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WO2000042179A2 - Komplexbildende proteine - Google Patents

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WO2000042179A2
WO2000042179A2 PCT/EP2000/000029 EP0000029W WO0042179A2 WO 2000042179 A2 WO2000042179 A2 WO 2000042179A2 EP 0000029 W EP0000029 W EP 0000029W WO 0042179 A2 WO0042179 A2 WO 0042179A2
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
component
jun
proteins
protein
receptor
Prior art date
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PCT/EP2000/000029
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English (en)
French (fr)
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WO2000042179A3 (de
Inventor
Valerie Jerome
Hans-Harald Sedlacek
Rolf Müller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
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Publication date
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Priority to EP00906186A priority patent/EP1144634A2/de
Priority to KR1020017008779A priority patent/KR20010089817A/ko
Priority to JP2000593736A priority patent/JP2002534121A/ja
Priority to HK02104074.9A priority patent/HK1042520A1/zh
Priority to AU27960/00A priority patent/AU2796000A/en
Priority to MXPA01006988A priority patent/MXPA01006988A/es
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    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
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    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding

Definitions

  • these proteins can be assigned to the following groups:
  • Antibodies which can bind specifically to the corresponding epitope of an antigen (which can also be another antibody) with their antigen binding site
  • the largely specific connections between at least two proteins specified by nature are used for the analysis or detection of proteins in the diagnosis of diseases (see EP 0 491 362 B1) and the binding partners of such proteins for prophylaxis or therapy of diseases. If a partner of the respective protein complexes is available, the amount of the second or further partner, be it complement or coagulation factors, antigens, receptors or signal proteins, can be determined with the help of this partner.
  • specific protein complexes are used to search for small-molecule activators or inhibitors. Purified antibodies or ligands for receptors, such as cytokines and peptide hormones, for the prophylaxis or therapy of diseases are also administered to patients or animals.
  • unspecific, ie undesired complex formation with foreign protein partners is known to be the main problem of analysis and diagnosis with antibodies.
  • Undesired complex formation with foreign protein partners can also cause in vivo, for example, side effects after injection of antibodies.
  • the specific exclusive binding between two proteins is an essential prerequisite for the production and specific functioning of complex transcription factors, in particular of artificial transcription factor complexes, as described in the patent application EP-A 0 805 209.
  • the invention relates to a complex of non-naturally occurring, specifically complex-forming proteins, characterized in that the following components are contained in the complex:
  • mutated dimerization domain having been derived by mutation from a naturally occurring dimerization domain, this mutated dimerization domain can interact specifically with component c) and component b) is covalently linked to component a),
  • components b) and c) are characterized in that amino acids are exchanged or inserted in naturally occurring peptides or proteins of the same or different types, so that the mutated peptides or proteins can practically only complex with one another. A complexation of mutated peptides or proteins with the corresponding non-mutated wild-type proteins or peptides does not occur. In this way, homodimers or heterodimers can be formed from mutated monomers (mutated peptides or proteins).
  • the mutations in the binding domains of the same or different proteins therefore have the purpose of preventing the ability to complex between an unmutated monomer and a mutant monomer of a pair of identical or different proteins or peptides that would complex in the unmutated state.
  • the mutations give such a pair of mutant proteins the ability to bind to one another with high specificity.
  • the mutations thus occur in pairs, one mutation being present in component b) and the other in component c) in such a way that a molecular interaction between the respective amino acids of such a pair is possible.
  • Amino acids according to the invention inserted into naturally occurring peptides or proteins can be, for example (the listing in pairs is intended to indicate the molecular interaction in the context of a dimeric protein complex):
  • Glutamic acid 3-24 hydrophobic amino acids such as 3-24 aromatic amino acids such as methionine, phenylalanine, isoleucine, tyrosine, leucine, tryptophan valine
  • the starting proteins for components b) and c) can be the same or different.
  • HSP70 HSF2 Heat shock factor 2 Those protein pairs which naturally have a helix-loop-helix / leucine-zipper binding sequence should be preferred.
  • the invention further relates to the most varied uses of these complex-forming proteins according to the invention, for example
  • Components a) and d) are selected depending on the selected type of use.
  • the invention particularly relates to new complex-forming proteins, characterized in that the amino acids listed have been inserted into proteins which naturally form homodimers or heterodimers, so that these mutated proteins (components b) and c)) only with themselves (homodimers) or form complexes with the corresponding mutated partner (heterodimers), but no longer with the naturally occurring, non-mutated starting proteins.
  • New complex-forming proteins with components a), b), c) and d) can be used in two embodiments, for example.
  • component b) is a homo- (or hetero) mu.timer [component b) 1-b) n] to which the respectively corresponding (or different) components c ) bind each as a monomer and in each case connected to component d).
  • both component b) and component c) are multimers, only one or a few components d) being bound to component c).
  • both component b) and component c) are multimers, only one or a few components d) being bound to component c).
  • only a few components d) (effectors) are bound to the target structure, but the binding between components c) and d) is extremely strong, which can increase the specificity of the binding of components c) and d) to the target structure .
  • the invention relates to new, complex-forming proteins consisting of components a), b), c) and d), as well as nucleic acid constructs which code for these complex-forming proteins.
  • the invention also relates to complexes consisting of components d), b), c) and d), d. H. component a) is replaced by d), and nucleic acid constructs coding therefor.
  • the invention furthermore relates to a complex consisting of components a), b), c) and a); d.
  • component d) is replaced by a), and nucleic acid constructs coding therefor.
  • the invention also relates to complex-forming proteins consisting of components a), b), c) and d) or variants thereof described above, which additionally contain a fusogenic peptide, a translocation peptide or between components c) and d) or a) and b) contain a cleavage sequence for a protease and nucleic acid constructs coding therefor.
  • nucleic acid constructs can be introduced into bacteria, yeasts or mammalian cells with the aid of viral or non-viral vectors known to the person skilled in the art.
  • Such cells can be used to produce the protein according to the invention or can be administered to an organism itself for the purpose of prophylaxis or therapy.
  • Such nucleic acid constructs, inserted into a vector can, however, also be administered directly to an organism for the purpose of prophylaxis or therapy.
  • Another object of the invention is the production of one of the above.
  • the production takes place without the expression of a second protein different from the first.
  • Component a) represents a ligand for a target structure.
  • This target structure can be present on a cell membrane, in the extracellular matrix or in a tissue or blood fluid.
  • component a) can represent
  • a ligand for a cellular receptor for example
  • Growth factors such as VEGF, PDGF, EGF, TGF ⁇ , TGFß, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, Neurotrophine, BMF, Bombesin, M-CSF, Thrombopoietin, Erythropoietin, SCF, SDGF, Oncostatin, PDEGF, Endothelin - 1
  • Cytokines such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 , IL-13, IL-14, IL-15
  • TNF ⁇ Tumor necrosis factors
  • -ß Tumor necrosis factors
  • Chemokines such as RANTES, MCAF, MIP-1 ⁇ or -ß, NAP, ß-thromboglobulin
  • Peptide hormones such as SRH, SIH or STH, MRH or MSH, PRH, PIH or prolactin, GnRH, LH-RH, FSH-RH, LH / ICSH or FSH, TRH or TSH, CRH or ACTH
  • Steroid hormones such as estrogens, progestogens, androgens, glucocorticoids, mineralocorticoids, homologues or analogues thereof
  • component a) can also be an adhesion molecule, part of the adhesion molecule or an analogue of an adhesion molecule which binds to a corresponding adhesion molecule on the cell membrane or to another specific binding structure for an adhesion molecule on the target cell.
  • Adhesion molecules such as component a) are, for example
  • ICAM-1 for LFA-1, MAC-1
  • component a) can also be a protein which binds to a partner protein and thereby participates in a biological reaction chain, for example a complement factor, a coagulation factor, a factor of the kinin system, the fibrinolysis system or a plasmatic or cellular enzyme inhibitor or a plasmatic or cellular enzyme.
  • a complement factor for example a complement factor, a coagulation factor, a factor of the kinin system, the fibrinolysis system or a plasmatic or cellular enzyme inhibitor or a plasmatic or cellular enzyme.
  • component a) can also represent a receptor for one of the aforementioned proteins.
  • component a) can also be the extracellular part of an Fc receptor (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)), to which an antibody is bound specifically for the target cell via its Fc part .
  • component a) can also be an antibody molecule or the epitope-binding part of an antibody molecule. Human antibodies are preferred.
  • the murine monoclonal antibodies can be used in humanized form. Humanization takes place in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) and Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)). Antibody fragments are produced in accordance with the prior art, for example in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)), Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379 (1991)) or Huston et al. (Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)).
  • Recombinant antibody fragments are produced directly from existing hybridomas or are isolated from libraries of murine or human antibody fragments using "phage display” technology. These antibody fragments are then used directly on the genetic level for further manipulations (e.g. fusion with other proteins).
  • the genetic information coding for the antigen-binding domains (VH, VL) of the antibodies is complementary to the 5 by isolating the mRNA, reverse transcribing the RNA into cDNA and then amplifying it using the polymerase chain reaction and oligonucleotides '- or 3' ends of the variable fragments obtained.
  • the VH and VL fragments are then converted into bacterial expression vectors e.g. cloned in the form of Fv fragments, single-chain Fv fragments (scFv) or as Fab fragments.
  • New antibody fragments can also be isolated directly from antibody libraries (immune libraries, naive libraries) of murine or human origin using the "phage display” technology.
  • the antigen-binding domains are cloned as fusion proteins with the coat protein g3P of filamentous bacteriophages either in the phage genome or in phagemid vectors in the form of scFv fragments or as Fab fragments.
  • Antigen-binding phages are selected on antigen-loaded plastic vessels ("panning"), on antigen-conjugated, paramagnetic beads ("beads”) or by binding to cell surfaces.
  • Immune libraries are prepared by PCR amplification of the variable antibody fragments from B lymphocytes of immunized animals or patients. Combinations of oligonucleotides that are specific for murine or human immunoglobulin genes or used for the human immunoglobulin gene families.
  • Naive libraries can be made using non-immunized donors as the source of the immunoglobulin genes.
  • immunoglobulin germline genes can be used for the production of semisynthetic antibody repertoire, the complementarity-determining region 3 of the variable fragments being supplemented by PCR using degenerate primers.
  • single pot libraries have the advantage over immune libraries that antibody fragments against a large number of antigens can be isolated from a single library.
  • the affinity of antibody fragments can be further increased by means of the "phage display” technology, new libraries of already existing antibody fragments by random, codon-based or targeted mutagenesis, by "chain shuffling" individual domains with fragments from native repertoires or with the aid of bacterial mutator strains are produced and antibody fragments with improved properties are isolated by reselection under stringent conditions.
  • murine antibody fragments can be humanized by gradually replacing one of the variable domains with a human repertoire and subsequent selection with the original antigen ("guided selection").
  • the humanization of murine antibodies takes place by targeted exchange of the hypervariable regions of human antibodies by the corresponding regions of the original murine antibody.
  • At least two identical or different ligands for the target structure can be contained in the ligand (component a) according to the invention.
  • component a A special form of bispecific or multispecific, recombinant antibodies are single-chain, double or multiple antigen-binding molecules. The preparation of these molecules was described in patent application DE 19816141.7 (not published). To this Patent application is expressly referred to, for example, the production of component a).
  • component a) can also be the coat protein or a part of the coat protein of viruses which specifically bind to selected cells via their coat protein.
  • component a) depends on the target structure to which the complex-forming protein according to the invention is to bind.
  • Examples include:
  • this includes antibodies or antibody fragments, directed against membrane structures of endothelial cells, as described, for example, by Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) and Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744 (1990)).
  • these include antibodies against the VEGF receptors.
  • the ligands also include all active substances which bind to membrane structures or membrane receptors on endothelial cells.
  • these include substances that contain mannose, IL-1 or growth factors or their fragments or partial sequences thereof that bind to receptors expressed by endothelial cells, such as PDGF, bFGF, VEGF, TGFß (Pusztain et al., J Pathol. 169, 191 (1993)).
  • Adhesion molecules that bind to activated and / or proliferating endothelial cells.
  • Adhesion molecules of this type such as, for example, Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4, vitronectin or RGD peptides have already been described (reviews by Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119: 483 (1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev. H, 353 (1992)).
  • the ligands for the purposes of this invention include in particular glycoproteins of the envelope of viruses which have a tropism for endothelial cells.
  • viruses include, for example:
  • the ligands also include substances which specifically bind to the surface of immune cells. These include antibodies or antibody fragments directed against membrane structures of immune cells, as described, for example, by Powelson et al. (Biotech. Adv. 1_1, 725 (1993)).
  • the ligands also include monoclonal or polyclonal antibodies or antibody fragments which, with their antigen-binding variable part, bind to Fc- ⁇ - or Fc- ⁇ - or Fc- ⁇ receptors of immune cells (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11, 1731 (1994)).
  • Fc fragment of human monoclonal or polyclonal immunoglobulin also includes the Fc fragment of human monoclonal or polyclonal immunoglobulin.
  • Fc fragments are, for example, genetically engineered using recombinant DNA or according to the methods of Haupt et al. (Klin. Wschr. 47, 270 (1969)), Kranz et al. (Dev. Biol. Standard 44, 19 (1979)), Fehr et al. (Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974)) or Menninger et al. (Immunochem. 13, 633 (1976)).
  • the ligands also include all substances that bind to membrane receptors on the surface of immune cells. These include cytokines such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNF ⁇ , GM-CSF, M-CSF, further growth factors such as EGF, TGF, FGF, IGF or PDGF or their fragments or partial sequences of them that bind to receptors expressed by immune cells.
  • cytokines such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNF ⁇ , GM-CSF, M-CSF, further growth factors such as EGF, TGF, FGF, IGF or PDGF or their fragments or partial sequences of them that bind to receptors expressed by immune cells.
  • adhesion molecules and other ligands that bind to cell membrane structures such as the mannose 6-phosphate receptor on macrophages in the spleen, liver, lungs and other tissues.
  • the ligands also include glycoproteins of the envelope of those viruses which have a tropism for lymphocytes and / or macrophages.
  • Viruses that infect macrophages include, for example: - HIV-1 particularly those strains with mutations in the V3 region of gp120 which lead to an increased binding to macrophages
  • Viruses that infect lymphocytes include, for example:
  • VZV varicella zoster virus
  • HHV-6 Herpes virus 6
  • HHV-6 particularly infects T cells
  • the Rabies virus coat protein binds particularly to TH2 cells
  • glycoprotein gp120 preferentially binds to the CD4 molecule of T cells
  • HTLV-II particularly infects B cells
  • HTLV-I particularly infects T cells
  • Influenza C viruses bind via the hemagglutinin esterase fusion (HEF) protein to N-acetyl-9-ß-acetylneuraminic acid (Neu 5.9 Ac), which preferentially on B lymphocytes, less or not on T- Lymphocyte occurs
  • Influenza C viruses with mutation in nucleotide position 872 (which encodes position 284 of the HEF of the amino acid sequence), for example an exchange of the threonine by isoleucine.
  • the surface protein HEF with this Mutation has a significantly stronger affinity for the N-acetyl-9-ß-acetylneuraminic acid receptor than the wild virus
  • binding structure for N-acetyl-9-ß-acetylneuraminic acid.
  • This binding structure is defined by the catalytic triad serine-71, histidine 368 or - 369 and arpartic acid 261
  • HSV-2 particularly infects T cells
  • antibodies or antibody fragments directed against membrane structures of muscle cells, in particular of smooth muscle cells.
  • Such antibodies are, for example, antibodies or antibody fragments, directed against membrane structures of muscle cells, in particular of smooth muscle cells.
  • Such antibodies are, for example, antibodies or antibody fragments, directed against membrane structures of muscle cells, in particular of smooth muscle cells.
  • Such antibodies are, for example, antibodies or antibody fragments, directed against membrane structures of muscle cells, in particular of smooth muscle cells.
  • Such antibodies are, for example, antibodies or antibody fragments, directed against membrane structures of muscle cells, in particular of smooth muscle cells.
  • the ligands also include all active substances which bind to membrane structures or membrane receptors on muscle cells (review by Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol. 2, 260 (1991)).
  • this includes growth factors or their fragments or partial sequences of them, which bind to receptors expressed by smooth muscle cells, for example
  • the ligands also include glycoproteins of the envelope of those viruses which have a tropism for muscle cells.
  • viruses include, for example, the cytomegalovirus.
  • the ligands include antibodies or antibody fragments directed against receptors expressed on poorly differentiated blood cells.
  • the ligands also include monocional or polyclonal antibodies or antibody fragments which bind with their constant domains to Fc- ⁇ receptors of immune cells.
  • the ligands also include all substances that bind to membrane structures or membrane receptors on the surface of poorly differentiated blood cells.
  • this includes growth factors, such as SCF, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF or their fragments or partial sequences thereof, which bind to receptors expressed by blood cells.
  • This also includes all active substances that bind to membrane structures or membrane receptors on synovial cells.
  • cytokines or growth factors or their fragments or partial sequences belong to them, which bind to receptors expressed by synovial cells, such as IL-1-RA, TNF ⁇ , IL-4, IL-6, IL-10, IGF, TGFß.
  • This also includes ligands, the essential component of which is terminal mannose, which binds to mannose-6-phosphate receptors on macrophages.
  • the ligands include antibodies or antibody fragments directed against the virus antigens expressed on the cell membrane of virus-infected cells.
  • the ligands include all substances that bind to membrane structures or membrane receptors on the surface of liver cells.
  • this includes growth factors, such as cytokines, EGF, TGF, FGF or PDGF, or their fragments or partial sequences thereof, which bind to receptors expressed by such cells.
  • ligands that bind to cell membrane structures that are selective for certain tissues. These include, for example: Membrane structure of ligand tissue cells
  • Transferrin receptor transferrin liver, other tissue cells
  • Insulin receptor insulin liver other tissue cells
  • Fc- ⁇ receptors immunoglobulin G reticuloendothelial system, other tissues
  • the ligands include, in particular, glycoproteins of the envelope of viruses which have a tropism for selected cells, for example for
  • liver cells bind the Marburg virus via the asialoglycoprotein receptor * Hepatitis B virus
  • Liver cells preferentially bind to the preS2 and preS1 domains of HBV via the asiaioglycoprotein receptor
  • HBV is bound via fibronectin.
