[go: up one dir, main page]

WO1999009159A1 - Proteines du type recepteurs accepteurs - Google Patents

Proteines du type recepteurs accepteurs Download PDF

Info

Publication number
WO1999009159A1
WO1999009159A1 PCT/JP1998/003602 JP9803602W WO9909159A1 WO 1999009159 A1 WO1999009159 A1 WO 1999009159A1 JP 9803602 W JP9803602 W JP 9803602W WO 9909159 A1 WO9909159 A1 WO 9909159A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
cells
human
csr
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/003602
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yusuke Nakamura
Takashi Tokino
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Yusuke Nakamura
Takashi Tokino
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tobacco Inc, Yusuke Nakamura, Takashi Tokino filed Critical Japan Tobacco Inc
Priority to CA002300476A priority Critical patent/CA2300476A1/en
Priority to EP98937802A priority patent/EP1004665A4/en
Publication of WO1999009159A1 publication Critical patent/WO1999009159A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a novel scavenger receptor-like protein and a fragment thereof, a DNA encoding the protein and a fragment thereof, an expression vector containing the DNA, a transformed cell transformed with the expression vector, the protein or a fragment thereof.
  • the present invention relates to an antibody having reactivity with a fragment, and a cell producing the antibody.
  • LDL low density lipoprotein
  • the LDL receptor is down-regulated when intracellular cholesterol increases due to LDL uptake so that excessive cholesterol accumulation does not occur.
  • Peripheral macrophages usually express little LDL receptor, but express scavenger receptors that recognize denatured LDL, such as oxidized LDL, and have been shown to take up modified LDL via this receptor.
  • scavenger receptors that recognize denatured LDL, such as oxidized LDL, and have been shown to take up modified LDL via this receptor.
  • this scavenger receptor does not undergo down regulation due to an increase in intracellular cholesterol, so it takes up excessive denatured LDL (cholesterol) and makes macrophages foam cells.
  • LDL cholesterol
  • the accumulation of foamed macrophages in the subendothelium and the blood vessel wall is considered to be one of the main causes of atherosclerosis.
  • atherosclerotic lesions were smaller in knockout mice in which this macrophage force-venger receptor had been genetically inactivated than in control mice. It has been demonstrated that the scavenger receptor is deeply involved.
  • Type I and type II macrophage force-bender receptors exist, each consisting of six domains, and differing only in the C-terminus. In addition, it is a rare inside-out type trimeric membrane glycoprotein as a membrane protein. Human, mouse, mouse Among the species of magpie, both type I and type II have high amino acid sequence homology (type I: 64-81%, type II: 60-81%).
  • Type I “C-terminal specific domain” is rich in cysteine and has high homology to complement factor 1, CD5 and CD6.
  • the “collagen-like domain” has a repeating structure of glycine (Gly) -X-Y unique to collagen. At the C-terminal side, many positively charged amino acids suitable for binding negatively charged ligands are concentrated. Mutants lacking the 22 amino acids at the C-terminal side of the collagen-like domain have been confirmed to lose ligand binding. In addition, experiments using various deletion mutants have revealed that lysine residues (K337) are important for ligand binding.
  • the “helical coiled-coil domain” not only plays a role in associating three scavenger receptor polypeptides as the primary structure of the protein to form an active receptor, but also binds ligands such as denatured LDL into cells. It has a role in changing the conformation of the receptor depending on the decrease in pH within the endosome to dissociate the ligand.
  • This domain takes the form of a right-handed heptated repeat that rotates twice every seven amino acids, that is, a helical coiled-coil structure, and the three polypeptides have hydrophobic amino acids such as leucine-disoloisin, which are present in every seven amino acids, inside. It forms a trimer with the polar amino acid and sugar chain binding sites on the outside.
  • histidine present on the collagen-like domain side of the heptets repeat functions in dissociating ligands in cells. Furthermore, an antibody that recognizes the 15 amino acid region centered on histidine in the coiled-coil domain inhibits macrophage calcium-independent cell adhesion. of It is suggested that it also has a function.
  • the ⁇ cytoplasmic domain '' has a characteristic title-turn structure found in the endocytosis signal similar to the NPXY sequence found in the LDL receptor and the insulin receptor and the YXRF sequence found in the transducin receptor. Deletion of the sequence has been shown to suppress end-site lysis.
  • the collagen-like domain which is the ligand-binding site of the scavenger receptor, is clearly a structure suitable for removing foreign substances such as denatured LDL and waste products that bind to and deposit on extracellular matrix such as collagen. Have been.
  • the phage force force receptor is a “cleaner” in the living body, and that foreign matter and denatured proteins (eg, denatured LDL, saccharified products, Its primary role is to take up foreign substances derived from infectious bacteria, etc., and it plays a role as one of the biological defense mechanisms that protect cells and living organisms by removing such foreign substances and denatured proteins from living bodies. Is believed to be. Disclosure of the invention
  • the present inventors have identified various human genes that are transcriptionally regulated by the tumor suppressor protein p53, a gene belonging to a different technical field from known LDL receptors, oxidized LDL receptors, and macrophage force venger receptors. As a result of diligent research on the analysis, it has a structure very similar to the protein secondary structure specific to the human macrophage force-venger receptor, but has no amino acid sequence homology to the receptor, and ⁇ Three new human cDNAs (alternatively referred to as “CSR genes” (Cellular Sensor-Related Genes; Cellular Stress Response Genes) that encode alternative splicing variants.
  • CSR genes Cellular Sensor-Related Genes; Cellular Stress Response Genes
  • the proteins encoded by the cDNAs were abbreviated as “CSR 1”, “CSR 2” and “CSR 3”), and the present invention was completed.
  • the novel gene / protein of the present invention has the following characteristics, and is considered to be a novel scavenger receptor that acts protectively against various types of stress generated in cells.
  • Macrophage force-venger receptor type I and type II (GenBank session number: S08278; Rohrer, L. et al., Nature, Vol. 343, 570-572, 1990) and / or Sensor protein (GenBank accession number: P30844; Nagasaw a, S. et al. J. Biochem., Vol. 114, 350-357, 1993).
  • transmembrane domain containing a leucine zipper structure in which the leucine unit is repeated four times, which has a secondary structure as shown schematically in Fig. 2, and It consists of a helical coiled coil domain and a collagen-like domain in which 3 G 1 y-X-Y sequence units are repeated 49 times.
  • the three molecules having the characteristic structure form a helix in the coiled-coil domain and a triple helix in the collagen-like domain to form a trimer.
  • the collagen-like domain has a positive net charge at physiological pH.
  • the untranslated region at the 3 'end of the CSR gene contains a 3'-terminal poly (A) It contains a six base sequence consisting of AGTAAA and MTAAA, each of which appears to be closely related to the provision of polyadenylation signals.
  • CSR expression is induced by intracellular stress such as ultraviolet irradiation, hydrogen peroxide and heat shock. Expression is also induced by stress caused by a number of reagents that exert oxidative stress on cells (DEM, PMA, sodium azide, sodium arsenite, GSNO, SNP, Hemin, etc.).
  • CSR suppresses cell death caused by intracellular stress such as ultraviolet irradiation, hydrogen peroxide and heat shock.
  • microbody-1 peroxisome
  • the gene, protein or fragment thereof encoding the CSR of the present invention can be obtained by using the gene or protein molecule as a target to obtain a pathological condition or disease caused by intracellular stress, foreign body or denatured protein generated in a living body.
  • a pathological condition or disease caused by intracellular stress, foreign body or denatured protein generated in a living body For example, it is extremely useful in drug development for prevention and treatment of arteriosclerosis, diabetic vascular disease, bacterial infection, etc.).
  • DNA itself is useful as an antisense drug that regulates the function of CSR at the gene level, and in use in gene therapy.
  • fragments of the protein eg, extracellular region, each domain
  • the antibody having a reactivity to CSR protein of the present invention or a part thereof is extremely useful as an antibody drug by controlling the function of CSR.
  • the gene (DNA), protein, and antibody of the present invention are used to search for a protein (ligand) that interacts with the protein of the present invention, elucidate the function of the ligand, and treat the ligand as a target. Useful as a reagent for drug development is there.
  • model animals are created by disrupting (inactivating) those genes based on the genetic information of CSRs derived from mammals (such as mice), which are one embodiment of the DNA of the present invention. It is possible to By analyzing the physical, biological, pathological and genetic characteristics of this model animal, it becomes possible to elucidate the functions of the gene and protein according to the present invention.
  • a model animal having only the human-derived gene of the present invention can be prepared. It is.
  • a drug compound, antibody, etc.
  • the present invention provides, for the first time, the following DNA, protein, expression vector, transformant, antibody pharmaceutical composition, and cell described below.
  • a DNA comprising the nucleotide sequence of base numbers 364 to 1971 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and a fragment thereof.
  • a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence, and fragments thereof.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody according to (13) or (14) or a part of the antibody and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the cell is a fusion cell obtained by fusing a B cell derived from a non-human mammal capable of producing a monoclonal antibody with a myeloma cell derived from a mammal.
  • the cell according to 16 The method according to (1), wherein the cell is a fusion cell obtained by fusing a B cell derived from a non-human mammal capable of producing a monoclonal antibody with a myeloma cell derived from a mammal.
  • the cells are transformed by the introduction of either the DNA encoding the heavy chain of the monoclonal antibody or the DNA encoding the light chain, or both DNAs, into the cell.
  • the "protein or fragment thereof" of the present invention refers to a protein derived from mammals such as humans, sea lions, olives, magpies, goats, goats, rabbits, rats, hamsters, guinea pigs, and mice, and fragments thereof. Yes, preferably human, egret, rat or mouse-derived protein or a fragment thereof, and particularly preferably human-derived protein and its fragment (fragment).
  • Particularly preferred embodiments include (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence and a fragment thereof; (2) a protein represented by SEQ ID NO: 12 And a fragment thereof having the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence, and (3) the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 or the amino acid substantially the same as the amino acid sequence Evening proteins containing the sequence and fragments thereof can be mentioned.
  • amino acid sequence having substantially the same amino acid sequence means that it has a biological property substantially equivalent to that of the protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, or 14.
  • the “protein fragment” refers to any partial sequence (fragment) in the amino acid sequence of the CSR protein of the present invention described above, for example, its extracellular region, transmembrane region, (transmembrane region) Certain domains may include a domain such as a cytoplasmic region, or a site at which each domain binds (interacts) with another protein molecule or small molecule ligand. Furthermore, the fusion protein of the extracellular region and another molecule (for example, a constant region (Fc, constant region) of a heavy chain of human immunoglobulin) or a part thereof is also a subject of the present invention. Are included in the range of protein fragments.
  • the “extracellular region” has the following meaning. That is, the CSR protein of the present invention, a cell transmembrane protein such as various G protein-coupled receptors or cell membrane surface molecules, is bound to the membrane by a hydrophobic peptide region that penetrates the lipid bilayer once or several times. It has a structure composed of three main regions: an extracellular region, a transmembrane region, and a cytoplasmic region. Further, such transmembrane proteins may be used as monomers or with another chain having the same amino acid sequence or a chain having a different amino acid sequence, respectively, as a homodimer or a heterodimer. ) Or exist as an origomer.
  • the “extracellular region” used in the present invention refers to a partial structure (partial sequence) existing on the outer side of the membrane in which the membrane protein is retained, of the entire structure of the transmembrane protein described above.
  • the region other than the region taken up in the membrane (transmembrane region) and the region present in the cytoplasm following the region in the membrane (intracellular region) correspond to the extracellular region. I do.
  • the extracellular region in the present invention may have, if desired, 1 to 5 amino acids derived from an amino acid sequence constituting a transmembrane region and / or an intracellular region at its N-terminal and / or C-terminal. Is also good.
  • the constant region or part of the heavy chain of human immunoglobulin refers to the constant region, Fc region, or the constant region of heavy chain (Heavy Chain, H chain) of human-derived immunoglobulin. Means part of.
  • the immunoglobulin may be an immunoglobulin belonging to any class and subclass. Specifically, IgG (IgGl, IgG2, IgG3 and IgG4), IgM, IgA (IgG gAl and IgA2), IgD and IgE. Preferably, it is IgG (IgGl, IgG2, IgG3 or IgG4) or IgM. Particularly preferred examples of the present invention include human-derived IgG (IgGl, IgG 2. It is an immunoglobulin belonging to IgG3 or IgG4).
  • Immunoglobulin is composed of four homologous light chains (Light Chains, L chains) and two homologous heavy chains (Heavy Chains, H chains) linked by disulfide bonds (SS bonds). It has a letter-shaped structural unit.
  • the light chain consists of the light chain variable region (V L ) and the light chain constant region.
  • Heavy chains are comprised of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH).
  • the heavy chain constant region is unique for each class (IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE) and subclass (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, and IgA2). Is composed of several domains having the following amino acid sequences:
  • the heavy chain of I GGL is this order from N terminus, V H, C 7 l l domain, hinge area, C7! 2 domains and C7! Consists of three domains.
  • the heavy chain of I gG2 are in this order from N terminus, V H, C ⁇ 2 1 domain, hinge region, and a C ⁇ 2 2 domain, and C ⁇ 2 3 domain.
  • the heavy chain of I GG3 is this order from N terminus, V H, C ⁇ 3 1 domain, hinge region, and a 3 2 domain, and C ⁇ 3 3 domain.
  • the heavy chain of I GG4 are in this order from N terminus, V H, C ⁇ 4 1 domain, hinge region, and a C ⁇ 4 2 domain, and C ⁇ 4 3 domain.
  • the IgA heavy chain is composed of, in order from the N-terminus, VH , C1 domain, hinge region, C2 domain and C3 domain.
  • the heavy chain of IgAl is composed of, in order from the N-terminus, VH, Ccl domain, hinge region, C2 domain and Ci ⁇ 3 domain.
  • the heavy chain of I GA2 are in this order from N terminus, V H, C monument 2 1 domain, hinge region, C monument 2 2 domain, and Co: composed of 2 3 domain.
  • the heavy chain of IgD consists of VH , C51 domain, hinge region, Cc52 Domain and the C53 domain.
  • the heavy chain of IgM is composed of, in order from the N-terminus, VH , C1 domain, domain, C3 domain and C4 domain, and comprises a hinge region as found in IgG, 18 and 10. Do not have.
  • the heavy chain of I gE are in this order from N terminus, V H, Cs l domain, Ce 2 domain, consists C £ 3 domain and Cs 4 domains, I gG, hinge region as seen in I gA and I gD Does not have.
  • IgG when IgG is treated with papain, it is cleaved slightly at the N-terminal side of the disulfide bond present in the hinge region connecting the two heavy chains, resulting in VH and two homologous Fab that heavy chain fragment and one light chain comprising a C H 1 are linked by disulfide bonds, as well as the hinge region, the C H 2 domain, and C h 3 two homologous heavy chain fragments composed of domain
  • This results in one Fc linked by a disulfide bond (“Immunological Illustrated", 2nd ed., Pp. 65-75, 1992, published by Nankodo, and "Focus on the Latest Medical Science” Recognition Mechanisms of the Immune System ", pp. 4-7, 1991, published by Nankodo, etc.).
  • a part of the constant region of the immunoglobulin heavy chain in the present invention means a part of the constant region of the immunoglobulin heavy chain having the structural characteristics as described above, and is preferably C 1.
  • a constant region or Fc region lacking a domain.
  • each hinge region a region composed of a C2 domain and a C3 domain
  • IgM or IgE each C2 Domain, a C3 domain and a C4 domain.
  • a particularly preferred example is the Fc region of human IgG1.
  • the fusion protein included in the “protein fragment” of the present invention include the extracellular region of the protein of the present invention and the constant of the heavy chain of the immunoglobulin of human as defined above. Region or part of the constant region. " Preferably, the extracellular region of the protein of the present invention and human gG A fusion Poribe peptide with a portion of the constant region of the heavy chain, especially preferably the extracellular region and human I g heavy chain hinge region of G evenings Npaku of the present invention, C H 2 domain and CH 3 domain Is a fusion polypeptide with the region (F c). It should be noted that Ig G is preferably Ig Gl.
  • the protein of the present invention is preferably a protein derived from human, mouse or rat (preferably human).
  • the protein, protein fragment and fusion protein of the present invention can be obtained by a known method known in the technical field such as a chemical synthesis method or a cell culture method, or a modification method thereof, in addition to a gene recombination technique described below. It can be manufactured by using it appropriately.
  • the fusion protein of the present invention described above has a part of the immunoglobulin constant region (for example, F c) such as IgG as a fusion partner as described above, and thus is specific for the immunoglobulin fragment.
  • F c immunoglobulin constant region
  • the use of affinity column chromatography using the property of protein A, which binds to the protein, has an advantage in that the fusion protein can be extremely easily purified. Furthermore, since various antibodies against Fc of various immunoglobulins are provided, it is possible to easily perform the imnoassay of the fusion polypeptide using an antibody against Fc.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the above-described protein of the present invention or a fragment thereof, including any base sequence capable of encoding the protein of the present invention, and includes any of genomic DNA and cDNA. Include.
  • the DNA includes a DNA consisting of any codon as long as the codon encodes the same amino acid.
  • the present invention also includes DNAs composed of any codons that encode the same amino acid.
  • a preferred embodiment of the DNA in the present invention is a DNA encoding a human-derived protein.
  • a plurality of amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, particularly preferably 1 to 5 amino acids are substituted in the amino acid sequence of a protein or fragment containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 12 or 14.
  • a DNA comprising a base sequence of base numbers 364 to 1971 of the base sequence described in SEQ ID NO: 13 and a fragment thereof.
  • stringent conditions include, for example, the following conditions: I can do it.
  • Tm target temperature
  • the temperature of the chillon can be set as in the following formula.
  • Tm 82.3 ° C + 0.4 lx (G + C)% -500 / n -0.61 x (formamide)% (n indicates the number of bases in the probe.)
  • Tm changes as shown in (1) and (2) below.
  • Tm decreases by about 1 ° C.
  • Tm decreases by 0.6 to 0.7 ° C.
  • the temperature conditions in the case of a combination of perfectly complementary strands can be as follows.
  • the temperature condition in the case of a combination of incomplete complementary strands can be as follows.
  • the temperature condition can be set to 37 ° C., and the following formula can be used as a guide.
  • DNA of the present invention may be obtained by any method.
  • complementary DNA cDNA prepared from mRNA
  • DNA prepared from genomic DNA DNA obtained by chemical synthesis
  • the DNA encoding the protein of the present invention can be obtained by a method of cloning cDNA from mRNA of the protein of the present invention, a method of isolating and splicing genomic DNA, a method of chemical synthesis, and the like according to a conventional method. Can be.
  • the following method is exemplified as a method for cloning cDNA from mRNA of the protein of the present invention.
  • mRNA encoding the protein of the present invention is prepared from the above-described tissue or cell that expresses and produces the protein of the present invention.
  • the mRNA is prepared by, for example, the guanidine thiosinate method (Chirgwin et al., Biochemistry, Vol. 18, p. 5294, 1979), the thermal phenol method or the AGPC method. It can be performed by subjecting all RNA prepared using a known method to affinity chromatography using oligo (dT) cellulose, poly-U-sepharose or the like.
  • the obtained mRNA is used as type ⁇ , and a known method such as, for example, using reverse transcriptase, for example, the method of Okayama et al. (Mol. Cell. Bio 1., Vol. 2, p. 161; 1982 and the same volume 3, p. 280, 1983) and the method of Hoffman et al. (Gene, Vol. 25, p. 263, 1983). Is converted to double-stranded cDNA.
  • the cDNA is integrated into a plasmid vector, phage vector or cosmid vector, and transformed into E. coli, or after in vitro packaging, transfected into E. coli to produce a cDNA library.
