芳香族炭化水素から水素原子 1個を除いた 1価の基を示し、 たとえばフエニル基、 トリル基、 キシリル基、 ビフエ二ル基、 ナフチル基、 アン トリル基、 フエナントリル基などがあげられる。
低級アルキレン基とは直鎖または分岐鎖状の、 炭素数 1〜 6のアルキレン基を 示し、 たとえばメチレン基、 エチレン基、 プロピレン基、 ブチレン基、 ペンチレ ン基、 へキシレン基等があげられる。
シクロアルキル基とは、 炭素数 3〜 8の環状飽和炭化水素基を示し、 たとえば シクロプロピル基、 シクロブチル基、 シクロペンチル基、 シクロへキシル基、 シ クロへプチル基などがあげられ、 置換基を有するシクロアルキル基としてはメン チル基、 ァダマンチル基などがあげられる。 複素環基とは、 1個以上のへテロ原子を有する芳香族複素環基を示し、 たとえ ばピリジル基、 フリル基、 チェニル基、 ィミダゾリル基、 ビラジニル基、 ピリミ ジル基などがあげられる。
上記した低級アルキル基、 低級アルケニル基、 アルキニル基、 低級アルコキシ 基、 ァシル基、 ァリール基、 シクロアルキル基、 複素環基は、 必要に応じて、 1 以上の種々の置換基により置換されていてもよい。 このような置換基の例として は、 ハロゲン原子、 低級アルキル基、 シクロアルキル基、 ァリール基、 水酸基、 低級アルコキシ基 （この低級アルコキシ基は、 ハロゲン原子で置換されていても よい）、 ァリールォキシ基、 低級アルキルチオ基、 複素環基、 ホルミル基 （この ホルミル基はァセタールとして保護されていてもよい）、 低級アルキルカルボ二 ル基、 ァリールカルボニル基、 カルボキシル基、 低級アルコキシカルボニル基、 アミノ基（このアミノ基は、 低級アルキル基等を有していてもよい）、 ィミノ基、 チオアセタール基、 ニトロ基、 二トリル基、 トリフルォロメチル基などがあげら れる。
次に、 本発明の軟骨形成促進剤および軟骨修復剤の有効成分である化合物 （前 記一般式 （I ) で表されるインドリン一 2—オン誘導体） について、 より詳しく 説明する。
R 1はハロゲン原子、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 水酸基、 ニトロ基、 トリフルォロメチル基、 低級アルキルチオ基、 ァシル基、 カルボキシル基、 メル カプト基、 または置換基を有していてもよいアミノ基を示し、 中でも R 1はハロ ゲン原子、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 またはニトロ基であることが好 ましい。
nは 0〜4の整数を示す。 nは 0または 1であることが好ましく、 特に 0であ ることが好ましい。
R2は水素原子、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよい低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置 換基を有していてもよい低級アルコキシ基、置換基を有していてもよいァシル基、 置換基を有していてもよいァリ一ル基、 または置換基を有していてもよい複素環 基を示す。
R2は水素原子、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよい低級アルケニル基、 または置換基を有していてもよいァリール基であ ることが好ましく、 軟骨形成促進剤ないし軟骨修復剤としての活性の点からは、 更には置換基 （この置換基は、 ハロゲン原子で置換されていてもよい） を有して いてもよい低級アルキル基であることが好ましい。
中でも、 R2は 2つの低級アルコキシ基 （この低級アルコキシ基は、 1〜5個 のハロゲン原子で置換されていてもよい） または一 0— Z— 0—基 （式中、 Zは 1〜1 0個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す） が 同一炭素上に置換されている低級アルキル基であることが好ましく、 更には一般 式 (II)
—— CH2CH ( Π )
、〇R11
(式中、 R 1Q， R 11は同一でも異なっていてもよく、 それそれ 1〜5個のハロゲ ン原子で置換されていてもよい低級アルキル基を示し、 少なくとも一方は 1〜5 個のハロゲン原子を有する低級アルキル基であることが好ましい）、
または一般式 (III)
—— CH2CH Z (ΠΙ)
ヽ〇z (式中、 Zは 1〜1 0個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン 基を示す） で表される基であることが好ましい。
このような R2としては、 より具体的には、 2 , 2—ジエトキシェチル基、 2， 2—ジメ トキシェチル基、 2 , 2—ジイソプロポキシェチル基、 2 , 2—ビス （2 一フルォロエトキシ） ェチル基、 または 2， 2—ビス （2—クロ口エトキシ） ェ チル基が好ましく、 中でも、 2， 2—ジエトキシェチル基、 または 2， 2—ビス (2—フルォロエトキシ） ェチル基がより好ましく、 2 , 2—ジエトキシェチル 基が特に好ましい。
R3は置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよい シクロアルキル基、 置換基を有していてもよいァリール基、 または置換基を有し ていてもよい複素環基を示す。 R3は置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよいシクロアルキル基、 または置換基を有していてもよい ァリール基であることが好ましく、 中でも置換基を有していてもよいァリール基 がより好ましい。 このような置換基としては、 低級アルキル基 （好ましくは、 メ チル基、 ェチル基； より好ましくはメチル基） または低級アルキル基を有してい てもよぃァミノ基が好ましく、 前記 R3としては、 4一メチルフエニル基が好ま しレ、。
R4は水素原子、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよいァリール基、 置換基を有していてもよい複素環基、 —OR5 一 S R5、 または一 NR6R7を示す。 ここに、 Rs, R6, R7は同一でも異なっていてもよく、 それそれ水素原子、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有して いてもよいシクロアルキル基、 置換基を有していてもよいァリール基、 置換基を 有していてもよい複素環基、 低級アルコキシ基、 または置換基を有していてもよ いアミノ基を示し、 R6, R7は一緒になって一 （CH2) m—、 ― (CH2) ,N (CH2) k一 （式中 k， 1 , mはそれぞれ 1〜8の整数を示し、 R8は水素原子 または低級アルキル基を示す） で表される基を構成してもよい。 R4は、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよ ぃァリール基、 置換基を有していてもよい複素環基、 一 OR5、 または一 NR6R7 (式中、 R5， R6, R7は前記と同義） で表される基であることが好ましく、 更 には一 NR6IT (式中、 R6, R7は同一でも異なっていてもよく、 それそれ水素 原子または置換基を有していてもよいァリ一ル基を示す） で表される基であるこ とがより好ましい。
中でも、 R4が一 NR6R7 (式中、 R6， R7は同一でも異なっていてもよく、 そ れぞれ水素原子、 あるいはァリ一ル基 （このァリール基は、 低級アルキル基また はァミノ基 （このアミノ基は、 さらに低級アルキル基を有していてもよい） を有 している） で表される基であることが好ましく、 更には一 NHR7 (式中、 R7は 4一メチルフエニル基、 4—ェチルフエニル基、 または 4一 （N, N—ジメチル ァミノ） フエニル基） で表される基であることが特に好ましい。
X、 Yは同一でも異なっていてもよく、 それぞれ— CH2—、 一 NH—または 一 0—を示し、 Xが一 CH2—、 一 NH—または一 0—、 Yがー CH2—または一 NH—をそれそれ示すことが好ましい。 中でも、 軟骨形成促進剤ないし軟骨修復 剤としての活性の点からは、 X， Yは同一でも異なっていてもよく、 — CH2— または一 NH—を示すことがより好ましく、 Xは一NH—、 Yがー CH2—であ ることが特に好ましい。
また、 本発明にかかるインドリン— 2—オン誘導体は、 製薬学的に許容される 塩の形態として使用してもよい。 このような塩としては、 例えば、 塩酸塩、 臭化 水素酸塩、 ヨウ化水素酸塩、 硫酸塩、 りん酸塩等の無機塩類、 コハク酸塩、 マロ ン酸塩、 酢酸塩、 マレイン酸塩、 フマル酸塩、 クェン酸塩、 安息香塩、 サリチル 酸塩等の有機酸塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩、 マグネシウム塩等の金属塩が挙 げられる。
更に、 本発明にかかるインドリン— 2—オン誘導体は、 その光学活性体であつ てもよい。 光学活性体である場合には、 その 3位の絶対配置が R配置であるもの が好ましい。
本発明のィンドリン一 2—オン誘導体の具体的な化合物の例としては、 たとえ ば国際公開 94/19322号公報の実施例に記載されている化合物、 ないしは 特開平 7— 48349号公報の実施例に記載されている化合物、すなわち下記（表 1 ) 〜 （表 9) に示す化合物番号 1〜201の化合物があげられる。
下記の （表 1) 〜 （表 9) 中、 Ri〜R4、 X、 Yおよび nは、 前記一般式 （I) におけるのと同義である。
Figure imgf000018_0001
(表 2 )
Figure imgf000019_0001
CO ゝ
Figure imgf000020_0001
T
I (表 4
