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WO1999018994A1 - Procede pour conserver la qualite d'une solution parenterale aqueuse de thrombomoduline pour l'entreposage ou la distribution - Google Patents

Procede pour conserver la qualite d'une solution parenterale aqueuse de thrombomoduline pour l'entreposage ou la distribution Download PDF

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Publication number
WO1999018994A1
WO1999018994A1 PCT/JP1998/004609 JP9804609W WO9918994A1 WO 1999018994 A1 WO1999018994 A1 WO 1999018994A1 JP 9804609 W JP9804609 W JP 9804609W WO 9918994 A1 WO9918994 A1 WO 9918994A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
thrombomodulin
adjusted
concentration
soluble
injection
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/004609
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masaki Yui
Akira Yokozawa
Tomoyo Murata
Kazuhisa Tsuruta
Hirotomo Shimizu
Original Assignee
Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
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Application filed by Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha filed Critical Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority to JP2000515626A priority Critical patent/JP4460762B2/ja
Priority to CA002306206A priority patent/CA2306206A1/en
Priority to AU94603/98A priority patent/AU729876B2/en
Priority to DK98947842T priority patent/DK1029548T3/da
Priority to US09/509,994 priority patent/US6808706B1/en
Priority to DE69837493T priority patent/DE69837493T2/de
Priority to EP98947842A priority patent/EP1029548B1/en
Priority to HK00106889.1A priority patent/HK1027514B/en
Publication of WO1999018994A1 publication Critical patent/WO1999018994A1/ja

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for maintaining the quality of a frozen or unlyophilized liquid thrombomodulin aqueous solution injection during storage and distribution, or to a stable aqueous and thorulin solution injection during storage and distribution.
  • Conventional technology for maintaining the quality of a frozen or unlyophilized liquid thrombomodulin aqueous solution injection during storage and distribution, or to a stable aqueous and thorulin solution injection during storage and distribution.
  • Thrombodulin is a substance that specifically binds to thrombin and has an effect of significantly promoting the activation of protein C by thrombin.
  • Protein C is a bimin K-dependent protein that plays an important role in the blood coagulation / fibrinolysis system, and is activated by the action of thrombin to become activated protein C.
  • the activated protein C inactivates the active coagulation factors V and VIII of the blood coagulation factor in vivo and is involved in the production of thrombolytic plasminogen activator. [Koji Suzuki, History of Medicine, Vol. 125, pp. 91 (1989)].
  • thrombomodulin promotes the activation of protein C by thrombin to produce a large amount of active protein C having an anticoagulant effect and a thrombolytic effect, and is used as an anticoagulant or thrombolytic agent. It is said to be useful.
  • thrombomodulin include, for example, acute coronary syndrome (ACS) (eg, myocardial infarction, unstable angina, coronary revascularization, etc.), thrombosis (eg, acute or Chronic cerebral thrombosis, arterial or venous acute or chronic peripheral thrombosis, etc., embolism (eg, acute or chronic cerebral embolism, arterial or venous acute or chronic peripheral embolism, etc.), Peripheral vascular obstruction (eg, Baja disease, Reino disease, etc.), atherosclerosis obliterans, vasculitis (eg, systemic lupus erythematosus (SLE), Behcet's disease, Kawasaki disease, etc.), heart hand Functional disorders secondary to surgery, Transplant organ complications, Intravascular coagulation syndrome (DIC), Angina, Transient cerebral ischemia attacks, Toxemia of pregnancy, Diabetes, Liver VOD (LiVerveno—occlusivedisease) It is expected to be used for the
  • thrombomodulin has been discovered and obtained as a glycoprotein expressed on vascular endothelial cells of various animal species including humans.
  • the present inventors have succeeded in cloning for the first time. That is, a human thrombomodulin precursor gene including a signal peptide was cloned from a human lung cDNA library using a genetic engineering technique, and the entire gene sequence of thrombomodulin was analyzed. The amino acid sequence of 575 residues including the signal peptide of residues has been clarified (JP-A-64-219).
  • the mature thrombomodulin from which the signal peptide has been cleaved has an N-terminal region (1-226) from the N-terminal side of the mature peptide, a region having six EGF-like structures (227-462), 0 It is composed of five regions: a glycosylation region (463-498th), a transmembrane region (4991-521), and a cytoplasmic region (522-557th).
  • the part having the same activity as the full-length thrombomodulin ie, the smallest active unit
  • thrombomodulin prepared so as not to contain a transmembrane region has the property of being able to dissolve neatly even in the absence of a surfactant (hereinafter, sometimes referred to as soluble).
  • Thrombomodulin is composed of only three regions, namely, a ⁇ terminal region, a region having six EGF-like structures, and a ⁇ type glycosylation region (that is, consisting of the amino acid sequence at positions 19 to 51 of SEQ ID NO: 1).
  • the above-mentioned thrombomodulin consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a polymorphic peptide of thrombomodulin consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and can be determined to be substantially the same.
  • the present inventors have studied the development of an aqueous solution injection of thrombomodulin that does not need to be dissolved at the time of use without performing the freeze-drying step, in order to develop a new formulation other than the freeze-dried formulation. Quality required for thrombomodulin aqueous injection preparations. First of all, it is necessary to ensure that the residual titer does not decrease significantly (long-term stability) during long-term storage at room temperature from 5 onwards, but it is necessary to obtain this long-term stability. Was not easy. Even more surprisingly, it was confirmed that when the aqueous solution for injection was shaken, clouding sometimes occurred.
  • aqueous injections can be administered more easily than lyophilized preparations without the need to dissolve in distilled water for injection at the time of use, and are simpler to manufacture because they do not require lyophilization in the manufacturing process.
  • advantages such as economy, as described above, simply using thrombomodulin as a solution is inferior in long-term stability, and satisfactory shaking stability cannot be obtained. ⁇ It has been difficult to make aqueous injections that can be distributed.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have confirmed that all of these problems can be solved under specific conditions, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a method for maintaining the quality of a frozen or unlyophilized liquid aqueous solution of thrombomodulin during storage and distribution, which comprises an effective amount of a soluble thrombomodulin, a pH of 5 or more, and a pH of 7.0 or more.
  • a thrombomodulin aqueous solution containing a buffer component having a buffering capacity between 5 and 7.0 and (a) the thrombomodulin aqueous solution further contains a surfactant, Or (b) a prefilled syringe preparation that is aseptically filled in a syringe container so that the aqueous thrombomodulin solution does not cause substantial voids to exist.
  • the first aspect of the method for maintaining quality during storage and distribution according to the present invention comprises: an effective amount of soluble thrombomodulin; a buffer component having a buffering ability between pH 5 and 7.0; A thrombomodulin aqueous solution with a pH of 5 or more and 7.0 or less is aseptically filled in a container. The method as described above.
  • a second embodiment of the present invention comprises an effective amount of soluble thrombomodulin and a buffer component having a buffering capacity between pH 5 and 7.0.
  • a thrombomodulin aqueous solution wherein the aqueous solution of the thrombomodulin having an H of not less than 5 and not more than 7.0 is a pre-filled syringe preparation which is aseptically filled in a syringe container so as to prevent substantial voids from being present.
  • a preferred third embodiment of the present invention comprises an effective amount of soluble thrombomodulin, a buffer component having a buffering ability between pH 5 and 7.0, and a surfactant, wherein the pH is pH.
  • a thrombomodulin aqueous solution injection wherein the thrombomodulin aqueous solution is 5 or more and 7.0 or less and is a prefilled syringe preparation which is aseptically filled in a syringe container so as to prevent substantial voids from being present. Is stored and distributed in a liquid state for a long period of time.
  • the method of the present invention is characterized in that an aqueous solution of thrombomodulin containing an effective amount of soluble thrombomodulin and a buffer component having a buffering capacity between pH 5 and 7.0 is pH 5 or more and 7.0 or less.
  • the thrombomodulin aqueous solution further contains a surfactant, and the container is aseptically filled;
  • the thrombomodulin aqueous solution does not allow substantial voids to exist.
  • the aqueous thrombomodulin injection for use in the method of the present invention has an effective amount of soluble thrombomodulin and a buffering ability between pH 5 and 7.0.
  • the pH of the thrombomodulin aqueous solution containing the buffer component is 5 or more and 7.0 or less, and (a) the thrombomodulin aqueous solution further contains a surfactant and is aseptically filled in a container. Or (b) the thrombomodulin aqueous solution is a prefilled syringe preparation which is aseptically filled in a syringe container so as to prevent substantial voids from being present. It is an injectable thrombomodulin aqueous solution that is excellent in properties and shaking stability, is liquid and not frozen or freeze-dried for long-term storage and distribution.
  • a first embodiment of the thrombomodulin aqueous solution injection comprises an effective amount of a soluble thrombomodulin, a buffer component having a buffering ability at a pH of 5 or more and 7.0 or less, and a surfactant.
  • the container is aseptically filled with an aqueous solution of thrombomodulin having a pH of 5 or more and 7.0 or less, and is excellent in long-term stability and shaking stability. It is a thrombomodulin aqueous solution injection that has not been frozen or freeze-dried.
  • a soluble tombombomodulin and a buffer component having a buffering ability between pH 5 and 7.0 are contained, and the pH is adjusted.
  • Long-term stability characterized by being a prefilled syringe formulation in which a syringe container is aseptically filled with an aqueous solution of thrombodulin which has a pH of 5 or more and 7.0 or less so as not to have substantial voids. It is an injectable aqueous solution of thrombomodulin that is excellent in properties and shaking stability and is not frozen or lyophilized for long-term storage and distribution in liquid form.
  • a third embodiment of the thrombomodulin aqueous injection comprises an effective amount of a soluble thrombomodulin, a buffer component having a buffering ability between pH 5 and 7.0, and a surfactant.
  • a thrombomodulin aqueous solution having a pH of 5 or more and 7.0 or less is a prefilled syringe preparation which is aseptically filled in a syringe container so as not to cause substantial voids. It is an injectable thrombomodulin aqueous solution that is liquid and not frozen or freeze-dried for long-term storage and distribution for long-term stability and shaking stability.
  • thrombomodulin refers to thrombin that binds to thrombin
  • the substance is not particularly limited as long as it has a function of promoting the activation of the oral tin c.
  • Soluble thrombomodulin is a substance that has the above-mentioned activity as thrombomodulin and can be easily dissolved even in the absence of a surfactant.For example, at least 1 mg Zm 1 or more with respect to distilled water for injection. It is preferable that a solubility of 3 mg / m 1 or more, particularly preferably 6 mg / ml or more, be obtained.
  • soluble thrombodulin has, for example, a molecular weight (measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in a non-reducing state) of 66,000 ⁇ 10,000, and inhibits the activation of protein C by thrombin.
  • a preferred example is a soluble peptide which has an accelerating action and is soluble as a concentration of at least 6 mg Zm1 in distilled water for injection.
  • Another soluble thrombomodulin which comprises an amino acid sequence containing the amino acid sequence of 19-29 of SEQ ID NO: 1 and has an action to promote the activation of protein C by thrombin and should be soluble.
  • the peptide is exemplified by soluble thrombomodulin.
  • Still other soluble thrombomodulins include (i) a soluble tombo modulin consisting of the amino acid sequence of 1915-1616 of SEQ ID NO: 1, or (ii) one or more of the above amino acid sequences.
  • Preferred examples of the soluble thrombomodulin include amino acids in which amino acids have been substituted, deleted, or added, and which have an action of promoting the activation of protein C by thrombin.
  • thrombomodulin the fourth, fifth and sixth structures from the N-terminal side of the region having six EGF-like structures which are usually the minimum activity unit of thrombomodulin (for example, human thrombomodulin, A peptide having at least the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (position 3767-480).
  • particularly preferred soluble thrombomodulin is a peptide which can be produced by a transformed cell prepared by transfecting DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 into a host cell using a vector. Is mentioned.
  • the signal portion may be as it is, a peptide consisting of the amino acid sequence at positions 17 to 5 of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, or a mixture thereof.
  • these peptides have extremely high solubility, and have the above-mentioned solubility sufficiently.
  • these peptides need only have the amino acid sequence described above, and may or may not have a sugar chain, and are not particularly limited.
  • a soluble peptide obtained from human urine or the like can also be used.
  • the type of host cell the type of sugar chain, the position of addition, and the degree of addition are different, and any of them can be used.
  • the peptide consisting of the positions 367-480 of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 has high shaking stability and is a preferable aqueous preparation in any case.
  • soluble thrombomodulin for example, the soluble thrombomodulin consisting of the amino acid sequence of 19- 5 16 of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of 195-1516 of SEQ ID NO: 2
  • Any of the soluble thrombomodulins obtained by transfecting cells with soluble thrombomodulin has improved shaking stability by the structure of the present invention. It is understood that there is a need.
  • Host cells include Chinese hamster ovary (CHO) cells, COS-1 cells, COS-7 cells, VERO (ATCC CCL-81) cells, BHK cells, canine kidney-derived MDCK cells, hamster AV-12-6 64 cells and the like, and human-derived cells include HeLa cells, WI38 cells, human 293 cells and the like.
  • CH ⁇ cells DHFR-CH ⁇ cells are more preferred.
  • microorganisms such as Escherichia coli are often used, and it is preferable to use a host-vector system suitable for each of them, and an appropriate vector system can also be selected for the above-mentioned host cells.
  • the gene for thrombomodulin used in gene recombination technology has been cloned, and an example of production using gene recombination technology for thrombomodulin has been disclosed. Further, a purification method for obtaining the purified product is also known (JP-A-64-219, JP-A-2-2556999, JP-A-5-239). -2 13 9 9-8, JP-A-5-310787, JP-A 7-155 176, J. Biol. Chem., 2664 , 1 0 3 5 1—1 0 3 5 3, 1 9 8 9). Therefore, the thrombomodulin of the present invention can be produced by using the method described in the above report or according to the method described therein.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 62-62919 discloses that Escherichiacoli K-12 strain DH5 (ATCC Deposit No.) contains a plasmid psV2TMJ2 containing DNA encoding full-length thrombomodulin. Applicant again discloses the same strain (Escherichiacoli DH5 / psV2TJ2) at 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan. Deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry on June 19, 1996. The accession number is FERM BP—5570. Using the DNA encoding the full-length thrombomodulin as a raw material, the thrombomodulin of the present invention can be prepared by known gene manipulation techniques.
  • the soluble thrombomodulin used in the present invention may be prepared by a conventionally known method or a method similar thereto.
  • a method of Yamamoto et al. See Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-62119, Examples), or Reference can be made to JP-A-5-213998. That is, a human-derived thrombomodulin gene can be converted into, for example, a DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by a genetic engineering technique, and further modified as necessary.
  • Examples of this modification include, for example, a codon that encodes the amino acid at position 473 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to form a DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (particularly, The method described in Method in Enzymology, Vol. 100, pp. 468 (1989), Academic Press
  • a site-specific mutation is performed according to. For example, using the DNA fragment containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the synthetic DNA for mutation having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, the above-described site-specific mutation was performed to encode the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. To do with DNA it can.
  • the DNA thus prepared is incorporated into, for example, Chinese hamster ovary (CHO) cells, used as transformed cells, selected as appropriate, and purified from a culture obtained by culturing the cells by a known method.
  • a soluble thrombomodulin can be produced.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably transfected into the host cell.
  • the method for producing thrombomodulin used in the present invention is not limited to the above method.
  • thrombomodulin or a tissue producing a thrombomodulin or soluble thrombomodulin can be extracted and purified from human urine or the like, or If necessary, it is possible to carry out a cleavage treatment with a protease.
  • the method of isolating and purifying thrombodulin from the culture supernatant or culture obtained as described above can be performed according to a known method [Takeshi Horio-edited; Basic experiment method for proteins and enzymes]. .
  • ion exchange chromatography utilizing the interaction between a chromatographic support on which a functional group having a charge opposite to that of thrombomodulin is immobilized and thrombomodulin.
  • affinity chromatography utilizing specific affinity for thrombomodulin.
  • Preferred examples of the adsorbent include an example using an antibody to thrombin or thrombomodulin, which is a ligand of thrombomodulin.
  • thrombomodulin antibodies which recognize appropriate properties or appropriate epitopes can be used.
  • Japanese Patent Publication No. 5-42920 Examples include those described in JP-A No. 4-453998 and JP-A-6-205692.
  • Gel filtration chromatography and ultrafiltration utilizing the molecular weight of thrombomodulin are also mentioned.
  • Another example is hydrophobic chromatography using a hydrophobic bond between a chromatographic carrier having immobilized pendant groups and a hydrophobic site of thrombomodulin. These techniques can be combined as appropriate.
  • the degree of purification can be selected depending on the purpose of use, but for example, the ability to obtain the results of electrophoresis, preferably SDS-PAGE as a single band, or gel filtration of isolated purified products, HPLC or reverse phase HP. It is desirable to purify until a single peak results.
  • a specific example of the purification method is a method using thrombomodulin activity as an index.
  • the thrombomodulin activity is roughly purified by purifying the culture supernatant or culture using Q-Sepharose FF of an ion exchange column. The fractions with high thrombomodulin activity were collected by purifying the fraction with DIP-TB (diisoprolyphosporylthrombinagaga) (affinity column), and the collected fractions were concentrated.
  • thrombomodulin activity used as an index includes, for example, the activity of promoting the activation of protein C by thrombin.
  • Other preferred purification methods are as follows.
  • a particularly preferred example is a method using Q-Sepharose FF equilibrated with a 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.18 M NaCl. After washing as appropriate, for example, elution is performed with a 0.02 M Tris-HCl buffer solution (pH 7.4) containing 0.3 M NaCl to obtain thrombomodulin as a crude product.
  • a substance having a specific affinity for thrombomodulin can be immobilized on a resin and subjected to affinity mouth purification.
  • Preferred examples include a DIP-thrombin-agarose column and an anti-thrompomodulin monoclonal antibody ram.
  • the DIP-Thrombin-agarose column is preliminarily equilibrated with, for example, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing lO OmM NaCl and 0.5 mM calcium chloride. And eluted with 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 1.0 NaCl and 0.5 mM calcium chloride to obtain thrombomodulin as a purified product. Can be.
  • the obtained purified soluble thrombomodulin solution is usually equilibrated under the conditions of, for example, a specific conductivity of 25 to 34 ms Zcm and a pH of 3 to 4, depending on the salt concentration, the measurement accuracy of pH, and the molecular species of TM.
  • the cation exchanger preferably a strong cation exchanger, SP-Sepharose FF (Pharmacia) is charged.
  • the above specific conductivity is more preferably 30 ⁇ 3 msZcm, and the pH is preferably pH 3.0 to 3.7, more preferably pH 3.5 ⁇ 0.1. It is.
  • a buffer solution to which an appropriate concentration of salt is added, and various embodiments can be considered.
  • 0.25 to 32 M preferably 0.3 ⁇ 0.1 M
  • Examples include 50 to 15 OmM buffer containing NaCl at pH 3-4.
  • the type of the buffer is not particularly limited, examples thereof include glycine hydrochloride, citrate-sodium citrate, sodium citrate and acetic acid. More specifically, the above conditions are exemplified by a 100 mM glycine hydrochloride buffer (pH 3.5) containing 300 mM NaCl.
  • the specific conductivity can be easily measured with, for example, a portable conductivity meter (manufactured by Toa Denpa Kogyo Co., Ltd., P series CM-11P, conversion reference temperature 25 ° C).
  • the buffer component in the present invention can be adjusted to a pH of 5 or more and 7.0 or less, and is not particularly limited as long as it has a buffering ability at the same pH. More preferably, pH 5.5 to 6.5 is exemplified.
  • one or more effective amounts selected from the group consisting of phosphoric acid, carboxylic acids and / or water-soluble salts thereof are used.
  • the carboxylic acid and Z or the water-soluble salt thereof include, for example, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, tartaric acid, fumaric acid, malic acid, and Z or a water-soluble salt thereof.
  • the water-soluble salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include a sodium salt and a potassium salt.
  • the container in the present invention is not particularly limited as long as it is a material and a shape suitable for aseptic filling, and examples thereof include a glass syringe (further aseptic filling with a rubber cap and a rubber stopper), Examples include glass vials (and stoppers) and glass ampules, and other plastic products can also be used.
  • a prefilled syringe preparation sealed in a syringe container.
  • Prefilled syringe preparation Is a product that is stored and distributed in a syringe container in which an aqueous solution for injection is pre-filled.
  • the container may or may not have a needle beforehand, and no needle is attached.
  • Another method is to increase the pressure of the aqueous injection solution itself in the prefilled syringe without using an injection needle to allow the skin to penetrate.
  • Buffer components having a buffering capacity at the above pH are related not only to the type but also to the concentration and the type of container to be aseptically filled.
  • the buffer to be used is filled in the container to be used. ⁇ After a predetermined amount (for example, lml or 0.5 ml, etc.) is filled and the heat treatment at 50 ° C for 96 hours described in Measurement Method 1 described below is performed, the fluctuation of pH is within ⁇ 0.3. It is preferable to select the type of buffer component that can be suppressed or its concentration. In the above-mentioned typical buffer components, the concentration to be used is generally 0.
  • ImM or more preferably 1 mM or more, and the upper limit is usually 100 mM or less, preferably 200 mM or less. Particularly preferred is 25 mM or less or 20 mM or less. It is also preferred that the glassware has been pre-sulfurized.
  • the inner wall of the glass syringe may be coated with silicon.
  • Examples of a manufacturing method of a buffer for the aqueous injectable formulation of the present invention in the case of phosphate buffer, sodium dihydrogen phosphate (NaH 2 P0 4, or its dihydrate) given the A predetermined amount of an aqueous solution having a predetermined concentration and a predetermined concentration of an aqueous solution of disodium hydrogen phosphate (Na 2 HPO4 or its 12-hydrate) are mixed in predetermined amounts to adjust to a desired pH. Or dihydrogen phosphate Natoriumu (NaH 2 P0 4, or its dihydrate) in an aqueous solution of a predetermined concentration, was added dropwise a sodium hydroxide solution, it may be adjusted to a pH of interest.
  • diluted hydrochloric acid or phosphoric acid may be added dropwise.
  • a carboxylate buffer represented by an acetate buffer an aqueous solution having a predetermined concentration of acetic acid and an aqueous solution having a predetermined concentration of sodium acetate are mixed in predetermined amounts to adjust to a desired pH. I do.
  • add a solution of acetic acid The desired pH may be adjusted by dropping an aqueous solution of thorium.
  • diluted acetic acid may be added dropwise.
  • the pH of the aqueous injection preparation of the present invention is usually pH 5.0 or more and 7.0 or less, and preferably pH 5.5 to 6.5. Particularly preferred is about pH 6.0.
  • pH 5.5-6.0 is mentioned as a preferable example.
  • carboxylate buffers other than acetic acid show the same thermal stability as acetate buffer at the same concentration and pH range as acetate buffer. Even when an acetate buffer component or a carboxylate buffer component is further added to the phosphate buffer, the same thermal stability is exhibited.
  • a nonionic surfactant is preferable.
  • polysorbates [polysorbate 80 (trade name: Tween 80), polysorbate 20 (trade name: Tween 20) ) Etc.), polyoxyethylene-hardened castor oil [polyoxyethylene-hardened castor oil 60 (trade name: HC ⁇ -60, trade name: Cremophor RH 60), polyoxyethylene-hardened castor oil 50 (trade name: HCO—50, trade name: Cremophor RH 50), etc., polyoxyethylene castor oils [trade name: CO—60 TX, trade name: CO—50 TX, trade name: Cremophor EL, etc.] , Ethylene oxide and propylene oxide Coalesced [polyoxetylene (160) polyoxypropylene (30) glycol (trade name: pull mouth nick F68)] and sorbitan sesquioleate.
  • These surfactants may be used as a mixture of two or more, and one or more selected from the above group may be used.
  • polysorbate 80 (trade name: Tween 80) is at least 0.01%, and polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60 (trade name: HCO-60) and poly Oxechylene (160) polyoxypropylene (30) glycol (trade name: Pull mouth nick F68) exhibits an anti-whitening effect at at least 0.1%.
  • Polysorbate 80 (trade name: Tween 80) shows an effect of preventing white turbidity even when 0.01% is added, and is a particularly preferred example.
