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WO1999020641A1 - New triplex forming oligonucleotides and their use in anti-hbv - Google Patents

New triplex forming oligonucleotides and their use in anti-hbv Download PDF

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WO1999020641A1
WO1999020641A1 PCT/CN1998/000248 CN9800248W WO9920641A1 WO 1999020641 A1 WO1999020641 A1 WO 1999020641A1 CN 9800248 W CN9800248 W CN 9800248W WO 9920641 A1 WO9920641 A1 WO 9920641A1
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WO
WIPO (PCT)
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triple
helix
gga
dna
gag
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/CN1998/000248
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English (en)
French (fr)
Inventor
Changde Lu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Original Assignee
Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS filed Critical Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
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Priority to JP2000516982A priority patent/JP2002511384A/ja
Priority to AU95287/98A priority patent/AU9528798A/en
Publication of WO1999020641A1 publication Critical patent/WO1999020641A1/zh
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs

Definitions

  • Novel triple helix-forming oligonucleotide and its application in anti-HBV technology Novel triple helix-forming oligonucleotide and its application in anti-HBV technology
  • the present invention relates to a novel triple-helix-forming oligonucleotide, in particular to a novel triple-helix-forming oligonucleotide and its modified derivative with a two-stage homopolypurine / homopolypyrimidine sequence that forms a triple-helix DNA. Structure and its application in anti-HBV. technical background
  • TFO Triplex Forming Oligonucleotide
  • triple-helix DNA can inhibit the binding of protein factors to DNA.
  • TFO with EDTA-Fe 2+ at the end is combined with a specific target sequence to form a triple helix DNA, and the target double-stranded DNA can be specifically cut at the position where the triple helix DNA is formed (Moser HE, Dervan PB., Science, 1987, 238: 645-50.). Therefore, the formation of triple helix DNA is expected to inhibit gene expression at the DNA level, the so-called Antigene Strategy. Compared with antisense technology and ribozyme, it has its advantages.
  • Triple helix-forming oligonucleotides use a specific sequence of double-stranded DNA as a binding site, and by forming a triple-helix DNA with a specific double-stranded DNA sequence or cutting the target DNA at the location of the triple-helix DNA, the gene transcription or replication is inhibited.
  • Antisense nucleic acid and ribozyme All take mRNA as the target, and block mRNA expression by binding with mR A to block translation or promote mRNA degradation. In a cell, multiple mRNAs can be transcribed from a single DNA. Therefore, it may be more effective in blocking gene replication or transcription at the DNA level.
  • a triple-helix-forming oligonucleotide fragment is designed in the promoter of a specific gene to form a triple-helix DNA with a specific sequence of the target gene, preventing DNA from binding to a protein or in a certain gene. Designing a triple-helix-forming oligonucleotide fragment with a specific sequence to form a triple-helix DNA at a specific site prevents replication and transcription complexes from passing, and can inhibit DNA replication or RNA transcription.
  • the triple helix DNA formed by shorter TFO and shorter double-stranded target DNA is not stable and specific, so its inhibitory effect is not strong, which limits the practical application of anti-gene strategies. Only a few theoretical studies have been done to expand the range of target DNA formed by triple helix DNA, and there is no practical application.
  • Home and Dervan et al. Designed an alternating triple-helix DNA, in which two homopolypurine sequences are located on two strands of double-stranded DNA, one part of TFO is paired with one purine strand in the double-strand, and the other part of TFO is Another pair of purine chains in the double strand (Home, DA, Dervan, PB, J. Ain. Chem.
  • HBV is a hepatotropic DNA virus whose infection can cause acute or chronic hepatitis. 80% of patients with Hepatocellular Carcinoma (HCC) are infected with HBV. People with chronic HBV infection are at least 100 times more likely to develop HCC. China is a highly endemic region of Hepatitis B. About 8-10% of the population (approximately 100 million people) are positive for Hepatitis B (virus) Surface Antigen (HBsAg). Hepatitis B caused by HBV infection and its associated HCC are one of the major health problems worldwide. However, so far, effective treatments are still lacking in clinical practice.
  • HCC Hepatocellular Carcinoma
  • An object of the present invention is to provide a triple-helix-forming oligonucleotide capable of forming a triple-helix DNA structure with a homo-purine / homopyrimidine sequence close to the two segments.
  • the triple helix-forming oligonucleotide can inhibit the expression of the hepatitis B virus gene and the reproduction of the hepatitis B virus. It includes two types of genes that can interact with the DR region of HBV and the second S promoter region of the HBV adr subtype, respectively.
  • a homozygous purine / homopyrimidine sequence is combined with a triple helix to form an oligonucleotide. They can also be modified by 3 'monophosphorylation or other chemical modifications to improve stability.
  • the triple helix-forming oligonucleotide can be used as a medicine for treating hepatitis B. Summary of the Invention
  • the present invention provides a triple-helix-forming oligonucleotide capable of forming a triple-helix DNA structure with a homo-purine / homopyrimidine sequence close to the two segments.
  • a triple helix-forming oligonucleotide capable of forming a triple-helix DNA structure with a homo-purine / homopyrimidine sequence close to the two segments.
  • the corresponding triple helix-forming oligonucleotides were designed and applied on a DNA synthesizer
  • the corresponding triple-helix-forming oligonucleotides and 3, monophosphorylated triple-helix-forming oligonucleotides were synthesized: (see Figures 1 and 2)
  • the homo-purine / homopolymer is similar to the two regions of the DR region of the HBV and the promoter region of the pre-S gene.
  • the triple helix is measured by a band electrophoresis band mobility shift assay method. Thermodynamic parameters of DNA formation. TFO B1-B5 can all bind to the two homopolypurine / homopyrimidine sequences of the two pre-S genes of HBV.
  • TFO B1-B4 is stronger than B5, and B4 has the strongest effect.
  • TF0 B11, B12, and B15 can all bind to the two homopolypurine / homopyrimidine sequences in the DR region of HBV.
  • TFO B15 and B12 are stronger than Bl11, and B15 has the strongest effect.
  • B5 and B11 only bind to the preS gene of the HBV adr subtype and a homopolypurine / homopyrimidine sequence in the DR region.
  • TFO B1-B4 is stronger than B5, indicating that TFO B1-B4 can bind to two of the preS genes of HBV. Similar homopurine / homopyrimidine sequences bind.
  • TFO B15 and B12 are stronger than Bll, indicating that TFO B15 and B12 can bind to two similar homopurine / homopyrimidine sequences in the DR region of HBV.
  • the Hoogsteen bond or anti-Hoogsteen bond is paired with the target double-stranded DNA.
  • the new triple helix-forming oligonucleotide of the present invention binds to the two homologous purine / homopyrimidine sequences of the HBV DR region and the two segments of the preS gene of the HBV adr subtype, the target double-stranded DNA structure has a purine to pyrimidine Turn to Purine.
  • this transition reduced the stability of the triple-helix DNA, the stability and specificity of the extended triple-helix-forming oligonucleotide ultimately binding to the target double-stranded DNA were greatly improved, so its inhibitory effect Also stronger. This also proves that the most important factor affecting the stability of the formed triple-helix DNA is the length of the triple-helix-forming oligonucleotide.
  • the present invention uses a HBV gene-containing plasmid ( ⁇ 1.2 ⁇ ) to transfect HepG2 cells of liver origin as a research model to study three The role of helix-forming oligonucleotides.
  • the plasmid (pl.211) contains a 1.2-fold clone of the HBV (adr subtype) gene, including the full-length HBV genome and the overlapping region from 1403 to 1983. It can express all HBV mRNA. After pl.2II is transfected into HepG2 cells, it can produce Produce complete infectious virus particles.
  • HBsAg and HBeAg expression levels can be measured with existing assay kits.
  • the inhibitory effect of triple helix-forming oligonucleotides on HBV gene expression can be observed.
  • the number of HBV virus DNA in cells can be measured.
  • triple helix-forming oligonucleotides such as thiophosphate modification, methyl phosphate modification, 2'-0-methyl modification, 3 , Monophosphorylation modification, etc. to improve its stability.
  • the serum is mainly 3, ⁇ 5, exonuclease, it requires a nucleic acid with an OH group at the 3 'end as a substrate, according to the previous research results of the inventor (see invention patent application number 97106495.4, application date 1997 6 Month 28), take 3, monophosphorylated modified oligonucleotide is the best modified derivative, when the 3 'OH group of the oligonucleotide is phosphorylated, it cannot be used as 3, ⁇ 5, exonuclease
  • the substrate of the enzyme prolongs its residence time in serum and cells, so it can bind to the target gene more effectively.
  • the stability of 3 'phosphorylated oligonucleotides in serum and cells was significantly higher than that of unmodified oligonucleotides, slightly higher than that of phosphorothioate-modified oligonucleotides, and 3' phosphorylated oligonucleotides.
  • the ability of the nucleotide to be taken up by cells is higher than that of unmodified oligonucleotides and thiophosphate-modified oligonucleotides.
  • the 3 'phosphorylated oligonucleotide does not have non-natural modification components, its metabolic degradation products have no toxic and side effects, so it is more superior and safe, and it is a better modification method.
  • the triple-helix-forming oligonucleotides B4 (3T) and B15 (3, P) that have the strongest binding to the target sequence are selected to represent the study of the inhibitory effect of triple-helix-forming oligonucleotides on HBV gene expression and HBV virus reproduction Inhibitory effect.
  • the research results show that the triple helix-forming oligonucleotide synthesized by the present invention can inhibit the expression of HBV gene and the replication of HBV virus DNA, thereby inhibiting the reproduction of hepatitis B virus, and therefore, it can be applied to formulating and inhibiting hepatitis B virus and treating hepatitis B Drug.
  • HBV is a very closely arranged virus, and its four promoter sequences overlap with the coding region.
  • its transcripts that is, the four mRNAs with a length of 3.5kb, 2.4kb, 2.1kb, and 0.8kb, all have a common 3 'end.
  • the 3 'end of the 3.5 kb pregene RA is a template for viral reverse transcription into DNA.
  • the two target sequences of HBV provided by the present invention are also present at 3.5 kb.
  • Pre-gene RNA The DR region is at the 3 'end of the 3.5 kb pregene RNA, and the pre S gene region is in the middle of the 3.5 kb pregene RNA.
  • RNA hybrid triple helix AsDR (3'P) 5 'TCT CCT CCC CCA ACT CCT CCCp 3', which forms the oligonucleotide B15 (3) (or B12 (3 'P), B11 (3, P)) —form a target sequence that can act on RNA to form (DNA) 2: RNA hybrid triple helix.
