WO1999038997A1

WO1999038997A1 - Method for measuring heparin cofactor ii activity and reagent kit

Info

Publication number: WO1999038997A1
Application number: PCT/JP1999/000291
Authority: WO
Inventors: Takashi Goto; Naomi Asahara; Akimasa Omizu; Yahiro Uemura
Original assignee: Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 1999-08-05
Anticipated expiration: 2000-07-30
Also published as: AU1983699A

Description

明細書

へパリンコファクタ一 IIの活性測定方法および試薬キット

技術分野

本発明はへパリンコファクタ一 II (以下、「HCII」という）の活性測定方法および HC II活性測定用試薬キッ卜に関する。

背景技術

HCIIは、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE) により求めた分子量が約 72 kD aの一本鎖の血漿糖蛋白質であり、その cDNAの塩基配列も既に同定されている（J. Biol. Chem., 257, 2162-2169， 1982;

Nucleic Acids Res., 14, 1073-1088, 1986 ) 。 H C IIの生理作用は十分解明されていないが、トロンビンを特異的に阻害する抗凝固物質の 1つである。血中で抗トロンビン作用を有する他の蛋白質としては、主にアンチトロンビン III (以下「AT— III」という。）が知られているが、 HCIIは AT— III とは作用部位が異なり、血管内皮細胞上よりも血管内皮細胞下の血管中膜におけるトロンビン阻害物質として機能していると考えられ、血流異常を生じる各種疾患をはじめ、敗血症や各種臓器障害、各種炎症などの疾患の予防および治療への適用可能性が示唆されている（特開平 9一 1 76040号公報）。

このように、 HCIIは生体内で重要な役割を果しており、血漿などの検体中に含まれる HCIIを正確に定量できる測定方法が必要である。 HCIIの活性は、 A T一 III測定系を用いて、へパリン存在下でトロンビン阻害活性として求められる。しかしながら、この方法では検体中に AT— IIIが混在している場合、 AT -III のトロンビン阻害活性も HCII活性として測定されるため、測定値が実際の HCII活性より高い値となる。

発明の開示

本発明の目的は、妨害物質である AT— III の影響が抑制された、精度のよい H C IIの活性測定方法を提供することである。

また本発明の目的は、上記 HCIIの活性測定方法で使用される試薬キットを提供することである。

本発明者らは、 AT— III は S— S結合を有するが、 HCIIには S— S結合がないことに着目し、還元剤で S— S結合を切断することにより AT— III を選択的に不活性化し、 HCIIのみのトロンビン阻害活性を測定する方法を見いだし、本発明を完成するに至った。

本発明は以下に関する。

(1) HCIIを含有する検体を還元剤で処理した後、硫酸化多糖の存在下で HC IIをトロンビンと反応させ、残存トロンビン活性を測定することにより検体中の H C IIのトロンビン阻害活性を求めることを特徴とする H C IIの活性測定方法。

(2) 還元剤がジチオトレイトールである上記（1) の方法。

(3) 還元剤による処理工程における反応液中の還元剤の濃度が 0. 00 1 mM 〜10 OmMである上記（1) または（2) の方法。

(4) 硫酸化多糖がデルマタン硫酸である上記（1) 〜（3) のいずれかに記載の方法。

(5) HCIIとトロンビンの反応を低塩濃度の反応液中で行う上記（1) 〜（4) のいずれかに記載の方法。

(6) H C IIとトロンビンの反応を塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナトリウム濃度 0. 25 M以下の反応液中で行う上記（1) 〜（4) のいずれかに記載の方法。

(7) HCIIと卜ロンビンの反応を塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナトリウム濃度 0. 2 M以下の反応液中で行う上記（1) 〜（4) のいずれかに記載の方法。

(8) 還元剤、硫酸化多糖、トロンビン、トロンビンの基質、反応停止剤、および H C II標準品からなる H C Π活性測定用試薬キット。

(9) 還元剤がジチオトレイトールである上記（8) の HCII活性測定用試薬キッ卜 ο

(10) 硫酸化多糖がデルマタン硫酸である上記（8) または（9) の HCII活性測定用試薬キット。

(1 1) さらに希釈用緩衝液を含む上記（8) 〜（10) のいずれかに記載の H C II活性測定用試薬キッ卜。

(12) 希釈用緩衝液が低塩濃度を有する緩衝液である上記（1 1) の HCII活性測定用試薬キッ卜。

(13) 希釈用緩衝液が塩化ナ卜リゥムを含有しないかまたは塩化ナトリゥム濃度 0. 25M以下である上記（1 1) の HCII活性測定用試薬キット。

(14) 希釈用緩衝液が塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナ卜リゥム濃度 0. 2 M以下である上記（1 1) の HCII活性測定用試薬キット。