  • the plasmid vector used here is not particularly limited as long as it can be replicated and maintained in the host, and the phage vector used may be any vector that can be propagated in the host.
  • Examples of commonly used closing vectors include pUC19, gt10, and gt11.
  • the immunological When used for screening it is preferable that the vector be a vector having a promoter capable of expressing the gene encoding the protein of the present invention in a host.
  • Methods for incorporating cDNA into plasmid include, for example, the method of Maniais is et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition); And the method described in Cold Spring Harbor Laboratory, page 1.53, 1989. Also, as a method of incorporating cDNA into a phage vector, the method of Hyunh et al. (DNA cloning, a practical approach), Vol. 1, p. 49,
  • plasmid or phage vector thus obtained is introduced into an appropriate host such as a prokaryotic cell (for example, E. coli: HB101, DH5 or MC1061 / P3).
  • a prokaryotic cell for example, E. coli: HB101, DH5 or MC1061 / P3
  • Methods for introducing the plasmid into the host include (molecular cloning,
  • a method for introducing a phage vector into a host include a method in which phage DNA is packaged in vitro, and then introduced into a grown host. In-vitro packaging can be easily performed by using a commercially available in vitro packaging kit (for example, Straus Gene, Amersham, etc.). The method of isolating the cDNA encoding the protein of the present invention from the cDNA library prepared by the above method can be performed by combining general cDNA screening methods.
  • oligos which are considered to correspond to the amino acid sequence of the protein of the present invention separately After chemically synthesizing the oligonucleotide, it is labeled with 32 P to be used as a probe, and the known colony hybridization method (Crimstein et al., Et al. Natl. Acid. Sci. USA, Vol. 72, pp. 3961, 1975) or plaque hybridization 3 ⁇ 4 ⁇ (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory No. 2.108) P.
  • an antibody reactive with the protein of the present invention may be used.
  • a target clone can be selected by utilizing an antigen-antibody reaction using the method.
  • the nucleotide sequence of the DNA obtained in this manner may be determined by the Maxam-Gilbert method (Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ⁇ 74, 560, 1977) or phage M13. The method of terminating the dideoxynucleotide synthesis chain used (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 74, No. 546, pages 3-5467, 1977). .
  • the gene encoding the protein of the present invention can be obtained by cutting out all or a part of the clone obtained as described above using a restriction enzyme or the like.
  • a clone having the target sequence is detected by, for example, a method using a radiolabeled DNA probe, and all or a part of the gene encoding the protein of the present invention is cut out from the clone with a restriction enzyme or the like and obtained.
  • the production of the DNA of the present invention by chemical synthesis can be carried out according to a conventional method based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, 11 or 13.
  • the present invention relates to a recombinant vector containing DNA encoding the above-mentioned protein of the present invention.
  • the recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it can maintain replication or proliferate in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells, and includes a plasmid vector and a phage vector.
  • the recombinant vector can be conveniently prepared by ligating a DNA encoding the protein of the present invention to a vector for recombination (plasmid DNA and bacterial phage DNA) available in the art by a conventional method. Can be prepared.
  • plasmids derived from Escherichia coli such as pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, and pUC19
  • plasmids derived from yeast such as pSH19 pSH15
  • plasmids derived from Bacillus subtilis such as Examples are pUB110, pTP5, pC194 and the like.
  • phage includes pacteriophage such as input phage, and animal such as retrovirus, puccinia virus, and nucleopolyhedrovirus.
  • insect viruses pVL1393, manufactured by Invitrogen).
  • Expression vectors are useful for the purpose of expressing DNA encoding the protein of the present invention to produce the protein of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it expresses the gene encoding the protein of the present invention in various host cells such as prokaryotic cells and / or eukaryotic cells and has a function of producing these proteins.
  • pMAL C2 pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol. 18, p. 5322, 1990, etc.) or pME18S (Experimental Medicine separate volume "Genetic Engineering Handbook", 1992, etc.), etc. Can be mentioned.
  • the expression vector When a bacterium, particularly Escherichia coli, is used as a host cell, the expression vector generally comprises at least a promoter-operator region, an initiation codon, DNA encoding the protein of the present invention, a stop codon, a terminator region, and a replicable unit. You.
  • the expression vector preferably contains at least a promoter, an initiation codon, DNA encoding the protein of the present invention, and a stop codon.
  • a copyable unit may be included. Further, it may contain a gene amplification gene (marker) commonly used depending on the purpose.
  • the promoter-to-operator region for expressing the protein of the present invention in bacteria includes a promoter, an operator, and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (for example, AAGG).
  • SD Shine-Dalgarno
  • the host is Eshierikia spp, it preferably comprises Trp promoter, lac promoter Isseki one, re cA promoter, human PL flop Romo - evening one, iota [rho [rho promoter - evening -, those including tac promoter evening one An example is shown.
  • Promoters for expressing the protein of the present invention in yeast include P HO5 promoter, PGK Promoter, GAP Promoter, ADH Promoter-If the host is Bacillus, SL01 Promoter, SP02 Promoter, penP Promoter And the like.
  • the host is a eukaryotic cell such as a mammalian cell
  • examples thereof include an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, and a heat shock promoter.
  • SV-40 is a retrovirus.
  • enhansa is also an effective method for expression.
  • Suitable initiation codons include methionine codon (ATG).
  • stop codon examples include commonly used stop codons (eg, TAG, TGA, TAA).
  • evening / mineral / night area natural or synthetic evening / mineral evening can be used.
  • a replicable unit is DNA that has the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell, and is composed of natural plasmids, artificially modified plasmids (prepared from natural plasmids). DNA fragments) and synthetic plasmids.
  • Suitable plasmids include the plasmid pBR322 in E. coli or an artificially modified product thereof (a DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme), and the yeast 2 ⁇ plasmid in yeast.
  • plasmid pRSVneo ATCC 37198 plasmid pSV2dh fr ATCC 37145
  • plasmid pdBPV-MMMTneo ATCC 37224 plasmid pSV2neo ATCC 37149.
  • polyadenylation site and splicing junction site those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, can be used.
  • selection marker a commonly used selection marker can be used by an ordinary method. Antibiotic resistance such as tetracycline, ampicillin, or kanamycin Genes and the like are exemplified.
  • Gene amplification genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene, the thymidine kinase gene, the neomycin resistance gene, the glutamate synthase gene, the adenosine deaminase gene, the orditin decarboxylase gene, and the hygromycin B gene. Examples thereof include a phosphotransferase gene and an aspartatranstrans gene.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • neomycin resistance gene the glutamate synthase gene
  • the adenosine deaminase gene the orditin decarboxylase gene
  • hygromycin B gene examples thereof include a phosphotransferase gene and an aspartatranstrans gene.
  • the expression vector of the present invention comprises a continuous and circular suitable region comprising at least the promoter, the initiation codon, the DNA encoding the protein of the invention, the termination codon, and the yeast / mine region. It can be prepared by linking to a replicable unit. At this time, if necessary, use an appropriate DNA fragment (for example, linker, other restriction site, etc.) by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase. Can be.
  • the transformed cell of the present invention can be prepared by introducing the above-described expression vector into a host cell.
  • the host cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is compatible with the above-mentioned expression vector and can be transformed, and natural cells or artificial cells usually used in the technical field of the present invention are used.
  • Various cells such as established recombinant cells (for example, bacteria (genus Escherichia, genus Bacillus), yeasts (genus Saccharomyces, genus Pichia), animal cells or insect cells) are exemplified.
  • Escherichia coli or animal cells specifically Escherichia coli (DH5a, TB1, HB101, etc.), mouse-derived cells (COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1, or NIH3T3, etc.), rat-derived cells, hamster-derived cells (BHK and CH_ ⁇ etc.), monkey-derived cells (COS l, COS3, CO S 7 N CV1 and Ve 1 o, etc.) and human-derived cells (He 1 a, 2 diploid fibroblasts And cells derived from E. coli, myeoma cells and Nama 1 wa).
  • Escherichia coli DH5a, TB1, HB101, etc.
  • mouse-derived cells COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1, or NIH3T3, etc.
  • rat-derived cells hamster-derived cells
  • BHK and CH_ ⁇ etc. monkey-derived cells
  • the introduction (transformation (transfection)) of the expression vector into a host cell is performed by a conventionally known method. Can be performed.
  • the protein of the present invention can be produced by culturing a transformed cell containing the expression vector prepared as described above (hereinafter referred to as including a transfectant) in a nutrient medium.
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant).
  • Carbon sources include, for example, glucose, dextran, soluble starch, and sucrose; inorganic or organic nitrogen sources include, for example, ammonium salts, nitrates, amino acids, corn liquor, peptone, casein, and meat. Examples include extracts, soybean meal, and potato extract.
  • other nutrients eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride)
  • vitamins, antibiotics eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.
  • antibiotics eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.
  • the culturing is performed by a method known in the art. Culture conditions, eg temperature The pH of the medium and the culture time are appropriately selected so that the protein of the present invention is produced in large quantities.
  • a liquid medium containing the above-mentioned nutrient is suitable.
  • the medium has a pH of 5 to 8.
  • preferred mediums include LB medium and M9 medium (Mi Her et al., Exp. Mol. Genets Cold Spring Harbor Laboratory, p. 431, 1972).
  • the culturing can be carried out usually at 14 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, with aeration and stirring as necessary.
  • the reaction can be carried out usually at 30 to 40 ° for about 16 to 96 hours with aeration and stirring as necessary.
  • the medium includes, for example, Burkholder's minimal medium (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, pp. 4505, 1980), and the pH is 5-8. It is desirable that The cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
  • the host is an animal cell, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum (Science, Vol. 122, pp. 501, 1952), a DMEM medium (Virology) ), Vol. 8, pp. 396, 1959), RPMI 1640 medium (J. Am. Med. Assoc., Vol.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 15 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring can be carried out.
  • the host is an insect cell
  • Grace's medium containing fetal bovine serum Pro Natl. Acad. Sci. USA Vol. 82, p. 8404, 1985
  • the cultivation is usually performed at about 20 to 40 ° C. for 15 to 100 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
  • the receptor of the present invention enables high expression of a target molecule on the cell surface by culturing the above-described transformed cell, particularly an animal cell.
  • the protein of the present invention is produced as a soluble protein such as an extracellular region protein fragment
  • the DNA is used to transform the extracellular region or the DNA encoding each domain as described above.
  • the transformant can be prepared by culturing the transformant and secreting it into a culture supernatant.
  • a culture filtrate (supernatant) is obtained from the obtained culture by a method such as filtration or centrifugation, and the present invention is subjected to a conventional method generally used for purifying and isolating a natural or synthetic protein from the culture filtrate. Purify and isolate the protein.
  • isolation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, and methods using molecular weight differences such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Methods using charge such as ion exchange chromatography and hydroxyapatite chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, and differences in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method utilizing the difference in isoelectric points such as isoelectric focusing.
  • the culture is subjected to a conventional method such as filtration or centrifugation to collect the cells or cells.
  • the membrane fraction containing the protein of the present invention is suspended in a buffer solution, and the cell wall and / or the cell membrane of the cells and the like is disrupted by ultrasonic lysozyme and freeze-thawing, for example, and then centrifuged or filtered. Get.
  • the membrane fraction is solubilized using a surfactant such as Triton-X100 to obtain a crude solution. Then, the crude solution can be isolated and purified by using a conventional method as exemplified above.
  • transgenic non-human mammal that is, the human-derived DNA Is integrated on the endogenous locus of a non-human mammal (eg, mouse).
  • a non-human transgenic mammal that expresses and secretes the protein of the present invention encoded by the DNA in the body Can be produced.
  • This transgenic non-human mammal also belongs to the invention of the present application.
  • the transgenic non-human mammal can be prepared by a conventional method used in the production of transgenic animals (for example, the latest manual for animal cell experiments, published by LCI, Chapter 7, Chapter 36). 1 to 408, see 1990).
  • an embryonic stem cell obtained from a normal mouse blastocyst (blastcyst) encodes the human-derived protein of the present invention. Transformation is performed with an expression vector into which a gene and a marker gene (eg, a neomycin resistance gene) have been inserted so as to allow expression.
  • ES cells in which the gene encoding the human protein of the present invention has been integrated on an endogenous gene are selected by a conventional method based on the presence or absence of the marker gene.
  • the selected ES cells are microinjected into fertilized eggs (blastocysts) obtained from another normal mouse (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, No. 12, pp. 7380- 7384, 1980; U.S. Pat. No. 4,873,191).
  • the blastocysts are implanted into the uterus of another normal mouse as a foster mother. Then, a founder mouse (child mouse) is born from the foster parent mouse.
  • a heterotransgenic mouse is obtained by crossing the Huawunda mouse with a normal mouse. By crossing the heterogeneic transgenic mice, a homogenic transgenic mouse is obtained according to Mendel's law.
  • a so-called “knockout mouse” can be prepared based on the nucleotide sequence of DNA encoding a protein derived from a mouse included in the present invention.
  • the “knockout mouse” in the present invention is a mouse in which an endogenous gene encoding a mouse-derived protein of the present invention has been knocked out (inactivated).
  • a positive negative selection method utilizing homologous recombination (US Patent Nos. 5,464,764, 5,487,992, 5,627,059, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.86, 8932-8935, 1989, Nature, Vol.342 , 435-438, 1989), and such a knockout mouse is also one embodiment of the present invention.
  • the “antibody” in the present invention means a polyclonal antibody (antiserum) or a monoclonal antibody, and is preferably a monoclonal antibody.
  • the “antibody” of the present invention is a protein of the present invention (natural, recombinant, synthetic, cell, etc.) or a fragment thereof, or the target protein is highly expressed on the cell surface by the above-described gene recombination technique.
  • Natural antibodies obtained by immunizing mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, and egrets with chimeric antibodies and human antibodies that can be produced by genetic recombination techniques (transformants). CDR-grafted antibodies), and human antibodies that can be produced using human antibody-producing transgenic animals and the like.
  • a monoclonal antibody having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE is also included. Preferably, it is IgG or IgM.
  • the polyclonal antibody (antiserum) or monoclonal antibody referred to in the present invention can be produced by an existing general production method. That is, for example, an antigen may be added together with Freund's adjuvant, if necessary, to a mammal, Preferably, it immunizes a mouse, a rat, a hamster, a guinea pig, a rabbit, a cat, a dog, a dog, a goat, a dog or a rabbit, and more preferably a mouse, a rat, a hamster, a guinea pig or a rabbit.
  • the polyclonal antibody can be obtained from serum obtained from the immunized animal.
  • a monoclonal antibody is prepared by preparing a hybridoma from the antibody-producing cells obtained from the immunized animal and a myeloma cell line (myeloma cells) having no autoantibody-producing ability, cloning the hybridoma, It is produced by selecting a clone that produces a monoclonal antibody exhibiting specific affinity for the antigen used for immunizing the animal.
  • the monoclonal antibody can be specifically produced as follows. That is, using the above-described protein of the present invention or a fragment thereof or a cell expressing the protein as an immunogen, the immunogen may be used together with Freund's adjuvant (FreuncTs Adjuvant), if necessary, to obtain a mouse. Rats, hamsters, guinea pigs or egrets, preferably mice, rats or hamsters (including transgenic animals produced to produce antibodies from other animals, such as transgenic mice producing human antibodies). 1) Immunize by subcutaneous, intramuscular, intravenous, hoodpad or intraperitoneal injections or transplantation. Usually, immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 14 days after the first immunization, and antibody producing cells are obtained from the immunized mammal about 1 to 5 days after the last immunization.
  • Freund's adjuvant FreuncTs Adjuvant
  • the preparation of the hybridoma secreting the monoclonal antibody was carried out according to the method of Keller and Mirushi Utain (Nature, Vol. 256, pp. 495-497, 1979) and It can be performed according to a modification method according to it. That is, the antibody-producing cells contained in the spleen, lymph node, bone marrow, tonsil, etc., preferably in the spleen, obtained from the mammal immunized as described above, and preferably mouse, rat, guinea pig, hamster, pea or Cell fusion with myeloma cells that are not capable of producing autoantibodies derived from mammals such as humans, more preferably mouse, rat or human It is prepared by allowing
  • Myeloma cells used for cell fusion include, for example, mouse-derived myeloma
  • P3 / X63-AG8.653 (653; ATCC No.CRL1580), P3 / NSI / l-Ag4-l (NS-1), P3 / X63-Ag8.Ul (P3U1), SP2 / 0-Agl4 (Sp 2 / ⁇ , Sp 2), PAI, FO or BW5147, rat myeloma 210RCY3-Ag.2.3., Human myeloma U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM- AGR, D1R11 or CEM-T15 can be used.
  • Screening for hybridoma clones producing monoclonal antibodies is performed by culturing hybridomas, for example, in a microtiter plate, and using the culture supernatant of the growing gel against the immunizing antigen used in the mouse immunization described above.
  • the reactivity can be measured by, for example, measuring an enzyme immunoassay such as RIA or ELISA.
  • the production of monoclonal antibodies from Hypri-doma is carried out in vitro, or in vivo, for example, in mice, rats, guinea pigs, hamsters, or egrets, preferably in mice or rats, more preferably in ascites of mice. It can be performed by isolating from the obtained culture supernatant or ascites of a mammal.
  • hybridomas When culturing in vitro, hybridomas are grown, maintained, and stored according to various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test and research, and the culture method, and the monoclonal antibody is produced in the culture supernatant. It can be carried out using any known nutrient medium or any nutrient medium derived and prepared from a known basal medium.
  • a low calcium medium such as Ham, F12 medium, MCDB 153 medium or low calcium MEM medium and MCDB 104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI 1640 medium, ASF 104 medium or A high calcium medium such as an RD medium
  • the basic medium can be, for example, depending on the purpose. For example, it may contain serum, hormones, site-in and Z or various inorganic or organic substances.
  • the culture supernatant or ascites described above was purified from the saturated ammonium sulfate, euglobulin sedimentation method, forceproic acid method, forceprillic acid method, ion-exchange chromatography (0.8 or 0%). £ 52, etc.) and affinity column chromatography such as an anti-immunoglobulin column or a protein A column.
  • a gene encoding a monoclonal antibody is cloned from the hybridoma, and the transgenic peacock in which the antibody coding gene has been incorporated into an endogenous gene using transgenic animal production technology. It is also possible to produce goats, goats, sheep or bush, and obtain large quantities of monoclonal antibodies derived from the antibody gene from the milk of the transgenic animal (Japanese Science, April 1997 issue). Pp. 78-84).
  • the “chimeric antibody” in the present invention is a monoclonal antibody produced by genetic engineering.
  • the variable region is a variable region derived from murine immunoglobulin
  • the constant region is A chimeric monoclonal antibody such as a mouse / human chimeric monoclonal antibody characterized by being a constant region derived from human immunoglobulin.
  • the constant region derived from human immunoglobulin has a unique amino acid sequence depending on the isotype, such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE.
  • the constant region of the antibody may be a human immunoglobulin constant region belonging to any isotype. Preferably, it is the constant region of human IgG.
  • the chimeric monoclonal antibody in the present invention can be produced, for example, as follows. However, it is needless to say that the present invention is not limited to such a manufacturing method.
  • a mouse / human chimeric monoclonal antibody can be prepared with reference to Experimental Medicine (Extra Extra Number), Vol. 1.6, No. 10, 1988, and Japanese Patent Publication No. 3-73280. That is, downstream of an active VH gene (rearranged VDJ gene encoding a heavy chain variable region) obtained from DNA encoding a mouse monoclonal antibody isolated from a hybridoma producing a mouse monoclonal antibody.
  • the C H gene (C gene encoding the H chain constant region) obtained from DNA encoding human immunoglobulin and the activity obtained from DNA encoding a mouse monoclonal antibody isolated from the hybridoma were used.