  • triple helix-forming oligonucleotides and their modified derivatives with negative-sequence oligonucleotides in the same region can both inhibit the transcription of the HBV gene and form it on the target sequence of the pregene RNA.
  • Heterozygous triple helix, which inhibits DNA reverse transcription, can ultimately more effectively inhibit the reproduction of hepatitis B virus.
  • the triple helix-forming oligonucleotide and its modified derivative B4 can be used together with AsPS to formulate drugs that inhibit hepatitis B virus and treat hepatitis B, B15 (or Bl l, B12) It can be used together with AsDR to formulate drugs for inhibiting hepatitis B virus and treating hepatitis B.
  • Triple helix-forming oligonucleotides and their modified derivatives B4 (3, P) (or B1 (3'P), B2 (3, P), B3 (3'P), B5 (3, P)), can And AsPS (3T)-used in the formulation to inhibit hepatitis B virus And medicines for treating hepatitis B.
  • B15 (3, P) (or B11 (3'P), B12 (3, P)) can be used with AsDR (3'P) to formulate drugs that inhibit hepatitis B virus and treat hepatitis B.
  • An oligonucleotide and a modified derivative thereof capable of forming a triple-helix DNA structure with two homo-purine / homopyrimidine sequences close to each other are provided.
  • the length of the oligonucleotide is increased, and thus the formation thereof can be improved.
  • Stability and Specificity of Triple Helix DNA can be formed with two homo-purine / homopyrimidine sequences that are close to each other, thus expanding the application of the anti-gene strategy of triple-helix-forming oligonucleotides.
  • a triple helix-forming oligonucleotide is provided, which can inhibit the expression of the hepatitis B virus gene and the reproduction of the hepatitis B virus. This is a substance that directly inhibits the expression of the hepatitis B virus gene and the reproduction of the virus, and provides a new method for the treatment of hepatitis B.
  • triple-helix-forming oligonucleotides to inhibit HBV gene expression and virus reproduction is highly specific, without affecting the human cells themselves.
  • the triple helix-forming oligonucleotide provided by the present invention can also improve its stability in vivo by adding a phosphate to the 3, terminus. Make their inhibitory effect more obvious. Since the triple helix-forming oligonucleotide of the present invention does not contain non-natural modification components, its degradation products do not have toxic and side effects on the human body.
  • RNA hybrid triple helix structure this structure can Suppressing the passage of replicators, inhibiting reverse transcription from viral RNA to DNA, and enhancing the effect of triple helix-forming oligonucleotides against hepatitis B virus.
  • Figure 1 The 21 bp double-stranded sequence of the HBV pre-S gene and the designed triple-helix-forming oligonucleotide sequence.
  • the numbers in the sequence indicate the position of the underlined bases in the HBV gene.
  • the bases in bold italics are Different nature pairs inserted in genes and bases inserted at corresponding positions in TFO.
  • Figure 2 25 bp double-stranded sequence of the HBVDR region and the designed triple-helix-forming oligonucleotide sequence.
  • the numbers on the sequence indicate the position of the underlined bases in the HBV gene.
  • the bold italic bases are the different nature pairs inserted in the gene and the bases inserted at the corresponding positions in the TFO.
  • FIG. 3 Gel electrophoresis analysis of the 21-bp double-stranded sequence of HBV pre-S gene and TFOBl-B6.
  • A, B, C, D, E, F, G are the results of TFOB1-B6 and control oligonucleotide (NC) binding to double-stranded DNA, respectively.
  • S, D, and T next to the picture indicate the positions of single-stranded, double-stranded, and triple-helix DNA, respectively.
  • S at the bottom of the photo is a single-stranded DNA control without TFO;
  • D is a double-stranded DNA control without TFO;
  • the concentrations of TFO used in 1-7 are 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ⁇
  • A, B, C, D, and E are the results of TFOB11-B15 binding to double-stranded DNA, respectively.
  • the rest is the same as Figure 3.
  • Figure 6 Curve of the relationship between the ratio of triple-helix DNA to double-stranded DNA (b-f) and TFO concentration a when the 25-bp double-stranded sequence of HBVDR region and TFO B11-15 form triple-helix DNA.
  • Figure 7 Time curve of HBsAg expression inhibition by triple helix-forming oligonucleotides.
  • the triple helix-forming oligonucleotide or control deoxynucleotide concentration was 10 Mmol / L. Without oligonucleotide (X), add B4 (3'P) (4), add B15 (3, P) ( ⁇ ), control deoxynucleotide (A).
  • Figure 8 Time curve of HBeAg expression inhibition by triple helix-forming oligonucleotides.
  • the triple helix-forming oligonucleotide or control deoxynucleotide concentration was 10 m O l / L.
  • the concentration of the triple helix-forming oligonucleotide B15 is 10 ⁇ / L.
  • Figure 10 Ding? 0815 (3>) inhibited HBeAg expression in HepG 2 cells pre-transfected with 1 ⁇ ⁇ plasmid.
  • the concentration of the triple helix-forming oligonucleotide B15 was 10 ⁇ / L.
  • Figure 11 Dot blot detection of HBV DNA in HepG 2 cells.
  • TFO B1-B4 is used at the corresponding position of the pre-S gene fragment cytosine, respectively, using thymine, cytosine, adenine or guanine to determine which base can be better paired with GC to form a more stable TFO B6 is the same as the 11 nucleotides at the 5 'end of TFO B1-B4, which are all purine nucleotides, and can be the same as the pre-S gene.
  • the fragment forms a triple helix DNA, and the 8 nucleotides at the 3 ′ end of TFO B6 are all T, which cannot form a triple helix DNA with the pre-S gene fragment.
  • TFO Bl-B4 and TFO B6 By comparing the stability of TFO Bl-B4 and TFO B6 with the pre-S gene fragment to form a triple helix DNA, we can understand whether the 3, TFO B1-B4 end can form a triple-helix DNA with the pre-S gene fragment, so that it is known that In the double-stranded DNA / homopolypyrimidine sequence, if a base of a different nature is inserted, whether triple-helix DNA formation is interrupted or not, NC is the control oligonucleotide.
  • the corresponding positions of TT in the fragment are AA, GG, CC or TT, respectively, to determine which base can be better paired with two ATs to form a more stable tribasic body, so that the triple helix DNA it forms has High stability;
  • TFO B1-B5 and TFO B11-B15 oligonucleotides were modified by 3'monophosphorylation.
  • Oligonucleotides were synthesized on a DNA synthesizer (ABI391-EP) manufactured by PE company using the phosphite amide triester method, and purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a 0.2 ⁇ mol solid phase column (product of Glen Research) was used to synthesize using a 0.2 ⁇ mol synthesis sequence on an ABI 391EP DNA synthesizer.
  • a 0.2 ⁇ ⁇ 3 'phosphate solid-phase column (3'-phosphate CPG Glen Research company product, full name 2- [2- (4,4, -dimethyltriphenylmethoxy) ethanesulfonyl] ethyl-butane
  • Diacyl long-chain fluorenylamine-microporous glass beads (2- [2- (4,4'-Dimethoxytrityloxy) ethylsulfomyl] ethyl-succinoyl long chain alkylamino-CPG) were synthesized using the same synthetic sequence.
  • oligonucleotide fragment 1 Take 50 pmol of oligonucleotide fragment 1 (or ⁇ ), add 50 ⁇ [ ⁇ - 32 ⁇ ] ⁇ , 2 u ⁇ 4 polynucleotide kinase, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 4 Forward Buffer, add double distilled water to 10 ⁇ Incubate at 37 ° C for 1 hour, take 4 ⁇ 1 in an ice bath, add another 6 ⁇ 1 to 50 pmol oligonucleotide fragment ⁇ (or IV), incubate at 100 ° C for 5 minutes, slowly anneal, and then walk 15% non-denaturing polymer.
  • TFO + double-stranded DNA triple-helix DNA, assuming that the initial concentrations of the triple-helix-forming oligonucleotide and the double-stranded DNA are a and b, respectively.
  • the concentration of the helical DNA is f.
  • the concentrations of the triple-helix-forming oligonucleotide and the double-stranded DNA after equilibrium are (af) and (bf), respectively.
  • Ka ⁇ When a »f, a-f « a, then,
  • 2-2-1 TFO and Hepatitis B virus preS gene are similar to two homopurine / homopyrimidine sequences 2-2-1-1 TFO and labeled hepatitis B virus preS double-stranded gene segment to form triple helix DNA and coagulate Gel block analysis
  • Oligonucleotide fragment I was renatured after fragmentation at the 5 and 32 P ends, and purified by polyacrylamide gel electrophoresis to obtain a 32 P-labeled oligonucleotide single-strand and a 32 P-labeled hepatitis B virus preS gene. Double-stranded fragment.
  • a synthetic oligonucleotide and a 32 P-labeled double-stranded fragment of the hepatitis B virus preS gene were used for gel retardation analysis.
  • the oligonucleotide designed and synthesized in the present invention, in addition to the control oligonucleotide NC, has other oligonucleotides.
  • the nucleotides Bl, B2, B3, B4, B5, and B6 can all form triple helix DNA with the hepatitis B virus gene fragment, as shown in FIG.
  • Tri-helix DNA was formed, and the 8 poly T bases at its 3 and ends could not be paired with the target double-stranded DNA.
  • the results are shown in Figure 3, Figure 4, and Table 1.
  • TFO B6 and the HBV preS gene fragment formed a triple-helix.
  • the amount of DNA and its Ka value are significantly less than those of oligonucleotides B1-B4, and are similar to B5, indicating that both the 5 'and 3' ends of oligonucleotides B1-B4 can interact with the target double-stranded DNA Combine to form triple helix DNA.
  • TFO Bl-B4 has 5 polynucleosides of the same sequence at the 5 terminal, 11 nucleotides and 3 3 terminal nucleotides, except that the 12th position is D, C, A or G, respectively. They are different from the stability of the triple-helix DNA formed by the pre-S segment of the hepatitis B virus gene. It can be understood that the corresponding position in the third helical oligonucleotide of the target double-stranded DNA homopolypurine strand when inserted into a single cytosine Which base to use to pair it with.
  • the results show that the combination of TFO B4 and the hepatitis B virus gene fragment to form triple-helix DNA is the most stable. Therefore, if a C base is inserted in the middle of the homopolypurine strand of the target double-stranded DNA, it is more stable to form a GGC tribase by applying a G base to the homopolypurine TFO.
  • TFO B5 has only 11 nucleotides and TFO B1-B4 has 17 nucleotides.
  • oligonucleotide B5 can form triple-helix DNA with the target sequence, it is less stable than TFO B1-B4. Therefore, relative to the same target double-stranded DNA sequence, the longer the TFO, the more stable the triple helix DNA they form, and the length of the oligonucleotide is the main factor that determines the stability of the triple helix DNA.