Figure imgf000021_0001
(表 5 )
Figure imgf000022_0001
：表 6
Figure imgf000023_0001
(表 7)
Figure imgf000024_0001
(表 8
Figure imgf000025_0001
to
Figure imgf000026_0001
) ¾9 また、 本発明の軟骨形成促進剤ないし軟骨修復剤のより好適な具体的化合物の 例として、 下記の各化合物を挙げることができる。
(化合物 A)
Figure imgf000027_0001
(化合物 B)
Figure imgf000027_0002
CH2CH(OEt)2
(化合物 C)
Figure imgf000027_0003
CH2CH(OEt)2 (化合物 D)
Figure imgf000028_0001
CH2CH(OMe)2
(化合物 E)
Figure imgf000028_0002
CH2CH(OiPr)2
(化合物 F)
Figure imgf000028_0003
CH2CH(OCH2CH2F)2 (化合物 G)
Figure imgf000029_0001
また、 化合物 Aの生体内代謝物の例として、 下記の化合物 Hおよび Iを挙げる 二とができる。
(化合物 H)
Figure imgf000029_0002
CH2CH(OEt)2
(化合物 I )
Figure imgf000030_0001
表 1〜9に記載の化合物は、 特開平 7— 4 8 3 4 9号公報記載の方法により合 成することができる。 また、 上記した化合物 A〜Gのうち、 化合物 A〜Dは、 特 開平 7— 4 8 3 4 9号公報記載の方法に従い合成することができる。
また、 上記化合物 E、 化合物 F、 及び化合物 Gは、 特開平 7— 4 8 3 4 9号公 報に記載された方法に従い合成した、 本願実施例記載のアルデヒド中間体を原料 として、 例えば、 下記の反応経路 A (特開平 7— 4 8 3 4 9号公報の 「反応経路 6」 に相当する） に従い合成することができる。
(反応経路 A )
Me
Figure imgf000031_0001
CH2CHO
アルデヒ ド中間体
Figure imgf000031_0002
CH2CH(OiPr)2 CH2CH(OCH2CH2F)2 CH2CH(OCH2CH2CI)2 化合物 E 化合物 F 化合物 G
上記化合物 Hは特開平 7— 4 8 3 4 9号公報に記載されている 「反応経路 7」 に従い合成することができる。 また、 上記化合物 Iはラセミ体もしくは光学活性 体として次のような方法により得ることができる。
すなわち、 化合物 Iのラセミ体は、 ヒドロキシ基を適当な保護基 （例えば、 ト リェチルシリル基、 t -プチルジメチルシリル基等の置換シリル基） で保護した ィソシアナートを用い、 例えば、 下記の反応経路 B (特開平 7— 4 8 3 4 9号公 報の 「反応経路 5」 に相当する） に従い合成できる。
また、 化合物 Iの光学活性体はヒドロキシ基を適当な保護基 （例えば、 トリェ チルシリル基、 t—プチルジメチルシリル基等の置換シリル基） で保護したイソ シアナ一トを用い、 例えば、 下記の反応経路 B (特開平 7— 4 8 3 4 9号公報の 「反応経路 7」 に相当する） に従い合成するか、 化合物 Iの立体異性体混合物を 当業者に周知の方法 （例えば、 光学活性カラムを用いる方法） により光学分割し て得ることができる。
得られた化合物の同定および構造決定、 純度は、 通常の方法 （N M R， I R等 の分光学的方法、 および高速液体クロマトグラフィー等） により行うことができ る。
(反応経路 B )
Figure imgf000033_0001
ゥレア中間体 エステル中間体
Figure imgf000033_0002
化合物 I (ラセミ体） アミド中間体 化合物 I (光学活性体）
本発明の軟骨形成促進剤は、 該薬剤の軟骨形成促進効果が有効に利用可能な限 り、 種々の用途に特に制限なく使用可能であるが、 特に、 軟骨の変性 .破壊によ る軟骨機能不全を伴う軟骨疾患、 外傷や手術による軟骨の損傷 ·切除、 先天的な 軟骨の低形成や奇形の治療に有用である。 このような軟骨疾患の例としては、 例 えば、 変形性関節症、 慢性関節リウマチ、 離断性骨軟骨炎、 外傷による関節軟骨 の損傷、 椎間板ヘルニアなどがあげられる。 また先天的な軟骨の低形成や奇形の 例としては、 例えば、 無耳症、 小耳症などがあげられる。
本発明の化合物を含有する薬剤は、 経口的にまたは非経口的に投与することが できるが、 投与した部位以外での、 必要でない軟骨形成促進を回避する点、 もし くは効果の点からは、 非経口投与が好ましい。 投与に際しては、 それぞれの投与 方法に適した製剤に調製することができる。
本発明化合物を有効成分とする医薬組成物は、 通常の製剤化技術を用いて製剤 化することができる。 該医薬組成物は、 その用途に応じてカプセル剤、 顆粒剤、 クリーム剤、 散剤、 シロップ剤、 錠剤、 注射剤、 および軟膏剤等の、 固体および 液体の種々の製剤として使用することができる。製剤用の担体ゃ賦形剤としては、 固体または液体状の物質が挙げられる。 これらの例としては、 例えば、 乳糖、 ス テアリン酸マグネシウム、 スターチ、 タルク、 ゼラチン、 寒天、 ぺクチン、 ァラ ビアゴム、 ォリーブ油、 ゴマ油、 エチレングリコールなどやその他、 常用のもの が例示される。
かかる製剤中の本発明化合物の含有量は、 その剤型によって異なるが、 一般に
0 . 0 0 0 0 1〜8 0重量％の濃度で含有していることが望ましい。 本発明化合 物の医薬組成物は、対象とするヒトをはじめとする温血動物の種類、症状の軽重、 医師の診断などに応じて、 広範囲に変えることができるが、 一般に有効成分とし て、 経口投与の場合は 1日あたり 0 . 0 1〜2 g/k g、 非経口投与の場合は 1 日あたり 0 . 0 0 0 0 0 0 1〜0 . 0 1 gZk gである。 また、 上記投与量は、 1〜7日あたり 1回または数回に、 まとめて又は分けて投与することができ、 症 状の軽重、 医師の判断により、 適宜変更することができる。
以下の実施例に示したように、 本発明の薬剤はラッ卜に対して経口的または非 経口的に投与した場合、 軟骨形成促進作用を有することが確認された。 この事実 は、 本発明の薬剤の関節疾患の治療薬としての有用性を示したものである。 また、 経口投与した時に認められた、 一般式 （ I ) で表される化合物による気 管軟骨、 椎間板、 耳介軟骨、 胸骨の軟骨形成促進は、 一般式 （ I ) で表される化 合物が、 これらの軟骨の軟骨の欠損や変性 ·破壊などを示す疾患における修復剤 としても有用な治療薬となることを示したものである。
さらに、 未分化な間葉系細胞 （C L— 1 ) または軟骨細胞を、 一般式 （ I ) で 表される軟骨形成促進剤で処理することで、 軟骨細胞 （軟骨細胞を処理した場合 はより多くの軟骨細胞）、その細胞外基質または軟骨様組織を得ることができる。 これらの本願軟骨形成促進剤を用いて、 軟骨細胞の細胞外基質代謝や軟骨細胞へ の分化の機構 （以上が生物学的項目）、 細胞外基質の構成成分の分析 （化学的項 目）、 粘弾性などの物性 （物理的項目） の解析に用いることができる。
またさらに、 本発明の一般式 （ I ) で表される軟骨形成促進作用を有するイン ドリン— 2—オン誘導体は、 場合によっては、 その軟骨形成促進作用による石灰 化軟骨形成の促進が起こり得るため、 その場合、 最終的に該化合物の軟骨内骨化 を介した骨折治療促進作用を想起することができる。 すなわち、 該化合物は骨折 の修復促進剤としても有用となることが期待できる。
以下、 実施例により本発明を更に具体的に説明する。
(実施例）
合成例 1
化合物 A、 Cおよび Dは、 以下の方法により合成した。
化合物 A
特開平 7— 4 8 3 4 9号公報の 「実施例 1 7 4 ( 2 )」 に記載されている方法 により合成した。 該化合物のラセミ体は、 同公報の 「実施例 7 1」 に記載されて いる方法により合成した。
化合物 C
特開平 7— 48349号公報の 「実施例 1 80」 に記載されている方法により 合成した。
化合物 D
特開平 7— 48349号公報の 「実施例 1 00」 に記載されている方法により 合成した。
合成例 2
化合物 B、 E、 Fおよび Gは、 以下の方法により合成した。
化合物 B
( 3 R) - 1 - (2 , 2—ジェトキシェチル） 一 3 _ (4—ェチルフヱニル） ァ ミノカルボ二ルメチルー 3— (N， 一 （4一メチルフエニル） ウレイ ド） インド リン一 2—オン
(+ ) — 1— (2， 2—ジエトキシェチル） 一 3—ヒドロキシカルボニルメチル — 3— （N， 一 （4—メチルフエニル） ゥレイ ド） インドリン一 2—オン （特開 平 7— 48349号公報の 「実施例 1 74 ( 1 )」 に記載された化合物、 1 8 2 mg) をジクロルメタン （ 1 0mL) に溶かし、 1一ェチル _ 3— (3—ジメチ ルァミノプロピル） —カルポジイミ ド塩酸塩 （ 9 6 mg：)、 及びパラェチルァニ リン （ 6 1 mg) を加えた。得られた混合物を 1 5〜30°Cで 1 5時間撹拌した。 得られた反応混合物を 1 N—希塩酸と飽和重曹水で順次洗浄し、 無水硫酸ナト リウム上で乾燥 （ 1 5〜30°C) した後、 減圧下で溶媒を除去し、 濃縮した。 残 留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン/酢酸ェチル = 3/1 ) で精製し、 1 45mgの標題化合物を白色粉末として得た （収率 65%)。
NMR (CD C 13ヽ 2 7 OMH z)
δ 8. 48 (b r s , 1 H), 7. 37〜6. 82 (m, 1 4 H), 4.