  • These include antibodies or antibody fragments directed against membrane structures of glial cells, as described, for example, by Mirsky et al. (Cell and Tissue Res. 240, 723 (1985)), Coakham et al. (Prog. Exp. Tumor Res. 29, 57 (1985)) and McKeever et al. (Neurobiol. 6, 119 (1991)).
  • These membrane structures also include neural adhesion molecules such as N-CAM, in particular its polypeptide chain C.
  • This also includes all active substances that bind to membrane structures or membrane receptors on glial cells.
  • these include substances that carry mannose at the end and bind to the mannose 6 phosphate receptor, insulin and insulin-like growth factor, PDGF and those fragments of these growth factors that bind to the associated membrane receptors.
  • the ligands include, in particular, glycoproteins of the envelope of viruses which have a tropism for glial cells.
  • viruses include, for example:
  • Suitable ligands are, for example, monoclonal antibodies or their antigen-binding antibody fragments with specificity for the following antigens:
  • the ligands also include all active substances which bind to membrane structures or membrane receptors of leukemia cells. For example, growth factors or their fragments or Partial sequences of them that bind to receptors expressed by leukemia cells.
  • Retinoids e.g. "Retinoic acid” in acute promyelocytic leukemia.
  • component d) may either be absent or, depending on the type of disease which is to be prevented or treated, may be selected together with component a) as follows, for example:
  • Target cells a) Therapy of tumors a.1) Target cells:
  • Effectors inhibitors of cell proliferation, for example
  • the retinoblastoma protein (pRb / p110) and the related p107 and p130 proteins are inactivated by phosphorylation. Those genes of these cell cycle inhibitors which have mutations for the inactivation sites of the expressed proteins are preferably to be used without their function being impaired thereby. Examples of these mutations have been described for p110.
  • the DNA sequence for the p107 protein or the p130 protein is mutated in an analogous manner.
  • the protein p53 is inactivated in the cell either by binding to special proteins, such as MDM2, or by oligomerizing the p53 via the dephosphorylated C-terminal serine.
  • a DNA sequence is therefore preferably used for a p53 protein which is shortened at the C-terminal by the serine 392.
  • effectors coagulation-inducing factors and angiogenesis inhibitors, for example:
  • PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1
  • LIF Leukemia inhibitory factor
  • Interferons such as IFN- ⁇ , IFNß or IFN ⁇
  • TNF such as TNF ⁇ or TNFß
  • cytostatic or cytotoxic antibodies include those directed against membrane structures of endothelial cells, as described, for example, by Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) and Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)). In particular, these include antibodies against the VEGF receptors.
  • This also includes cytostatic or cytotoxic antibodies directed against membrane structures on tumor cells.
  • Such antibodies have been described, for example, by Sedlacek et al. (Contrib. To Oncol. 32, Karger Verlag, Kunststoff (1988) and Contrib. To Oncol. 43, Karger Verlag, Kunststoff (1992)).
  • Further examples are antibodies against Sialyl Lewis; against peptides on tumors that are recognized by T cells; against proteins expressed by oncogenes; against gangliosides such as GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1; against blood group antigens and their precursors; against antigens on the polymorphic epithelial mucin; against antigens on heat shock proteins
  • MCP-2 - RANTES
  • MCAF monocyte chemotactic and activating factor
  • MIP-1 ⁇ , -ß macrophage inflammatory protein-1
  • NAP-2 neutrophil activating protein-2
  • LIF human leukemia inhibitory factor
  • CVF Cobra venom factor
  • bacterial proteins which activate complement or trigger inflammation such as, for example, porins from Salmonella typhimurium, "clumping" factors from Staphylococcus aureus, modulins especially from gram-negative bacteria, "major outer membrane protein” from Legionella or from Haemophilus influenza type B or from Streptococcal group G adhesive or M molecules.
  • Effectors Enzymes for the activation of precursors of cytostatics, for example for enzymes which cleave inactive pre-substances (prodrugs) into active cytostatics (drugs).
  • CB Human carboxy peptidase
  • Phosphatase in particular human alkaline phosphatase, human acidic prostate phosphatase or type 5 acidic phosphatase
  • Oxidase in particular human lysyloxidase or human acidic D-aminooxidase
  • Immunosuppressive antibodies are, for example, antibodies specific for the T cell receptor or its CD3 complex, against CD4 or CD8 furthermore against the IL-2 receptor, IL-1 receptor or IL-4 receptor or against the adhesion molecules CD2, LFA-1, CD28 or CD40
  • Effectors inhibitors of cell proliferation, cytostatic or cytotoxic proteins and enzymes for the activation of precursors of cytostatics. Examples of such proteins are already listed in section a.7).
  • effectors are selected which directly or indirectly inhibit the inflammation in the joint, for example, and / or promote the reconstitution of extracellular matrix (cartilage, connective tissue) in the joint.
  • IL-1-RA - IL-1 receptor antagonist
  • soluble IL-1 receptor binds and inactivates IL-1
  • IL-6 increases the secretion of TIMP and superoxides and decreases the secretion of IL-1 and TNF ⁇ by synovial cells and chondrocytes
  • TNF receptor soluble TNF receptor binds and inactivates TNF.
  • IL-4 inhibits the formation and secretion of IL-1, TNF ⁇ and MMP - IL-10
  • IL-10 inhibits the formation and secretion of IL-1, TNF ⁇ and MMP and increases the secretion of TIMP
  • IGF-1 insulin-like growth factor
  • IGF-1 stimulates the synthesis of extracellular matrix.
  • TGFß especially TGFßl and TGFß2
  • TGFß stimulates the synthesis of extracellular matrix.
  • TIMP-1 TIMP-1
  • TIMP-2 TIMP-3
  • LIF Leukemia inhibitory factor
  • neuronal growth factors for example
  • NGF Nerve growth factor
  • BDNF Brain-derived neurotrophic factor
  • NT-3 Neurotrophin-3
  • CNTF - Ciliary neurotrophic factor
  • effectors enzymes, for example
  • effectors cytokines and their inhibitors which inhibit or neutralize the neurotoxic effect of TNF ⁇ , for example
  • TNF receptors neutralize TNF ⁇
  • IL-10 inhibits the formation of IFN ⁇ , TNF ⁇ , IL-2 and IL-4
  • Target cells e) Therapy of disorders of the blood coagulation and blood circulation system e.1) Target cells:
  • Target structures proteins of the blood coagulation system such as
  • Urokinase-type plasminogen activator uPA
  • Serine proteinase inhibitors such as C-1 S inhibitor, ⁇ 1-antitrypsin or antithrombin III
  • TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
  • a protein, glycoprotein or lipoprotein, formed by the infectious agent is selected as the effector Immune response, ie through antibody binding and / or through cytotoxic T lymphocytes leads to neutralization and / or to the killing of the pathogen.
  • neutralization antigens are already used as vaccine antigens (see overview in Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
  • neutralization antigens of the following pathogens are preferably used:
  • HSV Herpes Simplex Virus
  • VZV Varizella Zoster Virus
  • Effectors within the meaning of the invention also include an anti-idiotype antibody or its antigen-binding fragments, whose antigen-binding structures (the "complementarity determining regions") Represent copies of the protein or carbohydrate structure of the neutralizing antigen of the infectious agent.
  • anti-idiotype antibodies can replace carbohydrate antigens in particular in bacterial infectious agents.
  • antigens on tumor cells have been described, for example, by Sedlacek et al. (Contrib. To Oncol. 32, Karger Verlag, Kunststoff (1988) and Contrib. To Oncol 43, Karger Verlag, Kunststoff (1992)).
  • antigens or, for anti-idiotypic antibodies correspond to the following antigens:
  • an enzyme that cleaves a precursor of an antiviral or cytotoxic substance into the active substance an enzyme that cleaves a precursor of an antiviral or cytotoxic substance into the active substance.
  • IFN ⁇ , IFNß, IFN- ⁇ , TNFß, TNF ⁇ , IL-1 or TGFß include, for example, IFN ⁇ , IFNß, IFN- ⁇ , TNFß, TNF ⁇ , IL-1 or TGFß
  • Antibodies against virus antigens include:
  • Rev binding proteins bind to the Rev-RNA and inhibit Rev-dependent post-transcriptional stages of retrovirus gene expression.
  • Rev binding proteins are:
  • Antibacterial proteins include, for example, antibodies that neutralize bacterial toxins or opsonize bacteria.
  • two different components d which have at least one additive effect, are to be complexed with one another via components b) and c).
  • cytokines such as IL-1, IL-3, IL-6 or GM-CSF and erythropoietin, G-CSF or thrombopoietin
  • an antithrombotic and a fibrinolytic e.g. tPA or uPA
  • a fibrinolytic e.g. tPA or uPA
  • an antigen and an immunostimulating cytokine such as IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-2, GM-CSF, IL-3 or IL-4 receptor
  • Multifunctional ligands have already been described in detail in patent application EP-A 0 846 772. Reference is expressly made to this patent application.
  • a component a) When used as a multifunctional ligand, a component a) must be selected which is directed against a cellular target structure. Examples of ligands (component a) specific for cellular target structures have already been listed in section 3).
  • the effector (component d) should be selected so that it binds to a viral vector or to a non-viral vector.
  • Such effectors are for example:
  • a cellular receptor for a virus such as for AdV, AAV, a lentivirus, an RTV, vaccinia virus, HSV, influenza virus, HJV
  • a recombinant antibody specific for a virus protein for a non-viral vector or for a nucleic acid, such as an IgG, F (ab) 2> Fab, rec. Fv, diabody or single chain, double antigen binding protein
  • Component d) preferably represents a whole antibody molecule or an epitope-binding fragment of a human antibody.
  • the murine monoclonal antibodies are preferably used in humanized form. Humanization takes place in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) and Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)). Antibody fragments and recombinant Fv fragments are produced in accordance with the prior art and as already described.
  • a bivalent or a monovalent fragment is used depends on the choice of the antibody specificity and the gene construct. If the selected antibody interferes with the fusion activity of the coat protein of a viral gene construct (as described, for example, by Ubol et al. (J. Virol. 69 1990 (1995)), a monovalent antibody fragment is preferred.
  • the specificity of the antibody depends on the type of gene construct used.
  • the gene construct is a naked RNA or a naked DNA alone or in complex with a non-viral carrier
  • one of the embodiments of this invention according to the invention is that the specificity of the antibody is directed against those epitopes which have been introduced into the DNA.
  • Such epitopes can be generated by binding xenogenic substances to the DNA. Examples for this are
  • E. coli strains are known to methylate the DNA of the plasmids introduced into them at N 6 of adenine (Winnacker, From Genes to Clones, page 18/19, VCH Publisher, Weinheim (1987)).
  • Bacteria have the enzyme DNA adenine methylase, which specifically methylates adenines at the N 6 position during replication (Hartman et al., J. Mol. Biol. 126, 367 (1978)).
  • a particular subject of this invention is thus the use of monoclonal antibodies against methylated DNA - in particular against methylated N 6 of adenine - in the ligand system according to the invention. If the gene construct is complex with a non-viral carrier, a further particular embodiment of this invention is that the specificity of the antibody is directed against an epitope on the carrier.
  • These carriers include cationic polymers, peptides, proteins, polyamines or cationic lipids such as cationic lipids and phospholipids. Examples of antibodies against such carriers are
  • the gene construct is a virus
  • the specificity of the antibody is directed against one or more identical or different epitopes on the envelope proteins of the virus.
  • the linker in the ligand system used is preferably a fusiogenic peptide or protein, it is also possible to use antibodies which, by binding to the coat protein, impair the cell adhesion and / or the fusiogenic activity of the virus.
  • Antibodies against the envelope proteins of viruses which can be used as vectors are, for example, antibodies against the
  • component d) represents the cell-external part of an Fc receptor.
  • Fc receptor the cell-external part of an Fc receptor.
  • One of the antibodies mentioned above binds to this Fc receptor via its Fc part, which binds directly or indirectly to the gene construct with its antigen-binding part .
  • component d) is a cationic structural unit, such as a cationic amino acid, a cationic peptide or protein or a biogenic amine, which can complex with the gene construct.
  • cationic structural units include, for example:
  • - Polyamines such as cadaverine, spermidine, spermine, agmatine or putrescine
  • component d) is the receptor for the coat protein of the virus harboring the transgene.
  • a fusiogenic peptide In the case of multivalent protein complexes in which the effector (component d) has to penetrate intracellularly in order to have a prophylactic or therapeutic effect or which are intended to introduce a vector into the cytoplasm of a cell as multifunctional ligands, a fusiogenic peptide must be added to the effector.
  • This fusiogenic Peptide can be inserted between component c) and d) or added to component d).
  • the fusiogenic peptides include, for example:
  • LAEA LAAAAGC (SEQ ID NO .: 2)
  • - Peptides contain the peptide GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG (SEQ ID NO .: 5) or the peptide
  • proteins of viruses which have fusiogenic properties are also used.
  • viruses have fusiogenic and / or translocating coat proteins, such as paramyxoviruses, retroviruses and herpes viruses. These include, for example, the TAT protein from HIV or its translocalizing amino acid sequence or the VP22 protein from HSV.
  • viruses also have glycoproteins which are responsible both for virus attachment and subsequently for cell membrane fusion (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)).
  • Such proteins are formed, for example, by alpha, rhabdo and orthomyxoviruses.
  • Fusiogenic proteins in the sense of this invention are, for example:
  • influenza A viruses used alone or in combination with the hemagglutinin of the influenza virus or with mutants of neuraminidase from influenza A which lack enzyme activity but which do cause hemagglutination.
  • the invention further relates to multifunctional protein complexes which have a peptide sequence between component a) and b) or between component c) and d) which is cleavable for proteases.
  • the effector can be split off from the ligand (component a) or from the ligand and the mutated proteins [components a), b) and c)] and, for example, develop its effect in free form at the site of the enrichment of the multivalent protein complexes.
  • the invention relates in particular to cleavage sequences which are cleaved by proteases which are formed in tumors or by tumor cells or by inflammatory cells.
  • the invention further relates to multivalent protein complexes with cleavage sequences which are cleaved by proteases which are formed by viruses.
  • cleavage sequences for enzymes from retroviruses, polioviruses, influenza viruses, Epstein-Barr viruses, herpes simplex viruses, hepatitis viruses, pox viruses, cytomegaloviruses and dengue viruses are in German patent application DE 198 50987.1 (not published) to which express reference is made.
  • the invention furthermore relates to multivalent protein complexes with cleavage sequences which are cleaved by proteases which can be released in the cell.
  • proteases examples include, for example, caspases, such as caspases 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9.
  • Patent application EP-A 0 805 209 has described activator-responsive promoters. This invention is expressly referred to in this invention. These activator-responsive promoters are activated by an artificial transcription factor, which in principle consists of two activator subunits: subunit A and subunit B. Both subunits contain binding proteins (A, B). In EP-A 0 805 209 binding proteins (A, B) were selected which naturally form the complex AB, so that the subunit A combines with the subunit B to form a functional transcription factor complex. The invention now relates to artificial transcription factors for activator-responsive promoters in which the binding proteins A + B represent mutated binding proteins.
  • this artificial transcription factor complex consists of the following components:
  • Activation domain Component b) mutates a binding protein in such a way that it binds exclusively to component c)
  • Component c) mutates a binding protein such that it binds exclusively to component b)
  • the invention further relates to nucleic acid constructs which code for a transcription factor complex according to this invention.
  • the expression of this nucleic acid construct is under the control of promoters as listed in patent application EP-A 0 805 209, to which express reference is made.
  • the invention relates to new complex-forming proteins for analytical or diagnostic systems for qualitative or quantitative analysis or diagnosis of a reaction partner.
  • component a) represents at least one ligand which forms a specific bond with the reaction partner to be analyzed.
  • This ligand is directly or indirectly connected to at least one mutated binding protein [components b) 1-b) n], so that the component results.
  • at least one mutated binding protein [component c) 1-c) n] which can dimerize with component b) via at least two binding sites, is connected to at least one effector (component c), this effector being a signaling substance (analyte) represents.
  • the component cd results from the connection of component b) with component c).
  • the component ab binds via a) to the reaction partner.
  • This diagnostic system can be used, for example, in the two listed embodiments (see FIGS. 1 and 2):
  • component b) is a homo- (or hetero-) multimer [component b) 1-b) n], to which many identical (or different) components c) are each present as a monomer and bind each connected to component d).
  • both component b) and component c) are multimers, only one or a few components d) being bound to component c).
  • the binding between components c) and d) is extremely strong, which can increase the specificity of the detection of the reaction partner to be analyzed.
  • component c) [ci-cn] is bound to at least one further component b [b bn], to which at least one further component can dimerize cd.
  • FIG. 1 b An example of this is shown in Figure 1 b.
  • reaction partner can be determined in or on a solid phase, in a liquid, for example in a body fluid, on cells and in tissues.
  • component a) can represent:
  • nucleotide sequence If a nucleotide sequence is selected, it must be derivatized at the end [for example in accordance with WO95 / 02422 or by inserting a binding sequence for a nucleotide binding protein (such as for LexA, Gal4 or for a transcription factor) or for an antibody that is directly or indirectly via a nucleotide binding protein or component b) can be coupled via an antigen-binding part of an antibody.
  • a nucleotide binding protein such as for LexA, Gal4 or for a transcription factor
  • a cellular receptor for a growth factor for a growth factor, a cytokine, a chemokine, a peptide hormone, a mediator or a steroid
  • a protein which binds to a partner protein and thereby participates in a biological reaction chain for example a complement factor, a coagulation factor, a factor of the kinin system, of the fibrinolysis system or a plasmatic or cellular enzyme inhibitor or a plasmatic or cellular enzyme
  • the signaling component, the analyte (component d) can, for example, be a fluorescent molecule, a molecule that triggers a chemiluminescent reaction, an enzyme, such as a phosphatase or peroxidase for cleaving a substrate to be measured, an isotope or a metal.