  • Oligonucleotide fragment m was renatured with fragment IV after being labeled at 5, terminal 32 P, and purified by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis to obtain 32 P-labeled oligonucleotide single-strand and 32 P-labeled hepatitis B virus DR Area Domain double-stranded fragment.
  • the synthetic oligonucleotide and the 32 P-labeled double-stranded fragment of the hepatitis B virus DR region were used for gel block analysis.
  • the oligonucleotides Bl, B12, B13, B14, and B15 designed and synthesized by the present invention can be used with the hepatitis B virus.
  • the DR segment of the gene forms a triple helix DNA, as shown in Figure 5.
  • end 8 bp of the 21 ′ bp gene fragment from 1734 to 1754 of the DR region of hepatitis B virus are homopolypurines / homopolypyrimidines Sequence, two AT base pairs are inserted at positions 1745 and 1746 in the middle.
  • the 11 homopolypurine bases of TFO B11 can bind to the first homopolypurine / homopyrimidine sequence at the 5 'end of the target DNA.
  • the 11' 5 'end of TFO B12-B15 and 8 at the 3' end The oligopurine nucleotides of the nucleotides can bind to two homopolypurine / homopyrimidine sequences of the target double-stranded DNA, respectively, and two nucleotides AA, GG, CC and TT are inserted in the middle. Based on the differences between the stability of the triple-helix DNA and the hepatitis B virus gene fragments, the corresponding position in the third helical oligonucleotide of the homo-purine strand of the target double-stranded DNA can be understood. Which base should be used to pair it with.
  • Nucleotides B11-B15 can be combined with target double-stranded DNA to form triple helix DNA, but their stability is different.
  • the stability of TFO B13 combined with target DNA to form triple helix DNA and the stability of B11 combined with target DNA to form triple helix DNA are similar, indicating that only 11 bases at the 5 'end of TFO B13 participate in the formation of triple helix DNA, while TFO B15
  • the stability of B12 and target DNA forming triple helix DNA is significantly higher than the stability of B11 and target DNA forming triple helix DNA, indicating that TFO B15 and B12 have 5 nucleotides, 11 ends and 3, 8 nucleosides.
  • TFO B14 has only 11 nucleotides and TFO B15 has 21 nucleotides. Both of them can form triple-helix DNA with the target sequence.
  • TFO B15 and target DNA to form triple-helix DNA is significantly higher than that of TFO B11.
  • TFO B15 and the target DNA in the DR region Comparing the stability of TFO B15 and the target DNA in the DR region to form a triple helix DN A compared to the stability of TFO B4 and the DNA in the pre S region to form a triple helix DNA, TFO B15 and the target DNA in the DR region form a triple helix The stability of DNA is higher than that of TFO B4 and the target DNA of the pre-S region to form a triple helix DNA. B15 is longer than B4, which also indicates that the longer the TFO, the more stable the triple helix DNA they form.
  • Example 3 Effect of Triple Helix-forming Oligonucleotides B4 (3, P) and B15 (3, P) on Hepatitis B Virus Gene Expression
  • HepG 2 cells were cultured in 1 x DMEM (containing 10% fetal bovine serum) at 37 ° C, 5% C0 2. One day before transfection, the cells were seeded in 96-well plates and cultured overnight. 2 hours before transfection Replace with fresh medium.
  • 1 x DMEM containing 10% fetal bovine serum
  • Preparation solution A 0.8 ⁇ ⁇ plasmid pl.2II (by Wang, Shanghai Institute of Biochemistry, Chinese Academy of Sciences (Provided by Professor Yuan), and different concentrations of deoxynucleotides TFO B4 (3'P) or TFO B15 (3'P), deoxynucleotides are 0, 40, 80, 120, 160, 200 pmoL when When the transfection volume is 20 ⁇ , the final concentration of deoxynucleotide is 0, 2, 4, 6, 8, 10 ⁇ / L), add DMEM to 10 ⁇ 1, and mix; Solution B: 0.3 ⁇ lipofectin, 9.7 ⁇ DMEM, mix well and leave at room temperature for 30 minutes. Solution A and solution B were mixed and left at room temperature for 30 minutes.
  • Inhibition rate A M2 X 1 0t without uridine
  • HepG2 cells were cultured in 12-well plates, and each well was transfected with TFO B4 (3, P) or TFO B15 (3, P) with HB V gene plasmid pi.211 10 ⁇ g and 10 pmol / L, each sample Repeat 3 times, and every Take 12 ⁇ ⁇ culture medium for 12 hours, of which 100 ⁇ culture medium is used to determine HBeAg, and another 100 ⁇ culture medium is used to determine HBsAg. The average value is calculated in three replicates. The results are shown in Figures 7 and 8.
  • HBeAg and HBsAg began to be expressed on the second day, and the expression gradually increased with time.
  • 10 ⁇ / L TFO B4 (3'P) or TFO B15 (3T) were co-transfected with HBV plasmid DNA, the expressions of HBeAg and HBsAg were significantly lower than without TFO, especially when TFO B15 (3'P ), The inhibition of HBeAg and HBsAg expression was particularly significant, and the expression of HBeAg and HBsAg increased slowly.
  • HBeAg and HBsAg are significantly smaller than the inhibitory effect of triple helix-forming oligonucleotides on the expression of HBeAg and HBsAg.
  • HepG2 cells were cultured in a 12-well plate, and each well was transfected with the plasmid HBV gene pl.2II, respectively. Then, was added to the cell culture medium at a final concentration of 10 0101? 0 815 (3), repeat 3 times for each sample, and take 200 ⁇ culture medium every 10 hours, of which 100 ⁇ culture medium is used to determine HBeAg, and another 100 ⁇ culture medium is used to determine HBsAg. The results are shown in Figures 9 and 10. After the HBV gene was transfected into HepG 2 cells, when no triple helix was added to form the oligonucleotide, HBeAg and HBsAg began to be expressed on the second day, and the expression gradually increased with time.
  • HepG 2 cells were cultured in 1 x DMEM (containing 10% fetal bovine serum) culture medium, at 37 ° C, 5% C0 2 culture day, cells were seeded in 12-well plates, cultured overnight before transfection, transfection before 5 Change the fresh culture medium every hour.
  • Preparation solution A plasmid ⁇ 1.2 ⁇ 10 ⁇ ⁇
  • the final concentration of the triple helix-forming oligonucleotide in the transfection mixture was 10 ⁇ / L
  • serum-free DMEM was added to 110 ⁇ , and mixed
  • solution B 6 ⁇ lipofectin, 114 ⁇ serum-free DMEM, mix well and leave at room temperature for 30 minutes.
  • 10 ⁇ / L triple helix-forming oligos were treated for 5 days, then the cells were digested with trypsin, and the cells repeated three times were combined, centrifuged at 3000 g for 2 minutes at 4 ° C, and the cells were collected in 1.5 ml Eppendorf tubes and 1 ml of TRIzol reagent was added Mix well, let stand for 5 minutes at room temperature, add 0.2 ml of chloroform, shake for 15 seconds, place at room temperature for 2-3 minutes, centrifuge at 1200g for 15 minutes at 4 ° C, transfer the aqueous phase to another 1.5 ml Eppendorf tube, For total RNA extraction.
  • Plasmid ⁇ 1.2 ⁇ was digested with BamHI and electrophoresed to purify a complete linear HBV DNA with a length of 3.2 kb.
  • HBV DNA probes were prepared using a random hexanucleotide primer method (see: Molecular Cloning Experiment Guide, Second Edition, J By Sambrook &, EF Fritsch and T. Maniatis, translated by Jin Dongyan, etc. Science Press, 1986, 502-504).
  • a denatured DNA sample was spotted onto a nylon membrane with a suction filter sampler, cross-linked to the membrane with UV, and then hybridized with a 32 P-labeled HBV DNA probe.