7 7 (t , J = 5. 0 H z , 1 H), 3. 94 (dd, J = 5. 8 , 1 3. 7 H z, 1 H)， 3. 80〜3. 42 (m, 5 H)， 3. 00 (d， J = 14. 7 H z , 1 H), 2. 6 6 (d， J= 1 4. 7 H z , 1 H), 2. 53 (q, J = l . 6 H z , 2 H)， 2. 1 7 (s , 3 H), 1. 20〜 1. 05 (m, 9 H).
アルデヒド中間体
( 3 R) - 1 - (ホルミルメチル） 一 3— （（4一メチルフエニル） ァミノカル ボニルメチル） 一 3— (N， 一 （4—メチルフエニル） ゥレイ ド） インドリン一 2一オン
(+ ) - 1 - ( 2， 2—ジエトキシェチル） 一 3— ((4—メチルフヱニル） ァ ミノカルボニルメチル） 一 3— (N， - (4一メチルフエニル） ゥレイ ド） イン ドリン— 2—オン （特開平 7— 48349号公報の 「実施例 1 74 (2)」 に記 載された化合物、 6 1 Omg) のァセトン （3 OmL) 溶液に、 水 （ 1 OmL) と濃塩酸 （3mL) を加え、 混合物を 2時間加熱還流した。 反応液を放冷した後 減圧下で溶媒を除去し濃縮した。 残留物にジクロロメタンを加え、 食塩水で 2回 洗浄した。 有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥 （ 1 5〜30°C) 後、 減圧下 濃縮し、 52 9 mgの標題化合物を粗生成物として得た。
NMR ( CD C 13 27 OMH z )
δ 9. 7 1 (s， 1 H), 7. 75 (s , 1 H), 7. 40 (s， 1 H)， 7. 3 8〜 6. 90 (m, 1 1 H), 6. 65 (d， J = 7. 9H z , 1 H), 4. 7 6 (d， J = 1 8. 7 H z , 1 H)， 4. 40 (d， J = 1 8. 7H z, 1 H), 2. 9 8 (d, J = 14. 5 H z, 1 H), 2. 55 ( d , J= 14. 5 H z), 2. 30 (s， 3 H), 2. 23 (s， 3 H).
化合物 E
( 3 R) - 1 - (2 , 2—ジイソプロポキシェチル） 一 3— （（4—メチルフエ ニル） ァミノカルボニルメチル） 一 3— (N， ― (4—メチルフエニル） ゥレイ ド） イン ドリン一 2—オン
上記で得たアルデヒド中間体 （60mg) をイソプロパノール （ 1 0mL) に 溶解し、 パラ トルエンスルホン酸 （ 1 0mg) を加え、 混合物を 4時間加熱還流 した。 反応液を放冷した後減圧下で溶媒を除去し濃縮した。 残留物をジクロロメ タンで希釈し、 飽和重曹水で洗浄した。 有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥 ( 1 5〜30°C) した後、 減圧下濃縮した。 残留物をシリカゲルカラムクロマト グラフィー （へキサン/酢酸ェチル = 1/1 ) で精製して 46 mgの標題化合物 を得た （収率 62%)o
NMR ( CD C 13ヽ 27 OMH z )
δ 8. 37 (s , 1 H), 7. 3 9〜6. 90 (m， 1 3 H), 6. 79 (s， 1 H), 4. 84 (dd， J = 4. 9 , 4. 7 H z , 1 H), 3. 94〜 3. 7 3 (m, 4H)， 3. 00 (d, J = 1 4. 9 H z , 1 H)， 2. 58 (d， J = 1 4. 9 H z， 1 H)， 2. 2 9 ( s , 3 H), 2. 2 2 (s， 3 H), 1. 1 8 (d, J = 6. 3 Hz , 6 H), 1. 1 1〜 1. 04 (m， 6 H).
化合物 F
( 3 R) - 1 - (2 , 2—ビス （2—フルォロエトキシ） ェチル） 一 3— ((4 —メチルフエニル） ァミノカルボニルメチル） 一 3— （N， - (4—メチルフエ ニル） ゥレイ ド） インドリン一 2—オン
上記したアルデヒド中間体 （5 Omg) を 2—フルォロエタノール （ 1 mL) に溶解し、 カンファースルホン酸 （ 5mg) を加え、 混合物を 5時間加熱還流し た。 反応液を放冷後、 トルエンを加えて過剰の 2—フルォロエタノールを共沸除 去しながら減圧下濃縮した。 残留物をジクロロメタンで希釈し、 飽和重曹水で洗 浄した。 有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥 （ 1 5〜30°C) 後、 減圧下濃 縮した。 残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン/酢酸ェチル = 2/ 1 ) で精製して 2 5 mgの標題化合物を得た （収率 4 1 %)。
NMR ( CD C 13、 2 70MH z )
δ 7. 79 (s， 1 H), 7. 32〜6. 93 (m, 1 3 H), 6. 7 6
(s , 1 H)， 5. 0 1〜4. 96 (m, 1 H), 4. 62〜4. 53 (m, 2 H)， 4. 45〜 4. 35 (m， 2 H), 4. 1 1 (dd， J = 6. 6, 14. 3 H z , 1 H), 4. 00〜3. 72 (m， 5H)， 2. 88 (d， J = 14. 5Hz, 1 H), 2. 49 (d, J= 14. 5 H z , 1 H)， 2. 30 (s， 3 H), 2. 2 3 (s , 3 H).
化合物 G
( 3 R) - 1 - (2 , 2—ビス （2—クロ口エトキシ） ェチル） 一 3— ((4— メチルフエニル） ァミノカルボニルメチル） 一3— (N， ― (4一メチルフエ二 ル） ウレイ ド） インドリン一 2—オン
上記アルデヒド中間体 （ 5 Omg) を 2—クロ口エタノール （ lmL) に溶解 し、 カンファースルホン酸 （5mg) を加え、 混合物を 90°Cで 5時間攪拌した。 反応液を放冷後、 トルエンを加えて過剰の 2—クロ口エタノールを共沸除去しな がら減圧下濃縮した。残留物をジクロロメ夕ンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。 有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥 （ 15〜30°C) 後、 減圧下濃縮した。 残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一 （へキサン/酢酸ェチル = 2/ 1) で精製して 15 mgの標題化合物を得た （収率 23%)。
NMR ( CD C 13ヽ 27 OMH z )
δ 7. 88 (s, 1 Η), 7. 32〜6. 93 (m, 13 H), 6. 79 (s， 1 H)， 4. 96〜4. 9 1 (m， 1 H), 3. 97〜3. 46 (m， 10 H), 2. 98 (d, J = 14. 5Hz， 1 H), 2. 49 (d, J= 14. 5 H z, 1 H)， 2. 30 (s, 3 H), 2. 23 (s， 3 H).
合成例 3
化合物 H、 化合物 Iのラセミ体および化合物 Iの光学活性体は、 以下の方法に より合成した。
化合物 H
( 3 R) — 1— (2 , 2—ジエトキシェチル） 一3— （4ーヒ ドロキシメチルフ ェニル ]_ァミノカルボ二ルメチルー 3— (Ν' - (4—メチルフエニル)—ゥレイ ド） インドリン一 2—オン
(+ ) - 1 - (2 , 2—ジエトキシェチル） 一 3—ヒドロキシカルボニルメチル — 3— （N， - (4—メチルフエニル） ゥレイ ド） インドリン _ 2—オン （特開 平 7— 48349号公報の 「実施例 1 74 ( 1 )」 に記載された化合物、 300 mg)をァセトニトリル（ 1 OmL)に溶かし p—アミノベンジルアルコール（ 1 O Om ：)、 1一ェチル一 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル） 一カルボジイ ミ ド塩酸塩 （ 1 5 1 mg) を順次加え混合物を 1 5〜30°Cで 18時間攪拌した。 反応液に水を加え酢酸ェチルで抽出し有機層を無水硫酸ナトリゥム上で乾燥し、 溶媒を留去した。 得られた反応混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、 標 題化合物を 324m g得た （収率 88%)。
'H-NMR (CD C l 200MHz)
δ 8. 83 (s， 1 H), 7. 40〜6. 84 (m, 14 H) ,4. 78 (t， J = 5. 6 H z , 1 H) ,4. 5 1 (s， 2 H) ,3. 99 (dd， J = 5. 9 H z , 14. 2 H z , 1 H) ,3. 83〜3. 45 (m， 5H) ，2. 90 (d, J= 1 5. 2 H z, 1 H) ,2. 67 (b r o ad s, 1 H) ,2. 60 (d, J= 15. 2 H z , 1 H) ，1. 15 ( t , J = 6. 9Hz, 3 H) , 1. 1 0 ( t , J = 6. 9Hz, 3 H).