  • a V L gene (L chain variable region encoding the rearranged VJ genes)
  • C gene encoding the C L gene (L-chain constant region obtained human immuno Glo impossible emissions from copolyesters one de to DNA downstream of the )
  • a host cell is transformed with the expression vector, and the transformed cell is cultured. It can be prepared by Rukoto.
  • DNA is extracted from a mouse monoclonal antibody-producing hybridoma by a conventional method, and the DNA is digested with an appropriate restriction enzyme (for example, EcoRI, HindIII, etc.) and subjected to electrophoresis.
  • an appropriate restriction enzyme for example, EcoRI, HindIII, etc.
  • electrophoresis for example, use 0.7% agarose gel
  • Southern blot method The electrophoresed gel is stained with, for example, an ethidium die, and after photographing, the marker is attached. The gel is washed twice with water and immersed in 0.25M HCl solution for 15 minutes. Then soak in 0.4N NaOH solution for 10 minutes, while gently shaking. Transfer to Phil Yuichi by the usual method, and after 4 hours, collect Phil Yuichi and wash twice with 2 XSSC.
  • the filter After thoroughly drying the filter, perform pacing (75 ° C, 3 hours). After completion of the pacing, the fill is put into a 0.1 ⁇ SSC / 0.1% SDS solution and treated at 65 ° C. for 30 minutes. Then soak in 3 x SSC / 0.1% SDS solution. The obtained filter is put in a plastic bag together with the pre-hybridization solution, and treated at 65 ° C. for 3 to 4 hours.
  • the probe DNA labeled with 32 P and the hybridization solution were added thereto. And react at 65 ° C for about 12 hours. After completion of the hybridization, wash the filter under the appropriate salt concentration, reaction temperature and time (eg, 2 XSSC-0.1% SDS solution, room temperature, 10 minutes). Place the film in a plastic bag, add a small amount of 2XSSC, seal, and perform autoradiography.
  • reaction temperature and time eg, 2 XSSC-0.1% SDS solution, room temperature, 10 minutes.
  • the rearranged VDJ gene and VJ gene encoding the H chain and L chain of the mouse monoclonal antibody are identified by the Southern blot method described above.
  • the region containing the identified DNA fragment is fractionated by sucrose density gradient centrifugation, integrated into a phage vector (for example, Charon 4A, Charon 28, human EMBL 3, human EMBL 4, etc.), and the phage vector Transform Escherichia coli (eg, LE392, NM539, etc.) with to generate a genomic library.
  • a phage vector for example, Charon 4A, Charon 28, human EMBL 3, human EMBL 4, etc.
  • the phage vector Transform Escherichia coli eg, LE392, NM539, etc.
  • the Benton Davis method (Science, Vol. 196, 180-182) can be used.
  • plaque hybridization is performed to obtain positive clones containing the rearranged VDJ gene or VJ gene, respectively. Create a restriction map of the clone obtained, determine its nucleotide sequence, and confirm that the desired rearranged gene containing the VH (VDJ) or VL (VJ) gene has been obtained. I do.
  • human C H gene and human C L gene used for chimerization.
  • C / c gene is C ⁇ 1 gene
  • C L gene is C H gene.
  • These genes probe the mouse CA1 gene and mouse CA gene corresponding to the human CA1 gene and human CA: gene by utilizing the high homology of the nucleotide sequences of the mouse immunoglobulin gene and the human immunoglobulin gene. And can be obtained by isolating from a human genome library.
  • human Ca1 gene for example, after cutting human fetal hepatocyte DNA with Hind111 and fractionating by agarose gel electrophoresis, a 5.9 kb band was inserted into 788, and the above probe was used. Use to isolate.
  • the chimeric gene insertion and expression vector thus prepared can be used for protoplast fusion, DEAE-dextran, and calcium phosphate methods for myeloma cells that do not produce antibodies themselves, for example, P3X63'Ag8'653 cells or SP210 cells. Or, it is introduced by electroporation.
  • the transformed cells are selected by culturing in a drug-containing medium corresponding to the drug resistance gene introduced into the expression vector to obtain the desired chimeric monoclonal antibody-producing cells.
  • the desired chimeric monoclonal antibody is obtained from the culture supernatant of the antibody-producing cells thus selected.
  • the “human-type antibody (CDR-grafted antibody)” in the present invention is produced by genetic engineering. Specifically, for example, part or all of the complementarity-determining region of the hypervariable region is a complementarity-determining region of a hypervariable region derived from a mouse monoclonal antibody.
  • the human-type monoclonal antibody is characterized in that the framework region is a framework region of a variable region derived from human immunoglobulin, and the constant region is a constant region derived from human immunoglobulin.
  • the complementarity-determining regions of the hypervariable region are three regions (Complementarity-determining residue; CDR 1, CDR1) that are present in the hypervariable region in the variable region of the antibody and are sites that directly bind complementarily to the antigen.
  • CDR2, CDR3 and the framework region of the variable region means four relatively conserved regions (Framework; FR1, FR2, FR3, FR4) intervening before and after the three complementarity-determining regions. Point to.
  • it means a monoclonal antibody in which all regions other than part or all of the complementarity determining region of the hypervariable region of a mouse monoclonal antibody have replaced the corresponding region of human immunoglobulin.
  • the constant region derived from human immunoglobulin has an amino acid sequence unique to each of isotypes such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, but the constant region of the humanized monoclonal antibody in the present invention It may be a constant region of human immunoglobulin belonging to the following isotype. Preferably, it is a human IgG constant region. Further, the framework region of the variable region derived from human immunoglobulin is not limited.
  • the humanized monoclonal antibody in the present invention can be produced, for example, as follows. However, it is needless to say that the present invention is not limited to such a manufacturing method.
  • a recombinant humanized monoclonal antibody derived from a mouse monoclonal antibody can be prepared by genetic engineering with reference to Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-506458 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-296890. it can. That is, at least one mouse H chain CDR fragment was isolated from a hybridoma producing a mouse monoclonal antibody. Isolating the gene and at least one mouse L chain CDR gene corresponding to the mouse H chain CDR gene; and encoding all regions other than the human H chain CDR corresponding to the mouse H chain CDR from the human immunoglobulin gene. And a human L chain gene encoding the entire region other than the human L chain CDR corresponding to the pre-mouse L chain CDR.
  • the isolated mouse H chain CDR gene and the human H chain gene are introduced into an appropriate expression vector so that they can be expressed, and the mouse L chain CDR gene and the human L chain gene can be expressed in the same manner. Introduce into another suitable expression vector.
  • the mouse H chain CDR gene / human H chain gene and mouse L chain CDR gene / human L chain gene can be introduced so that they can be expressed in the same expression vector.
  • human antibody means that all regions including the variable region of the H chain and the constant region of the H chain, and the variable region of the L chain and the constant region of the L chain which constitute immunoglobulin are human immunoglobulin. It is an immunoglobulin derived from a gene that encodes
  • Human antibodies can be obtained by immunizing a transgenic animal produced by integrating at least a human immunoglobulin gene into a genetic locus of a mammal other than human, such as a mouse, with an antigen according to a conventional method. It can be produced in the same manner as in the method for producing a polyclonal antibody or a monoclonal antibody described above.
  • transgenic mice that produce human antibodies are described in Nature Genetics, Vol. 15, pp. 146-156, 1997; Nature Genetics, Vol. 7, pp. 13-21. Page, 1994; Japanese Translation of PCT International Publication No. 4-504365; International Application Publication No. WO 94/25585; Nikkei Science, June, pp. 40-50, 1995; 368, 856-859, 1994; and JP-T-6-500233.
  • part of an antibody in the present invention means a region of the above-mentioned antibody of the present invention, preferably a part of a monoclonal antibody, and specifically, F (ab,) 2 , Fab, ⁇ Fab, FV (variable fragment of antibody), s Fv, d sFv (dis ulphide stabilised Fv) or dAb (single domain antibody) (Expert Opinion on 'Therapeutic Patent (Exp. Opin. Ther. Patents), 6, No. 5, pp. 441-456, 1996).
  • F (ab,) 2 and “F ab,” are manufactured by treating immunoglobulin (monoclonal antibody) with pepsin or papain, which is a proteolytic enzyme.
  • immunoglobulin monoclonal antibody
  • papain which is a proteolytic enzyme.
  • the “cells producing a monoclonal antibody reactive to evening protein or a fragment thereof” of the present invention means any cells producing the above-described monoclonal antibody of the present invention.
  • the protein of the present invention obtained by immunizing a non-human mammal with the protein of the present invention, a fragment thereof, or a cell producing the protein as described above; (2) a monoclonal antibody-producing B cell derived from the non-human mammal that produces a monoclonal antibody reactive with the protein or a part thereof;
  • the above-mentioned hybridoma (fused cell) obtained by cell fusion with a cell, or (3) the gene encoding the monoclonal antibody isolated from the monoclonal antibody-producing B cell or the monoclonal antibody-producing hybridoma (duplicate).
  • the transformed monoclonal antibody-producing cell according to (3) is a gene set that produces a recombinant of a monoclonal antibody produced by the B cell (1) or the hybridoma of (2). It means a transgenic cell.
  • the recombinant monoclonal antibody-producing cells can be produced in the same manner as the method used in the production of the above-described chimeric monoclonal antibody and human antibody.
  • composition refers to a medicament comprising the protein of the present invention or a fragment thereof, an antibody or a part of the antibody as defined above, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a composition comprising the protein of the present invention or a fragment thereof, an antibody or a part of the antibody as defined above, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, coloring agents, sweeteners, thickeners. And flavoring agents, solubilizing agents or other additives.
  • tablets, pills, powders, granules, injections, liquids, capsules, troches, elixirs, suspensions, emulsions or syrups can be used.
  • a composition can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration examples include topical solutions containing one or more active substances and formulated in a conventional manner, suppositories and pessaries for enteric administration.
  • the dosage varies depending on the age, sex, weight and condition of the patient, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of active ingredient (such as the protein or antibody) contained in the pharmaceutical composition, but is usually used for adults.
  • the dose can be in the range of 10 mg to 100 mg (or 10 zg to 500 mg) per dose per person. However, the dose varies depending on various conditions, so that a dose lower than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be necessary.
  • the concentration of 0.1 g antibody / ml carrier to 10 mg antibody / ml carrier in a non-toxic pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection can be produced by dissolving or suspending so that The injection thus produced is applied to a human patient in need of treatment at a rate of 1 to 100 mg, preferably 50 to 50 mg per kg of body weight per administration. In proportion, it can be administered once to several times a day.
  • the administration form include medically suitable administration forms such as intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and intraperitoneal injection. Preferably, it is an intravenous injection.
  • Injectables are sometimes prepared as non-aqueous diluents (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions and emulsions. You can also.
  • non-aqueous diluents eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic illustration of the differences in the protein secondary structures of CSR 1, # 312 and # 3 R3, which are splice variants of human CSR.
  • A, B, B ,,, C, D, E, E, and F represent exon units, and the number attached to each exon unit indicates the approximate number of bases in the DNA encoding the exon. .
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the secondary structures of proteins of human CSR 1 and CSR2.
  • the numbers in the figure indicate amino acid numbers when counted from the N-terminus.
  • FIG. 3 Schematic representation of the secondary structure of the protein of the macrophage force benger receptor.
  • Fig. 4 Diagram showing the protein-substructure of human CSR 1.
  • Figure 5 (a) is a diagram showing the position of the human CSR gene on the human chromosome, analyzed by the FISH method. The two white dots (about 0.3 mm) at the end of the arrow indicate the 8q21 site where the CSR gene is present.
  • Figure 5 (b) is a diagram showing the mapping of chromosomes of metaphase human cells on the R-staining karyotype.
  • FIG. 6 is a view showing the expression status of human RNA of human CSR in various human tissues analyzed by Northern blotting.
  • FIG. 7 is a diagram showing the gel electrophoresis state of CS Rc DNA amplified by the RT-PCR method in an analysis test for the presence or absence of regulation of CSR gene expression by the p53 protein.
  • W shows the test results using human colon cancer cell SW480 transformed with the native p53 gene
  • M shows the test results using the SW480 transformed with the mutant p53 gene.
  • the numbers in the upper row indicate the time over which RNA was obtained.
  • FIG. 4 is a view showing a gel electrophoresis state of a CSR cDNA obtained by the ⁇ method.
  • Lane 1 shows the test results using normal human fibroblast NHDF4042 as the host cell.
  • Lane 2 shows test results using human cervical cancer-derived epithelial-like cells Hela as host cells
  • Lane 3 shows test results using human lung cancer cells H1299 as host cells
  • Lane 4 shows human esophageal cancer cells as host cells
  • Lane 5 shows the test results using human neuroglioma T98G as the host cell
  • lane 6 shows the test results using human neuroglioma U87MG as the host cell
  • lane 5 shows the test results using TE10.
  • 7 shows the test result using human tumor cell SKBR3 as the host cell
  • lane 8 shows the test result using human colon cancer cell SW480.
  • W indicates that the cell expresses the native p53
  • M indicates that the cell expresses the mutant P53 gene.
  • FIG. 9 is a diagram showing the expression status of CSR mRNA by Northern plotting in an analysis test for the presence or absence of transcriptional regulation of the CSR gene due to serum starvation stress.
  • the diagram shows the test results using human normal fibroblast NHDF4042, human colon cancer cell SW480, human glioblastoma neuronal T98G, and human esophageal cancer cell TE13, respectively.
  • plus (+) and minus (1) indicate the results with and without serum starvation stress, respectively.
  • FIG. 10 is a diagram showing the expression status of CSR mRNA by Northern blotting in an analysis test for the presence or absence of transcriptional regulation of the CSR gene due to ultraviolet irradiation stress.
  • the numbers at the top of the figure indicate the intensity of UV irradiation.
  • Fig. 11 Diagram showing the expression status of CSR mRNA by Northern processing in an analysis test for the presence or absence of transcriptional regulation of the CSR gene due to hydrogen peroxide stress.
  • the numbers at the top of the figure indicate the concentration of hydrogen peroxide.
  • FIG. 12 is a diagram showing the expression state of CSRmRNA by Northern blotting in an analysis test for the presence or absence of transcriptional regulation of the CSR gene due to heat shock stress.
  • the numbers at the top of the figure indicate the time over time after the heat shock was given.
  • FIG. 13 (a) shows the cytoplasmic distribution of the CSR protein analyzed by immunocytochemical staining using an anti-HA polypeptide polyclonal antibody.
  • FIG. 13 (b) is a diagram showing the positions of nuclei obtained by staining with DAP I.
  • Fig. 14 Diagram showing the inhibitory effect of CSR on cell death caused by UV irradiation stress.
  • Fig. 15 Diagram showing the inhibitory effect of CSR on cell death caused by hydrogen peroxide stress.
  • Fig. 16 (a) shows the protein secondary structure of human CSR1.
  • Figure 16 (b) is a diagram showing the protein-substructure of human CSR2.
  • the numeral (451) at the left end of the amino acid sequence shown in FIG. 16 (b) means that it is the 451st amino acid of human CSR2 protein, and the amino acids at amino acid numbers 1 to 450 are shown in FIG. 16 (b). This shows that the amino acid sequence is identical to the amino acid sequence of amino acids 1 to 450 of human CSR1 protein.
  • the dark boxed area indicates the estimated position of the helical coiled col domain.
  • the boxed box indicates the putative location of the N-terminal transmembrane region.
  • the portion surrounded by a rectangle similar to an ellipse indicates an N-linked sugar chain binding site.
  • the double underline indicates the position of the leucine zipper structure (repeated leucine is shown in slightly larger letters).
  • a region surrounded by a bold square indicates a collagen-like domain having a G-X-Y repeating structure.
  • FIG. 17 Structure of genomic DNA encoding human CSR protein and primary structure of splicing variants CSR 1 and CSR2 proteins The figure which shows a difference typically.
  • the black vertical regions 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 6 "represent exon units.
  • the nucleotide sequence shown in the figure shows that the p53 protein binding region has the second intron. Indicates that it is present in
  • Fig. 1 Diagram showing the gel electrophoresis state of the nuclear extract of the transformant under various conditions in the EMSA test for analyzing the presence or absence of CSR gene expression regulation by the 8p53 protein.
  • Fig. 19 Figure showing the gel electrophoresis state of CSR cDNA by amplification by the T-PCR method in the analysis of the expression status of CSR gene in various cells.
  • FIG. 20 Fig. 20 (a) is a view showing the expression state of CSRmRNA by Northern blotting in an analysis test on the presence or absence of transcriptional regulation of the CSR gene by ultraviolet irradiation stress. The numbers at the top of the figure indicate the intensity of UV irradiation.
  • FIG. 20 (b) is a diagram showing the expression status of CSR mRNA by Northern blotting in an analysis test for the presence or absence of transcriptional regulation of the CSR gene by hydrogen peroxide stress. The numbers at the top of the figure indicate the concentration of hydrogen peroxide.
  • Fig. 21 Diagram showing the expression status of CSR mRNA by Northern plotting in an analysis test for the presence or absence of transcriptional regulation of the CSR gene by adriamycin (ADR). The numbers at the top of the figure indicate the concentrations of adriamycin.
  • FIG. 22 is a diagram showing the expression status of CSR mRNA by Northern blotting in an analysis test of the effect of an antioxidant on the induction of transcription of the CSR gene by intracellular stress given by ultraviolet irradiation and hydrogen peroxide.
  • FIG. 23 is a diagram showing a gel electrophoresis state of CS R c DNA amplified by the RT-PCR method in an analysis test for the presence or absence of CSR gene expression regulation by various reagents.
  • Figure 23 (a) shows the results when using DEM
  • Figure 23 (b) shows the results when using PMA (TPA)
  • Figure 3 (c) shows the results when using sodium azide
  • Fig. 23 (d) shows the results when using sodium arsenite
  • Fig. 23 (e) shows the results when using GSN0
  • Fig. 23 (f) shows the results when using SNP.
  • FIG. 24 is a diagram showing the gel electrophoresis state of various cDNAs amplified by the RT-PCR method in the analysis of whether or not the expression of various genes is regulated by Hemin and hydrogen peroxide.
  • FIG. 24 (a) shows the presence or absence of induction of gene expression over time by Hemin
  • FIG. 24 (b) shows the presence or absence of induction of gene expression over time by hydrogen peroxide.
  • the numbers in the upper row indicate the time over which RNA was obtained.
  • Figure 25 shows the cytoplasmic expression of the CSR protein, analyzed by immunocytochemical staining of cells transformed with an empty expression vector without CSRcDNA using an anti-HA epitope polyclonal antibody. The figure which shows distribution.
  • FIG. 25 (b) is a diagram showing the location of nuclei of cells transformed with an empty expression vector without CSR cDNA by DAP I staining.
  • Figure 25 (c) shows the cytoplasmic distribution of the CSR protein analyzed by immunocytochemical staining of cells transformed with an expression vector that expresses CSR cDNA using an anti-HA epitope polyclonal antibody.
  • FIG. 25 (d) is a diagram showing the nucleus position of cells transformed with an expression vector expressing CSR cDNA by DAP I staining.
  • Figure 25 (e) shows that cells transformed with an expression vector that expresses CSR cDNA were analyzed by immunocytology dangling staining using an anti-Golgi -58K protein antibody. The figure which shows the distribution in the cytoplasm of a protein.
  • FIG. 25 (f) shows the nucleus position of cells transformed with an expression vector that expresses CSR cDNA by DAP I staining.
  • Figure 25 (g) shows a cell obtained by immunocytochemical staining using anti-Golgi-58K protein antibody to analyze cells transformed with an expression vector expressing CSR cDNA subjected to oxidative stress by hydrogen peroxide.