  • a reaction partner to be determined is mixed with an excess of the component.
  • the portion of component ab not bound to the reaction partner to be determined is removed, for example, by washing.
  • the component ab bound to the reactant is mixed with an excess of component cd, the portion of component bc not bound to the component ab is removed, for example by washing, and the component d) bound to the reactant via the components ab and c) is determined.
  • An activator-responsive promoter unit was produced, in which an activator subunit A connects to an activator subunit B (see FIG. 3). The connection takes place via mutated c-jun and mutated c-fos (see FIG. 4).
  • the complex is a transcription factor that activates an activator-responsive promoter.
  • This activator-responsive promoter unit consists of the following different nucleotide sequences which follow one another downstream: Activator subunit A:
  • NLS nuclear localization signal
  • TAD acidic transactivation domain
  • NLS nuclear localization signal
  • the expression products of the activator subunits A and B dimerize by binding the mutated c-fos leucine zipper to the mutated c-jun leucine zipper.
  • the proteins were synthesized in an "in vitro transmission" system (TNT T7 quick coupled transcription / translation system, Promega, Madison, Wl) with or without (S 35 ) methionine. Subsequently, the synthesized proteins (m-jun-VP16 and m-fos-Gal4) were mixed in a 1: 1 ratio and the complexes were separated by gel electrophoresis and, after immunoprecipitation, analyzed with an anti-GAL4 antibody. The following results were achieved:
  • the protein m-jun-VP16 can combine with the protein m-fos-GAL4.
  • the protein m-jun-VP16 cannot combine with the protein wt-fos-GAL4 and the protein wt-jun-VP16 cannot combine with the protein m-fosGAL4 (see Table 1).
  • the dimeric protein represents a chimeric transcription factor for the activator-responsive promoter 10x (Gal4-SV40).
  • the activator-responsive promoter has the following composition: 10x the binding sequence for Gal4 binding protein with the nucleotide sequence 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3 '(Webster et al., Cell 52, 169 (1988); SEQ ID NO.:21)
  • the nucleotide construct thus produced is cloned into the pGL3 plasmid vector (Promega; Madison, USA), which is used directly or in colloidal dispersion systems for in vivo application.
  • the entire activator-responsive promoter unit works as follows:
  • the cyclin A promoter regulates cell cycle-specific the transcription of the combined cDNAs for the activation domain of VP16 and the mutant leucine zipper of c-jun (activation subunit A) (FIG. 3)
  • the tyrosinase promoter restricts the transcription of the combined cDNAs for the Gal4 binding domain, the NLS of SV40 and the mutant leucine zipper of c-fos to melanoma cells (activation subunit B) (FIG. 3).
  • the individual components of the construct are linked and inserted into a plasmid (pGL3, Promega, Madison Wi USA) (FIG. 6) via suitable restriction sites which are carried out at the termini of the various elements via PCR amplification.
  • the linkage takes place with the aid of enzymes and DNA ligases which are known to the person skilled in the art and are specific for the restriction sites. These enzymes are commercially available.
  • tumor cells kept in culture (MeWo: human melanoma cells, PC3: human prostate cells) are transfected with the DOTAP method known to the person skilled in the art (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) and the amount of luciferase produced by the cells is measured (Herber et al. , Oncogene 9, 1295 (1994); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) and Jerome et al., Hum. Gen. Ther., In press (1998)).
  • the tumor cells are synchronized by withdrawing methionine over 48 hours in G0 / G1.
  • BrdU incorporation shows that MeWo and PC3 cells can be synchronized after methionia deprivation (Jerome et al., Hum. Gen. Ther., In press (1998)).
  • Activator subunits A and B which contain mutant leucine zippers, cannot bind to the endogenous c-fos and c-jun (Table 2).
  • the activator subunits A and B which contain mutant leucine zippers, are more effective than the system with CD4 and LCK (Table 2), described in detail in, by the strong binding of the mutant c-fos leucine zipper to the mutant c-jun leucine zipper of patent application EP-A 0 805 209.
  • the activator-responsive promoter unit described leads to cell-specific, cell cycle-dependent expression of the luciferase gene (Table 4).
  • Melanoma xenografts were introduced into nude mice by intradermal injection of 10 6 MeWo cells.
  • Lung carcinoma xenografts were introduced into nude mice by subcutaneous injection of 2.10 7 H322 cells (H3 22, bronchoalveolar carcinomas, human ATCC No. CRL 5806).
  • Plasmid combination When the xenografts reached a size of 4 mm, they were co-injected intratumorally with the following plasmid combination in a carrier solution of 5% glucose, 0.01% Triton X100. Plasmid combination:
  • the pRL-SV40 vector was used as an internal control to standardize the results of the various xenografts.
  • mice 24 hours after the injection, the mice were sacrificed, the tumors were dissected out and mechanically ground, and the luciferase activity in the lysate was determined using the dual luciferase reporter gene assay system (Promega, Incorporated). The results were reported as the ratio of firefly luciferase activity to pRL-SV40 activity and were transferred to the protein concentration.
  • the constitutively expressed promoter SV40 leads to the detection of firefly luciferase activity.
  • the reporter gene luciferase was replaced by Bax cDNA (Oltvai et al., 1993).
  • the cells were cotransfected with CMV-luc. A large amount of luciferase was expressed constitutively, which is easily measurable with a luciferase assay, so that the percentage of surviving transfected cells can be calculated.
  • MeWo (human melanoma) and H322 (bronchoalveolar lung carcinoma) cell lines were transfected with Lipofectin (Gibco BRL Inc.) and DOTAP (Boehringer Mannheim Inc.) as described by the manufacturer.
  • the cells were co-transfected with the following plasmids: pCDNA3 (Invitrogen Inc .; control): 1 ng CMV-luc + 1 ⁇ g Tyr-m-fos-CycA-VP16 + 1 ⁇ g pCDNA3
  • CMV-bax (Bax cDNA, cloned in pCDNA3): 1 ng CMV-luc + 1 ⁇ g Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + 1 ⁇ g CMV-bax
  • 10xBS Gal4-SV40-bax 1 ng CMV-luc + 1 ⁇ g Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + 1 ⁇ g 10xBS Gal4-SV40-bax.
  • the luciferase values measured in the case of cotransfection with pCDNA3 and pBax (control plasmids which do not express Bax cDNA) were assumed to be 100% survival of the transfected cells.
  • the cells were collected 48 h after the transfection and the luciferase activity was measured.
  • the percentage of surviving transfected cells decreased in both cell types, to 9-10% for MeWo cells and to 32-36% for H322 cells.
  • the percentage of surviving transfected cells was 100% when the Me Wo cells were cotransfected with the control plasmid (Tyr-m-fos-CycA-VP16) and decreased to 36% when Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun was used. In the H3 22 cells, the percentage of surviving transfected cells was 100% in both cases.
  • the Tyr-m-fos-CycA-VP16, Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun and the 10 x BS Gal4-SV40-luc transcription cassettes were determined by bacterial recombination as described by He et al. (1998), cloned in a human E1 / E3-deleted adenovirus (serotype 5).
  • the MeWo and H322 cells were either with for 6 hours
  • Fig. 1 (a) Schematic representation of the new complex-forming
  • Fig. 4 mutations of c-jun and c-fos according to the examples.
  • Fig. 5 The activator responsive promoter and the effector gene.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf einen Komplex aus nicht natürlich vorkommenden, spezifisch komplexbildenden Proteinen enthaltend folgende Komponenten: a) mindestens ein für eine Zielstruktur spezifischer Ligand, b) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente c) wechselwirken kann und die Komponente b) kovalent mit der Komponente a) verbunden ist, c) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente b) wechselwirken kann und die Komponente c) kovalent mit der Komponente d) verbunden ist, und d) mindestens einen Effektor. Desweiteren bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung und Herstellung dieser Komplexe sowie Nukleinsäurekonstrukte kodierend für die genannten Proteine und deren Verwendung.

Description

Neue komplexbildende Proteine
1. Einleitung
Komplexverbindungen zwischen Proteinen sind in der Natur weit verbreitet.
Grundsätzlich können diese Proteine folgenden Gruppen zugeordnet werden:
- Antikörper, welche mit ihrer Antigenbindestelle spezifisch an das korrespondierende Epitop eines Antigens (welches auch ein anderer Antikörper sein kann) binden können
- Proteinkomplexe, wie sie beispielsweise bei der Aktivierung des Gerinnungssystems oder des Komplementsystems vorkommen
- Liganden-Rezeptorinteraktionen der unterschiedlichsten Art, beispielsweise
* von Antigenen oder deren Epitopen mit dem T-Zell- oder B-Zell-Rezeptor
* von Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Chemokinen, Peptidhormonen, Steroidhormonen und Mediatoren mit ihren jeweiligen Rezeptoren
* von Enzymen wie beispielsweise uPA oder tPA mit ihrem Rezeptor
* von Virusproteinen mit ihrem zugehörigen zellulären Rezeptor
- Adhäsionen zwischen Adhäsionsmolekülen
- Proteinkomplexe bei der Signalübertragung, der Zellzykluskontrolle und der Transkriptionskontrolle von Genen
Zahlreiche Beispiele hierfür sind in der Literatur zusammengefaßt, so von Hardie et al., The Protein Kinase Facts Book I and II, Academic Press 1995, Callard et al., The Cytokine Facts Book, Academic Press 1994, Pigott et al., The Adhesion Molecule Facts Book, Academic Press 1994, Barclay et al., The Leukocyte Antigen Facts Book, Academic Press 1994, Watson et al., G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press 1994, Hesketh, The Oncogene Facts Book, Academic Press 1995, Leid et al., Cell 68, 377 (1992), Murre et al., Cell 58, 537 (1989), Bbeneza et al., Cell 61 , 49 (1990), Brügge, Curr. Top.Microbiol. Immunolbiol. 123, 1 (1981), Callebaut et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 6270 (1992), Nadeau et al., J. Biol. Chem. 268, 1479 (1993), Burbach et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 8185 (1992), Hoffman et al., Science 252, 954 (1991 ), Stress-induced Proteins, M.L. Pardue, J.R. Feramisco and S. Lindquist Ed, A.R. Liss, New York (1989), Eukaryotic Transcription Factor, D.S. Lachman, Academic Press (1991 ), Transcriptional Regulations, Eds. S. McKnight and K.R. Yamamoto, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York (1992).
In einigen Fällen werden die von der Natur vorgegebenen, weitgehend spezifischen Verbindungen zwischen mindestens zwei Proteinen benutzt für die Analyse bzw. Detektion von Proteinen bei der Diagnose von Krankheiten (siehe hierzu EP 0 491 362 B1 ) und die Bindungspartner solcher Proteine für die Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen. Steht ein Partner der jeweiligen Proteinkomplexe zur Verfügung, kann mit Hilfe dieses Partners die Menge des zweiten oder weiterer Partner, seien es beispielsweise Komplement- oder Gerinnungsfaktoren, Antigene, Rezeptoren oder Signalproteine ermittelt werden. Darüber hinaus werden spezifische Proteinkompiexe benutzt für die Suche nach kleinmolekularen Aktivatoren oder Inhibitoren. Des weiteren werden gereinigte Antikörper oder Liganden für Rezeptoren, wie beispielsweise Cytokine und Peptidhormone, für die Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen Patienten oder Tieren verabreicht.
Bei diesen unterschiedlichen Anwendungsmögiichkeiten für Proteine, die Proteinkomplexe bilden, ist von entscheidender Bedeutung die Spezifität, mit welcher die jeweiligen Proteine eine Komplexbildung eingehen, des weiteren die Verbreitung der jeweiligen Proteine im Organismus. Je geringer die Spezifität ist, um so häufiger werden unspezifische Bindungen eines Partners mit fremden Proteinen auftreten.
Beispielsweise sind unspezifische, d.h. unerwünschte Komplexbildungen mit fremden Proteinpartnern bekanntermaßen das wesentliche Problem der Analytik und Diagnose mit Antikörpern. Unerwünschte Komplexbildungen mit fremden Proteinpartnern können auch in vivo die Ursache für Nebenwirkungen beispielsweise nach Injektion von Antikörpern sein. Des weiteren ist die spezifische ausschließliche Bindung zwischen zwei Proteinen eine wesentliche Voraussetzung für die Herstellung und spezifische Funktionsweise von komplexen Transkriptionsfaktoren, insbesondere von künstlichen Transkriptionsfaktorkomplexen, wie sie in der Patentanmeldung EP-A 0 805 209 beschrieben wurden.
Es besteht somit ein erheblicher Bedarf an neuen, hochspezifisch, nicht mit fremden Partnern reagierenden komplexbildenden Proteinen.
2. Kurzbeschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Komplex aus nicht natürlich vorkommenden, spezifisch kompiexbildenden Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Komponenten im Komplex enthalten sind:
a) mindestens ein für eine Zielstruktur spezifischer Ligand,
b) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente c) wechselwirken kann und die Komponente b) kovalent mit der Komponente a) verbunden ist,
c) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimensierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente b) wechselwirken kann und die Komponente c) kovalent mit der Komponente d) verbunden ist, und
d) mindestens einen Effektor. Entsprechend der Erfindung sind die Komponenten b) und c) dadurch charakterisiert, daß in natürlich vorkommenden Peptiden oder Proteinen gleicher oder unterschiedlicher Art Aminosäuren ausgetauscht oder eingefügt werden, so daß die so mutierten Peptide oder Proteine praktisch nur noch ausschließlich miteinander komplexieren können. Eine Komplexierung so mutierter Peptide oder Proteine mit den entsprechenden nichtmutierten Wildtyp-Proteinen oder -Peptiden unterbleibt hingegen. Auf diese Weise können Homodimere oder Heterodimere aus mutierten Monomeren (mutierte Peptide oder Proteine) gebildet werden.
Die Mutationen in den Bindungsdomänen der gleichen oder verschiedenen Proteine haben daher den Zweck, die Fähigkeit zur Komplexbildung zwischen einem unmutierten Monomeren und einem mutierten Monomeren eines Paares gleicher oder verschiedener Proteine oder Peptide, die im unmutierten Zustand komplexieren würden, zu verhindern. Gleichzeitig verleihen die Mutationen einem solchen Paar von mutierten Proteinen die Fähigkeit, mit hoher Spezifität aneinander zu binden. Die Mutationen treten also paarweise auf, wobei eine Mutation in Komponente b), die andere in Komponente c) vorliegt, und zwar so, daß eine molekulare Interaktion zwischen den jeweiligen Aminosäuren eines solchen Paares möglich ist.
Aminosäuren gemäß der Erfindung eingefügt in natürlich vorkommende Peptide oder Proteine können beispielsweise sein (die paarweise Auflistung soll die molekulare Interaktion im Rahmen eines dimeren Proteinkomplexes andeuten):
Komponente b) oder c) Komponente c) oder b)
3-18 Cysteine 3-18 Cysteine
3-24 basische Aminosäuren wie 3-24 saure Aminosäuren wie
Histidin, Asparagin,
Arginin, Asparaginsäure,
Lysin Glutamin,
Glutaminsäure 3-24 hydrophobe Aminosäuren wie 3-24 aromatische Aminosäuren wie Methionin, Phenylalanin, Isoleucin, Tyrosin, Leucin, Tryptophan Valin
3-24 aromatische Aminosäuren 3-24 aromatische Aminosäuren
Die Ausgangsproteine für Komponenten b) und c) können hierbei gleich oder unterschiedlich sein.
Die Bindungskonstante eines Komplexes zweier erfindungsgemäßer Proteine beträgt mindestens K = 10"7 mol I"1, bevorzugt mindestens KM = 10"8 mol I"1.
Im Sinne dieser Erfindung werden beispielsweise folgende gleiche oder ungleiche Partner (für die Herstellung von Komponente b) oder c) und mit dem Ziel Heteromere zu binden) bevorzugt in ihrer jeweiligen Bindedomäne mutiert und diese oder das gesamte Protein verwendet:
Komponente b) oder c) Komponente c) oder b)
Fos Jun oder Jun B oder Jun D
FRAU-1 Jun oder Jun B oder Jun D
FRAU-2 Jun oder Jun B oder Jun D
FOS-B Jun oder Jun B oder Jun D
OCT-1 Jun oder Jun B oder Jun D
NFKB (p65) IKB
Ras RAF
CD4 p56LcK bcl-2 bad oder bax cyclin A cdkl
E2F DP CD40 CD40L
Myc Max
Myc N Max
Myc L Max p105 (Rb1 ) AFF-2, E1A p107 (Rb2) E7, E2F oder Myc p130 E7, E2F oder Myc
CBL Gag
TRP TRP
Met Met
Myb p67 oder p160
VAV p67 oder p160
APC α- oder ß-Catenin
APC APC
VD Rezeptor h-(Retinoid x-Rezeptor)RXR α oder ß
T3 Rezeptor hRXR α oder ß
MyoD E12
Komponente b) oder c) Komponente c) oder b)
E12 Id
E47 Id hHSP90 Progesteron-Rezeptor hHSP90 Glucocorticoid-Rezeptor hHSP90 Mineralocorticoid-Rezeptor hHSP90 Dioxinrezeptor
Dioxinrezeptor Amt
HPS90 FKBP59
HSP90 Cyclosporin-bindendes Protein
HPS90 pp60v-src
HSP70 HSF1 Heat shock Faktor 1
HSP70 HSF2 Heat shock Faktor 2 Bevorzugt werden sollten solche Proteinpaare, welche natürlicherweise über eine Helix-Loop-Helix/Leucin-Zipper-Bindesequenz verfügen.
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren die unterschiedlichsten Verwendungen dieser erfindungsgemäßen kompiexbildenden Proteine, beispielsweise
- als multivalente Protein komplexe für die Prophylaxe und Therapie
- als multivalente Liganden für Vektoren zur Gentherapie
- als künstliche Transkriptionsfaktoren für die Kontrolle der Expression von Genen
- und als diagnostische oder analytische Systeme.
