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WO1999027951A1 - Preparation pour l'admission intraveineuse continue - Google Patents

Preparation pour l'admission intraveineuse continue Download PDF

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Publication number
WO1999027951A1
WO1999027951A1 PCT/JP1998/005470 JP9805470W WO9927951A1 WO 1999027951 A1 WO1999027951 A1 WO 1999027951A1 JP 9805470 W JP9805470 W JP 9805470W WO 9927951 A1 WO9927951 A1 WO 9927951A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hgf
administration
intravenous administration
continuous intravenous
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1998/005470
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Naoki Yamazaki
Tomokazu Nagano
Ikue Mori
Michitoshi Sekine
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd filed Critical Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority to US09/555,629 priority Critical patent/US6869609B1/en
Priority to EP98957162A priority patent/EP1036566B1/en
Priority to DK98957162T priority patent/DK1036566T3/da
Priority to DE69838399T priority patent/DE69838399T2/de
Publication of WO1999027951A1 publication Critical patent/WO1999027951A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to a preparation for continuous intravenous administration containing hepatocyte growth factor as an active ingredient.
  • Conventional technology hepatocyte growth factor as an active ingredient.
  • Hepatocyte growth factor has been discovered as a powerful growth-promoting factor for mature hepatocytes and is a gene cloned protein (Biochem Biophys Res Co Ryuun, 122, 1450 (1984) Natl. Acad. Sci, USA, 83, 6489, (1986), FEBS Letter, 224, 311 (1987), Nature, 342, 440 (1989), Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 87. , 3200 (199 0)). Subsequent studies have revealed that HGF not only works as a liver regeneration factor in vivo but also has a variety of pharmacological effects, in addition to repairing and regenerating damaged liver.
  • HGF vascular endothelial growth factor
  • a therapeutic agent for cranial nerve disorders a therapeutic agent for cartilage disorders
  • a therapeutic agent for arterial disease a therapeutic agent for pulmonary fibrosis
  • HGF plays a central role also in renal regeneration.
  • HGF ⁇ lRNA in the residual kidney increased, resulting in an increase in HGF activity (J. Biol. Chem., 266, 22781 (1991)).
  • HGF mRNA was induced and then HGF activity was increased (American Journal of Physiology, 265, 61 (1993)), and that HGF mRNA expression was similarly induced in mice impaired by nephrotoxic substances. There have been reports of increased HGF activity (Nephron; ⁇ , 735 (1996)) and others, and HGF is now thought to be expressed and functioning as a repair factor for renal damage.
  • the renal ischemia model and the renal injury model are disease models of acute renal failure
  • the renal ischemia model and the renal injury model are also used for spontaneously developing Nef lipase mice, which are considered to have characteristics as a disease model of chronic renal failure.
  • HGF has been shown to exhibit remarkable efficacy (Record of the Japanese Society for Disease Modeling, Vol. 13, 113, Abstract 28 (1997)).
  • intravenous administration is a common sense for proteinaceous preparations.
  • intravenous administration of HGF to the above-mentioned renal disease model for example, frequent intravenous administration (CYTOKINE, 8, Natl. Acad. Sci. USA, 91, 4357 (1994)) or a single intravenous dose (J. American Society of Nephrology, 1835, abstract A2944 (1996), Journals of the Japanese Society of Nephrology vo 1.39, 260, abstracts 0-302) are known.
  • CYTOKINE 8, Natl. Acad. Sci. USA, 91, 4357 (1994)
  • a single intravenous dose J. American Society of Nephrology, 1835, abstract A2944 (1996), Journals of the Japanese Society of Nephrology vo 1.39, 260, abstracts 0-302
  • HGF was continuously administered intravenously to the renal disease model.
  • the present inventors have been diligently studying the dosage and administration method when adapting HGF to renal disease. Investigations have been conducted assuming two methods of administering HGF for renal disease: intravenous bolus administration and continuous intravenous administration. However, while the intravenous bolus administration has an established evaluation system, the intravenous continuous administration has the following effects: 1) the power is lost during the continuous administration; and 2) the power is lost. It is difficult to establish a system for evaluating the jugular vein, which is relatively difficult to withdraw, due to the difficulty of controlling the disease state due to stress on the animal, and the like. . against this background, there have been no reports of trials of continuous intravenous administration of renal disease models, and thus it was not clear whether continuous intravenous administration of HGF was effective. .
  • the present inventors have made some contrivances on the mercury chloride model mouse, such as placing a pterygoid needle in the tail vein instead of the jugular vein and anesthetizing the mouse.
  • the present inventors have compared the efficacy of intravenous bolus administration and the above-mentioned continuous intravenous administration, and surprisingly, by performing the continuous administration as compared with the bolus administration, the dose was significantly increased. It became clear that it could be reduced. As described above, since the dose can be reduced as compared with the conventional bolus administration, it has an effect of reducing side effects in clinical practice.
  • the present inventors have further studied and found that continuous intravenous administration of HGF is more effective than bolus administration even for occlusive lesions of blood vessels. More specifically, in a glycerol model in which glycerol is administered intramuscularly, a large amount of myoglobin is released into the blood from skeletal muscle tissue with skeletal muscle damage, and creatine kinase, creatine, Various constituents such as potassium, phosphate, and purine precursors are released into the blood.
  • the glycerol model is regarded as a so-called MNMS (Myonephropathic-Metabolic Syndrome) model, such as rhabdomyolysis, myoglobinuria, and crush syndrome, accompanied by disruption of skeletal muscle tissue. 7 Kidney syndrome 5 2 3 to 5 26, 1 9 97 years).
  • MNMS Myonephropathic-Metabolic Syndrome
  • ischemic vascular lesions if ischemia due to acute vascular occlusion persists, extensive ischemic muscle necrosis occurs, and MNMS that raises creatine kinase, potassium, myoglobin, etc. in the blood occurs, and the glycerol model Can also be considered a model for occlusive lesions of blood vessels.
  • continuous intravenous administration of HGF is more effective than bolus administration, and continuous intravenous administration of HGF may also be effective against occlusive lesions of blood vessels. found.
  • the present inventors have studied and found that continuous intravenous administration of HGF is more effective than bolus administration in terms of the effect of increasing the platelet count of HGF and the like. It was concluded that continuous intravenous administration was more effective than intravenous bolus administration, and that lower doses could produce an effect.
  • the present invention has been made based on the above findings, and an object of the present invention is to provide a preparation for continuous intravenous administration containing HGF as an active ingredient. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a preparation for continuous intravenous administration containing HGF as an active ingredient.
  • the present invention provides a preparation for continuous intravenous administration that is effective for treating or preventing renal diseases, occlusive lesions of blood vessels, and the like. Since the preparation for continuous intravenous administration of the present invention can reduce the dose compared to intravenous bolus administration, it has the effect of reducing side effects.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of the administration schedule of Example 1-3).