  • FIG. 25 (h) is a diagram showing the location of nuclei of cells transformed with an expression vector expressing CSR cDNA subjected to oxidative stress by hydrogen peroxide by DAP I staining.
  • Fig. 26 Diagram showing the inhibitory effect of CSR protein on cell death caused by UV irradiation stress.
  • Fig. 27 Diagram showing changes in the amount of reactive oxygen species in cells, measured by flow cytometry overnight.
  • FIG. 27 (a) is a diagram showing a change in the amount of reactive oxygen species in the control H1299-vector group.
  • FIG. 27 (b) is a graph showing changes in the amount of reactive oxygen species in the H1299-CSR1 group.
  • FIG. 27 (c) shows the change in the amount of reactive oxygen species in the H1299-CSR2 group.
  • Figure 27 (d) is a diagram showing the change in the amount of reactive oxygen species in the CSR1 / CSR2 group.
  • FIG. 28 is a diagram showing temporal changes in cell morphology induced by hydrogen peroxide.
  • FIG. 28 (a) is a diagram showing the morphology of cells in the H1299-vector group when hydrogen peroxide is not added.
  • FIG. 28 (b) shows the morphology of cells in the H1299-vector group immediately after adding hydrogen peroxide.
  • FIG. 28 (c) is a diagram showing the morphology of cells of the H1299-vector group after culturing for 1 hour with the addition of hydrogen peroxide.
  • FIG. 28 (d) shows the morphology of cells of the H1299-vector group after culturing for 3 hours with the addition of hydrogen peroxide.
  • FIG. 28 (e) shows the morphology of cells in the CSIQ / CSI12 group when hydrogen peroxide was not added.
  • Figure 28 (f) shows the morphology of cells in the CSR1 / CSR2 group immediately after adding hydrogen peroxide.
  • Figure 28 (g) shows the CSR1 / CSR2 group after culturing for 1 hour with hydrogen peroxide. The figure which shows the form of the cell of FIG.
  • FIG. 28 (h) is a diagram showing the morphology of cells in the CSR1 / CSR2 group after culturing for 3 hours with the addition of hydrogen peroxide.
  • FIG. 29 Mouse Figure showing Yuichi's structure for creating a CSR gene knockout mouse.
  • Example 1 Obtaining Human Genomic DNA Fragments That Interact (Bind) with Tumor Suppressor Protein p53
  • a human genomic DNA fragment that binds to p53 was obtained using a yeast expression system in which the tumor suppressor protein P53 was expressed and the human genomic DNA cloned upstream of the selective reporter gene was expressed. (Tokino et al., Human Molecular Genetics, Vol. 3, No. 9, 1537-1542, 1994).
  • the GAL1 promoter in the natural tumor suppressor gene P53 expression vector PRS314-SN (Nigro, JM, et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 12, 1357-1365, 1992) was converted to the PGK promoter overnight. Substitution was performed to construct plasmid PRS314-PGK-p53.
  • the Xhol-BamHI fragment containing the p53 cDNA excised from pRS314-SN was synthesized with Sail and Ba of plasmid pPGK (Poon, D. et al., Mol. Cell Biol., Vol. 11, 4809-4821, 1991). Subsite at lI site After cloning, plasmid pPGK-SN was constructed.
  • PGK promoter / p53cDNA / PGK Kpnl-Sacl fragment of pPGK-SN consisting of one minute and one minute was converted to plasmid pRS314 (Sikorski, RS, et al., Genetics, Vol. 122, 19-27, 1989) to construct the plasmid PRS314-PGK-p53.
  • the obtained DNA was used for yeast transformation by the PEG / lithium acetate method (Gietz, D., et al., Nucleic Acids Res., Vol. 20, 1425, 1992).
  • the yeast YPH686 containing the P53 expression vector PRS314-PGK-P53 was sown in an SD-Trp medium (100 ml) and cultured overnight (1 ⁇ 10 7 cells / ml). The culture was washed with sterile water and resuspended in sterile water (10 ml).
  • the cells were washed with LiAc / TE (10 ml) (0.1 M LiAc (pH 7.5), 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), ImM EDTA), and then resuspended in LiAc / TE (lxlO 9 cells / ml).
  • the yeast cell suspension (0.2 ml) was used for transformation (2 g; 1 (1XTE)), single-stranded salmon sperm DNA (100 ⁇ g; 10 g / jl), and a 40% sterile PEG solution (0.6%).
  • ml) (40% polyethylene glycol 4000 / LiAc / TE). The obtained cell mixture was cultured at 30 ° C.
  • the cell pellet was resuspended in IXTE (0.2 ml), plated on an SD-trp-ura plate, and cultured at 30 ° C for 3 days.
  • IXTE 0.2 ml
  • One reporter plasmid library (1 mg) was transformed and plated on 500 plates. Each plate contains about 2Xl0 4 clones.
  • the yeast transformants were recovered from the plates, pooled in 10-plate increments, and It was resuspended in lyserol (v / v), 0.1 M magnesium sulfate and 25 mM Tris-HCl (pH 8) and stored at 180 ° C.
  • Yeast cells (O.lml) diluted to 10 at 600 nm absorbance were plated on selective SD-trp-ura-his plates and cultured at 30 ° C for 5 days. The number of live yeast cells was determined by plating a small amount of the transformant on a non-selective SD-trp-ura plate. After each histidine-requiring (HIS +) positive cell was cultured in SD-ura medium, the extracted DNA was introduced into a Ura-deficient E. coli strain KC8. The HIS3 activity of the recovered repo overnight plasmid in the yeast was tested in the presence and absence of the p53 expression vector.
  • each of the repo overnight plasmid and the expression plasmid were introduced into a yeast EGY 048 cell line (Gyuris, J., et al., Cell, Vol. 75, 791-803, 1993) to obtain a yeast transformant. .
  • the cells were cultured overnight at 30 ° C. in a synthetic medium containing roughinose as a carbon source.
  • the culture solution was diluted to 0.1 at 600 nm absorbance in a medium containing raffinose (1%) and galactose (1%), cultured for 19 hours, and then subjected to galactosidase assay (Kern, SE). Et al., Science, Vol. 256, 827-830, 1992).
  • Each of the resulting plasmids was used to transform a yeast cell line containing a p53 expression vector or an empty control vector without the p53 gene.
  • 273 clones (29%) were p53 dependent.
  • the 273 P53-reactive plasmids were analyzed by restriction enzyme digestion and nucleotide sequence analysis.
  • the 273 clones contained 57 different Mbol digested fragments.
  • the inserted nucleotide sequence in each clone was determined using the sequence outside (immediately / immediately) the cloned site as a primer (for further details, see above 13>).
  • the cosmid library used in the present invention was prepared according to “Lab Manual Human Genome Mapping” (edited by Masaaki Hori and Yusuke Nakamura, Maruzen Publishing, pp. 41-48). The method is briefly described below.
  • the vector DNA (lg) and the genomic DNA (l jug) were ligated with 10x ligation buffer (Tris-HCl (0.5 M (pH 7.5)), 100 mM magnesium chloride, 10 OmM dithiothreitol, 500 / g / ml (Serum albumin), 20 mM ATP, 50 polyethylene glycol 8000, 1 M sodium chloride, T4 DNA ligase (Boehringer) and a mixture of distilled water.
  • 10x ligation buffer Tris-HCl (0.5 M (pH 7.5)
  • 100 mM magnesium chloride 100 mM magnesium chloride
  • 10 OmM dithiothreitol 500 / g / ml
  • 20 mM ATP 50 polyethylene glycol 8000, 1 M sodium chloride
  • T4 DNA ligase Boehringer
  • Example 3 Screening of human genomic DNA cosmid library
  • each clone was digested with BamHI and Bglll, and ligated to the exon trapping vector pSPL3 (GIBC0-BRL). Then, using a marathon cDNA amplification kit (Clontech), 5 'RACE-PCR and 3' RACE-PCR (Rapid Amplification Ends-PCR) (Proc. Natl. Aca. Sci. USA, Vol. 85, 8998-9002, 1988 and "Gene Amplification PCR Method: Basics and New Developments", published by Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 1992), and insertion of a total of 29 exon-like sequences into 18 cosmid clones was confirmed. Was.
  • Example 4 Screening of human cDNA library to obtain cDNA fragment encoding human CSR protein (Cellular Sensor-Related protein, scavenger receptor)
  • the whole genomic DNA sequence of cosmid 2 (clone number 2), one of the cosmid clones in which the insertion of the exon-like sequence was confirmed, was analyzed using a 377ABI automatic nucleotide sequencer (Perkin Elmer).
  • One exon sequence analyzed was named 2E1 (SEQ ID NO: 4).
  • the exon sequence site in the genomic DNA sequence was estimated using computer software Grai 12 and Hexon.
  • the clone includes a cDNA fragment encoding the CSR protein (abbreviation for Cellular Sensor-Related protein; also referred to as scavenger receptor) of the present invention.
  • CSR protein abbreviation for Cellular Sensor-Related protein
  • scavenger receptor a cDNA fragment encoding the CSR protein
  • thermocycler Thermocycler; manufactured by Perkin Elmer Cetus
  • the mixed cDNA solution contained 40 ng of cDNA, 1 ⁇ PCR buffer (containing 6.7 mM Tris (pH 8.8), 16.6 mM ammonium sulfate, 6.7 M EDTA and 10 mM // mercaptoethanol), and 25 pmol of sense primer. 1. 25 pmol of antisense primer, 0.5 U of Taq DNA polymerase (manufactured by TAKMA), 250 ⁇ M of deoxynucleotide, 10% of DMS0, and 7.6 mM of magnesium chloride.
  • Each PCR cycle consisted of a reaction at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. However, in the final PCR step, the temperature was 72 ° C for 5 minutes.
  • the resulting PCR product was subjected to 3% agarose gel electrophoresis, transferred to an N + nylon membrane (manufactured by PALL), and hybridized using an internal oligonucleotide probe F12 (SEQ ID NO: 8). .
  • a marathon cDNA amplification kit manufactured by Clonetech was used to amplify cDNA by 5 ′ RACE-PCR and 3 ′ RACE-PCR, and to obtain 5 ′ of each long cDNA sequence. The end and the 3 'end were identified.
  • CSR 1 protein and CSR 2 protein the proteins they encode are named CSR 1 protein and CSR 2 protein; hereinafter simply referred to as CSR 1 and CSR 2 protein; and full-length cDNA
  • CSR 3 protein hereinafter simply referred to as CSR 3
  • the cDNA sequence of CSR 1 and the deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NOS: 9 and 10, respectively, the cDNA sequence of CSR 2 and the deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NOS: 11 and 12, respectively, and the cDNA sequence of CSR 3 is shown in SEQ ID NO: No. 13 and No. 14.
  • the size of the obtained CSR1 gene containing the cDNA and the open reading frame (ORF) were about 4.0 kb and about 1.8 kb, respectively, and encoded 606 amino acids.
  • the size of the gene containing the cDNA of CSR2 and the ORF were about 1.9 kb and about 1.4 kb, respectively, and encoded 466 amino acids. From the comparative analysis of the nucleotide sequences, it was confirmed that each of these three types of CSR was a transcript obtained by alternative splicing. For example, in CSR2, the sequence from the 1st to the 457th codon is identical to CSR1. The structural differences between these three splice variants are shown schematically in FIG.
  • the human CSR genomic gene has a size of about 90 kb, including six or more coding exons, and is located in the second intron sequence (between exon A and exon B in Fig. 1).
  • the subsequence (SEQ ID NO: 20) is a previously reported p53-binding sequence (in contrast to the base sequence consisting of two copies of 1 Omer (5 'RRRC (A / T) (T / A) GYYY 3, (R Was purine, Yiipyrimidine; EL-Deiry, WS et al., Nature Genetics, Vol. 1, 45-49, 1992).
  • CSR A, B, C , D, six Wekison of E and E, ', CSR2 is A, B, six Ekison of C s D, E and F, or CSR3 was assumed to be composed of at least four exons, C, D, E and E '(in the 5'-terminal sequence of the cDNA of CSR3, there was a copy corresponding to B and B'''). Since the coding sequence is found, B and B "may have exons as well.)
  • genomic DNA of CSR1 consists of six exons represented by exons 1, 2, 3, 4, 5 and 6 '.
  • CSR2 Genomic DNA is subjected Ekison 6 5 splicing, Ekison 6 "is used, Ekison 1, 2, 3, 4, 5 and 6" instead of six Ekiso emissions represented by.
  • exon E shown in Fig. 1 has 61% amino acid sequence homology with collagen
  • exon D shows amino acid sequence with chromosome segregation protein-smc2p and human myosin heavy chain, which is isolated from yeast chromosome.
  • Homology and exon C is a hibernation-related protein 25
  • CSR 2 protein is a sensor (Sensor) protein (GenBank accession number: P30844; Nagasawa, S. et al., J. Biochem., Vol. 114, 350-357, 1993) And had the highest structural similarity with over 80% reliability.
  • the secondary structure of the CSR protein was analyzed using computer software such as PR0SITE, COIL, TMpred and PS0RT. As a result, # 311 and # 312 were considered to have secondary structures as schematically shown in FIG.
  • the CSR1 protein consists of three distinct domains: (1) a transmembrane domain containing a leucine zipper structure in which the leucine unit is repeated four times; (2) a transmembrane domain.
  • This structure has a high similarity to the structure of the macrophage force-venger receptor type II (Fig. 3) (Source: “Molecular Atherosclerosis”, Chapter IV “Inflammatory cells”).
  • CSR2 protein lacks the collagen-like domain of CSR1 protein and instead has a C-terminal structure consisting of 10 amino acids.
  • the collagen-like domain can bind to a wide range of molecules such as lipids, plasma components (fibronectin, laminin, collagen, fibrinogen, etc.) and many negatively charged molecules.
  • Analysis using one-soft DNASIS suggested that the collagen-like domain of the CSR protein had a positive net charge at physiological pH.
  • the CSR protein has many phosphorylation sites and sugar chain binding sites, and a heme binding site and a microbody (peroxisome) C-terminal targeting signal. ( Figure 4 and Figure 16). This result suggests that the CSR protein is a protein that undergoes post-translational modification.
  • the untranslated regions at the 3 'end of the CSR 1 gene and the CSR 2 gene contained a 6-base sequence consisting of AGTAAA and AATAAA, respectively, near the 3, terminal poly (A) site. From previous reports, it appears that the sequence is closely related to the provision of a polyadenylation signal.
  • FISH method Fluorescence in situ hybridization; experimental medicine Child Handbook ”, published by Yodosha Co., Ltd., 1992, pp. 271 to 277
  • the localization of the human CSR gene on the human chromosome was analyzed by an ordinary method.
  • Metaphase chromosomes of human cells were prepared using the thymidine synchronization and bromodeoxyuridine release methods to separate chromosomes by the G-band method.
  • RNA blottein derived from human heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, renal spleen, spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, large intestine, and peripheral blood leukocytes
  • Each of the CSR 1 and CSR 2 labeled with [hy- 32 P] dCTP was hybridized on a membrane (each 2 ⁇ g of poly (A) + RNA was blotted; manufactured by Clonetech).
  • a human colon cancer cell line SW480 (Rodrigues, N. et al.) Expressing a mutant p53 (having a mutation at the 273rd and 309th codons) was used to express the native P53 gene or the mutant p53-273 gene expression plasmid. ⁇ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, 7555-7559, 1990) was transiently transfected (natural transfected cells are referred to as W, and mutant transfected cells are referred to as M). ). After the gene transfer,; NA was obtained over time from each of the introduced cells W and M, and the expression status of the CSR gene was analyzed by RT-PCR. The results are shown in FIG.
  • normal human fibroblast NHDF4042 manufactured by Clonetics
  • human cervical cancer-derived epithelial-like cells Hela (3) human lung cancer cells H1299, (4) human esophageal cancer cells TE10
  • human glioblastoma cell T98G The expression status of the CSR gene in human glioblastoma cell T98G, (6) human glioblastoma cell U87MG, (7) human tumor cell SKBR3, and (8) the human colon cancer cell SW480 was the same as described above. was analyzed by the RT-PCR method.
  • Fig. 8 shows the results.
  • the RT-PCR was performed as follows.
  • RNA was converted into cDNA by random priming using d (N) 10 (Beilinger Mannheim) in the presence of M-MuLV reverse transcriptase (200 units / ⁇ 1, manufactured by GIBC0-BRL). After conversion, a cDNA library was prepared.
  • RT—P For amplification of CSR cDNA by CR, EC12 (SEQ ID NO: 15) and EC2 (SEQ ID NO: 16) were used as primers.
  • RT-PCR was performed for 30 to 40 cycles using a thermocycler (Thermocycler; manufactured by Perkin Elmer Cetus) under a mixed cDNA solution (251).
  • the mixed cDNA solution contained 40 ng of cDNA, 1 ⁇ PCR buffer (containing 6.7 mM Tris (pH8.8), 16.6 mM ammonium sulfate, 6.7 M EDTA and 10 mM mercaptoethanol), 25 pmol of sense primer, It consists of 25 pmol of antisense primer, 0.5 U of Taq DNA polymerase (TAKMA), 250 M of deoxynucleotide, 10% of DMS0, and 7.6 mM of magnesium chloride.
  • TAKMA Taq DNA polymerase
  • Each PCR cycle consisted of a reaction at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. However, in the final PCR step, the temperature was 72 ° C for 1 minute.
  • the resulting PCR product was subjected to 3% agarose gel electrophoresis, transferred to an N + nylon membrane (manufactured by PALL), and subjected to Southern hybridization using an internal oligonucleotide probe F12 (SEQ ID NO: 8). I let you see.
  • amplification of a GAPDH transcript using HGS (SEQ ID NO: 17) and HGA (SEQ ID NO: 18) as primers was used as a control.
  • an internal probe SEQ ID NO: 19 was used.
  • Example 8 To further verify the results of Example 8, whether or not p53 protein binds to the CSR gene was analyzed by an EMSA (electrophoretic mobility shift assay) method.
  • EMSA epitrophoretic mobility shift assay
  • a nuclear extract was prepared from each of the transformed cells W and M by the same method as described previously (Mol. Cell. Biol., Vol. 12, p. 2866-2871, 1992). c That is, the transformed cells (each 1 ⁇ 10 6 cells or more) were mixed with 5 volumes of buffer A (20 mM HE PES (pH 7.5), 20% glycerol, 10 mM NaCl, 10 mM MgC, 0.2 mM EDTA, ImM DTT , 0.13 ⁇ 4 NP40, and a protease inhibitor), incubated on ice for 10 minutes, and centrifuged at 4 ° C for 10 minutes.
  • buffer A (20 mM HE PES (pH 7.5), 20% glycerol, 10 mM NaCl, 10 mM MgC, 0.2 mM EDTA, ImM DTT , 0.13 ⁇ 4 NP40, and a protease inhibitor
  • the obtained nuclear pellet is suspended in 2 volumes of buffer B (same composition as buffer A except that the concentration of NaCl is 500 mM), incubated on ice for 30 minutes, and then centrifuged. (14,000 rpm, 15 minutes), and the centrifuged supernatant was collected. The supernatant was adjusted to a concentration of 1 to 5 ⁇ g / ml and used for the EMSA test.
  • buffer B standard composition as buffer A except that the concentration of NaCl is 500 mM
  • Each EMSA test consisted of nuclear extract (8 ⁇ 1), buffer A (9 ⁇ 1), poly (dl-dC) (1 jug Boehringer Mannheim), mono-monomeric PAb421 11 and Oncogene Science) And / or using competitive DNA (more than 100 times the amount of unlabeled probe) on double-stranded oligonucleotides (about 5 ng) labeled at the ends. After incubation for 30 minutes at room temperature, the product was run on a gel (4% polyacrylamide / 0.5 ⁇ Tris-borate-EDTA), electrophoresed at 200 V for 3 hours, and transferred to a film at ⁇ 80 ° C.