I R (KB r、 c m1)
3330，2980, 1 708，167 1, 16 1 0，1533, 1478，146 4, 14 1 2, 1 375, 13 10,1 248, 1 209,1 1 25, 1059,8 18,7 5 1,475.
MS (E I、 70 e V)
m/e = 560 (M+), 5 14, 486 , 453.
ゥレア中間体
3— （N， 一 （ 4—t一プチルジメチルシリルォキシメチルフエニル） ウレイ ド） — 1 - ( 2， 2—ジエトキシェチル） ィンドリン一 2—オン 1 5〜30°Cにてトリホスゲン （ 6 8 1 mg) のジクロロメ夕ン溶液に p -ァ ミノベンジル -t-ブチルジメチルシリルエーテル （ 1. 6 3 g) のジクロロメ夕 ン溶液をゆつく り滴下し、 続いてトリエチルアミン （ 1. 9 2 mL) のジクロ口 メ夕ン溶液を加え 1時間攪拌しィソシアナ一ト体のジクロロメ夕ン溶液を調製し た。
1— (2， 2—ジエトキシェチル） 一 3— (ヒ ドロキシィ ミノ） インドリン一 2—オン （特開平 7— 48349号公報の実施例 2 8の中間体として記載された 化合物、 2. 0 14 g) をメタノールに溶解し 1 0%Pd炭素を加え水素雰囲気 下 1 5〜30°Cにて 4時間攪拌した。 反応混合物をろ過し P d炭素を除去したの ちろ液を濃縮した。 残渣をジクロロメタンに溶かしあらかじめ調製しておいたィ ソシアナート体のジクロロメタン溶液に氷冷下加えた。 同温度で 1時間攪拌のの ち反応液に水を加えジクロロメ夕ンで抽出し、 有機層を無水硫酸水素ナトリウム 上で乾燥後溶媒を留去した。 反応混合物を力ラムクロマトグラフィ一で精製し標 題化合物を 2. 454 g得た （収率 68%)。
— NMR (CD C 13、 20 OMH z)
δ 7. 58 (b r o ad s , l H) ，7. 44〜6. 95 (m， 9 H) ,
6. 03 (b r o ad d， J = 5. 7 H z , 1 H) ，5. 2 1 (d， J二 6.
6 H z , 1 H) ,4. 70 (t , J = 5. 1 H z , 1 H) ，4. 63 (s , 2 H) ,
3. 9 6 (d d， J = 5. l H z， 1 3. 7 H z , 1 H) ,3. 83〜 3. 4 2 (m， 5 H) , 1. 1 5 (t , J = 6. 9 H z , 6 H) ,0. 94 (s， 9 H) ,0.
09 ( s， 6 H).
アミ ド中間体
3— （N， 一 （ 4一 tーブチルジメチルシリルォキシメチルフエニル） ウレイ ド） — 1— (2 , 2—ジエトキシェチル）一3— ((4—メチルフエニル） アミノカ ルボニルメチル） インドリン一 2—オン
3— (N， 一 （4—tーブチルジメチルシリルォキシメチルフエニル） ゥレイ ド） 一 1一 ( 2 , 2—ジェトキシェチル） インドリン一 2—オン （ l g) をジメ チルホルムアミ ド （ 1 5 m'L) に溶解し 1 5〜3 0°Cにて力リゥム一 tーブトキ シド （ 2 3 7mg) を加え混合物を 1分間攪拌ののち N—パラトリル— 2—ブロ モアセトアミ ド （4 6 0mg) を加えた。 1 5分間攪拌ののち水を加え酢酸ェチ ルで抽出し,有機層を無水硫酸水素ナトリウム上で乾燥し溶媒を留去した。 この 反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し標題化合物を 9 3 9 mg得た （収率 7 3 % )o
— NMR (CD C 13、 2 0 0MH z)
δ 8. 5 2 ( s , 1 Η) ,7. 4 0〜6. 9 2 (m， 1 4 Η) ,4. 7 8 (t , J = 5. 7 Η ζ , 1 Η) ,4. 6 0 ( s , 2 Η) ,4. 0 2 (d d, J = 5.
7 Η ζ、 1 4. 9 Η ζ， 1 Η) ,3. 8 7〜3. 4 6 (m, 5 Η) ,3. 0 0 (d , J = 1 4. 9 Η ζ , 1 Η) ,2. 6 7 ( d , J = 1 4. 9 Η ζ , 1 Η) ,2. 3 0 ( s , 3 Η) , 1. 1 7 ( t , J = 7. 4 Η ζ , 3 Η) , 1. 1 3 ( t , J = 7. 4 Η ζ , 3 Η) ,0. 9 2 ( s , 9 Η) ，0. 0 6 ( s , 6 Η).
ィ匕合物 Ι (ラセミ体)
1— ( 2 , 2—ジェトキシェチル） 一 3— （Ν， 一 （4—ヒドロキシメチルフエ ニル） ゥレイ ド） 一 3— (( 4—メチルフエニル） ァミノカルボニルメチル） ィ ン ドリンー 2—オン
3— （Ν， 一 （4一 tーブチルジメチルシリルォキシメチルフエニル） ゥレイ ド） 一 1一 （2 , 2—ジエトキシェチル） 一 3— (( 4—メチルフエニル） アミ ノカルボニルメチル） インドリン一 2—オン （3 0 8mg) をエタノール （ 1 5 mL) に溶かし濃硫酸 （ 1 Omg) を加え 1 5〜3 0 °Cにて 1時間攪拌した。 反 応液に水を加え酢酸ェチルで抽出し、 有機層を無水硫酸水素ナトリゥム上で乾燥 し溶媒を留去した。 この反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一で精 製し標題化合物 2 2 5 mgを得た （収率 8 8%)。
Figure imgf000042_0001
δ 8. 1 3 (s， 1 H) ,7. 37〜6. 9 0 (m， 1 4 H) ,4. 7 9 (b r o ad s , 1 H) ,4. 50 (s , 2 H) ,4. 0 1 (d d， J = 5. 9 H z , 1 4. 5 Hz , 1 H) ,3. 8 6〜3. 46 (m， 6 H) ,2. 9 6 (d， J = 1 . 8 H z, 1 H) ,2. 53 (d, J = 1 4. 8 H z , 1 H) ,2. 2 9 (s , 3 H) ， 1. 1 6 (t， J = 7. 3 H z， 3 H) , 1. 1 1 (t , J = 6.
9 H z , 3 H).
I R (KB r、 cm1)
3365, 3000，1 7 1 7, 1 702, 1 62 1, 1 545，1 52 1, 1 49 8，1 480, 1 42 0, 1 388, 1 3 2 1, 1 2 63, 1 1 3 7，1 0 69, 83 1, 7 63,5 1 5,484.
MS (E I、 7 0 θ V)
m/e = 560 (M+) ,5 1 5,392,365,306,2 9 2.
エステル中間体
1ー （2 , 2—ジエトキシェチル） 一 3— (N， - (4—t一ブチソレジメチルシ リルォキシメチルフエニル） ウレイ ド） 一 3— （（L—メントキシ） カルボニル メチル） インドリン一 2—オン
窒素気流、 及び氷冷下、 3— (N， 一 （4— t一プチルジメチルシリルォキシ メチルフエニル） ウレイ ド） 一 1— ( 2 , 2—ジェトキシェチル） インドリン一 2—オン （93 6mg)の乾燥テトラヒドロフラン（20mL)溶液に 1当量（ 1. 68M、 1. OmL) の n—ブチルリチウムのへキサン溶液をゆっく り加え、 こ の混合物を同温度で 1 0分間撹拌後、 ブロモ酢酸 （L—メンチル） （ 542 mg) の乾燥テトラヒドロフラン溶液 （ 1 0 m L ) 溶液を滴下した。 この混合物を 0 °C で 8時間撹拌したのち、 食塩水中に注ぎ酢酸ェチルで抽出した。 有機層を無水硫 酸ナトリゥム上で乾燥後濃縮し、 残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (へキサン/酢酸ェチル = 3/1で溶離） で精製し、 さらにメタノール水から再 結晶して 357 mgの標題化合物を得た （収率 28%)。 — NMR (CD C 13、 2 70MH z)
δ 7. 30〜6. 9 7 (m, 8H) ,6. 8 1 (b r s , 1 H) ,6. 7 6 (b r s , 1 H) ,4. 74 (d d, J = 5. 7 H z , 4. 9 Hz , 1 H) ,4. 69〜 4. 6 1 (m， 3 H) ,3. 94 (d d, J = 6. 9 H z , 14. 2 H z , 1 H) ，3. 8 6〜3. 49 (m, 5 H) ,2. 9 9 ( d , J = 1 5. 2 H z , 1 H) ,2. 59 (d, J = 1 5. 2 H z , 1 H) ， 1. 9 2〜1. 90 (b r s , 1 H) , 1. 2 1〜； L . 1 0 (m， 6H) ，0. 9 2 (s , 9 H) , 1. 3 6〜0.