  • the concentration of the surfactant used in the present invention is usually 0.001% or more, preferably 0.01% or more, and the upper limit is usually 1% or less, preferably 0.1% or less. Is done.
  • a tonicity agent for example, sodium chloride
  • a preservative for example, paraoxybenzoic acid esters
  • the addition method is not particularly limited.
  • a method in which the additive is directly added to the thrombomodulin-containing solution or a method in which the additive is dissolved in water, distilled water for injection or an appropriate buffer in advance and added. And the like.
  • thrombodulin is added to a syringe, ampoule or vial in water, distilled water for injection or a suitable buffer solution in an amount of 0.05 mg or more, preferably 0.1 mg or more per 1 ml. Particularly preferably, 1 mg or more is added.
  • the upper limit of the amount of thrombomodulin is not particularly limited, but is, for example, 15 mg or less, preferably 1 Omg or less, and particularly preferably 6 mg or less.
  • a solution containing these concentrations of thrombomodulin and the above additives is filled, for example, in a sterile state of 0.3 to 10 ml, and can be prepared as an aqueous injection preparation by an ordinary method.
  • the thrombomodulin aqueous solution to be filled in the container is usually preferably filtered through a 0.22 or 0.2 micron filter for sterilization by filtration.
  • the sterilized container is filled with a sterilized and filtered aqueous solution of tobombodulin under aseptic conditions to prepare the injection of the present invention.
  • This injection is also preferably packaged in a film or a box.
  • the preparation for injection into an aqueous solution of the present invention is preferably a prefilled syringe, and may be a vial or an ampoule.
  • a commercially available sulfa-treated ampoule may be used. I like it.
  • the sulfur treatment ampoule after either contacting S_ ⁇ 2 gas, or preferably with blown sulfate
  • Anmoniumu aqueous solution is prepared by heating treatment.
  • a method of spraying a 1 to 10% aqueous solution of ammonium sulfate, followed by heat treatment at 63 to 700 ° C. is exemplified.
  • they are ultrasonically treated with water added using an ampoule washing machine or the like, and then washed with water, and then heated at about 300 to 350 ° C. for several minutes for dry sterilization. It is used by letting go.
  • the second aspect of the present invention comprising an effective amount of soluble thrombomodulin and a buffer component having a buffering capacity of pH 5 or more and 7.0 or less, wherein pH is pH 5 or more.
  • a thrombomodulin aqueous solution that is 7.0 or less is a prefilled preparation that is aseptically filled in a syringe container so as to prevent substantial voids from being present. The following is a description of the method of distribution.
  • soluble thrombomodulin II buffer component The definitions of the soluble thrombomodulin II buffer component and the aqueous thrombomodulin injection are the same as described above.
  • a commercially available syringe for injection is preferably used, but usually, a prefilled syringe having an inner diameter (diameter) of about 8.6 mm, about 6.3 mm, about 4.6 mm, or the like is used.
  • a syringe container for a syringe is exemplified.
  • a syringe container of about 4.6 mm is most preferable, and a syringe container of about 6.3 mm is sufficiently preferable.
  • a syringe container of about 8.6 mm care must be taken to reduce the void ratio to 50% or less.As a result, for a syringe container of about 8.6 mm or less, the void ratio should be 50% or less. Then, shaking stability is ensured.
  • the thrombomodulin aqueous injection may not be substantially shaken due to its surface tension.
  • the shaking site is a shaking condition in which the thrombomodulin aqueous solution is moved by shaking under shaking conditions of 25 and an amplitude of 5 (: 111, 180 reciprocations / minute), and can be substantially shaken.
  • the ratio of the void portion is the volume of the container's shakeable part minus the volume of the ⁇ -nbomodulin aqueous solution present in the container's shakeable part from the volume of the container's shakeable part.
  • the amount of the aqueous thrombomodulin solution at the shakeable site is determined, for example, by placing a container filled with the aqueous thrombomodulin solution under the above-mentioned shaking conditions for 2 minutes, and then performing various vertical, horizontal, and vertical directions. After standing for 5 seconds while holding in the direction, the amount of solution moving below the container is confirmed, and by repeating the experiment of measuring, the amount of solution that can be shaken, that is, the amount of movable solution, can be confirmed At the same time, it is possible to confirm the shaking site and calculate its volume.Of course, in a syringe with a simple container shape, the shaking site is surrounded by a syringe and a stopper (and cap).
  • the stopper is stoppered after the aqueous solution is filled by the method described in (1), and the stoppering method can be a vacuum stopper or a vent tube method (or a sleeve method).
  • the void ratio can be relatively easily reduced to, for example, 15% or less. Therefore, in the present invention, the substantial void It is understood that the case where the voids are not present is preferably a case where the void ratio is typically 15% or less. Further, the void ratio is preferably 10% or less, and more preferably 5% or less.
  • Syringe containers for prefilled syringes suitable for subcutaneous or intramuscular injection usually a few ml, preferably 2 ml or less, more preferably 1 ml or less, particularly preferably 0.5 ml or less), for example, at least about
  • a prefilled syringe preparation having excellent shaking stability can be easily prepared with the above-mentioned void ratio.
  • a vial or ampoule can be used as a container in consideration of the addition of a surfactant.
  • Ordinary vials and ampoules have relatively large inner diameters, and it is relatively difficult to reduce or adjust the percentage of voids. It is safer to avoid.
  • the aqueous injection thus obtained is capable of maintaining a long-term stability of a titer of at least 5 for at least 12 months, preferably 18 months for about 80% or more.
  • storage and distribution may be possible for up to 2 years, preferably up to 3 years.
  • the amplitude is 5 (: 111, 180 reciprocations, no turbidity occurs under the shaking condition for one month.
  • the aqueous solution injection of the present invention having these sufficient stability. Agents can be stored and distributed in liquid form for long periods of time.
  • the storage and distribution of the present invention is carried out at a temperature not lower than the temperature at which the thrombomodulin aqueous solution injection does not freeze and at room temperature or lower, specifically, higher than 0 ° C and 20 or lower, preferably 5 ° C. Around C is exemplified. The period depends on conditions such as temperature, but is usually 12 months, preferably 18 months, and more preferably about 2 years.
  • the present invention also provides a case where the composition is used for subcutaneous administration or intramuscular injection. That is, as a fourth embodiment of the present invention, the above-mentioned prefilled syringe preparation is used for subcutaneous administration or intramuscular injection.
  • an aqueous injection containing soluble thrombomodulin as an active ingredient which is to be injected subcutaneously or intramuscularly once every 2 to 5 days.
  • This is a method for maintaining the blood concentration of soluble thrombomodulin characterized by using a long-acting preparation.
  • an aqueous injection containing soluble thrombomodulin as an active ingredient which is a sustained-release preparation for subcutaneous or intramuscular injection once every 2 to 5 days.
  • Thrombomodulin is originally present on the surface of vascular endothelial cells, and its site of action is intravascular. Therefore, when thrombomodulin is administered, it is directly performed by intravenous injection. I was believed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. S64-62919 describes an example of intravenous drip infusion.
  • thrombomodulin was actively used by administration other than intravenous administration.
  • Subcutaneous administration of soluble thrombomodulin consisting of the amino acid sequence at position 1 (a soluble thrombomodulin obtained by transfection of a host cell with DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), the soluble thrombomodulin in the blood Not only is the concentration confirmed, but also compared to the soluble thrombomodulin consisting of the amino acid sequence at position 367-480 of SEQ ID NO: 1, for the first time that the concentration of this thrombomodulin in the blood is remarkably sustained. confirmed. Therefore, according to the present invention, there is provided a preferred long-acting preparation.
  • the sustained-release preparation further contains a local anesthetic. It is also preferable to include a preservative.
  • Preferred examples of the local anesthetic include proforce hydrochloride and benzyl alcohol.
  • the amount of the local anesthetic added is usually 0.5 to 10%, preferably 1 to 5% of the injection volume.
  • amino acids, salts, carbohydrates, surfactants, and albumins as disclosed in JP-A-6-321805, JP-A-64-21919, etc. , Gelatin, etc.
  • a preservative for example, paraoxybenzoic acid esters are mentioned as preferable examples, and a mixture of ethyl ethyl paraoxybenzoate, methyl paraoxybenzoate, or aesthetics of paraoxybenzoic acid is particularly preferable.
  • the amount of the preservative to be added is usually from 0.1 to 1.0%, preferably from 0.1 to 0.3%.
  • the soluble thrombomodulin used in the sustained release preparation of the present invention any soluble thrombomodulin can be used, and it is not particularly limited.
  • the soluble thrombomodulin may be prepared from the amino acid sequence of 19-5 16 of SEQ ID NO: 1.
  • Preferred examples thereof include thrombomodulin or any soluble thrombomodulin obtained by transfecting a DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 into a host cell.
  • Preferred examples of the sustainability of the present invention include, for example, a blood concentration half-life (T1Z2) of 16 hours or more, and an average plasma residence time (MRT) of 36 hours or more. .
  • the long-acting preparation of the present invention is preferably provided in the form of an injection solution.
  • the long-acting preparation of the present invention is also considered to be provided in the form of a freeze-dried preparation which is dissolved and used at the time of use.
  • the prefilled syringe preparation filled with the aforementioned thrombomodulin aqueous injection aseptically subcutaneously is used subcutaneously. It is extremely convenient to use it as an injection or intramuscular injection.
  • the method of adding these additives is not particularly limited.
  • a solution is prepared by directly adding the additive to the thrombomodulin-containing solution, or dissolving the additive in water, distilled water for injection or an appropriate buffer, and adding and mixing with each other.
  • syringes or vials, and in some cases, ampoules may contain 0.05 to 15 mg, preferably 0.1 to 6 mg, of thrombomodulin per ml of water, distilled water for injection, or a suitable buffer.
  • a solution containing the above-mentioned additives is filled, for example, with 0.5 to 10 ml, and the preparation is ready for injection as an aqueous solution. Or lyophilized in vials and ampoules.
  • this sustained release formulation will contain from 0.01 to 100 mg of soluble thrombomodulin.
  • the administration frequency of the aqueous thrombodulin injection or sustained-release preparation of the present invention may be, as usual, 1 to 3 times a day, or for example, Z2 to 5 days once.
  • vascular injection there is a case where the maximum dose is administered by intravenous drip infusion, but one dose in intravascular one-shot administration is usually as soluble thrombomodulin. lmgZkg (body weight) The following are exemplified.
  • the minimum amount is usually at least 0.001 mgZkg (body weight), preferably at least 0.05 mg / kg (body weight).
  • the upper limit is the amount that can be dissolved in a liquid that can be injected subcutaneously or intramuscularly.
  • the amount of liquid suitable for subcutaneous injection or intramuscular injection is usually several ml, preferably 2 ml or less, more preferably 1 ml or less, and particularly preferably 0.5 ml or less. Therefore, as a single dose for subcutaneous injection or intramuscular injection, the soluble thrombomodulin is usually 2 Omg or less, and the minimum amount is 0.001 mg / kg (body weight), 0.005 mgZkg (body weight).
  • the sustained-release preparation of the present invention exhibits the same sustainability when administered subcutaneously or intramuscularly, but subcutaneous administration is particularly preferred.
  • a soluble thrombomodulin preparation which can significantly extend the blood concentration duration, reduce the number of administrations, and is effective in a smaller amount than an intravenous injection. Becomes possible. It can reduce pain at the time of injection of the patient and, in some cases, allow self-injection, greatly contributing to the convenience of patients going to the hospital.
  • FIG. 1 shows the time-dependent changes in the plasma soluble thrombomodulin concentration when soluble thrombomodulin was administered to rats.
  • IV indicates intravenous injection
  • SC indicates subcutaneous injection.
  • SEQ ID NO: 1 Other information in SEQ ID NO: 1 can be found in the partial amino acid sequence of human thrombomodulin
  • SEQ ID NO: 2 Other information in SEQ ID NO: 2 is the partial amino acid sequence of human thrombomodulin.
  • SEQ ID NO: 3 is a partial nucleotide sequence of the human thrombomodulin gene.
  • SEQ ID NO: 4 The other information of SEQ ID NO: 4 is the partial nucleotide sequence of the human thrombomodulin gene.
  • SEQ ID NO: 5 Other information in SEQ ID NO: 5 is the synthetic DNA for the mutation.
  • Soluble thrombomodulin used in Examples was carried out according to the method of Yamamoto et al. (The method described in Example 10 of JP-A-64-62119). That is, the DNA of SEQ ID NO: 3 was incorporated into Chinese hamster ovary (CHO) cells to form transformed cells, and the cells were cultured to produce soluble thrombomodulin.
  • Reference example 2 The method described in Example 10 of JP-A-64-62119. That is, the DNA of SEQ ID NO: 3 was incorporated into Chinese hamster ovary (CHO) cells to form transformed cells, and the cells were cultured to produce soluble thrombomodulin.
  • the filtered culture supernatant was analyzed using a Q-Sephar 0 se (Pharmacia) column (9 Omm in diameter, equilibrated with 2 OmM Tris-phosphate buffer (pH 7.4) containing 15 OmM NaCl). 6.5 cm).
  • the plate is washed with 2 OmM acetate buffer containing 180 mM NaC1, and further washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 180 mM NaC1.
  • anti-thrombomodulin monoclonal antibody B is obtained by culturing a culture supernatant obtained by culturing a hybridoma producing the antibody, or growing the hybridoma in the abdominal cavity of a histocompatible animal, nude mouse, or the like.
  • the ascites was purified by a separation and purification procedure such as salting out, ion exchange chromatography, and protein A column.
  • Pharmacia's Manual Af finity Ch r oma t ogr aphy princip 1 es & methods
  • the monoclonal antibody B 5M NaC l containing 0. 1M N a HC 0 3 buffer (PH 8.3), contacted with CNB r-actiVated Sepharose 4B (Pharmacia, 52-1-153-00-AI), and reacted with Sepharose 4B for anti-thrombomodulin monoclonal antibody B was coupled to prepare Sepharose 4B conjugated with anti-thrombomodulin monoclonal antibody (antibody B).
  • Sepharose 4B conjugated with this anti-thrombomodulin monoclonal (antibody B) was packed in a column to prepare a monoclonal (antibody B) column.
  • washing was started with 100 mM glycine phosphate buffer containing 30 OmM NaC1 (same as above), and the absorbance of the washing solution was obtained from the rising edge to the falling edge of the 28 O nm peak.
  • the eluate (180 ml) obtained in Reference Example 4 was adjusted to ⁇ 3.5 with 1.0 ⁇ glycine hydrochloride buffer ( ⁇ 2.0), and the solution was adjusted to 100 mM glycerol containing 30 OmM NaCl.
  • the sample was applied to an SP-Sepharose (Pharmacia) column (diameter 26 mm, height 3 cm) equilibrated with a syn-hydrochloric acid buffer (same as above). Washing is started with 100 mM NaCl-containing 10 OmM glycine hydrochloride buffer (same as above), and the absorbance of the washing solution is obtained from the rising edge to the falling edge at 280 nm. Neutralized to pH 7 with phosphate buffer (pH 7.3), and the neutralized wash was obtained as a highly purified product.
  • the obtained thrombomodulin was confirmed to be soluble in distilled water for injection at a concentration of at least 6 mgZm1.
  • the following measurement of the molecular weight confirmed that it was 66,000 and 10,000 (non-reduced state).
  • Soluble thrombomodulin consisting of amino acid at position 367-480 of SEQ ID NO: 1 was obtained as follows. That is, the plasmid obtained by the method described in Example 11 (1) 1 (b) of JP-A-5-213 998 is transferred to cells according to the method described in Example 1— (2). After transfection, purification was carried out according to the method described in Example 3- (3), and the buffer was exchanged to obtain a highly purified product.
  • thrombomodulin was soluble in distilled water for injection at a concentration of at least 6 mg / ml.
  • the above measurement of the molecular weight confirmed that the value was 250,000 ⁇ 0.50 (non-reduced state).
  • concentration of buffer components ⁇
  • concentration of thrombomodulin was adjusted by adding a buffer having an appropriate concentration. The pH was adjusted by adding an appropriate amount of diluted hydrochloric acid or aqueous sodium hydroxide solution.
  • Soluble thrombomodulin consisting of the amino acid at position 19—5 16 of SEQ ID NO: 2 was obtained as follows. That is, according to the method described in Method in Enzymology, vol. 100, p. 468 (1989), Academic Press, the base of SEQ ID NO: 3 The DNA fragment containing the sequence was subjected to site-specific mutation using the synthetic DNA for mutation having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was obtained. According to Examples 1 to 7, the above thrombomodulin was obtained.
  • thrombomodulin was soluble in distilled water for injection at a concentration of at least 6 mg / ml.
  • the above measurement of the molecular weight confirmed that it was 66,000 to 10,000 (non-reduced state).
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm 1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 0.2 mM, and the concentration of Na C 1 was adjusted to 150 mM and polysorbate 80 (trade name: Tween 800) ) was added to a concentration of 0.01%, and the pH was adjusted to 6.0. Dispense this solution into 2 m1 ampoules (inner diameter 12 mm) in 2 m1 portions Then, the mixture was sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. At this time, the ratio of voids in the shakeable portion was about 35%. -Example 2
  • the concentration of thrombodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 0.2 mM, Na C 1 was adjusted to 15 OmM, and polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60 (trade name) : HCO-60) was added to a concentration of 0.1%, and the pH was adjusted to 6.0.
  • This medicinal solution was dispensed in 2 ml 1 ampules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1 and the concentration of sodium acetate buffer to 2 OmM.Furthermore, NaC1 was adjusted to 15 OmM, and polysorbate 80 (0.066180) to 0.0. After the addition to 1%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the concentration of the sodium acetate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC 1 was adjusted to 15 OmM.
  • Polyoxyethylene hardened castor oil 60 HCO-6 After 0 was added to 0.1%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 20 OmM, Na C 1 was adjusted to 15 OmM, and polysorbate 8 was adjusted. After adding 0 (Tween 80) to 0.01%, the pH was adjusted to 6.0. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 20 mM, NaC1 was adjusted to 15 OmM, and borosorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.01. %, And then the pH was adjusted to 5.5.
  • This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 20 mM, NaC1 was adjusted to 150 mM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.0. After the addition to 1%, the pH was adjusted to 5.0. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 2 mM, NaCl was adjusted to 150 mM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.01%. After the addition, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm 1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 2 mM, NaC 1 was adjusted to 150 mM, and polysorbate 80 ( Tween 80) was added to a concentration of 0.01%, and the pH was adjusted to 5.5.
  • This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomoduli. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg Zm1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 2 mM, NaCl was added to 150 mM, and polysorbate 80 (Tween 80) was added to 0.01%. After the addition, the pH was adjusted to 5.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 0.2 mM, and NaCl 1 was adjusted to 150 mM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.01. After the addition, the pH was adjusted to 6.0. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • Example 1 2 The concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 0.2 mM, and NaCl 1 was adjusted to 150 mM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.01. After the addition, the pH was adjusted to 6.0. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodul
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 0.2 mM, and NaCl 1 was adjusted to 150 mM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted. After the addition to give a concentration of 0.01%, the pH was adjusted to 5.5. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 0.2 mM, and NaC1 was adjusted to 150 mM, polysorbate 8 After adding 0 (Tween 80) to 0.01%, the pH was adjusted to 5.0. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 200 mM, Na C 1 was adjusted to 150 mM, and borosorbate 80 (Tweeen) was used. 80) was added to a concentration of 0.01%, and the pH was adjusted to 6.0.
  • This medicinal solution was dispensed in 2 ml 1 ampules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • Example 15 Example 15
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM.
  • Polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.0. After the addition to 1%, the pH was adjusted to 6.0. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM, polysorbate 8 After adding 0 (Tween 80) to 0.01%, the pH was adjusted to 5.0. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg Zm 1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 mM, and Na C 1 was adjusted to 15 OmM.
  • Polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.01. %, The pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 mM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM and polysorbate 80 (Tween 80) to 0. After the addition, the pH was adjusted to 5.0.
  • This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of tropomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was adjusted to 15 mM. After adding OmM, polysorbate 80 (Tween 80) to 0.01%, the pH was adjusted to 7.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules in 2 ml portions and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • Example 2 1 The concentration of tropomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was adjusted to 15 mM. After adding OmM, polysorbate 80 (Tween 80) to 0.01%, the pH was adjusted to 7.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules in
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was set to 1 mg
  • the buffer concentration was adjusted to 2 OmM and the sodium acetate buffer concentration was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM.Polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.01%. After the addition, the pH was adjusted to 6.5.
  • This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules in 2 ml portions and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer to 2 OmM, the concentration of sodium acetate buffer to 2 OmM, and the NaC1 to 15 OmM. After adding a base 80 (Tween 80) to 0.01%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules in 2 ml portions and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • Example 23 The concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer to 2 OmM, the concentration of sodium acetate buffer to 2 OmM, and the NaC1 to 15 OmM. After adding a base 80 (Tween 80) to 0.01%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules in 2 ml portions and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombo
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM and polysorbate. Twenty-eight (Tween 80) was added to a concentration of 0.01%, and the pH was adjusted to 5.5. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules in 2 ml portions and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • Example 24 The concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM and polysorbate. Twenty-eight (Tween 80) was added to a concentration of 0.01%, and the pH was adjusted to 5.5. This medicinal solution was dispensed into 2
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg Zm1, the concentration of sodium phosphate buffer to 2 OmM, the concentration of sodium acetate buffer to 2 OmM, and the NaC1 to 15 OmM, polysorbate 8 After 0 (Tween 80) was added to a concentration of 0.01%, the pH was adjusted to 5.0. This drug solution is dispensed into 2 ml ampoules in 2 ml portions, sealed, and injected with an aqueous solution containing thrombomodulin. Preparations were prepared. (Void portion: 35%) Example 25
  • thrombomodulin concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the sodium malonate buffer concentration was adjusted to 2 OmM, NaC1 was adjusted to 15 OmM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.01%. After the addition, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed in 2 ml 1 ampules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void portion: 35%) Example 26
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the concentration of sodium succinate buffer solution was adjusted to 2 OmM, the NaC 1 was adjusted to 15 OmM, and the polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0 After the addition of 0.1%, the pH was adjusted to 6.0. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm 1, the sodium glucurate buffer solution was adjusted to 2 OmM, Na C 1 was adjusted to 15 OmM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.01. %, The pH was adjusted to 6.0.
  • This medicinal solution was dispensed in 2 ml 1 ampules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the sodium fumarate buffer solution concentration was adjusted to 2 OmM, NaC 1 was adjusted to 15 OmM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted. After the addition to give a concentration of 0.01%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1 and the concentration of sodium citrate buffer solution was adjusted to 2 OmM, and further, Na C 1 was adjusted to 15 OmM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0.01. After the addition, the pH was adjusted to 6.0. This solution is dispensed in 2m1 ampules for 2m1 and sealed. An aqueous injection formulation containing phosphorus was prepared. (Void ratio: 35%) Example 33
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg Zm1, the sodium phosphate buffer concentration to 2 OmM, the sodium propionate buffer concentration to 2 OmM, and NaC1 to 15 OmM and polysorbate. After 80 (Tween 80) was added to a concentration of 0.01%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous solution injection containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer to 2 OmM, the concentration of sodium succinate buffer to 2 OmM, and NaC1. After adding 150 mM of polysorbate 80 (Tween 80) to a concentration of 0.01%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an injectable aqueous solution containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Example 36
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg
  • the buffer concentration was adjusted to 2 OmM
  • the sodium tartrate buffer concentration was adjusted to 2 OmM.
  • the NaC1 was adjusted to 15 OmM
  • the polysorbate 80 was adjusted to 0.01. %, ⁇ was adjusted to 6.0.
  • This drug solution was dispensed in 2 ml 1 ampules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous solution injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the concentration of thrompomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg Zm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 OmM, the sodium fumarate buffer was adjusted to 2 OmM, and the NaC1 was adjusted to 15 OmM.
  • Polysorbate 80 (Tween 80) was added to adjust the pH to 0.01, and the pH was adjusted to 6.0.