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Description

新的三螺旋形成寡核苷酸及其在抗乙肝病毒中的应用 技术领域
本发明涉及一种新的三螺旋形成寡核苷酸，尤指一种新的三螺旋形成寡核 苷酸及其修饰衍生物与二段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列形成三螺旋 DNA 结构及其在抗乙型肝炎病毒中的应用。 技术背景
80年代， 发现在体内的均聚嘌呤或均聚嘧啶序列双链 DNA可以反折过 来， 其中一条链与 5'上游的均聚嘌呤或均聚嘧啶的双链 DNA形成三螺旋 DNA, 而与之配对的另一条链则成为单链， 而且三螺旋 DNA还参与了基因表 达的调控 (Lyamichev VI， Mirkm SM, et al., J Biomol Struct Dyn, 1986， 3: 667-9. Larsen A, Weintraub H, et al., Cell, 1982, 29: 609-22. Htun H, Da lberg JE. Science, 1989, 243: 1571-76.)。 在体外也可以通过寡核苷酸与特异的靶 DNA 识别， 形成三螺旋 DNA, —条均聚嘌呤或均聚嘧啶的寡核苷酸链能够以碱基 配对的方式特异地识别相应的均聚嘌呤 /均聚嘧啶的双链 DNA 序列， 以 Hoogsteen键或反 Hoogsteen键与双链 DNA中的嘌呤链结合形成稳定的三螺旋 DNA结构。与双链 DNA形成三螺旋 DNA的寡核苷酸片段则称为三螺旋形成 寡核苷酸 (Triplex Forming Oligonucleotide, TFO),三螺旋 DNA的形成可以阻抑 蛋白因子与 DNA结合。用末端带有 EDTA-Fe2+的 TFO与特异的靶序列结合形 成三螺旋 DNA，还能在三螺旋 DNA形成的位置特异地切断靶双链 DNA(Moser HE, Dervan PB., Science, 1987, 238: 645-50.)。 因此通过三螺旋 DNA的形成， 有望在 DNA水平抑制基因表达， 即所谓的抗基因策略（Antigene Strategy)。 它与反义技术及核酶相比， 有其优越性。 三螺旋形成寡核苷酸是以双链 DNA 的特定序列为结合位点， 通过与特定的双链 DNA序列形成三螺旋 DNA或在 三螺旋 DNA的位置上切断靶 DNA, 抑制基因转录或复制。 反义核酸及核酶 均是以 mRNA为作用靶， 通过与 mR A结合以阻断翻译或促进 mRNA降解 的方式来达到阻断基因表达的目的。 在细胞中， 一个考贝 DNA可以转录出多 个 mRNA考贝。 因此， 在 DNA水平阻断基因的复制或转录方面可能更为有 效。 根据三螺旋 DNA形成的原理及配对规则， 在某一特定基因的启动子中设 计三螺旋形成寡核苷酸片段与靶基因的特定序列形成三螺旋 DN A，阻碍 DN A 与蛋白质结合或在某一特定部位设计三螺旋形成寡核苷酸片段与其特定序列 形成三螺旋 DNA， 阻碍复制、 转录复合体通过， 可以抑制 DNA复制或 RNA 的转录。 1988年 Cooney等证实在人 c-myc基因起始位点形成的分子间三螺旋 结构可抑制 c-myc的转录 (Cooney,M.， Science,1988,241:450-9)。 然而， 至今还 很少有利用 TFO抑制基因表达的实际应用。 查阅各国专利， 仅有一项专利涉 及用 TFO抑制雄激素受体基因的表达 (US.5556956, 1996,9,17)。 其主要原因是 在基因的启动子或在某些特定区域中很少有足够长的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序 列。较短的 TFO与较短的双链靶 DN A形成的三螺旋 DN A稳定性和专一性不 高， 因而其抑制作用也不强， 限制了抗基因策略的实际应用。 对于扩大三螺 旋 DNA形成的靶 DNA范围仅作了一些理论的研究， 并无实际应用。 Home 和 Dervan等设计了一种交替式的三螺旋 DNA，即两段均聚嘌呤序列位于双链 DNA的两条链上， TFO的一部分与双链中的一条嘌呤链配对， 而 TFO的另一 部分则与双链中的另一条嘌呤链配对（ Home, D.A., Dervan, P.B., J. Ain.Chem. Soc, 1990,112,2435-37.)。 对于三螺旋 DNA形成的稳定性， 也有人进行了研 究。 发现虽然含有单个错配碱基仍然可以形成三螺旋 DNA, 但其稳定性明显 降低。 因此， 研究新的 TFO结构并用于抑制有害基因的表达仍是要解决的问 题。 也有人研究了 TFO的化学修饰来提高 TFO的稳定性及抑制作用， 包括硫 磷酸修饰（ Tu,et al., J.Biol.Chem.,1995,270:28402-7), 3，接一个氨基酸 (OrsenJF.M. et al., Nucleic Acids Res.,1991, 19:3435-41; Postel,E.H. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88:8827-31; McShan,W.M. et al, J. Biol. Chem., 1992, 267:5712- 21), 3，接胆固醇 (Ing,N.H. et al., Nucleic Acids Res., 1993， 21 :2789-96·)等。 虽然 一些化学修饰可以提高 TFO的稳定性及抑制作用，但 TFO的长度仍然是决定 TFO的稳定性的最主要的因素。
HBV是一种嗜肝性 DNA病毒， 其感染可引起急性或慢性肝炎。肝细胞癌 (Hepatocellular Carcinoma, HCC)患者中， 有 80 %是 HB V感染者， 受 HB V慢 性感染的人群患 HCC的相对危险性至少增加 100倍。 我国是乙型肝炎高流行 区，有大约 8 - 10 %的人群 (约 1亿人口）为乙型肝炎（病毒）表面抗原 (Hepatitis B (virus) Surface Antigen, HBsAg)的阳性者。 由 HBV感染引起的乙型肝炎与其 相关的 HCC是世界性的主要健康问题之一。 但是， 到目前为止， 临床上仍缺 乏有效的治疗方法。 因此， 发展抗 HBV的三螺旋形成寡核苷酸作为研究新的 治疗方法也是当今的科研方向。但在 HBV基因中没有足够长的均聚嘌呤 /均聚 嘧啶序列可以作为三螺旋形成寡核苷酸的作用靶， 所以寻找一种新的三螺旋 DNA结构是一个很有意义的科研工作。 发明目的
本发明的目的是提供一种能与二段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列形成三 螺旋 DN A结构的三螺旋形成寡核苷酸。该三螺旋形成寡核苷酸能够抑制乙型 肝炎病毒基因的表达及乙型肝炎病毒的繁殖， 它包括二类分别能与 HBV 的 DR区域及 HBV adr亚型的前 S基因启动子区域的二段相近的均聚嘌呤 /均聚 嘧啶序列结合的三螺旋形成寡核苷酸。 它们还能通过 3'单磷酸化修饰或其他 化学修饰以提高稳定性。 该三螺旋形成寡核苷酸可应用于作为治疗乙型肝炎 的药物。 发明内容
本发明提供一种能与二段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列形成三螺旋 DNA 结构的三螺旋形成寡核苷酸。根据三螺旋 DNA形成的原理及 HBV基因序列， 针对 HBV的 DR区域及 HBVadr亚型的前 S基因启动子区域的二段相近的均 聚嘌呤 /均聚嘧啶序列， 本发明设计了相应的三螺旋形成寡核苷酸， 并在 DNA 合成仪上合成了相应的三螺旋形成寡核苷酸及 3，单磷酸化修饰的三螺旋形成 寡核苷酸： （参见图 1和图 2 )
B1 5， AAG GAG GAG GAT GGA GG 3' 17nt
B2 5， AAG GAG GAG GAC GGA GG 3， 17nt
B3 5' AAG GAG GAG GAA GGA GG 3' 17nt
B4 5， AAG GAG GAG GAG GGA GG 3， 17nt
B5 5' AAG GAG GAG GA 3' l int
Bll 5 ' AG A GGA GGG GG 3' l int
B12 5' AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3， 21nt
B13 5' AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGG 3' 21nt
B14 5， AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGG 3， 21nt
B15 5' AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3' 21nt
B1(3'P) 5 ' AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3' 17nt
B2(3，P) 5， AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3' 17nt
B3(3'P) 5， AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3， 17nt
B4(3'P) 5 ' AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3 ' 17nt
B5(3'P) 5' AAG GAG GAG GAp 3, 1 Int
B11(3'P) 5 ' AGA GGA GGG GGp 3' l int
B12(3，P) 5， AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3， 2 lnt
B13(3'P) 5， AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGGp 3' 2 lnt
B14(3，P) 5， AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGGp 3， 2 lnt