  • Fig. 2 is a graph showing the results of examining the effect of anesthesia on this evaluation system. In the figure, A shows the effect on BUN, and B in the figure shows the effect on creatinine.
  • FIG. 3 is a diagram showing an outline of the administration schedule of Examples 1-4).
  • Figure 4 is between 0.5 hours to 5.5 hours after 2 administration, HGF200 g / kg / hr ( 100 0 g / kg / day) is a graph showing the effect of continuous intravenous administration of 0 g / kg / day).
  • a in the figure is B
  • FIG. 5 is a diagram showing an outline of the administration schedule in Example 2-2). 6, the (1 2 between 0.5 hours to 5.5 hours after administration, HGF60Aig / kg / hr (300 ⁇ g / kg / day), and HGF 200 ⁇ g / kg / hr (1000 g / kg / day) It is a graph showing the effect of continuous intravenous administration, wherein A shows the effect on creatinine, and B shows the effect on BUN.
  • FIG. 7 is a diagram showing an outline of the administration schedule in Example 2-3).
  • Figure 8 shows HGF 60 g / kg / hr (120 ⁇ g / kg / day), and 110-200; ⁇ / 13 ⁇ 4 / (400 g / kg / day) between 0.5 h and 2.5 h after 2 doses.
  • 4 is a graph showing the effect of intravenous continuous administration of. A in the figure shows the effect on creatinine, and B in the figure shows the effect on BUN.
  • FIG. 9 is a diagram showing an outline of the administration schedule of Example 2-4).
  • Figure 10 shows that HGF was administered only 0.5 hour after administration of HgCl 2 with lOO ⁇ g / kg (group 2), 300 g / kg (group 3), iOOO g / kg (group 4), 3000 / xg / kg ( 5 is a graph showing the effect of a single intravenous administration in group 5).
  • a in the figure shows the effect on creatinine
  • B in the figure shows the effect on BUN.
  • FIG. 11 is a diagram showing an outline of the administration schedule of Example 3-2). 1 2, for 0.5 hour to 3.5 hours after 2 administration, HGF6 ( ⁇ g / kg / hr (18 0 g / kg / day), and HGF 200 ⁇ g / kg / hr (600 g / kg / day (A) shows the effect of continuous intravenous administration of A. In the figure, A shows the effect on creatinine, and B shows the effect on B ring.
  • FIG. 13 is a graph showing an increase in platelet count when HGF is intravenously administered.
  • the HGF used in the present invention is a known substance, and is used as a pharmaceutical. As long as it is highly purified, those prepared by various methods can be used, and a commercially available product (for example, Toyobo Code No. HGF-101 or the like) may be used.
  • a method for producing HGF for example, the HGF can be obtained by culturing primary cultured cells or cell lines that produce HGF, and separating and purifying it from a culture supernatant or the like.
  • a gene encoding HGF is inserted into an appropriate vector by genetic engineering techniques, inserted into an appropriate host, and transformed, and the recombinant HGF of interest is obtained from the culture supernatant of the transformant.
  • the host cells described above are not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques, for example, Escherichia coli, yeast, or animal cells can be used.
  • the HGF thus obtained may have one or more amino acids in its amino acid sequence substituted, deleted and / or added, as long as it has substantially the same action as natural HGF.
  • a sugar chain may be substituted, deleted and / or added.
  • the preparation for continuous intravenous administration of the present invention can be applied to various diseases for which the efficacy of HGF is recognized, but is particularly suitably applied to renal diseases and occlusive lesions of blood vessels. it can.
  • the above-mentioned renal diseases include chronic renal disease (nephropathy, renal failure, nephritis) and acute renal disease.
  • kidney disease glomerular disease associated with liver disease, diabetic nephropathy, tubulointerstitial nephritis, renal vascular disorder, hypertensive renal disorder, renal urolithiasis, urinary tract infection, obstructive nephropathy, cystic kidney Diseases, kidney * Urinary tract tumors, hereditary kidney disease, kidney transplantation, complications associated with kidney transplantation, drug-induced renal failure, and the like.
  • the obstructive lesions include, for example, lower extremity blood, acute arterial occlusion, chronic arterial occlusion, obstructive arteriosclerosis, arterial embolism, arterial thrombosis, Bajaja disease, venous occlusion, venous thrombosis, thrombotic Includes phlebitis, vascular dysplasia, vascular injury, coronary artery occlusion, coronary artery stenosis, pulmonary embolism, organ arterial occlusion, etc. (Clinical Angiology, Bunkodo, 19992; Therapeutics, Vol. 31, Volume 3, Issue 3 , P. 284-p. 338, 199 7).
  • the pH of the active ingredient, HGF, and buffer may be adjusted.
  • Agents, stabilizers, preservatives, solubilizers and the like may be added.
  • the dose varies depending on symptoms, age, gender, etc.For example, in the case of treatment and prevention of renal disease, 500 g / head / hr or less, more preferably 60 ⁇ g / head / hr or less It is injected intravenously over 30 minutes to 5 hours, preferably 30 minutes to 3 hours, and in the case of treatment of vascular obstructive lesions, in the case of prevention, 1800 g / head / hr or less. More preferably, it is infused intravenously at 200 g / head / hr or less over a period of 30 minutes to 3 hours, preferably 30 minutes to 1.5 hours.
  • the continuous administration can be performed a plurality of times.
  • the administration time of the preparation for continuous intravenous administration of the present invention is not limited. However, as shown in Examples described later, in acute renal failure, a remarkable effect is exhibited by the continuous administration in the early stage of onset, and the onset of patients Administration at an earlier stage is more preferred.
  • the preparation for continuous intravenous administration of the present invention can be used not only for the above-mentioned therapeutic purposes but also for prophylaxis.
  • acute renal failure due to ischemia or nephrotoxicity is a disease that develops as a side effect of bleeding due to surgery or a side effect of administration of antibiotics such as antitumor drugs and contrast agents.
  • antibiotics such as antitumor drugs and contrast agents.
  • the onset of renal failure can be predicted in advance depending on the degree of the bleeding, the dosage of the antibiotic or the contrast agent, or the condition of the patient.
  • the preparation for continuous intravenous administration of the present invention can also be used for prevention of acute renal failure and the like.
  • a preparation for continuous intravenous administration containing HGF as an active ingredient. Since the dosage for continuous administration of the present invention can be reduced compared to bolus administration, it has the effect of reducing side effects.
  • mice Male BALB / c mice (5 or 6 weeks old) purchased from SLC, temperature 23 ⁇ 2 ° C, humidity 55 ⁇ 10%, lighting from 8:00 to 20:00, free eating, free drinking conditions Were preliminarily reared and subjected to experiments at 6.5 to 8 weeks of age.
  • mice were anesthetized with Nembutal (100 mg / kg, s.c.), a needle was inserted into the tail vein on a hot plate at 37 ° C, and fixed with tape.