図面の簡単な説明

図 1は実施例 2の検量線を示す図である。

発明の詳細な説明

本発明において、測定対象となる検体としては、血液、血漿、血清およびこれらから得られた分画成分、ならびにその他の生体由来の液状成分などが例示される。またこれらの検体を緩衝液などで希釈したものを使用することもできる。本発明で用いる還元剤は、 S - S結合を切断できるものであれば特に限定されない。例えば、ジチオトレイト一ル（DTT) 、ジチォエリトリトール（DTE)、 2—メルカプトエタノール、システィンなどが挙げられる。

還元剤による処理工程における反応液中の還元剤の濃度は、通常 0. 001〜 10 OmMであり、好ましくは 0. 1〜 1 OmMである。還元剤による処理工程は pH 7〜9の緩衝液中で行うことが好ましい。緩衝液は特に限定されないが、えば、トリス—塩酸緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられる。

還元剤で処理した後、反応液中の還元剤の濃度が 0. ImM以下となるよう希釈する。希釈液としては pH6〜l 0の緩衝液、例えばトリス—塩酸緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられる。この希釈液中に硫酸化多糖を含有させることもできる。還元剤は蛋白変性作用を有するため、トロンビン活性測定を行う反応液中に高濃度の還元剤が存在すると活性測定に影響を及ぼす。したがって、トロンビン活性測定に供する反応液中の還元剤の濃度は 0 . 1 mM以下が好ましい。

H C IIとトロンビンとの反応は硫酸化多糖の存在下で行う。 H C IIのトロンビン阻害活性は硫酸化多糖の存在下で促進される。本発明で用いる硫酸化多糖は硫酸基（― O S 0 ₃ H) を有する多糖であり、例えば、へパリン、デルマタン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、デキストラン硫酸などが挙げられる。へパリンまたはデルマタン硫酸が好適に用いられる。特に、 H C IIを特異的に活性化することができ、 A T— III による影響が少ないことから、デルマタン硫酸が好ましい。反応液中の硫酸化多糖の濃度は 0 . 0 1〜 1 0 m g Zm 1が好適であり、 0 . 1〜 1 m g /m 1が特に好適である。

本発明で用いるトロンビンの由来は特に限定されない。ヒト、ゥシ、ゥマ、ャギ等の由来のトロンビンを使用することができる。反応液中のトロンビンの濃度は 0 . 0 1〜5 UZm 1が好適である。

本発明の H C II活性測定は、低塩濃度の反応液中で行うことが好ましい。低塩濃度の反応液中で行うことにより、トロンビンと H C IIとの反応が速やかに定常状態に達する。低塩濃度とは、塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナトリゥム濃度が 0 . 2 5 M以下であることを意味する。好ましくは塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナトリウム濃度が 0 . 2 M以下である。特に好ましくは塩化ナトリゥムを添加していない反応液中でトロンビンと H C IIの反応を行う。さらに、還元剤による処理工程、残存トロンビン活性を測定する工程を塩化ナトリウムを添加していない反応液中で行つてもよい。

H C IIをトロンビンと反応させた後、トロンビンの基質を添加してトロンビン i基質との反応を行う。その後、反応停止剤を添加して反応を停止させ、トロンビンの残存活性を測定する。

本発明で用いるトロンビンの基質としては、 S— 2 2 3 8 (H— D—フエニルァラニルー L—ピペコリル— L—アルギニル一 p—ニトロァニリド ·二塩酸塩）などの市販のものを使用することができる。