  • This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules in 2 ml portions and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 OmM, the sodium malate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM and polysol. After adding a base 80 (Tween 80) to 0.01%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules in 2 ml portions and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Example 39
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 mM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM, borosorbate 80 (Tween 80). After the addition to 0.1%, the pH was adjusted to 6.0. This drug solution was dispensed in 2 ml ampoules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin.
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm 1, the concentration of sodium phosphate buffer solution was adjusted to 2 mM, and NaCl 1 was adjusted to 150 mM, polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) After adding glycol (trade name: Pull Mouth Nick F68) to 1%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an injectable aqueous solution containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • Example 4 3 The concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm 1, the concentration of sodium phosphate buffer solution was adjusted to 2 mM, and NaCl 1 was adjusted to 150 mM, polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) After adding glycol (trade name: Pull Mouth Nick F68) to 1%, the pH was adjusted to 6.0. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm 1, the concentration of sodium phosphate buffer solution was adjusted to 2 mM, and NaC 1 was adjusted to 150 mM, polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) After adding glycol (pull mouth nick F68) to 0.1%, the pH was adjusted to 6.0. This drug solution is dispensed in 2 m 1 ampules for 2 m 1, sealed, and injected with an aqueous solution containing thrombomodulin.
  • thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg Zm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, and polysorbate 80 (Tween 80) was added to 0.01%. After that, the pH was adjusted to 6.0. This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous solution injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%)
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaC1 was added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.0. did.
  • a 8.6 mm ID glass syringe with a cap (Basic composition: bromobutyl rubber) attached to the tip at the tip (Becton Dickinson, 1 m 1 standard type syringe, no needle) ), Adjust the degree of vacuum so that the percentage of voids is 5%, stopper the stopper (produced by EST Co., Ltd., basic composition: promobutyl rubber) in a vacuum, and apply thrombomodulin.
  • a prefilled syringe preparation for aqueous solution injection was prepared.
  • Example 5 0
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaCl was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 6.0.
  • a prefilled syringe formulation for injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaCl was added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.0. .
  • a 8.6 mm inner diameter glass syringe (Becton Dickinson, 1 m1 standard type syringe with no needle) ), Adjust the degree of vacuum so that the void ratio is 15%, stopper the stopper (West Corp., basic composition: bromobutyl rubber) in a vacuum, and add an aqueous solution containing thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation for injection was prepared.
  • tombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 mM, and NaC1 was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 6.0.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous solution injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration was adjusted to 1 mgZm1
  • the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM
  • NaCl was added to 150 mM
  • the pH was adjusted to 6.0.
  • a glass syringe (Becton, Dickinson, 1m1 long-type syringe) with an inner diameter of 6.3mm, fitted with a cap (manufactured by West Corporation, basic composition: promobutyl rubber) at the tip, without needle ), Adjust the degree of vacuum so that the void ratio becomes 15%, apply a stopper (manufactured by EST Co., Ltd., basic composition: bromobutyl rubber) to vacuum, and contain thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaC1 was added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.0. .
  • a prefilled syringe formulation for aqueous injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was set to 1 mgZm 1 and sodium phosphate buffer. The solution concentration was adjusted to 2 mM, and NaCl was further added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.0.
  • a prefilled syringe formulation containing an aqueous solution for injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaCl was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 6.0. It was adjusted.
  • a 4.6-mm inner diameter glass syringe with a cap (Basic composition: bromobutyl rubber) attached to the tip at the tip (Becton 'Dickinson's 0.5 ml syringe with needle) 0.5 ml, and adjust the degree of vacuum so that the void ratio is 10%, stopper the stopper (manufactured by West Corporation, basic composition: bromobutyl rubber) in a vacuum, and inject an aqueous solution containing thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation was prepared.
  • Example 6 0
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaC1 was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 6.0. .
  • a prefilled syringe formulation was prepared.
  • Example 6 2 Dispensed 0.3 ml, adjusted the degree of vacuum so that the void ratio became 15%, stoppered the stopper (produced by West Co., Ltd., basic composition: promobutyl rubber) in a vacuum, and added an aqueous solution containing thrombomodulin. A prefilled syringe formulation for injection was prepared.
  • Example 6 2 Dispensed 0.3 ml, adjusted the degree of vacuum so that the void ratio became 15%, stoppered the stopper (produced by West Co., Ltd., basic composition: promobutyl rubber) in a vacuum, and added an aqueous solution containing thrombomodulin. A prefilled syringe formulation for injection was prepared.
  • Example 6 2 Dispensed 0.3 ml, adjusted the degree of vacuum so that the void ratio became 15%, stoppered the stopper (produced by West Co., Ltd., basic composition: promobutyl rubber) in a vacuum, and added an aqueous solution containing thrombomodulin. A prefilled
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaCl was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 5.0. It was adjusted.
  • a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm with a cap (Basic composition: Bromobutyl rubber, manufactured by West Co., Ltd.) attached to the tip (Becton D. Dickinson, 1 m1 long type syringe, needle) None), adjust the degree of vacuum so that the void ratio is 10%, apply a stopper (manufactured by West Co., Ltd., basic composition: promobutyl rubber) to vacuum and apply thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation containing an aqueous solution for injection was prepared.
  • the concentration of thrombodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of the sodium phosphate buffer was adjusted to 2 mM, and NaCl was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 5. Adjusted to 5.
  • a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm with a cap (Basic composition: Bromobutyl rubber, manufactured by West Co., Ltd.) attached to the tip (Becton D. Dickinson, 1 m1 long type syringe, without needle) ), Adjust the degree of vacuum so that the void ratio becomes 10%, stopper the stopper (product of West Co., Ltd., basic composition: bromobutyl rubber) under vacuum, and include thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation having an aqueous solution for injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaC1 was added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.5. did.
  • a syringe formulation was prepared.
  • thrombomodulin concentration was adjusted to 1 mgZm1
  • sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM
  • NaC1 was added to 150 mM
  • pH was adjusted to 7.0.
  • This solution is supplied to a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm (Becton Dickinson, 1 m1 long type syringe, needle) with a cap (Basic composition: bromobutyl rubber) attached to the tip. None) adjust the degree of vacuum so that the percentage of voids is 10%, stopper the stopper (product of West Co., Ltd., basic composition: bromobutyl rubber) under vacuum, and add thrombomodulin.
  • An aqueous solution containing a prefilled syringe formulation was prepared.
  • the thrombomodulin concentration was adjusted to 1 mg Zm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.0. .
  • a prefilled syringe formulation for aqueous solution injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 20 OmM, and NaC1 was added to adjust to 15 OmM, and then the pH was adjusted to 6.0. Was adjusted.
  • This solution is filled with a cap (West ⁇ ml into a 6.3 mm inner diameter glass syringe (Becton 'Dickinson, 1 m1 long type syringe, no needle) fitted with a basic composition: bromobutyl rubber).
  • Example 70 The degree of vacuum was adjusted to 10%, and a stopper (manufactured by Est Co., Ltd., basic composition: bromobutyl rubber) was stoppered in vacuum to prepare a prefilled syringe preparation containing thrombomodulin for injection in an aqueous solution.
  • a stopper manufactured by Est Co., Ltd., basic composition: bromobutyl rubber
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the sodium acetate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaCl was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 6.0. .
  • a prefilled syringe formulation was prepared.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm 1, the sodium acetate buffer concentration was adjusted to 2 OmM, and NaCl was added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.0.
  • a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm (Becton 'Dickinson's, 1 m 1 long type syringe, needle) with a cap (Basic composition: Promobutyl rubber) attached to the tip end None), adjust the degree of vacuum so that the void ratio is 10%, apply a stopper (West Co., Ltd., basic composition: bromobutyl rubber) under vacuum, and apply thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation containing an aqueous solution for injection was prepared.
  • the troline concentration in Reference Example 7 was 1 mg / m 1, and sodium acetate buffer The concentration was adjusted to 20 OmM, NaCl was added to a concentration of 150 mM, and the pH was adjusted to 6.0.
  • This chemical solution is a 6.3 mm inner diameter glass syringe (Becton Ditzkinson, 1 m1 long type syringe, without needle) fitted with a cap (West Corporation, basic composition: bromobutyl rubber) at the tip. ), Adjust the degree of vacuum so that the void ratio is 10%, stopper the stopper (basic composition: bromobutyl rubber) by vacuum, and contain thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 0.1 mgZml, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaCl was added to 15 OmM, and the pH was adjusted to 6.0. It was adjusted. Apply this chemical solution to a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm (Becton, Dickinson, 1 m1 long type syringe, no needle) fitted with a cap (manufactured by West Corporation, basic composition: promobutyl rubber) at the tip.
  • Dispense 1 ml adjust the degree of vacuum so that the void ratio becomes 10%, stopper the stopper ( ⁇ Est Co., basic composition: bromobutyl rubber) in a vacuum, and prefill an aqueous solution containing thrombomodulin for injection.
  • a syringe formulation was prepared.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 3 mg Zm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 6 mM, and NaCl was added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.0. did.
  • a 6.3 mm inner diameter glass syringe with a cap (Basic composition: bromobutyl rubber) fitted with a cap at the end (Becton 'Dickinson, 1 m 1-port type syringe) 1m1 into a syringe (without a needle), adjust the degree of vacuum so that the void ratio becomes 10%, stopper the stopper (produced by West Co., Ltd., with a basic composition of promobutyl rubber) in a vacuum, and thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous injection containing the following was prepared.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 6 mgZm 1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 12 mM, and NaCl was added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.0.
  • a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm (Becton. Dickinson, 1 m 1 long type syringe, without needle) with a cap (West Corporation, basic composition: bromobutyl rubber) attached to the tip ), Adjust the degree of vacuum so that the void ratio becomes 10%, apply a stopper (manufactured by Pest, basic composition: bromobutyl rubber) in a vacuum, and contain thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 3 mg / m1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 6 mM, and NaCl was added to 150 mM, and then the pH was adjusted to 6.0. .
  • This chemical solution is a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm (Becton Dickinson, 1 m 1 long type syringe with a needle (with a base composition: bromobutyl rubber) fitted with a cap at the tip), no needle ), Adjust the degree of vacuum so that the percentage of voids becomes 15%, stopper the stopper ( ⁇ Est Co., basic composition: bromobutyl rubber) in a vacuum, and apply thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous solution injection was prepared.
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 6 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 12 mM, and NaCl was added to a concentration of 150 mM. Adjusted to 0.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous solution injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, NaC1 was adjusted to 15 OmM, and polysorbate 80 (Tween SO) was adjusted to 0.01%.
  • PH was adjusted to 6.0 after the addition.
  • a prefilled syringe formulation was prepared.
  • the tropomodulin concentration was adjusted to 3 mg / m1
  • the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 6 mM
  • NaC1 was adjusted to 150 mM
  • polysorbate 80 (C ⁇ 6 611 8 0 ) was added to a concentration of 0.01%
  • the pH was adjusted to 6.0.
  • Example 8 1 The degree of vacuum was adjusted, and a stopper (produced by West Co., Ltd., basic composition: promobutyl rubber) was stoppered in vacuum to prepare a prefilled syringe preparation for aqueous injection containing thrombomodulin.
  • a stopper produced by West Co., Ltd., basic composition: promobutyl rubber
  • the concentration of thrombodulin in Reference Example 7 was adjusted to 6 mg Zm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 12 mM, the NaC1 was adjusted to 15 OmM, and the polysorbate 80 (C66111080) was adjusted to 0. After the addition, the pH was adjusted to 6.0.
  • a 6.3 mm inner diameter glass syringe with a cap (West Corp., basic composition: bromobutyl rubber) fitted with a cap at the tip (Becton Ditzkinson, 1 m 1 long, without needle) 0.5 m1 into the solution, adjust the degree of vacuum so that the void ratio is 15%, stopper the stopper (West Corp., basic composition: bromobutyl rubber) in a vacuum, and add an aqueous solution containing thrombomodulin.
  • a pre-filled syringe formulation for injection was prepared.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 6 mg Zm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 12 mM, NaC1 was adjusted to 15 OmM, and polyoxyethylene castor oil (Cremophor EL) was adjusted to 0.01%. After the addition, the pH was adjusted to 6.0. This chemical solution was filled with a glass syringe (Becton Ditzkinson, 1 m1 long type syringe, needle with a 6.3 mm inner diameter with a cap (West Corporation, basic composition: bromobutyl rubber) attached to the tip.
  • a glass syringe Becton Ditzkinson, 1 m1 long type syringe, needle with a 6.3 mm inner diameter with a cap (West Corporation, basic composition: bromobutyl rubber
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer to 2 OmM, the concentration of sodium acetate buffer to 2 OmM, and the NaC1 to 15 OmM. After the addition, the pH was adjusted to 6.0.
  • a 6.3 mm inner diameter glass syringe with a cap (Basic composition: bromobutyl rubber) attached to the tip (1 m1 long type syringe, manufactured by Vecton Dickinson) (Without needle), adjust the degree of vacuum so that the percentage of voids is 10%, stopper the stopper (manufactured by West Co., Ltd., basic composition: butyl mobutyl rubber) with vacuum, and contain thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous solution injection was prepared.
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer to 2 OmM, the concentration of sodium propionate buffer to 2 OmM, and the concentration of NaC1 to 15 OmM. After the addition, the pH was adjusted to 6.0.
  • a syringe (Becton D. Dickinson, 1 m1 long-type syringe, needle with a 6.3 mm inner diameter with a cap (Basic composition: Pro-butyl rubber) attached to the tip of this chemical solution None), adjust the degree of vacuum so that the void ratio is 10%, stopper the stopper (West Corp., basic composition: bromobutyl rubber) in a vacuum, and add an aqueous solution containing thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation for injection was prepared.
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to lmgZml, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, the concentration of sodium glutarate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM. After addition, the pH was adjusted to 6.0. A 6.3 mm inner diameter glass syringe (Becton Dates) fitted with a cap (Basic composition: bromobutyl rubber) at the tip is attached to this chemical.
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the sodium phosphate buffer concentration to 2 OmM, the sodium succinate buffer concentration to 2 OmM, and the NaC1 to 15 OmM. After the addition, the pH was adjusted to 6.0.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous injection was prepared.
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg Zm1, the concentration of sodium phosphate buffer to 2 OmM, the concentration of sodium tartrate buffer to 2 OmM, and the concentration of NaC1 to 15 OmM. After the addition as described above, the pH was adjusted to 6.0.
  • a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm (Becton, made by Dickinson, 1 m 1 long type syringe, without needle) with a cap (West Corporation, basic composition: promobutyl rubber) attached to the tip ), Adjust the degree of vacuum so that the void ratio is 10%, stopper the stopper (manufactured by West Corporation, basic composition: bromobutyl rubber) with a vacuum, and inject an aqueous solution containing thrombomodulin.
  • a brefilled syringe formulation was prepared.
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, the sodium fumarate buffer was adjusted to 2 OmM, and the NaC1 was adjusted to 15 OmM. After the addition as described above, the pH was adjusted to 6.0.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 OmM, the sodium malate buffer was adjusted to 2 OmM, and the NaC1 was adjusted to 15 OmM. After the addition, the pH was adjusted to 6.0.
  • a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm (Becton Dickinson, 1 m 1 long type syringe, without needle) with a cap (West Corporation, basic composition: bromobutyl rubber) attached to the tip ), Adjust the degree of vacuum so that the void ratio becomes 10%, stopper the stopper (Basic composition: Bromobutyl rubber, manufactured by West Co., Ltd.) in a vacuum, and inject an aqueous solution containing thrombomodulin.
  • a prefinoledo syringe formulation was prepared.
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 9 was adjusted to 1 mgZm 1, the concentration of sodium phosphate buffer solution was adjusted to 2 OmM, and NaC 1 was adjusted to 15 OmM.
  • the concentration of the thrombomodulin of Reference Example 8 (consisting of the amino acids at positions 367-480 of SEQ ID NO: 1) was adjusted to 1 mgZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was added to adjust the pH to 6.0 after adding 15 OmM, polysorbate 80 (Tween 80) to 0.01%.
  • This drug solution was dispensed in 2 ml 1 ampules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous solution injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Comparative Example 1
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaCl was added to adjust to 15 OmM. Was adjusted.
  • This drug solution was dispensed in 2 ml ampoules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Comparative Example 2
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg Zm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was added to 15 OmM. After that, the pH was adjusted to 6.0. This drug solution was dispensed in 2 ml 1 ampules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Comparative Example 3
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 0.2 mM, and NaC1 was added to adjust to 15 OmM, and then the pH was adjusted to 6.0. did.
  • This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Comparative Example 4
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium acetate buffer was adjusted to 20 mM, and NaCl was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 6.0. .
  • This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Comparative Example 5
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, and the concentration of sodium phosphate buffer solution was adjusted to 20 OmM. Further, NaC 1 was adjusted to 15 OmM. Polysorbate 80 (Twe en 80) was added to a concentration of 0.01%, and the pH was adjusted to 7.3. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35
  • the concentration of thrombodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg
  • the buffer concentration was adjusted to 2 OmM, and NaC1 was added to 15 OmM, and vorisolate 80 (Tween 80) to 0.01%, and the pH was adjusted to 7.3. Adjusted.
  • This drug solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Comparative Example 7
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 mM, and NaC1 was adjusted to 15 OmM, polysorbate 80 (Tween 80) to 0. After the addition, the pH was adjusted to 7.3. This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Comparative Example 8
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mg Zm1, the concentration of sodium phosphate buffer to 2 OmM, the concentration of sodium acetate buffer to 2 OmM, and the NaC1 to 15 OmM and the polysorbate 8 0 (Tween 80) was added to a concentration of 0.01%, and the pH was adjusted to 7.3.
  • This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules in 2 ml portions and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Comparative Example 9
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 mM, and NaC1 was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 7.3. It was adjusted.
  • This medicinal solution was dispensed into 2 ml ampoules for 2 ml each and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. At this time, the percentage of voids in the shakeable portion was 35%. Comparative Example 10
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 1 mgZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaC1 was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 7.3. .
  • This solution was injected into a 6.3 mm glass syringe (Becton Ditzkinson, 1 m1 long type syringe) with a cap (West Corporation, basic composition: bromobutyl rubber) attached to the tip. 1m1 into a syringe (without a needle), adjust the degree of vacuum so that the void ratio is 10%, and stopper the stopper (made by West Co., Ltd., basic composition: bromobutyl rubber) with a vacuum to stop thrombomodulin.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous injection containing the following was prepared. Comparative Example 1 1
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 1 mg / m 1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaCl was added to 150 mM, and the pH was adjusted to 6.0.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous solution injection was prepared. Comparative Example 1 2
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 8 was adjusted to 1 mg / m1, the concentration of sodium phosphate buffer was adjusted to 2 OmM, and NaCl was added to adjust to 15 OmM. Was adjusted.
  • This medicinal solution was dispensed in 2 ml 1 ampules for 2 ml and sealed to prepare an aqueous injection preparation containing thrombomodulin. (Void ratio: 35%) Test Example 1
  • the aqueous injection preparations of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 4 were heated by the following measurement method 1. Residual rate of stability-related titer (Residual titer was measured. According to the determination method 1, one having a titer of 66% or more after storage at 50 ° C for 96 hours was determined to be appropriate. According to the predictions by the plot, those with a potency of 66% or more after storage at 50 for 96 hours are estimated to retain the potency at 80% or more at 5 ° C for 3 years. The evaluation of the shaking stability test was performed by Method 2. The results that were satisfactory in both of Method 1 and Method 2 were compared Appropriate and unsuitable evaluations were made, and the results are shown in Table 1.
  • the residual potency in thermal stability was 66% or more at pH 6.0, but the pH of the comparative example was 7.3. In 1 it was less than 66%.
  • a surfactant of 0.01% Tween 80 or 0.1% HCO-60 coexists, no turbidity occurs in shaking stability, and the overall evaluation is “suitable”.
  • a solution for aqueous injection was prepared.
  • ⁇ Measurement method 1 Thermal stability test (Heat treatment at 50 at 96 hours) Heat the aqueous solution to be measured at 50 ° C for 96 hours. Measure the thrombomodulin titer in step, and compare the residual ratio of the heat-treated sample (residual titer%) with the titer of the sample frozen and stored without heat treatment as 100%.
  • the thrombomodulin titer is measured by an action that promotes protein C activation by thrombin (APC Atsay method). That is, 5 OmM Tris-HCl containing 10 OmM NaCl, 3 mM calcium chloride, 0.1% PB serum albumin (Sigma), and 0.225N I HU human thrombin (Sigma).
  • Buffer solution pH 8.5
  • sample solution appropriately prepared from an aqueous injection solution containing thrombomodulin (however, the amount of toombomodulin in 5 // L of sample solution)
  • thrombomodulin the amount of toombomodulin in 5 // L of sample solution
  • 37 ° C 15 minutes to obtain about 300 ng / m1 of ⁇ cyprotein.
  • Add 7.5 L of C (Life Technologies) and let it stand at 37 ° C for another 30 minutes to activate protein C.
  • a solution containing about 100 g / m1 heparin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and about 6 g / m1 antithrombin III (Life Technologies) was added to stop the reaction. Let it. Next, add 500 L of substrate reaction solution containing 100 / g / m1 of the synthetic substrate (BOC-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA), and add Let stand for 0 minutes. Stop the substrate cleavage reaction by adding 50 L of acetic acid. The fluorescence intensity of the reaction mixture was measured at an excitation wavelength of 380 nm and an emission wavelength of 450 nm using a fluorimeter, and the amount of activated protein C generated was determined. Calculate thrombomodulinka value.
  • ⁇ Measurement method 2 Shaking stability test (shaking treatment for 180 reciprocations) The aqueous solution to be measured was placed in a thermostat shaker at 25 ° C with an amplitude of 5 cm for 180 minutes per minute. Perform the shaking treatment for one month under the reciprocating condition, and observe the appearance change before and after the treatment. If necessary, measure turbidity (absorbance at 650 nm) and residual ratio of thrombomodulin titer. The shaking direction should be parallel to the long axis of the container. The method of measuring the thrombomodulin value is the same as the method 1. Test example 2
  • the concentration of the sodium acetate buffer was varied over a wide range from 0.2 to 20 OmM, but it was not affected by the concentration of the buffer, and if the pH was within the range of 5.0 to 6.0, it was thermally stable. Residual titers in sex were all above 66%. When 0.01% 0—ee ⁇ 80 was present, an aqueous injection preparation was prepared that did not cause turbidity in shaking stability and had an overall evaluation of “suitable”. Test example 3
  • the concentration of both sodium phosphate buffer and sodium acetate buffer was adjusted to 2 OmM and the pH was shaken at 5.07.3.
  • the residual titers in all were more than 66%.
  • the pH is in the range of 5.5.6.5, the residual titer in thermal stability is 73% or more, which is the case where the potency is maintained at 80% or more at 5 ° C for 4 years. It was estimated.
  • the residual titer at pH 5.5 and 6.0 was as high as 80% or more.
  • pH 7.3 it was lower than 66% (Comparative Example I8).
  • 0.0 I% Tween 80 was present, a formulation for aqueous solution injection was prepared which did not cause turbidity in shaking stability and had an overall evaluation of “suitable”. Test example 5
  • Test Example 6 One of the aqueous injection preparations of Examples 33 to 38 and Comparative Examples 1 and 2 was measured by the above-mentioned measurement method 1 and measurement method 2, and similarly evaluated comprehensively. The result was sixth. Table 6
  • Example 1 For the aqueous injection preparations of Example 1 8 3 9 4 3 4 4 and Comparative Example 9, the measurement methods 1 and 2 described above were measured. The results are shown in Table 7.
  • Example 4 56 3 and Comparative Example 10 12 For the aqueous injection preparations of Example 4 56 3 and Comparative Example 10 12, the above-mentioned measurement methods 1 and 2 were measured, and the overall evaluation was similarly performed. The results are shown in Table 8. In other words, when the ratio of the voids in the shakeable portion was set to 50% or less, no turbidity occurred in the shaking stability, but 60% of Comparative Example 11 and 70% of Comparative Example 1 In 2, shaking caused cloudiness. In addition, when the pH was 6.0, the residual titer in thermal stability was 66% or more, and an aqueous injection preparation having an “appropriate” overall evaluation was prepared. Test example 9
  • the thrombomodulin concentration should be at least in the range of 0.1 to 6 mgZm1. There was no influence, and when the pH was adjusted to 6.0, the residual titers in thermal stability were all 66% or more. In addition, when the void ratio was set to 10 to 15%, an aqueous injection was prepared which did not cause turbidity in shaking stability and had an overall evaluation of “suitable”.