  • Nembutal 100 mg / kg, s.c.
  • a needle was inserted into the tail vein on a hot plate at 37 ° C, and fixed with tape.
  • the syringe was set in an infusion pump (Neuroscience), and the pistons were aligned using a three-way stopcock. This was used as an evaluation system for continuous intravenous administration, and was used in subsequent experiments (Examples 1-3). Using.
  • HgCl 2 Eight-week-old male BALB / c mice were divided into four groups of eight mice per group, and HgCl 2 was subcutaneously administered at 8.5 mg / kg to all groups. This time was defined as 0 hour. Fasted from -12 hours to 12 hours. Groups i and 2 received Nembutal subcutaneously at 100 mg / kg posterior back before HgCl 2 administration. At 0.5, 6, 12, 24, and 36 hours after HgCl 2 administration, vehicle was administered to Groups 1 and 3, and HGF was administered to Groups 2 and 4, respectively. HG F And Forty-eight hours later, blood was collected from all groups, serum was separated, and the levels of urea nitrogen (BUN) and creatinine were measured (Syncron CX3 system delta: Beckman).
  • BUN urea nitrogen
  • creatinine were measured (Syncron CX3 system delta: Beckman).
  • the HGF used was human recombinant HGF (the same applies to the following experiments), and the vehicle used was 10 mM citrate buffer (pH 6.0) containing 0.01% Tween80 and 0.3M NaCl.
  • Statistical processing of data was performed by Tukey's test. The result is shown in figure 2. Creatinine levels did not vary significantly with or without anesthesia. HGF significantly inhibited creatinine, but the effect was hardly affected by anesthesia. This indicates that the effects of anesthesia do not need to be considered when evaluating the efficacy of HGF.
  • Figure 3 shows an overview of the dosing schedule.
  • mice Eight-week-old male BALB / c mice were divided into two groups of 10 mice per group, and all groups were subcutaneously administered with HgCl 2 at 8.5 mg / kg at the back. This time was defined as 0 hour. Fasted from -12 hours to 12 hours. Vehicle was administered to the first group and HGF was administered to the second group by continuous intravenous administration using the evaluation system described in 2) above. Immediately before HgCl 2 administration, the mice were anesthetized with Nembutal (100 mg / kg, sc), and were continuously administered 0.5 hours after HgC administration according to the method described above. The dose of HGF was 1000 g / kg / day, and continuous administration was performed at 200 ⁇ g / kg / hr for 5 hours. Blood was collected from all groups for 48 hours, and serum was separated to measure urea nitrogen (BUN) and creatinine (Syncron CX3 System Delta: Beckman). Statistical processing of data was performed by t-test.
  • BUN urea nitrogen
  • FIG. 4 shows the experimental results. Both BU and creatinine were significantly suppressed by continuous intravenous administration of HGF. Therefore, it became clear that continuous intravenous administration of HGF was effective for renal disease.
  • mice Male BALB / c mice (6 weeks old) were purchased from SLC, under the conditions of temperature 23 ⁇ 2 ° C, humidity 55 ⁇ 10%, lighting from 8:00 to 20:00, free eating and free drinking Preliminary rearing, 6.
  • the test was performed at the age of 5 weeks.
  • mice Divided into three groups with 10 animals per group male BALB / c mice (6.5 weeks) were anesthetized with Nembutal (lOOmg / kg sc), and dorsal subcutaneous administration of HgCl z with 8.5 mg / kg immediately all groups. This time was set to 0 hour. Fasting and water deprivation were performed from -12 hours to 12 hours.
  • the first group is the vehicle, the second group is the HGF
  • HGF was continuously administered intravenously at a dose of 200 g / kg / hr (1000 jag / kg / day) for 0.5 to 5.5 hours. Blood was collected from all groups 48 hours later, and serum was separated to measure urea nitrogen (BUN) and creatinine (Syncron CX3 System Delta: Beckman). The statistical processing of the data was performed by the nonparametric test because the equal variance was denied by the BartleU test.
  • Fig. 6 shows the results. Although the efficacy was slightly lower than the positive control 200 g / kg / hr (1000 / g / kg / day), the increase in creatinine was significantly suppressed even at 60 g / kg / hr (300 g / kg / day). . Although BU did not differ significantly, it showed a tendency to suppress.
  • mice Male BALB / c mice (6.5 weeks) were divided into 3 groups of 10 mice per group, anesthetized with Nembutal (100 mg / kg sc), and immediately all the groups were subcutaneously administered with HgCl 2 at 8.5 mg / kg to the back. This time was set to 0 hour. In addition, fasting and water deprivation were performed from -12 hours to 12 hours.
  • the first group contains vehicle
  • the second group contains HGF at 60 ⁇ g / kg / hr (120 ⁇ g / kg / day)
  • the third group contains HGF at ⁇ O g / kg / hr ⁇ OO ⁇ g / kg / day) at 0.5 to 2.5 hours.
  • Fig. 8 shows the results. In this experiment, there was no significant improvement in both BUN and creatinine, but an improvement trend was observed.
  • mice Male BALB / c mice were divided into 5 groups of 10 mice per group, and HgCl 2 was administered subcutaneously at 8.5 mg / kg to all groups. This time was set to 0 hour. In addition, from the -12 hours to 12 hours, fasted * water-absent treatment was performed. In the first group, the vehicle was administered into the tail vein only 0.5 hour after HgCl 2 administration. Groups 2 to 5 received HGF at 100, 300, 1000, and 3000 g / kg, respectively, in the tail vein only for 0.5 hours, collected blood from all groups for 48 hours, separated serum, and isolated urea nitrogen ( BUN) and creatinine were measured (Synchron CX3 System Delta: manufactured by Beckman). Data statistical processing was performed with Dunnett's test.
  • mice Male BALB / c mice were purchased from SLC at the age of 6 weeks, and temperature 23 ⁇ 2 ° (: Humidity 55 ⁇ 10 °, lighting from 8:00 to 20:00, free eating, free drinking) They were bred and used for experiments.
  • Example 2-2 the force that could reduce the dose to 300 / xg / kg / day 1 At 20 g / kg / day, there was only an improvement trend, and no significant improvement was achieved. Therefore, the study was conducted at an intermediate dose of 180 ⁇ g / kg / day. An overview of the dosing schedule is shown in Figure 11.
  • mice Male BALB / c mice (6.5 weeks) were divided into 3 groups of 10 mice per group and anesthetized with Nembutal (100 mg / kg sc). Immediately thereafter, HgCl 2 was subcutaneously injected at 9 mg / kg to all groups. Was administered. This time was set to 0 hour. In addition, fasting and water-stopping treatment was performed from-12 hours to 24 hours. The first group had vehicle, the second group had HGF at 60 g / kg / h (180 / zg / kg / day), and the third group (positive control) had HGF at 200 ⁇ g / kg / h. (600 ⁇ g / kg / day), the drug was continuously administered intravenously from 0.5 hours to 3.5 hours.