B15(3'P) 5， AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3， 21nt 为了研究三螺旋形成寡核苷酸与 HBV 的 DR 区域及前 S基因启动 子区域的两段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列结合的能力， 本发明用凝 胶电泳条带移位（Band mobility shift assays)的方法测定了 三螺旋 DNA形成的热力学参数。 TFO B1-B5 都能与 HBV 的前 S基因的两段相 近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列结合。 其中 TFO B1-B4强于 B5， B4的作用最 强。 TF0 B11,B12及 B15都能与 HBV 的 DR区域的两段相近的均聚嘌呤 / 均聚嘧啶序列结合， 其中 TFO B15和 B12强于 Bl l , B15的作用最强。 B5 和 B11分别只与 HBV adr亚型的前 S基因及 DR区域的一段均聚嘌呤 / 均聚嘧啶序列结合， TFO B1-B4强于 B5说明 TFO B1-B4能与 HBV 的前 S基因的两段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列结合。另一个对照的寡核苷 酸 TFOB6 , 它的 3， 端比 B5 多了 8个 T , 不能与第二段均聚嘌呤 / 均聚嘧啶序列结合， 它与靶序列的结合明显弱于 B5， 也证明了这一 点。 同样， TFO B15和 B12强于 Bll，说明 TFO B15和 B12能与 HBV 的 DR区域的两段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列结合。 这些结果说明本发 明设计的三螺旋形成寡核苷酸可以与两段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列 结合形成一种新的三螺旋 DNA结构， 而且， 结合强的 TFO 中碱基也是以 Hoogsteen键或反 Hoogsteen键原则与靶双链 DNA配对的。本发明的新的三螺 旋形成寡核苷酸与 HBV 的 DR区域及 HBV adr亚型前 S基因的两段 相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列结合时靶双链 DNA结构有从嘌呤到嘧啶到 嘌呤的转折。 这一转折虽然使三螺旋 DNA的稳定性有所降低， 但延长了的三 螺旋形成寡核苷酸最终与靶双链 DNA结合的稳定性及专一性都大大得到了提 高， 因而其抑制作用也更强。 这也证明影响形成的三螺旋 DNA的稳定性的最 主要因素是三螺旋形成寡核苷酸的长度。
为了研究三螺旋形成寡核苷酸对于 HBV基因表达及病毒自身繁殖的抑制 作用， 本发明釆用含 HBV基因的质粒 (ρ1.2Π) 转染到肝来源的 HepG2细胞作 为研究的模型来研究三螺旋形成寡核苷酸的作用。 质粒 (pl.211)含有 1.2倍长 度的 HBV(adr亚型)基因克隆， 包括全长的 HBV基因组及 1403〜1983的重叠 区， 它能表达所有的 HBV mRNA。 pl.2II转染到 HepG2细胞中之后， 可以产 生完整的有感染活力的病毒颗粒。用已有的测定试剂盒测定 HBsAg和 HBeAg 的表达量， 可以观察三螺旋形成寡核苷酸对 HBV基因表达的抑制作用， 测定 细胞中 HBV病毒 DNA的考贝数，可以观察三螺旋形成寡核苷酸对 HBV病毒 繁殖的抑制作用。
考虑到血清中及细胞内有较高活性的核酸水解酶，可以通过对三螺旋形成 寡核苷酸进行化学修饰， 例如硫磷酸修饰、 甲基磷酸修饰、 2'-0-甲基修饰、 3， 单磷酸化修饰等， 以提高其稳定性。 由于血清中主要为 3，→5，核酸外切酶， 它要求 3'端为 OH基团的核酸为底物， 根据发明人以前的研究成果（参见发 明专利申请号 97106495.4， 申请日 1997年 6月 28曰） ， 釆取 3，单磷酸化修 饰寡核苷酸为最佳修饰衍生物， 当寡核苷酸 3'的 OH基团被磷酸化后， 不能 作为 3，→5，核酸外切酶的底物， 延长了其在血清中及细胞内的滞留时间， 因 此能够更有效地与目的基因相结合。在血清中和细胞内 3'磷酸化修饰的寡核苷 酸的稳定性明显高于不修饰的寡核苷酸， 略高于硫磷酸修饰的寡核苷酸， 3' 磷酸化修饰的寡核苷酸被细胞摄取的能力高于不修饰的寡核苷酸及硫磷酸修 饰的寡核苷酸。 此外， 由于 3'磷酸化修饰的寡核苷酸不带非天然的修饰成份， 其代谢降解产物无任何毒副作用， 因此更为优越与安全， 是一种更好的修饰 方式。 本发明选择与靶序列结合最强的三螺旋形成寡核苷酸 B4(3T)和 B15(3，P)为代表研究三螺旋形成寡核苷酸对 HBV 基因表达的抑制作用和对 HBV病毒繁殖的抑制作用。 研究结果证明本发明合成的三螺旋形成寡核苷酸 能够抑制 HBV基因的表达以及 HBV病毒 DNA的复制，从而抑制乙型肝炎病 毒的繁殖， 因此， 可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的药物。
此外， HBV是一种基因安排得非常紧密的病毒， 它的 4种启动子序列都 与编码区重叠。 而且它的转录产物， 即 4种长度分别为 3.5kb, 2.4kb, 2.1kb, 0.8kb的 mRNA都有共同的 3' 末端。 3.5kb的前基因 R A的 3' 末端是病毒 反转录成 DNA的模板。 本发明提供的 HBV的 2个靶序列也都存在于 3.5kb 的前基因 RNA中。 DR区在 3.5kb的前基因 RNA的 3'端，前 S基因区在 3.5kb 的前基因 RNA的中间。同时加入 DR区域的负链序列寡核苷酸： AsDR 5 ' TCT CCT CCC CCA ACT CCT CCC3，或其修饰衍生物， 它与三螺旋形成寡核苷酸 B15 (或 B12, B11 )及其修饰衍生物一起可以作用于 RNA上的靶序列而形成 (DNA)2:RNA杂合三螺旋。 或同时加入前 S 区域的负链序列寡核苷酸： AsPS 5'GGA GGC AGG AGG AGG AA 3'或其修饰衍生物， 它与三螺旋形成寡核苷 酸 B4(或 Bl， B2, B3 , B5)及其修饰衍生物一起可以作用于 R A上的靶序列 而形成 (DNA)2:RNA杂合三螺旋。 或同时加入 DR区域的负链序列寡核苷酸： AsDR ( 3'P ) 5' TCT CCT CCC CCA ACT CCT CCCp 3' , 它与三螺旋形成寡 核苷酸 B15 ( 3 ) (或 B12 ( 3'P ) ,B11(3，P) ) —起可以作用于 RNA上的靶 序列而形成 （DNA ) 2 ： RNA杂合三螺旋。 或同时加入前 S区域的负链序列 寡核苷酸： AsPS (3，P) 5' GGA GGC AGG AGG AGG AAp 3' ， 它与三螺旋 形成寡核苷酸 B4 ( 3 ) (或 Β1(3，Ρ),Β2(3'Ρ),Β3(3'Ρ),Β5(3，Ρ) )—起可以作用 于 R A上的靶序列而形成 （DNA ) 2： DNA杂合三螺旋。 DNA上的这一段 (DNA)2:R A杂合三螺旋结构可以阻抑复制体的通过， 达到抑制从病毒 RNA 反转录成 DNA的作用。其结果是增强了三螺旋形成寡核苷酸抗乙型肝炎病毒 的作用。
因此， 对于 HBV, 将三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物与同一区域的 负链序列寡核苷酸一起应用既可以抑制 HBV基因的转录， 又可以在前基因 RNA的靶序列上形成杂合三螺旋， 抑制 DNA反转录， 最终能更有效地抑制 乙型肝炎病毒的繁殖。 因而三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物 B4 (或 Bl， B2, B3, B5)， 可以与 AsPS—起应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的 药物， B15(或 Bl l , B12 )可以与 AsDR—起应用于配制抑制乙肝病毒及治疗 乙型肝炎的药物。 三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物 B4(3，P) (或 B1(3'P)， B2(3，P), B3(3'P), B5(3，P))， 可以与 AsPS(3T)—起应用于配制抑制乙肝病毒 及治疗乙型肝炎的药物。 B15(3，P) (或 B11(3'P)， B12(3，P) )可以与 AsDR(3'P) 一起应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的药物。
本发明的优点在于：
1.提供了一种能与两段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列形成三螺旋 DNA结 构的寡核苷酸及其修饰衍生物， 由于增加了寡核苷酸的长度， 因而可以提高 形成三螺旋 DNA 的稳定性和专一性。 由于能与两段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧 啶序列形成三螺旋 DNA结构， 因而扩展了三螺旋形成寡核苷酸的抗基因策略 的应用范围。
2.提供了一种三螺旋形成寡核苷酸， 它能抑制乙型肝炎病毒基因的表达及 乙型肝炎病毒的繁殖。 这是一种直接抑制乙型肝炎病毒基因的表达及病毒的 繁殖的物质， 为乙型肝炎的治疗提供了新的方法。
3.用三螺旋形成寡核苷酸抑制 HBV基因的表达及病毒的繁殖具有专一性 高的特点， 而不会对人体细胞本身产生影响。
4.本发明提供的三螺旋形成寡核苷酸还可以通过在 3，末端加上一个磷酸 提高其在体内的稳定性。 使它们的抑制作用更加明显。 由于本发明三螺旋形 成寡核苷酸不含非天然的修饰成分， 其降解产物不会对人体产生毒副作用。
5.同时加入同一区域的负链序列寡核苷酸， 它与三螺旋形成寡核苷酸一起 可以作用于 RNA上的靶序列而形成 (DNA)2:RNA杂合三螺旋结构， 此结构可 以阻抑复制体的通过， 抑制从病毒 RNA反转录成 DNA, 增强了三螺旋形成 寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的作用。 附图说明
图 1 HBV 前 S基因的 21 bp双链序列及设计的三螺旋形成寡核苷酸序 列。
序列上的数字表示有下划线的碱基在 HBV基因中的位置， 粗斜体碱基为 基因中插入的不同性质配对及在 TFO中相应位置插入的碱基。
图 2HBVDR区域的 25 bp双链序列及设计的三螺旋形成寡核苷酸序列。 序列上的数字表示有下划线的碱基在 HBV基因中的位置， 粗斜体碱基为 基因中插入的不同性质配对及在 TFO中相应位置插入的碱基。
图 3HBV 前 S基因的 21bp双链序列与 TFOBl-B6形成三螺旋DNA的 凝胶电泳分析。 A,B,C,D,E,F,G分别是 TFOB1-B6和对照寡核苷酸 (NC)与双链 DNA结合的结果。 照片旁的 S,D,T分别表示单链、 双链和三螺旋 DNA的位 置。 照片底部的 S为不加 TFO的单链 DNA对照； D为不加 TFO的双链 DNA 对照； 1-7中所用的 TFO的浓度分别为 1,2,3,4,5,6,7μιηο
图 4 HBV 前 S基因的 21 bp双链序列与 TFO B1-6形成三螺旋 DNA时 三螺旋 DNA与双链 DNA之比 f/(b-f)与 TFO浓度 a的关系曲线。
图 5 HBVDR区域的 25 bp双链序列与 TFO B11-15形成三螺旋 DNA的 凝胶电泳分析。
A,B,C,D,E分别是 TFOB11-B15与双链 DNA结合的结果。 其余同图 3。 图 6HBVDR区域的 25 bp双链序列与 TFO B11-15形成三螺旋 DNA时 三螺旋 DNA与双链 DNA之比 (b-f)与 TFO浓度 a的关系曲线。
图 7三螺旋形成寡核苷酸对 HBsAg表达抑制的时间曲线。
三螺旋形成寡核苷酸或对照脱氧寡核苷酸浓度为 10Mmol/L。 不加寡核苷 酸 (X), 加 B4(3'P)(4)， 加 Β15(3，Ρ)(·), 对照脱氧寡核苷酸 (A).
图 8三螺旋形成寡核苷酸对 HBeAg表达抑制的时间曲线。
三螺旋形成寡核苷酸或对照脱氧寡核苷酸浓度为 10 mOl/L。 不加寡核苷 酸 (X),加 B4(3T) (令)， 加 B15(3'P)(躍)， 对照脱氧寡核苷酸 (A).
图 9 TFO B15(3，P)对预转染 HBV质粒的 HepG2细胞中 HBsAg表达的抑 制作用。
三螺旋形成寡核苷酸 B15的浓度为 ΙΟμπιοΙ/L. 图 10丁？0815(3 >)对预转染1©¥质粒的 HepG2细胞中 HBeAg表达的抑 制作用。
三螺旋形成寡核苷酸 B15的浓度为 10 μιηοΙ/L.