  • Example 92 using the soluble thrombomodulin of Reference Example 8, an aqueous solution injection having excellent heat stability and shaking stability was prepared.
  • Test example 1 1
  • Example 6m 6.0 0.01% 100 94.4 85.6
  • the injectable aqueous solution to be measured is stored at 20 ° C for 6 months, and the residual ratio of thrombomodulin titer is measured.
  • the tombombomodulin value is measured in the same manner as in Method 1. Test example 1 2
  • test solutions or preparations were administered subcutaneously to the tail vein or the back of a 9 to 10-week-old male SD rat (Charles River Japan), and blood was collected over time.
  • the concentration of thrombomodulin in Reference Example 7 was increased by 10 g / m to 50 ng / m1,2
  • the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 1 OmM to each concentration of 50 pigZm1, and NaC1 was added to 15 OmM, and polysorbate 80 (Tween 80) was added to 0.01. %,
  • the pH was adjusted to 7.4, and used as a test solution for intravenous injection.
  • the doses are as shown in Table 13.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 10 ⁇ g / m1, 50 ⁇ g / ml, and 250 ⁇ g / m1, and the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 1 OmM. , 150 mM of NaC1, 0.01% of polysorbate 80 (Tween 80), 4 OmgZm 1 of benzyl alcohol, 0.3% of methyl paraoxybenzoate. %, The pH was adjusted to 7.4, and the solution was prepared as test solution A for subcutaneous injection. The doses are as shown in Table 13.
  • the thrombomodulin concentration in Reference Example 7 was adjusted to 10 ⁇ gZm1, 50 ⁇ g / ml, and 250g / m1, respectively, and the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 1OmM.
  • Na C 1 was added at 15 OmM
  • polysorbate 80 (Tween 80) was added at 0.01%
  • procaine hydrochloride was added at 4 Omg / m 1
  • methyl paraoxybenzoate was added at 0.3%. Thereafter, the pH was adjusted to 7.4, and used as a test solution B for subcutaneous injection.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 250 ag / m1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, and NaCl was added to a concentration of 15 OmM, and the pH was adjusted to 6.0.
  • a glass syringe with an inner diameter of 6.3 mm available from Becton's Dickinson, 1 m 1 long type syringe without needle
  • a cap West Corporation, basic composition: bromobutyl rubber
  • stopper the stopper ⁇ Est Co., basic composition: bromobutyl rubber
  • a prefilled syringe formulation for aqueous injection was prepared.
  • the formulation is equipped with a plunger rod (Becton Dickinson, for 1m1 long type syringe, composition: polypropylene) and a syringe needle (Termo, 26Gx1Z2 "). This was referred to as a preparation c for subcutaneous injection.
  • the thrombomodulin concentration of Reference Example 7 was adjusted to 250 gZm1, the sodium phosphate buffer concentration was adjusted to 2 mM, NaC1 was adjusted to 15 OmM, and polysorbate 80 (Tween 80) was adjusted to 0. After the addition of 0.1%, the pH was adjusted to 6.0.
  • a prefilled syringe formulation for aqueous injection was prepared.
  • a plunger rod (Becton Dickinson, 1 m1 long type syringe, composition: polypropylene) and an injection needle (TERMO, 26 Gx1 Z2 ") were attached to this formulation, Formulation D for injection was given.
  • the subcutaneous administration route maintains the blood concentration to maintain an effective therapeutic level as compared with the conventional intravenous administration route.
  • the B A (bioavailability) value at the time of subcutaneous administration was 50% or more at all doses, and good absorption was observed.
  • the pH of the drug to be administered subcutaneously was adjusted to 3.0 to 7.4, but no particular change was found in the blood concentration.
  • the ionic strength of the drug was changed (NaCl concentration was 0 to 4.8%), and no particular change was found in the blood concentration.

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Description

明 細 書 トロンボモジュリン水溶液注射剤の貯蔵 ·流通時の品質保持方法 産業上の利用分野
本発明は、 凍結又は凍結乾燥されていない液状のトロンボモジュリン水溶液注 射剤の貯蔵 ·流通時における品質保持方法、 又は貯蔵 ·流通において安定なト口 ュリン水溶液注射剤に関する。 従来の技術
トロンボ乇ジュリン （以下、 TMと略記することがある） は、 トロンビンと特 異的に結合し、 トロンビンによるプロテイン Cの活性化を著しく促進する作用を 有する物質である。 プロテイン Cは、 血液凝固線溶系において重要な役割を演じ ているビ夕ミ ン K依存性のたん白質であり、 トロンビンの作用により活性化され 、 活性型プロテイン Cとなる。 この活性型プロテイン Cは、 生体内で血液凝固系 因子の活性型第 V因子、 および活性型第 V I I I因子を失活させ、 また血栓溶解 作用を有するプラスミノ一ゲンァクチべ一夕一の産生に関与していることが知ら れている 〔鈴木宏治、 医学のあゆみ、 第 1 2 5巻、 9 0 1頁 （ 1 9 8 3年） 〕 。 したがって、 トロンボモジュリンは、 このトロンビンによるプロテイン Cの活 性化を促進して抗血液凝固作用と血栓溶解作用を示す活性型プロティン Cを大量 に生産せしめるものであり、 抗血液凝固剤又は血栓溶解剤として有用であるとさ れている。 また、 従来トロンボモジュリンの用途としては、 例えば、 急性冠 1¾脈 症候群 （A C S ； acute coronary syndrome ) (例えば、 心筋梗塞、 不安定狭心 症、 冠動脈血行再建術など） 、 血栓症 （例えば、 急性期又は慢性期の脳血栓症、 動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢血栓症等） 、 塞栓症 （例えば、 急性期又は慢 性期の脳塞栓症、 動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢塞栓症等） 、 末梢血管閉塞 症 （例えば、 バージャ一病、 レイノ一病等） 、 閉塞性動脈硬化症、 血管炎 （例え ば、 全身性エリテマトーデス （S L E ) 、 ベーチェッ ト病、 川崎病等） 、 心臓手 術に続発する機能性障害、 移植臓器の合併症、 血管内血液凝固症候群 （D I C) 、 狭心症、 一過性脳虚血発作、 妊娠中毒症、 糖尿病、 肝 VOD (L i V e r v e n o— o c c l u s i v e d i s e a s e ;劇症肝炎や骨髄移植後の肝静脈 閉塞症） 、 深部静脈血栓症 （D VT； D e e p v e n o u s t h r omb o s i s) 等の疾患の治療及び予防に用いられることが期待されている。
従来、 トロンボモジュリンは、 ヒ トを始めとする種々の動物種の血管内皮細胞 上に発現している糖蛋白質として発見取得されたが、 発明者らのグループにより 、 始めてクロ一ニングに成功した。 即ち、 遺伝子工学的手法を用いてヒ ト肺 c D N Aライブラリ一から、 シグナルべプチドを含むヒト トロンボモジユリン前駆体 の遺伝子をクロ一ニングし、 そしてトロンボモジュリンの全遺伝子配列を解析し 、 1 8アミノ酸残基のシグナルペプチドを含む 5 75残基のアミノ酸配列が明ら かにされている （特開昭 64— 6 2 1 9号公報） 。 シグナルペプチドが切断され たマチュアなトロンボモジュリンは、 そのマチュアなぺプチドの N末端側より N 末端領域 （ 1— 22 6番目） 、 6つの EGF様構造をもつ領域 （ 227— 4 6 2 番目） 、 0型糖鎖付加領域 （4 6 3 - 4 9 8番目） 、 膜貫通領域 （4 9 9一 5 2 1 ) 、 そして細胞質内領域 （ 5 22— 5 5 7番目） の 5つの領域から構成されて おり、 そして全長のトロンボモジュリンと同じ活性を有する部分 （即ち、 最小活 性単位） は、 6つの EGF様構造をもつ領域のうち N末端側から 4、 5、 6番目 の EGF様構造からなる部分であることが知られている 〔M. Zu s h i ら、 J . B i o l . Ch em. , 24 6, 1 0 3 5 1— 1 0 3 5 3 ( 1 9 8 9) 〕 。 少なく とも、 膜貫通領域を含有しないように調製されたトロンボモジュリンに おいては、 界面活性剤の非存在下でも綺麗に溶解することができる性質 （以下、 可溶性ということがある） を有し、 例えば、 Ν末端領域と 6つの EGF様構造を もつ領域と〇型糖鎖付加領域の 3つの領域のみからなる （即ち、 配列番号 1の 1 9〜5 1 6位のアミノ酸配列からなる） トロンボモジュリンは、 組換え技術の応 用により取得できること、 そしてその組換え体トロンボモジュリンは、 天然のト ロンボモジュリンの活性を有していることが確認されている （特開昭 64 - 6 2 1 9号公報） 。 因みに、 遺伝子においては、 自然の変異または取得時の変異により、 多くのケ ースで認められる通り、 ヒトにおいても多形性の変異が見つけられており、 上述 の 5 7 5残基のァミノ酸配列からなるヒ ト トロンボモジュリン前駆体の第 4 7 3 位の了ミノ酸において V a 1であるものと、 A 1 aであるものが現在確認されて いる。 このアミノ酸をコードする塩基配列においては、 第 1 4 1 8位において、 それぞれ Tと Cとの変異に相当する 〔W e nら、 B i o c h e m i s t r y 2 6 , 4 3 5 0 - 4 3 5 7 ( 1 9 8 7 ) 〕 。 しかし、 活性及び物性においては、 全 く相違なく、 両者は実質的に同一と考えることができる。 したがって、 上述の配 列番号 1のァミノ酸配列からなるトロンボモジュリンは、 配列番号 2のァミノ酸 配列からなるトロンボモジュリンの多形性のぺプチドであり、 実質的に同一と判 断できる。
ところで、 このトロンボモジュ リ ンは、 医薬組成物として広く安定的に供給す る場合には、 凍結乾燥製剤として供給することが行われている。 この凍結乾燥の 過程で、 トロンボモジュリ ン含有溶液を凍結乾燥すると、 微量ではあるが一部が 変性によって高分子化し、 トロンボモジュリン分子がいくつか会合した多量体が 生成することが明らかとなった。 この課題を解決するために、 本発明者らは、 鋭 意検討した結果、 アミノ酸またはその塩類を添加することにより、 凍結乾燥時の トロンボモジュリンの変性が防止されることを確認し、 先に出願した （特開平 6 - 3 2 1 8 0 5号公報） 。 発明が解決しょうとする課題
しかしながら、 簡便に用いることができ、 また製造費用の安価な、 凍結乾' 製 剤以外の、 新たな製剤を提供することが求められている。 課題を解決するための手段
本発明者らは、 凍結乾燥製剤以外の新たな製剤を開発する目的で、 凍結乾燥ェ 程を行わずに、 用時溶解する必要のないトロンボモジュリンの水溶液注射用製剤 の開発を検討した。 トロンボモジュリンの水溶液注射用製剤に必要とされる品質 としては、 先ず第一に、 5でから室温での長期保存において残存力価が大きく下 がらないこと （長期安定性） が必要であるが、 調べてみると、 必ずしもこの長期 安定性を得ることは容易ではなかった。 またさらに意外なことに、 水溶液注射用 製剤を振盪したときに、 白濁を生ずる場合があることが確認された。 輸送等の流 通の過程において、 程度の差はあっても、 製剤が振盪されることは十分に予想さ れ、 粉体である従来の凍結乾燥製剤においては全く問題となることはなく、 全く 予想もされなかった振盪安定性に関する課題が、 本発明者らにより新たに確認さ れた。 注射剤において、 不溶物が存在することは、 特に循環器疾患を有する患者 にとつて致命的な問題を引き起こす可能性があり、 振盪により白濁して不溶物が 生ずる振盪安定性に関する問題は極めて大きな障害である。
以上まとめると、 水溶液注射剤は、 凍結乾燥製剤に比べると使用時における注 射用蒸留水への溶解の必要もなく簡便に投与でき、 また製造工程で凍結乾燥操作 を必要とせず製造上簡便且つ経済的であるなどの利点があるが、 上述の通り、 単 純にトロンボモジュリ ンを溶液にするだけでは、 長期安定性に劣り、 振盪安定性 についても満足のいくものは得られず、 長期に貯蔵 ·流通せしめることのできる 水溶液注射剤を作成することは困難であつた。
本発明者らは、 前記の問題を解決するために鋭意研究を行った結果、 特定の条 件によりこれらの問題点をことごとく解決できることを確認して、 本発明を完成 するに至った。
即ち、 本発明は、 凍結又は凍結乾燥されていない液状のトロンボモジュリン水 溶液注射剤の貯蔵 ·流通時における品質保持方法であって、 有効量の可溶性ト口 ンボモジュリンと、 p H 5以上、 7 . 0以下の間において緩衝能を有する緩衝液 成分とを含有せしめたトロンボモジュリン水溶液の p Hが 5以上 7 . 0以下であ り、 （a ) 該トロンボモジュリン水溶液は、 さらに、 界面活性剤を含有し、 容器 に無菌充填されていること、 又は、 （b ) 該トロンボモジュリン水溶液が実質的 な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充塡されているプレフィル ドシリンジ製剤であること、 のいずれかを特徴とするトロンボモジュリン水溶液 注射剤を液状で長期に貯蔵 ·流通せしめることからなる方法である。 したがって、 本発明の貯蔵 ·流通時における品質保持方法の第一の態様は、 有 効量の可溶性トロンボモジュリンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間において緩衝 能を有する緩衝液成分と、 界面活性剤とを含有し、 pHが pH 5以上 7. 0以下 であるトロンボモジュリン水溶液が、 容器に無菌充塡されていることを特徴とす るトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵 ·流通せしめることから なる上記に記載の方法である。
また、 本発明の第二の態様は、 有効量の可溶性トロンボモジュリンと、 pH 5 以上、 7. 0以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有し、 ^！が H 5以上 7. 0以下であるトロンボモジュリ ン水溶液が、 実質的な空隙部を存在 せしめないようにシリンジ容器に無菌充塡されているプレフィルドシリンジ製剤 であることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵 · 流通せしめることからなる上記に記載の方法である。
また、 好ましい本発明の第三の態様は、 有効量の可溶性トロンボモジュリンと 、 pH 5以上、 7. 0以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分と、 界面活性 剤とを含有し、 pHが pH 5以上 7. 0以下であるトロンボモジュ リ ン水溶液が 、 実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプ レフィルドシリンジ製剤であることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射 剤を液状で長期に貯蔵 ·流通せしめることからなる上記記載の方法である。
また、 本発明の方法は、 有効量の可溶性トロンボモジュリンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有せしめたトロンボモ ジュリン水溶液の pHが 5以上 7. 0以下であり、 （a) 該トロンボモジュリン 水溶液は、 さらに、 界面活性剤を含有し、 容器に無菌充塡されていること、 文は 、 (b) 該トロンボモジュリン水溶液が実質的な空隙部を存在せしめないように シリンジ容器に無菌充塡されているプレフィルドシリンジ製剤であること、 のい ずれかを特徴とする凍結又は凍結乾燥されていない液状のトロンボモジュリン水 溶液の長期および振盪における安定化方法である。
本発明の方法に用いられるトロンボモジュリン水溶液注射剤は、 有効量の可溶 性トロンボモジュリンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間において緩衝能を有する 緩衝液成分とを含有せしめたトロンボモジュリン水溶液の pHが 5以上、 7. 0 以下であり、 （a) 該トロンボモジュ リ ン水溶液は、 さらに、 界面活性剤を含有 し、 容器に無菌充塡されていること、 又は、 （b) 該トロンボモジュリン水溶液 が実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充塡されているプ レフィルドシリンジ製剤であること、 のいずれかを特徴とする長期安定性および 振盪安定性において優れ、 液状で長期貯蔵 ·流通せしめるための凍結又は凍結乾 燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤である。
即ち、 トロンボモジュリン水溶液注射剤の第 1の態様としては、 有効量の可溶 性トロンボモジュリ ンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間において緩衝能を有する 緩衝液成分と、 界面活性剤とを含有し、 pHが pH 5以上、 7. 0以下であるト ロンボモジュリン水溶液が、 容器に無菌充塡されていることを特徴とする長期安 定性および振盪安定性において優れ、 液状で長期貯蔵 ·流通せしめるための凍結 又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤である。
また、 トロンボモジュリン水溶液注射剤の第 2の態様としては、 有効量の可溶 性ト^ンボモジュリンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間において緩衝能を有する 緩衝液成分とを含有し、 pHが pH 5以上、 7. 0以下であるトロンボ乇ジユリ ン水溶液が、 実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充塡さ れているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とする長期安定性および振 盪安定性において優れ、 液状で長期貯蔵 ·流通せしめるための凍結又は凍結乾燥 されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤である。
また、 トロンボモジュリン水溶液注射剤の第 3の態様としては、 有効量の可溶 性トロンボモジュリンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間において緩衝能を有 る 緩衝液成分と、 界面活性剤とを含有し、 pHが pH 5以上、 7. 0以下であるト ロンボモジュリン水溶液が、 実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容 器に無菌充塡されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とする長期 安定性および振盪安定性において優れ、 液状で長期貯蔵 ·流通せしめるための凍 結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤である。
本発明でトロンボモジュリンとは、 トロンビンに結合し、 トロンビンによるプ 口ティン cの活性化を促進する作用を有する物質であれば特に限定されない。 可 溶性トロンボモジュリンとは、 上記のトロンボモジュリンとしての活性を有じ、 界面活性剤の非存在下でも容易に溶解し得る物質であり、 例えば、 注射用蒸留水 に対して、 少なくとも 1 m g Zm 1以上、 好ましくは 3 m g /m 1以上、 特に好 ましくは 6 m g /m l以上の溶解性が得られるものが好ましい。 また、 可溶性ト ロンボ乇ジュリンとしては、 例えば、 分子量 （非還元状態での S D S—ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動法による測定） が 6 . 6万 ± 1万であり、 トロンビンに よるプロテイン Cの活性化を促進する作用を有し、 且つ注射用蒸留水に少なく と も 6 m g Zm 1の濃度として溶解可能な可溶性であるべプチドが好ましい例とし て挙げられる。 他の可溶性トロンボモジュリンとしては、 配列番号 1の 1 9— 2 9のァミノ酸配列を含有するァミノ酸配列からなり、 トロンビンによるプロティ ン Cの活性化を促進する作用を有し、 且つ可溶性であるべプチドである可溶性ト ロンボモジュリンが例示される。 またさらに他の可溶性トロンボモジュリンとし ては、 （ i ) 配列番号 1の 1 9 一 5 1 6のアミノ酸配列からなる可溶性ト口ンボ モジュリ ン、 又は （ i i ) 上記ァミノ酸配列の 1個又は複数個のァミノ酸が置換 、 欠失、 付加されたアミノ酸配列からなり、 且つトロンビンによるプロテイン C の活性化を促進する作用を有する可溶性トロンボモジュリンのいずれかも好まし い例として示される。
さらに、 トロンボモジュリンとしては、 通常、 トロンボモジュリンの最小活性 単位とされる、 6つの E G F様構造を持つ領域のうちの N末端側から 4、 5、 6 番目の構造 （例えば、 ヒト型のトロンボモジュリンとしては、 配列番号 1および 配列番号 2の 3 6 7 - 4 8 0位） を少なく とも有するアミノ酸配列からなる プ チドが挙げられる。 このなかで特に好ましい可溶性トロンボモジュリンとしては 、 配列番号 1 または配列番号 2のァミノ酸配列をコードする D N Aをベクターに より宿主細胞にトランスフエク トして調製される形質転換細胞が産生し得るぺプ チドが挙げられる。 この形質転換細胞が産生し得るペプチド （可溶性トロンボモ ジュリン） としては、 配列番号 1および配列番号 2の 1 9— 5 1 6位のァミノ酸 配列からなるぺプチドが好ましい例として挙げられる。 その他に宿主細胞によつ ては、 シグナル部分がそのままや、 前記配列番号 1および配列番号 2の 1 7— 5 1 6位のアミノ酸配列からなるペプチド、 又はそれらの混合物であってもよい。 勿論これらのぺプチドは極めて溶解性が高いもので、 前述の溶解性を十分に有す るものである。 さらに、 これらのペプチドは、 前記のアミノ酸配列を有すればよ いのであって、 糖鎖が付いていても、 又付いていなく ともよく、 特に限定される ものではない。 また、 ヒト尿等から取得できる可溶性ペプチドも利用することが できる。 宿主細胞の種類により、 糖鎖の種類や、 付加位置や付加の程度は相違す るものであり、 いずれも用いることができる。 配列番号 1および配列番号 2の 3 6 7 - 4 8 0位からなるペプチド自体は、 振盪安定性が高く、 その点ではいずれ にしても好ましい水溶液製剤となるが、 上記の分子量 （非還元状態で 6. 6万土 1万） の可溶性トロンボモジュリン、 例えば、 前述の配列番号 1の 1 9— 5 1 6 のァミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、 配列番号 2の 1 9一 5 1 6 のァミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、 配列番号 1に記載のァミノ 酸配列をコ一ドする DNAを宿主細胞にトランスフ ク トして得られる可溶性ト ロンポモジュリン、 又は、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列をコードする DNA を宿主細胞にトランスフエク トして得られる可溶性トロンボモジュリンのいずれ かの可溶性トロンボ乇ジュリンにおいては、 本発明の構成により振盪安定性を高 める必要があると理解される。
宿主細胞としては、 チャイニーズハムスター卵巣 （CHO) 細胞、 COS— 1 細胞、 COS— 7細胞、 VERO (ATCC CCL- 8 1 ) 細胞、 BHK細胞 、 ィヌ腎由来 MDCK細胞、 ハムスター AV— 1 2 - 6 6 4細胞等が、 またヒト 由来細胞として H e L a細胞、 W I 3 8細胞、 ヒト 2 9 3細胞等が挙げられ 。 CH〇細胞においては、 DHFR— CH〇細胞がさらに好ましい。
また、 遺伝子操作の過程において、 大腸菌等の微生物も多く使われ、 それぞれ に適した宿主一ベクター系を使用することが好ましく、 上述の宿主細胞において も、 適宜のベクター系を選択することができる。
遺伝子組換え技術に用いるトロンボモジユリンの遺伝子は、 クローニングされ ており、 そしてトロンボモジュリンの遺伝子組換え技術を用いた製造例が開示さ れており、 さらにはその精製品を得るための精製方法も知られている （特開昭 6 4 - 6 2 1 9号公報、 特開平 2— 2 5 5 6 9 9号公報、 特開平 5 - 2 1 3 9 9— 8 号公報、 特開平 5— 3 1 0 7 8 7号公報、 特開平 7 - 1 5 5 1 7 6号公報、 J. B i o l . Ch e m. , 2 6 4, 1 0 3 5 1— 1 0 3 5 3, 1 9 8 9) 。 したが つて本発明のトロンボモジュリンは、 上記の報告に記載されている方法を用いる ことにより、 あるいはそれらに記載の方法に準じることにより製造することがで きる。 例えば特開昭 64 - 6 2 1 9号公報では、 全長のトロンボモジュリンをコ ―ドする DN Aを含むプラスミ ド p s V 2 TM J 2を含む、 E s c h e r i c h i a c o l i K- 1 2 s t r a i n DH 5 (ATCC 寄託番号 6 72 8 3号） を開示しているが、 本出願人は、 再度、 同じ菌株 （E s c h e r i c h i a c o l i DH 5/p s V 2T J 2) を日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成 8年 6月 1 9日に寄託した。 受託番号は FERM BP— 5 5 70である。 この全長のト ロンボモジュリンをコ一ドする DN Aを原料として、 公知の遺伝子操作技術によ つて、 本発明のトロンボモジュリンを調製することができる。
本発明に用いられる可溶性トロンボモジュリンは、 従来公知の方法またはそれ に準じて調製すればよいが、 例えば、 前記山本らの方法 （特開昭 64 - 6 2 1 9 号公報、 実施例参照） 、 又は特開平 5 - 2 1 3 9 9 8号公報を参考にすることが できる。 すなわちヒト由来のトロンボモジュリン遺伝子を遺伝子操作技術により 、 例えば、 配列番号 1のアミノ酸配列をコードする DNAとなし、 さらに必要に 応じた改変を行うことも可能である。 この改変としては、 例えば、 配列番号 2の ァミノ酸配列をコードする DNAとなすために、 配列番号 1のァミノ酸配列の第 4 73位のァミノ酸をコ'一ドするコドン （特に、 第 1 4 1 8位の塩基） に、 メソ ッ ド イン ェンザィモロジ一 （Method in Enzymology) 、 第 1 0 0巻、 第 4 6 8頁 （ 1 9 8 3年） 、 アカデミックプレス （Academic Press) に記載の方法に従 つて、 部位特異的変異を行う。 例えば、 配列番号 3の塩基配列を含む DN A断片 及び配列番号 5に示された塩基配列を有する変異用合成 DN Aを用い、 上記部位 特異的変異を行い、 配列番号 2のァミノ酸配列をコードする DNAとなすことが できる。 このようにして、 調製した D N Aを、 例えばチャイニーズハムスター卵 巣 （C H O ) 細胞に組み込んで、 形質転換細胞とし、 適宜選択し、 この細胞を培 養して得た培養液から、 公知の方法により精製された可溶性トロンボモジュリン が製造できる。 前述の通り配列番号 1のァミノ酸配列をコードする D N Aを前記 宿主細胞にトランスフエク トすることが好ましい。 本発明に用いられるトロンボ モジュリンの生産方法は、 上記の方法に限定されるものではなく、 例えば、 トロ ンボモジュリン又は可溶性トロンボモジュリンを産生する組織または組織培養液 やヒト尿等から抽出精製することも、 又は必要によりさらに蛋白分解酵素により 切断処理することも可能である。
次いで上記により取得された培養上清、 または培養物からのトロンボ乇ジュリ ンの単離精製方法は、 公知の手法 〔堀尾武ー編集；蛋白質 ·酵素の基礎実験法〕 に準じて行なうことができる。 例えば、 トロンボモジュリンと逆の電荷を持つ官 能基を固定化したクロマトグラフィー担体と、 トロンボモジユリンの間の相互作 用を利用したイオン交換クロマトグラフィーの使用も好ましい。 また、 トロンボ モジユリンとの特異的親和性を利用したァフィ二ティークロマトグラフィーも好 ましい例として挙げられる。 吸着体の好ましい例として、 トロンボモジュリンの リガンドであるトロンビンやトロンボモジュリンの抗体を利用する例が挙げられ る。 これらの抗体としては、 適宜の性質、 或いは適宜のェピト一プを認識する ト ロンボモジュリンの抗体を利用することができ、 例えば、 特公平 5— 4 2 9 2 0 号公報、 特開昭 6 4— 4 5 3 9 8号公報、 特開平 6 - 2 0 5 6 9 2号公報などに 記載された例が挙げられる。 また、 トロンボモジュリ ンの分子量サイズを利用し た、 ゲル濾過クロマトグラフィーや限外濾過が挙げられる。 そしてまた、 疎永性 基を固定化したクロマトグラフィ一担体と、 トロンボモジュリンのもつ疎水性部 位との間の疎水結合を利用した疎水性クロマトグラフィーが挙げられる。 これら の手法は適宜組み合わせることができる。 精製の程度は、 使用目的等により選択 できるが、 例えば電気泳動、 好ましくは S D S— P A G Eの結果が単一バンドと して得られる力、、 もしくは単離精製品のゲル濾過 H P L Cまたは逆相 H P じの 結果が単一のピークになるまで純粋化することが望ましい。 精製法を具体的に例示すれば、 トロンボモジュ リ ン活性を指標に精製する方法 が挙げられ、 例えばイオン交換カラムの Q—セファロ一ス F Fで培養上清または 培養物を粗精製しトロンボモジュリン活性を有する画分を回収し、 ついでァフィ 二ティ一カラムの D I P— TB ( d i i s op r opy l pho s p o r y l t h r omb i n a ga r o s e) で主精製しトロンボモジュリン活性が強い 画分を回収し、 回収画分を濃縮し、 ゲルろ過にかけトロンボモジュリン活性画分 を純品として取得する精製方法 [五味ら ； B l o o d、 75、 1 396 - 1 39 9、 1 990 ] が挙げられる。 指標とするトロンボモジュリン活性としては、 例 えばトロンビンによるプロテイン C活性化の促進活性が挙げられる。 その他に、 好ましい精製法を例示すると以下の通りである。
トロンボモジュリンと良好な吸着条件を有する適当なイオン交換樹脂を選定し 、 イオン交換クロマト精製を行なう。 特に好ましい例としては、 0. 1 8M N aC lを含む 0. 02Mトリス塩酸緩衝液 （pH7. 4) で平衡化した Q—セフ ァロース F Fを用いる方法である。 適宜洗浄後、 例えば 0. 3M NaC lを含 む 0. 02Mトリス塩酸緩衝液 （pH7. 4) で溶出し粗精製品のトロンボモジ ュリンを得ることができる。