  • a 7- to 8-week-old male Wi star rat (weight: about 200 g) was used for the experiment.
  • the rats that had been dehydrated (15 hours) from the night before were given 50% glycerol intramuscularly (I 0 ml / kg) under ether anesthesia, and the dehydration treatment was continued until 8 hours later.
  • a model was created.
  • 8 hours after glycerol administration HGF was continuously administered into the tail vein at a dose of lmg / kg (30 minutes). The progress was observed until 1 day after administration.
  • HGF was injected into the tail vein of the model prepared in the same manner three times in total 8 hours after glycerol administration (total 750 g / kg), and the progress was observed.
  • HGF group was 8Z10.
  • P ⁇ 0.05 the survival rate
  • HGF group was 5Z8, and no survival effect was observed by HGF. Therefore, it was found that continuous administration tends to be more advantageous than bolus administration.
  • HGF human endothelial growth factor
  • PBS containing 0.01% Tween80 and 0.25% HAS as a vehicle
  • the single dose was 0.25 mg / kg, and only vehicle was administered for control.
  • the drug was administered twice a day for 7 consecutive days, blood was collected on the day following the last day of the last administration, and the platelet count was measured using a semi-automatic blood cell analyzer (Sysmex, F-800).
  • HGF was diluted with the vehicle to lml / kg / shot and administered into the tail vein.
  • the single dose was 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 mg / kg, and was administered twice a day for 7 consecutive days.

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Description

田 » 静脈内持続投与用製剤 技術分野
本発明は、 肝実質細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor)を有効成分 として含有する静脈内持続投与用製剤に関する。 従来の技術
肝実質細胞増殖因子 （以下、 HGFという） は成熟肝細胞に対する強力 な増殖促進因子として発見され、 その遺伝子クローニングがなされたタン パ質である （Biochem Biophys Res Co龍 un， 122, 1450 (1984)、 Proc. Na tl. Acad. Sci, USA, 83, 6489,(1986)、 FEBS Letter, 224, 311 (1987)、 Nature, 342， 440 (1989)、 Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 87, 3200 (199 0)) 。 その後の研究により、 HGFは in vivoにおいて肝再生因子として 障害肝の修復再生に働くだけでなく、 種々の薬理作用を有することが明ら かとなリ、 肝疾患治療剤の他に、 例えば腎疾患治療剤、 脳神経障害治療剤、 軟骨障害治療剤、 動脈疾患治療剤、 肺線維症治療剤などとしての開発が期 待されている。 例えば、 上記の腎疾患に対する HGFの薬理作用について 具体的に説明すると、 HGFは腎再生においても中心的な役割を果たして いることが明らかとなってきた。 すなわち、 片腎摘出後のラッ卜において 残余腎のHGFπlRNAが上昇し、 その結果 H G F活性の上昇が起こった という報告 （J. Biol. Chem. , 266, 22781 (1991)) 、 腎虚血ラッ トにお いて HGFmRNAが誘導され、 その後 H G F活性の上昇が起こったとい う報告 （American Journal of Physiology, 265, 61 (1993)) 、 また腎毒 性物質による障害マウスにおいても同様に HGF mRN Aの発現誘導 · H GF活性上昇が起こったという報告 （Nephron；^， 735 (1996)) などがな され、 腎障害からの修復因子として HGFが発現、 機能していると考えら れるようになった。
このような HGFの機能に基き腎障害モデルに対して HGFを投与し、 薬効が確認されたという報告がなされている。 すなわち前記腎虚血モデル、 あるいは塩化水銀（HgClJやシスブラチン等の腎毒性物質による腎障害モ デルは、 急性腎不全の病態である急性尿細管壊死を示すことから、 急性腎 不全の疾患モデルとして古くから用いられているものであるが、 これら腎 虚血モデルあるいは腎障害モデルに対して H G Fを投与した結果、 いずれ の障害モデルにおいても血中尿素窒素 （Blood urea nitrogen;以後 BUNと いう） や血中クレアチニンなどの腎機能障害のパラメ一ター値の上昇が速 やかに抑えられたことから、 H G Fは腎障害に対して修復作用を有するこ とが明らかとなっている （American Journal of Physiology, 266, 129 (1994)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91_, 4357 (1994) ) 。
さらに、 前記腎虚血モデル及び腎障害モデルが急性腎不全の疾患モデル であるのに対し、 慢性腎不全の疾患モデルとしての性格を持つと考えられ ているネフ口一ゼ自然発症マウスに対しても、 H G Fは顕著な薬効を示す ことが明らかとなっている （日本疾患モデル学会記録 Vol. 13， 113,演題 28 (1997) ) 。
以上のように種々の動物モデルを用いた H G Fの薬効評価により、 急性 腎不全あるいは慢性腎不全といった腎疾患に対する H G Fの有効性が明ら かにされている。 しかし具体的な H G Fの投与法あるいは投与量等につい ては、 未だ結論が出されていない。
一般的にタンパク性製剤の場合は静脈内への投与が常識となっている力 \ 前記腎疾患モデルに対する H G Fの静脈内投与に関しては、 例えば静脈内 への頻回投与の例 （CYTOKINE, 8, 387 ( 1996)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 , 4357 ( 1994) ) 、 あるいは静脈内への単回投与の例 （J. America n Society of Nephrology, 1835, 演題 A2944 ( 1996)、 日本腎臓学会誌 vo 1.39， 260，演題 0-302) などが知られている。 しかし、 前記腎疾患モデルに 対して H G Fを静脈内に持続的に投与したという報告は、 未だなされてい ない。 、