本発明で用いる反応停止剤は A T— III 測定系と同様のものが使用できる。例えば、クェン酸水溶液を使用することができる。

本発明の測定方法の具体的操作について説明する。

検体（またはその希釈液）に還元剤を添加し、 4〜4 0 °C、好ましくは 2 0〜 3 7 °Cにて 5〜6 0分間、前処理する。前処理した反応液を適宜希釈する。ここに硫酸化多糖とトロンビンを添加し、 2 0〜4 0 °C、好ましくは 3 7 °Cにて 0. 5 〜1 5分間反応させる。さらにトロンビンの基質を添加し、 2 0〜4 0 °C、好ましくは 3 7でにて0 . 5〜1 5分間反応させる。反応停止剤を添加して反応を停止させる。トロンビンの残存活性を測定する。トロンビンの活性測定方法は特に限定されず、公知の手法を用いることができる。例えば、基質として S— 2 2 3 8を使用した場合には、 4 0 5 n mにおける吸光度を測定することによりトロンビンの残存活性を求めることができる。上記の反応温度、反応時間は適宜変更し得る。 H C II標準品またはその希釈液を種々の濃度に希釈し、上記と同様の操作を行いトロンビン残存活性を測定する。希釈標準品の H C II活性の対数に対して、各希釈標準品の卜口ンビン阻害活性の対数をプロットして検量線を作成する。得られた検量線より、検体中の H C II活性を求める。

また本発明は、還元剤、硫酸化多糖、トロンビン、トロンビンの基質、反応停止剤、および H C II標準品からなる H C II活性測定用試薬キットを提供する。本発明の試薬キットを構成する各試薬は、常法に従って、賦形剤と共に反応液中で所定の濃度になるように精製水や緩衝液に溶解した形態、あるいは使用時に所望の濃度に希釈する濃厚溶液の形態、あるいは凍結乾燥品の形態とすることができる。本発明の試薬キットは、さらに希釈用緩衝液を含んでいてもよい。該希釈用辏衝液は低塩濃度であることが好ましい。詳細には、希釈用緩衝液は塩化ナ卜リゥムを含有しないかまたは塩化ナトリウム濃度 0 . 2 5 M以下であることが好ましく、より好ましくは塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナトリゥム濃度 0 . 2 M以下である。特に好ましくは塩化ナトリウムを添加していない緩衝液を使用する。実施例

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例 1 ：還元剤処理による AT- III の不活性化効果

(1) DTT処理

10 mMの DTTを含むまたは DTTを含まない、 20 mM Tr i s— HC 1， pH 8の緩衝液で AT— III濃度を 5 UZm 1に調整し、 37 °Cで 30分間の DTT処理を行った。夾雑蛋白の影響を調べるために、 5%ヒト血清アルブミン（HSA) 存在下または非存在下で DTT処理を行った。

DTT処理した検体を、 DTTを含有しない検体希釈液（0. 04M Tr i s , 0. 06 M エチレンジァミン四酢酸（E DTA) , 0. 2 %H S A, 0. 1 mg/m 1 デルマタン硫酸， pH8. 56) で 100倍希釈し、トロンビン活性測定系に供した。

(2) トロンビン活性測定

希釈した検体溶液 50 1に、 0. 05%ゥシ血清アルブミン（B S A) ， 0. 05 %ポリエチレングリコール 6000 (PEG6000) を含有するヒトトロンビン溶液（1. OU/m l) 100 1を添加し、 3 7でで 5分間静置した。ここに基質溶液（S— 2238， 1. 52 mM) 100 ^ 1を添加し、 37 でで 5分間静置した。 2%クェン酸 1 000 μ 1を添加し反応を停止させた後、 405 nmにおける吸光度（A ₄₀₅ ) を測定した。

抗トロンビン活性は、検体希釈液のみの場合のトロンビン活性に対する抑制率であり、下記式により求めた。検体希釈液のみの場合の一検体のトロンビン活性

卜ロンビン活性

X100(¾)

検体希釈液のみの場合のトロンビン活性

DTT処理による抗トロンビン活性の抑制率を下記式により求めた。結果を表 1に示す。 DTT処理しない場合の DTT処理した場合の

抗トロンビン活性抗トロンビン活性

100(¾)

D T T処理しない場合の抗トロンビン活性

H S Aの有無にかかわらず、 AT— III を DTTで前処理すると、無処理の場合に比べて抗トロンビン活性は 8 7 %抑制された。この結果から、還元剤処理により、 AT— III による影響を抑制できることが示された。