次に、 例えばトロンボモジュリンと特異的親和性を持つ物質を樹脂に固定化し ァフィ二ティーク口マト精製を行なうことができる。 好ましい例として D I P— トロンビンーァガロースカラムの例と、 抗トロンポモジュリ ンモノクロ一ナル抗 体力ラムの例が挙げられる。 D I P—トロンビンーァガロースカラムは、 予め、 例えば、 l O OmM NaC l及び0. 5 mM塩化カルシウムを含む 20 mMト リス塩酸緩衝液 （pH7. 4) で平衡化せしめ、 上記の粗精製品をチャージして 、 適宜の洗浄を行い、 例えば、 1. 0 NaC l及び 0. 5mM塩化カルシゥ ムを含む 2 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH7. 4) で溶出し精製品のトロンボモ ジュリンを取得することができる。 また抗トロンボモジュリンモノクロ一ナル抗 体力ラムにおいては、 予め CNB rにより活性化したセファロ一ス 4 B (フアル マシア社） に、 抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体を溶解した 0. 5M NaC l含有0. 1M NaHC03 緩衝液 （pH8. 3) に接触させ、 セファ ロース 4 Bに抗トロンボモジュリンモノクロ一ナル抗体をカツプリングさせた樹 脂を充塡したカラムを、 予め例えば 1. OM Na C 1を含む 2 OmMリ ン酸—塩 緩衝液 （pH 7. 3) で平衡化し、 適宜の洗浄の後、 例えば、 0. 3M Na C 1を含む 1 0 OmMグリシン塩酸緩衝液 （pH 3. 0) にて溶出せしめる方法が 例示される。
次に得られた上記精製可溶性トロンボモジュリ ン溶液を、 塩濃度、 pHの測定 精度及び TMの分子種にもよるが、 通常例えば比伝導度 25〜34msZcm、 pH 3〜4の条件下にて平衡化せしめた、 陽イオン交換体、 好ましくは強陽ィォ ン交換体である SP—セファロ一ス FF (フアルマシア社） にチャージする。 上 記の比伝導度としては、 3 0 ± 3msZcmが、 より好ましく、 また pHは、 p H 3. 0〜3. 7が好ましく、 さらに好ましくは pH 3. 5 ± 0. 1の条件が例 示される。 これらの条件は、 適当な濃度の塩を添加した緩衝液を使用することが 好ましく、 種々の態様が考えられるが、 例えば 0. 25〜 3 2 M、 好ましく は 0. 3 ± 0. 1 Mの Na C 1を含む 5 0〜 1 5 OmMの pH 3〜4の緩衝液が 例示される。 緩衝液の種類としては特に限定されないが、 例えば、 グリシン塩酸 、 クェン酸—クェン酸 2ナト リウム、 クェン酸ナト リウム、 酢酸が例示される。 上記の条件をさらに具体的に示せば、 3 0 0 mM Na C 1を含む 1 0 0 mMグ リ シン塩酸緩衝液 （pH 3. 5) が例示される。 比伝導度は、 例えば、 ポータブ ル伝導度計 （東亜電波工業株式会社製、 Pシリーズ CM - 1 1 P、 換算基準温度 25度） により簡単に測定することができる。
上記のカラムを例えば 3 0 0 mM N a C 1を含む 1 0 OmlV [グリシン塩酸緩 衝液 （pH 3. 5、 比伝導度 3 l ms/cm) で洗浄を開始し、 素通り画分の吸 光度 28 0 nmのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの素通り画分を得、 適当 な緩衝液で中和し、 血清由来物及び抗体由来物を実質的に含有しない程度まで精 製された可溶性 TMを高純度精製品として取得することができる。 後記する通り 、 このカラムを使用すると血清由来物や抗体由来物を効率および再現性よく除去 できることが確認される。 勿論、 これらは、 適宜限外濾過により濃縮することが できる。 さらに、 ゲル濾過による緩衝液交換を行なうことも好ましい。 例えば、 5 0m M Na C 1を含む 2 OmMリ ン酸塩緩衝液 （pH 7. 3) で平衡化せしめた S e p a h c r y l S— 3 0 0カラムもしくは S— 20 0カラムに、 限外濾過に より濃縮した高純度精製品をチャージし、 5 0mM Na C lを含む20mMリ ン酸塩緩衝液 （pH 7. 3) で展開分画し、 トロンビンによるプロテイン Cの活 性化の促進活性の確認を行ない活性画分を回収し緩衝液交換した高純度精製品を 取得することができる。
多くの精製工程においては、 塩類を含有する溶出液等を用いることから、 最終 的に本発明に合致する P Hや緩衝液成分や界面活性剤を含む溶液を用いることが できれば、 特に、 最終的に添加や調製を必要とせず、 本発明の水溶液注射用製剤 となるが、 通常は、 可溶性トロンボモジュリンに本発明に必要な成分等を追加す る方法が簡便であり好ましい。
また本発明における緩衝液成分は、 pHを pH5以上、 7. 0以下に調整でき 、 同 p Hの間において緩衝能を有するものであれば特に限定されない。 さらに好 ましくは、 pH5. 5〜6. 5が例示される。 例えば、 リン酸や、 カルボン酸及 び/又はその水溶性塩からなる群から選ばれた一種以上の有効量が用いられる。 カルボン酸及び Z又はその水溶性塩としては、 例えば酢酸、 プロピオン酸、 酪酸 、 吉草酸、 マロン酸、 コハク酸、 グルタル酸、 酒石酸、 フマル酸、 リンゴ酸及び Z又はその水溶性塩からなる群から選ばれた一種以上が挙げられ、 特に好ましく はリ ン酸、 酢酸及び/又はそれらの水溶性塩などが挙げられる。 水溶性塩として は製剤学的に許容されるものであれば特に制限はなく、 例えば、 ナトリウム塩、 力リウム塩などが挙げられる。
本発明における容器としては、 無菌充塡することに適した材料、 形状であれば 特に限定されないが、 例えば、 ガラス製シリンジ （さらに、 ゴム製キャップおよ びゴム製ストッパーにより無菌充塡） や、 ガラス製バイアル （および栓） 、 ガラ ス製アンプルが挙げられ、 その他にそれぞれのプラスチック製品を用いることも できる。 本発明において、 シリンジ容器に封入せしめたプレフィルドシリンジ製 剤として提供されることは最も好ましい態様である。 プレフィルドシリンジ製剤 は、 予め水溶液注射剤がシリ ンジ容器に充塡された状態で、 貯蔵 ·流通される製 剤であり、 容器に注射針が予め付いていても付いていなくともよく、 注射針が付 いていない場合には、 使用時には必要に応じて、 注射針を付けて使用されること が通常である。 また、 注射針を使わずに、 プレフィルドシリ ンジ内の水溶液注射 剤自体の圧力を高め、 皮膚を透過せしめる方法も挙げられる。 この場合に、 プレ フィルドシリンジ前方の水溶液注射剤の射出口は、 比較的狭くすることが好まし く、 また圧力を高める手法としては、 例えば、 ガス （窒素ガス、 ヘリウムガス、 炭酸ガス等） やパネ等による圧力を利用する方法が挙げられる。
上記の pHにおいて緩衝能を有する緩衝液成分は、 その種類の他、 その濃度や 無菌充塡する容器の種類とも関係するが、 例えば、 使用を予定している容器に、 検討する緩衝液を充塡予定量 （例えば lm l、 或いは 0. 5m l等） を充填して 、 後記の測定法 1に記載の 50°C96時間の加熱処理を行った後の pHの変動が ± 0. 3以内に抑制できる緩衝液成分の種類又はその濃度を選択することが好ま しい。 前述の代表的な緩衝液成分において、 使用される濃度としては、 通常 0. ImM以上、 好ましくは 1 mM以上が例示され、 上限としては、 通常は、 1 00 0 mM以下、 好ましくは 200 mM以下、 特に好ましくは 25 mM以下又は 20 mM以下が例示される。 ガラス製品が予めサルファ一処理されていることも好ま しい。 また、 ガラス製シリンジの内壁はシリコンコートされていてもよい。 本願発明の水溶液注射用製剤のための緩衝液の作製方法の例としては、 リン酸 塩緩衝液の場合には、 リン酸二水素ナトリウム （NaH2 P04 、 又はその 2水 塩） の所定の濃度の水溶液とリン酸水素ニナトリウム （Na2 HPO4 、 又はそ の 1 2水塩） の所定の濃度の水溶液とを、 所定量ずつ混合して目的とする pHに 調整する。 またはリン酸ニ水素ナトリゥム （NaH2 P04 、 又はその 2水塩） の所定の濃度の水溶液に、 水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、 目的とする pH に調整してもよい。 また pHの微調整のために、 薄めた塩酸又はリン酸を滴下し てもよい。 酢酸塩緩衝液で代表されるカルボン酸塩緩衝液の場合には、 酢酸の所 定の濃度の水溶液と酢酸ナトリゥムの所定の濃度の水溶液とを、 所定量ずつ混合 して目的とする pHに調整する。 または酢酸の所定の濃度の水溶液に、 水酸化ナ トリウム水溶液を滴下して、 目的とする pHに調整してもよい。 また pHの微調 整のために、 薄めた酢酸を滴下してもよい。 ― 本発明の水溶液注射用製剤の pHは、 通常 pH 5. 0以上、 7. 0以下であり 、 好ましくは PH 5. 5〜6. 5である。 特に好ましくは約 pH 6. 0が挙げら れる。 また、 pH5. 5〜6. 0が好ましい例として挙げられる。
リン酸塩緩衝液においては、 その濃度を 0. 2〜2 0 OmMの広い濃度範囲で 振ったところ、 pH 7. 3ではリ ン酸塩緩衝液濃度による影響が大きく、 リン酸 塩緩衝液濃度が濃くなるほど力価の低下が見られ、 例えば 20 OmMでは大きく 残存力価を減少させる。 しかし、 リン酸塩緩衝液を用いる場合であっても、 pH を 5〜7. 0の範囲にて厳密に管理すれば、 熱安定性 （長期安定性） において好 ましい品質が得られる。 pH5. 5〜6. 5、 特には約 pH 6. 0に設定すれば 好ましく、 余り pH7. 0に近い設定をした場合には、 若干の変動でも熱安定性 において影響があるので、 避けることが好ましい。
酢酸塩緩衝液においては、 その濃度を 0. 2〜20 OmMの広い濃度範囲で振 つても、 緩衝液濃度による影響はなく、 またリン酸塩と酢酸塩を組み合わせた緩 衝液においては、 pH 5. 0〜7. 0の範囲において熱安定性において好ましい 品質となる。
また酢酸以外のカルボン酸塩緩衝液においても、 酢酸塩緩衝液と同じ濃度、 P H範囲で酢酸塩緩衝液と同等の熱安定性を示す。 またリン酸塩緩衝液に更に酢酸 塩緩衝液成分やカルボン酸塩緩衝液成分を添加しても、 同等の熱安定性を示す。 また本発明における界面活性剤としては、 例えば非イオン性界面活性剤が好ま しく、 例えばポリソルベート類 [ポリソルベート 8 0 (商品名 ： Tw e e n 8 0 ) 、 ポリソルべ一ト 20 (商品名 ： Tw e e n 20 ) など] 、 ポリォキシェチレ ン硬化ヒマシ油類 [ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 6 0 (商品名 ： HC〇— 6 0、 商品名 ： クレモフォール RH 60) 、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 5 0 (商品名 ： HCO— 5 0、 商品名 ： クレモフォール RH 5 0) など] 、 ポリオキ シエチレンヒマシ油類 [商品名 ： CO— 6 0 TX、 商品名 ： CO— 5 0 TX、 商 品名 ： クレモフォール ELなど] 、 エチレンォキサイ ドプロピレンォキサイ ド重 合体 [ポリォキシェチレン （ 1 6 0) ポリオキシプロピレン （ 3 0) グリコール (商品名 ： プル口ニック F 6 8 ) など] 、 セスキォレイン酸ソルビタンが挙げら れる。 これらの界面活性剤は、 複数を混合して用いてもよく、 上記の群から選ば れた一種以上を用いることができる。
振盪安定性において、 ポリソルべ一ト 8 0 (商品名 ： Twe e n 8 0) は少な く とも 0. 0 1 %で、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 6 0 (商品名 ： HCO— 6 0 ) 及びポリォキシェチレン （ 1 6 0) ポリオキシプロピレン （ 3 0) グリコ ール （商品名 ： プル口ニック F 6 8) は少なく とも 0. 1 %で白濁防止効果を示 す。 ポリソルべ一ト 8 0 (商品名 ： Twe e n 8 0) は 0. 0 1 %添加でも白濁 防止効果を示し、 特に好ましい例として挙げられる。
本発明で用いる界面活性剤の濃度は、 通常 0. 0 0 1 %以上、 好ましくは 0. 0 1 %以上が例示され、 上限としては、 通常 1 %以下、 好ましくは 0. 1 %以下 が例示される。
上記添加物の他に本発明においては、 第 3成分として、 等張化剤 （例えば、 塩 化ナトリウムなど） 、 防腐剤 （例えばパラォキシ安息香酸エステル類など） 等を 添加してもよい。
前述の通り、 添加方法は特に限定されないが、 例えば、 添加物を直接トロンボ モジュリン含有溶液に添加する方法、 またはあらかじめ添加物を水、 注射用蒸留 水あるいは適当な緩衝液に溶解して添加する方法などが挙げられる。
また、 例えば製剤化工程においては、 シリンジや、 アンプルまたはバイアルに 、 水、 注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液 1 m 1当たり トロンボ乇ジュリンを 0 . 0 5m g以上、 好ましくは 0. 1 mg以上、 特に好ましくは 1 mg以上添加す ることが好ましい例として挙げられる。 トロンボモジユリンの添加量の上限とし ては特に限定されないが、 例えば、 1 5mg以下、 好適には 1 Omg以下、 特に 好ましくは 6mg以下が例示される。 これら濃度のトロンボモジュリン及び上記 添加物を含有する溶液を、 例えば 0. 3〜 1 0m 1無菌状態において充塡し、 常 法により水溶液注射用製剤として調製できる。 先ず容器を滅菌するためには、 常 法、 例えば、 乾熱滅菌、 ォ一トクレーブ、 7線滅菌を考慮して採用すればよく、 乾熱滅菌としては、 例えば 2 5 0 °C以上で 3 0分間以上、 ォ一トクレーブとして は、 例えば 1 2 1 °C 2 0分間以上、 7線滅菌としては、 例えば 2 0〜6 0 k G y (キログレー） の照射量の 7線を照射する方法が挙げられる。 滅菌に際しては、 ガラス製のアンプルやバイアルは、 乾熱滅菌を採用することが普通であり、 また バイアルのゴム栓については、 オートクレープを採用することが普通である。 シ リンジについてはォ一トクレーブを使用することもできる力^ 通常は、 7線滅菌 を採用することが普通である。 また、 容器に充塡するトロンボモジュリン水溶液 は、 通常、 0 . 2 2又は0 . 2 ミクロンの濾過滅菌用のフィルターで濾過するこ とが好ましい。 滅菌した容器に滅菌濾過したト口ンボ乇ジュリン水溶液を無菌条 件下で充塡して、 本発明の注射剤が調製される。 この注射剤は、 フィルムや箱に 包装されていることも好ましい。
本願発明の水溶液注射用製剤としては、 前述の通り、 好ましくはプレフィルド シリンジが例示され、 バイアルあるいはアンプルであってもよく、 特にアンプル を用いる場合には、 市販されているサルファ処理アンプルを用いることが好まし い。 サルファ処理アンプルとは、 S〇2 ガスを接触させるか、 または好ましくは 硫酸アンモニゥム水溶液を吹きつけた後、 加熱処理して作成される。 通常、 1〜 1 0 %の硫酸アンモニゥ厶水溶液を吹きつけた後、 6 3 0〜7 0 0 °Cで加熱処理 する方法が例示される。 通常、 これらは使用する前に、 アンプル洗浄機等により 、 水を付加した状態で超音波処理後水洗浄し、 ついで、 乾燥滅菌のために 3 0 0 〜3 5 0 °C程度で数分間加熱せしめることにより使用されるものである。
また、 本発明の第二の態様である、 有効量の可溶性トロンボモジュリンと、 p H 5以上、 7 . 0以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有し、 p H が p H 5以上 7 . 0以下であるトロンボモジュリン水溶液が、 実質的な空隙部を 存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルド製剤であ ることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵 ·流通 せしめることからなる方法に関して説明すると、 以下の通りである。
可溶性トロンボモジュリンゃ緩衝液成分、 およびトロンボモジュリン水溶液注 射剤についての定義は、 前述と同様である。 本発明におけるシリンジ容器としては、 市販されている注射用シリンジを利用 することが好ましいが、 通常は、 内径 （直径） 約 8 . 6 m m、 約 6 . 3 m m、 約 4 . 6 m m等のプレフィルドシリンジ用のシリンジ容器が例示される。 トロンボ モジュリ ン水溶液の充塡量により選択されるが、 振盪安定性の点からは、 約 4 . 6 m mのシリンジ容器が最も好ましく、 約 6 . 3 m mのシリンジ容器も十分に好 ましい。 約 8 . 6 m mのシリ ンジ容器においては、 空隙部割合を 5 0 %以下とす る配慮が必要となり、 結局、 約 8 . 6 m m以下のシリンジ容器においては、 空隙 部割合を 5 0 %以下とすれば振盪安定性が確保される。
容器の形状や内径によっては、 該トロンボモジュリン水溶液注射剤は、 その表 面張力により、 実質的に振盪されないことがある。 本発明で振盪可能部位とは、 2 5でで振幅5 (：111、 1 8 0往復/分の振盪条件において、 振盪により該トロン ボモジュリン水溶液注射剤が移動し、 実質的に振盪され得る実質的な容器の部位 を言い、 空隙部割合とは、 容器の振盪可能部位の容積から容器の振盪可能部位に 存在する ト πンボモジュリン水溶液の存在量を差引いた空隙容積を、 容器の振盪 可能部位の容積で除した百分率を意味する。 振盪可能部位のトロンボモジュリン 水溶液の存在量は、 例えば、 トロンボモジュリ ン水溶液を充塡した容器を、 上記 の振盪条件にて 2分間振盪後上下左右の種々の方向を鉛直線方向に保持したまま 5秒静置後に容器の下方に移動している溶液量を確認、 測定する実験を繰り返す ことにより、 振盪可能、 即ち移動可能な溶液の存在量が確認できる。 また同時に 振盪可能部位の確認ができ、 その容積を算出すればよい。 勿論、 容器の形状が単 純なシリンジにおいては、 振盪可能部位は、 シリンジおよびストッパー （及びキ ヤップ） により囲まれたスペース自体である。 特に、 約 4 . 6 m mのシリ ンジ容 器においては実質的な振盪がなされず、 特に空隙部割合を考慮する必要はない。 通常は、 キャップの付いたシリンジ容器に、 通常の手法により水溶液注射剤を 充塡した後、 ストッパーを打栓するが、 打栓方法としては、 真空打栓や、 ベント チューブ方式 （或いはスリーブ方式） を採用することができる。
上述の真空打栓等により打栓する際には、 比較的容易に、 空隙部割合を例えば 1 5 %以下とすることができる。 したがって、 本発明において、 実質的な空隙部 を存在せしめないとは、 典型的には空隙部割合が 1 5 %以下の場合が好ましい例 として理解される。 また、 空隙部割合が 1 0 %以下である場合も好ましく、 た 5 %以下である場合も好ましい。 皮下注射や筋肉注射に適したプレフィルドシリ ンジ用のシリンジ容器 （通常は数 m 1、 好ましくは 2 m 1以下、 さらに好ましく は l m l以下、 特に好ましくは 0 . 5 m 1以下） 、 例えば少なく とも約 8 . 6 m m以下の内径を有するシリンジ容器においては、 上述の空隙部割合とすれば、 振 盪安定性に優れたプレフィルドシリンジ製剤が容易に調製される。
また、 上記のシリンジ容器の他に、 界面活性剤の添加を考慮すると、 バイアル やアンプルを容器として用いることができる。 通常のバイアルやアンプルは、 内 径が比較的大きいものであり、 空隙部割合を低下させたり、 調整することが比較 的困難であるため、 空隙部割合を厳密に調節する必要がある場合には避ける方が 無難である。
かく して得られる水溶液注射剤は、 長期安定性として、 5でで少なく とも 1 2 ヶ月、 好ましくは 1 8ヶ月約 8 0 %以上の力価を保持できるものであって、 その 他の条件が整えば場合によっては、 2年間、 好ましくは 3年間まで貯蔵 '流通で きる場合も想定される。
また、 2 5でで振幅5 (：111、 1 8 0往復 分、 1 ヶ月間の振盪条件においても 白濁を生ずることがないものである。 これらの十分な安定性を有する本発明の水 溶液注射剤は、 液状において長期に貯蔵 ·流通することができる。
本発明の貯蔵 ·流通は、 トロンボモジュリン水溶液注射剤が凍結しない温度以 上、 室温以下であり、 具体的には、 0 °Cより高く、 2 0で以下であることが例示 され、 好ましくは 5 °C前後が例示される。 期間は、 温度等の条件によるが、 il常 1 2ヶ月、 好ましくは 1 8ヶ月、 更に好ましくは 2年間程度が例示される。 また、 本発明においては、 皮下投与又は筋肉注射に用いる用いる場合も提供さ れる。 すなわち、 本発明の第四の態様としては、 前述のプレフィルドシリンジ製 剤を皮下投与用又は筋肉注射用に用いるものである。
また、 本発明の第五の態様としては、 可溶性トロンボモジュリンを有効成分と する水溶液注射剤であって、 1回 / 2〜5日の間隔で皮下又は筋肉注射するため の持続性製剤を用いことを特徴とする可溶性トロンボモジュリンの血中濃度を持 続させる方法である。 ― また、 本発明の第六の態様としては、 可溶性トロンボモジュリンを有効成分と する水溶液注射剤であって、 1回 Z 2〜5日の間隔で皮下又は筋肉注射するため の持続性製剤である。
トロンボモジュリンはもともと血管内皮細胞表面に存在するものであり、 また その作用部位は血管内であることから、 トロンボモジュリンを投与する場合には 、 静脈注射で行なうことが直接的であり、 従来より最も好ましいと信じられてい た。 例えば、 特開昭 6 4 - 6 2 1 9号公報には点滴静注の例が記載されている。 しかしながら、 患者の容体や利便に合わせた選択肢となり得る他の便利な従来 にない製剤等の開発は必要である。
これまでの報告や発表では、 トロンボモジュリンが静脈投与以外の投与により 積極的に使用されることは必ずしも明確ではなかったが、 本発明者らが確認した ところ、 配列番号 1の 1 9 一 5 1 6位のァミノ酸配列からなる可溶性トロンボモ ジュリン （配列番号 1のアミノ酸配列をコ一ドする D N Aを宿主細胞にトランス フエタ トして得られる可溶性トロンボモジュリン） を皮下投与すると、 可溶性ト ロンボモジュリンの血中濃度が確認されるばかりでなく、 特に配列番号 1の 3 6 7 - 4 8 0位のァミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリンに比べても、 血 中のこのトロンボモジユリン濃度が著しく持続することがはじめて確認された。 したがって、 本発明によれば、 好ましい持続性製剤が提供される。
この持続性製剤には、 さらに、 局部麻酔剤を含有せしめることも好ましい。 ま たは防腐剤を含有せしめることも好ましい。
この局部麻酔剤として、 塩酸プロ力インまたはべンジルアルコールが好ましい 例として挙げられる。 局部麻酔剤の添加量は、 通常、 注射液量の 0 . 5〜 1 0 % 、 好ましくは 1〜5 %が例示される。
さらに必要に応じて、 特開平 6 - 3 2 1 8 0 5号公報、 特開昭 6 4 - 6 2 1 9 号公報等に開示される通り、 アミノ酸、 塩類、 糖質、 界面活性剤、 アルブミン、 ゼラチン等を添加しても良いし、 また、 防腐剤を添加することも好ましく、 例え ば、 パラォキシ安息香酸エステル類が好ましい例として挙げられ、 パラォキシ安 息香酸ェチルゃパラォキシ安息香酸メチル、 又はパラォキシ安息香酸エステ 類 の混合物が特に好ましい例として挙げられる。 防腐剤の添加量は、 通常 0 1 〜1. 0 %が例示され、 好ましくは 0. 1〜0. 3%が挙げられる。
本発明の持続性製剤に用いる可溶性トロンポモジュリンとしては、 可溶性トロ ンボモジュリンであれば全て使用可能であって、 特に限定されないが、 例えば、 配列番号 1の 1 9— 5 1 6のァミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、 配列番号 2の 1 9— 5 1 6のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、 配列番号 1に記載のァミノ酸配列をコ一ドする DNAを宿主細胞にトランスフエ ク トして得られる可溶性トロンボモジュリン、 又は、 配列番号 2に記載のァミノ 酸配列をコードする DNAを宿主細胞にトランスフエク トして得られる可溶性ト 口ンボモジュリンのいずれかの可溶性トロンボモジュリンが好ましい例として挙 げられる。
本発明の持続性としては、 例えば血中濃度半減期 （T 1Z2) が 1 6時間以上 であることや、 平均血漿滞留時間 （MRT) が 36時間以上であることが好まし い例として挙げられる。
本発明の持続性製剤としては、 注射液の形態で提供されることが好ましい。 本 発明の持続性製剤としては、 凍結乾燥製剤を使用時に溶解して使用する形態で提 供されることも考慮される力 前述のトロンボモジュリン水溶液注射剤が無菌充 塡されたプレフィルドシリンジ製剤をそのまま皮下用、 又は筋肉内注射剤として 用いることが、 極めて都合がよい。
本発明の持続性製剤を調製するに際して、 これら添加物の添加方法は特に限定 されない。 添加物を直接トロンボモジュリン含有溶液に添加したり、 またはあら かじめ添加物を水、 注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液に溶解して互いに添加混 合する方法にて溶液を調製する。 例えば、 シリンジ、 またはバイアル、 場合によ つてはアンプルに、 水、 注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液 1 m 1当たり 0. 0 5〜1 5mg、 好適には 0. 1〜6mgのトロンボモジユリン及ぴ上記添加物を 含有する溶液を、 例えば 0. 5〜1 0m l充塡し、 そのままに水溶液注射用製剤 として調製するか、 バイアルやアンプルにおいては凍結乾燥することもできる。 通常この持続性製剤には、 可溶性トロンボモジュリンを 0. 0 1〜 1 0 0 m g含 有させることが挙げられる。
本発明のトロンボ乇ジュリン水溶液注射剤あるいは持続性製剤の投与回数は、 通常の如く、 1 日 1〜3回投与としてもよいが、 例えば 1回 Z2〜5日投与とし て投与することもできる。 特に皮下注射や筋肉注射の場合には、 持続性であるた めに、 例えば 1回 Z2〜 5日投与として投与することが特に好ましい。 血管注射 の場合の 1回の投与量としては、 点滴静注で最大量を投与する例も挙げられるが 、 血管内へのワンショッ ト投与における 1回の投与量としては、 通常は、 可溶性 トロンボモジュリンとして lmgZkg (体重） 以下が例示される。 最低量とし ては、 通常、 0. 0 0 1 mgZk g (体重） 以上、 好ましくは 0. 0 0 5mg/ k g (体重） 以上が例示される。 皮下注射や筋肉注射の場合の 1回の投与量は、 皮下注射や筋肉注射ができる液量に溶解し得る量が上限となる。 皮下注射や筋肉 注射に適した液量としては、 通常は数 ml、 好ましくは 2m l以下、 さらに好ま しくは lml以下、 特に好ましくは 0. 5m l以下が例示される。 したがって、 皮下注射や筋肉注射の場合の 1回の投与量としては、 可溶性トロンボモジュリン として 2 Omg以下が通常であり、 最低量は上記と同様に 0. 0 0 lmg/kg (体重） 以上、 好ましくは 0. 0 0 5 mgZk g (体重） 以上が例示される。 本発明の持続性製剤は、 皮下に投与しても、 筋肉内に投与しても、 同様に持続 性が発揮されるが、 特に皮下投与が好ましい。
本発明によれば、 著しく血中濃度持続時間を延長させることが可能であり、 投 与回数を減少させることができるとともに、 静脈注射剤に比べて少量で有効な可 溶性トロンボモジュリン製剤を提供することが可能となる。 患者の注射時の痛み を軽減させ、 場合によれば、 自己注射も可能となるものであり、 患者の通院等の 利便が著しく貢献するものである。
さて、 本発明の可溶性トロンボモジュリン水溶液注射剤の急性毒性を調べたと ころ、 各群 5匹の雌雄 SDラッ トを用いて、 トロンボモジュリン量として 1 8 0 mgZkgの用量で静脈内投与しても死亡例は 1例も見られなかった。 また 1 8 Omg/k gの用量で皮下注射を行なった際も死亡例は 1例も見られなかった。 図面の簡単な説明
第 1図はラッ トへ可溶性トロンボモジュリンを投与した場合の血漿中可溶性ト ロンボモジュリン濃度の経時変化を示すものである。 なお、 I Vは静脈注射を示 し、 SCは皮下注射を示すものである。 配列表フリ一テキスト
配列番号 1の他の情報は、 ヒト トロンボモジュリンの部分的なァミノ酸配列で める
配列番号 2の他の情報は、 ヒト トロンボモジュリンの部分的なァミノ酸配列で める。
配列番号 3の他の情報は、 ヒト トロンボモジュリン遺伝子の部分的な塩基配列 である。
配列番号 4の他の情報は、 ヒト トロンボモジュリン遺伝子の部分的な塩基配列 でめる。
配列番号 5の他の情報は、 変異用の合成 DN Aである。 実施例
以下、 実施例及び比較例により本発明を具体的に説明するが、 本発明は何らこ れらによって限定されるものではない。
参考例 1
実施例に用いる可溶性トロンボモジュリンは、 前記山本らの方法 （特開昭 6 4 - 6 2 1 9号公報の実施例 1 0に記載の方法） に従って行った。 すなわち配列番 号 3の DNAを、 チャイニーズハムスター卵巣 （CHO) 細胞に組み込んで、 形 質転換細胞とし、 この細胞の培養により可溶性トロンボモジュリンの生産を行つ た。 参考例 2
強陰ィォン交換樹脂力ラムによる粗精製 ― 参考例 1で取得した— 20°C凍結培養上清 1 1 Lを溶解し、 0. 2 mのメン プレンフィルタ一 （ミ リポア社、 ミ リノ、。ック 20) で濾過した。
濾過した培養上清については、 1 5 OmM Na C 1を含む 2 OmMトリス塩 酸緩衝液 （pH 7. 4 ) で平衡化した Q— S e p h a r 0 s e (フアルマシア社 ) カラム （直径 9 Omm、 高さ 6. 5 c m) に供した。 次に 1 8 0 mM Na C 1を含む 2 OmM酢酸塩緩衝液で洗浄し、 更に 1 8 0mM Na C 1を含む 2 0 mMトリス塩酸緩衝液 （pH 7. 4) で洗浄を行ない、 3 0 OmM Na C lを 含む 2 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH 7. 4) で溶出を開始し、 溶出液の吸光度 28 0 nmのピーク立ち上がりからの 0. 5カラムボリユー厶容量の溶出液を粗 精製品として取得した。 参考例 3
ァフィ二ティ一カラム （トロンビンカラム） による主精製 参考例 2で得られた溶出画分 4 0 Om 1を 1 0 OmM Na C l及び 0. 5 m M塩化カルシウムを含む 2 OmMトリス緩衝液 （pH 7. 4) に対して透析した 。 透析後、 1 0 OmM Na C l及び 0. 5 mM塩化カルシウムを含む 20 mM トリス緩衝液 （pH 7. 4) で平衡化した D I P-トロンビンーァガロース （P AESE LORE I社、 0 6— 1 4 8— 1 0 35、 直径 5 0 mm、 高さ 6 c m ) に供した。 20 OmM Na C l及び 0. 5 mM塩化カルシウムを含む 2 0 m Mトリス緩衝液 （pH 7. 4) で洗浄後、 1. OM Na C l及び 0. 5mM塩 化カルシウムを含む 2 OmMトリス緩衝液 （pH 7. 4) で溶出を開始し、 溶出 液の吸光度 2 8 0 nmのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を主精製 品として取得した。 参考例 4
ァフィ二ティ一カラム （抗体 B) による主精製 ァフィ二ティ一カラムは以下のように作製した。 即ち、 抗トロンボモジュリン モノクローナル抗体 Bは、 その抗体を産生するハイプリ ドーマを培養することに より得た培養上清、 あるいは、 ハイプリ ドーマを組織適合性動物、 ヌードマウス 等の腹腔内にて増殖させて得た腹水より、 塩析、 イオン交換クロマトグラフィー 、 プロテイン Aカラム等の分離精製操作により精製した。 次に、 フアルマシア社 のマニュアル （Af f i n i t y Ch r oma t ogr aphy p r i n c i p 1 e s & m e t h o d s ) に従い、 精製抗トロンボモジュリ ンモノ クロ —ナル抗体 Bを 0. 5M NaC l含有 0. 1M N a H C 03 緩衝液 （ p H 8 . 3 ) に溶解し、 CNB r— a c t i V a t e d S e pha r o s e 4 B ( フアルマシア社、 52— 1 1 53— 00— A I) と接触反応させ、 セファロース 4 Bに抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体 Bをカツプリングし、 抗トロン ボモジュリンモノクローナル （抗体 B) 結合 S epha r o s e 4 Bを作製し た。 次いでこの抗トロンボモジュリンモノクロ一ナル （抗体 B) 結合 S e p h a r o s e 4 Bをカラムに充填しモノクロ一ナル （抗体 B) カラムを作製した。 参考例 2で得られた溶出画分 400 m 1を、 1. OM N a C 1を含む 20 m IV [リン酸塩緩衝液 （pH 7. 3) で平衡化したモノクローナル抗体 （抗体 B) 力 ラム （直径 50 mm、 高さ 6 cm) に供した。 1. 0M N a C 1を含む 20 m Mリン酸塩緩衝液 （PH7. 3) を流し、 更に 1 0 OmM酢酸塩緩衝液 （pH5 . 0) を流し洗浄し、 0. 3M Na C 1を含む 1 0 OmMグリシン塩酸緩衝液
(pH 3. 0) で溶出を開始し、 溶出液の吸光度 280 nmのピーク立ち上がり から立ち下がりまでの溶出液を主精製品として取得した。 参考例 5
強陽ィォン交換樹脂力ラムによる高純度精製
1. トロンビンカラム溶出液の精製 （SP非吸着画分）
参考例 3で得られた溶出液 200 m 1に 1 0 OmMグリシン塩酸緩衝液 （pH 3. 5) を加え希釈した液を、 次に 1. 0Mグリシン塩酸緩衝液 （pH2. 0) で pH3. 5に調製した。 この希釈 pH調製した溶出液を 30 OmM Na C 1 を含む 1 0 0 mMグリシン塩酸緩衝液 （比伝導度 3 1 msZcm、 pH 3. 5) で平衡化した S P— S e p h a r o s e (フアルマシア社） カラム （直径 2 6 m m、 高さ 3 cm) に供した。 3 0 OmM N a C 1を含む 1 0 0 mMグリシン塩 酸緩衝液 （同上） で洗浄を開始し、 洗浄液の吸光度 2 8 O nmのピーク立ち上が りから立ち下がりまでの洗浄液を得、 直ちに 5 0 OmMリン酸塩緩衝液 （pH 7 . 3) で pH7に中和し、 中和した洗浄液を高純度精製品として取得した。
2. モノ クローナル抗体カラム溶出液の精製 （S P非吸着画分）
参考例 4で得られた溶出液 1 8 0m lを 1. 0Μグリシン塩酸緩衝液 （ρΗ2 . 0) にて ρΗ 3. 5に調製した液を、 3 0 OmM Na C lを含む1 0 0mM グリ シン塩酸緩衝液 （同上） で平衡化した SP— S e p h a r o s e (フアルマ シァ社） カラム （直径 26mm、 高さ 3 cm) に供した。 3 0 0 mM N a C 1 を含む 1 0 OmMグリ シン塩酸緩衝液 （同上） で洗浄を開始し、 洗浄液の吸光度 28 0 nmのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの洗浄液を得、 直ちに 5 0 0 mMリン酸塩緩衝液 （pH7. 3) で pH7に中和し、 中和した洗浄液を高純度 精製品として取得した。
3. トロンビンカラム溶出液の精製 （SP吸着画分）
参考例 3で得られた溶出液 2 0 0 m 1に 1 0 OmMグリシン塩酸緩衝液 （pH 3. 5) を加え希釈した液を、 次に 1. 0Mグリシン塩酸緩衝液 （pH 2. 0) で pH 3. 5に調製した。 この希釈、 pH調製した液を、 1 0 OmM Na C 1 を含む 1 0 OmMグリシン塩酸緩衝液 （pH 3. 5) で平衡化した SP— S e p h a r o s e (フアルマシア社） カラム （直径 2 6 mm, 高さ 3 cm) に供した 。 1 0 OmM Na C 1を含む 1 0 OmMグリシン塩酸緩衝液 （pH 3. 5) で 洗浄し、 3 0 OmM Na C 1を含む 1 0 OmMグリシン塩酸緩衝液 （pH 3. 5) で溶出し、 溶出液の吸光度 28 0 nmのピーク立ち上がりから立ち下がりま での溶出液を得、 直ちに 5 0 OmMリン酸塩緩衝液 （pH7. 3) で pH 7に中 和し、 中和した溶出液を高純度精製品として取得した。
4. 抗体カラム溶出液の精製 （S P吸着画分）