65 (m, 1 8H) ，0. 0 6 5 (s， 6 H).
化合物 I (光学活性体)
1 - ( 2 , 2—ジエトキシェチル） 一 3— （Ν， 一 (4—ヒドロキシメチルフエ ニル） ゥレイ ド） 一 3— （（4—メチルフエニル） ァミノカルボニルメチル） ィ ンドリン一 2—オン
1— (2， 2—ジエトキシェチル） 一 3— （Ν， 一 （4— tーブチルジメチル シリルォキシメチルフエニル） ウレイ ド） 一 3— （（L—メントキシ） カルボ二 ルメチル） インドリン一 2—オン （2 93mg) のエタノール （8mL) 溶液に
1 5〜 30°Cで水酸化カリウム水溶液 （ 1 N、 1.3 6 mL) を加え、 混合物を
70°Cで 4時間攪拌後、濃縮した。残留物に水を加えクロ口ホルムで洗浄した後、 これに 2 N塩酸を加えることにより酸性にした。 生成した不溶物を酢酸ェチルで 抽出し、 有機層を食塩水で洗浄後、 無水硫酸ナトリウム上で乾燥、 濃縮して 2 3 4mgの 1— (2， 2—ジエトキシェチル） 一 3—ヒドロキシカルボニルメチル 一 3— （N， 一 （4ーヒドロキシメチルフエニル） ゥレイ ド） インドリン一 2— オン （カルボン酸中間体） を粗生成物として得た。
このカルボン酸中間体 （234mg) をジクロルメタン （ 1 0mL) に溶かし、
1一ェチル— 3— （3—ジメチルァミノプロピル） —カルポジイミ ド塩酸塩 （ 1 3 1 mg)、 パラトルイジン （ 73mg) を順次加えた。 混合物を 1 5〜 30 °C で 1 8時間撹拌し、 濃縮した。 残留物を酢酸ェチルで希釈し、 希塩酸と飽和重曹 水で洗浄後、 無水硫酸ナトリゥム上で乾燥し濃縮した。 粗生成物をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー （へキサン/酢酸ェチル = 2/1で溶離） で精製し 2 0 4mgの白色粉末を得た （90%e e、 エステル中間体からの収率 80 %)。 この粉末のうち 14 Omgを光学活性カラムを用い分取用高速液体クロマトグラ フィ一で精製し、 R体 （ 1 1 7m ：、 [ひ] D 26= 94。 C = 1. 0 1 4/Me OH) と S体 （7mg) を得た。
ぐ分取条件 >
カラム ： SUMI CH I RAL OA— 4800
直径 20 mmx長さ 25 c m
検出： U V 2 54 nm
流速： 2 OmL/分
溶媒：へキサン /1， 2—ジクロ口ェ夕ン /メタノール二 75/22/3
保持時間： S体 24分， 1^体 40分
実施例 1 (正常ラッ卜に対する経口投与時の軟骨形成促進作用）
6週令の雄性 SD系ラット （日本エスエルシ一社製—日本チヤ一ルス . リバ一 社製） に、 上記合成例 1で得た 「化合物 A」 を 3%アラビアゴム溶液に懸濁して、 2 gノ kg/日の用量で 4週間経口投与した。
その後該ラットを剖検し、 耳介、 気管、 胸骨、 大腿骨 ·下腿骨の膝関節部、 腰椎 (椎間板） を 2 0%中性緩衝ホルマリン （和光純薬社製） に 1週間浸潰して固定 し、 胸骨、 大腿骨 ·下腿骨の膝関節部、 腰椎 （椎間板） は 20%EDTA4ナト リウム溶液 （pH 7. 4、 和光純薬社製） で 2週間脱灰し、 観察部位を剃刀 （フ ェザ一社製） で切り出した。 耳介、 気管は脱灰せずに剃刀で観察部位を切り出し た。
これらの切り出した部位を、 自動包埋装置（サクラ社製）およびパラフィン（国 産化学社製とフィッシャ一サイェンティフィック社製品の等量混合物）を用いて、 パラフィン包埋ブロヅクとした。 この際には、 パラフィン自動分注器包埋セン夕 — (Mi l e s S c i e nt i f i c社製） を用いて、 組織標本用カセッ ト （T I S SUE— TEK社製） に、 パラフィンブロックを固定した。
このパラフィンブロックをミクロトーム （大和光機社製） およびミクロト一ム 用ナイフ （フェザー社製） を用いて厚さ 2〃mの切片を作成し、 スライ ドガラス (松浪硝子社製） に貼り付け、 乾燥した。 乾燥後、 切片をキシレンに漬けてパラ フィンを除去し、エタノールから水までの段階希釈系列に漬けて水中に保存した。 その切片を 0. 2%へマトキシリンおよび 0. 1 %ェォジン （いずれもメルク社 製） で染色し、 封入剤 （武藤化学社製） およびカバーガラス （松浪硝子社製） で 封入し、 顕微鏡 （日本光学社製、 倍率：対物レンズ 10倍) で観察した。 大腿骨 の切片は、 硝子軟骨の形成促進を組織化学的に解析するため 0. 3%サフラニン 0 (メルク社製） 染色を施し、 同様に顕微鏡 （倍率：対物レンズ 1 0倍） で観察 した。 結果を図 1 A〜 5 Aおよび図 1 B〜5 Bの写真に示した。
染色後の顕微鏡写真から明らかに、 溶媒対照群 （3%アラビアゴム溶液のみを ラッ トに経口投与） では軟骨形成促進が認められなかったのに対し （図 1 A、 2 A、 3A、 4八ぉょび5八）、 上記 「化合物 A」 を投与した群では、 いずれの臓 器でも硝子軟骨形成が促進されていた （図 1 B、 2 B, 3B、 4Bおよび 5 B)。 これらの実験事実により、 化合物 Aが in vivoにおいて軟骨形成促進作用を示 すことが確認された。
実施例 2 (ラッ卜に対する膝関節内投与時の軟骨形成促進作用）
10週令の雄性 SD系ラット （日本チヤ一ルス . リバ一社製） の右膝関節内に
1 mmo 1/Lの上記 「化合物 A」 （50%DMSO (ジメチルスルホキシド） 一生理食塩水溶液に溶解；該 DM S 0は純正化学社製、 生理食塩水は大塚製薬社 製） を 1日あたり 50〃L、 27G注射針および lmLシリンジ （いずれもテル モ社製） を用いて 3週間投与した。
溶媒対照として、 50%DMSO—生理食塩水溶液 （それぞれ純正化学社製、 大塚製薬社製） を同様に投与する実験群を設けた。 3週間の連日反復投与後ラッ トを剖検し、 大腿骨の左右の側副靱帯付着部間距離 をノギス （ミツトヨ社製） で測定し、 大腿骨膝関節の幅を測定した。 その後、 実 施例 1と同様の方法で組織標本を作製し、 0. 3%サフラニン 0水溶液 （メルク 社製） で染色して顕微鏡下 （日本光学社製；倍率：対物レンズ 10倍） で観察し た。 結果を図 6、 図 7 Aおよび 7 Bに示した。
図 6に示したように、 大腿骨膝関節の幅は、 化合物 Aを投与した群では溶媒対 照群に対して有意に大きくなつた。 また、 図 7 Aおよび 7Bに示したように、 組 織学的にサフラニン 0陽性の軟骨組織の形成促進が認められた。
これらの実験事実により、 化合物 Aが関節内などの局所投与によっても軟骨形 成促進作用を示すことが確認された。
実施例 3 (ラット初代培養関節軟骨細胞に対する化合物 Aの作用）
6週令の雄性 SD系ラッ ト （日本エスエルシ一社製） の大腿骨膝関節より関節 軟骨細胞をメスで切り出し、 0. 3 %コラゲナ一ゼ （WORTHINGTON社製） で消化して分離培養した （Calcif. Tissue Int.19 : 179〜 1 87, 1975 )。 分離した関節軟骨細胞を用いて、 軟骨基質なかでもグリコサミノグリカン合成 を測定するため、 35S標識硫酸 （アマシャム社製） のグリコサミノグリカンへの 取り込み量を測定した。 具体的には関節軟骨細胞を、 細胞培養用の 96穴プレー ト （FALCON社製） に、 一穴あたり 10000個の細胞密度で培養した。 培 地はゥシ胎児血清 （最終濃度 1 0%)、 1 0 OU/mLのペニシリン （明治製菓 社製）、 10 のス トレプトマイシン（萬有製薬社製）を含む Dulbecco の MEMと Ham F— 12の等量混合培地（いずれも GIBCO社製） を用いた。 軟骨細胞がコンフルェントに達した時点で血清濃度を 0. 3 %にした培地に交 換して一晩培養し、 化合物 Aを 10〃mo 1/L含有する同培地に交換し、 その 3時間後に 35 S標識硫酸 （アマシャム社製） を一穴あたり 0. 5〃C i添加し、 24時間培養した。 その後、 培地を 24穴プレートに回収して 4度で保存した。 細胞層は、 2mg/mLのァクチナ一ゼ E (科研製薬社製） を穴あたり 0. l m L添加して、 3 7°Cで一晩 （ 1 6時間） 消化した。 翌日消化した細胞層と、 保存 しておいた培地とを合一し、 0. 1 mg/mLコンドロイチン硫酸 C (S i gm a社製） 0. l mL， 2mmo l/L M g S 04 (和光純薬社製） 0. 5mL, 0. 2 mo 1/L T r i s/HC l (S i gma社製） 0. 5mL, 1 % セチルピリジニゥムクロライ ド（2 Ommo 1/L塩化ナトリゥム溶液に溶解、 和光純薬社製） 0. 5mLを添加し、 37度で 2時間静置した。 その後、 この試 料をガラス繊維濾紙 （東洋濾紙社製） で濾過し、 濾紙を 1 % セチルピリジニゥ ムクロライ ド （20mmo l/L) の 2 mLで 3回洗浄し、 液体シンチレ一ショ ンカウンター用バイアル （PACKARD社製） に 1枚ずつ入れ、 シンチレ一夕 (NacalaiTesque社製） を 1 OmL注ぎ、 液体シンチレ一シヨンカウン夕一 （P