图 11点杂交检测 HepG2 细胞中 HBV DNA。
1 : 不加寡核苷酸； 2: 加 TFO B4(3，P); 3: 加 TFO B15(3，P); 4: 加对照 寡核苷酸 最佳实施例
实施例 1 三螺旋形成寡核苷酸的设计、 合成及纯化
1-1三螺旋形成寡核苷酸片段的设计
在乙型肝炎病毒 adr亚型的 3127-3143核苷酸的位置有一段 17bp的序列, 除其中第 12位插入一个胞嘧啶外， 均为嘌呤 （如图 1所示） 。 根据三螺旋 DNA的配对规则， 合成了两条互补的乙肝病毒前 S基因片段（片段 I , 片段 Π )、一系列三螺旋形成寡核苷酸片段（TFO B1 - B6 )及对照寡核苷酸（NC ) , 其中 TFO B1 - B4在前 S基因片段胞嘧啶的相应位置分别釆用胸腺嘧啶， 胞 嘧啶， 腺嘌呤或鸟嘌呤， 以确定哪个碱基能较好地与 G.C配对,形成较稳定的 三碱基体， 从而使其形成的三螺旋 DNA具有较高的稳定性； TFO B6与 TFO B1 - B4 5'端的 11 个核苷酸相同， 都是嘌呤核苷酸， 可以与前 S基因片段形成 三螺旋 DNA, 而 TFO B6 3'端的 8个核苷酸均为 T, 不能与前 S基因片段形成 三螺旋 DNA。 通过比较 TFO Bl - B4及 TFO B6与前 S基因片段形成三螺旋 DNA的稳定性， 可以了解 TFO B1 - B4的 3，端能否与前 S基因片段形成三螺 旋 DNA， 从而知道在均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列的双链 DNA中， 如果有一个不 同性质的碱基插入时， 三螺旋 DNA形成是否中断， NC为对照寡核苷酸。
在乙型肝炎病毒基因组的 DR 区域， 1734-1754 位核苷酸的位置有一段 21bp的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列， 其 5'端 l lbp和 3'端 8bp为均聚嘌呤 /均聚嘧 啶序列， 在 12、 13 位插入相反的两个 AT对（如图 2所示） 。 根据三螺旋 DNA的配对规则， 合成了两条互补的乙肝病毒 Dr基因片段（片段 m， 片段 IV )及一系列三螺旋形成寡核苷酸片段 TFO B11 - B15， 其中 TFO B12 - B15 在 DR区域片段中 TT的相应位置分别釆用 AA， GG, CC或 TT， 以确定哪 个碱基能较好地与两个 AT配对，形成较稳定的三碱基体， 从而使其形成的三 螺旋 DNA具有较高的稳定性； 通过比较 TFO B12 - B15及 B11与 DR区域片 段形成三螺旋 DNA的稳定性， 可以了解 TFO B12 - B15 3'端的 8个碱基能否 与 DR区域片段形成三螺旋 DNA, 从而知道在均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列的双链 DNA中， 如果有两个不同性质的碱基插入时， 其两侧的碱基是否能同时与靶 DNA形成三螺旋 DNA。
1-2三螺旋形成寡核苷酸的末端修饰
对上述 TFO B1-B5及 TFO B11-B15寡核苷酸釆取 3'单磷酸化修饰。
1-3三螺旋形成寡核苷酸的合成及纯化
寡核苷酸在 PE公司生产的 DNA合成仪 (ABI391-EP)上， 用亚磷酸酰胺三 酯法合成， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
1-3-1 3'-OH寡核苷酸的合成
用 0.2 μ mole固相柱 （ Glen Research产品） ， 在 ABI 391EP DNA合成 仪上用 0.2 y mole合成顺序合成。
1-3-2 3'单磷酸化修饰寡核苷酸的合成
使用 0.2 μ πιοΐβ 3'磷酸固相柱 （ 3'-phosphate CPG Glen Research公司产 品，全称 2-[2-(4,4，-二甲基三苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰长链垸基胺-微孔玻 璃珠 (2- [2-(4,4 ' -Dimethoxytrityloxy) ethylsulfomyl] ethyl-succinoyl long chain alkylamino-CPG), 用相同的合成顺序合成。
1-3-3 本实验所合成的脱氧寡核苷酸包括：
片段 I 5' CA TTC CTC CTC CTG CCT CC AC 3， 21nt 片段 Π 3' GT AAG GAG GAG GAC GGA GG TG 5， 21nt
Bl 5， AAG GAG GAG GAT GGA GG 3' 17nt
B2 5 ' AAG GAG GAG GAC GGA GG 3' 17nt
B3 5' AAG GAG GAG GAA GGA GG 3' 17nt
B4 5， AAG GAG GAG GAG GGA GG 3' 17nt
B5 5' AAG GAG GAG GA 3, l int
B6 5 , AAG GAG GAG GAT TTT TTT T 3 , 19nt
B1(3'P) 5' AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3， 17nt
B2(3'P) 5 ' AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3， 17nt
B3(3，P) 5' AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3' 17nt
B4(3，P) 5 ' AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3' 17nt
B5(3'P) 5' AAG GAG GAG GAp 3' l int
对照 5 , GGG ATG CAG TGG TGG AAT TCC AC A 3' 24nt 片段 1115， AA TCT CCT CCC CCA ACT CCT CCC AG 3' 25nt 片段 IV3 ' TT AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG TC 5' 25nt
Bll 5， AGA GGA GGG GG 3， l int
B12 5， AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3， 21nt
B13 5' AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGG 3' 21 nt
B14 5' AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGG 3' 21nt
B15 5， AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3， 21nt
B11(3'P) 5， AGA GGA GGG GGp 3' l int
B12(3'P) 5， AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3， 21nt
B13(3'P) 5' AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGGp 3， 21nt
B14(3，P) 5， AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGGp 3， 21nt
B15(3'P) 5， AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3' 21nt 实施例 2 螺旋形成寡核苷酸与靶双链 DNA结合 2-1方 法
2-1-1 寡核苷酸片段的标记及 32P标记的双链片段的纯化
取 50 pmol寡核苷酸片段 1(或 ΠΙ), 加 50 μθΐ [γ-32Ρ]ΑΤΡ, 2 u Τ4多聚核苷 酸激酶， Ι μΙ ΙΟ χ Τ4 Forward Buffer,加双蒸水至 10 μΐ, 37°C保温 1小时， 取 4 μ1于冰浴中， 另外 6 μ1加入 50 pmol寡核苷酸片段 Π (或 IV), 100°C保温 5 分钟， 缓慢退火， 然后走 15 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 做好同位素标记， 放射自显影， 切割含寡核苷酸片段 I及 Π (或 ffl及 IV)双链 DNA条带， 压碎凝 胶， 加 500 μΐ蒸馏水， 在旋转仪上浸泡过夜， 过玻璃棉小柱， 去除凝胶碎片， 滤过液测定同位素放射性强度并加未标记的双链 DNA片段至 l pmol/μΐ, - 20 °C保存待用。
2-1-2三螺旋 DNA的形成及凝胶电泳阻滞试验
在 10 μΐ反应体系中含 0.1 μπιοΙ/L 32Ρ标记的双链 DNA片段， 10 mmol/L Tris.HCl pH 7.5, 0.5 mmol/L Spermidine, 10 mmol/L MgCl2, 分别加入 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 |nmol/L不同的 TFO， 在 37°C水浴中保温 4小时， 冰浴 10分钟， 走 15 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 4°C、 电压 100伏特， 电泳 4小时， 然后 放射自显影。密度扫描计上分析各条带的黑度。在研究外界条件对三螺旋 DNA 形成的影响时改变为相应的条件， 电泳条件相同。
2-1-3 三螺旋 DNA形成的结合常数 (Ka)、 解离常数 (Kd)及自由能变化（Δ G)的计算
寡核苷酸与双链 DNA结合的化学反应式为： TFO +双链 DNA = 三螺旋 DNA, 假设三螺旋形成寡核苷酸与双链 DNA的起始浓度分别为 a和 b, 平衡 后三螺旋 DNA的浓度为 f， 那么，平衡后三螺旋形成寡核苷酸及双链 DNA的 浓度分别为 (a-f)及 (b-f)。 那么， Ka = ~~ 当 a » f时， a-f«a， 那么，
(a - f) (b - f)
Ka =—-^~ , (-^-)=Ka x a, 以 (τ^)对 a作图， 可得一直线， 其斜率为 Ka。 Kd=丄， Δ G=-RTlnKa, R为气体常数， T 为绝对温度， 可计算三螺旋
Ka
DNA形成的自由能变化 AG。
2-2实验结果及分析
2-2-1 TFO与乙肝病毒前 S基因两段相近均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列的作用 2-2-1-1 TFO与标记的乙肝病毒前 S双链基因片段形成三螺旋 DNA及凝胶 阻滞分析
寡核苷酸片段 I经 5，末端 32P标记后部分与片段 Π复性，经聚丙烯酰胺凝 胶电泳纯化得到 32P标记的寡核苷酸单链及 32P标记的乙肝病毒前 S基因双链 片段。用合成的寡核苷酸与 32P标记的乙肝病毒前 S基因双链片段进行凝胶阻 滞分析， 本发明设计合成的寡核苷酸除对照寡核苷酸 NC之外,其它的寡核苷 酸 Bl、 B2、 B3、 B4、 B5、 B6均可与乙肝病毒基因片段形成三螺旋 DNA， 如 图 3所示。
2-2-1-2 TFO与乙肝病毒前 S基因形成三螺旋 DNA的平衡常数、解离常 数及自由能变化
通过对放射自显影结果进行黑度扫描， 计算出三螺旋 DNA形成反应平衡 之后双链 DNA及三螺旋 DNA的浓度 [b-fj及 [f] , 然后， 以 (」二)对 作图， b— f 可得一直线，其斜率为 Ka (如图 4所示）。通过 Ka值计算 Kd及 A G， Kd=— ,
Ka
A G=-RTlnKa。 如表 1 所示： 表 1. TFO与 HBV前 S基因片段形成三螺旋 DNA的热力学参数
Bl B2 B3 B4 B5 B6
KaixlO^"1) 6.97 4.57 6.75 7.71 0.91 1.68
d(xlO"6M) 1.44 2.19 1.48 1.30 11.0 5.95
厶 G(-kcal/mol) 8.42 8.16 8.4 8.48 5.71 7.53 从结果可见， 在与乙型肝炎病毒的前 S基因从 3127至 3143 位的 bp基 因片段作用时， TFO B1 - B4的 5，端 11个核苷酸及 3'端 5个核苷酸都是序 列相同的多聚嘌呤核苷酸， 可分别与靶序列的 5'端 11 bp及 3'端 5 bp相作用， 寡核苷酸 B6只有 5，端 11个核苷酸可与靶双链 DNA形成三螺旋 DNA， 而其 3，端的 8个多聚 T碱基不能与靶双链 DNA配对， 结果如图 3、 图 4及表 1所 示， TFO B6与乙肝病毒前 S基因片段形成三螺旋 DNA的量及其 Ka值要明显 少于寡核苷酸 B1 - B4, 而与 B5相近， 说明寡核苷酸 B1 - B4的 5 '端及 3'端 的核苷酸均可以与靶双链 DNA结合形成三螺旋 DNA。