Hierbei werden die Komponenten a) und d) je nach der gewählten Verwendungsart ausgewählt.
Gegenstand der Erfindung sind besonders neue komplexbildende Proteine, dadurch charakterisiert, daß in natürlicherweise Homodimere oder Heterodimere bildenden Proteinen die aufgeführten Aminosäuren eingefügt worden sind, so daß diese derartig mutierten Proteine (Komponenten b) und c)) nur noch mit sich selber (Homodimere) oder mit dem entsprechend mutierten Partner (Heterodimere) Komplexe bilden, jedoch nicht mehr mit den natürlicherweise vorkommenden, nicht mutierten Ausgangsproteinen.
Neue komplexbildende Proteine mit den Komponenten a), b), c) und d) können in beispielsweise zwei Ausführungsformen verwendet werden.
In der ersten Ausführungsform (siehe Figur 1 a) stellt die Komponente b) ein Homo- (oder Hetero-)mu.timer dar [Komponente b)1-b)n], an welche die jeweils korrespondierenden gleichen (oder unterschiedlichen) Komponenten c) jeweils als Monomer und jeweils verbunden mit der Komponente d) binden.
Mit dieser Ausführungsform werden viele Komponenten d) (Effektoren) an die Zielstruktur gebunden. In der zweiten Ausführungsform (siehe Figur 2) stellen sowohl die Komponente b) als auch die Komponente c) Multimere dar, wobei an die Komponente c) nur eine oder wenige Komponenten d) gebunden sind. Mit dieser Ausführungsform werden zwar nur wenige Komponenten d) (Effektoren) an die Zielstruktur gebunden, aber die Bindung zwischen den Komponenten c) und d) ist außerordentlich stark, was die Spezifität der Bindung der Komponenten c) und d) an die Zielstruktur erhöhen kann.
Gegenstand der Erfindung sind neue, komplexbildende Proteine bestehend aus den Komponenten a), b), c) und d), wie auch Nukleinsäurekonstrukte, welche für diese komplexbildenden Proteine kodieren. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Komplexe bestehend aus den Komponenten d), b), c) und d), d. h. die Komponente a) ist durch d) ersetzt, und dafür kodierende Nukleinsäurekonstrukte.
Desweiteren ist Gegenstand der Erfindung ein Komplex bestehend aus den Komponenten a), b), c) und a); d. h. die Komponente d) ist durch a) ersetzt, und dafür kodierende Nukleinsäurekonstrukte.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind auch komplexbildende Proteine bestehend aus den Komponenten a), b), c) und d) oder oben beschriebenen Varianten davon, die zusätzlich ein fusiogenes Peptid, ein Translokationspeptid oder zwischen den Komponenten c) und d) oder a) und b) eine Spaltsequenz für eine Protease enthalten, und dafür kodierende Nukleinsäurekonstrukte.
Alle solchen derartigen Nukleinsäurekonstrukte können in Bakterien, Hefen oder Säugerzellen mit Hilfe von viralen oder nichtviralen, dem Fachmann bekannten Vektoren eingeführt werden.
Derartige Zellen können der Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins dienen oder selbst zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie einem Organismus verabeicht werden. Derartige Nukleinsäurekonstrukte, eingefügt in einen Vektor, können jedoch auch direkt einem Organismus zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie verabreicht werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung einer der o. g. Komplexe, in dem ein Protein dieses Komplexes mit Hilfe eines dafür kodierenden Nukleinsäurekonstruktes exprimiert wird und eine weiteres Protein dieses Komplexes, welches von ersterem verschieden ist, mit Hilfe eines dafür kodierenden Nukleinsäurekonstrukts exprimiert wird, die exprimierten Proteine isoliert und miteinander komplexiert werden. Im Falle von Komplexen bestehend aus Homodimeren oder Homooligomeren erfolgt die Herstellung ohne die Expression eines zweiten, vom ersten verschiedenen Protein.
3. Multivalente Proteinkomplexe für die Prophylaxe und Therapie
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteinkomplexe für die Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung. Hierbei stellt die Komponente a) einen Liganden für eine Zielstruktur dar. Diese Zielstruktur kann auf einer Zellmembran, in der extrazellulären Matrix oder in einer Gewebe- oder Blutflüssigkeit vorhanden sein.
Gemäß der Erfindung kann die Komponente a) darstellen
- einen Liganden für einen zellulären Rezeptor, beispielsweise
* Wachstumsfaktoren wie VEGF, PDGF, EGF, TGFα, TGFß, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, Neurotrophine, BMF, Bombesin, M-CSF, Thrombopoietin, Erythropoietin, SCF, SDGF, Oncostatin, PDEGF, Endothelin- 1
+ Cytokine wie IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-14, IL-15
* Interferon α, ß und γ
^ Tumomekrosefaktoren TNFα, -ß * Chemokine wie RANTES, MCAF, MIP-1α oder -ß, NAP, ß-Thromboglobulin
* Peptidhormone wie SRH, SIH oder STH, MRH oder MSH, PRH, PIH oder Prolaktin, GnRH, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH oder FSH, TRH oder TSH, CRH oder ACTH
* Angiotensin, Kinine, Histamin, Homologe oder Analoge hiervon
* Steroidhormone wie Östrogene, Gestagene, Androgene, Glukokortikoide, Mineralokortikoide, Homologe oder Analoge hiervon
* Vitamine wie z.B. Folsäure
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch ein Adhäsionsmolekül, ein Teil des Adhäsionsmoleküls oder ein Analogon eines Adhäsionsmoleküls sein, welches an ein korrespondierendes zellmembranständiges Adhäsionsmolekül oder an eine andere spezifische Bindestruktur für ein Adhäsionsmolekül auf der Zielzelle bindet.
Derartige als Komponente a) funktionsfähige Adhäsionsmoieküle sind beispielsweise
- Lewis X (für GMP-140)
- S-Lewis X (für ELAM-l ).
- LFA-1 (für ICAM-1 und ICAM-2)
- MAC-1 (für lCAM-1 )
- VLA-4 (für VCAM-1 )
- PECAM (für PECAM)
- Vitronectin (für den Vitronectinrezeptor)
- GMP-140 (für Lewis X)
- S-Lewis X (für ELAM-l )
- ICAM-1 , ICAM-2 (für LFA-1 , MAC-1 )
- VCAM-1 (für VLA-4)
- Fibronectin (für VLA-4)
- Laminin (für VLA-6)
- Fibronectin, Laminin (für VLA-1 , VLA-2, VLA-3)
- Fibronectin (für VLA-4) - Fibrinogen (für GPIIb-llla)
- B7 (für CD28)
- CD28 (für B7)
- CD40 (für CD40L)
- CD40L (für CD40)
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch ein Protein sein, welches sich mit einem Partnerprotein verbindet und hierdurch an einer biologischen Reaktionskette teilhat, beispielsweise ein Komplementfaktor, ein Gerinnungsfaktor, ein Faktor des Kininsystems, des Fibrinolysesystems oder ein plasmatischer oder zellulärer Enzyminhibitor oder ein plasmatisches oder zelluläres Enzym .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch einen Rezeptor für einen der zuvor erwähnten Proteine darstellen.
Im Rahmen der vorliegenden Verbindung kann die Komponente a) auch der extrazelluläre Teil eines Fc-Rezeptors sein (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)), an welchem ein Antikörper spezifisch für die Zielzelle über seinen Fc-Teii gebunden wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch ein Antikörpermolekül oder den epitopbindenden Teil eines Antikörpermoleküls darstellen. Humane Antikörper sind zu bevorzugen.
Die murinen monoklonalen Antikörper können in humanisierter Form eingesetzt werden. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991 )) und Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente werden entsprechend dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von Winter et al., (Nature 349, 293 (1991 )), Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379 (1991 )) oder Huston et al. (Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)) beschriebenen Weise.
Rekombinante Antikörperfragmente werden direkt aus existierenden Hybridomen hergestellt oder werden mit Hilfe der "phage display"-Technologie aus Bibliotheken muriner bzw. humaner Antikörperfragmente isoliert. Diese Antikörperfragmente werden dann auf genetischer Ebene direkt für weitere Manipulationen (z.B. der Fusion mit anderen Proteinen) eingesetzt.
Zur Herstellung von rekombinanten Antikörperfragmenten aus Hybridomen wird die genetische Information, die für die antigenbindenden Domänen (VH, VL) der Antikörper kodiert, durch Isolierung der mRNA, die reverse Transkription der RNA in cDNA und die anschließende Amplifikation mittels Poiymerasekettenreaktion und Oligonukleotiden komplementär zu den 5'- bzw. 3'-Enden der variablen Fragmente gewonnen. Die VH- und VL-Fragmente werden dann in bakterielle Expressionsvektoren z.B. in Form von Fv-Fragmenten, einzelkettigen Fv- Fragmenten (scFv) oder als Fab-Fragmente kloniert.
Neue Antikörperfragmente können mittels der "phage-display"-Technologie auch direkt aus Antikörperbibliotheken (immunbibliotheken, naive Bibliotheken) murinen oder humanen Ursprungs isoliert werden. Beim "phage display" von Antikörperfragmenten werden die antigenbindenden Domänen als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein g3P filamentöser Bakteriophagen entweder in das Phagengenom oder in Phagemid-Vektoren in Form von scFv-Fragmenten oder als Fab-Fragmente kloniert. Antigen-bindende Phagen werden an antigenbeladenen Plastikgefäßen ("panning"), an antigenkonjugierten, paramagnetischen Kügelchen ("beads") oder durch Bindung an Zelloberflächen selektioniert.
Immunbibliotheken werden hergestellt durch PCR-Amplifikation der variablen Antikörperfragmente aus B-Lymphozyten immunisierter Tiere oder Patienten. Dazu werden Kombinationen von Oligonukleotiden die spezifisch sind für murine oder humane Immunglobulingene bzw. für die humanen Immunglobulin-Genfamilien verwendet.
Unter Verwendung nichtimmunisierter Spender als Quelle der Immunglobulingene lassen sich naive Bibliotheken herstellen. Alternativ können Immunglobulin- Keimbahngene zur Herstellung semisynthetischer Antikörperrepertoires eingesetzt werden, wobei die Komplementarität-bestimmende Region 3 der variablen Fragmente durch PCR mit Hilfe degenerierter Primer ergänzt wird. Diese sogenannten "Single pot"-Bibliotheken haben gegenüber Immunbibliotheken den Vorteil, daß Antikörperfragmente gegen eine Vielzahl von Antigenen aus einer einzigen Bibliothek isoliert werden können.
Die Affinität von Antikörperfragmenten kann mittels der "phage display"-Technologie weiter erhöht werden, wobei neu Bibliotheken von bereits existierenden Antikörperfragmenten durch zufällige, kodonbasierende oder gezielte Mutagenese, durch "chain shuffling" einzelner Domänen mit Fragmenten aus nativen Repertoires oder unter Zuhilfenahme von bakteriellen Mutatorstämmen hergestellt werden und durch Reselektion unter stringenten Bedingungen Antikörperfragmente mit verbesserten Eigenschaften isoliert werden. Zusätzlich können murine Antikörperfragmente durch stufenweisen Austausch einer der variablen Domänen gegen ein humanes Repertoire und anschließende Selektion mit dem ursprünglichen Antigen ("guided selection") humanisiert werden. Alternativ erfolgt die Humanisierung muriner Antikörper durch zielgerichteten Austausch der hypervariablen Regionen humaner Antikörper durch die korrespondierenden Regionen des originalen murinen Antikörpers.
Entsprechend der Erfindung können mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche Liganden für die Zielstruktur, z.B. auf der Zielzelle im erfindungsgemäßen Liganden (Komponente a) enthalten sein. Eine besondere Form von bispezifischen oder multispezifischen, rekombinanten Antikörpern stellen einzelkettige, zweifach- oder mehrfach-antigenbindende Moleküle dar. Die Herstellung dieser Moleküle wurde in der Patentanmeldung DE 19816141.7 (nicht veröffentlicht) beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird zur beispielsweisen Herstellung der Komponente a) ausdrücklich Bezug genommen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch das Hüllprotein oder ein Teil des Hüllproteins von Viren darstellen, welche über ihr Hüllprotein an ausgewählte Zellen spezifisch binden.
Die Wahl der Komponente a) richtet sich nach der Zielstruktur, an welche das erfindungsgemäße komplexbildende Protein binden soll.
Als Beispiele hierfür gelten:
- Liqanden für aktivierte Endothelzellen
Hierzu gehören im Sinne der Erfindung Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose enthalten, des weiteren IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGFß (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)).
Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise Slex, LFA-1 , MAC-1 , LECAM-1 , VLA-4, Vitronectin oder RGD-Peptide wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev. H, 353 (1992)).
Zu den Liganden im Sinne dieser Erfindung gehören insbesondere Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Endothelzellen haben. Zu diesen Viren gehören beispielsweise:
- Filoviren, beispielsweise
* das Marburg-Virus mit seinem Hüllprotein GP (glycoprotein) und sGP (second glycoprotein)
* oder das Ebola-Virus jeweils mit seinem Hüllprotein GP und sG
- das Cytomegalovirus besonders mit seinem gB-Protein
- das Herpes Simplex-Virus Type I
- das HIV-1 Virus
- das Masern-Virus
- das Hantaan-Virus
- Alphaviren, wie Semliki Forest-Virus
- das Virus des epidemischen, haemorrhagischen Fiebers
- das Poliovirus
- Enteroviren (wie z.B. Echo 9, Echo 12, Cocksackie B3)
Liqanden für aktivierte Makrophaqen und/oder aktivierte Lvmphozyten
Zu den Liganden im Sinne der Erfindung gehören des weiteren Substanzen, welche an die Oberfläche von Immunzellen spezifisch binden. Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Immunzellen, wie sie beispielsweise von Powelson et al. (Biotech. Adv. 1_1, 725 (1993)) beschrieben wurden. Des weiteren gehören zu den Liganden auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihrem antigenbindenden variablen Teil an Fc-γ - oder Fc-ε - oder Fc-μ Rezeptoren von Immunzelien binden (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11 , 1731 (1994)).
Des weiteren gehört hierzu das Fc-Fragment von humanem monoklonalem oder polyklonalem Immunglobulin. Derartige Fc-Fragmente werden beispielsweise gentechnisch mit Hilfe rekombinierter DNA oder entsprechend der Methoden von Haupt et al. (Klin. Wschr. 47, 270 (1969)), Kranz et al. (Dev. Biol. Standard 44, 19 (1979)), Fehr et al. (Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974)) oder Menninger et al. (Immunochem. 13, 633 (1976)) hergestellt.
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Substanzen, welche an Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Immunzellen binden. Hierzu gehören Zytokine wie beispielsweise IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα, GM-CSF, M- CSF, des weiteren Wachstumsfaktoren wie beispielsweise EGF, TGF, FGF, IGF oder PDGF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Immunzellen binden.
Hierzu gehören des weiteren Adhäsionsmoleküle und andere Liganden, welche an Zellmembranstrukturen, wie beispielsweise an den Mannose 6-Phosphat- Rezeptor auf Makrophagen in Milz, Leber, Lunge und andere Gewebe binden.
Eine Auswahl dieser Liganden und Membranstrukturen sind übersichtlich bei Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)) beschrieben.
Zu den Liganden im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Lymphozyten und/oder Makrophagen haben.
Zu diesen Makrophagen infizierenden Viren gehören beispielsweise: - HIV-1 besonders solche Stämme mit Mutationen in der V3-Region von gp120, die zu einer erhöhten Bindung an Makrophagen führen
- HIV-2
- Hantaviren, beispielsweise das Punmalavirus
- Cytomegaiovirus
- Respiratory Syncytial Virus
- Herpes simplex-Virus
- Filoviren.
Zu den Lymphozyten infizierenden Viren gehören beispielsweise:
- Varizella-Zoster-Virus (VZV); VZV infiziert besonders T-Zellen
- Herpes Virus 6 (HHV-6);
HHV-6 infiziert besonders T-Zellen
- Rabies-Virus; das Rabies-Virus Hüllprotein bindet besonders an TH2-Zellen
- HIV-1 ; das Glykoprotein gp120 bindet bevorzugt an das CD4 Molekül von T-Zellen
- HTLV-II;
HTLV-II infiziert besonders B-Zellen
- HTLV-I;
HTLV-I infiziert besonders T-Zellen
- Influenza C-Viren;
Influenza-C-Viren binden über das Haemagglutinin-Esterase-Fusions-(HEF)- Protein an N-acetyl-9-ß-acetylneuraminsäure (Neu 5,9 Ac), welche bevorzugt auf B-Lymphozyten, weniger oder nicht auf T-Lymphozyten vorkommt
- Influenza C-Viren mit Mutation in der Nukleotidposition 872 (die die Position 284 des HEF der Aminosäuresequenz kodiert), beispielsweise ein Austausch des Threonins durch Isoleucin. Das Oberflächenprotein HEF mit dieser Mutation hat eine deutlich stärkere Affinität zum N-acetyl-9-ß- acetylneuraminsäure-Rezeptor als das Wildvirus
- HEF Spaltprodukte des Influenza C-Virus, welche die Bindestruktur für N- acetyl-9-ß-acetylneuraminsäure enthalten. Diese Bindestruktur ist definiert durch die katalytische Triade Serin-71 , Histidin 368 oder - 369 und Arsparaginsäure 261
- Epstein-Barr Virus;
EBV infiziert besonders B-Zellen
- Herpes simplex-Virus-2;
HSV-2 infiziert besonders T-Zellen
- Masernvirus
Liqanden für Muskelzellen
Hierzu gehören beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Muskelzellen, insbesondere von glatten Muskelzellen. Derartige Antikörper sind beispielsweise
- der Antikörper 10F3
- Antikörper gegen Actin
- Antikörper gegen Angiotensin Il-Rezeptoren
- Antikörper gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren oder Antikörper gerichtet beispielsweise gegen
- EGF-Rezeptoren
- oder gegen PDGF-Rezeptoren
- oder gegen FGF-Rezeptoren
- oder Antikörper gegen Endothelin A-Rezeptoren.