実施例 2 ： HCir活性測定

0丁丁溶液（1001]^ DTT, 20 mM T r i s— HC 1， pH8) で H C II濃度を一定比（1 : 2 : 4) に調整し、 3 7 、 3 0分間の DTT処理を行つた。 DTT処理した反応液を、 DTTを含有しない検体希釈液（0. 0 4 M T r i s , 0. 0 6 M EDTA, 0. 2 %H S A, 0. 1 mg/m 1 デルマタン硫酸， p H 8. 5 6 ) で 1 0 0倍希釈し、実施例 1と同様の方法で DTT処理した場合の検体の抗トロンビン活性を測定した。 D T Tを含有しない検体希釈液（同上）で HCII標準品を希釈した。実施例 1と同様の方法で各希釈標準品の抗トロンビン活性を測定し、検量線を作成した。検量線を図 1に示す。この検量線に、前記の DTT処理した検体の抗トロンビン活性を導入し、 DTT処理した検体の HC II活性を算出した。結果を表 2に示す。 0丁丁処理後の検体の11〇11 活性比が、 DTT処理をしていない検体の HCII濃度比と同じであった。従って- DTT処理は HC II活性に影響を及ぼさないことが示された。

表 2

実施例 3 ： HCII活性測定用試薬キット

α) DTT溶液（1 0mM DTT, 20 mM Tr i s—HC l, p H 8)

(2) 検体希釈液（0. 04 M Tr i s， 0. 06 M EDTA, 0. 2 %H S A, 0. 1 mg/m 1 デルマタン硫酸， pH8. 56)

(3) トロンビン溶液（1. OUZml トロンビン， 0. 05%BSA, 0. 0 5%PEG6000)

(4) 基質溶液（S— 2238, 1. 52 mM)

(5) 反応停止剤（2 %クェン酸）

(6) HCII標準品

以上の試薬からなる H C II活性測定用試薬キットを得た。

産業上の利用可能性

本発明の測定方法によれば、 AT— III が混在する検体であっても、 AT— II I の影響を抑制し、 HCIIのみのトロンビン阻害活性を正確に測定することができる。本発明の測定方法は、簡便な操作により短時間で HCII活性の正確な測定を行うことができる有用な方法である。本出願は日本で出願された平成 10年特許願第 18993号を基礎としており- その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1 . へパリンコフアクター IIを含有する検体を還元剤で処理した後、硫酸化多糖の存在下でへパリンコファクタ一 IIをトロンビンと反応させ、残存トロンビン活性を測定することにより検体中のへパリンコフアクター IIのトロンビン阻害活性を求めることを特徴とするへパリンコファクタ一 IIの活性測定方法。

2 . 還元剤がジチオトレイトールである請求項 1記載の方法。

3 . 還元剤による処理工程における反応液中の還元剤の濃度が 0 . 0 0 1 mM 〜1 0 O mMである請求項 1または 2記載の方法。

4 . 硫酸化多糖がデルマタン硫酸である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の方法。

5 . へパリンコファクタ一 IIとトロンビンの反応を低塩濃度の反応液中で行う請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の方法。

6 . へパリンコファクター IIとトロンビンの反応を、塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナトリウム濃度 0 . 2 5 M以下の反応液中で行う請求項 1〜4 のいずれか 1項に記載の方法。

7 . へパリンコファクタ一 IIとトロンビンの反応を、塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナトリゥム濃度 0 . 2 M以下の反応液中で行う請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

8 . 還元剤、硫酸化多糖、トロンビン、トロンビンの基質、反応停止剤、およびへパリンコファクタ一II標準品からなるへパリンコファクタ一 Π活性測定用試千ッ卜 o

9 . 還元剤がジチォトレイトールである請求項 8記載のへパリンコファクタ一 II活性測定用試薬キッ卜。

1 0 . 硫酸化多糖がデルマタン硫酸である請求項 8または 9記載のへパリンコファタター II活性測定用試薬キット。

1 1 . さらに希釈用緩衝液を含む請求項 8〜1 0のいずれか 1項に記載のへパリンコフアクター Π活性測定用試薬キット。

1 2 . 希釈用緩衝液が低塩濃度を有する緩衝液である請求項 1 1記載のへパリンコファクタ一 II活性測定用試薬キット。

1 3 . 希釈用緩衝液が塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナトリゥム濃度 0 . 2 5 M以下である請求項 1 1記載のへパリンコファクタ一 II活性測定用試薬キット。

1 4 . 希釈用緩衝液が塩化ナトリゥムを含有しないかまたは塩化ナ卜リゥム濃度 0 . 2 M以下である請求項 1 1記載のへパリンコファクタ一 II活性測定用試薬ャッ卜