参考例 4で得られた溶出液 1 8 0 m 1に 1 0 0 mMグリシン塩酸緩衝液 （ P H 3. 5) を加え希釈した液を、 次にし 0Mグリシン塩酸緩衝液 （pH2. 0) で pH 3. 5に調製した。 この希釈、 pH調製した液を、 l O OmM N a C"l を含む 1 0 OmMグリシン塩酸緩衝液 （pH 3. 5) で平衡化した SP— S e p h a r 0 s e (フアルマシア社） カラム （直径 2 6mm、 高さ 3 cm) に供した 。 1 0 OmM N a C 1を含む 1 0 0 mMグリシン塩酸緩衝液 （p H 3. 5) で 洗浄し、 3 0 OmM Na C 1を含む 1 0 OmMグリシン塩酸緩衝液 （pH 3. 5 ) で溶出し、 溶出液の吸光度 28 0 nmのピーク立ち上がりから立ち下がりま での溶出液を得、 直ちに 5 0 OmMリン酸塩緩衝液 （pH 7. 3) で pH 7に中 和し、 中和した溶出液を高純度精製品として取得した。 参考例 6
ポリスルフォン中空糸による高純度精製品の濃縮 参考例 5で得られた高純度精製品をそれぞれ、 5 OmM Na C 1を含む 20 mMリン酸塩緩衝液 （pH 7. 3) で湿潤化した 1 mのポリスルフォン中空糸 （ 旭化成工業社製） を用い濃縮し、 それぞれ 5m 1の濃縮液を取得した。 参考例
ゲル濾過カラムによる高純度精製品の緩衝液交換 参考例 6で得られたそれぞれの濃縮液 5m 1を、 5 OmM N a C 1を含む 2 OmMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH7. 3) で平衡化したそれぞれの S e p h a c r 1 S— 3 0 0カラム （フアルマシア社、 直径 1 6mm、 高さ 9 0 cm ) に供した。 5 OmM Na C 1を含む 2 OmMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH 7. 3) で展開し分画した。 各画分は測定法 1のトロンビンによるプロテイン C 活性化を促進する活性の測定法方により活性の確認を行ない活性画分を回収し緩 衝液交換した高純度精製品を取得した。
以下の実施例及び比較例では、 参考例 2、 4、 5の 2、 6、 7の順により精製 したトロンボモジュリン高純度精製品を用いた。 また、 緩衝液成分の濃度を調整 する場合ゃリン酸ナトリゥム緩衝液以外の緩衝液成分を用いる場合には、 上記で 得られた高純度精製品を各緩衝液に対して透析して緩衝液成分を交換した。 さら に、 適当な濃度の緩衝液を添加することでトロンボモジュリン濃度を調整した。 p Hの調整は薄めた塩酸あるいは水酸化ナトリウム水溶液を適量添加することで 行った。
取得されたトロンボモジュリンは、 注射用蒸留水に少なく とも 6mgZm 1の 濃度で可溶であることが確認された。 また、 以下の分子量の測定により、 6. 6 万土 1万 （非還元状態） であることが確認された。
分子量の測定
電気泳動用グラジェントゲル （SDSポリアクリルアミ ド濃度勾配ゲル、 商品 名 ：パジエル 5/2 0 %、 アト一社製、 ゲルサイズ 9 0 x 7 3 x 1. 0 mm ) にて、 非還元状態において、 2 5°C、 2 0 m Aの定電流で約 9 0分間泳動を行 い、 分子量標準物質 〔フアルマシア社製、 低分子電気泳動用キッ ト ： 1バイアル 中に、 フォスフオリラ一ゼ b (分子量 9 4， 0 0 0 ) 、 ゥシ血清アルブミン （分 子量 6 7， 0 0 0 ) 、 卵白アルブミン （分子量 4 3， 0 0 0 ) 、 カルボ二ルアン ヒドラーゼ （分子量 3 0， 0 0 0 ) 、 トリプシンインヒビ夕一 （分子量 2 0, 1 0 0) 、 ひーラク トアルブミ ン （分子量 1 4， 4 0 0 ) 及びショ糖を含む〕 との 比較により、 トロンボモジュリ ンの分子量を測定した。 染色はクマシーブリ リア ントブル一染色による。 参考例 8
配列番号 1の 3 6 7— 4 8 0位の了ミノ酸からなる可溶性トロンボモジュリ ン を以下のように取得した。 すなわち特開平 5— 2 1 3 9 9 8号公報の実施例 1 一 ( 1 ) 一 (b) に記載の方法で取得したプラスミ ドを、 実施例 1 — (2) に記載 の方法に従って細胞へトランスフ クシヨンし、 実施例 3— (3) に記載の方法 に従って精製し、 更に緩衝液交換して高純度精製品を取得した。
取得されたトロンボモジュリンは、 注射用蒸留水に少なく とも 6mg/m 1の 濃度で可溶であることが確認された。 また、 上記の分子量の測定により、 2. 5 万 ± 0. 5万 （非還元状態） であることが確認された。 緩衝液成分の濃度を調整する場合ゃリン酸ナトリウム緩衝液以外の緩衝液成分 を用いる場合には、 上記で得られた高純度精製品を各緩衝液に対して透析して緩 衝液成分を交換した。 さらに、 適当な濃度の緩衝液を添加することでトロンボモ ジュリン濃度を調整した。 pHの調整は薄めた塩酸あるいは水酸化ナトリウ厶水 溶液を適量添加することで行った。 参考例 9
配列番号 2の 1 9— 5 1 6位のァミノ酸からなる可溶性トロンボモジュリンを 以下のように取得した。 すなわち、 メソッ ド イン ェンザィモロジ一 （Method in Enzymology) 、 第 1 0 0巻、 第 4 6 8頁 （ 1 9 8 3年） 、 アカデミックプレ ス （Academic Press) に記載の方法に従って、 配列番号 3の塩基配列を含む D N A断片を、 配列番号 5に示された塩基配列を有する変異用合成 DN Aを用いて部 位特異的変異を行い、 配列番号 2のアミノ酸配列をコードする DNAとなし、 以 下参考例 1〜7に準じて、 上記のトロンボモジュリンを取得した。
取得されたトロンボモジュリンは、 注射用蒸留水に少なく とも 6mg/m 1の 濃度で可溶であることが確認された。 また、 上記の分子量の測定により、 6. 6 万土 1万 （非還元状態） であることが確認された。
緩衝液成分の濃度を調整する場合ゃリン酸ナトリゥム緩衝液以外の緩衝液成分 を用いる場合には、 上記で得られた高純度精製品を各緩衝液に対して透析して緩 衝液成分を交換した。 さらに、 適当な濃度の緩衝液を添加することでトロンボモ ジュリン濃度を調整した。 pHの調整は薄めた塩酸あるいは水酸化ナトリゥム水 溶液を適量添加することで行った。 実施例 1
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 0. 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0mM、 ポリソルべ一ト 8 0 (商品名 ： Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2 m 1用アンプル （内径 1 2 mm) に 2 m 1分注 して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 この ときの振盪可能部位における空隙部割合は約 3 5 %であった。 ― 実施例 2
参考例 7のトロンボ乇ジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 0. 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリオキシェチ レン硬化ヒマシ油 6 0 (商品名 ： HCO— 6 0) を 0. 1 %となるように添加し た後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して 熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部 割合： 3 5 %) 実施例 3
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 酢酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルベート 8 0 (丁 6 61 8 0) を0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調整 した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジユリ ンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 4
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 酢酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2 OmMに調整し、 更に Na C 1を 1 5 OmM. ポリオキシエチレン硬 化ヒマシ油 6 0 (H CO— 6 0) を 0. 1 %となるように添加した後、 pHを 6 . 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロン ボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 5
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 酢酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 0 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0 ) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 実施例 6
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 酢酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2 0 mMに調整し、 さらに、 Na C 1を 1 5 OmM、 ボリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 5. 5に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 実施例 7
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 酢酸ナトリウ厶緩衝 液濃度を 2 0 mMに調整し、 さらに、 Na C 1を 1 5 0mM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 5. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 8
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 酢酸ナトリウ厶緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0mM、 ポリソルベート 8 0 ( Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調整し た。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 実施例 9
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 酢酸ナトリゥ厶緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0mM、 ポリソルべ一ト 8 0 ( Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 5. 5に調整し た。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリ を含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 実施例 1 0
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 酢酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mM、 ポリソルベート 8 0 ( Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 5. 0に調整し た。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 実施例 1 1
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 酢酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 0. 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0mM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 80 ) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 1 2
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 酢酸ナトリウム緩衝 液濃度を 0. 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0mM、 ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 5. 5に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 1 3
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 酢酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 0. 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mM, ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 5. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 1 4
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 0 0 mMに調整し、 さらに N a C 1を 1 5 0 mM、 ボリソルべ一ト 8 0 (Tw e e n 8 0 ) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に 調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジ ュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 1 5
参考例 7のト πンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥ厶緩 衝液濃度を 20 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 5. 0に 調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジ ュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 1 6
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM. ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 実施例 1 7
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 5. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 1 8
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥ厶緩 衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM. ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調整 した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジユリ ンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 1 9
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルべ一ト 80 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 5. 0に調整 した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジユリ ンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%)
実施例 20
参考例 7のトロンポモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 酢酸ナトリゥム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0 . 0 1 %となるように添加した後、 pHを 7. 0に調整した。 この薬液を 2m l 用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射 用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 実施例 2 1
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 酢酸ナトリゥム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM. ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0 . 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 5に調整した。 この薬液を 2m l 用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射 用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 22
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 酢酸ナトリゥム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに N a C 1を 1 5 OmM. ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0 ) を 0 . 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m l 用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射 用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 実施例 23
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 酢酸ナトリゥム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0 . 0 1 %となるように添加した後、 pHを 5. 5に調整した。 この薬液を 2m l 用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射 用製剤を調製した。 （空隙部割合： 35%) 実施例 24
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 酢酸ナトリゥム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0 . 0 1 %となるように添加した後、 pHを 5. 0に調整した。 この薬液を 2m l 用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射 用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 2 5
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 マロン酸ナトリゥム 緩衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に 調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジ ュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 2 6
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1 に、 コハク酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 2 7
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1 に、 グル夕ル酸ナトリゥム 緩衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に 調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジ ュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 2 8
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 酒石酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調整 した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジユリ ンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 2 9
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 フマル酸ナトリウ厶緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0 ) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボ乇ジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 3 0
参考例 7のト πンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リンゴ酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 3 1
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 プロピオン酸ナトリウ ム緩衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルべ一 ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0 に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモ ジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 3 2
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 クェン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 3 3
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 プロピオン酸ナトリゥム緩衝液濃度が 2 OmMとなるよ うに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液 を 2m 1用アンプルに 2 m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水 溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 3 4
参考例 7のト□ンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 グルタル酸ナトリウム緩衝液濃度が 2 OmMとなるよう に調整し、 さらに N a C 1を 1 5 0 mM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0 ) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2 m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶 液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 3 5
参考例 7のトロンボモジユリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 コハク酸ナトリゥム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように 調整し、 さらに N a C 1を 1 5 0 mM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2 m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液 注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 3 6
参考例 7のトロンボモジユリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 酒石酸ナトリウ厶緩衝液濃度が 2 OmMとなるように調 整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0 ) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 ρΗを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注 射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 35 %) 実施例 3 7
参考例 7のトロンポモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥ厶緩 衝液濃度を 2 OmMに、 フマル酸ナトリウム緩衝液が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0 . 0 1 となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m l 用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射 用製剤を調製した。 （空隙部割合： 35 %) 実施例 3 8
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 リンゴ酸ナトリウ厶緩衝液が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0 ) を 0 . 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m l 用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射 用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 実施例 3 9
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ボリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調整し た。 この薬液を 2m l用アンプルに 2m l分注して熔閉し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5%) 参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 m g Zm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリオキシエチレン 硬化ヒマシ油 6 0 (HCO— 6 0) を 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボ モジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合 ： 3 5 %) 実施例 4 1
参考例 7のトロンボモジユリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 mMに調整し、 更に Na C 1を 1 5 0mM、 ポリォキシエチレン硬 化ヒマシ油 6 0 (HCO— 6 0) を 0. 1 %となるように添加した後、 pHを 6 . 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロン ボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 4 2
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0mM、 ポリオキシエチレン ( 1 6 0) ポリオキシプロピレン （ 3 0) グリコール （商品名 ： プル口ニック F 6 8) を 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2 m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液 注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 4 3
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウ厶緩 衝液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0mM、 ポリオキシエチレン ( 1 6 0) ポリオキシプロピレン （3 0) グリコール （プル口ニック F 6 8) を 0. 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1 用アンプルに 2 m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射
4 0 用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 実施例 4 4
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらにポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2 m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注 射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 35 %) 実施例 4 5
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウ厶緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン -ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト 社製、 基本組成：プロモブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジュ リ ンを含有 する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 4 6
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリ ンジ （ベ ク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 4 7
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：プロモブチルゴ厶） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 1 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 4 8
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ッキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 25 %となるように真空度を調整してス トッパー （ウェス ト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打拴し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 4 9
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥ厶緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 8. 6mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ッキンソン社製、 1 m 1スタンダードタイプシリンジ、 針なし） に l m l分注し、 空隙部割合が 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成：プロモブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリ ンジ製剤を調製した。 実施例 5 0
参考例 7のトロンボモジュリ ン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 8. 6mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1スタンダードタイプシリンジ、 針なし） に l m l分注し、 空隙部割合が 1 0%となるように真空度を調整してストッパー （ ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジユリ ンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 5 1
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： プロモブチルゴム） を装着した内径 8. 6mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1スタンダードタイプシリンジ、 針なし） に l m l分注し、 空隙部割合が 1 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジユリ ンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 5 2
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウ厶緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 8. 6 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ッキンソン社製、 1 m 1スタンダードタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部割合が 25 %となるように真空度を調整してストツバ一 （ ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリ- ンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 5 3