ACKARD社製） で放射活性を測定した。
また、 細胞増殖の測定として 3H標識チミジン （アマシャム社製） の取り込み 量を測定した。 この測定のために、 分離した関節軟骨細胞を細胞培養用の 9 6穴 プレート （FALCON社製）に一穴あたり 1 0000個の細胞密度で培養した。 培地は、 ゥシ胎児血清 （最終濃度 1 0 %)、 1 00 U/mLのペニシリン （明治 製菓社製）、 1 0 0 g/mLのストレプトマイシン （萬有製薬社製） を含む Dulbecco の MEMと Ham F— 1 2の等量混合培地 （いずれも G I B CO社 製）を用いた。細胞が 60〜70%のコンフルェン卜に達した後、培地を 0, 3 % ゥシ胎児血清を含むものに交換し、 一晩培養した。 翌日、 同培地に最終濃度 0. 1， 1. 0， 1 0 Λίΐηο 1/Lの化合物 Aを含む 0. 3%ゥシ胎児血清を含む培 地に交換した。 その 24時間後に、 3H標識チミジン （アマシャム社製） を穴あ たり 1〃 C i添加し、 4時間培養した後に培地を捨て、細胞回収装置（SKATRON 社製） を用いて細胞層をシンチレ一シヨンカウン夕用のガラス繊維濾紙 （Wa l l a c社製） に回収した。 この濾紙にプラスチックシンチレ一夕 （Wa l l a c 社製） を染み込ませ、 シンチレーシヨンカウン夕 （Wa 1 1 a c社製） で放射活 性を測定した。 結果を図 8、 9のグラフに示した。 35S標識硫酸の取り込み量は、 10〃mo 1/Lの化合物 Aの添加により溶媒 対照である培地中最終濃度 1 %エタノールに対して有意な増加を示した。 3H標 識チミジンの取り込み量も、 10〃mo 1/Lの化合物 Aにより溶媒対照に対し て有意な増加を示した。
これらの結果により、 化合物 Aが軟骨基質合成および軟骨細胞増殖を増加させ る作用を有することが確認された。 また、 一般式 （I ) で表される軟骨形成促進 剤は自家軟骨細胞移植など軟骨細胞移植において、 移植前および移植後の軟骨細 胞の細胞外基質合成能または増殖能を促進させる薬剤として利用することができ る。
実施例 4 (マウス由来軟骨細胞および脂肪細胞の共通前駆細胞株 （C L— 1 ) の 軟骨細胞への分化に対する化合物 Aの作用 )
正常成熟マウスより樹立した軟骨細胞および脂肪細胞株 C L— 1 (国際公開 9 8/394 14) を 5000個/ cm2の細胞密度で 4穴のチヤンバースライ ド (Nunc社製） に培養した。 培地には 1 00U/mLのペニシリン （明治製菓 社製）、 1 ◦ 0 /g/mLのストレプトマイシン （萬有製薬社製） および 1 0% ゥシ胎児血清 （I NTERGEN社製） を含むひ— MEM (G I BCO社製） を 用いた。 CL一 1がコンフルェントに達した時、 化合物 Aを最終濃度 10〃mo 1/Lになるように添加し、 週 3回の培地交換時にも添加して 7日間培養した。 溶媒対照として培地中の最終濃度が 1 %になるようにエタノール （純正化学社 製） を添加したスライ ドも設けた。 コンフルェント後 7日後、 これらのプレート を回収して、 CL— 1細胞層をアルシアンブル一およびオイルレツド 0の 2重染 色し、 それそれ軟骨細胞または脂肪細胞への分化を観察した。 培養終了後、 細胞 層は 4%パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬社製）で室温で 1時間固定後、 0. 1 N塩酸で洗浄して 1 %アルシアンブルー （EM S c i e nc e社製） 水溶液 ( H 1. 0) で一晩染色した。 その後 0. 1 N—塩酸および蒸留水で洗浄し、
85%プロピレングリコール（ナカライテスク社製）水溶液で 1分間処理し、 ◦ . 5%オイルレッド 0 (メルク社製） プロピレングリコ一ル溶液に 30分間染色し た。 85%プロピレングリコール水溶液で洗浄後、 蒸留水で洗浄した。 その後 0. 3%ケルンェヒトロート （メルク社製） 水溶液で 5分間、 核を染色した。 結果を 図 1 OAおよび 10Bの写真に示した。 CL— 1の軟骨細胞および脂肪細胞への 分化は、 同細胞がコンフルェントに達した後に始まり、 通常の培養状況では、 お よそ 70%の細胞がオイルレツド 0陽性の脂肪細胞に、 およそ 30%の細胞がァ ルシアンブル一陽性の軟骨細胞に分化する。 図 10 Aおよび 10 Bにおいて、 黒 点はオイルレツド 0陽性の脂肪内脂肪滴を、 濃灰色の部分はアルシアンブルー陽 性の軟骨基質を表す。
図 10 Bの染色後の顕微鏡写真から明らかなように、 溶媒対照 （図 1 OA) に 比較して、 化合物 Aは CL一 1の軟骨細胞への分化を明らかに促進し、 脂肪細胞 への分化は明らかに抑制した。
実施例 5 (マウス由来軟骨細胞および脂肪細胞の共通前駆細胞株 （CL一 1 ) の 35S標識硫酸取り込みに対する化合物 A， B, C， D, E， F, Gの作用） 前述の細胞株 CL一 1を、 液体シンチレ一シヨンカウンター （Wa 11 a c社 製） 用の 96穴細胞培養用プレート （Wa 11 a c社製） に一穴あたり 1000 個の細胞密度で培養した。培地には 1 0 OU/mLのペニシリン（明治製菓社製)、 100〃g/mLのストレブトマイシン （萬有製薬社製） および 10% ゥシ胎 児血清 （ I NTERGEN社製） を含むひ一 MEM (G I B CO社製） を用いた。 C L- 1がコンフルェン卜に達した時点で 10 mo 1/Lの化合物 A， B, C, D, E， F, Gを含む培地に交換し、 24時間後に 35 S標識硫酸を穴あたり 0. 5〃 C i添加し、 継続して培養した。 化合物 A, Fについては、 1および 5〃m o 1ZLの濃度の培地も設定した。 その 24時間後に、 培地を捨て、 細胞層を 0. 4%セチルピリジニゥムクロライ ド （和光純薬社製） を含む 5%パラホルムアル デヒド 0. 2mL (0. 1 m o 1 / Lリン酸緩衝液 （ p H 7. 4)、 いずれも和 光純薬社製） で室温で 2時間固定した。 固定液を捨てた後、 同液で 1回洗浄し、 洗浄した液を捨てた。 細胞層にシンチレ一夕一 （Wa l l a c社製） を 0. lm L添力卩し、 攪拌の後シンチレーシヨンカウン夕一 （Wa l l a c社製） で放射活 性を測定した。 結果を図 1 1 , 12に示した。
この結果は、 化合物 A, B, C, D, E, F, Gが CL— 1に対して軟骨細胞 への分化を明らかに促進し、 脂肪細胞への分化は明らかに抑制したことを示した ものである。 同時にこの結果は、 一般式 （I) で表される軟骨形成促進剤を、 多 分化能を有する未分化間葉系細胞 （例えば CL一 1に類似の分化状態を有する細 胞） を軟骨細胞に分化させる薬剤として、 軟骨細胞移植などの軟骨疾患の治療に おいて利用できることを示すものである。
実施例 6 (ラット関節全層欠損モデルに対する化合物 Aの軟骨修復効果）
1 0週齢の雄性 CD系ラット （日本チャールズリバ一社製） の右側大腿骨膝外 面に直径 2. 4 mmのキルシュナー鋼線 （瑞穂医科機械社製） を用いて骨髄に達 する、 深さ 2. 5mmの欠損部を作製した。 術後 7日から、 溶媒である 50%ジ メチルスルホキシド （DM SO) 生理食塩水溶液 （DMSO ：純正化学社製、 生 理食塩水：大塚製薬社製）、 あるいは 1. Ommo 1/Lの化合物 A溶液の 50 を 1日 1回、 右側膝関節内に 3週間連日投与した。 化合物 Aの一日あたりの 投与量は、 8 1. 7〃 であった。
投与最終日の翌日、 右側大腿骨を採取し、 20%中性緩衝ホルマリン （和光純 薬社製） で 1週間浸漬して固定し、 20%EDTA4ナトリゥム溶液 （pH 7. 4、 和光純薬社製） で 2週間脱灰し、 欠損部を剃刀 （フェザー社製） で切り出し た。 切り出した部位を、 自動包埋装置 （サクラ社製） およびパラフィン （国産化 学社製とフィッシャーサイェンチフィック社製の等量混合物） を用いて、 パラフ インブロックとした。 この際には、 パラフィン自動分注器包埋セン夕一 （Mi l e s S c i e nt i f i c社製） を用いて、 組織標本用カセッ ト （T I S S U E— TEK社製） に、 パラフィンブロックを固定した。