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirksubstanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Muskelzellen binden (Übersicht bei Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol. 2, 260 (1991 )). Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch glatte Muskelzellen binden wie beispielsweise
- PDGF
- EGF
- TGFß
- TGFα
- FGF
- Endothelin A
Zu den Liganden im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Muskelzellen haben. Zu diesen Viren gehört beispielsweise das Cytomegalovirus.
- Liqanden für blutbildende Zellen
Zu den Liganden gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Rezeptoren exprimiert auf gering differenzierten Blutzellen.
Derartige Antikörper sind beispielsweise für folgende Rezeptoren beschrieben worden:
- Stern Cell Factor Receptor
- IL-1 -Rezeptor (Type I)
- IL-1 -Rezeptor (Type II)
- IL-3-Rezeptor α
- IL-3-Rezeptor ß
- IL-6-Rezeptor
- GM-CSF-Rezeptor. Des weiteren gehören zu den Liganden auch monokionale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-γ Rezeptoren von Immunzelien binden.
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von gering differenzierten Blutzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie SCF, IL-1 , IL-3, IL-6, GM-CSF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Blutzellen binden.
Liqanden für Synovialzellen und Entzündunqszellen
Hierzu gehören monokionale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren variablen Domänen an Membranstrukturen von Synovialzellen oder Entzündungszellen binden. Solche Membranstrukturen sind beispielsweise
- Vimentin
- Fibronectin oder
- Fc-Rezeptoren.
Hierzu gehören auch monokionale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-Rezeptor binden.
Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Synovialzellen binden. Beispielsweise gehören hier Cytokine oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Synovialzellen binden wie beispielsweise IL-1-RA, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10, IGF, TGFß. Des weiteren gehören hierzu Liganden, deren wesentlicher Bestandteil endständige Mannose ist, welche an Mannose-6-Phosphatrezeptoren auf Makrophagen bindet.
- Liqanden für mit Viren infizierte Zellen
Zu den Liganden gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen die Virusantigene exprimiert auf der Zellmembran von virusinfizierten Zellen.
Derartige Antikörper sind beispielsweise für mit folgenden Viren infizierten Zellen beschrieben worden:
- HBV
- HCV
- HSV
- HPV
- HIV
- EBV
- HTLV.
- Liqanden für Leberzellen und weitere Gewebezellen
Zu den Liganden gehören alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Leberzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie Zytokine, EGF, TGF, FGF oder PDGF, oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch derartige Zellen binden.
Hierzu gehören des weiteren Liganden, welche an Zellmembranstrukturen binden, welche selektiv sind für bestimmte Gewebe. Hierzu zählen beispielsweise: Membranstruktur Ligand Gewebezellen
Asialoglycoprotein- Asialoorosomucoid Leberzellen Rezeptor Neoglycoprotein
Galactose
Transferrin-Rezeptor Transferrin Leber, andere Gewebezellen
Insulin-Rezeptor Insulin Leber, andere Gewebezellen
Mannose-6-Phosphat- Mannose Makrophagen in Milz, Rezeptor Leber, Lunge, andere Gewebe
Fc-γ-Rezeptoren immunglobulin G retikuloendotheliales System, andere Gewebe
Diese Liganden und Membranstrukturen sind übersichtlich bei Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)) beschrieben.
Zu den Liganden im Sinne der Erfindung gehören jedoch besonders Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für ausgewählte Zellen haben, wie beispielsweise für
- Bronchialepithelzellen
* Respiratory syncytial virus
- Leberzellen
* Hepatitis C-Virus, Hepaptitis B-Virus, Hepatitis A-Virus
* Filoviren
Leberzellen binden z.B. das Marburg-Virus über den Asialoglykoprotein- Rezeptor * Hepatitis B-Virus
Leberzellen binden bevorzugt über den Asiaioglykoprotein-Rezeptor an der preS2 und preS1 Domäne von HBV
* Hepatitis D-Virus
- lebersinusoidale Zellen
* Hepatitis V-Virus
HBV wird gebunden über Fibronectin.
Liqanden für Gliazellen
Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Gliazellen, wie sie beispielsweise von Mirsky et al. (Cell and Tissue Res. 240, 723 (1985)), Coakham et al. (Prog. Exp. Tumor Res. 29, 57 (1985)) und McKeever et al. (Neurobiol. 6, 119 (1991 )) berichtet wurden. Zu diesen Membranstrukturen gehören des weiteren Neuraladhäsionsmoleküle wie N-CAM, insbesondere dessen Polypeptidkette C.
Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Gliazellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose tragen und an den Mannose-6- Phosphatrezeptor binden, Insulin und Insulin-like growth factor, PDGF und diejenigen Fragmente dieser Wachstumsfaktoren, welche an die zugehörigen Membranrezeptoren binden.
Zu den Liganden im Sinne der Erfindung gehören insbesondere Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Gliazellen haben.
Zu diesen Viren gehören beispielsweise:
- HIV-1 Subtyp JRF1
- Herpes simplex-Virus I Liqanden für Leukämiezellen
Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 4_1, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991 )). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente mit Spezifität für folgende Antigene geeignet:
Zellen Membranantigen
AML CD13
CD14
CD15
CD33
CAMAL
Sialosyl-Le
B-CLL CD5
CD1c CD23
Idiotypen und Isotypen der Membranimmun- globuline
T-CLL CD33
M38
IL-2-Rezeptoren T-Zell-Rezeptoren
ALL CALLA
CD19 Non-Hodgkin Lymphoma
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren von Leukämiezellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Leukämiezellen binden.
Derartige Wachstumsfaktoren wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Cross et al., Cell 64, 271 (1991); Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995); Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)). Beispielsweise gehören zu ihnen:
- IFNα bei Non-Hodgkin Lymphomen
- IL-2, besonders bei T-Zell-Leukämien
- FGF bei T-Zell-, monozytären, myeloiden, erythroiden und megakaryoblastischen Leukämien
- TGFß bei Leukämien
- Retinoide, z.B. "Retinoic acid" bei akuter promyelozytärer Leukämie.
Liqanden für Tumorzellen
Hierzu gehören Antikörper und Fragmente dieser Antikörper, gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992)) übersichtlich dargestellt.
Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen:
- Sialyl Lewis
- Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden
- von Onkogenen exprimierte Proteine
- Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1
- Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
- Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
- Antigene auf Heat Shock Proteinen Gemäß der Erfindung kann die Komponente d) entweder fehlen oder ist, je nach Art der Erkrankung, welche verhütet oder behandelt werden soll, gemeinsam mit der Komponente a) beispielsweise wie folgt auszuwählen:
a) Therapie von Tumoren a.1 ) Zielzellen:
- prolife erende Endothelzellen oder
- der Endothelzelle benachbarte Stromazellen und Muskelzellen oder
- Tumorzellen oder Leukämiezeilen
a.2) Effektoren: Inhibitoren der Zellproliferation, zum Beispiel
- das Retinoblastomprotein (pRb=p110) oder die verwandten p107 und p130 Proteine
Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind solche Gene dieser Zellzyklusinhibitoren zu verwenden, welche Mutationen für die inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110. In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert.
- das p53 Protein
Das Protein p53 wird in der Zelle inaktiviert entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2, oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte C-terminale Serin. Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C-terminal verkürzt ist um das Serin 392.
- das p21 (WAF-1 )
- das p16 Protein
- andere cdk-lnhibitoren
- das GADD45 Protein
- das Bak Protein - das Bax Protein a.3) Effektoren: Gerinnung induzierende Faktoren und Angiogeneseinhibitoren, zum Beispiel:
- Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1 )
- PAI-2
- PAI-3
- Angiostatin und/oder Endostatin
- Interferone (IFNα, IFNß oder IFNγ)
- Platelet factor 4
- IL-12
- TIMP-1
- TIMP-2
- TIMP-3
- Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
- Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente
a.4) Effektoren: zytostatische und zytotoxische Proteine, zum Beispiel
- Perforin
- Granzym
- IL-2
- IL-4
- IL-12
- Interferone, wie beispielsweise IFN-α, IFNß oder IFNγ
- TNF, wie TNFα oder TNFß
- Oncostatin M
- Sphingomyelinase
- Magainin und Magainin-Derivate
a.5) Effektoren: zytostatische oder zytotoxische Antikörper - Zu den zytostatischen oder zytotoxischen Antikörpern gehören solche gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
- Des weiteren gehören hierzu zytostatische oder zytotoxische Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992)) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen Sialyl Lewis; gegen Peptide auf Tumoren, welche von T- Zellen erkannt werden; gegen von Onkogenen exprimierte Proteine; gegen Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1 ; gegen Blutgruppenantigene und deren Vorläufer; gegen Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin; gegen Antigene auf Heat Shock Proteinen
- Des weiteren gehören hierzu Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991 )). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente gerichtet gegen folgende Membranantigene geeignet: Zellen Membranantigen
AML CD13
CD15
CD33
CAMAL
Sialosyl-Le
B-CLL CD5 CD1c
CD23
Idiotypen und Isotypen der Membranimmunglobuline
T-CLL CD33
M38
IL-2-Rezeptoren T-Zell-Rezeptoren
ALL CALLA
CD19 Non-Hodgkin Lymphoma
- Die Humanisierung muriner Antikörper, die Herstellung und Optimierung der Gene für Fab und rek. Fv Fragmente erfolgt entsprechend der dem Fachmann bekannten Technik (Winter et al., Nature 349, 293 (1991 ); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991 ) oder Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)). Die Fusion der rek. Fv-Fragmente mit der Komponente b) und/oder Komponente c) erfolgt mit dem dem Fachmann bekannten Stand der Technik durch Expression eines Genes kodierend für das Fusionsprotein.
a.6) Effektoren: Induktoren von Entzündungen, zum Beispiel
- IL-1
- IL-2
- RANTES (MCP-2)
- monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)
- IL-8
- macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -ß)
- neutrophil activating protein-2 (NAP-2) - IL-3
- IL-5
- human leukemia inhibitory factor (LIF)
- IL-7
- IL-11
- IL-13
- GM-CSF
- G-CSF
- M-CSF
- Cobra venom factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktioneil entsprechen, d.h. welche an den Kompiementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen
- der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b
- Spaltprodukte des menschlichen Kompiementfaktors C3, welche funktioneil und strukturell dem CVF ähneln
- bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhimurium, "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legionellen oder von Haemophilus influenza Typ B oder von Klebsiellen oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G.
a.7) Effektoren: Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika, zum Beispiel für Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten.
Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Müllen (Pharmac. Ther. 63, 199 (1994) und Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) übersichtlich beschrieben worden. Beispielsweise ist eines der folgenden Enzyme zu verwenden: - Herpes Simplex Virus Thymidinkinase
- Varizella Zoster Virus Thymidinkinase
- bakterielle Nitroreduktase
- bakterielle ß-Glucuronidase
- pflanzliche ß-Glucuronidase aus Seeale cereale
- humane ß-Glucuronidase
- humane Carboxy peptidase (CB) zum Beispiel CB-A der Mastzelle, CB-B des Pankreas oder bakterielle Carboxypeptidase
- bakterielle ß-Laktamase
- bakterielle Cytosine Deaminase
- humane Catalase bzw. Peroxidase
- Phosphatase, im besonderen humane alkalische Phosphatase, humane saure Prostataphosphatase oder Typ 5 saure Phosphatase
- Oxidase, im besonderen humane Lysyloxidase oder humane saure D- aminooxidase
- Peroxidase, im besonderen humane Glutathion Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase oder humane Schilddrüsen Peroxidase
- Galaktosidase
b) Therapie von Autoimmunerkrankungen und Entzündungen b.1 ) Zielzellen:
- proliferierende Endothelzellen oder
- Makrophagen und/oder Lymphozyten oder
- Synovialzellen
b.2) Effektoren zur Therapie von Allergien, zum Beispiel
- IFNß
- IFNγ
- IL-10
- Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen IL-4
- lösliche IL-4-Rezeptoren - IL-12
- TGFß b.3) Effektoren zur Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen, zum Beispiel
- IL-10
- TGFß
- lösliche IL-1 -Rezeptoren
- lösliche IL-2-Rezeptoren
- IL-1-Rezeptorantagonisten
- lösliche IL-6-Rezeptoren
- immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL enthaltende Fragmente oder deren über einen Linker verbundene VH- und VL- Fragmente.
Immunsuppressive Antikörper sind beispielsweise Antikörper spezifisch für den T-Zell-Rezeptor oder seinen CD3-Komplex, gegen CD4 oder CD8 des weiteren gegen den IL-2-Rezeptor, IL-1 -Rezeptor oder IL-4-Rezeptor oder gegen die Adhäsionsmoleküle CD2, LFA-1 , CD28 oder CD40
b.4) Effektoren für die Therapie von Antikörper-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel
- TGFß
- IFNα
- IFNß
- IFNγ
- IL-12
- lösliche IL-4-Rezeptoren
- lösliche IL-6-Rezeptoren
- immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL-enthaltende Fragmente
b.5) Effektoren für die Therapie von zellmediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel - IL-6
- IL-9
- IL-10
- IL-13
- TNFα oder TNFß
- IL-13
- einen immunsuppressiven Antikörper oder dessen VH- und VL-enthaltende Fragmente
b.6) Effektoren: Inhibitoren der Zellproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine und Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika Beispiele für derartige Proteine sind bereits im Abschnitt a.7) aufgeführt.
b.7) Effektoren für die Therapie der Arthritis
Im Sinne der Erfindung werden Effektoren ausgewählt, die die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmen und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördern.
Hierzu gehören zum Beispiel
- IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1-RA); IL-1-RA inhibiert die Bindung von IL-1α, ß
- löslicher IL-1 -Rezeptor; löslicher IL-1 -Rezeptor bindet und inaktiviert IL-1
- IL-6
IL-6 erhöht die Sekretion von TIMP und Superoxiden und vermindert die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und Chondrozyten
- löslicher TNF-Rezeptor löslicher TNF-Rezeptor bindet und inaktiviert TNF.
- IL-4
IL-4 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1 , TNFα und MMP - IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1 , TNFσ und MMP und erhöht die Sekretion von TIMP
- Insulin-like growth factor (IGF-1 )
IGF-1 stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
- TGFß, im speziellen TGFßl und TGFß2
TGFß stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
- Superoxiddismutase
- TIMP, im speziellen TIMP-1 , TIMP-2 oder TIMP-3
c) Therapie der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes c.1 ) Zielzelien:
- proliferierende, unreife Zellen des blutbildenden Systems oder
- Stromazellen benachbart den blutbildenden Zellen
c.2) Effektoren für die Therapie der Anämie, zum Beispiel
- Erythropoietin
c.3) Effektoren für die Therapie der Leukopenie, zum Beispiel
- G-CSF
- GM-CSF
- M-CSF
c.4) Effektoren für die Therapie der Thrombozytopenie, zum Beispiel
- IL-3
- Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
- IL-11
- Thrombopoietin
d) Therapie von Schäden des Nervensystems d.1) Zielzellen:
- Gliazellen oder - proliferierende Endothelzellen
d.2) Effektoren: neuronale Wachstumsfaktoren, zum Beispiel
- FGF
- Nerve growth factor (NGF) Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
- Neurotrophin-3 (NT-3)
- Neurotrophin-4 (NT-4)
- Ciliary neurotrophic factor (CNTF)
d.3) Effektoren: Enzyme, zum Beispiel
- Tyrosinhydroxylase
- Dopadecarboxylase
d.4) Effektoren: Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, zum Beispiel
- TGFß
- lösliche TNF-Rezeptoren TNF-Rezeptoren neutralisieren TNFα
- IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4
- lösliche IL-1 -Rezeptoren
- I L-1 -Rezeptor I
- I L-1 -Rezeptor II lösliche I L-1 -Rezeptoren neutralisieren die Aktivität von IL-1
- IL-1-Rezeptor-Antagonist
- lösliche IL-6-Rezeptoren
e) Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems e.1 ) Zielzellen:
- Endothelzellen oder - proliferierende Endothelzellen oder
- somatische Zellen in Nachbarschaft von Endothelzellen und glatte Muskelzellen oder
- Makrophagen
e.2) Zielstrukturen: Proteine des Blutgerinnungssystems wie beispielsweise
- Thrombin
- Fibrin
e.3) Effektoren für die Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der Fibrinolyse, zum Beispiel
- Tissue Plasminogen Activator (tPA)
- Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA)
- Hybride von tPA und uPA
- Protein C
- Hirudin
- Serin Proteinase Inhibitoren (Serpine), wie beispielsweise C-1 S-lnhibitor, α1-Antitrypsin oder Antithrombin III
- Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
e.4) Effektoren für die Förderung der Gerinnung, zum Beispiel
- F VIII
- F IX
- von Willebrand factor
- F XIII
- PAI-1
- PAI-2
- Tissue Factor and Fragmente hiervon
e.5) Effektoren: Angiogenesefaktoren, zum Beispiel
- VEGF - FGF
- Tie-1
- Tie-2
e.6) Effektoren für die Blutdrucksenkung, zum Beispiel
- Kallikrein
- Endothelzell "nitric oxide synthase"
e7) Effektoren für die Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen nach Verletzungen der Endothelschicht, zum Beispiel
- ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein oder
- ein Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika wie bereits oben (Abschnitt a.7) aufgeführt
e.8) Effektoren: weitere Blutplasmaproteine, zum Beispiel
- C1-lnaktivator
- Serum Cholinesterase
- Transferrin
- 1-Antritrypsin
f) Impfungen f.1 ) Zielzellen:
- Muskelzellen oder
- Makrophagen und/oder Lymphozyten
f.2) Effektoren für die Prophylaxe von Infektionserkrankungen
Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe herzustellen, sind beschränkt.