参考例 7のト口ンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウ厶緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：プロモブチルゴ厶） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5 m l分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 54
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：プロモブチルゴ厶） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ッキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5 m l分注し、 空隙部割合が 1 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打拴し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 5 5
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ッキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5— m l分注し、 空隙部割合が 3 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成：プロモブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 5 6
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥ厶緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ッキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5 m l分注し、 空隙部割合が 4 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打拴し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 5 7
参考例 7のトロンボモジユリン濃度を 1 mgZm 1 に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 8. 6mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ッキンソン社製、 1 m 1スタンダードタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5m 1分注し、 空隙部割合が 4 0 %となるように真空度を調整してストツバ 一 （ウェスト社製、 基本組成： プロモブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジ ュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 5 8
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： プロモブチルゴ厶） を装着した内径 8. 6 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1スタンダードタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5m l分注し、 空隙部割合が 5 0 %となるように真空度を調整してストツバ 一 （ウェスト社製、 基本組成： ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジ ュ 'Jンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 5 9
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウ厶緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 4. 6mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ッキンソン社製、 0. 5m l シリンジ、 針付） に 0. 5m l分注し 、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製 、 基本組成： ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する 水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 6 0
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウ厶緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製/基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 4. 6mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ッキンソン社製、 0. 5m 1 シリンジ、 針付） に 0. 5m l分注し 、 空隙部割合が 1 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製 、 基本組成： ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する 水溶液注射用プレフィルドシリ ンジ製剤を調製した。 実施例 6 1
参考例 7のトロンボモジユリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 4. 6mmのガラス製シリ ンジ （ベ ク トン ，ディ ッキンソン社製、 0. 5m lシリンジ、 針付） に 0. 3m l分注し 、 空隙部割合が 1 5%となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製 、 基本組成：プロモブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する 水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 6 2
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：プロモブチルゴ厶） を装着した内径 4. 6 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン，ディ ッキンソン社製、 0. 5m 1シリンジ、 針付） に 0. 3m l分注し 、 空隙部割合が 3 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製 、 基本組成：プロ乇ブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する 水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 6 3
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 4. 6mmのガラス製シリ ンジ （ベ ク トン 'ディ ッキンソン社製、 0. 5m 1 シリンジ、 針付） に 0. 3m l分注し 、 空隙部割合が 5 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製 、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する 水溶液注射用プレフィルドシリ ンジ製剤を調製した。 実施例 64
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 5. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 1 0%となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本組成： プロモブチルゴ厶） を真空打拴し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 6 5
参考例 7のトロンボ乇ジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 5. 5に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 6 6
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥ厶緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 5に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本組成：プロモブチルゴ厶） を真空打拴し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 6 7
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 7. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリ ンジ製剤を調製した。 実施例 6 8
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した 後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリ ンジ （ べク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥェ スト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジユリジをー 含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 6 9
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 0 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加し た後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製 、 基本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ (べク トン 'ディ ッキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に Ί m l分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 70
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 m g /m 1に、 酢酸ナトリゥム緩衝液 濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本 組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （べク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分 注し、 空隙部割合が 1 0%となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト 社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有 する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 7 1
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 酢酸ナトリゥム緩衝液 濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：プロモブチルゴ厶） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 1 0%となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打拴し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 72
参考例 7のトロ リン濃度を 1 mg/m 1に、 酢酸ナトリゥム緩衝液 濃度を 2 0 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した 後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ べク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥェ スト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを 含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 73
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 0. l mgZm lに、 リン酸ナトリウム 緩衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加し た後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製 、 基本組成： プロモブチルゴ厶） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ (べク トン 'ディッキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m l分注し、 空隙部割合が 1 0%となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例 74
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 0. 3mg/m lに、 リン酸ナトリウム 緩衝液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加し た後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製 、 基本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ (べク トン .ディツキンソン社製、 1 m 1口ングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m l分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成： ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 75
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 3 m g Zm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 6 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1口ングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本組成：プロモブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 7 6
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 6mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 1 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した 後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ べク トン .ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥェ スト社製、 基本組成： ブロモブチルゴム） を真空打拴し、 トロンボモジュリンを 含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 77
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 3mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 6mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ッキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5 m l分注し、 空隙部割合が 1 5%となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 7 8
参考例 7のトロンボモジユリン濃度を 6 mg/m 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 1 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した 後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （ べク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5m l分注し、 空隙部割合が 1 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ ウェスト社製、 基本組成：ブ πモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジユリ ンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 7 9
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルベート 8 0 ( Twe e n S O) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調整し た。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成： プロモブチルゴ ム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （べク トン 'ディ ッキンソン 社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製、 基本組成：プロ モブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレ フィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 0
参考例 7のトロンポモジユリン濃度を 3 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 6 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mM, ポリソルベート 8 0 ( 丁^6 611 8 0) を0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整し た。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：プロモブチルゴ ム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリ ンジ （べク トン 'ディ ッキンソン 社製、 1 m l ロングタイプシリンジ、 針なし） に l m l分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製、 基本組成： プロ モブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレ フィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 1
参考例 7のトロンボ乇ジュリン濃度を 6mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 1 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルべ一ト 8 0 (丁 6 611 8 0) を0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整 した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチル ゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （べク トン 'ディ ツキンソ ン社製、 1 m 1ロングタイプ、 針なし） に 0. 5 m 1分注し、 空隙部割合が 1 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製、 基本組成：ブロモ ブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフ ィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 2
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 6mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 1 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリオキシエチレン ヒマシ油 （クレモフォール EL) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリ ンジ （べク トン · ディツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリ ンジ、 針なし） に 0. 5 m 1分注 し、 空隙部割合が 1 5 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社 製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有す る水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 3
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 酢酸ナトリゥム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加した後、 pHを 6. 0に調整 した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成： ブロモブチル ゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリ ンジ （べク トン 'ディ ツキンソ ン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に lm l分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製、 基本組成： ブ 口モブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プ レフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 4
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 プロピオン酸ナト リウム緩衝液濃度が 2 OmMとなるよ うに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：プロ 乇ブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （べク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙 部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製、 基本 組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液 注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 5
参考例 7のトロンボモジユリンの濃度を lmgZmlに、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 グルタル酸ナトリウム緩衝液濃度が 2 OmMとなるよう に調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加した後、 pHを 6. 0 に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：ブロモ ブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （べク トン 'デイ ツ キンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部 割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本 ¾ 成： ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注 射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 6
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 コハク酸ナトリウム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように 調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加した後、 pHを 6. 0に 調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：プロモブ チルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （べク トン 'ディ ツキ ンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部割 合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製、 基本組成 ：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射 用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 7
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 酒石酸ナトリウム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように調 整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加した後、 pHを 6. 0に調 整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：プロモブチ ルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （べク トン 'デイ ツキン ソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部割合 が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製、 基本組成： ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用 ブレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 8
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 フマル酸ナトリウ厶緩衝液が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加した後、 pHを 6. 0に調整 した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチル ゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （べク トン 'ディ ツキンソ ン社製、 1 m lロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m l分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ウェスト社製、 基本組成： ブ ロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プ レフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 8 9
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 リンゴ酸ナトリゥム緩衝液が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加した後、 pHを 6. 0に調整 した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチル ゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （べク トン 'ディ ツキンソ ン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に l m l分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストツバ一 （ウェスト社製、 基本組成： ブ ロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プ レフイノレドシリンジ製剤を調製した。 実施例 9 0
参考例 9のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM. ポリソルベート 8
0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 35 %) 実施例 9 1
参考例 9のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した 後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ べク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥェ スト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを 含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 実施例 9 2
参考例 8のトロンボモジュリン （配列番号 1の 3 6 7— 4 8 0位のアミノ酸か らなる） の濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝液濃度を 2 OmMに調 整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注 射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 35%) 比較例 1
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加し た後、 pHを 7. 3に調整した。 この薬液を 2m l用アンプルに 2m l分注して 熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部 割合： 3 5 %) 比較例 2
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 m g Zm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加し た後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して 熔閉し、 トロンボモジュ リ ンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部 割合： 3 5%) 比較例 3
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 0. 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加 した後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注し て熔閉し、 トロンボモジュリ ンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙 部割合： 3 5 %) 比較例 4
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 酢酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 20 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した 後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔 閉し、 トロンボモジュリ ンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割 合： 35%) 比較例 5
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度が 2 0 OmMとなるように調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM. ポリ ソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 pH を 7. 3に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 ト ロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 35
比較例 6
参考例 7のトロンボ乇ジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ボリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 7. 3に詾 整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュ リンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 比較例 7
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM, ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 7. 3に調整 した。 この薬液を 2 m 1用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジユリ ンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 比較例 8