  • a p53 DNA binding consensus sequence (P53-C0N, SEQ ID NO: 21) was used.
  • a probe for the putative p53 binding sequence present in the CSR gene (P53-CSR, SEQ ID NO: 22) was constructed with annealing oligonucleotides. The results are shown in FIG.
  • Example 8 To further analyze the effect of the presence or absence of the p53 protein on the expression of the CSR gene, in addition to the various tumor cells used in Example 8, the expression of the CSR gene in the following more tumor cells was determined by RT-PCR. The analysis was carried out in the same manner as in Example 8 by Southern hybridization according to However, as a control, human? Amplification of actin transcript was used as a control. Human? In RT-PCR for actin, oligonucleotides of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 were used as a food primer and a reverse primer, respectively. In addition, an internal oligonucleotide of SEQ ID NO: 25 was used as a probe for Southern hybridization.
  • Normal human fibroblasts NHDF4042 (manufactured by Clonetics), human glioblastoma cells U87MG, human breast cancer adenocarcinoma MCF7, ceacum adenocarcinoma SNU-C4, and human colon cancer carcinoma HCT116.
  • Human cervical cancer-derived epithelial-like cells Hela, human lung cancer cells H1299, human esophageal cancer cells (TE-3, TE10), human glioblastoma cells T98G, human tumor cells SK-BR-3, and Human colon cancer cells (SW480, HCT-15, DLD-1), human metastatic prostate cancer cells LNCaP.
  • FGC human cea cum adenocarcinoma (H498, SNU-C2A), human gastric cancer cells (SNU-1 , SNU-5, SNU-16), and human lung cancer cells (ACC-LC174, ACC-LC176).
  • the normal human fibroblasts NHDF4042 (3xl0 4 ), human colon cancer cells SW480 (3x10 5 ), human glioblastoma cells T98G (3X10 5 ), human esophageal cancer cells TE13 (3x10 5 ), and human
  • Each of cervical cancer-derived epithelial-like cells Hela ( 5 x 3 ) was plated in a 100-mm-diameter culture dish on a complete medium containing 10% fetal bovine serum (FBS, Fetal Bovine Serum; GIBCO-BRL). , were cultured in 5% C0 2, 37 ° C conditions. One to two days later, the culture solution was replaced with a complete medium containing 0.1% FBS, and cultured for 4 days. Next, RNA was extracted from each cell, and the mRNA expression status of CSR was examined by Northern blotting (Nothern Blotting Assay) according to a conventional method. Northern plots were performed as described below.
  • the hybridized membrane is washed twice with 2xSSC / 0.05% SDS (each at room temperature for 15 minutes) and then once with O.lxSSC / O.SDS (10 ° C at 65 ° C). Minutes).
  • the membrane was exposed on an imaging plate BAS1000 (Fuji, Japan) for 24 to 48 hours.
  • RNA of 0.24 to 9.5 kb (GIBC0-BRL) was used as a size marker for electrophoresis.
  • Fig. 9 shows the results.
  • Ultraviolet irradiation was performed as follows. That is, before irradiating with ultraviolet rays, the culture solution was removed and the cells were washed twice with a phosphate buffer. The ultraviolet light was irradiated for 5 to 120 seconds at a distance of 50 cm from the 40 W lamp. The amount of ultraviolet light was measured using a Black Ray UV meter. The results are shown in FIG.
  • the human normal fibroblast NHDF4042 (80% confluent, complete medium (5 ml)) was cultured at 43 ° C for 40 minutes, and further cultured at 37 ° C.
  • RNA was extracted from the cells over time, and the mRNA expression status of CSR was examined by Northern blotting in the same manner as described above. The mRNA expression level was analyzed using the actin RNA expression level as a control.
  • the normal human fibroblasts NHDF4042 (3 ⁇ 10 4 cells) were plated on a complete medium (10 cm culture dish) and cultured for 24 to 48 hours.
  • the culture medium was removed from the cell culture system that reached subconfluence (50-70%), and the cells were washed twice with phosphate buffer.
  • a new culture solution was added.
  • the ultraviolet light was irradiated for 50 to 120 seconds at a distance of 50 cm from the 40 W lamp.
  • the amount of ultraviolet light was measured using a radiometer (Model 254, manufactured by AT).
  • Example 9 Similar to the result of Example 9 ( ⁇ 9-2>), it was confirmed that the expression of CSR mRNA was induced by ultraviolet irradiation. Also in this experiment, the maximum expression was observed when irradiation was performed at an intensity of 15 J / m 2 .
  • the normal human fibroblasts NHDF4042 (3 ⁇ 10 4 cells) were plated on a complete medium (10 cm culture dish) and cultured for 24 to 48 hours.
  • the culture medium was removed from the cell culture system that reached subconfluence (50-70%), and the cells were washed twice with phosphate buffer.
  • a complete medium containing 1% fetal calf serum supplemented with a 30% hydrogen peroxide solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) at a concentration of 5 to 400 / M was added, and the cells were cultured for 1 hour. The medium was then replaced with fresh complete medium and cultured for a further 24 hours.
  • adriamycin a drug that intercalates with double-stranded DNA and exhibits anticancer activity by inhibiting the synthesis of DNA and RNA, exhibits toxicity to genes like the drug It was examined whether the reagent affected the expression of mRNAs of # 51 and # 53.
  • the normal human fibroblasts NHDF4042 (3 ⁇ 10 4 cells) were plated on a complete medium (10 cm culture dish) and cultured for 24 to 48 hours.
  • Adriamycin (ADR) at a concentration of 0.02 to l ⁇ g / ml was added to the cell culture system that reached subconfluent (50-70%) and cultured. After culturing for 24 hours, the cells were washed twice with a phosphate buffer, and fresh complete medium was added for culturing.
  • Example 10 Inhibition of CSR gene expression by antioxidants To demonstrate whether oxidative stress is involved in the induction of CSR gene expression, the following experiment is performed.
  • the normal human fibroblast NHDF4042 was converted to a complete medium containing 10% FBS supplemented with acetylsilsteine (NAC; Acetylcysteine 40m), a thio compound having antioxidant activity and an activity of eliminating oxidative stress. Incubate. Whether acetyl cysteine is nontoxic to the cells is confirmed by a trypan blue staining method according to a conventional method.
  • RNA is extracted and Northern plotting is performed. The mRNA expression level is analyzed using the actin RNA expression level as a control.
  • Example 10 In order to further examine whether or not oxidative stress is involved in the induction of CSR gene expression, the same test as in Example 10 was performed.
  • the human normal fibroblasts NHDF4042 the (3 1 0 4 cells) were plated in complete medium (10 cm culture dish), and cultured for 24 to 48 hours. Cells that reached subconfluence (50-70%) were cultured for one hour with acetylsilsteine (NAC; Acetylcysteine 3 mM), a thio compound having antioxidant activity and activity to eliminate oxidative stress.
  • NAC Acetylsilsteine
  • a thio compound having antioxidant activity and activity to eliminate oxidative stress The non-toxicity of acetyl cysteine to the cells was confirmed by a trypan blue staining method according to a conventional method.
  • Example 8 Expression of the CSR gene was analyzed in the same manner as in Example 8 by Southern hybridization using the RT-PCR method. However, as a control, amplification of a human 3 actin transcript was used as a control.
  • oligonucleotides of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 were used as forward primer and reverse primer, respectively.
  • an internal oligonucleotide of SEQ ID NO: 25 was used as a probe for Southern hybridization.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 were used as the forced primer and the reverse primer, respectively.
  • the internal oligonucleotide of SEQ ID NO: 28 was used as a probe for Southern hybridization.
  • the human normal fibroblast NHDF4042 Prior to obtaining the mRNA, the human normal fibroblast NHDF4042 was subjected to the following treatment to give stress. mRNA was isolated within 2 hours of the treatment and subjected to RT-PCR.
  • PMA membrane-bound NAPDH oxidase and protein kinase C.
  • Sodium arsenite (NaAs0 3, manufactured by Sigma) was added 0-24 h incubation. Sodium arsenite strongly induces an intracellular heat shock-like response and subsequent oxidative stress.
  • nitrM SNP sodium nitroprusside, Sigma
  • FIG. 23 The results are shown in FIG. 23 (FIGS. 23 (a) to 23 (f)).
  • Nitric oxide functions as an important regulator in the central, immune and circulatory systems and also acts as a cause of septic shock, hypertension, infarction, and neurodegenerative disorder (Annu. Rev. Biochem., Vol. 63, p. 175-195, 1994). Therefore, the result that CSR gene expression is induced by SNP or GSNO indicates that CSR protein is an oxidative stress responsive gene and is involved in the development of the above-mentioned diseases. It is an instigator.
  • Example 10 Analysis of Expression Induction of Various Genes by Oxidative Stress
  • the human normal fibroblast NHDF4042 was cultured for 1 to 50 hours in the presence of 10 ⁇ M Hemin or hydrogen peroxide, and A was isolated over time and RT
  • RT-PCI for each gene The foreground primer and reverse primer used, and the internal oligonucleotide probe used for Southern hybridization are as follows.
  • the intracellular distribution of the CSR protein was examined by immunocytochemical staining as follows.
  • the full-length CSR cDNA obtained as described above was ligated with 0.25 U of Taq polymerase.
  • Cells that stably express CSR were selected by RT-PCR, Western blotting, and SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • the selected cells were plated in a two-well slide chamber (Falcon) 24 hours before immunocytochemical staining. After the culture, the cells were washed briefly with phosphate buffer and fixed with 4% paraformaldehyde. After washing with a phosphate buffer, the cells were cultured for 30 minutes at room temperature in the presence of 2% serum albumin. Then, the cells were cultured at 37 ° C for 1 hour together with an anti-HA epitope polyclonal antibody (manufactured by MBL). After washing three times with a phosphate buffer, the cells were cultured with a FITC-labeled secondary antibody at 37 ° C for 40 minutes, and observed under a fluorescence microscope.
  • Fig. 13 (a) o
  • the nucleus was stained with DAPI (4 ', 6'-Diamino-2-phenyl indole, Sigma) and observed under a fluorescence microscope (Fig. 13 (b)).
  • Fig. 13 (a) the position is the same as the position with the nucleus stained by DAP I (Fig.).
  • the presence of the CSR protein in the cytoplasm regardless of the HA-tagged sites (C-terminal and N-terminal), confirms that the staining is wider (around the nucleus) than the stained nucleus. It was confirmed that.
  • control staining is performed in the same manner as described above using an anti-Golgi-58K protein (golgi-58K protein) antibody (Sigma).
  • CSR proteins intracellular localization of CSR proteins when subjected to intracellular stress (cytotoxicity) can be examined as follows.
  • Example 11 The results obtained in Example 11 were further verified in the same manner as in the method of Example 11.
  • the full-length cDNAs of CSR1 and CSR2 obtained as described above were subjected to a conventional method using a mixture of 0.25 U of Taq polymerase (TAKARA) and 0.5 U of pfu DNA polymerase (Stratagene). After amplification by PCR according to the above, the clone was cloned into mammalian expression vector pCDN A3.1 (manufactured by Invitrogen). Insertion of the cDNA into the vector was confirmed by nucleotide sequence analysis.
  • TAKARA Taq polymerase
  • pfu DNA polymerase pfu DNA polymerase
  • HA hemagglutinin
  • YPYDVPDYA hemagglutinin epitope
  • Wilson I. et al., CELL, Vol. 37, 767-778, 1984
  • tags (5) and 3 'end of CSR cDNA were used. tag).
  • the cDNA was used to transform human cervical cancer cells Hela. The cells were cultured for 10 days in the presence of Geneticin (G418, GIBC0-BRL). Cells stably expressing CSR were selected by RT-PCR, Western blotting, and SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The selected cells were seeded in a two-well slide chamber (Falcon) 24 hours before immunocytochemical staining.
  • the cells were washed briefly with phosphate buffer and fixed with cold methanol. After washing with a phosphate buffer, the cells were cultured at room temperature for 30 minutes in the presence of 2% serum albumin. Then, the cells were cultured at 37 ° C for 1 hour together with an anti-HA-epitope polyclonal antibody (manufactured by MBL). After washing three times with a phosphate buffer, the cells were cultured with a FITC-labeled secondary antibody (manufactured by Cappel) at 37 ° C for 40 minutes and observed under a fluorescence microscope.
  • a FITC-labeled secondary antibody manufactured by Cappel
  • the nuclei were stained with DAPI (4,6, -Diamino-2-phenyl indole, manufactured by Boeheringer Mannheim) and observed under a fluorescence microscope. The results are shown in FIG. 25 (FIGS. 25 (a) to 25 (d)).
  • DAPI 4,6, -Diamino-2-phenyl indole, manufactured by Boeheringer Mannheim
  • human lung cancer cells H1299 were transformed.
  • Cells were cultured for 10 days in the presence of Geneticin (GIBCO-BRL) to select cells stably expressing CSR.
  • CSR overexpression was confirmed using RT-PCR.
  • the overexpressed cells 500 cells were plated on a culture dish having a diameter of 60 thighs. After culturing for 18 hours, the cells were irradiated with ultraviolet light having a strength of 5 to 60 J / m 2 , or 50 to 200 iM of hydrogen peroxide was added to the culture solution, and cultured for 1 hour.
  • the medium was changed, and the cells were further cultured for 10 to 20 days.
  • the obtained colonies were fixed with cold methanol and stained with Giemsa's solution (manufactured by Merck), and the number of living cell colonies was counted.
  • H1299 transformants transformed with PCDNA3.1 vector into which the CSR gene was not inserted, and H1299 not transformed with any of the vectors A similar test was performed using parent cells.
  • Example 12 The results of the test related to the ultraviolet irradiation obtained in Example 12 were further verified in the same manner as in Example 12. However, in this test, cells (Co-transfection) with both the CSR1 gene expression vector and the CSR2 gene expression vector (abbreviated as “CSR1 / CSR2”) were also examined. The results are shown in FIG.
  • H1299-CSR1 Cells transformed with the CSR1 gene expression vector (abbreviated as “H1299-CSR1”), cells transformed with the CSR2 gene expression vector (abbreviated as “H1299-CSR2”), and cells co-transformed with both vectors (abbreviated as “H1299-CSR2”) (CSR1 / CSR2) compared to control H1299 parent cells (abbreviated as “H1299”) and cells transformed with an empty vector without any CSR gene (abbreviated as “H1299-vector”). It was resistant to cell death due to intracellular stress due to irradiation.
  • This method determines the amount of reactive oxygen spieces produced by cells based on the fluorescence intensity that increases with the oxidation of DCFH-DA in the cells. The results are shown in FIG. 27 (FIGS. 27 (a) to 27 (d)).
  • H1299-vector group and the CSR1 / CSR2 group were tested for their resistance to cell death (which leads to cell death through morphological changes called cell agglomeration) induced by hydrogen peroxide stress in this test. Analyzed from changes in cell morphology.
  • the morphology of the cells after addition of hydrogen peroxide (0 hour), after 1 hour of culture in the presence of hydrogen peroxide, and after 3 hours of culture was determined by a standard method. Under a microscope.
  • FIG. 28 The results are shown in FIG. 28 (FIGS. 28 (a) to 28 (h)).
  • the H1299-vector group changes in cell morphology (granulation) were observed immediately after the application of oxidative stress with hydrogen peroxide, and it was observed that the cells tended to die over time.
  • the CSR1 / CSR2 group the ability to temporarily change the cell morphology immediately after the application of oxidative stress by hydrogen peroxide and the return to the original cell morphology over time were observed.
  • Knockout mice in which the endogenous CSR gene of the mouse corresponding to the human CSR gene was inactivated (knocked down) were prepared as follows.
  • TK thymidine kinase gene
  • the plasmid was cut with Xbal and Sail of pBluescript II SK (-), and DNA fragments (exons A to D) obtained by digesting mouse CSR genomic DNA with Hpal and Acc65I were inserted into the cut site at blunt ends. , Consolidated.
  • neomycin resistance gene ("neo", a positive selection marker) excised by treatment with Xbal and EcoRV was ligated to the NciI cleavage site of exon B and the Aor51HI cleavage site of exon D in the mouse CSR genomic DNA. Between the blunt ends ⁇ Entered and consolidated. The resulting plasmid was cut with Notl and linearized to obtain a targeting vector.
  • FIG. 29 is a diagram schematically showing the structure of the prepared evening targeting vector.
  • Mouse embryonic stem cells were cultured in DMEM medium containing 15% ⁇ Shi calf serum (ES cells; embryonic stem cel l, 1 1 0 8 cells) (Nature, Vol .362, p.255-258 , 1993 ⁇ Beauty Nature, Vol .326, p.292-295, prepare 1987) was a single cell by treatment with trypsin and washed three times with phosphate buffer and the cell concentration to 1 X 1 0 7 cells / ml did. 25 ⁇ g of the above-mentioned evening vector was added per 1 ml of the cell suspension, and an electric pulse was applied once under the condition of 350 V / cm (25 ° F).
  • ES cells embryonic stem cel l, 1 1 0 8 cells
  • ES cells were seeded on a Petri dish (10 cm) and cultured in a maintenance medium for 1 day. After that, the medium was transformed into a selective medium (containing G418 (250 g / ml) and 2 ⁇ M ganciclovir). ) was replaced. Thereafter, the medium was exchanged every two days and the cells were cultured.
  • a selective medium containing G418 (250 g / ml) and 2 ⁇ M ganciclovir).
  • the medium was exchanged every two days and the cells were cultured.
  • 10th day after the introduction of the targeting vector several hundred neomycin-resistant ES cell clones were obtained under a microscope using a micropipette. The obtained ES cell clones were separately cultured in a 24-well plate on which Feeder cells were spread to obtain replicas of neomycin-resistant ES cells.
  • Genomic Southern blotting is performed by the usual method using two probes having the 5'-side and 3'-side sequences of mouse CSR genomic DNA for EcoRI digested fragments of genomic DNA extracted from each neomycin-resistant ES cell. .
  • DNA purification use an automated DNA robot (Kubo Yun).
  • This ES cell clone was used for the production of knockout mice described below. I have.
  • Each of the ES cell clones in which the endogenous gene encoding the mouse CSR protein obtained above was inactivated (knocked out) by homologous recombination was bred to male and female C57BL6 mice (manufactured by Nippon Charles River).
  • the obtained blastocysts are injected (microinjection) at a rate of 15 per embryo.
  • about 10 blastocysts per side of the uterus are implanted into the uterus of a foster parent ICR mouse (CLEA Japan) 2.5 days after pseudopregnancy treatment.
  • a knockout chimera mouse is obtained for each ES cell clone.
  • each of the obtained chimeric mice is bred with normal C57BL6 mice to obtain an agouti-colored mouse with a hair-color gene derived from ES cells.
  • the novel gene / protein of the present invention has the following characteristics, and is considered to be a novel scavenger receptor that functions to protect against various stresses generated in cells.
  • the gene or protein encoding the scavenger receptor (CSR, Cellular Sensor-related protein) of the present invention is used as an overnight target to obtain pathological symptoms or diseases caused by intracellular stress, foreign substances, or denatured proteins generated in the living body. (Eg, arteriosclerosis, diabetic vascular disease, bacterial infection, etc.), it is extremely useful for developing pharmaceuticals for prevention and treatment.
  • the gene can be used as an antisense drug and in gene therapy, and the protein is useful as a soluble protein drug by producing a soluble fragment thereof (extracellular region or each domain).