本発明者らは H G Fを腎疾患に適応するにあたり、 投与量、 投与法の検 討を鋭意行ってきた。 腎疾患に対する H G Fの投与法として、 静脈内ボ一 ラス投与及び静脈内持続投与の 2通りの方法を想定して検討を行ってきた が、 静脈内ボーラス投与は評価系が確立しているのに対し、 静脈内持続投 与は、 1 ) 持続投与の途中で力二ュ一レが抜けてしまう、 2 ) 力二ュ一レ が比較的抜け難い頸静脈への力二ユレーシヨンには手術に手間がかかる、 あるいは 3 ) 動物へのストレス等により病態のコントロールが難しい、 な どの問題があり、 その評価系の確立は困難であった。 このような背景から か、 腎疾患モデルに対して静脈内持続投与を試みた報告はなされておらず、 従って H G Fの静脈内持続投与が有効であるか否かについては明らかにさ れていなかった。
このような状況下、 本発明者らは前記塩化水銀モデルマウスに対し、 頸 静脈ではなく尾静脈に翼状針を留置すること、 またマウスに麻酔をするこ と等の幾つかの工夫を施すことにより、 静脈内持続投与の評価系を確立す ることに成功した。 そこで実際に、 このモデルを用いて H G Fの静脈内持 続投与の効果を検討したところ、 該持続投与により H G Fが顕著な薬効を 示すこと、 すなわち H G Fの静脈内持続投与が腎疾患に対して効果を示す ことを、 初めて明らかにした。
さらに本発明者らは静脈内ボーラス投与と前記静脈内持続投与との薬効 の比較を行ったところ、 驚くべきことにボーラス投与と比較して該持続投 与を行うことにより、 その投与量が大幅に低減できることが明らかとなつ た。 このように、 従来のボーラス投与と比較して投与量の低減ができるた め、 臨床において副作用が軽減されるという効果を有する。
かかる知見に基づき、 本発明者らはさらに研究を進めたところ、 血管の 閉塞性病変などに対しても、 H G Fの静脈内持続投与はボーラス投与に比 ベてより有効であることが判明した。 より具体的には、 グリセロールを筋 肉内に投与するグリセロールモデルにおいては、 骨格筋の障害を伴い、 骨 格筋組織から大量のミオグロビンが血中に遊離し、 また、 クレアチンキナ ーゼ、 クレアチン、 カリウム、 リン酸、 プリン前駆物質など種々の構成成 分が血中に放出される。 このように、 グリセロールモデルは骨格筋組織の 崩壊を伴う、 横紋筋融解症、 ミオグロビン尿症、 挫滅症候群などの所謂 M N M S (Myonephropathic-Metabol ic Syndrome)モデルと位置付けられる (別冊 日本臨床領域別症候群 1 7 腎臓症候群 5 2 3頁〜 5 2 6頁、 1 9 9 7年など） 。
一方、 血管の閉塞性病変において、 急性血管閉塞による虚血が持続する と、 広範な虚血性筋壊死が生じ、 血中のクレアチンキナーゼ、 カリウム、 ミオグロビンなどが上昇する M N M Sが発生するので、 グリセロールモデ ルは血管の閉塞性病変のモデルとも考えられ得る。 このようなグリセ口一 ルモデルにおいても、 HGFの静脈内持続投与はボーラス投与に比べてよ り効果的であり、 H G Fの静脈内持続投与は血管の閉塞性病変に対しても 有効であることが判明した。
さらに、 本発明者等は研究した結果、 HGFの血小板数増加作用などに おいても HGFの静脈内持続投与はボーラス投与に比べて有効であり、 一 般的に HGFの単回又は頻回の静脈内ボーラス投与よリも静脈内持続投与 の方が効果的であり、 低投与量で効果を発現し得るという結論が得られた。 本発明は以上のような知見に基づいてなされたものであり、 本発明は、 HGFを有効成分として含有する静脈内持続投与用製剤を提供することを 目的とする。 発明の開示
本発明は、 HGFを有効成分として含有する静脈内持続投与用の製剤を 提供する。 特に、 腎疾患、 血管の閉塞性病変などの治療又は予防に有効な 静脈内持続投与用の製剤を提供する。 本発明の静脈内持続投与用製剤は、 静脈内ボーラス投与と比較して投与量を低減することができるため、 副作 用を軽減できるという効果を有する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1— 3) の投与スケジュールの概要を示す図である。 図 2は、 本評価系に及ぼす麻酔の影響を調べた結果を示すグラフである 図中 Aは BUNに対する影響を、 また図中 Bはクレアチニンに対する影響を、 それぞれ示す。
図 3は、 実施例 1一 4) の投与スケジュールの概要を示す図である。 図 4は、 2投与後0.5時間〜5.5時間の間、 HGF200 g/kg/hr (100 0 g/kg/day) を静脈内持続投与した効果を示すグラフである。 図中 Aは B
UNに対する効果を、 また図中 Bはクレアチニンに対する効果を示す。
図 5は、 実施例 2— 2) の投与スケジュールの概要を示す図である。 図 6は、 (12投与後0.5時間〜5.5時間の間、 HGF60Aig/kg/hr (300 ^g/kg/day) 、 及び H G F 200 μ g/kg/hr (1000 g/kg/day) を静脈内持続 投与した効果を示すグラフである。 図中 Aはクレアチニンに対する効果を、 また図中 Bは BUNに対する効果を示す。
図 7は、 実施例 2— 3) の投与スケジュールの概要を示す図である。 図 8は、 2投与後0.5時間〜2,5時間の間、 HGF60 g/kg/hr (120 ^g/kg/day) 、 及び110?200;^/1¾/ (400 g/kg/day) を静脈内持続 投与した効果を示すグラフである。 図中 Aはクレアチニンに対する効果を、 また図中 Bは BUNに対する効果を示す。
図 9は、 実施例 2— 4) の投与スケジュールの概要を示す図である。 図 1 0は、 HgCl2投与後 0.5時間のみに HGFをそれぞれ lOO^g/kg (2群） 、 300 g/kg (3群） 、 iOOO g/kg (4群） 、 3000/xg/kg (5群） で静脈内単 回投与した効果を示すグラフである。 図中 Aはクレアチニンに対する効果 を、 また図中 Bは BUNに対する効果を示す。
図 1 1は、 実施例 3— 2) の投与スケジュールの概要を示す図である。 図 1 2は、 2投与後0.5時間〜3.5時間の間、 HGF6(^g/kg/hr (18 0 g/kg/day) 、 及び H G F 200 μ g/kg/hr (600 g/kg/day) を静脈内持続 投与した効果を示すグラフである。 図中 Aはクレアチニンに対する効果を、 また図中 Bは B環に対する効果を示す。
図 1 3は、 HGFを静脈内投与したときの血小板数の増加を示すグラフ である。 図中 Aは HGFを静脈内持続投与したときを示し （平均土 SD、 n = 3、 氺 * : コントロールに対して p< 0. 0 1 ) 、 また図中 Bは HG
Fを静脈内ボーラス投与したときを示す （平均土 S D、 n = 6、 * * ： コ ントロ一ルに対して p<0. 0 1 ) 。 発明を実施するための最良の形態
本発明で使用される HGFは公知物質であり、 医薬として使用できる程 度に精製されたものであれば、 種々の方法で調製されたものを用いること ができ、 また既に市販されている製品 （例えば、 東洋紡 Code No.HGF-101 等） を使用してもよい。 HGFの製造法としては、 例えば、 HGFを産生 する初代培養細胞や株化細胞を培養し、 培養上清等から分離、 精製して該 HGFを得ることができる。 あるいは遺伝子工学的手法により HGFをコ 一ドする遺伝子を適切なベクタ一に組み込み、 これを適当な宿主に挿入し て形質転換し、 この形質転換体の培養上清から目的とする組換え HGFを 得ることができる （例えば Nature, 342, 440 (1989)、 特開平 5-111383号 公報、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 967 (1989)など参照） 。 上 記の宿主細胞は特に限定されず、 従来から遺伝子工学的手法で用いられて いる各種の宿主細胞、 例えば大腸菌、 酵母又は動物細胞などを用いること ができる。 このようにして得られた HGFは、 天然型 HGFと実質的に同 じ作用を有する限り、 そのアミノ酸配列中の 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失及びノ又は付加されていてもよく、 また同様に糖鎖が置換、 欠 失及び 又は付加されていてもよい。