TFO Bl - B4的 5，端 11个核苷酸及 3'端 5个核苷酸均是同样序列的多聚 嘌呤核苷酸， 只是其中第 12位分别是丁、 C、 A或 G, 通过它们分别与乙肝病 毒基因前 S片段形成三螺旋 DNA的稳定性之间的差别，可以了解靶双链 DNA 均聚嘌呤链中插入单个胞嘧啶时其第三螺旋寡核苷酸中的相应位置应该用哪 一种碱基与之配对。通过三螺旋 DNA形成及凝胶阻滞试验， 结果显示， TFO B4 与乙肝病毒基因片段结合形成三螺旋 DNA最稳定。 因此， 如果靶双链 DNA 的均聚嘌呤链中间有 C碱基插入时，在均聚嘌呤的 TFO上应用 G碱基与之配 对， 形成 GGC三碱基体较为稳定。
TFO B5只有 11个核苷酸， TFO B1 - B4有 17个核苷酸， 寡核苷酸 B5虽 然能与靶序列形成三螺旋 DNA, 但是稳定性比 TFO B1 - B4差。 所以， 相对 于同一个靶双链 DNA序列， TFO越长， 它们所形成的三螺旋 DNA越稳定， 寡核苷酸的长度是决定三螺旋 DNA稳定性的主要因素。
2-2-2 TFO与乙肝病毒 DR区域两段相近均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列的作用
2-2-2-1 TFO与标记的乙肝病毒 DR区域片段形成三螺旋 DNA及凝胶阻滞 分析
寡核苷酸片段 m经 5，末端 32P标记后部分与片段 IV复性，经非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳纯化得到 32P标记的寡核苷酸单链及 32P标记的乙肝病毒 DR区 域双链片段。 用合成的寡核苷酸与 32P标记的乙肝病毒 DR区域双链片段进行 凝胶阻滞分析， 本发明设计合成的寡核苷酸 Bl l、 B12、 B13、 B14、 B15均可 与乙肝病毒基因 DR片段形成三螺旋 DNA, 如图 5所示。
2-2-2-2 寡核苷酸与乙肝病毒基因形成三螺旋 DNA的平衡常数、 解离常 数及自由能变化
通过对放射自显影结果进行黑度扫描， 计算出三螺旋 DNA形成反应平衡 之后双链 DNA及三螺旋 DNA的浓度 [b-f]及 [f]， 然后， 以(^ ^-)对 a作图， b— f 可得一直线， 其斜率为 Ka， 如图 6所示。 通过 Ka值计算 Kd及 A G, Kd=-^-,
Ka
△ G=-RTlnKa。 如表 2 所示：
表 2. TFO与 HBV DR基因片段形成三螺旋 DNA的热力学参数
Bl l B12 B13 B14 B15
KaCxlO^"1) 1.23 1.68 1.25 0.93 2.21
Kd(xlO-7M) 8.11 5.94 8.02 10.7 4.52
厶 G(-kcal/mol) 8.78 8.97 8.79 8.6 9.14 乙型肝炎病毒 DR区域的 1734位至 1754 位的 21 bp基因片段的 5'端 11 bp 及 3，端 8 bp是均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列， 中间第 1745、 1746 位插入两个 A.T 碱基对。 TFO B11的 11个均聚嘌呤碱基能与靶 DNA的 5'端第一段均聚嘌呤 / 均聚嘧啶序列结合， TFO B12 - B15的 5'端 11个核苷酸及 3'端 8个核苷酸 的寡聚嘌呤核苷酸分别可与靶双链 DNA 的两段均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列结 合， 而中间各插入两个核苷酸 AA、 GG、 CC和 TT。 通过它们分别与乙肝病 毒基因片段形成三螺旋 DNA的稳定性之间的差别， 可以了解靶双链 DNA的 均聚嘌呤链中存在两个胸腺嘧啶时其第三螺旋寡核苷酸中的相应位置应该用 哪一种碱基与之配对。 通过三螺旋 DNA形成及凝胶阻滞试验， 结果表明， 寡 核苷酸 B11 - B15均可以与靶双链 DNA结合形成三螺旋 DNA,但是， 它们的 稳定性却不同。 TFO B13与靶 DNA结合形成三螺旋 DNA的稳定性和 B11与 靶 DNA结合形成三螺旋 DNA的稳定性相近， 说明， TFO B13只有 5'端的 11 个碱基参与三螺旋 DNA的形成， 而 TFO B15及 B12与靶 DNA形成三螺旋 DNA的稳定性要明显高于 B11与靶 DNA形成三螺旋 DNA的稳定性， 说明 TFO B15及 B12的 5，端 11个核苷酸及 3，端 8个核苷酸均参与三螺旋 DNA的 形成。 而且，插入 TT比插入 AA对在两段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列上形 成三螺旋 DNA的影响更小。 TFO B14与靶 DNA结合形成三螺旋 DNA的稳 定性比 B11与靶 DNA结合形成三螺旋 DNA的稳定性差， 表明 CC的存在影 响了两侧三螺旋 DNA的稳定性。 TFO B11只有 11个核苷酸， TFO B15有 21 个核苷酸， 它们都能与靶序列形成三螺旋 DNA， 但是 TFO B15与靶 DNA形 成三螺旋 DNA的稳定性要明显比 TFO B11高。 所以， 相对于同一个靶双链 DNA序列， TFO越长， 它们所形成的三螺旋 DNA越稳定。将 TFO B15与 DR 区的靶 DN A形成三螺旋 DN A的稳定性与 TFO B4与前 S区的靶 DN A形成三 螺旋 DNA的稳定性相比， TFO B15与 DR区的靶 DNA形成三螺旋 DNA的稳 定性比 TFO B4与前 S区的靶 DNA形成三螺旋 DNA的稳定性高， B15比 B4 更长， 也说明 TFO越长， 它们所形成的三螺旋 DNA越稳定。 实施例 3 三螺旋形成寡核苷酸 B4(3，P)和 B15(3，P)对乙型肝炎病毒基因 表达的影响
3-1实验步骤
3-1-1 质粒 DNA( pl.2II)及三螺旋形成寡核苷酸共转染 HepG2细胞
HepG2细胞培养于 1 x DMEM (含 10 %胎牛血清）培养液中， 37°C , 5 % C02培养， 转染前一天， 接种细胞于 96孔板， 培养过夜， 转染前 2小时换新 鲜的培养液。 配制溶液 A: 0.8 μβ 质粒 pl.2II (由中国科学院上海生化所汪 垣教授提供）， 及不同浓度的脱氧寡核苷酸 TFO B4(3'P)或 TFO B15(3'P), 脱氧寡核苷酸分别是 0、 40、 80、 120、 160、 200 pmoL 当转染体积是 20 μΐ 时，脱氧寡核苷酸的终浓度分别是 0 、 2 、 4 、 6 、 8 、 10 μπιοΙ/L),加 DMEM 至 10 μ1， 混匀； 溶液 Β: 0.3 μΐ lipofectin, 9.7 μΐ DMEM, 混匀， 室温放置 30 分钟。 溶液 A和溶液 B混匀， 室温放置 30分钟。 用 DMEM洗细胞两次， 加 入上述转染混合液 （每个样孔做 6 次， 其中 3 个样品的上清用于重复测定 HBsAg, 另三个样品的上清用于重复测定 HBeAg), 37°C , 5 % C02培养 5小时， 加入 ΙΟΟ μΙ含 10 %胎牛血清的 DMEM培养基，继续培养 120小时，取 100 μΐ 细胞培养上清用于 HBsAg及 HBeAg的测定。
3-1-2 细胞培养上清中 HBsAg及 HBeAg的测定
在包被抗 HBs或 HBe反应板加入 100 μΐ待测标本，并设 HBsAg或 HBeAg 阳性对照 2孔， 阴性对照 2孔， 空白对照 1孔， 然后每孔加入酶结合物 100 μΐ (空白不加） ， 充分混匀， 封板。 37°C孵育 1 小时。 弃去反应板孔内液体， 用洗涤液注满每孔，静置 20秒钟，甩干，反复 5次。然后每孔加底物液 100 μΐ ， 封板。 37°C孵育 15分钟， 加终止液 50 μΐ 。 最后， 在酶标仪上用空白孔校零， 读取各孔反应液在 492亳微米的吸收 Α492值。
3-1-3 三螺旋形成寡核苷酸对 HBsAg及 HBeAg抑制率的计算方法 不加寡梭苷酸时的 AM2 -加寡核苷酸时的 A y 滅
抑制率 = 不加灘苷酸时的 A M2 X 1 0t
3-2实验结果及分析
3-2-1 三螺旋形成寡核苷酸与 HBV质粒 DNA共转染 HepG2细胞时对 HBV 基因表达影响的时间效应
在 12孔板培养 HepG2细胞，每个孔分别转染带有 HB V基因质粒 pi .211 10 μg及 lO pmol/L的 TFO B4(3，P)或 TFO B15(3，P), 每个样品重复 3次， 并每隔 12小时取 200 μΐ培养液， 其中 100 μΐ培养液用于测定 HBeAg, 另 100 μΐ培养 液用于测定 HBsAg, 三次重复取平均值， 结果如图 7、 图 8所示。 HBV基因 转染 HepG2细胞后， 当不加三螺旋形成寡核苷酸时， HBeAg及 HBsAg在第二 天开始表达， 随着时间的增加， 表达量逐步升高。 当 10 μιηοΙ/L TFO B4(3'P) 或 TFO B15(3T)与 HBV质粒 DNA共转染时， HBeAg及 HBsAg的表达比不 加 TFO时要明显降低， 尤其是加入 TFO B15(3'P)时， 对 HBeAg及 HBsAg表 达的抑制作用尤其显著， HBeAg及 HBsAg的表达量上升很慢。 同时， 当加入 对照寡核苷酸时， HBeAg及 HBsAg的表达量也有些降低，这可能是由于 DNA 转染系统中的寡核苷酸影响了 HBV DNA的转染效率，因此， HBeAg及 HBsAg 的表达量有所下降。 但是， HBeAg及 HBsAg表达量下降的幅度要明显小于三 螺旋形成寡核苷酸对 HBeAg及 HBsAg表达的抑制作用。
3- 2-2 TFO B15(3T)在预转染 pl.2II的 HepG2细胞中，对 HBV抗原表达 影响的时间效应
在 12孔板培养 HepG2细胞， 每个孔分别转染带有 HBV基因质粒 pl.2II， 然后， 在细胞培养液中加入终浓度为 10 0101 的丁？0 815(3 )， 每个样品重 复 3次，并每隔 10小时取 200 μΐ培养液，其中 100 μΐ培养液用于测定 HBeAg, 另 100 μΐ培养液用于测定 HBsAg, 三次重复取平均值， 结果如图 9、 图 10所 示。 HBV基因转染 HepG2细胞后， 当不加三螺旋形成寡核苷酸时， HBeAg及 HBsAg在第二天开始表达， 随着时间的增加， 表达量逐步升高。 当细胞培养 液中含 10 μπιοΙ/L TFO B 15 (3 ' P)时， HB s Ag的表达比不加 TFO时要明显降低， 但是对 HBeAg的影响较小。 实施例 4 三螺旋形成寡核苷酸对乙型肝炎病毒在 HepG2细胞中繁殖的抑 制作用
4- 1实验步骤 4-1-1 质粒 DNA及三螺旋形成寡核苷酸的转染
HepG2细胞培养于 1 x DMEM (含 10 %胎牛血清）培养液中， 于 37°C， 5 % C02培养， 转染前一天， 接种细胞于 12孔板， 培养过夜， 转染前 5小时换 新鲜的培养液。 配制溶液 A: 质粒 ρ1.2Π 10 μ§, 三螺旋形成寡核苷酸在转 染混合液中的终浓度为 ΙΟ μιηοΙ/L,加不含血清的 DMEM至 110 μΐ, 混匀； 溶 液 Β: 6 μΐ lipofectin, 114 μΐ不含血清的 DMEM, 混匀， 室温放置 30分钟。 用 不含血清的 DMEM洗细胞两次，加入上述转染混合液（每个样品重复 3次， ), 37°C , 5 % C02 培养 5小时， 加入 2ml含 10 %胎牛血清的 DMEM培养基， 继续在 37°C， 5 % C02培养 5天。
4-1-2 细胞 DNA的抽提
10 μιηοΙ/L三螺旋形成寡核苷酸作用 5天后， 用胰酶消化细胞， 合并重复 三次的细胞，在 4°C以 3000g离心 2分钟，收集细胞于 1.5 ml Eppendorf管中， 加入 lml TRIzol试剂， 充分混匀， 室温静置 5分钟， 加入 0.2 ml氯仿， 振荡 15秒， 室温放置 2 ~ 3分钟， 在 4°C以 1200g离心 15分钟， 将水相转移至另 一个 1.5 ml Eppendorf管中， 用于总 RNA的抽提。 在中层及下层有机相中加 入 0.3 ml 无水乙醇， 混匀， 室温放置 5分钟， 然后以 10,000g离心 5分钟， 弃上清， 加入 1 ml 0.1 mol/L柠檬酸钠， 10 %乙醇溶液， 室温放置 30分钟， 每 5分钟混匀一次，然后于 4°C，以 10,000g离心 5分钟，重复用 l ml 0.1 mol/L 柠檬酸钠， 10 %乙醇溶液洗一次， 悬浮于 75 %乙醇中， 室温放置 20分钟， 每 5分钟摇动一次， 于 4°C， 10,000g离心 5分钟， 置于空气中干燥后， 加入 100 μΐ 8 mmol/L NaOH溶解。
4-1-3 HBV基因探针的制备
质粒 ρ1.2Π用 BamHI酶切、 电泳， 纯化出含 3.2 kb长度的完整线性 HBV DNA, 用随机六核苷酸引物法制备 HBV DNA探针， （参见： 分子克隆实验 指南， 第二版， J. Sambrook &, E. F. Fritsch及 T. Maniatis 著， 金冬雁等译， 科学出版社， 1986年， 502-504) 。
4-1-4 用点杂交 (Dot Blot)检测 HBV DNA
用抽滤加样器把变性的 DNA样品点到尼龙膜上， 用紫外交联于膜上， 然 后与 32P标记的 HBVDNA探针杂交。 （参见： 现代分子生物学实验技术， 卢 圣栋主编， 高等教育出版社， 1993年， 209-210) 。