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩 衝液濃度を 2 OmMに、 酢酸ナトリゥム緩衝液濃度が 2 OmMとなるように調整 し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0 ) を 0 . 0 1 %となるように添加した後、 pHを 7. 3に調整した。 この薬液を 2m l 用アンプルに 2m 1分注して熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射 用製剤を調製した。 （空隙部割合： 3 5 %) 比較例 9
参考例 7のトロンボモジュリンの濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥ厶緩 衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した 後、 pHを 7. 3に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して熔 閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 このときの 振盪可能部位における空隙部割合は 3 5 %であった。 比較例 1 0
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩 ® 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 7. 3に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内怪 6. 3 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m 1 分注し、 空隙部割合が 1 0%となるように真空度を調整してストッパー （ウェス ト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジユリンを含 有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 比較例 1 1
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリゥ厶緩衝 液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成： ブロモブチルゴム） を装着した内径 8. 6 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1スタンダードタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5m l分注し、 空隙部割合が 6 0%となるように真空度を調整してストツバ 一 （ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジ ュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 比較例 1 2
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリウム緩衝 液濃度を 2mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した後 、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基 本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 8. 6 mmのガラス製シリンジ （ベ ク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1スタンダ一ドタイプシリンジ、 針なし） に 0. 5m l分注し、 空隙部割合が 70%となるように真空度を調整してストツバ 一 （ウェスト社製、 基本組成：プロモブチルゴ厶） を真空打栓し、 トロンボモジ ュ 'Jンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 比較例 1 3
参考例 7のト πンボ乇ジュリン濃度を 1 mgZm 1に、 リン酸ナトリゥム緩衝 液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 0 mMとなるように添加した 後、 pHを 7. 3に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリ ンジ （ べク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロング夕ィプシリンジ、 針なし） に 1 m 1分注し、 空隙部割合が 1 0 %となるように真空度を調整してストッパー （ゥェ スト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを 含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。 比較例 1 4
参考例 9のトロンボモジユリンの濃度を l mgZm lに、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加し た後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して 熔閉し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部 割合： 35 %) 比較例 1 5
参考例 8のトロンボモジュリンの濃度を 1 mg/m 1に、 リン酸ナトリウム緩 衝液濃度を 2 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加し た後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を 2m 1用アンプルに 2m 1分注して 熔閉し、 トロンボモジュリ ンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。 （空隙部 割合： 35%) 試験例 1
実施例 1〜 4及び比較例 1〜 4の水溶液注射用製剤を、 下記測定法 1により熱 安定性に関する力価の残存率 （残存力価 を測定した。 则定法 1では、 5 0°C 9 6時間の保存後の力価が 6 6 %以上であるものを適と判定した。 なおァレニゥ スプロッ トによる予測から、 5 0で9 6時間の保存後の力価が 6 6 %以上である ものは、 5°C保存で 8 0 %以上力価を保持している期間が 3年と推定される。 ま た、 測定法 2により振盪安定性試験に関する評価を行った。 そして、 測定法 1 と 測定法 2の測定結果のいずれにおいても満足すべき結果を得たものに対して、 総 合評価として、 適、 不適を判断した。 その結果は、 第 1表に示した。
第 1表
Figure imgf000065_0001
即ち、 リン酸ナトリウム緩衝液および酢酸ナトリゥ厶緩衝液のいずれにおいて も、 pH 6. 0においては、 熱安定性における残存力価はすべて 6 6 %以上であ つたが、 pH 7. 3の比較例 1では 6 6 %以下であった。 また、 0. 0 1 %Tw e e n 8 0、 又は 0. 1 %HCO— 6 0の界面活性剤が併存した場合に、 振盪安 定性において白濁を生ずることがなく、 総合評価が 「適」 である水溶液注射用製 剤が調製された。
<測定法 1 > 熱安定性試験 （ 5 0でで 9 6時間加熱処理） 測定する水溶液注射用製剤を、 5 0°Cで 9 6時間加熱処理を行い、 以下の手順 でトロンボモジュリンカ価を測定し、 熱処理せずに凍結保存していた試料の力価 を 1 0 0 %として、 熱処理した試料の力価の残存率 （残存力価％) を比較する。
トロンボモジュリンカ価の測定は、 トロンビンによるプロテイン C活性化を促 進する作用 （APCアツセィ法） で測定する。 すなわち、 1 0 OmMの Na C 1 、 3mMの塩化カルシウム、 0. 1 %のゥシ血清アルブミン （シグマ社） 、 0. 2 2 5N I HUのヒ ト トロンビン （シグマ社） を含む 5 OmMトリス塩酸緩衝液 (pH 8. 5) 3 7. 5〃Lに、 トロンボモジュリ ンを含有する水溶液注射用製 剤から適宜調製した試料溶液 5 L (但し、 試料溶液 5 //L中のト oンボモジュ リン量を、 0. 3 5〜 4 n gの範囲となるように適宜の希釈率で希釈する） を加えて 3 7°Cで 1 5分静置し、 約 3 0 0 n g/m 1のゥシプロテイン C (ライ フテクノロジ一ズ社） を 7. 5 L添加して 3 7°Cで更に 3 0分静置し、 プロテ イン Cを活性化させる。 次に約 1 0 0 g/m 1のへパリン （和光純薬工業社） と約 6 g/m 1のアンチトロンビン I I I (ライフテクノロジーズ社） を含む 液 7. 5 Lを添加して反応を停止させる。 次に、 合成基質 （BOC— L e u— S e r -Th r -Ar g -MC A) 1 0 0 / g/m 1を含む基質反応液 5 0 0 Lを添加し、 3 7°Cで 2 0分間静置する。 酢酸 5 0 Lを添加して基質切断反応 を停止させる。 反応液を蛍光光度計を用いて、 励起波長 3 8 0 nm、 発光波長 4 4 0 nmで蛍光強度を測定し、 生成した活性型プロテイン C量を求め、 更にトロ ンボモジュリンカ価標準品との比較からトロンボモジュリンカ価を計算する。
<測定法 2 > 振盪安定性試験 （ 1 8 0往復 分の振盪処理） 測定する水溶液注射用製剤を、 2 5 °Cの恒温振盪機中にて、 振幅 5 cm、 1分 間に 1 8 0往復の条件で 1 力月間振盪処理を行い、 処理前後の外観変化を観察す る。 必要に応じて濁度 （ 6 5 0 nmにおける吸光度） 及びトロンボモジュリンカ 価の残存率を測定する。 なお、 振盪方向は、 容器の長軸と平行方向とする。 トロ ンボモジュリンカ価の測定法は、 測定法 1 と同一の測定法による。 試験例 2
実施例 3、 5〜1 3、 及び比較例 1の水溶液注射用製剤について、 前述の測定 法 1および測定法 2の測定を行い、 同様に総合評価を行った。 その結果は、 第 2 表に示した。
第 2表
Figure imgf000067_0001
即ち、 酢酸ナトリウム緩衝液の濃度を 0. 2〜2 0 OmMの広い濃度範囲で振 つたが、 緩衝液濃度による影響はなく、 pHを 5. 0〜6. 0の範囲にすれば、 熱安定性における残存力価はすべて 6 6 %以上であった。 また、 0. 0 1 %Τ — e e η 8 0が併存した場合に、 振盪安定性において白濁を生ずることがなく、 総 合評価が 「適」 である水溶液注射用製剤が調製された。 試験例 3
実施例 1 4〜 1 9及び比較例 5〜7の水溶液注射用製剤について、 前述の測定 法 1および測定法 2の測定を行い、 同様に総合評価を行った。 その結果は、 第 3 表に示した。 第 3表
Figure imgf000068_0001
即ち、 リン酸ナトリウム緩衝液の濃度を 2〜2 0 OmMの広い濃度範囲で振つ たところ、 pH 7. 3では緩衝液濃度による影響があり、 濃度が濃くなるほど力 価の低下が見られて 6.6 %を下回ったが （比較例 5〜7) 、 pHを 5. 0〜6. 0の範囲にすれば、 熱安定性における残存力価はすべて 6 6 %以上であった。 ま た、 0. 0 1 %Twe e n 8 0が併存した場合に、 振盪安定性において白濁を生 ずることがなく、 総合評価が 「適」 である水溶液注射用製剤が調製された。 試験例 4
実施例 2 0〜2 4及び比較例 1、 8の水溶液注射用製剤について、 前述の測定 法 1および測定法 2の測定を行い、 同様に総合評価を行った。 その結果は、 第 4 表に示した。 第 4表
Figure imgf000069_0001
即ち、 リン酸ナトリウム緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液の濃度を共に 2 OmM に調整し、 pHを 5. 0 7. 3で振ったところ、 pHが 5. 0 7. 0の範囲 では、 熱安定性における残存力価はすべて 6 6%以上であった。 pHを 5. 5 6. 5の範囲にすれば、 熱安定性における残存力価は 73%以上であり、 これは 5°C保存で 8 0 %以上力価を保持している期間が 4年と推定された。 特に pH5 . 5及び 6. 0での残存力価は 8 0 %以上と高かった。 一方 pH 7. 3では 6 6 %を下回った （比較例 I 8) 。 また、 0. 0 I %Twe e n 8 0が併存した場 合に、 振盪安定性において白濁を生ずることがなく、 総合評価が 「適」 である水 溶液注射用製剤が調製された。 試験例 5
実施例 25 3 2及び比較例 I 2の水溶液注射用製剤について、 前述の測定 法 Iおよび測定法 2の測定を行い、 同様に総合評価を行った。 その結果は、 第 5
： ^に不した。 第 5表
Figure imgf000070_0001
即ち、 緩衝液成分を 2 OmMの各種カルボン酸塩に変えても、 pHを 6. 0に 調整すれば、 熱安定性における残存力価はすべて 6 6 %以上であった。 また、 0 . 0 1 %Twe e n 8 0が併存した場合に、 振盪安定性において白濁を生ずるこ とがなく、 総合評価が 「適」 である水溶液注射用製剤が調製された。 試験例 6 一 実施例 3 3〜3 8及び比較例 1、 2の水溶液注射用製剤について、 前述の測定 法 1および測定法 2の測定を行い、 同様に総合評価を行った。 その結果は、 第 6 に不した。 第 6表
Figure imgf000071_0001
即ち、 リン酸ナトリウム緩衝液に、 各種カルボン酸塩の緩衝液成分を加えても pHを 6. 0に調整すれば、 熱安定性における残存力価はすべて 6 6%以上で あった。 また、 0. 0 l %Twe e n 8 0が併存した場合に、 振盪安定性におい て白濁を生ずることがなく、 総合評価が 「適 j である水溶液注射用製剤が調製さ れた。 試験例 7
実施例 1 8 3 9 4 3 4 4及び比較例 9の水溶液注射用製剤について、 述の測定法 1および測定法 2の測定を行った。 その結果は、 第 7表に示した。
第 7表
Figure imgf000072_0001
即ち、 界面活性剤の種類と濃度を振って振盪安定性を则定したところ、 界面活 性剤なしでは外観が白濁した （比較例 9) のに対し、 界面活性剤入りでは、 白濁 が防止された。 界面活性剤濃度は、 商品名： Twe e η 8 0は 0. 1 %で、 商品 名： HCO— 6 0及び商品名：プル口ニック F 6 8は 0. 1 %で充分効果があつ た。 また食塩の影響はなかった。 試験例 8
実施例 4 5 6 3及び比較例 1 0 1 2の水溶液注射用製剤について、 前述の 測定法 1及び測定法 2の測定を行い、 同様に総合評価を行った。 その結果は、 第 8表に示した。
Figure imgf000073_0001
即ち、 振盪可能部位における空隙部割合を 5 0 %以下とした場合には、 振盪安 定性において白濁を生ずることがなかったが、 6 0 %の比較例 1 1、 7 0 %の比 較例 1 2では振盪によって白濁が生じた。 また、 p Hを 6. 0とした場合には、 熱安定性における残存力価は 6 6 %以上となり、 総合評価が 「適」 である水溶液 注射用製剤が調整された。 試験例 9
実施例 4 6、 6 4〜7 2及び比較例 1 0の水溶液注射用製剤について、 前述の 测定法 1及び測定法 2の測定を行い、 同様に総合評価を行った。 その結果は、 第 9表に示した。
第 9表
Figure imgf000074_0001
即ち、 リン酸ナトリウム緩衝液あるいは酢酸ナトリゥム緩衝液の濃度を 2〜2 0 O mMの広い濃度範囲で緩衝液濃度による影響はなく、 p Hが 5. 0〜7. 0 の範囲にすれば、 熱安定性における残存力価はすべて 6 6 %以上であった。 また 、 空隙部割合を 1 0 %とした場合に、 振盪安定性において白濁を生ずることがな く、 総合評価が 「適」 である水溶液注射用製剤が調製された。 試験例 1 0
実施例 4 6、 7 3〜8 2、 9 0〜9 2及び比較例 1 3〜 1 5の水溶液注射用製 剤について、 前述の測定法 1及び測定法 2の測定を行い、 同様に総合評価を行つ た。 その結果は、 第 1 0表に示した。
第 1 0表
Figure imgf000075_0001
即ち、 少なく とも 0. 1〜6mgZm 1の範囲で、 トロンボモジュリン濃度に よる影響はなく、 p Hを 6 . 0に調整すれば熱安定性における残存力価はすべて 6 6 %以上であった。 また、 空隙部割合を 1 0 〜 1 5 %とした場合に、 振盪安定 性において白濁を生ずることがなく、 総合評価が 「適」 である水溶液注射剤が調 製された。
比較例 1 4によれば、 参考例 9の可溶性トロンボモジュ リ ンにおいても振盪安 定性の問題が存在することが確認され、 実施例 9 0、 9 1の結果によれば、 参考 例 9の可溶性トロンボモジュリンにおいても、 本発明の構成により、 熱安定性お よび振盪安定性に優れた水溶液注射剤が調製されることが確認された。
参考例 8の可溶性トロンボモジュリンを用いた実施例 9 2において、 熱安定性 および振盪安定性に優れた水溶液注射剤が調製された。 試験例 1 1
実施例 1 、 3、 7 9 〜 8 2及び比較例 6 、 1 3の水溶液注射用製剤について、 下記測定法 3により加速安定性 （2 0 °C保存） に関する残存力価を測定した。 そ の結果は、 第 1 1表に示した。
第 1 1表 測定法 3 残存力価(％)
保存時の緩衝液 保存時界面活性剤
濃度、組成 の pH 濃度、種類 0力月 3力月 6力月 比較例 20m 7. 3 0.01% 100 67.1 52.4
6 リン酸ナトリウム Tween80
比較例 20m 7. 3 なし 100 81.8 63.2
13 リン酸ナトリウム
実施例 0.2mM 6. 0 0.01% 100 92.5 73.7
1 リン酸ナトリウム Tween80
実施例 20mM 6. 0 0.01% 100 97.5 80.1
3 齚酸ナトリウム Tween80
実施例 2mM 6. 0 0.01% 100 92.8 86.4
79 リン酸ナトリウム Tween80
実施例 6m 6. 0 0.01% 100 94.4 85.6
80 リン酸ナトリウム Tween80
実施例 12mM 6. 0 0.01% 100 93.4 84.9
81 リン酸ナトリウム Tween80
実施例 12mM 6. 0 0.01% 100 94.0 82.5
82 リン酸ナトリウム クレモフォール EL 即ち、 2 0°C 6力月保存後、 比較例 6では 5 2. 4 %まで、 比較例 1 3では 6 3. 2%まで力価が低下したが、 実施例 1、 3、 7 9〜8 2は有意に安定であつ た。
<測定法 3 > 加速安定性試験 （2 0eCで 6 力月間保存）
測定する水溶液注射用製剤を、 2 0°Cで 6 力月間保存し、 トロンボモジュ リ ン 力価の残存率を測定する。 ト αンボモジュリンカ価は、 測定法 1 と同様に測定す る。 試験例 1 2
実施例 1、 3の水溶液注射用製剤について、 下記測定法 4により長期安定性 （ 5°C保存） に関する残存力価を測定する。 トロンボモジュリンカ価は则定法 1 と 同様に測定する。 その測定結果は、 第 1 2表に示した。
第 1 2表
Figure imgf000077_0001
実施例 1、 3は 5°C、 9力月保存後も力価の低下見られなかった。
<測定法 4 > 長期安定性試験 （ 5でで 9力月間保存） 測定する水溶液注射用製剤を、 5°Cで 9力月間保存し、 トロンボモジユリン 価の残存率を測定する。 トロンボモジュリンカ価は試験例 1 と同様に測定する。 試験例 1 3
9〜 1 0週齢の SD系雄性ラッ ト （日本チヤ一ルス · リバ一社） の尾静脈ある いは背部皮下に、 下記被験液または製剤を投与し、 経時的に採血を行った。
1. 静脈内注射用被検液：
参考例 7のトロンボモジュリ ンの濃度を 1 0〃 g/mし 5 0 n g/m 1 , 2 5 0 pi gZm 1の各濃度に、 リン酸ナトリウ厶緩衝液濃度を 1 OmMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 pHを 7. 4に調整し、 静脈内注射用被検液とし た。 投与量は第 1 3表に示した通りである。
2. 皮下注射用被検液 A：
参考例 7のトロンボモジュ リ ンの濃度を 1 0〃 g/m 1、 5 0〃 g/m l、 2 5 0 u g/m 1の各濃度に、 リン酸ナトリゥム緩衝液濃度を 1 OmMに調整し、 さらに N a C 1を 1 5 0 mM、 ポリソルべ一ト 8 0 (Tw e e n 8 0) を 0. 0 1 %、 局方べンジルアルコールを 4 OmgZm 1、 パラォキシ安息香酸メチルを 0. 3%となるように添加した後、 pHを 7. 4に調整し、 皮下注射用被検液 A とした。 投与量は第 1 3表に示した通りである。
3. 皮下注射用被検液 B ：
参考例 7のトロンボモジュ リ ン濃度を 1 0〃 gZm 1、 5 0〃 g/m l、 2 5 0 g/m 1の各濃度に、 リン酸ナトリウム緩衝液濃度を 1 OmMに調整し、 更 に Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルベート 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 % 、 局方塩酸プロカインを 4 Omg/m 1、 パラォキシ安息香酸メチルを 0. 3 % となるように添加した後、 pHを 7. 4に調整し、 皮下注射用被検液 Bとした。
4. 皮下注射用投与製剤 C ：
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 25 0 a g/m 1に、 リン酸ナトリゥム 緩衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmMとなるように添加し た後、 pHを 6. 0に調整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製 、 基本組成：ブロモブチルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ (べク トン 'ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリンジ、 針なし） に 1 m l分注し、 空隙部割合が 1 0%となるように真空度を調整してストッパー （ゥ エスト社製、 基本組成：ブロモブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュ リ ン を含有する水溶液注射用プレフィルドシリ ンジ製剤を調製した。 この製剤に、 プ ランジャーロッ ド （べク トン ·ディ ツキンソン社製、 1 m 1ロングタイプシリン ジ用、 組成： ポリプロピレン） と注射針 （テルモ社製、 26 Gx 1 Z2" ) を装 着し、 皮下注射用投与製剤 cとした。
5. 皮下注射用投与製剤 D ：
参考例 7のトロンボモジュリン濃度を 2 5 0 gZm 1に、 リン酸ナトリウム 緩衝液濃度を 2 mMに調整し、 さらに Na C 1を 1 5 OmM、 ポリソルべ一ト 8 0 (Twe e n 8 0) を 0. 0 1 %となるように添加した後、 p Hを 6. 0に調 整した。 この薬液を、 先端部にキャップ （ウェスト社製、 基本組成： プロモブチ ルゴム） を装着した内径 6. 3mmのガラス製シリンジ （べク トン ·デイ ツキン ソン社製、 1 m 1ロングタイプ、 針なし） に 0. 5 m 1分注し、 空隙部割合が 1 5 %となるように真空度を調整してストツバ一 （ウェスト社製、 基本組成： プロ モブチルゴム） を真空打栓し、 トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレ フィルドシリンジ製剤を調製した。 この製剤に、 プランジャーロッ ド （べク トン •ディ ツキンソン社製、 1 m 1 ロングタイプシリンジ用、 組成： ポリプロピレン ) と注射針 （テルモ社製、 2 6 Gx 1 Z2" ) を装着し、 皮下注射用投与製剤 D とした。
第 1 3表 投与方法 被検液 濃度 投与液量 投与量
( β g/ml) (ml/kg) R/k(?)
静脈内 静脈内注射用 10 1 10 3
II 50 " 50 //
II II 250 1) 250 II
皮下 皮下注射用被検液 A 10 1 10 3
II ，1 50 " 50 ，1
II II 250 II 250 II 各時点の血漿中の可溶性トロンボモジユリン濃度を酵素免疫測定法 （EL I S A) にて測定し、 その値を第 1図に示した。 本測定法としては、 固相化抗体とし て R 4 B 6を、 標識抗体として R 4 D 1を組み合わせた EL I S Aによる公知の 濃度測定法を実施して行なった （特開平 6 - 20 5 6 9 2号公報） 。 血漿中濃度 推移より求めた薬物速度論的パラメ一夕を第 1 4表に示した。 第 1 4表 投与方法 被検液 投与量 1 max Cmax Tl/2 AUC(O-oo) RT
( β R/kfd (hr) (ηκ/ml) (hr) (hr) 静脈内 静脈内注射用 10 0 322.7 6.1 2.02 6.1
II II 50 0 1346.2 7.8 10.75 7.9
II II 250 0 6138.3 7.2 44.79 7.2 皮下 皮下注射用被検液 A 10 32.2 21.4 17.4 1.06 38.4
50 23.4 140.3 19.9 7.01 38.8
II II 250 8.3 661.5 16.7 42.67 36.6 第 1 4表に示すように、 皮下注射用被検液 Aでは、 いずれの投与量においても M R T (平均滞留時間） は皮下投与の方が静脈内投与よりも大きく、 加えて第 1 図から明らかなように、 皮下投与が静脈内投与に比べて著しく血中濃度持続時間 が長いことが判明した。 また皮下投与により T 1 2が 1 6時間以上に持続され 得ることが確認された。
皮下注射用被検液 B、 および皮下注射用投与製剤 C、 Dの各投与群においても 、 皮下注射用被検液 Aとほぼ同じ結果が得られた。 これらのことより皮下投与経 路は従来の静脈内投与経路に比べて有効な治療レベルを維持するための血中濃度 の維持がなされることが確認された。 また、 皮下投与時の B A (生物学的利用率 ) 値はいずれの用量においても 5 0 %以上であり、 良好な吸収が認められた。 皮下投与する薬剤の p Hを 3 . 0〜7 . 4としたが、 特に血中濃度に変化は見 られなかった。 また、 薬剤のイオン強度を変化させた （N a C l濃度を0〜4 . 8 % ) 、 特に血中濃度に変化は見られなかった。

Claims

請 求 の 範 囲 ―
1. 凍結又は凍結乾燥されていない液状のトロンボモジュリン水溶液注射剤 の貯蔵 ·流通時における品質保持方法であって、 有効量の可溶性トロンボモジュ リンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含 有せしめたトロンボモジュリン水溶液の pHが 5以上 7. 0以下であり、 （a) 該トロンボモジュリ ン水溶液は、 さらに、 界面活性剤を含有し、 容器に無菌充塡 されていること、 又は、 （b) 該トロンボモジュリン水溶液が実質的な空隙部を 存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充塡されているプレフィルドシリンジ 製剤であること、 のいずれかを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液 状で長期に貯蔵 ·流通せしめることからなる方法。
2. 有効量の可溶性トロンボモジュリンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間に おいて緩衝能を有する緩衝液成分と、 界面活性剤とを含有し、 1が ^{5以上 7. 0以下であるトロンボモジュリン水溶液が、 容器に無菌充塡されていること を特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵■流通せしめ ることからなる請求の範囲第 1項に記載の方法。
3. 有効量の可溶性トロンボモジュリンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間に おいて緩衝能を有する緩衝液成分とを含有し、 pHがpH5以上7. 0以下であ るトロンボモジュリン水溶液が、 実質的な空隙部を存在せしめないようにシリン ジ容器に無菌充塡されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とする トロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵 ·流通せしめることからな る請求の範囲第 1項に記載の方法。
4. 有効量の可溶性トロンボモジュリンと、 pH5以上、 7. 0以下の間に おいて緩衝能を有する緩衝液成分と、 界面活性剤とを含有し、 pHがpH 5以上
7 . 0以下であるトロンボモジュ リ ン水溶液が、 実質的な空隙部を存在せしめな いようにシリンジ容器に無菌充塡されているプレフィルドシリンジ製剤であるご とを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵 ·流通せし めることからなる請求の範囲第 1項〜 3項のいずれかに記載の方法。
5 . 可溶性トロンボモジュリンが、 分子量 （非還元状態での S D S —ポリア クリルアミ ドゲル電気泳動法による測定） が 6 . 6万 ± 1万であり、 トロンビン によるプロテイン Cの活性化を促進する作用を有し、 且つ注射用蒸留水に少なく とも 6 m g /m 1の濃度として溶解可能な可溶性であるべプチドであることを特 徴とする請求の範囲第 1項〜 4項のいずれかに記載の方法。
6 . 可溶性トロンボモジュリン力、
( i ) 配列番号 1の 1 9— 5 1 6のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジ ュリン、 又は
( i i ) 上記ァミノ酸配列の 1個又は複数個のァミノ酸が置換、 欠失、 付加さ れたァミノ酸配列からなり、 且つトロンビンによるプロテイン Cの活性化を促進 する作用を有する可溶性ト oンボモジュリンのいずれかである請求の範囲第 1項 〜 5項のいずれかに記載の方法。
7 . 可溶性トロンボモジュリン力、 配列番号 1の 1 9— 5 1 6のァミノ酸配 列からなる可溶性トロンボモジュリン、 配列番号 2の 1 9— 5 1 6のアミノ酸配 列からなる可溶性トロンボモジュリン、 配列番号 1に記載のアミノ酸配列をコー ドする D N Aを宿主細胞にトランスフエク トして得られる可溶性トロンボモジュ リン、 又は、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列をコードする D N Aを宿主細胞に トランスフ ク トして得られる可溶性トロンボモジユリンのいずれかの可溶性ト ロンボモジュリンである請求の範囲第 1項〜 6項のいずれかに記載の方法。
8. 緩衝液成分がリン酸塩緩衝液成分、 又は酢酸塩緩衝液成分の少なく とも 1つであることを特徴とする請求の範囲第 1項〜 7項のいずれかに記載の方法。
9. 緩衝液の pHが、 5. 5〜6. 5であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜 8項のいずれかに記載の方法。
1 0. 実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填され ているプレフィルドシリンジ製剤が、 シリンジ容器でのトロンボモジュリン水溶 液の存在量が、 空隙部割合として 1 5 %以下であることを特徴とする請求の範囲 第 1項、 又は 3項〜 9項のいずれかに記載の方法。
1 1. プレフィルドシリンジ製剤におけるシリンジ容器の内径が、 8. 6 m m以下であることを特徴とする請求の範囲第 1項、 又は 3項〜 1 0項のいずれか に記載の方法。
1 2. 有効量の可溶性トロンボモジュリンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間 において緩衝能を有する緩衝液成分と、 界面活性剤とを含有し、 pHが pH 5以 上 7. 0以下であるトロンボモジュリン水溶液が、 容器に無菌充塡されているこ とを特徴とする長期安定性および振盪安定性において優れ、 液状で長期貯蔵 ·流 通せしめるための凍結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射 剤。
1 3. 有効量の可溶性トロンボモジュリンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間 において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有し、 pHがpH 5以上7. 0以下で あるトロンボモジュリン水溶液が、 実質的な空隙部を存在せしめないようにシリ ンジ容器に無菌充塡されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とす る長期安定性および振盪安定性において優れ、 液状で長期貯蔵 ·流通せしめるた めの凍結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤。
1 4. 有効量の可溶性トロンボモジュリ ンと、 pH 5以上、 7. 0以下の間 において緩衝能を有する緩衝液成分と、 界面活性剤とを含有し、 pHがpH 5以 上 7. 0以下であるトロンボモジュ リ ン水溶液が、 実質的な空隙部を存在せしめ ないようにシリンジ容器に無菌充塡されているプレフィルドシリンジ製剤である ことを特徴とする長期安定性および振盪安定性において優れ、 液状で長期貯蔵 · 流通せしめるための凍結又は凍結乾燥されていないト πンボ乇ジュリン水溶液注 射剤。
1 5. 該プレフィルドシリ ンジ製剤が、 皮下注用、 又は筋肉注射用製剤であ る請求の範囲第 1 3項〜 1 4項のいずれかに記載のトロンボモジュリン水溶液注 射剤。
1 6. 可溶性トロンボモジュリンカ 配列番号 1の 1 9一 5 1 6のアミノ酸 配列からなる可溶性トロンボモジュリン、 配列番号 2の 1 9— 5 1 6のアミノ酸 配列からなる可溶性トロンボモジュ リ ン、 配列番号 1に記載のアミノ酸配列をコ 一ドする DNAを宿主細胞にトランスフエク トして得られる可溶性ト口ンボモジ ュリン、 又は、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列をコードする DNAを宿主細胞 にトランスフ ク トして得られる可溶性トロンボモジュリンのいずれかの可溶性 トロンボモジュリンである請求の範囲第 1 2項〜 1 5項のいずれかに記載のトロ ンボモジュリン水溶液注射剤。
1 7. 緩衝液の pHが、 5. 5〜6. 5であることを特徴とする請求の範囲 第 1 2項〜 1 6項のいずれかに記載のトロンボモジュリン水溶液注射剤。
1 8. 実質的な空隙部を存在せしめないようにシリ ンジ容器に無菌充填され ているプレフィルドシリンジ製剤が、 シリンジ容器でのトロンボモジュリン水溶 液の存在量が、 空隙部割合として 1 5 %以下であることを特徴とする請求の範囲 第 1 3項〜 1 7項のいずれかに記載のトロンボモジュリン水溶液注射剤。
1 9 . プレフィルドシリンジ製剤におけるシリンジ容器の内径が、 8 . 6 m m以下であることを特徴とする請求の範囲第 1 3項〜 1 8項のいずれかに記載の トロンボモジュリ ン水溶液注射剤。
2 0 . 可溶性トロンボモジュリンを有効成分とする水溶液注射剤であって、 1回 Z 2〜5日の間隔で皮下又は筋肉注射するための持続性製剤を用いることを 特徴とする可溶性トロンボモジュリンの血中濃度を持続させる方法。
2 1 . 可溶性トロンボ乇ジュリンが、 配列番号 1の 1 9— 5 1 6のアミノ酸 配列からなる可溶性ト口ンボモジュリン、 配列番号 2の 1 9— 5 1 6のアミノ酸 配列からなる可溶性トロンボモジュリン、 配列番号 1に記載のアミノ酸配列をコ ードする D N Aを宿主細胞にトランスフ ク トして得られる可溶性トロンボモジ ュリン、 又は、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列をコードする D N Aを宿主細胞 にトランスフ ク トして得られる可溶性トロンボモジュリンのいずれかの可溶性 トロンボモジュリンである請求の範囲第 2 0項に記載の方法。
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