本発明の静脈内持続投与用製剤は、 H G Fの薬効が認められている種々 の疾患に対して適用することができるが、 特に腎疾患、 血管の閉塞性病変 に対して好適に適用することができる。 上記の腎疾患としては慢性腎疾患 (腎症、 腎不全、 腎炎） 及び急性腎疾患が挙げられ、 具体的には例えば、 急性腎不全、 慢性腎不全、 糸球体腎炎、 ネフローゼ症候群、 全身性エリテ メ トーデス、 肝疾患に伴う糸球体疾患、 糖尿病性腎症、 尿細管間質性腎炎、 腎血管障害、 高血圧性腎障害、 腎尿路結石、 尿路感染症、 閉塞性腎症、 嚢 胞性腎疾患、 腎 *尿路腫瘍、 遺伝性腎疾患、 腎移植、 腎移植に伴う合併症、 薬剤性腎障害などが例示される。 また、 閉塞性病変としては、 例えば、 下 肢虛血、 急性動脈閉塞、 慢性動脈閉塞、 閉塞性動脈硬化症、 動脈塞栓症、 動脈血栓症、 バージャ一病、 静脈閉塞、 静脈血栓症、 血栓性静脈炎、 血管 形成異常、 血管損傷、 冠動脈閉塞、 冠動脈狭窄、 肺塞栓症、 臓器動脈閉塞 などが含まれる （臨床脈管学、 文光堂、 1 99 2年；治療学 3 1卷、 3号、 284頁— 3 38頁、 1 9 9 7年） 。
その際、 有効成分である HGFに対し、 必要に応じて p H調製剤、 緩衝 剤、 安定化剤、 保存剤、 あるいは可溶化剤等を添加しても良い。 投与量と しては、 症状、 年齢、 性別等によって異なる力 例えば、 腎疾患の治療 · 予防の場合には、 500 g/head/hr以下、 より好ましくは 60 μ g/head/hr "以 下で、 3 0分から 5時間、 好ましくは 3 0分から 3時間かけて静脈内に注 入される。 また、 血管の閉塞性病変の治療 ' 予防の場合には、 1800 g/he ad/hr以下、 より好ましくは 200 g/head/hr以下で、 3 0分から 3時間、 好ましくは 3 0分から 1 . 5時間かけて静脈内に注入される。
なお、 1回の持続投与で効果が不十分であった場合は、 該持続投与を複 数回行うことも可能である。
本発明の静脈内持続投与用製剤の投与時期は問わないが、 後述の実施例 に示されるように、 急性腎不全では発症初期の持続投与により著明な効果 を発揮しており、 患者の発症初期の段階での投与がより好ましい。
さらに、 本発明の静脈内持続投与用製剤は、 前記治療目的の他、 予防の ためにも使用することができる。 例えば、 虚血性あるいは腎毒性による急 性腎不全はいずれも、 手術による出血、 あるいは抗生物質 '抗腫瘍薬 ·造 影剤等の投与に際し、 その副作用として発症する疾患であることから、 前 記急性腎不全は、 前記出血の程度あるいは前記抗生物質や造影剤の投与量 の程度、 あるいは患者の状態などにより、 あらかじめその発症が予測でき る場合がある。 その場合、 本発明の静脈内持続投与用製剤は、 急性腎不全 等の予防のためにも用いることができる。 産業上の利用可能性
本発明により、 H G Fを有効成分として含有する静脈内持続投与用製剤 が提供される。 本発明の持続投与用製剤は、 ボーラス投与と比較して投与 量が低減できることから、 副作用が軽減されるという効果を有する。 実施例
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実 施例によりなんら限定されるものではない。
実施例 1 マウス腎疾患モデルにおける HGFの静脈内持続投与の検討 （ 1 )
1 ) 動物
雄性 BALB/cマウス（5または 6週齢）を SLCより購入し、 温度 23±2°C、 湿度 55±10%、 8:00〜20:00までの照明、 自由摂食、 自由飲水の条件で予備飼育 し、 6.5週齢ないし 8週齢で実験に供した。
2) マウスへの静脈内持続投与
薬液をあらかじめ lmiのシリンジ（テルモ社）にいつぱいまで充填してお き、 それに三方活栓（テルモ社）を間にはさんで翼状針（テルモ社）を取り付 けた （このとき翼は切りとつておく） 。 マウスをネンブタール麻酔（lOOmg /kg, s.c.)し、 37°Cのホッ トプレート上で尾静脈に針を挿入し、 テープで 固定した。 BALB/cマウスに適当な大きさのコニカルチューブの底に呼吸の ための穴をあけ、 反対側にしっぽを外に出すためのスリツ 卜を開けたもの をあらかじめ用意しておき、 これにマウスを入れた。 シリンジをインフユ 一ジョンポンプ（ニューロサイエンス社）にセッ 卜し、 三方活栓でピストン の位置を揃えて、 これを静脈内持続投与のための評価系とし、 以降の実験 (実施例 1〜3) に用いた。
3) 麻酔の影響の検討
前記 2) に記載のように本評価系ではネンブタール麻酔を行うので、 こ れがモデルのでき方や HGFの薬効に影響を与えるかどうかをまず検討した。 投与スケジュールの概要を図 1に示す。
8週齢の雄性 BALB/cマウスを 1群 8匹で 4群に分け、 全群に HgCl2を 8.5mg/k gで背部皮下投与した。 この時を 0時間とした。 -12時間から 12時間まで絶 食 ·絶水処置した。 第 i群と第 2群には HgCl2投与前にネンブタールを lOOmg /kgで後部背部皮下投与した。 HgCl2投与後 0.5， 6, 12, 24, 36時間に、 第 1群と第 3群には vehicleを、 第 2群と第 4群には HGFをそれぞれ投与した。 HG Fは
Figure imgf000010_0001
とした。 48時間後に全群から採血し、 血清分離して尿 素窒素 （BUN) 量とクレアチニン量を測定した （シンクロン CX3システムデ ルタ ：ベックマン社製を使用） 。 HGFはヒ卜組換え型 HGF (以下の実験でも 同様）を、 vehicleは 0.01% Tween80， 0.3M NaClを含む 10mMクェン酸バヅフ ァー （pH6.0) を使用した。 データの統計処理は Tukey's testで行った。 結果を図 2に示す。 クレアチニン値については、 麻酔の有無にかかわら ず、 その上昇の程度に大差はなかった。 また HGFによってクレアチニンの 有意な抑制がみられたが、 効果の程度は麻酔による影響をほとんど受けな かった。 このことから、 HGFの薬効を評価する際に麻酔の影響は気にしな くてよいことが分かった。
4) 静脈内持続投与による薬効の確認
投与スケジュールの概要を図 3に示す。
8週齢の雄性 BALB/cマウスを 1群 10匹で 2群に分け、 全群に HgCl2を 8.5mg/ kgで背部皮下投与した。 この時を 0時間とした。 -12時間から 12時間まで絶 食 ·絶水処置した。 第 1群に vehicle、 第 2群には HGFを、 それぞれ前記 2) の評価系を用いて静脈内持続投与した。 HgCl2投与直前にマウスをネンブ タール麻酔（lOOmg/kg, s.c.)し、 HgC 投与後 0.5時間から上述の方法で持 続投与を行った。 HGFの投与量は 1000 g/kg/dayとし、 200 μ g/kg/hrで 5時 間の持続投与を行った。 48時間に全群から採血し、 血清分離して尿素窒素 (BUN) 量とクレアチニン量を測定した （シンクロン CX3システムデルタ ： ベックマン社製を使用） 。 データの統計処理は t-testで行った。
図 4に実験結果を示す。 BU 、 クレアチニンともに HGFの静脈内持続投与 により有意に抑制された。 従って HGFの静脈内持続投与が腎疾患に対し有 効であることが明らかとなつた。 実施例 2
マウス腎疾患モデルにおける H G Fの静脈内持続投与の検討 （ 2 )
1 ) 動物
雄性 BALB/cマウス （6週齢） を SLCより購入し、 温度 23±2°C、 湿度 55±1 0%、 8:00〜20:00までの照明、 自由摂食、 自由飲水の条件で予備飼育し、 6.