4-2 结果： 三螺旋形成寡核苷酸对 HepG2细胞中 HBV基因考贝数的影响 在 12孔板培养 HepG2细胞， 每个孔分别转染带有 HBV基因质粒 1.2Π和 ΙΟμιηοΙ/L 的三螺旋形成寡核苷酸 TFO B4(3T)或 TFO B15(3，P)， 每个样品重 复 3次， 五天后消化细胞， 抽提 DNA做点杂交， 结果如图 11所示。 从图中 可以看出， 用三螺旋形成寡核苷酸 TFOB4(3T)或 TFOB15(3T)作用的 HepG2 细胞中， 其 HBV DNA 的考贝数要少于不加三螺旋形成寡核苷酸及加不与 HBVDNA配对的寡核苷酸的细胞中的考贝数（杂交点直径小， 黑度浅）， 说 明三螺旋形成寡核苷酸可以抑制 HBV的繁殖。

Claims

杈 利 要 求
1.一种三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物， 其特征在于该三螺旋形成寡 核苷酸包括 5条与 HBV adr亚型的前 S基因启动子区域结合的三螺旋形成寡 核苷酸 B1-B5 , 3条与 HBV的 DR区域结合的三螺旋形成寡核苷酸 B11,B12 及 B15,它们的序列如下：
B1 5' AAG GAG GAG GAT GGA GG 3' 17nt
B2 5 ' AAG GAG GAG GAC GGA GG 3' 17nt
B3 5' AAG GAG GAG GAA GGA GG 3' 17nt
B4 5， AAG GAG GAG GAG GGA GG 3' 17nt
B5 5， AAG GAG GAG GA 3' 1 lnt
Bl 1 5' AGA GGA GGG GG 3' l int
B12 5' AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3， 21nt
B15 5， AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3' 21nt。
2.根据权利要求 1所述的三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物， 其特征在 于该三螺旋形成寡核苷酸可以通过 3'单磷酸化修饰得下列三螺旋形成寡核苷 酸的修饰衍生物：
Β1(3'Ρ) 5' AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3， 17nt
B2(3'P) 5， AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3 , 17nt
B3(3，P) 5' AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3 ' 17nt
B4(3'P) 5 ' AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3 ' 17nt
B5(3 ) 5' AAG GAG GAG GAp 3' l int
B11(3 ) 5， AGA GGA GGG GGp 3' l int
B12(3'P) 5， AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3' 2 lnt
B15(3'P) 5， AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3' 21nt。
3.—种含有权利要求 1,2所述的三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物的三 螺旋 DNA的结构，其特征在于它是由上述三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生 物与二段相近的均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列形成的三螺旋 DNA结构。
4.根据权利要求 3所述的三螺旋 DNA结构， 其特征在于所述二段相近的 均聚嘌呤 /均聚嘧啶序列在 HBV中是 DR区域及 HBV adr亚型的前 S基因启动 子区域。
5.—种含有权利要求 1中所述的三螺旋形成寡核苷酸 B15 (或 B12， B11 ) 及其修饰衍生物的杂合三螺旋结构， 其特征在于它是由所述的三螺旋形成寡 核苷酸 B15(或 B12, B11)及其修饰衍生物和 DR 区域的负链序列寡核苷酸 AsDR 5， TCT CCT CCC CCA ACT CCT CCC3，或其修饰衍生物一起作用于 R A上的靶序列形成的 (DNA)2: RNA杂合三螺旋结构。
6.—种含有权利要求 1中所述的三螺旋形成寡核苷酸 B4 (或 B] , B2, B3 , B5 )及其修饰衍生物的杂合三螺旋结构， 其特征在于它是由所述的三螺旋形 成寡核苷酸 B4(或 Bl , B2, B3 , B5)及其修饰衍生物和前 S 区域的负链序列 寡核苷酸 AsPS 5'GGA GGC AGG AGG AGG AA 3'或其修饰衍生物一起作用 于 RNA上的靶序列形成的 (DNA)2:RN A杂合三螺旋结构。
7.—种含有权利要求 2中所述的三螺旋形成寡核苷核的 3，单磷酸化修饰的 衍生物 B15(3，P)或 (B12(3，P),B11(3，P))的杂合三螺旋结构,其特征在于它是由 所述的三螺旋形成寡核苷酸的 3'单磷酸化修饰的衍生物 B15(3'P) (或 B12(3，P),B11(3，P))和 DR 区域的负链序列寡核苷酸 AsDR(3，P) 5， TCT CCT CCC CCA ACT CCT CCCp3'—起作用于 RNA上的靶序列形成的 (DNA)2:RNA 杂合三螺旋结构。
8.—种含有权利要求 2中所述的三螺旋形成寡核苷酸的 3，单磷酸化修饰衍 生物 B4(3'P)(或 B1(3T),B2(3，P),B3(3，P),B5(3，P))的杂合三螺旋结构， 其特征 在于它是由所述的三螺旋形成寡核苷酸的 3'单磷酸化修饰的衍生物 B4(3，P) (或 B1(3，P),B2(3，P),B3(3，P),B5(3，P))和前 S 区域的负链序列寡核苷酸 AsPS(3 ) 5， GGA GGC AGG AGG AGG AAp 3'—起作用于 RNA上的靶序列 形成的 (DNA)2:RNA杂合三螺旋结构。
9.根据权利要求 1所述的三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物的应用， 其 特征在于该三螺旋形成寡核苷酸含有下列序列之一：
B1 5， AAG GAG GAG GAT GGA GG 3 ' 17nt
B2 5, AAG GAG GAG GAC GGA GG 3' 17nt
B3 5' AAG GAG GAG GAA GGA GG 3 ' 17nt
B4 5' AAG GAG GAG GAG GGA GG 3， 17nt
B5 5' AAG GAG GAG GA 3， 1 lnt
B11 5' AGA GGA GGG GG 3， 1 lnt
B12 5， AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3' 2 lnt
B15 5， AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3， 21nt
可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的药物。
10.根据权利要求 1所述的三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物的应用， 其特征在于该三螺旋形成寡核苷酸的 3'单磷酸化修饰衍生物含有下列序列之
B1(3'P) 5， AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3, 17nt
B2(3'P) 5， AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3' 17nt
B3(3 ) 5， AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3， 17nt
B4(3'P) 5' AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3， 17nt
B5(3'P) 5， AAG GAG GAG GAp 3， l int
B 11 (3，P) 5， AGA GGA GGG GGp 3' l int
B12(3'P) 5， AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3， 21nt
B15(3'P) 5, AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3， 2 lnt
可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的药物。
11.根据权利要求 1中所述的三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物的应用 其特征在于该三螺旋形成寡核苷酸含有下列序列之一：
B1 5' AAG GAG GAG GAT GGA GG 3' 17nt B2 5 ' AAG GAG GAG GAC GGA GG 3， 17nt
B3 5 ' AAG GAG GAG GAA GGA GG 3' 17nt
B4 5， AAG GAG GAG GAG GGA GG 3' 17nt
B5 5， AAG GAG GAG GA 3' 1 lnt
同时加入前 S区域的负链序列脱氧寡核苷酸 AsPS 5'GGA GGC AGG AGG AGG AA 3，或其修饰衍生物， 可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的 药物。
12.根据权利要求 1中所述的三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物的应用, 其特征在于该三螺旋形成寡核苷酸含有下列序列之一：
B11 5' AGA GGA GGG GG 3' l int
B12 5' AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3， 21nt
B15 5' AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3' 2 lnt
同时加入 DR区域的负链序列脱氧寡核苷酸 AsDR 5' TCT CCT CCC CCA
ACT CCT CCC 3' 或其修饰衍生物， 可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型 肝炎的药物。
13. 根据权利要求 2 中所述的三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物的应 用， 其特征在于该三螺旋形成寡核苷酸的 3'单磷酸化修饰衍生物含有下列序 列之一：
B1(3'P) 5， AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3' 17nt
B2(3'P) 5， AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3' 17nt
B3(3'P) 5' AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3， 17ni
B4(3'P) 5' AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3， 17nt
B5(3'P) 5， AAG GAG GAG GAp 3' l int
同时加入前 S 区域的负链序列脱氧寡核苷酸 AsPS(3'P) 5'GGA GGC AGG AGG AGG AAp 3 可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的药 物。
14. 根据权利要求 2 中所述的三螺旋形成寡核苷酸及其修饰衍生物的应 用， 其特征在于该三螺旋形成寡核苷酸的 3'单磷酸化修饰衍生物含有下列序 列之一：
Β11(3'Ρ) 5' AGA GGA GGG GGp 3， l int
B12(3'P) 5， AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3， 21nt
B15(3'P) 5， AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3， 21nt
同时加入 DR 区域的负链序列脱氧寡核苷酸 AsDR(3T) 5' TCT CCT
CCC CCA ACT CCT CCCp 3', 可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的 药物。
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