このパラフィンブロヅクをミクロ 卜一ム （大和光機社製） およびミクロトーム 用ナイフ （フエザ一社製） を用いて厚さ 2〃mの切片を作製し、 スライ ドガラス (松浪硝子社製） に貼り付け、 乾燥した。 乾燥後、 切片をキシレンに漬けてパラ フィンを除去し、 エタノールから水までの段階希釈系列に漬けて水中に保存した 。 その切片を 0. 3%サフラニン 0 (メルク社製） 染色を施し、 顕微鏡 （倍率： 対物レンズ 1 0倍） で観察し、 Wak i t an iらの方法 （ J . Bone J o i nt Sur g. 76 -A, 579 - 592 ,. 1 994) を改変した方法で組 織学的スコアを採取した。
組織学的スコアは、 以下の表 10に示した基準に基づき、 溶媒対照群と化合物 A投与群を比較した。 化合物 Aのみを投与した群では、 溶媒のみを投与した群に 対して、 Ce l l mo r pho l o gy および Th i ckne s s o f c ar t i l age (図 13A；)、 また To t a l s c o r e (図 13 B) が有意 に低下した。 また、 図 14 Aおよび 14 Bに示したように、 欠損部はサフラニン 0陽性の軟骨様組織による修復が確認された。 これらの実験事実により、 化合物 Aが欠損などの関節軟骨の損傷に対して軟骨修復効果を示すことが確認された。
(表 1 0)
Cell morDholoav Score
Hvalinp cartilanp o
Mn^tlv hvalin partilfln^p w
Most nlv nnn-nartilaoe
on-ra rtilanp nnlv
Nnrmal ^ ΠΓΠΠΛ Γ Η with hns† aHi p nt r*?¾rtili¾n ^ノ π
Mild nn^itivp
Kl na cmti vc; n
/O―
<1/3 p
Total score
Sum of above scores 0-9 実施例 7 (ゥサギ変形性関節症モデルに対する化合物 Aの病態抑制効果）
12週齢の雄性 NZW系ゥサギ （北山ラベス社製） を用いて、 Co l omb o らの方法 （Ar t hr i t i s Rheum. 26 (7) : 875-886 , 1 9 83) に従い右側関節半月の部分切除、 外側側副靭帯および種子骨切除を行い、 ゥサギ変形性関節症モデルを作製した。 術後 7日から溶媒である 50%ジメチル スルホキシド （DM SO) 生理食塩水溶液 （DM SO ：純正化学社製、 生理食塩 水：大塚製薬社製）、 あるいは 3. Ommo 1/Lの化合物 A溶液の 5◦ 0〃L を 1日 1回、 右側膝関節内に 3週間連日投与した。 化合物 Aの一日あたりの投与 量は、 8 1 6. 8 JLL であった。
投与最終日の翌日、 右側大腿骨遠位部および下腿骨近位部を採取し、 大腿骨は 、 2 %パラホルムアルデヒド— 2. 5 %グルタールアルデヒド固定液 （いずれも 和光純薬社製） に一昼夜浸漬して固定し、 下腿骨は 20%中性緩衝ホルマリン （ 和光純薬社製） に 1週間浸潰して固定した。 大腿骨遠位部は 1 %オスミウム溶液 （和光純薬） で後固定したあと、 上昇エタ ノール系列に漬けて脱水した後、 酢酸ィソァミルで置換した後に臨界点乾燥装置 (日立社製） にて乾燥した。 乾燥した組織表面をイオンスパッ夕コーティング装 置 （E i ko社製） を用いて金によるコ一ティングを施し、 走査型電子顕微鏡 （ 日立製作所社製） を用いて大腿骨外顆軟骨表面を観察した （図 1 5 Aおよび 1 5 B)o この電子顕微鏡像について、 関節軟骨の損傷部の面積を以下の表 1 1に示 した基準に基づき、 画像解析ソフ ト I PAP (住化テクノサ一ビス社製） を用い て測定した。 図 16A、 16 Bおよび 1 6 Cに示したように、 化合物 Aのみを投 与した群では、 溶媒のみを投与した群に対し、 Me d i umな病変部面積および 病変部総面積に関して有意に関節軟骨損傷部面積が減少した。
(表 1 1 )
病変のグレード 関節軟骨表面の状態
Mild 軟骨表層が破壊され内部構造が露出しているが
コラーゲン線維の直径は 1 0 m以上
Medium 露出しているコラーゲン線維の直径が 1 0 m以下
Severe コラーゲン線維が失われ、 石灰化軟骨あるいは軟骨下骨が露出 下腿骨近位部はバンドソ一 （EXAKT社製） で切り出した後に 20%EDT A4ナトリウム溶液 （pH7. 4、 和光純薬社製） で 4週間脱灰した。 切り出し た部位を、 自動包埋装置 （サクラ社製） およびパラフィン （国産化学社製とフィ ッシヤーサイェンチフィック社製の等量混合物） を用いて、 パラフィンブロック とした。 この際には、 パラフィン自動分注器包埋センタ一 （Mi l e s S c i e n t i f i c社製） を用いて、 組織標本用カセット （T I S SUE— TEK社 製） に、 パラフィンブロックを固定した。
このパラフィンブロックをミクロ ト一ム （大和光機社製） およびミクロト一ム 用ナイフ （フェザー社製） を用いて厚さ 2〃mの切片を作製し、 スライ ドガラス (松浪硝子社製） に貼り付け、 乾燥した。 乾燥後、 切片をキシレンに漬けてパラ フィンを除去し、 エタノールから水までの段階希釈系列に漬けて水中に保存した 。 その切片を 0. 3%サフラニン 0 (メルク社製） 染色を施し、 顕微鏡 （倍率： 対物レンズ 10倍） で観察し、 K i ku c h iらの方法 （O s t e o ar t hr i t i s. Car t i l age 4 , 99 - 1 1 0, 1996 ) を改変した以下 の基準 （表 12) にもとづき組織学的スコアを採取した。
(表 12)
Score +1 +2 +3 . +4 し oss of Slight Moderate Focally severe Extensively superficial layer severe
Ulceration or Detectable Moderate Focally severe Extensively erosion severe
Fibrillation Noticeable Moderate Marked Extensive
Cluster 3-4 small 5-6 small, 7 or more small, 7 or more formation* or 1-2 3-4 medium, 5-6 medium, medium
medium or 1 -2 large or 3-4 large or 5-6 large
Global Sum of above scores
assessment
★Small = 2-4 cells； medium = 5-8 cells； large= 9 or more cells
化合物 Aのみを投与した群では、 溶媒のみを投与した群に対し、 Lo s s o f supe r f i c i a l 1 a y e rをのそく全ての組織学的スコアが有意に 低下した （図 1 7 Aおよび 17 B)。 これらの実験事実により、 化合物 Aが変形 性関節症などの軟骨変成疾患に対して抑制効果を示すことが確認された。 産業上の利用可能性
上述したように本発明によれば、 特定の構造を有するィンドリン一 2—オン誘 導体またはその塩を有効成分とする軟骨形成促進剤な t、し軟骨修復剤が提供され る。 該軟骨形成促進剤は、 ヒトを始めとする温血動物において軟骨形成を促進し て、 リウマチや変形性関節症、 または外傷による軟骨損傷などの軟骨疾患の優れ た治療薬となることが期待される。
更に、 本発明の軟骨形成促進作用を有するインドリン一 2—オン誘導体は、 軟 骨の生物学的、物理学的ならびに化学的な研究のための試薬としても有用である。

Claims

言青求の範囲 般
式
、
I 〇
Figure imgf000057_0001