  • an antibody reactive with the protein or a fragment thereof and a part of the antibody are extremely useful as an antibody drug for controlling the function of CSR.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

スカベンゞャヌ受容䜓様タンパク 技術分野
本発明は、 新芏スカベンゞャヌ受容䜓様タンパク及びその断片、 該倕ンパクを コヌドする DNA及びその断片、 該 DNAを含む発珟べクタ䞀、 該発珟ベクタヌ で圢質転換された圢質転換现胞、 該タンパク若しくはその断片に反応性を有する 抗䜓、 䞊びに該抗䜓を産生する现胞に関する。 背景技術
生䜓のあらゆる組織及び血挿䞭には、 遊離型、 長鎖脂肪酞型及び゚ステル型の コレステロヌルが存圚し、 前者の 2぀は现胞膜の構成においお重芁な圹割を果た し、 ゚ステル型は生理的に䞍掻性な貯蔵圢態ずしおの性質を有する。 生䜓䞭のコ レステロヌルは、 食物接皮による小腞からの取蟌みあるいは皮々組織、 特に肝臓 での生合成に由来する。 肝臓で生合成され分泌された遊離コレステロヌルは、 超 䜎比重リポ蛋癜 VLDL) に取り蟌たれ、 血䞭でリポ蛋癜リパヌれ LPL) 及び肝性トリグリセリ ドリパヌれ HTGL) の䜜甚を受け、 䞭間比重リポ蛋癜
(IDL) を経お、 䜎比重リポ蛋癜 LDL) ぞず代謝される。 このようにしお 圢成された L D Lは血流に乗り末梢ぞ運搬され、 末梢の L D L受容䜓を介しお血 管内皮现胞等の末梢现胞に取り蟌たれ、 末梢现胞の構成に必芁な量のコレステロ ヌルが䟛絊されるこずずなる。
LD L受容䜓は、 LD Lの取蟌みにより现胞内のコレステロヌルが増加するず、 過剰のコレステロヌルの蓄積が起こらないようにダりンレギュレヌション down regulation) される。
䞀方、 そのような LDL受容䜓を介した正垞 L D Lの现胞内ぞの取蟌みずは別 に、 Fe3+や熱などの物理 ·化孊的な皮々倉化により生じた倉性 LDL (酞化 L DL、 ァセチル化 LDL、 サクシ二ル化 LDL、 マロンゞアルデヒド MDA) LDLなど の现胞内ぞの取蟌みの経路が存圚する。 䞀぀は、 マクロファヌゞス 力ベンゞャヌ受容䜓 Scavenger receptor) を介した取蟌みであり、 さらなる䞀 ぀は、 血管内皮现胞酞化 LD L受容䜓 (Oxidized LDL receptor, Nature, Vol.3 86 73-77, 1997) である。
末梢マクロファヌゞは、 通垞 LDL受容䜓をほずんど発珟しおいないが、 酞化 LDLなどの倉性 LD Lを認識するスカベンゞャヌ受容䜓を発珟しおおり、 この 受容䜓を介しお倉性 LDLを取り蟌むこずが明らかにされおいる Nature, Vol. 343, 531-535, 1990s Natre, Vol.343, 570-572 1990s Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, 9133-9137, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, 8810- 8814, 1990、 Curr. Op in. Lipodol., Vol.2, 295-300, 1991、 J. Clin. Invest., Vol.90, 1450-1457, 1991) 。 このスカベンゞャヌ受容䜓は前蚘 L D L受容䜓ず は異なり、 现胞内のコレステロヌルの増加によるダりンレギュレヌションを受け ないため過剰の倉性 LDL (コレステロヌル を取蟌み、 マクロファヌゞを泡沫 现胞化させる。 この泡沫化マクロファヌゞの血管内皮䞋、 血管壁での蓄積が、 動 脈硬化症の䞻たる原因の䞀぀ずされおいる。 事実、 最近の報告で、 このマクロフ ァヌゞス力ベンゞャヌ受容䜓を遺䌝子操䜜で䞍掻性化したノックアりトマりスで は、 動脈硬化病巣は察照マりスに比べ瞮小しおいるこずが確認されおおり、 動脈 硬化の発症にスカベンゞダヌ受容䜓が深く関䞎しおいるこずが実蚌されおいる。 さらに、 このスカベンゞャヌ受容䜓が、 现菌感染防埡や糖尿病性の血管障害惹起 の原因である糖化産物 AGE、 Advanced Glycation End Product) の取蟌みに も関䞎しおいるこずが明らかにされおいる (Nature, Vol.386, 292-296, 1997) 。 マクロファヌゞス力ベンゞャヌ受容䜓には、 I型ず II型が存圚し、 ずもに 6個 のドメむンで構成され、 C末端のみが異なる構造を有しおいる。 たた、 膜蛋癜ず しおは珍しい inside-out型の䞉量䜓膜型糖蛋癜質である。 ヒト、 マりス、 ゥシ及 びゥサギの皮間では、 I型ず I I型ずもに高いアミノ酞配列盞同性を有する  I型 : 64-81%、 II型 60-81%) 。 該ドメむンは、 C末端から、 ① C末端特異ドメむン、 ②コラヌゲン様ドメむン、 ③ひヘリカルコむノレドコむルドメむン ひ- helical c oiled-coil domain) 、 ④スぺ䞀サヌドメむン、 ⑀膜貫通ドメむン、 及び⑥现胞質 ドメむンからなる。
I型の 「C末端特異ドメむン」 は、 システィンに富み、 たた補䜓因子 1 (comp lement factor 1) 、 C D 5及び C D 6などず高い盞同性を有しおいる。
「コラヌゲン様ドメむン」 は、 コラヌゲンに特有なグリシンGly)-X-Yの繰返し 構造を有しおいる。 たた、 C末端偎には、 負に架電したリガンドの結合に適した 正に架電したアミノ酞が倚く集たっおいる。 コラヌゲン様ドメむンの C末端偎 2 2個のアミノ酞を欠倱した倉異䜓は、 リガンド結合性を倱うこずが確認されおい る。 たた、 皮々欠倱倉異䜓の䜜補による実隓から、 リガンドずの結合には、 リゞ ン残基 K337) が重芁であるこずが解明されおいる。
「ひヘリカルコむルドコむルドメむン」 は、 蛋癜䞀次構造ずしおのスカベンゞ ダヌ受容䜓ポリべプチドの 3本を䌚合させお掻性受容䜓を圢成させる圹割だけで なく、 倉性 L D Lなどのリガンドを結合しお现胞内に入り、 ゚ンドゟヌム内での p Hの䜎䞋に䟝存しお受容䜓の高次構造を倉化させおリガンドを解離させる圹割 を有する。 このドメむンは、 7アミノ酞毎に 2回転する右巻のヘプテッドリピ䞀 ト、 即ちひヘリカルコむルドコむル構造を取り、 3本のポリペプチドは 7ァミノ 酞毎に存圚するロむシンゃィ゜ロむシンなどの疎氎性アミノ酞を内偎に向け、 極 性ァミノ酞や糖鎖結合郚䜍を倖偎にしお、 3量䜓を圢成しおいる。
該ヘプテツドリピヌトのコラヌゲン様ドメむン偎に存圚するヒスチゞンが、 现 胞内でのリガンドの解離においお機胜しおいるこずが実隓的に蚌明されおいる。 さらに、 このコむルドコむルドメむンのヒスチゞンを䞭心ずする 1 5アミノ酞領 域を認識する抗䜓が、 マクロファヌゞのカルシりム非䟝存性の现胞接着を阻害す るこずから、 このマクロファヌゞス力ベンゞャヌ受容䜓が现胞接着分子ずしおの 機胜も有しおいるこずが瀺唆されおいる。
「现胞質ドメむン」 は、 L D L受容䜓やむンスリン受容䜓に芋られる N P X Y 配列䞊びにトランスフヱリン受容䜓に芋られる Y X R F配列ず同様の゚ンドサむ トヌシスシグナルに芋られる特城的なタむ トタヌン構造を有し、 これらの配列を 欠倱させるずェンドサむ ト䞀シスが抑制されるこずが蚌明されおいる。
特に、 スカベンゞャヌ受容䜓のリガンド結合郚䜍であるコラヌゲン様ドメむン は、 コラヌゲンなどの现胞倖マトリヅクスに結合、 沈着する倉性 L D Lなどの異 物や老廃物を陀去するのに適した構造であるこずが明らかにされおいる。
マクロファ䞀ゞス力ベンゞャヌ受容䜓に関するこれたでの研究結果から、 マク 口ファヌゞス力ベンゞャ䞀受容䜓は、 生䜓内の 「掃陀屋」 であり、 生䜓内の異物 や倉性タンパク 䟋えば、 倉性 L D L、 糖化産物、 感染现菌由来の異物など を 取り蟌むこずが䞻たる圹割であり、 生䜓内からそのような異物や倉性蛋癜質を陀 去するこずにより现胞、 生䜓を防埡する生䜓防埡機構の䞀぀ずしおの圹割を担う ものであるず考えられおいる。 発明の開瀺
本発明は、 既知のマクロファヌゞス力ベンゞャヌ受容䜓に特有な構造ず同様な 構造を有し、 现胞内に発生した皮々のストレスに察しお防埡的に働く新芏なスカ ベンゞャヌ受容䜓を同定するこずにより、 生䜓内に生じた现胞内ストレス、 異物 あるいは倉性蛋癜に起因する病的症状や疟患の予防䞊びに治療に有甚な医薬及び 方法を提䟛するものである。
本発明者らは、 既知の L D L受容䜓、 酞化 L D L受容䜓及びマクロファ䞀ゞス 力ベンゞャヌ受容䜓ずは異なる技術分野に属する遺䌝子である腫瘍抑制タンパク p 5 3によっお転写制埡される皮々のヒト遺䌝子の解析に関しお鋭意研究した結 果、 ヒトマクロファ䞀ゞス力ベンゞャヌ受容䜓に特有の蛋癜二次構造に極めお類 䌌の構造を有する䞀方、 該受容䜓ずのアミノ酞配列盞同性を有さず、 各々がォヌ ノレ倕ナティブスプラむシング倉異䜓 (alternative splicing variant) をコヌドす る 新芏な 3぀のヒト cDN A ( 「CSR遺䌝子」 Cellular Sensor-Related Ge ne  Cellular Stress Response Gene) ず総称。 各々の c D N A及び該 c D N A がコヌドするタンパクを 「C SR 1」 、 「C SR 2」 及び 「C SR 3」 ず略 称。  を芋出し本発明を完成するに到った。
本発明の新芏な遺䌝子/倕ンパクは、 䞋蚘のような特城を有し、 现胞内に発生 した皮々のストレスに察しお防埡的に働く新芏なスカベンゞャ䞀受容䜓であるず 考えられる。
( 1) マクロファヌゞス力ベンゞャヌ受容䜓 I型及び II型 GenBankァクセッショ ン番号 S08278 Rohrer, L.ら、 Nature, Vol.343, 570-572, 1990) 及び/たた はセンサ䞀 Sensor) タンパク GenBankァクセッション番号 P30844 Nagasaw a, S.らボ J. Biochem., Vol.114, 350-357, 1993) ず高い構造的類䌌性を有する。
(2) 図 2に暡匏的に瀺されるような 2次構造を有し、 ①ロむシン単䜍が 4回繰 り返されるロむシンゞッパヌ構造を含むトランスメンブレンドメむン transmem brane domain) 、 ②ひヘリカゟレコィノレ ドコィノレ ドメむ ン (ひ— helical coiled co il domain) 、 及び③ G 1 y— X— Yの配列単䜍が 49回繰り返されるコラヌゲン 様ドメむン (collagen-like domain) から構成される。
(3) 前蚘特城的構造を有する 3分子が、 コむルドコむルドメむンでひぞリック スを、 たたコラヌゲン様ドメむンでトリプルヘリックスを圢成するこずにより 3 量䜓を圢成する。
(4) コラヌゲン様ドメむンは、 生理孊的 pHで正の実効電荷 net charge) を 垯びおいる。
(5) 倚くのリン酞化郚䜍及び糖鎖結合郚䜍を有しおいる。 リン酞化郚䜍に぀い おは、 具䜓的には、 casein kirmse2、 protein kinase C、 及び tyrosine kinase 2によるリン酞化郚䜍を有しおいる。
(6) CSR遺䌝子の 3 末端の非翻蚳領域には、 3' 末端 poly(A)郚䜍の近傍に、 ポリアデニレヌシペンシグナルの䟛䞎に深く関連しおいるず思われる各々 AGTAAA 及び MTAAAからなる 6塩基配列を含んでいる。
(7) CSRの発珟は、 玫倖線照射、 過酞化氎玠及び熱ショックなどの现胞内ス トレスにより誘導される。 たた、 现胞に酞化ストレスを䞎える倚くの詊薬 DEM PMA, Sodium azide, Sodium arsenite, GSNO, SNP, Heminなど によるストレ スによっおも発珟が誘導される。
(8) 前蚘の玫倖線照射、 過酞化氎玠及び熱ショックなどの现胞内ストレスによ る CSRの発珟は、 抗酞化剀存圚䞋では抑制される。
(9) CSRは、 玫倖線照射、 過酞化氎玠及び熱ショックなどの现胞内ス トレス により起こる现胞死を抑制する。
(10) ヘム結合郚䜍、 及びミクロボディ䞀 ペルォキシ゜䞀ム C末端タヌゲ ティングシグナル郚䜍を有しおいる。
埓っお、 本発明の CSRをコヌドする遺䌝子、 タンパク若しくはその断片は、 該遺䌝子あるいはタンパク分子を倕ヌゲットずしお、 生䜓内に生じた现胞内スト レス、 異物あるいは倉性蛋癜に起因する病的症状や疟患 䟋えば、 動脈硬化症、 糖尿病性血管障害、 现菌感染など の予防䞊びに治療のための医薬品開発におい お極めお有甚である。
たた、 該 DNAは、 それ自䜓 C SRの機胜を遺䌝子レベルで制埡するアンチセ ンス医薬品ずしお、 たた遺䌝子治療での䜿甚においお有甚である。 該倕ンパクの 断片 䟋えば、 现胞倖領域、 各ドメむン は、 䟋えば可溶性蛋癜医薬品ずしお有 甚である。
さらに本発明の C S R倕ンパクに反応性を有する抗䜓たたはその䞀郚は、 C S Rの機胜を制埡するこずによる抗䜓医薬品ずしお極めお有甚である。
さらに、 本発明の遺䌝子 DNA) 、 タンパク、 及び抗䜓は、 本発明のタンパ クず盞互䜜甚を有するタンパク リガンド の探玢、 該リガンドの機胜の解明、 䞊びに該リガンドを倕ヌゲッ トずした治療薬を開発するための詊薬ずしお有甚で ある。
たた、 本発明の DN Aの態様の䞀぀である哺乳動物 マりスなど 由来の CS Rの遺䌝子情報をもずに、 それらの遺䌝子を砎壊 䞍掻性化 するこずによりモ デル動物を䜜成するこずが可胜である。 このモデル動物の物理孊的、 生物孊的、 病理孊的及び遺䌝子的特城を分析するこずにより、 本発明に係る遺䌝子及びタン パクの機胜を解明するこずが可胜ずなる。
さらに、 そのようにしお内圚性遺䌝子が砎壊された該モデル動物、 本発明のヒ ト由来の CSR遺䌝子を導入するこずにより、 本発明のヒト由来遺䌝子のみを有 するモデル動物を䜜成するこずが可胜である。 このモデル動物に、 該導入された ヒト遺䌝子をタヌゲッ トずした薬剀 化合物、 抗䜓等 を投䞎するこずにより、 その薬剀の治療孊的効果を評䟡するこずが可胜ずなる。
本発明は、 即ち、 䞋蚘の DNA、 タンパク、 発珟べクタ䞀、 圢質転換䜓、 抗䜓 医薬組成物、 及び现胞を初めお提䟛するものである。
( 1 ) 配列番号 10に蚘茉されるアミノ酞配列を有するタンパクをコヌドす る DNA及びその断片。
(2) 配列番号 12に蚘茉されるアミノ酞配列を有するタンパクをコヌドす る DNA及びその断片。
( 3 ) 配列番号 14に蚘茉されるアミノ酞配列を含む倕ンパクをコ䞀ドする DN A及びその断片。
( 4 ) 配列番号 9に蚘茉される塩基配列の塩基番号 276乃至 2096の塩 基配列を有する DN A及びその断片。
( 5 ) 配列番号 11に蚘茉される塩基配列の塩基番号 276乃至 1676の 塩基配列を有する D N A及びその断片。
( 6 ) 配列番号 13に蚘茉される塩基配列の塩基番号 364乃至 1971の 塩基配列を含む DN A及びその断片。
(7) 配列番号 9、 11たたは 13のいずれかに蚘茉される塩基配列を有す る DNAにストリンゞェン卜な条件䞋でハむプリダむズする DNA。
( 8 ) 配列番号 10に蚘茉されるァミノ酞配列若しくは該ァミノ酞配列ず実 質的に同䞀のアミノ酞配列を有するタンパク䞊びにそれらの断片。
(9) 配列番号 12に蚘茉されるアミノ酞配列若しくは該アミノ酞配列ず実 質的に同䞀のアミノ酞配列を有するタンパク䞊びにそれらの断片。
(10) 配列番号 14に蚘茉されるアミノ酞配列若しくは該アミノ酞配列ず 実質的に同䞀のアミノ酞配列を含むタンパク䞊びにそれらの断片。
(11) 前蚘 1) 乃至 7) 蚘茉の DN Aを含む発珟ベクタヌ。
(12) 前蚘  1 1 ) 蚘茉の発珟べクタ䞀で圢質転換された圢質転換现胞。
(13) 前蚘 8) 乃至 10) 蚘茉のタンパクたたはその断片に反応性を 有する抗䜓たたは該抗䜓の䞀郚。
(14) 該抗䜓が、 モノクロヌナル抗䜓であるこずを特城ずする前蚘  1 3)蚘茉の抗䜓たたは該抗䜓の䞀郚。
(15) 前蚘  13) たたは  14)蚘茉の抗䜓若しくは該抗䜓の䞀郚及び 薬孊的に蚱容され埗る担䜓を含んでなる医薬組成物。
(16) 前蚘 8) 乃至前蚘 10) のいずれかに蚘茉のタンパクたたはそ の断片に反応性を有するモノクロヌナル抗䜓を産生する现胞。
(17) 該现胞が、 モノクロヌナル抗䜓を産生する胜力を有する非ヒト哺乳 動物由来の: B现胞ず哺乳動物由来のミ゚ロヌマ现胞ずを融合しお埗られる融合现 胞であるこずを特城ずする前蚘 16) に蚘茉の现胞。
(18) 該现胞が、 該モノクロヌナル抗䜓の重鎖をコヌドする DNA若しく はその軜鎖をコ䞀ドする DNAのいずれか䞀方の DNA、 たたは䞡方の DNAが 现胞内に導入されるこずにより圢質転換された遺䌝子組換え现胞であるこずを特 城ずする前蚘 16) に蚘茉の现胞。
以䞋、 本発明で甚いる語句の意味、 䞊びに本発明のタンパク、 DNA、 抗䜓及 び现胞の䞀般的補造方法を明らかにするこずにより、 本発明を詳现に説明する。 本発明の 「タンパクたたはその断片」 ずは、 ヒト、 ゥシ、 ヒヅゞ、 ブ倕、 ャギ、 ゥサギ、 ラット、 ハムスタヌ、 モルモット、 及びマりスなどの哺乳動物由来の倕 ンパク及びその断片 フラグメント であり、 奜たしくはヒト、 ゥサギ、 ラット たたはマりス由来の倕ンパク若しくはその断片であり、 特に奜たしくはヒト由来 のタンパク及びその断片 フラグメント である。
特に奜たしい態様ずしおは、  1 ) 配列番号 1 0に蚘茉されるアミノ酞配列た たは該アミノ酞配列ず実質的に同䞀のアミノ酞配列を有するタンパク及びその断 片、 2 ) 配列番号 1 2に蚘茉されるアミノ酞配列たたは該アミノ酞配列ず実質 的に同䞀のアミノ酞配列を有するタンパク及びその断片、 及び 3 ) 配列番号 1 4に蚘茉されるァミノ酞配列たたは該ァミノ酞配列ず実質的に同䞀のアミノ酞配 列を含む倕ンパク及びその断片を挙げるこずができる。