Als Effektor ist ein vom Infektionserreger gebildetes Protein, Glykoprotein oder Lipoprotein, auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d.h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T- Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als impfantigene bereits angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
Bevorzugt im Sinne der Erfindung werden Neutralisationsantigene folgender Erreger eingesetzt:
- Influenza A-Virus
- HIV
- Tollwut-Virus
- HSV (Herpes Simplex Virus)
- RSV (Respiratory Syncytial Virus)
- Parainfluenza-Virus
- Rotavirus
- VZV (Varizella Zoster Virus)
- CMV (Cytomegalo-Virus)
- Masern-Virus
- HPV (Humanes Papillomvirus)
- HBV (Hepatitis B-Virus)
- HCV (Hepatitis C-Virus)
- HDV (Hepatitis D-Virus)
- HEV (Hepatitis E-Virus)
- HAV (Hepatitis A-Virus)
- Vibrio Cholera-Antigen
- Borrelia Burgdorferi
- Helicobacter pylori
- Malaria-Antigen
- Zu Effektoren im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch ein Antiidiotyp- Antikörper oder seine Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementarity determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.
Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.
Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.
f.3) Effektoren: Tumorantigene
- Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen. Derartige Antigene wurden zum Beispiel von Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, München (1992)) übersichtlich dargestellt.
Weitere Beispiele stellen folgende Antigene bzw. für Antiidiotypantikörper korrespondierend mit folgenden Antigenen dar:
- Sialyl Lewis
- Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden
- von Onkogenen exprimierte Proteine
- Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
- Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
- Antigene auf Heat Shock Proteinen
g) die Therapie von chronischen Infektionserkrankungen g.1 ) Zielzelle:
- Leberzelle
- Lymphozyt und/oder Makrophage
- Epithelzelle - Endothelzelle
g.2) Effektoren beispielsweise
- ein Protein, welches zytostatische, apoptotische oder zytotoxische Wirkungen aufweist.
- ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen Substanz in die aktive Substanz spaltet.
g.3) Effektoren: antivirale Proteine
- antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise IFNα, IFNß, IFN-γ, TNFß, TNFα, IL-1 oder TGFß
- Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen VH und VL enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene VH und VL Fragmente herstellt wie bereits beschrieben.
Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise:
anti HBV anti HCV anti HSV anti HPV anti HIV anti EBV anti HTLV
Anti Coxsackie Virus anti Hantaan Virus
- ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus- Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:
RBP9-27 RBP1-8U RBP1-8D Pseudogene von RBP1-8
g.4) Effektoren: antibakterielle Proteine
Zu den antibakteriellen Proteinen gehören beispielsweise Antikörper, die bakterielle Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu Antikörper gegen
Meningokokken C oder B E. coli Borrelia Pseudomonas Helicobacter pylori Staphylococcus aureus
h) Kombination gleicher oder unterschiedlicher Effektoren
Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind zwei unterschiedliche Komponenten d), welche zumindest eine additive Wirkung aufweisen, über die Komponenten b) und c) miteinander zu komplexieren.
Im Sinne der Erfindung bevorzugt sind Kombinationen von Effektoren beispielsweise für
h.1 ) die Therapie von Tumoren
- gleiche oder unterschiedliche, zytostatische, apoptotische, zytotoxische und/oder entzündungserregende Proteine oder
- gleiche oder unterschiedliche Enzyme für die Spaltung der Vorstufe eines Zytostatikums h.2) die Therapie von Autoimmunerkrankungen
- unterschiedliche Cytokine oder Rezeptoren mit synergistischer Wirkung zur Hemmung der zellulären und/oder humoralen Immunreaktion oder
- unterschiedliche oder gleiche TIMPs
h.3) die Therapie von mangelhafter Bildung von Zellen des Blutes
- unterschiedliche, hierarchisch aufeinanderfolgende Cytokine, wie beispielsweise IL-1 , IL-3, IL-6 oder GM-CSF und Erythropoietin, G-CSF oder Thrombopoietin
h.4) die Therapie von Nervenzellschäden
- ein neuronaler Wachstumsfaktor und ein Cytokin oder der Inhibitor eines Cytokins
h.5) die Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems
- ein Antithrombotikum und ein Fibrinolytikum (z.B. tPA oder uPA) oder
- ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein und ein Antithrombotikum oder ein Fibrinolytikum
- mehrere unterschiedliche, synergistisch wirkende Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise F VIII und vWF oder F VIII und F IX
h.6) Impfungen
- ein Antigen und ein immunstimulierendes Cytokin, wie beispielsweise IL- 1α, IL-1 ß, IL-2, GM-CSF, IL-3 oder IL-4 Rezeptor
- unterschiedliche Antigene eines Infektionserregers oder unterschiedlicher Infektionserreger oder
- unterschiedliche Antigene eines Tumortyps oder unterschiedlicher Tumortypen
h.7) Therapie von viralen Infektionserkrankungen - ein antivirales Protein und ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein
- Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene eines Virus oder mehrere Viren
h.8) Therapie von bakteriellen Infektionserkrankungen
- Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene und/oder Toxine eines Keimes
4. Multifunktioneller Ligand für virale und nichtvirale Vektoren zur Gentherapie
Multifunktionelle Liganden wurden bereits in der Patentanmeldung EP-A 0 846 772 ausführlich beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird ausdrücklich Bezug genommen.
Bei Verwendung als multifunktioneller Ligand ist eine Komponente a) auszuwählen, welche gegen eine zelluläre Zielstruktur gerichtet ist. Beispiele für Liganden (Komponente a) spezifisch für zelluläre Zielstrukturen sind im Abschnitt 3) bereits aufgeführt worden.
In einem multifunktionellen Liganden ist der Effektor (Komponente d) so auszuwählen, daß er an einen viralen Vektor oder an einen nichtviralen Vektor bindet. Derartige Effektoren sind beispielsweise:
- ein zellulärer Rezeptor für ein Virus, wie beispielsweise für AdV, AAV, ein Lentivirus, ein RTV, Vacciniavirus, HSV, Influenzavirus, HJV
- ein rekombinanter Antikörper spezifisch für ein Virusprotein, für einen nichtviralen Vektor oder für eine Nukleinsäure, wie beispielsweise ein IgG, F(ab)2> Fab, rec. Fv, Diabody oder einzel kettiges, doppelantigenbindendes Protein
- ein Peptid mit einer reaktiven Gruppe zur Konjugation an ein Virusprotein
- ein Peptid mit Bindeaffinität zu einer definierten Nukleinsäuresequenz Bevorzugterweise stellt die Komponente d) ein ganzes Antikörpermolekül oder ein Epitop-bindendes Fragment eines humanen Antikörpers dar.
Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991 )) und Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente und rekombinante Fv-Fragmente werden entsprechend dem Stand der Technik, und wie bereits beschrieben, hergestellt.
Ob ein bivalentes oder ein monovalentes Fragment Verwendung findet, ist von der Wahl der Antikörperspezifität und des Genkonstruktes abhängig. Wenn der gewählte Antikörper die Fusionsaktivität des Hüllproteins eines viralen Genkonstruktes beeinträchtigt (wie z.B. von Ubol et al. (J. Virol. 69 1990 (1995)) beschrieben), so ist ein monovalentes Antikörperfragment zu bevorzugen.
Die Spezifität des Antikörpers richtet sich nach der Art des verwendeten Genkonstruktes.
- Ist das Genkonstrukt ein nackte RNA oder eine nackte DNA alleine oder im Komplex mit einem nichtviralen Träger, so ist eine der erfindungsgemäßen Ausführungsformen dieser Erfindung, daß die Spezifität des Antikörpers gerichtet ist gegen solche Epitope, welche in die DNA eingeführt wurden.
Derartige Epitope können erzeugt werden durch Bindung von xenogenen Substanzen an die DNA. Beispiele hierfür sind
* Kreuzvernetzungen der DNA durch Cisplatin
* Alkylierung am N7 von Guanin durch Alkylantien wie Nitrogen-Mustard, Melphalan, Chlorambucil
* Interkalation in die Doppelhelix der DNA von Anthracyclinen wie Doxorubicin, Daunomycin Monokionale Antikörper gegen derartige neu eingeführte Epitope auf der DNA sind beispielsweise:
- Antikörper gegen methylierte DNA
- Antikörper gegen O6-ethyl deoxyguanosin (nach Behandlung der DNA mit Ethylnitrosoharnstoff)
- Antikörper gegen N7-ethylguanin
- Antikörper gegen N5-methyl-N5-formyl-2,5,6-triamino-4-hydroxy pyrimidine
- Antikörper gegen 06-methyl-2'-deoxyguanosin
06-ethyl-2'-deoxyguanosin
O6-n-butyl-2'-deoxyguanosin
O6-isopropyl-2'-deoxyguanosin
O4-methyl-2'-deoxythymidin
O4-ethyl-2'-deoxythymidin
- Antikörper gegen Melphalan Addukte mit DNA
- Antikörper gegen Anthracycline
Neue Epitope in die DNA entstehen jedoch auch durch Methylierung der DNA im Rahmen des DNA-Stoffwechsels.
Von einer Reihe von E. coli Stämmen ist bekannt, daß sie die DNA der in sie eingeführten Plasmide am N6 des Adenins methylieren (Winnacker, From Genes to Clones, page 18/19, VCH Publisher, Weinheim (1987)). Bakterien besitzen das Enzym DNA-Adenin-Methylase, das während der Replikation spezifisch Adenine an der N6-Position methyliert (Hartman et al., J. Mol. Biol. 126, 367 (1978)).
Ein besonderer Gegenstand dieser Erfindung ist somit die Verwendung vom monoklonalen Antikörpern gegen methylierte DNA - im besonderen gegen methyliertes N6 des Adenins - im erfindungsgemäßen Ligandensystem. Ist das Genkonstrukt in Komplex mit einem nichtviralen Träger, so ist eine weitere besondere Ausführungsform dieser Erfindung, daß die Spezifität des Antikörpers gerichtet ist gegen ein Epitop auf dem Träger.
Zu diesen Trägern gehören kationische Polymere, Peptide, Proteine, Polyamine oder kationische Lipide wie beispielsweise kationische Lipide und Phospholipide. Beispiele für Antikörper gegen derartige Träger sind
* Antikörper gegen Spermidin, Spermin oder Putrescin
* Antikörper gegen Polylysin
* Antikörper gegen Albumin
* Antikörper gegen Phospholipid
* Antikörper gegen Polyethylenimin
Ist das Genkonstrukt ein Virus, so ist die Spezifität des Antikörpers gerichtet gegen ein oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Epitope auf den Hüllproteinen des Virus. Da der Linker im verwendeten Ligandensystem bevorzugterweise ein fusiogenes Peptid oder Protein darstellt, können auch Antikörper verwendet werden, welche durch Bindung an das Hüllprotein die Zelladhäsion und/oder die fusiogene Aktivität des Virus beeinträchtigen.
Antikörper gegen Hüllproteine von Viren, die als Vektoren Verwendung finden können, sind beispielsweise Antikörper gegen das
* murine Leukämie Virus
* HIV-Virus
* Adenovirus
* Herpes Simplex Virus
* Cytomegalovirus
* Minute Virus of mice
* adenoassoziiertes Virus
* Sindbis-Virus * Vaccinia Virus
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt die Komponente d) den zellexternen Teil eines Fc-Rezeptors dar. An diesen Fc-Rezeptor bindet über sein Fc-Teil einer der bereits erwähnten Antikörper, welcher mit seinem antigenbindenden Teil direkt oder indirekt an das Genkonstrukt bindet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Komponente d) eine kationische Struktureinheit, wie beispielsweise eine kationische Aminosäure, ein kationisches Peptid oder Protein oder ein biogenes Amin dar, welche mit dem Genkonstrukt komplexieren können.
Zu diesen kationischen Struktureinheiten gehören beispielsweise:
- Lysin oder Polylysin
- Arginin oder Polyarginin
- Histidin oder Polyhistidin
- Peptide enthaltend mindestens 1 Lysin, 1 Arginin und/oder 1 Histidin
- Polyamine wie beispielsweise Cadaverin, Spermidin, Spermin, Agmatin oder Putrescin
In einer weiteren bevorzugen Ausführungsform stellt die Komponente d) den Rezeptor für das Hüllprotein des das Transgen beherbergenden Virus dar.
Derartige Rezeptoren sind beispielsweise für folgende Viren beschrieben worden:
- HIV
* das CD4-Molekül (löslich oder nativ)
* Galactosylceramid
* Rezeptoren für Chemokine
- HBV
* der IL-6 Rezeptor * Annexin oder Apolipoprotein
- HTLV
* der IL-2 Rezeptor (die ß- wie auch die γ-Kette)
- Masern Virus
* das CD46 Molekül
- Friend Leukemia Virus
* der Erythropoietin Rezeptor
- Varizella Zoster
* das Fc-Fragment von humanem Immunglobulin G
- Sendai Virus
* das Glycophorin
- Influenza C-Virus
* die N-acetyl-9-acetamido-9-deoxy-neuraminsäure
* die 9-ß-acetyl-N-acetyl-neuraminsäure
- Foot and Mouth Disease Virus
* das integrin αVß3
- EBV
* der Complement Rezeptor 2 (CD21 )
- Herpes Simplex Virus
* der 275-kDa Mannose-6-Phosphat-Rezeptor oder der 46-kDa Mannose-6- Phosphat-Rezeptor
- adenovirales Virus
* der CAR (Cocksackie-Adenovirus-Rezeptor)
5. Einfügung eines fusiogenen Peptids oder eines Translokalisationspeptids
Bei multivalenten Proteinkomplexen, bei denen der Effektor (Komponente d) intrazellulär einzudringen hat, um prophylaktisch oder therapeutisch zu wirken oder die als multifunktionelle Liganden einen Vektor in das Zytoplasma einer Zelle einführen sollen, ist dem Effektor ein fusiogenes Peptid anzufügen. Dieses fusiogene Peptid kann zwischen der Komponente c) und d) eingefügt oder der Komponente d) angefügt werden. Zu den fusiogenen Peptiden gehören beispielsweise:
- Peptide enthaltend die Translokationsdomäne (Domäne II) des Exotoxins A von Pseudomonas
- Peptide enthaltend das Peptid GLFEALLELLESLWELLLEA (SEQ ID NO.: 1)
- Peptide enthaltend das Peptid
- AALAEA[LAEA]4LAAAAGC (SEQ ID NO.: 2)
- Peptide enthaltend das Peptid FAGV-VLAGAALGVAAAAQI (SEQ ID NO.: 3) des Fusionsproteins des Masern-Virus
- Peptide enthaltend das Peptid GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG (SEQ ID NO.: 4) des HA2 Proteins von Influenza A
- Peptide enthalten das Peptid GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG (SEQ ID NO.: 5) oder das Peptid
GLFGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 6)
ALFGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 7)
LFLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 8)
LLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 9)
LILGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 10)
GIFGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 11 )
GLLGAIAGFIE; (SEQ ID NO. 12)
GLFAAIAGFIE; (SEQ ID NO. 13)
GLFEAIAGFIE; (SEQ ID NO. 14)
GLFGAM/ÄGFIE; (SEQ ID NO. 15)
GLFGAIAGLIE; (SEQ ID NO. 16)
GLFGAIAGFJV; (SEQ ID NO. 17) GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG (SEQ ID NO.: 18) oder GLLEALAELLEGGWEGLLEG (SEQ ID NO.: 19).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden desweiteren Proteine von Viren verwendet, welche fusiogene Eigenschaften haben. Eine Reihe von Viren besitzt fusiogene und/oder translozierende Hüllproteine, so beispielsweise Paramyxoviren, Retroviren und Herpesviren. Hierzu gehören beispielsweise das TAT-Protein von HIV oder dessen translokalisierende Aminosäuresequenz oder das VP22-Protein von HSV.
Eine Reihe von Viren besitzen des weiteren Glykoproteine, die verantwortlich sind sowohl für die Virusanheftung als auch nachfolgend für die Zellmembranfusion (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)).
Derartige Proteine werden beispielsweise von Alpha-, Rhabdo- und Orthomyxoviren gebildet.
Virale fusiogene Proteine im Sinne der Erfindung wurden übersichtlich beschrieben von Hughson (Curr. Biol. 5, 265 (1995)), Hoekstra (J. Bioenergetics Biomembranes 22, 675 (1990)), und White (Ann. Rev. Physiol. 52, 675 (1990)).
Fusiogene Proteine im Sinne dieser Erfindung sind beispielsweise:
- das Haemagglutinin von Influenza A- oder B-Viren, insbesondere die HA2-Kom- ponente
- das M2-Protein von Influenza A-Viren alleine oder in Kombination mit dem Haemagglutinin des Influenza-Virus eingesetzt oder mit Mutanten von Neuraminidase von Influenza A, denen die Enzymaktivität fehlt, die jedoch Haemagglutination bewirken.
- Peptidanaloga des Influenza-Virus Haemagglutinins
Figure imgf000053_0001
6. Einfügung von Proteasespaltsequenzen
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren multifunktionelle Proteinkomplexe, welche zwischen der Komponente a) und b) oder zwischen der Komponente c) und d) eine Peptidsequenz besitzen, welche für Proteasen spaltbar ist. Durch diese Proteasen kann der Effektor von dem Liganden (Komponente a) oder von dem Liganden und den mutierten Proteinen [Komponenten a), b) und c)] abgespalten werden und beispielsweise am Ort der Anreicherung der multivalenten Proteinkomplexe in freier Form seine Wirkung entfalten.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Spaltsequenzen, weiche durch Proteasen, die in Tumoren oder von Tumorzellen oder von Entzündungszellen gebildet werden, gespalten werden.
Beispiele von Spaltsequenzen für die Enzyme
- Plasminogenaktivator
- prostataspezifisches Antigen
- Cathepsin
- Stromelysin
- Collagenase und
- Plasminogen sind in der Patentanmeldung EP-A 0 859 058 aufgeführt, auf weiche ausdrücklich Bezug genommen wird.
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren multivalente Proteinkomplexe mit Spaltsequenzen, welche von Proteasen, die von Viren gebildet werden, gespalten werden.
Beispiele von Spaltsequenzen für Enzyme von Retroviren, Polioviren, Influenzaviren, Epstein-Barr Viren, Herpes Simplex Viren, Hepatitisviren, Pockenviren, Cytomegalieviren und Dengue Viren sind in der deutschen Patentanmeldung DE 198 50987.1 (nicht veröffentlicht) aufgeführt, auf weiche ausdrücklich Bezug genommen wird.