{式中、 R 1はハロゲン原子、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 水酸基、 二 トロ基、 トリフルォロメチル基、 低級アルキルチオ基、 ァシル基、 カルボキシル 基、 メルカプト基、 または置換基を有していてもよいアミノ基を示し； R2は水 素原子、 置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよい 低級アルケニル基、 置換基を有していてもよい低級アルキニル基、 置換基を有し ていてもよい低級アルコキシ基、 置換基を有していてもよいァシル基、 置換基を 有していてもよいァリール基、 または置換基を有していてもよい複素環基を示 し； R3は置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよ ぃシクロアルキル基、 置換基を有していてもよいァリール基、 または置換基を有 していてもよい複素環基を示し ； R4は水素原子、 置換基を有していてもよい低 級アルキル基、 置換基を有していてもよいァリール基、 置換基を有していてもよ い複素環基、 一 O R 5、 — S R5、 または一 N R6R7 (式中、 R5, Rc, R7は同一 でも異なっていてもよく、 それそれ水素原子、 置換基を有していてもよい低級ァ ルキル基、 置換基を有していてもよいシクロアルキル基、 置換基を有していても よいァリール基、 置換基を有していてもよい複素環基、 低級アルコキシ基、 また は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、 Rfi， R7は一緒になつて— （C H 2) m—、 ― ( C H ) , N R8 ( C H 2) k— (式中 k， 1 , mはそれぞれ 1〜8の整 数を示し、 R 8は水素原子または低級アルキル基を示す） で表される基を構成し てもよい） で表される基を示し； X， Yは同一でも異なっていてもよく、 一 C H 2—、 — N H—または— 0—を示し、 nは 0〜4の整数を示す } で表される化合 物またはその塩を有効成分とすることを特徴とする軟骨形成促進剤。
2 . 前記 R 1がハロゲン原子、 低級アルキル基、 低級アルコキシ基、 または ニトロ基であり ；前記 R2が水素原子、 置換基を有していてもよい低級アルキル 基、 置換基を有していてもよい低級アルケニル基、 または置換基を有していても よいァリール基であり ；前言己 R3が置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換基を有していてもよいシクロアルキル基、 または置換基を有していてもよい ァリール基であり ；前記 R4が置換基を有していてもよい低級アルキル基、 置換 基を有していてもよいァリール基、 置換基を有していてもよい複素環基、 —〇R 5または一 N R6R7を示す （式中、 R5, R6, R7は前記と同義） で表される基で あり ；前記 Xは、 一 C H2—、 一 N H—または一 0—を示し、 前記 Yは、 一 C H2 —または— N H—を示し、 前記 nは 0または 1である請求の範囲第 1項記載の軟 骨形成促進剤。
3 . 前記 R2が置換基 （この置換基は、 ハロゲン原子で置換されていてもよ い） を有していてもよい低級アルキル基、 前記 R3が置換基を有していてもよい ァリール基、 前記 R4が— N R6R7 (式中、 R6， R7は同一でも異なっていてもよ く、 それぞれ水素原子または置換基を有していてもよいァリール基を示す） で表 される基であり、 前記 X , Yは同一でも異なっていてもよく、 — C H2—または 一 N H—を示し、 前記 nが 0である、 請求の範囲第 1項記載の軟骨形成促進剤。
4 . 前記 R2が 2つの低級アルコキシ基 （この低級アルコキシ基は、 1〜5 個のハロゲン原子で置換されていてもよい） または—〇— Z— 0—基 （式中、 Z は 1〜 1 0個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン基を示す） が同一炭素上に置換されている低級アルキル基であり、前記 R3がァリール基（こ のァリール基は、 低級アルキル基またはアミノ基 （このアミノ基は、 さらに低級 アルキル基を有していてもよい） を有している）、 前記 R4が一 N R6R 7 (式中、 R6, R 7は同一でも異なっていてもよく、 それぞれ水素原子あるいはァリ一ル基 (このァリール基は、 低級アルキル基またはアミノ基 （このアミノ基は、 さらに 低級アルキル基を有していてもよい） を有している） で表される基である、 請求 の範囲第 3項記載の軟骨形成促進剤。
Figure imgf000059_0001
一 CH2CH ( H )
、〇R11
5 . 前記 R2が一般式 （Π)
(式中、 R 1Q, R 11は同一でも異なっていてもよく、 それそれ 1〜5個のハロゲ ン原子で置換されていてもよい低級アルキル基を示す）
または一般式 （III)
(式中、 Zは 1〜 1 0個のハロゲン原子で置換されていてもよい低級アルキレン 基を示す） で表される基である請求の範囲第 4項記載の軟骨形成促進剤。
6 . 前記 R 1G， R 11の少なくとも一方が 1〜 5個のハロゲン原子を有する低 級アルキル基である請求の荦囲第 5項記載の軟骨形成促進剤。
7 . 前記 R2が 2， 2—ジエトキシェチル基、 2， 2—ジメ トキシェチル基、
O
CH2CH (m)
〇
2 , 2—ジイソプロポキシェチル基、 2 , 2—ビス （ 2—フルォロエトキシ） ェ チル基、 または 2， 2—ビス （2—クロ口エトキシ） ェチル基であり、 前記 Xが — NH—であり、 前記 Yが— CH2—である請求の範囲第 5項記載の軟骨形成促 進剤。
8. 前記 R3が 4—メチルフエニル基、 前記 Xがー NH—であり、 前記 Yが 一 C H 2—である請求の範囲第 5項記載の軟骨形成促進剤。
9. 前記 R4が一 NHR7 (式中、 R7は 4—メチルフエニル基、 4—ェチル フエニル基、 または 4一 （N, N—ジメチルァミノ） フエニル基であり、 前記 X がー NH—であり、 前記 Yがー CH2—である請求の範囲第 5項記載の軟骨形成 促進剤。
10. 前記 R2、 R3、 R4の組み合わせが、
R2が 2， 2—ジエトキシェチル基、 R3が 4一メチルフエニル基、 R4がー N
HR7 (R7は 4一メチルフエニル基）；
R2が 2 , 2—ジエトキシェチル基、 R3が 4一メチルフエニル基、 R4がー N HR7 (R7は 4一ェチルフエニル基）；
R2が 2， 2—ジェトキシェチル基、 R3が 4—メチルフエニル基、 R4がー N HR7 (R7は 4一 （N, N—ジメチルァミノ） フエニル基）；
R2が 2， 2—ジメ トキシェチル基、 R3が 4—メチルフエニル基、 R4がー N HR7 (R7は 4—メチルフエニル基）；
R2が 2， 2—ジイソプロポキシェチル基、 R3が 4—メチルフエニル基、 R4 が一 NHR7 (R7は 4—メチルフエニル基）；
R2が 2， 2—ビス （ 2—フルォロエトキシ） ェチル基、 R3が 4—メチルフエ ニル基、 R4がー NHR7 (R7は 4—メチルフエニル基）； または
R2が 2 , 2—ビス （2—クロ口エトキシ） ェチル基、 R3が 4—メチルフエ二 ル基、 R4が一 NHR7 (R7は 4—メチルフエニル基）；
のいずれかである請求の範囲第 5項記載の軟骨形成促進剤。
1 1. 請求の範囲第 1項記載の化合物の光学活性体、 またはその塩を有効成 分とする軟骨形成促進剤。
1 2. 請求の範囲第 1項記載の軟骨形成促進剤を有効成分とする軟骨修復剤。
1 3. 請求の範囲第 1項記載の軟骨形成促進剤を有効成分とする骨折修復促 進剤。
14. 請求の範囲第 1項記載の軟骨形成促進剤を含有する、軟骨の生物学的、 物理学的、 または化学的研究用の試薬。
1 5. 下記一般式 （IV)
Figure imgf000061_0001
R12
(式中、 R12は低級アルコキシ基 （この低級アルコキシ基は、 1〜5個のハロゲ ン原子で置換されている） が 2つ同一炭素上に置換されている低級アルキル基を 示す） で表されるインドリンー 2—オン誘導体またはその塩。
1 6. 前記 R12が一般式 （V)
一 Ch CH
Figure imgf000061_0002
(式中 R13， R14は同一でも異なっていてもよく、 それぞれ 1〜5個のハロ 原子で置換されている低級アルキル基を示す） で表される基である請求の範囲第 1 5項記載のィンドリン一 2—オン誘導体またはその塩。
1 7. 前記 R13, R"が同一でも異なっていてもよく、 それぞれハロゲン原 子で置換されているェチル基である請求の範囲第 1 6項記載のィンドリン一 2— オン誘導体またはその塩。
1 8. 前記 R12が 2， 2—ビス （2—フルォロエトキシ） ェチル基または 2 , 2—ビス （2—クロ口エトキシ） ェチル基である請求の範囲第 1 6項記載のイン ドリンー 2—オン誘導体またはその塩。
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