ここで 「実質的に同䞀のアミノ酞配列を有する」 ずは、 配列番号 1 0、 1 2た たは 1 4に瀺されるァミノ酞配列を含むタンパクず実質的に同等の生物孊的性質 を有する限り、 該アミノ酞配列䞭の耇数個のアミノ酞、 奜たしくは 1乃至 1 0個 のアミノ酞、 特に奜たしくは 1乃至 5個のアミノ酞が眮換、 欠倱及び/たたは修 食されおいるアミノ酞配列を有するタンパク、 䞊びに該アミノ酞配列に、 耇数個 のアミノ酞、 奜たしくは 1乃至 1 0個のアミノ酞、 特に奜たしくは 1乃至 5個の アミノ酞が付加されたアミノ酞配列を有するタンパクをも包含するこずを意味す る。
たた 「タンパクの断片」 ずは、 䞊述した本発明の C S Rタンパクが有するアミ ノ酞配列䞭の任意の郚分配列 フラグメント を意味し、 䟋えば、 その现胞倖領 域 (extracellular region) 、 膜貫通領域 (transmembrane region) あるレ、は现 胞内領域 cytoplasmic region) ずいった各ドメむン、 あるいは該各領域が他の タンパク分子や䜎分子リガンドず結合 盞互䜜甚 する郚䜍等を挙げるこずがで きる。 さらには、 該现胞倖領域ず他の分子 䟋えば、 ヒト免疫グロブリンの重鎖 の定垞領域 F c、 constant region) たたはその䞀郚ずの融合タンパクも本発明 のタンパクの断片の範囲に包含される。
ここで 「现胞倖領域」 ずは以䞋のような意味を有するものである。 即ち、 本発 明の C S Rタンパク、 皮々の G蛋癜質共圹型受容䜓あるいは现胞膜衚面分子のよ うな现胞膜貫通性タンパクは、 膜の脂質二重局を 1回たたは数回貫通する疎氎性 ペプチド領域により膜ず連結し、 党䜓ずしお现胞倖領域 (extracellular region), 膜貫通領域transmembrane region)及び现胞質領域cytoplasmic region)の 3぀ の䞻領域から構成される構造をず぀おいる。 さらにそのような膜貫通性タンパク は、 モノマヌ (monomer) ずしお、 たたは、 同䞀のアミノ酞配列を有するもう 1本 の鎖あるいは異なるァミノ酞配列を有する鎖ずずもにそれぞれホモダむマ䞀hom odimer)、 ヘテロダむマ䞀 (heterodimer) あるいはオリコマ䞀 (origomer)を匀成し お存圚する。
本発明においお甚いられる 「现胞倖領域」 ずは、 前述のような膜貫通性タンパ クの党䜓構造のうち、 該膜タンパクが保持されおいる膜の倖界偎に存圚する郚分 構造 郚分配列 を意味し、 換蚀すれば、 膜内に取り蟌たれおいる領域 膜貫通 領域 及び該膜内の領域に匕き続いお现胞質内に存圚する領域 现胞内領域 以 倖の領域が现胞倖領域に該圓する。 たた、 本発明における现胞倖領域は、 所望に 応じその N末端及び/たたは C末端に、 膜貫通領域及び/たたは现胞内を構成す るアミノ酞配列に由来する 1乃至 5のアミノ酞が付加されおいおもよい。
たた、 「ヒトの免疫グロブリンの重鎖の定垞領域たたはその䞀郚」 ずは、 ヒト 由来の免疫グロブリンの重鎖 Heavy Chain, H鎖 の定垞領域 Constant regi on) 、 F c領域たたはそれらの䞀郚を意味する。 該免疫グロブリンは、 どのよう なクラス及びサブクラスに属する免疫グロプリンであっおもよく、 具䜓的には、 I gG (I gG l、 I gG2、 I gG3及び I gG4) 、 I gM、 I gA (I g A l及び I gA2) 、 I gD及び I gEを挙げるこずができる。 奜たしくは、 I gG (I gG l、 I gG2、 I gG3若しくは I gG4) たたは I gMである。 本発明における特に奜たしい䟋ずしおは、 ヒト由来の I gG (I gG l、 I gG 2、 I gG3若しくは I gG4) に属する免疫グロブリンである。
免疫グロブリンは、 2぀の盞同な軜鎖 Light Chain, L鎖 ず 2぀の盞同な重 鎖 Heavy Chain, H鎖 の 4぀の鎖が、 ゞスルフィ ド結合 S— S結合 で結合 した Y字圢の構造単䜍を有する。 軜鎖は、 軜鎖可倉領域 VL) 及び軜鎖定垞領域
(CL) から構成される。 重鎖は、 重鎖可倉領域 VH) ず重鎖定垞領域 CH) か ら構成される。
重鎖定垞領域は、 クラス I gG、 I gM、 I gA、 I gD及び I gE) 䞊び にサブクラス I gGl、 I gG2、 I gG3、 I gG4、 I gAl及び I gA 2) 毎に各々固有のアミノ酞配列を有するいく぀かのドメむンから構成される。
I gG (I gGl、 I gG2、 I gG3及び I gG4) の重鎖は、 N末端から 順に、 VH、 CH I ドメむン、 ヒンゞ領域、 CH 2ドメむン及び CH 3ドメむンから 構成される。
同様に I gGlの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 C7 llドメむン、 ヒンゞ領 域、 C7 2ドメむン及び C7 3ドメむンから構成される。 I gG2の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cァ 21 ドメむン、 ヒンゞ領域、 Cァ 22ドメむン及び Cァ 23ドメむンから構成される。 I gG3の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cァ 31 ドメむン、 ヒンゞ領域、 32ドメむン及び Cァ33ドメむンから構成される。 I gG4の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cァ 41 ドメむン、 ヒンゞ領域、 Cァ 42ドメむン及び Cァ 43ドメむンから構成される。
I gAの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cひ 1ドメむン、 ヒンゞ領域、 Cひ 2 ドメむン及び Cひ 3ドメむンから構成される。
同様に I gAlの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cc l ドメむン、 ヒンゞ領 域、 C« i 2ドメむン及び Ci^ 3ドメむンから構成される。 I gA2の重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cひ 21 ドメむン、 ヒンゞ領域、 Cひ 22ドメむン及び Co: 23ドメむンから構成される。
I gDの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 C51 ドメむン、 ヒンゞ領域、 Cc52 ドメむン及び C 53 ドメむンから構成される。
I gMの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 C l ドメむン、 ドメむン、 C 〃3 ドメむン及び C〃4 ドメむンから構成され、 I gG、 1 八及び1 0に芋 られるようなヒンゞ領域を有しない。
I gEの重鎖は、 N末端から順に、 VH、 Cs l ドメむン、 Ce 2 ドメむン、 C £ 3 ドメむン及び Cs 4 ドメむンから構成され、 I gG、 I gA及び I gDに芋 られるようなヒンゞ領域を有しない。
さらに、 I gGを䟋に挙げるならば、 I gGをパパむンで凊理するず、 2぀の 重鎖を連結させおいるヒンゞ領域䞭に存圚するゞスルフィ ド結合のやや N末端偎 で切断されお、 VH及び CH 1からなる重鎖断片ず 1぀の軜鎖がゞスルフィ ド結合 で連結した 2぀の盞同な Fab、 䞊びにヒンゞ領域、 CH2 ドメむン及び Ch3 ド メむンからなる 2぀の盞同な重鎖断片がゞスルフィ ド結合で連結した 1぀の F c を生ずる 以䞊、 「免疫孊むラストレむテッ ド」 、 原曞第 2版、 第 65〜75頁、 1 992幎、 南江堂発行、 及び 「最新医科孊の焊点 「免疫系の認識機構」 」 、 第 4〜 7頁、 1 9 9 1幎、 南江堂発行など参照 。
即ち、 本発明における 「免疫グロブリンの重鎖の定垞領域の䞀郚」 ずは、 䞊述 のような構造的特城を有する免疫グロプリンの重鎖の定垞領域の䞀郚を意味し、 奜たしくは、 C 1 ドメむンを欠く定垞領域たたは F c領域である。 具䜓的には、 I G, I gAたたは I gDの堎合には、 各々のヒンゞ領域、 C 2 ドメむン及び C 3 ドメむンからなる領域が挙げられ、 I gMたたは I gEの堎合には、 各々の C 2 ドメむン、 C 3 ドメむン及び C 4 ドメむンからなる領域が挙げられる。 ずり わけ奜たしい䟋ずしおは、 ヒト由来の I gG 1の F c領域を挙げるこずができる。 本発明の 「タンパクの断片」 に包含される融合タンパクの奜適な䟋ずしおは、 前蚘の定矩されるずおりの本発明のタンパクの现胞倖領域ず該 「ヒ卜の免疫グロ プリンの重鎖の定垞領域たたは定垞領域の䞀郚」 ずからなる融合ポリべプチドを 挙げるこずができる。 奜たしくは本発明のタンパクの现胞倖領域ずヒトェ gGの 重鎖の定垞領域の䞀郚ずの融合ポリべプチドであり、 特に奜たしくは本発明の倕 ンパクの现胞倖領域ずヒト I g Gの重鎖のヒンゞ領域、 C H 2 ドメむン及び C H 3 ドメむンからなる領域 F c ) ずの融合ポリペプチドである。 なお、 I g Gずし おは、 I g G lが奜たしい。 たた、 本発明のタンパクずしおは、 ヒ ト、 マりスた たはラヅ ト 奜たしくはヒト に由来するタンパクが奜たしい。
本願明现曞たたは図面においおアミノ酞を衚蚘するために甚いられるアルファ べッ卜の䞉文字あるいは䞀文字は、 各々次に瀺すアミノ酞を意味する。
(Gly/G) グリシン、 Ala/A) ァラニン、 Val/V) パリン、 Leu/L) ロむ シン、 I le/I) む゜ロむシン、 Ser/S) セリン、 Thr/T) スレオニン、 (Asp/D) ァスパラギン酞、 Glu/E) グルタミン酞、 Asn/N) ァスパラギン、 (Glu/Q) グルタミン、 Lys/K) リゞン、 Arg/R) アルギニン、 Cys/C) システィン、 Met/M) メチォニン、 Phe/F) プ二ルァラニン、 Tyr/Y) チロシン、 Trp/W) トリブトファン、 His/H) ヒスチゞン、 Pro/P) プロ リン。
本発明のタンパク、 タンパクフラグメント及び融合タンパクは、 埌述するよう な遺䌝子組換え技術のほか、 化孊的合成法、 现胞培逊方法等のような圓該技術分 野においお知られる公知の方法あるいはその修食方法を適宜甚いるこずにより補 造するこずができる。
たた、 䞊述した本発明の融合タンパクは、 前述のような I g G等の免疫グロリ ンの定垞領域の䞀郚 䟋えば、 F c ) を融合パヌトナヌずしお有するこずから、 該免疫グロプリン断片に特異的に結合するずいうプロティン Aの性質を甚いたァ フィニティ䞀カラムクロマトグラフィヌを甚いるこずにより該融合タンパクを極 めお容易に粟補するこずが可胜であるずいう点で利点を有する。 さらに、 皮々の 免疫グロプリンの F cに察する皮々の抗䜓が提䟛されおいるこずから、 該 F cに 察する抗䜓を甚いお、 該融合ポリぺプチドのィムノアッセィを簡䟿に行うこずが できる。 本発明の DNAは、 前述の本発明のタンパクたたはその断片をコヌドする DN Aであっお、 本発明のタンパクをコヌドし埗るいかなる塩基配列をも包含し、 ゲ ノミック DNAたたは c DNAのいずれをも包含する。 たた、 該 DNAは、 同䞀 のアミノ酞をコ䞀ドするコドンであればどのようなコドンから構成される DNA をも含む。
たた、 本発明においおは、 同䞀のアミノ酞をコヌドするコドンであればどのよ うなコドンから構成される DNAをも含む。
たた、 本発明における DN Aの奜たしい態様ずしおは、 ヒト由来のタンパクを コヌドする DN Aを挙げるこずができる。
具䜓的な態様ずしおは、 䞋蚘が挙げられる。
(1) 配列番号 10、 12たたは 14で瀺されるアミノ酞配列を含むタンパク あるいは断片のアミノ酞配列䞭に耇数個のアミノ酞、 奜たしくは 1乃至 10個の アミノ酞、 特に奜たしくは 1乃至 5個のアミノ酞を眮換、 欠倱及び/たたは修食 するか、 若しくは該アミノ酞配列に耇数個のアミノ酞、 奜たしくは 1乃至 10個 のアミノ酞、 特に奜たしくは 1乃至 5個のアミノ酞を挿入するこずによっお埗ら れる生物孊的同等物をコヌドする DN Aである。
(2)配列番号 9、 配列番号 11たたは配列番号 13のいずれかに蚘茉される 塩基配列を有する DN Aたたはその断片にハむプリダむズする DNA。
より具䜓的には、 䞋蚘のような DNAが挙げられる。
(1)配列番号 9に蚘茉される塩基配列の塩基番号 276乃至 2096の塩基 配列を有する DN A及びその断片。
(2) 配列番号 11に蚘茉される塩基配列の塩基番号 276乃至 1676の塩 基配列を有する DN A及びその断片。
( 3 )配列番号 13に蚘茉される塩基配列の塩基番号 364乃至 1971の塩 基配列を含む DN A及びその断片。
ここで 「ストリンゞェン卜な条件䞋」 ずしおは、 䟋えば、 次のような条件を挙 げるこずができる。 䟋えば、 50塩基以䞊のプロヌブを甚い、 0.9%NaCl䞋でハむ ブリダィれヌシペンを行う堎合には、 50%の解離を生ずる枩床 Tm) の目安を 䞋蚘蚈算匏から求め、 ハむブリダィれヌシペンの枩床を䞋蚘蚈算匏のように蚭定 するこずができる。
Tm = 82.3°C + 0.4lx (G+C) % -500/n -0.61 x (フオルムアミ ド  (nはプロヌブの塩基数を瀺す。 
枩床 =Tm— 25°C
たた、 100塩基以䞊のプロ䞀プ G+C=40~50%の堎合 を甚いる堎合には、 Tm が䞋蚘  1) 及び 2) のように倉化するこずを目安する。
( 1) 1%ミスマッチ毎に、 Tmが玄 1°C䞋がる。
(2) フオルムアミ ド 1%毎に、 Tmが 0.6〜0.7°C䞋がる。
埓っお、 完党盞補鎖の組み合わせの堎合の枩床条件は䞋蚘のようにするこずが できる。
(A) 65〜75。C (フオルムアミ ド無添加
(B) 35〜45°C (50%フオルムアミ ド存圚䞋
たた、 䞍完党盞補鎖の組み合わせの堎合の枩床条件は䞋蚘のようにするこずが できる。
(A) 45〜55°C (フオルムアミ ド無添加
(B) 35〜42。C (30%フオルムアミ ド存圚䞋
たた、 23塩基以䞋のプロヌブを甚いる堎合の枩床条件は、 37°Cずするこずも できるし、 たた䞋蚘蚈算匏を目安ずするこずもできる。
枩床 =2°Cx (A+Tの数 +4°Cx (C+Gの数 侀 5°C
たた、 本発明の DN Aは、 いかなる方法で埗られるものであっおもよい。 䟋え ば mRNAから調補される盞補 DNA (cDNA) 、 ゲノム DNAから調補され る DNA、 化孊合成によっお埗られる DNA、 RNAたたは DNAを铞型ずしお P CR法で増幅させお埗られる DN Aおよびこれらの方法を適圓に組み合わせお 構築される DN Aをも党お包含するものである。
本発明のタンパクをコヌドする DNAは、 垞法に埓っお本発明のタンパクの m RNAから cDNAをクロヌン化する方法、 ゲノム DN Aを単離しおスプラむシ ング凊理する方法、 化孊合成する方法等により取埗するこずができる。
(1)䟋えば、 本発明のタンパクの mRN Aから cDNAをクロヌン化する方 法ずしおは、 以䞋の方法が䟋瀺される。
たず、 本発明のタンパクを発珟 ·産生する前述のような組織あるいは现胞から 該本発明のタンパクをコヌドする mRNAを調補する。 mRNAの調補は、 䟋え ばグァニゞンチオシァネヌト法 チダヌグりィン Chirgwin) ら、 バむオケミス トリ䞀 Biochemistry) 、 第 18巻、 第 5294頁、 1979幎 、 熱プノヌ ル法もしくは AG P C法等の公知の方法を甚いお調補した党 RN Aをオリゎ d T) セルロヌスやポリ U—セファロ䞀ス等によるァフィ二ティクロマトグラフィ 䞀にかけるこずによっお行うこずができる。
次いで埗られた mRNAを錡型ずしお、 䟋えば逆転写酵玠を甚いる等の公知の 方法、 䟋えばォカャマらの方法 モレキュラヌセルバむオロゞヌ Mol. Cell. Bio 1.)、 第 2卷、 第 161頁、 1982幎及び同誌第 3卷、 第 280頁、 1983 幎 やホフマン Hoffman) らの方法 ゞヌン Gene) 、 第 25巻、 第 263頁、 1983幎 等により cDNA鎖を合成し、 c D N Aの二本鎖 c D N Aぞの倉換 を行う。 この c DNAをプラスミ ドベクタ䞀、 ファヌゞベクタヌたたはコスミ ド ベクタヌに組み蟌み、 倧腞菌を圢質転換しお、 あるいはむンビトロパッケヌゞン グ埌、 倧腞菌に圢質移入 トランスプクト するこずにより cDNAラむブラ リヌを䜜補する。
ここで甚いられるプラスミ ドベクタヌずしおは、 宿䞻内で耇補保持されるもの であれば特に制限されず、 たた甚いられるファヌゞベクタヌずしおも宿䞻内で増 殖できるものであれば良い。 垞法的に甚いられるクロ䞀ニング甚ベクタヌずしお pUC 19、 入 gt l 0、 え g t 11等が䟋瀺される。 ただし、 埌述の免疫孊的 スクリヌニングに䟛する堎合は、 宿䞻内で本発明のタンパクをコ䞀ドする遺䌝子 を発珟させうるプロモ䞀倕䞀を有したベクタ䞀であるこずが奜たしい。
プラスミ ドに c DN Aを組み蟌む方法ずしおは、 䟋えばマニアテむス Maniat is) らの方法 モレキュラヌクロ䞀ニング、 ァ ·ラボラトリヌ 'マニュアル Mo lecular Cloning, A Laboratory Manual , second edition) 、 コ䞀ノレドスプリン グハ䞀バヌラボラトリ䞀 Cold Spring Harbor Laboratory) 、 第 1.53頁、 19 89幎 に蚘茉の方法などが挙げられる。 たた、 ファヌゞベクタヌに cDN Aを 組み蟌む方法ずしおは、 ヒナン Hyunh) らの方法 DN Aクロヌニング、 プラク ティカルアプロヌチ (DNA Cloning, a practical approach) 、 第 1卷、 第 49頁、