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren multivalente Proteinkompiexe mit Spaltsequenzen, welche von Proteasen, die in der Zelle freigesetzt werden können, gespalten werden.
Beispiele von derartigen Proteasen sind beispielsweise Caspasen, wie Caspasen 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 9.
Die zugehörigen Spaltsequenzen sind in der Patentanmeldung DE 198 50987.1 (nicht veröffentlicht) aufgeführt, auf weiche ausdrücklich Bezug genommen wird.
7. Künstliche Transkriptionsfaktoren für die Kontrolle der Expression von Genen
In der Patentanmeldung EP-A 0 805 209 sind aktivatorresponsive Promotoren beschrieben worden. Auf diese Erfindung wird in dieser Erfindung ausdrücklich Bezug genommen. Diese aktivatorresponsiven Promotoren werden durch einen künstlichen Transkriptionsfaktor aktiviert, welcher im Prinzip aus zwei Aktivatorsubeinheiten besteht: die Subeinheit A und die Subeinheit B. Beide Subeinheiten enthalten Bindeproteine (A, B). In der EP-A 0 805 209 wurden Bindeproteine (A, B) ausgewählt, welche natürlicherweise den Komplex AB bilden, so daß die Subeinheit A sich mit der Subeinheit B zu einem funktionsfähigen Transkriptionsfaktorkomplex verbindet. Gegenstand der Erfindung sind nunmehr künstliche Transkriptionsfaktoren für aktivatorresponsive Promotoren, bei denen die Bindeproteine A+B mutierte Bindeproteine darstellen.
In der einfachsten Form besteht dieser künstliche Transkriptionfaktorkomplex aus folgenden Komponenten:
Komponente a) mindestens einem Liganden für einen Reaktionspartner =
Aktivierungsdomäne Komponente b) ein Bindeprotein derartig mutiert, daß es sich ausschließlich mit der Komponente c) verbindet
Komponente c) ein Bindeprotein derartig mutiert, daß es sich ausschließlich mit der Komponente b) verbindet
Komponente d) mindestens einen Effektor = eine DNA-Bindedomäne
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren Nukleinsäurekonstrukte, welche für einen Transkriptionsfaktorkomplex entsprechend dieser Erfindung kodieren. Die Expression dieses Nukleinsäurekontruktes steht hierbei unter der Kontrolle von Promotoren wie in der Patentanmeldung EP-A 0 805 209 aufgeführt, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.
8. Neue analytische und diagnostische Systeme
Gegenstand der Erfindung sind neue komplexbildende Proteine für analytische oder diagnostische Systeme zur qualitativen oder quantitativen Analyse oder Diagnose eines Reaktionspartners.
In solchen diagnostischen Systemen stelle die Komponente a) mindestens einen Liganden dar, welche eine spezifische Bindung mit dem zu analysierenden Reaktionspartner eingeht. Dieser Ligand ist direkt oder indirekt verbunden mit mindestens einem mutierten Bindeprotein [ Komponenten b)1-b)n], so daß sich die Komponente ab ergibt. Des weiteren ist mindestens ein mutiertes Bindeprotein [Komponente c)1-c)n], welches mit der Komponente b) über mindestens zwei Bindestellen dimerisieren kann, verbunden mit mindestens einem Effektor (Komponente c), wobei dieser Effektor eine signalgebende Substanz (Analyten) darstellt. Aus der Verbindung der Komponente b) mit der Komponente c) ergibt sich die Komponente cd.
Die Komponente ab bindet über a) an den Reaktionspartner. Durch Komplexbildung der Komponente ab mit der Komponente bc läßt sich die Menge des Reaktionspartners, an welchen die Komponente ab über Komponente a) gebunden ist, ermitteln.
Dieses diagnostische System kann beispielsweise in den zwei aufgeführten Ausführungsformen (siehe Figur 1 und 2) verwendet werden:
In der ersten Ausführungsform (siehe Figur 1 ) stellt die Komponente b) ein Homo- (oder Hetero-)multimer dar [Komponente b)1-b)n], an welche viele gleiche (oder unterschiedliche) Komponenten c) jeweils als Monomer und jeweils verbunden mit der Komponente d) binden.
Mit dieser Ausführungsform werden viele signalgebende Komponenten [Analyten, Komponente d)] an den zu analysierenden Reaktionspartner gebunden, was die Empfindlichkeit des Systems steigert.
In der zweiten Ausführungsform (siehe Figur 2) stellen sowohl die Komponente b) als auch die Komponente c) Multimere dar, wobei an die Komponente c) nur eine oder wenige Komponenten d) gebunden sind. Mit dieser Ausführungsform werden zwar nur wenige Komponenten d) an den zu analysierenden Reaktionspartner gebunden, aber die Bindung zwischen den Komponenten c) und d) ist außerordentlich stark, was die Spezifität des Nachweises von dem zu analysierenden Reaktionspartners erhöhen kann.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die Komponente c) [ci-cn] mit mindestens einer weiteren Komponente b [b bn] gebunden, an welche mindestens eine weitere Komponente cd dimerisieren kann. Ein Beispiel hierfür ist in Figur 1 b dargestellt.
Diese besondere Ausführungsform steigert die Empfindlichkeit des Testsystems beträchtlich. Mit Hilfe dieses erfindungsgemäßen analytischen oder diagnostischen Systems kann ein Reaktionspartner in oder auf einer festen Phase, in einer Flüssigkeit, beispielsweise in einer Körperflüssigkeit, auf Zellen und in Geweben bestimmt werden.
Gemäß der Erfindung kann die Komponente a) darstellen:
- eine Nukleotidsequenz. Bei Wahl einer Nukleotidsequenz ist diese endständig so zu derivatisieren [beispielsweise entsprechend WO95/02422 oder durch Einfügung einer Bindesequenz für ein Nukleotidbindeprotein (wie beispielsweise für LexA, Gal4 oder für einen Transkriptionsfaktor) oder für einen Antikörper, daß an sie direkt oder indirekt über ein Nukleotidbindeprotein oder über einen antigenbindenden Teil eines Antikörpers die Komponente b) gekoppelt werden kann.
- einen Liganden für einen zellulären Rezeptor
- ein Virushüllprotein
- einen zellulären Rezeptor für ein Virushüllprotein
- einen zellulären Rezeptor für einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, ein Chemokin, ein Peptidhormon, einen Mediator oder ein Steroid
- ein Protein, welches sich mit einem Partnerprotein verbindet und hierdurch an einer biologischen Reaktionskette teilhat, beispielsweise ein Komplementfaktor, ein Gerinnungsfaktor, ein Faktor des Kininsystems, des Fibrinolysesystems oder ein plasmatischer oder zellulärer Enzyminhibitor oder ein plasmatisches oder zelluläres Enzym
- den extrazellulären Teil eines Fc-Rezeptors, an welchem ein Antikörper spezifisch für eine Zielzelle über seinen Fc-Teil gebunden wird
- ein Antikörpermolekül oder der epitopbindende Teil eines murinen oder humanen Antikörpermoleküls.
Rekombinante Antikörperfragmente werden hergestellt wie bereits in Abschnitt 3) aufgeführt. In einem analytischen oder diagnostischen System gemäß der Erfindung kann die signalgebende Komponente, der Analyt (Komponente d) beispielsweise darstellen ein fluoreszierendes Molekül, ein Molekül, welches eine Chemolumineszenzreaktion auslöst, ein Enzym, wie beispielsweise eine Phosphatase oder Peroxydase zur Spaltung eines zu messenden Substrates, ein Isotop oder ein Metall.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen analytischen und diagnostischen Systems wird ein zu bestimmender Reaktionspartner vermischt mit einem Überschuß der Komponente ab. Der nicht an den zu bestimmenden Reaktionspartner gebundene Anteil von Komponente ab wird beispielsweise durch Waschen entfernt. Nachfolgend wird die an den Reaktionspartner gebundene Komponente ab mit einem Überschuß von Komponente cd versetzt, der nicht an die Komponente ab gebundene Anteil der Komponente bc beispielsweise durch Waschen entfernt und die an den Reaktionspartner über die Komponenten ab und c) gebundene Komponente d) bestimmt.
Beispiele zur Verdeutlichung des Erfindungsgegenstandes
Herstellung und Prüfung einer Aktivator-responsiven Promotoreinheit
Es wurde eine Aktivator-responsive Promotereinheit hergestellt, bei welcher sich eine Aktivatorsubeinheit A mit einer Aktivatorsubeinheit B (siehe Figur 3) verbindet. Die Verbindung erfolgt über mutiertes c-jun und mutiertes c-fos (siehe Figur 4). Der Komplex ist ein Transkriptionsfaktor, welcher einen Aktivator-responsiven Promoter aktiviert.
Diese erfindungsgemäße Aktivator-responsive Promotereinheit besteht aus folgenden unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen: Aktivatorsubeinheit A:
- der Promoter des Cyclin A Gens (Nukleinsäuren -214 bis +100; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995))
- dem nuklearen Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 Large T, Aminosäuren 126-132; PKKKRKV (SEQ ID NO.: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991 ))
- der sauren Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (VP16, Aminosäuren 411 bis 455; Triezenberg et al., Genes Dev. 2, 718 (1988))
- der cDNA für den leucine Zipper Teil des c-jun Proteins (Aminosäuren 276 bis 312; Mark et al., Nature 373, 257 (1995)) in dem die Aminosäuren 283, 288 und 302 mutiert sind (m-jun).
Beschreibung der Mutationen (Figur 2): Aminosäure 283 K → E Aminosäure 288 K → E Aminosäure 302 R → E
Aktivatorsubeinheit B:
- der Promoter des Tyrosinase Gens (2X die Enhancer Sequenz, Nukleinsäuren -2014 bis -1820 und der Kernpromotor Nukleinsäuren -209 bis +51 ; Shibata et al., J. Biol: Chem. 267, 20584 (1992))
- dem nuklearen Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 Large T, Aminosäuren 126-132; PKKKRKV (SEQ ID NO.: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991 ))
- der cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4 Proteins (Aminosäuren 1 bis 147, Chasman und Kornberg , Mol. Cell. Biol. 10, 2916 (1990))
- der cDNA für den leucine Zipper Teil des c-fos Proteins (Aminosäuren 160 bis 196; Mark et al., Nature 373, 257 (1995)) in dem die Aminosäuren 167, 172 und 181 mutierten sind (m-fos).
Beschreibung der Mutationen (Figur 2): Aminosäure 167 E → K Aminosäure 172 E → K Aminosäure 181 E → K
Dimerisierung von mutiertem c-fos mit mutiertem c-jun
Die Expressionsprodukte der Aktivatorsubeinheiten A und B dimerisieren durch Bindung des mutierten c-fos leucine Zipper an den mutierten c-jun leucine Zipper.
Die Dimerisierung der Aktivatorsubeinheiten A und B, d.h. die Bindung des mutierten c-fos leucine Zipper an den mutierten c-jun leucine Zipper, wurde wie folgt geprüft:
Die Proteine wurden in einem "in vitro transiation" System (TNT T7 quick coupled transcription/translation System, Promega, Madison, Wl) mit oder ohne (S35)- Methionin synthetisiert. Nachfolgend wurden die synthetisierten Proteine (m-jun- VP16 und m-fos-Gal4) im Verhältnis 1 :1 vermischt und die Komplexe gelelektrophoretisch getrennt und nach Immunpräzipitation mit einem Antikörper anti-GAL4 analysiert. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
- Das Protein m-jun-VP16 kann sich mit dem Protein m-fos-GAL4 verbinden.
- Das Protein m-jun-VP16 kann sich nicht mit dem Protein wt-fos-GAL4 und das Protein wt-jun-VP16 kann sich nicht mit dem Protein m-fosGAL4 verbinden (siehe Tabelle 1 ).
Das dimere Protein stellt einen Chimären Transkriptionsfaktor für den Aktivator- responsiven Promotor 10x (Gal4-SV40) dar.
Aktivator-responsiver Promotor und das Effektorsystem
Der Aktivator-responsive Promotor hat folgende Zusammensetzung: - 10x die Bindesequenz für Gal4-Bindeprotein mit der Nukleotidsequenz 5'- CGGAGTACTGTCCTCCG-3' (Webster et al., Cell 52, 169 (1988); SEQ ID NO.:21)
- der basale Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191 ; Tooze (Ed). DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory))
- die cDNA für das Reportergen Luciferase (Luc) (Nordeen, BioTechniques 6, 454 (1988))
Die Reihenfolge der Nukleotidsequenzen und deren Aktivierungseinheiten ist in Figur 5 dargestellt.
Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in den pGL3 Plasmidvektor (Promega; Madison, USA) einkloniert, die direkt oder in kolloidalen Dispersionssystemen für eine in vivo Applikation genutzt wird.
Die Funktionsweise der gesamten Aktivator-responsiven Promotoreinheit ist wie folgt:
Der Promotor Cyclin A reguliert zellzyklusspezifisch die Transkription der kombinierten cDNAs für die Aktivierungsdomäne von VP16 und den mutierten leucine Zipper von c-jun (Aktivierungsuntereinheit A) (Fig. 3)
Der Promotor Tyrosinase beschränkt die Transkription der kombinierten cDNAs für die Gal4-Bindungsdomäne, das NLS von SV40 und den mutierten leucine Zipper von c-fos auf Melanomzellen (Aktivierungsuntereinheit B) (Fig. 3).
Das dimere Protein stellt einen Chimären Transkriptionsfaktor für den Aktivator- responsiven Promotor (DNA-Sequenz für die Gal4-Bindedomäne/SV40 Promotor) und für die Transkription des Effektorgenes (= Reportergen = Luciferasegen) dar (Fig. 5). Die Herstellung des Konstruktes
Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes und die Einfügung in ein Plasmid (pGL3, Promega, Madison Wi USA) (Figur 6) erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen Enzyme und DNA-Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu erwerben.
Mit den beschriebenen Plasmiden werden in Kultur gehaltene Tumorzellen (MeWo: Humanmelanom Zellen, PC3: Humanprostata Zellen) mit dem Fachmann bekannter Methode DOTAP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) transfiziert und die Menge an Luciferase produziert von den Zellen gemessen (Herber et al. , Oncogene 9, 1295 (1994); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) und Jeröme et al., Hum. Gen. Ther., im Druck (1998)).
Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden die Tumorzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in G0/G1 synchronisiert. BrdU-Einbau zeigt , daß sich MeWo und PC3 Zellen nach Methionientzug synchronisieren lassen (Jeröme et al., Hum. Gen. Ther., in press (1998)).
Ergebnisse
Folgende Ergebnisse werden erzielt: in transfizierten MeWo und PC3 Zellen kann eine deutliche Zunahme der Luciferase im Vergleich mit nichttransfizierte Tumorzellen ermittelt werden (Tabellen 2 und 3).
Proliferierende MeWo (DNA>2S) bilden deutlich mehr Luciferase als in G0/G1 synchronisierte Tumorzellen (DNA = 2S) und als proliferierende PC3 Zellen (Tabellen 2 und 3).
Die Aktivatorsubeinheiten A und B, die mutierte leucine Zipper enthalten, können nicht mit den endogenen c-fos und c-jun binden (Tabelle 2).
Die Aktivatorsubeinheiten A und B, die mutierten leucine Zipper enthalten, sind durch die starke Bindung von dem mutierten c-fos leucine Zipper an den mutierten c- jun leucine Zipper wirksamer als das System mit CD4 und LCK (Tabelle 2), im Detail beschrieben in der Patentanmeldung EP-A 0 805 209.
Somit führt die beschriebene Aktivator-responsive Promotoreinheit zu einer zellspezifischen, zelizyklusabhängigen Expression des Gens Luciferase (Tabelle 4).
Weitere Ergebnisse mit dem Fos/jun-System
Die Aktivität des neuen komplexbildenden Proteins in Melanom- und Lungenkarzinomxenotransplantaten
Melanomxenotransplantate wurden durch intradermale Injektion von 106 MeWo- Zellen in Nacktmäuse eingebracht.
Lungenkarzinomxenotransplantate wurden durch subkutane Injektion von 2.107 H322-Zellen (H3 22, bronchoalveoläre Karzinome, menschliche ATCC Nr. CRL 5806) in Nacktmäuse eingebracht.
Wenn die Xenotransplantate eine Größe von 4 mm erreichten, wurden sie mit folgender Plasmidkombination in einer Trägerlösung von 5 % Glukose, 0,01 % Triton X100 intratumoral coinjiziert. Plasmidkombination:
- 6 ng des pRL-SV40 Vektors (Promega, Incorporated)
+ 30 μg des pGL3-Promotor-Vektors (Promega, Incorporated)
- 6 ng des pRL-SV40 Vektors (Promega, Incorporated)
+ 15 μg 10 x BS Gal4-SV40-luc + 15 μg des Tyr-m-fos-CycA-VP16
- 6 ng des pRL-SV40 Vektors (Promega, Incorporated)
+ 15 μg 10 x BS Gal4-SV40-luc + 15 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun.
Alle diese Plasmide wurden mit dem endofreien QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN Inc.) isoliert.
Der pRL-SV40-Vektor wurde als interne Kontrolle verwendet, um die Ergebnisse der verschiedenen Xenotransplantate zu standardisieren.
24 h nach der Injektion wurden die Mäuse getötet, die Tumoren wurden herauspräpariert und mechanisch zerkleinert, und die Luciferaseaktivität im Lysat wurde mit Hilfe des Dual-Luciferase Reportergen-Assay-Systems (Promega, Incorporated) gemessen. Die Ergebnisse wurden als Verhältnis der Leuchtkäfer- Luciferaseaktivität zur pRL-SV40-Aktivität angegeben und auf die Proteinkonzentration übertragen.
Ergebnisse (siehe Tabelle 5):
1. In beiden Xenotransplantattypen, dem Melanom- und dem Lungenkarzinom- xenotransplantat, führt der konstitutiv exprimierte Promotor SV40 (pGL3- Promotor-Konstrukt) zum Nachweis der Leuchtkäfer-Luciferaseaktivität.