5週齢で実験に供した。
2 ) HGFの投与量低減化の試み（1)
実施例 1 一 4 ) にて 200 g/kg/hrの投与速度で 5時間 HGFを投与して、 有 効性を確認したので、 次に HGFの投与速度を 200 μ g/kg/hrから 60 μ g/kg/hr に減らして 5時間持続投与を行った。 投与スケジュールの概要を図 5に示 す。
雄性 BALB/cマウス（6.5週）を 1群 10匹で 3群に分け、 ネンブタール（lOOmg/ kg s.c.)で麻酔し、 すぐに全群に HgClzを 8.5mg/kgで背部皮下投与した。 このときを 0時間とした。 また、 -12時間から 12時間まで、 絶食 ·絶水処置 を行った。 第 1群には vehicleを、 第 2群には HGFを
Figure imgf000012_0001
day)で、 第 3群には HGFを 200 g/kg/hr(1000jag/kg/day)で、 0.5時間から 5. 5時間まで静脈内に持続投与した。 48時間に全群から採血し、 血清分離し て尿素窒素 （BUN) 量とクレアチニン量を測定した （シンクロン CX3システ ムデルタ ：ベックマン社製を使用） 。 データの統計処理は BartleUの検 定で等分散性が否定されたので、 ノンパラメ 卜リック検定（nonparametric test)で行った。
結果を図 6に示す。 陽性コントロールである 200 g/kg/hr(1000/ g/kg/ day)よりは若干効力が落ちるものの、 60 g/kg/hr (300 g/kg/day) でも クレアチニンの上昇を有意に抑制した。 BU は有意差はなかったものの、 抑制傾向を示した。
3) HGFの投与量低減化の試み （2)
前記 2) の 5時間の持続投与のうち、 後半の 3時間を削って 0.5時間から の 2時間の持続投与を試みた。 投与スケジュールの概要を図 7に示す。
雄性 BALB/cマウス（6.5週）を 1群 10匹で 3群に分け、 ネンブタール（lOOmg/ kg s.c.)で麻酔し、 すぐに、 全群に HgCl2を 8.5mg/kgで背部皮下投与した。 このときを 0時間とした。 また、 -12時間から 12時間まで、 絶食 '絶水処置 を行った。 第 1群には vehicleを、 第 2群には HGFを 60 μ g/kg/hr(120 μ g/kg/ day)で、 第 3群には HGFを ^O g/kg/hr^OO^g/kg/day)で、 0.5時間から 2. 5時間まで静脈内持続投与した。 48時間に全群から採血し、 血清分離して 尿素窒素 （BUN) 量とクレアチニン量を測定した （シンクロン CX3システム デルタ ：ベックマン社製を使用） 。 データの統計処理は Bartleuの検定で 等分散性が否定されたので、 ノンパラメ 卜リック検定で行った。
結果を図 8に示す。 この実験では BUN、 クレアチニンともに、 有意な改 善はなかったが、 改善傾向は認められた。
4 ) HGFの静脈内単回投与の用量-反応相関 静脈内持続投与との比較のために、 HGFの静脈内単回投与の用量-反応相 関を検討した。 投与スケジュールの概要を図 9に示す。
雄性 BALB/cマウスを 1群 10匹で 5群に分け、 全群に HgCl2を 8.5mg/kgで背 部皮下投与した。 このときを 0時間とした。 また、 -12時間から 12時間まで、 絶食 *絶水処置を行った。 第 1群には、 HgCl2投与後 0.5時間のみに vehicle を尾静脈内投与した。 第 2群から第 5群には、 0.5時間のみに HGFをそれぞれ 100, 300， 1000, 3000 g/kgで尾静脈内投与し、 48時間に全群から採血し、 血清分離して尿素窒素 （BUN) 量とクレアチニン量を測定した （シンクロ ン CX3システムデルタ ：ベックマン社製を使用） 。 データの統計処理は Dun nett' s testで行った。
結果を図 1 0に示す。 クレアチニンでみると、 1000 g/kg/day以上の投 与量で有意な改善が認められたが、 300/ g/kg/dayでは改善傾向が認めら れたにとどまり、 lOO^ug/kg/dayでは効果は認められなかった。 それに対 し、 静脈内持続投与では 300 g/kg/dayで有意な改善が認められ （前記 2) 、 また O g/kg/dayでも改善傾向が認められた （前記 3) 。 以上の結果 より、 静脈内単回投与と比較して静脈内持続投与の方が投与量が少なくて 済むことが明らかとなった。 なお本発明者らは別途、 総投与量を合わせて 静脈内頻回投与と単回投与との薬効を比較した結果、 単回投与でも頻回投 与と同様の効果が得られることを明らかにしている （日本腎臓学会誌 vol. 39， 260，演題 0-302) 。 従って HGFの静脈内持続投与は、 単回あるいは頻回 の静脈内ボーラス投与と比較して、 投与量を低減することができる。 実施例 3
マウス腎疾患モデルにおける H G Fの静脈内持続投与の検討 （ 3 )
1 ) 動物
雄性 BALB/cマウスを 6週齢で SLCより購入し、 温度 23±2° (：、 湿度 55±10°ん 8:00〜20:00までの照明、 自由摂食、 自由飲水の条件で予備飼育し、 実験 に供した。
2) HGFの投与量低減化の試み
前記実施例 2— 2) において 300/xg/kg/dayまで投与量を低減できた力 1 20 g/kg/dayでは改善傾向が示されたに留まり、 有意な改善には至ってい なかった。 そこでそのほぼ中間の投与量の 180 μ g/kg/ dayにて検討を行つ た。 投与スケジュールの概要を図 1 1に示す。
雄性 BALB/cマウス（6. 5週）を 1群 10匹で 3群に分け、 ネンブタール（l OOmg/ kg s. c. )で麻酔し、 その直後に、 全群に HgCl2を 9mg/kgで背部皮下投与し た。 このときを 0時間とした。 また、 - 12時間から 24時間まで、 絶食 ·絶水 処置を行った。 第 1群には vehicleを、 第 2群には HGFを 60 g/kg/h ( 180 /z g/ kg/day)で、 第 3群 (陽性コントロール) には HGFを 200 μ g/kg/h(600 μ g/kg /day)で、 0. 5時間から 3. 5時間まで静脈内持続投与した。 48時間に全群か ら採血し、 血清分離して、 クレアチニンと尿素窒素（BUN)を測定した （シ ンクロン CX3システムデルタ ：ベックマン社製を使用） 。 データの統計処 理は、 BarUeUの検定で等分散性が否定されたのでノンパラメ トリック検 定によって行った。
結果を図 1 2に示す。 HGF180 g/kg/day投与群は vehicle投与群に対し て、 クレアチニン、 BUNの上昇を有意に抑制した。 また、 その程度は陽性 コントロールの 600 g/kg/dayとほぼ同程度であった。 実施例 4
ラッ トグリセロールモデルを用いた H G Fの静脈内持続投与の検討
1 ) 材料と方法
7- 8週齢の雄性 Wi star系ラッ ト （体重約 200g) を実験に用いた。 前日の 晩から絶水状態 （15時間） にしたラッ 卜に、 エーテル麻酔下で 50%グリセ ロールを筋肉内投与 （I 0ml /kg) し、 さらに 8時間後まで絶水処置を続け ることによりモデルを作製した。 そして、 グリセロール投与 8時間後から HGFを lmg/kgの投与量で尾静脈内に持続投与した （30分間） 。 投与 1 1日後 まで、 経過を観察した。
また、 同様に作製したモデルに HGFをグリセロール投与 8時間後から計 3回、 尾静脈内にボーラス投与し （計 750 g/kg) 、 経過を観察した。
ノ ？ ίπ:^
グリセロール投与後 1 1日目の生存率は、 持続投与の場合は、 対照群 2 8、 H G F群 8 Z 1 0であった。 カイ二乗検定を用いて検定したところ、 HGFが生存率を有意に （P〈0. 05) 高めていることがわかった。 一方、 ボー ラス投与の場合は、 対照群 5 8、 H G F群 5 Z 8となり、 HGFによる救 命効果はみられなかった。 従って、 ボーラス投与よりも持続投与の方が有 利な傾向にあることが分かった。
以上のことから、 ラッ卜グリセ口一ルモデルに対して、 H G Fの静脈内 持続投与はボーラス投与よりも有効であることが明らかとなった。 従って、 グリセロールモデルと同じく M N M Sの発生する血管の閉塞性病変におい て、 静脈内ボーラス投与よりも静脈内持続投与の方が有効であることが判 明した。 実施例 5
血小板数の増加に対する H G Fの静脈内持続投与の検討
1 ) 材料と方法
7- 8週齢の雄性 Fisher系ラッ 卜を実験に用いた。 持続投与の場合は、 HGF を 0.01%Tween80、 0.25%HASを含む PBSを vehicleとして 2ml/kg/2hrになるよ うに希釈し、 尾静脈内に投与した。 1回の投与量は 0.25mg/kgとしコント ロールには vehicleのみを投与した。 1 日 2回、 連続 7 日間投与し、 最終 投与日の翌日に採血を行い、 半自動血球数解析装置 （シスメックス、 F - 80 0) を用いて血小板数を測定した。
ボ一ラス投与の場合は、 HGFを vehicleで lml/kg/shotになるように希釈 し、 尾静脈内に投与した。 1回の投与量は 0、 0. 125、 0.25、 0.5、 1、 2mg/ kgとし、 1 日 2回、 連続 7 日間行った。
2 ) 結果
結果を図 1 3に示した。 ボーラス投与の場合は、 0.5mg/kgx2/dayの投与 量以上で有意に血小板数を増加させた。 一方持続投与の場合は、 0.25mg/k gx2/dayの投与量でも有意に血小板数を増加させた。 よって、 持続投与の 方が少ない投与量で血小板数を増加できることが明らかとなった。 製剤例 1 生理食塩水 1 00m l中に HGF l mg、 マンニトール 1 g及びポリソ ルベー卜 80 1 0 mgを含む溶液を無菌的に調製し、 1 m lずつバイァ ルに分注した後、 凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。 製剤例 2
0. 02 Mリン酸緩衝液 （ 0. 1 5 M N a C 1及び 0. 0 1 %ポリソ ルべ一卜 80含有、 pH 7. 4 ) 1 00 m 1中に HGF 1 mg及びヒト血 清アルブミン 1 00 mgを含む水溶液を無菌的に調製し、 1 m 1ずつバイ アルに分注した後、 凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た <

Claims

請求の範 HI
1 . 肝実質細胞増殖因子 （H G F ) を有効成分として含有する静脈内持続 投与用製剤。
2 . 腎疾患の治療又は予防に用いられる、 請求の範囲 1記載の静脈内持続 投与用製剤。
3 . 腎疾患が急性腎不全又は慢性腎不全である、 請求の範囲 2記載の静脈 内持続投与用製剤。
4 . 血管の閉塞性病変の治療又は予防に用いられる、 請求の範囲 1記載の 静脈内持続投与用製剤。
δ . 血管の閉塞性病変が、 下肢虚血、 急性動脈閉塞、 慢性動脈閉塞、 閉塞 性動脈硬化症、 動脈塞栓症、 動脈血栓症、 バージャ一病、 静脈閉塞、 静脈 血栓症、 血栓性静脈炎、 血管形成異常、 血管損傷、 冠動脈閉塞、 冠動脈狭 窄、 肺塞栓症又は臓器動脈閉塞である、 請求の範囲 4記載の静脈内持続投 与用製剤。
6 . 有効量の H G Fを静脈内に持続投与することからなる腎疾患の治療又 は予防方法。
7 . 有効量の H G Fを静脈内に持続投与することからなる血管の閉塞性病 変の治療又は予防方法。
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