2. In beiden Xenotransplantattypen wurde nach der Injektion von 15 μg 10xBS Gal4-SV40-luc + 15 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16 keine Leuchtkäfer- Luciferaseaktivität festgestellt.
3. Leuchtkäfer-Luciferaseaktivität wurde nur in Melanomxenotransplantaten nach der Injektion von 15 μg 10xBS Gal4-SV40-luc + 15 μg Tyr-m-fos-CycA- VP16-m-jun festgestellt. Das zeigt, daß das fos-jun-System eine selektive Expression der Luciferaseaktivität im Melanomxenotransplantat bewirkt.
Die durch das fos/jun-System gesteuerte Expression eines Effektorgens hat einen biologischen Effekt
Zur Analyse der Fähigkeit des fos/jun-Systems, eine biologische Wirkung hervorzurufen, wurde die Reportergen-Luciferase durch Bax cDNA (Oltvai et al., 1993) ersetzt. Um die transfizierten Zellen analysieren zu können, wurden die Zellen mit CMV-luc cotransfiziert. Eine große Menge Luciferase wurde konstitutiv exprimiert, die mit einem Luciferase-Assay leicht meßbar ist, so daß der Prozentsatz der überlebenden transfizierten Zellen berechnet werden kann.
Die MeWo (menschlichen Melanom-) und die H322 (bronchoalveolären Lungenkarzinom-) Zellinien wurden, wie vom Hersteller beschrieben, mit Lipofectin (Gibco BRL Inc.) bzw. DOTAP (Boehringer Mannheim Inc.) transfiziert. Die Zellen wurden mit den folgenden Plasmiden cotransfiziert: pCDNA3 (Invitrogen Inc.; Kontrolle): 1 ng CMV -luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA- VP16 + 1 μg pCDNA3
CMV-bax (Bax cDNA, kloniert in pCDNA3): 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos- CycA-VP16-m-jun + 1 μg CMV-bax
pBax (Kontrolle): 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16 + 1 μg pBax
10xBS Gal4-SV40-bax: 1 ng CMV-luc + 1 μg Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + 1 μg 10xBS Gal4-SV40-bax.
Die im Falle der Cotransfektion mit pCDNA3 und pBax (Kontrollplasmide,die keine Bax cDNA exprimieren) gemessenen Luciferasewerte wurden als 100 % Überleben der transfizierten Zellen angenommen.
48 h nach der Transfektion wurden die Zellen gesammelt und die Luciferaseaktivität wurde gemessen.
Ergebnisse (siehe Tabelle 6)
1. Wenn die Bax cDNA vom konstitutiven CMV-Promotor gesteuert wurde, ging der Prozentsatz der überlebenden transfizierten Zellen in beiden Zelltypen zurück, auf 9-10 % bei MeWo-Zellen und auf 32-36 % bei H322-Zellen.
2. Wenn die Bax cDNA durch den 10xBS Gal4-SV40-Promotor gesteuert wurde, betrug der Prozentsatz der überlebenden transfizierten Zellen 100 %, wenn die Me Wo-Zellen mit dem Kontrollplasmid (Tyr-m — fos-CycA-VP16) cotransfiziert wurden und ging auf 36 % zurück, wenn Tyr-m-fos-CycA-VP16- m-jun verwendet wurde. In den H3 22-Zellen betrug in beiden Fällen der Prozentsatz der überlebenden transfizierten Zellen 100 %. Diese Ergebnisse zeigten, daß die Aktivierung des fos-jun-Systems in Melanomen ausreicht, um einen biologischen Effekt (Zellabtötung) hervorzurufen, was bei Nicht-Melanomzellen nicht festzustellen ist.
Selektive Expression des fos-jun-Systems in Melanomen nach der Übertragung des Adenovirus
Die Tyr-m-fos-CycA-VP16, Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun und die 10 x BS Gal4-SV40- luc-Transkriptionskassetten wurden mittels baktierieller Rekombination, wie von He et al. (1998) beschrieben, in einem humanen E1/E3-deletierten Adenovirus (Serotyp 5) kloniert.
Die MeWo- und H322-Zellen wurden 6 Stunden lang entweder mit
AdTyr-m-fos-CycA-VP16+ AdlOxBS Gal4-SV40-luc oder mit
AdTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + AdlOxBS Gal4-SV40-luc
coinfiziert, und die Luciferaseaktivität wurde 48 h nach der Infektion gemessen. Die Aktivitäten in beiden Zellinien wurden mit den Ergebnissen verglichen, die mit AdSV40-luc (humanes E1/E3-deletiertes Adenovirus (Serotyp 5) mit einem SV40- Promotor (-138/+45), D.M. Nettelbeck, unveröffentlichte Daten) erzielt wurden.
Ergebnisse (siehe Tabelle 7):
In beiden Zellinien führte die Coinfektion mit dem Kontroll-Adenovirus (AdTyr-m-fos- CycA-VP16) zu einer schwachen Expression der Luciferaseaktivität, während eine hohe Aktivität, das 70-fache der mit AdSV40-luc gemessenen, nur in MeWo-Zellen nach der Infektion mit AdTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun festgestellt wurde.
Die selektive Expression des fos-jun-Systems in Melanomen wird nach der Übertragung des fos-jun-Systems auf einen Adenovirus-Vektor aufrechterhalten. Figurenlegende:
Fig. 1 : (a) Schematische Darstellung der neuen komplexbildenden
Proteine, Möglichkeit 1 (b) Variante der Möglichkeit 1
Fig. 2: Schematische Darstellung der neuen komplexbildenden Proteine,
Möglichkeit 2.
Fig. 3: Aktivatorresponsive Promotoreinheiten A und B gemäß den Beispielen.
Fig. 4: Mutationen von c-jun und c-fos gemäß den Beispielen.
Fig. 5: Der Aktivator responsive Promotor und das Effektorgen.
Fig. 6: Nukleinsäurekonstrukte zur Expression der erfindungsgemäßen komplexbildenden Proteine.
Tabelle 1
Protein-Protein-Interaktion nach Immunprecipitation
Figure imgf000070_0001
Tabelle 2
Luciferase Aktivitäten in MeWo Zellen
Figure imgf000071_0001
Tabelle 3
Luciferase Aktivitäten in PC3 Zellen
Figure imgf000072_0001
Tabelle 4
Zellspezifische, zelizyklusabhängige Expression des Luciferasegens
Figure imgf000073_0001
Tabelle 5
Luciferaseaktivitäten in Melanom- und Lungenkarzinomxenotransplantaten
Figure imgf000074_0001
Für Standardabweichung n = 5
Tabelle 6
Prozentsatz überiebender transfizierter Zellen bei MeWo- und H322-Zellen
Alle Zellen wurden mit 1 n CMV-luc als "Marker" der transfizierten Zellen cotransfiziert
Figure imgf000074_0002
Tabelle 7
Selektive Genexpression in Melanomen nach der Adenovirusübertragung
Figure imgf000075_0001

Claims

Patentansprüche:
1. Komplex aus nicht natürlich vorkommenden, spezifisch komplexbildenden Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Komponenten im Komplex enthalten sind:
a) mindestens ein für eine Zielstruktur spezifischer Ligand,
b) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente c) wechselwirken kann und die Komponente b) kovalent mit der Komponente a) verbunden ist,
c) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente b) wechseiwirken kann und die Komponente c) kovalent mit der Komponente d) verbunden ist, und
d) mindestens einen Effektor.
2. Komplex gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente a) ersetzt ist durch die Komponente d).
3. Komplex gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente d) ersetzt ist durch die Komponente a).
4. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich ein fusiogenes Peptid oder ein Translokalisationspeptid enthält.
5. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er zwischen den Komponenten c) und d) oder a) und b) eine Spaltsequenz für eine Protease enthält.
6. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand (Komponente a) ausgewählt is aus einer Gruppe enthaltend einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, TNF, ein Chemokin, ein Peptidhormon, ein Mediator, ein Steroidhormon, ein Vitamin, einen Komplementfaktor, einen Gerinnungsfaktor, einen Faktor des Kininsystems oder des Fibrinoiysesystems, ein plasmatisches oder zelluläres Enzym, einen plasmatischen oder zellulären Enzyminhibitor, eine Virushüllprotein, einen zellulären Rezeptor für einen der zuvor aufgeführten Proteine und Wirkstoffe, einen Antikörper, ein Antikörperspaltprodukt wie F(ab)2, ein einzelkettiges Fv, ein einzelkettiges, doppelantigenbindendes Molekül, ein Fc-Fragment, ein DNA-Bindeprotein, die DNA-Bindedomäne eines Transkriptionsfaktors und die Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors.
7. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten b) und c) von natürlich sich miteinander verbindenden Proteinen abgeleitet werden.
8. Komplex gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die natürlich sich miteinander verbindenden Proteine ausgewählt werden aus einer Gruppe von natürlichen Dimerisierungspartnern enthaltend:
Fos Jun oder Jun B oder Jun D
FRAU-1 Jun oder Jun B oder Jun D
FRAU-2 Jun oder Jun B oder Jun D
FOS-B Jun oder Jun B oder Jun D OCT-1 Jun oder Jun B oder Jun D
NFKB (p65) IKB
Ras RAF
CD4 p56LcK bcl-2 bad oder bax
Cyclin A cdkl
E2F DP
CD40 CD40L
Myc Max
Myc N Max
Myc L Max p105 (Rb1 ) AFF-2, E1A p107 (Rb2) E7, E2F oder Myc p130 E7, E2F oder Myc
CBL Gag
TRP TRP
Met Met
Myb p67 oder p160
VAV p67 oder p160
APC α- oder ß-Catenin
APC APC
VD Rezeptor h-(Retinoid x-Rezeptor)RXR α oder ß
T3 Rezeptor HRXR α oder ß
MyoD E12
E12 Id
E47 Id
HHSP90 Progesteron-Rezeptor
HHSP90 Glucocorticoid-Rezeptor
HHSP90 Mineralocorticoid-Rezeptor
HHSP90 Dioxinrezeptor
Dioxinrezeptor Amt HPS90 FKBP59 HSP90 Cyclosporin-bindendes Protein HPS90 Pp60v"src HSP70 HSF1 Heat shock Faktor 1 HSP70 HSF2 Heat shock Faktor 2
9. Komplex gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die natürlich sich miteinander verbindenden Proteine, der Helix-Loop-Helix/Leucin-Zipper Familie angehören.
10. Komplex gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutationen der Dimerisierungsdomänen der Komponenten b) und c) erfolgt sind durch Einführung von
- 3 - 18 Cysteinen in die jeweils zugrundeliegenden natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen;
- 3 - 24 basischen Aminosäuren in jeweils eine der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen und von 3 - 24 sauren Aminosäuren in jeweils die andere der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen;
- 3 - 24 hydrophoben Aminosäuren in jeweils eine der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen und von 3 - 24 aromatischen Aminosäuren in jeweils die andere der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen; und/oder
- 3 - 24 aromatischen Aminosäuren in jeweils eine der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen und von 3 - 24 aromatischen Aminosäuren in jeweils die andere der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen.
11. Komplex nach Anspruch 10, bei welchen die Komponenten b) und c) die mutierten Bindedomänen von c-fos und c-jun darstellen, wobei folgende Mutationen vorliegen:
c-fos Aminosäure 167E → K
172E → K
181 E → K c-jun Aminosäure 283K → E
288 K → E
302K → E
12. Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, daß die Komponente d) ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Inhibitoren der Zellproliferation, Apoptose induzierende Proteine, zytostatische oder zytotoxische Proteine, Gerinnung induzierende Faktoren, Angiogenese induzierende Faktoren, Angiogenese hemmende Faktoren, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Interleukine, Interferone, Komplementfaktoren, Gerinnungsfaktoren, Fibrinolyse induzierende Proteine, Peptidhormone, Mediatoren, bakterielle Proteine, Rezeptoren (für Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Interleukine, Interferone, Komplementfaktoren, Gerinnungsfaktoren, Fibrinolyse induzierende Proteine, Peptidhormone, Steroidhormone, Mediatoren oder Virushüllproteine), virale Antigene, parasitäre Antigene, Tumorantigene, Autoantigene, Gewebsantigene, Adhäsionsmoleküle, Antikörper oder Antikörperspaltprodukte wie F(ab)2, Fab, einzelkettiges Fv, einzelkettige doppelantigenbindende Proteine, Enzyme zur Umsetzung einer signalgebenden Komponente, Enzyme zur Überführung einer Vorstufe einer Wirksubstanz in eine Wirksubstanz, Fluoreszenzfarbstoffe, Isotope, metallbindende Proteine, eine DNA-Bindedomäne.
13. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, mangelhafter Bildung von Zellen des Blutes, Schäden des Nervensystems, Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems, Tumoren, viralen- und bakteriellen Infektionen und zur Herstellung eines Impfstoffes.
14. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Komplexierung mit einem viralen oder nicht viralen Vektor und zur zielzellspezifischen Einführung dieses Vektors in die Zelle eines Organismus oder einer Zellkultur.
15. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für den Nachweis eines Reaktionspartners in vitro oder in vivo.
16. Nukleinsäurekonstrukt kodierend für ein Protein nach Ansprüchen 1 bis 12.
17. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 16, kodierend für die Aktivatorsubeinheiten einer Aktivator-responsiven Promotoreinheit.
18. Wirtszelle enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß dem Anspruch 16 oder 17.
19. Wirtszelle gemäß Anspruch 18 ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend ein Bakterium, eine Hefe und eine Säugerzelle.
20. Verwendung einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 18 und 19 zur Herstellung der Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12.
21. Herstellung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) ein Protein des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit
Hilfe eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 16 oder 17 exprimiert wird, (b) ein weiteres, von dem unter (a) beschriebenen Protein verschiedenes Protein des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit Hilfe eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 16 oder 17 exprimiert wird,
(c) die Proteine aus den Schritten (a) und (b) isoliert und
(d) miteinander komplexiert werden.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7285635B2 (en) 2001-02-12 2007-10-23 Research Development Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
RU2319709C2 (ru) * 2001-07-17 2008-03-20 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Терапевтические агенты, содержащие проапоптозные белки
EA020171B1 (ru) * 2009-11-09 2014-09-30 Илья Валерьевич ТИМОФЕЕВ Слитый белок, содержащий фактор роста фибробластов или его фрагмент и рецептор фактора роста фибробластов или его фрагмент, и применение белка для лечения или профилактики заболеваний или состояний, связанных с патологией сосудов

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6346510B1 (en) * 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
CA2454048C (en) 2001-07-17 2011-05-03 Research Development Foundation Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins
KR100474114B1 (ko) * 2001-12-24 2005-03-08 대한민국 소 타일레리아병에 대한 면역원성이 증진된 융합단백질, 및 그의 제조방법 및 용도
US7906118B2 (en) * 2005-04-06 2011-03-15 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (DNL) technology
AU2003255250A1 (en) * 2002-08-08 2004-02-25 Insert Therapeutics, Inc. Compositions and uses of motor protein-binding moieties
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
JP4838722B2 (ja) 2003-10-24 2011-12-14 ゲンシア コーポレーション ポリヌクレオチドを送達する方法、及び送達用組成物
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
CA2576971A1 (en) * 2004-08-20 2006-03-02 Entremed, Inc. Compositions and methods comprising proteinase activated receptor antagonists
ES2325344B1 (es) * 2004-11-02 2010-06-09 Univ Madrid Autonoma Inhibidores de angiogenesis multifuncionales y multivalentes.
US20120283315A1 (en) * 2009-08-28 2012-11-08 Penn Marc S Sdf-1 delivery for treating ischemic tissue
RU2486918C1 (ru) * 2011-10-25 2013-07-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ стимулирования восстановления периферической иннервации тканей с помощью векторных конструкций
RU2538621C2 (ru) * 2013-05-08 2015-01-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ стимулирования восстановления иннервации тканей после травм и ишемии с помощью векторной конструкции
WO2022225267A1 (ko) 2021-04-19 2022-10-27 엠브릭스 주식회사 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체 및 이를 포함하는 항균 조성물
CN113150086B (zh) * 2021-04-22 2022-10-11 成都欧林生物科技股份有限公司 幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057133A (en) * 1992-11-24 2000-05-02 G. D. Searle Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production
DE19524720A1 (de) 1995-07-12 1997-01-16 Hoechst Ag Zellspezifische Gentherapie mit Hilfe eines neuen Promotors für den "Tissue Inhibitor of Metalloproteinasn-3"
GB9506466D0 (en) 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
DE19605274A1 (de) 1996-02-13 1997-08-14 Hoechst Ag Nukleinsäurekonstrukte für die zellzyklusregulierte Expression von Genen, derartige Konstrukte enthaltende Zellen sowie deren Verwendung zur Herstellung von Heilmitteln
DE19605279A1 (de) 1996-02-13 1997-08-14 Hoechst Ag Zielzellspezifische Vektoren für die Einschleusung von Genen in Zellen, Arzneimittel enthaltend derartige Vektoren und deren Verwendung
DE19617851A1 (de) * 1996-05-03 1997-11-13 Hoechst Ag Nukleinsäurekonstrukte mit Genen kodierend für Transportsignale
US6110698A (en) * 1996-05-31 2000-08-29 American Cyanamid Company Screen for ultraspiracle inhibitors
DE19710643A1 (de) 1997-03-14 1998-09-17 Hoechst Ag Der Promotor des cdc25B Genes und seine Verwendung in der Gentherapie

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7285635B2 (en) 2001-02-12 2007-10-23 Research Development Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
RU2319709C2 (ru) * 2001-07-17 2008-03-20 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Терапевтические агенты, содержащие проапоптозные белки
EA020171B1 (ru) * 2009-11-09 2014-09-30 Илья Валерьевич ТИМОФЕЕВ Слитый белок, содержащий фактор роста фибробластов или его фрагмент и рецептор фактора роста фибробластов или его фрагмент, и применение белка для лечения или профилактики заболеваний или состояний, связанных с патологией сосудов

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Publication number Publication date
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US20030054409A1 (en) 2003-03-20
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EP1144634A2 (de) 2001-10-17

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