1985幎 などが挙げられる。 簡䟿には、 垂販のクロヌニングキッ ト 䟋えば、 宝酒造補等 を甚いるこずもできる。 このようにしお埗られる組換えプラスミ ド やファヌゞベクタ䞀は、 原栞现胞 䟋えば、 E. c o l i : HB 101、 DH 5 ひたたは MC 1061/P 3等 等の適圓な宿䞻に導入する。
プラスミ ドを宿䞻に導入する方法ずしおは、 モレキュラヌクロヌニング、 ァ
- ラボラ 卜リ—— ·マ二ナアノレ (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, seco nd edition) 、 コヌルドスプリングハヌバ䞀ラボラ ト リ䞀 Cold Spring Harbor
Laboratory) 、 第 1.74頁、 1 989幎 に蚘茉の塩化カルシりム法たたは塩化力 ルシゥム /塩化ルビゞりム法、 ゚レクトロボレ䞀シペン法等が挙げられる。 たた、 ファ—ゞベクタ—を宿䞻に導入する方法ずしおはファヌゞ DNAをむンビトロパ ッケヌゞングした埌、 増殖させた宿䞻に導入する方法等が䟋瀺される。 むンビト 口パッケヌゞングは、 垂販のむンビトロパッケヌゞングキット 䟋えば、 ストラ 倕ゞヌン補、 アマシャム補等 を甚いるこずによっお簡䟿に行うこずができる。 䞊蚘の方法によっお䜜補された cDNAラむブラリヌから、 本発明のタンパク をコヌドする cDNAを単離する方法は、 䞀般的な c DNAスクリヌニング法を 組み合わせるこずによっお行うこずができる。
䟋えば、 別個に本発明のタンパクのアミノ酞配列に察応するず考えられるオリ ゎヌクレオチドを化孊合成したのち、 これを32 Pでラベルしおプロヌブずし、 公 知のコロニヌハむブリダィれヌシペン法 クランシュ倕むン Crimstein) ら、 プ 口シ䞀デむングスォブナショナルァカデミ䞀ォブサむ゚ンス Proc. Natl. Acid. Sci. USA) 、 第 72卷、 第 3961頁、 1975幎 たたはプラヌクハむブリダ ィセヌショ ٤ (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory 第 2.108頁、 1989幎 により、 目的の cD NAを含有するクロヌンをスクリヌニングする方法、 P CRプラむマヌを䜜補し 本発明のタンパクの特定領域を P CR法により増幅し、 該領域をコヌドする DN A断片を有するクロヌンを遞択する方法等が挙げられる。
たた、 cDN Aを発珟しうるべクタ䞀 䟋えば、 人 gt 1 1ファ䞀ゞベクタ ―) を甚いお䜜補した c DN Aラむブラリヌを甚いる堎合には、 本発明のタンパ クに反応性を有する抗䜓を甚いる抗原抗䜓反応を利甚しお、 目的のクロヌンを遞 択するこずができる。 倧量にクロヌンを凊理する堎合には、 PCR法を利甚した スクリヌニング法を甚いるこずが奜たしい。
この様にしお埗られた DNAの塩基配列はマキサム 'ギルバヌト法 マキサム (Maxam) ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA.ボ 第 74卷、 第 560頁、 1977 幎 あるいはファヌゞ M 13を甚いたゞデォキシヌクレオチド合成鎖停止の方法 (サンガ䞀 Sanger) らボ Proc. Natl. Acad. Sci. USA.ボ 第 74卷、 第 546 3〜 5467頁、 1977幎 によっお決定するこずができる。 本発明のタンパ クをコ䞀ドする遺䌝子は、 その党郚たたは䞀郚を䞊蚘のようにしお埗られるクロ —ンから制限酵玠等により切り出すこずにより取埗できる。
(2) たた、 前述のような本発明のタンパクを発珟する现胞に由来するゲノム DN Aから本発明のタンパクをコ䞀ドする DN Aを単離するこずによる調補方法 ずしおは、 䟋えば以䞋の方法が䟋瀺される。 該现胞を奜たしくは SDSたたはプ 口ティナ䞀れ K等を甚いお溶解し、 プノヌルによる抜出を反埩しお DN Aの脱 蛋癜質を行う。 RNAを奜たしくはリボヌクレアヌれにより消化する。 埗られる DNAを適圓な制限酵玠により郚分消化し、 埗られる DNA断片を適圓なファヌ ゞたたはコスミ ドで増幅しラむブラリ䞀を䜜成する。 そしお目的の配列を有する クロヌンを、 䟋えば攟射性暙識された DNAプロヌブを甚いる方法等により怜出 し、 該クロヌンから本発明のタンパクをコヌドする遺䌝子の党郚たたは䞀郚を制 限酵玠等により切り出し取埗する。
ヒト由来タンパクをコヌドする cDNAを取埗する堎合には、 さらにヒトゲノ ム DNA (染色䜓 DNA) が導入されたコスミ ドラむスラリヌを䜜補  「ラボマ 二ナアルヒトゲノムマッピング」 、 堀雅明及び䞭村祐茔 線、 äžžå–„ 出版 し、 該コスミ ドラむブラリヌをスクリヌニングするこずにより、 目的タンパクのコ䞀 ディング領域の DN Aを含む陜性クロヌンを埗、 該陜性クロヌンから切り出した コヌディング DN Aをプロ䞀ブずしお甚い、 前述の c DNAラむブラリヌをスク リヌニングするこずにより調補するこずもできる。
(3) たた、 化孊的合成による本発明の DN Aの補造は、 配列番号 9、 1 1た たは 13に蚘茉される塩基配列をもずにしお、 垞法に埓っお行うこずができる。 さらに本発明は、 䞊述の本発明のタンパクをコヌドする DN Aを含有する組換 えベクタヌに関する。 本発明の組換えベクタヌずしおは、 原栞现胞及び/たたは 真栞现胞の各皮の宿䞻内で耇補保持たたは自己増殖できるものであれば特に制限 されず、 プラスミ ドベクタヌおよびファヌゞベクタヌが包含される。
圓該組換えべクタ䞀は、 簡䟿には圓業界においお入手可胜な組換え甚ベクタヌ (プラスミ ド DNAおよびバクテリアファヌゞ DNA) に本発明のタンパクをコ 䞀ドする DN Aを垞法により連結するこずによっお調補するこずができる。 甚い られる組換え甚べクタ䞀ずしお具䜓的には、 倧腞菌由来のプラスミ ドずしお䟋え ば pBR322、 pBR325、 pUC12、 pUC13、 pUC19など、 酵母由来プラスミ ドずしお䟋えば pSH19 pSH15など、 枯草菌由来プラスミ ドずしお䟋えば pUB110、 pTP5、 pC194など が䟋瀺される。 たた、 ファヌゞずしおは、 入ファヌゞなどのパクテリオファヌゞ が、 さらにレトロりむルス、 ヮクシニダりィルス、 栞倚角䜓りィルスなどの動物 や昆虫のりィルス pVL1393、 むンビトロゲン補 が䟋瀺される。
本発明のタンパクをコヌドする DN Aを発珟させ本発明のタンパクを生産させ る目的においおは、 発珟ベクタヌが有甚である。 発珟べクタ䞀ずしおは、 原栞现 胞および/たたは真栞现胞の各皮の宿䞻现胞䞭で本発明のタンパクをコヌドする 遺䌝子を発珟し、 これら蛋癜質を生産する機胜を有するものであれば特に制限さ れない。 䟋えば、 pMAL C2、 pEF-BOS (ヌクレむックァシッ ドリサヌチ Nucleic Acid Research)、 第 18卷、 第 5322頁、 1990幎等 あるいは pME18S (実隓医孊別冊 「遺䌝子工孊ハンドブック」 、 1992幎等 等を挙げるこずが できる。
宿䞻现胞ずしお现菌、 特に倧腞菌を甚いる堎合、 䞀般に発珟べクタ䞀は少なく ずもプロモヌタ䞀䞀オペレヌタヌ領域、 開始コドン、 本発明のタンパクをコヌド する DNA、 終止コドン、 タヌミネヌタ䞀領域および耇補可胜単䜍から構成され る。
宿䞻ずしお酵母、 動物现胞たたは昆虫现胞を甚いる堎合、 発珟べクタ䞀は少な くずもプロモヌタヌ、 開始コドン、 本発明のタンパクをコヌドする DNA、 終止 コドンを含んでいるこずが奜たしい。 たたシグナルべプチドをコ䞀ドする DNA、 ェンハンサ䞀配列、 本発明のタンパクをコヌドする遺䌝子の 5 偎および 3' 偎 の非翻蚳領域、 スプラむシング接合郚、 ポリアデニレヌシペン郚䜍、 遞択マヌカ 䞀領域たたは耇補可胜単䜍などを含んでいおもよい。 たた、 目的に応じお通垞甚 いられる遺䌝子増幅遺䌝子 マ䞀カヌ を含んでいおもよい。
现菌䞭で本発明の倕ンパクを発珟させるためのプロモヌ倕䞀䞀オペレヌタヌ領 域は、 プロモヌタヌ、 オペレヌタヌおよび Shine- Dalgarno(SD)配列 䟋えば、 A AGGなど を含むものである。 䟋えば宿䞻がェシ゚リキア属菌の堎合、 奜適に は Trpプロモヌタヌ、 lacプロモ䞀倕䞀、 re cAプロモヌタヌ、 人 PLプ ロモ—倕䞀、 ι ρ ρプロモ—倕—、 t a cプロモヌ倕䞀などを含むものが䟋瀺さ れる。 酵母䞭で本発明のタンパクを発珟させるためのプロモヌ倕䞀ずしおは、 P HO 5プロモヌタヌ、 PGKプロモヌ倕䞀、 GAPプロモヌ倕䞀、 ADHプロモ —倕䞀が挙げられ、 宿䞻がバチルス属菌の堎合は、 S L 0 1プロモヌ倕䞀、 SP 02プロモヌ倕䞀、 p e nPプロモヌ倕䞀などが挙げられる。 たた、 宿䞻が哺乳 動物现胞等の真栞现胞である堎合、 S V40由来のプロモヌタ䞀、 レトロりィル スのプロモヌタヌ、 ヒヌトショックプロモ䞀倕䞀などが挙げられる。 奜たしくは、 SV— 40、 レトロりむルスである。 しかし、 特にこれらに限定されるものでは ない。 たた、 発珟にはェンハンサ䞀の利甚も効果的な方法である。
奜適な開始コドンずしおは、 メチォニンコドン ATG) が䟋瀺される。
終止コドンずしおは、 垞甚の終止コドン 䟋えば、 TAG、 TGA、 TAA) が䟋瀺される。
倕䞀ミネ䞀倕䞀領域ずしおは、 通垞甚いられる倩然たたは合成の倕䞀ミネ䞀倕 䞀を甚いるこずができる。
耇補可胜単䜍ずは、 宿䞻现胞䞭でその党 D N A配列を耇補するこずができる胜 力をも぀ DNAを蚀い、 倩然のプラスミ ド、 人工的に修食されたプラスミ ド 倩 然のプラスミ ドから調補された DNAフラグメント および合成プラスミ ド等が 含たれる。 奜適なプラスミ ドずしおは、 E. coliではプラスミ ド pBR 322、 も しくはその人工的修食物 pBR 322を適圓な制限酵玠で凊理しお埗られる D NAフラグメント が、 酵母では酵母 2〃プラスミ ド、 もしくは酵母染色䜓 DN Aが、 たた哺乳動物现胞ではプラスミ ド pRSVneo ATCC 37198、 プラスミ ド pSV2dh fr ATCC 37145、 プラスミ ド pdBPV- MMTneo ATCC 37224、 プラスミ ド pSV2neo ATCC 37149等があげられる。
ェンハンサ䞀配列、 ポリアデ二レヌション郚䜍およびスプラむシング接合郚䜍 に぀いおは、 䟋えばそれそれ SV40に由来するもの等、 圓業者においお通垞䜿 甚されるものを甚いるこずができる。
遞択マ䞀カヌずしおは、 通垞䜿甚されるものを垞法により甚いるこずができる。 䟋えばテトラサむクリン、 アンピシリン、 たたはカナマむシン等の抗生物質耐性 遺䌝子等が䟋瀺される。
遺䌝子増幅遺䌝子ずしおは、 ゞヒドロ葉酞レダク倕䞀れ DHFR)遺䌝子、 チミゞンキナヌれ遺䌝子、 ネオマむシン耐性遺䌝子、 グルタミン酞合成酵玠遺䌝 子、 アデノシンデアミナヌれ遺䌝子、 オル二チンデカルボキシラ䞀れ遺䌝子、 ヒ グロマむシン䞀 B—ホスホトランスフェラ䞀れ遺䌝子、 ァスパルラ䞀トトランス 力ルバミラ䞀れ遺䌝子等を䟋瀺するこずができる。
本発明の発珟べクタ䞀は、 少なくずも、 䞊述のプロモヌ倕䞀、 開始コドン、 本 発明のタンパクをコ䞀ドする DNA、 終止コドンおよび倕䞀ミネ䞀倕䞀領域を連 続的か぀環状に適圓な耇補可胜単䜍に連結するこずによっお調補するこずができ る。 たたこの際、 所望により制限酵玠での消化や T 4 DNAリガヌれを甚いるラ ィゲ䞀シペン等の垞法により適圓な DNAフラグメント 䟋えば、 リンカ䞀、 他 のリストリクシペンサむ トなど を甚いるこずができる。
本発明の圢質転換现胞は、 䞊述の発珟ベクタヌを宿䞻现胞に導入するこずによ り調補するこずができる。
本発明で甚いられる宿䞻现胞ずしおは、 前蚘の発珟べクタ䞀に適合し、 圢質転 換されうるものであれば特に限定されず、 本発明の技術分野においお通垞䜿甚さ れる倩然现胞あるいは人工的に暹立された組換え现胞など皮々の现胞 䟋えば、 现菌 ェシヱリキア属菌、 バチルス属菌 、 酵母 サッカロマむセス属、 ピキア 属など 、 動物现胞たたは昆虫现胞など が䟋瀺される。
奜たしくは倧腞菌あるいは動物现胞であり、 具䜓的には倧腞菌 DH5a、 T B 1、 HB 101等 、 マりス由来现胞 COP、 L、 C127、 Sp2/0、 NS- 1たたは N I H3T3等 、 ラット由来现胞、 ハムスタヌ由来现胞 BHK および CH〇等 、 サル由来现胞 COS l、 COS3、 CO S 7N CV1およ び Ve 1 o等 およびヒト由来现胞 He 1 a、 2倍䜓線維芜现胞に由来する现 胞、 ミ゚口䞀マ现胞および Nama 1 wa等 などが䟋瀺される。
発珟べクタ䞀の宿䞻现胞ぞの導入 圢質転換 圢質移入  は埓来公知の方法 を甚いお行うこずができる。
䟋えば、 现菌 (E.coli Bacillus subtilis等) の堎合は、 䟋えば Cohenらの方 法 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 第 69卷、 第 2 1 10頁、 1972幎  、 プロトプラスト法 Mol. Gen. Genet.、 第 168巻、 第 1 1 1頁、 197 9 幎 やコンビテント法 ゞャヌナルォブモレキュラヌバむオロゞヌ J. Mol. Bi ol.) 、 第 56卷、 第 209頁、 197 1幎 によっお、 Saccharomyces cerevis iaeの堎合は、 䟋えばハむネン Hinnen) らの方法 Proc. Natl. Acad. Sci. US A.、 第 75卷、 第 1927頁、 1978幎 やリチりム法 J. Bacteriol.、 第 153卷、 第 163頁、 1983幎 によっお、 動物现胞の堎合は、 䟋えばグラ ハム Graham) の方法 バむロロゞ䞀 Virology) 、 第 52巻、 第 456頁、 1 973幎 、 昆虫现胞の堎合は、 䟋えばサマヌズ Summers) らの方法 Mol. Ce 11. Biol., 第 3卷、 第 2 156〜第 2 165頁、 1 983幎 によっおそれそ れ圢質転換するこずができる。
本発明のタンパクは、 䞊蚘の劂く調補される発珟ベクタヌを含む圢質転換现胞 (以䞋、 圢質移入䜓を包含する意味で䜿甚する。  を栄逊培地で培逊するこずに よっお補造するこずができる。
栄逊培地は、 宿䞻现胞 圢質転換䜓 の生育に必芁な炭玠源、 無機窒玠源もし くは有機窒玠源を含んでいるこずが奜たしい。 炭玠源ずしおは、 䟋えばグルコ䞀 ス、 デキストラン、 可溶性デンプン、 ショ糖などが、 無機窒玠源もしくは有機窒 玠源ずしおは、 䟋えばアンモニゥム塩類、 硝酞塩類、 アミノ酞、 コヌンスチヌプ • リカヌ、 ペプトン、 カれむン、 肉゚キス、 倧豆粕、 バレむショ抜出液などが䟋 瀺される。 たた所望により他の栄逊玠 䟋えば、 無機塩 䟋えば塩化カルシりム、 リン酞二氎玠ナトリりム、 塩化マグネシりム 、 ビタミン類、 抗生物質 䟋えば テトラサむクリン、 ネオマむシン、 アンピシリン、 カナマむシン等 など を含 んでいおもよい。
培逊は圓業界においお知られおいる方法により行われる。 培逊条件、 䟋えば枩 床、 培地の PHおよび培逊時間は、 本発明のタンパクが倧量に生産されるように 適宜遞択される。
なお、 䞋蚘に宿䞻现胞に応じお甚いられる具䜓的な培地および培逊条件を䟋瀺 するが、 䜕らこれらに限定されるものではない。
宿䞻が现菌、 攟線菌、 酵母、 糞状菌である堎合、 䟋えば䞊蚘栄逊源を含有する 液䜓培地が適圓である。 奜たしくは、 pHが 5〜8である培地である。
宿䞻が E. coli の堎合、 奜たしい培地ずしお LB培地、 M9培地 ミラ䞀 Mi Her) ら、 Exp. Mol. Genets Cold Spring Harbor Laboratoryボ 第 431頁、 1 972幎 等が䟋瀺される。 かかる堎合、 培逊は、 必芁により通気、 撹拌しなが ら、 通垞 14〜43°C、 箄 3〜24時間行うこずができる。
宿䞻が Bacillus属菌の堎合、 必芁により通気、 撹拌をしながら、 通垞 30〜4 0° 箄 16〜96時間行うこずができる。
宿䞻が酵母である堎合、 培地ずしお、 䟋えば Burkholder最小培地 ボスチアン (Bostian) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第 77卷、 第 4505頁、 1980 幎 が挙げられ、 pHは 5〜8であるこずが望たしい。 培逊は通垞玄 20〜35 °Cで玄 14〜144時間行なわれ、 必芁により通気や撹拌を行うこずもできる。 宿䞻が動物现胞の堎合、 培地ずしお䟋えば玄 5〜 20%の胎児牛血枅を含む M EM培地 サむ゚ンス Science) 、 第 122卷、 第 50 1頁、 1952幎 、 D MEM培地 バむロロゞヌ Virology) 、 第 8卷、 第 396頁、 1959幎 、 RPM I 1640培地 J. Am. Med. Assoc.、 第 1 99卷、 第 5 19頁、 196 7幎 、 199培地 proc. Soc. Exp. Biol. Med.、 第 73卷、 第 1頁、 195 0幎 等を甚いるこずができる。 培地の pHは玄 6〜8であるのが奜たしく、 培 逊は通垞玄 30〜40°Cで玄 1 5〜72時間行なわれ、 必芁により通気や撹拌を 行うこずもできる。
宿䞻が昆虫现胞の堎合、 䟋えば胎児牛血枅を含む Grace's培地 Pro Natl. A cad. Sci. USA 第 82卷、 第 8404頁、 1985幎 等が挙げられ、 その pH は玄 5〜 8であるのが奜たしい。 培逊は通垞玄 2 0〜4 0 °Cで 1 5〜 1 0 0時間 行なわれ、 必芁により通気や撹拌を行うこずもできる。
本発明の受容䜓は、 䞊述のような圢質転換现胞、 特に動物现胞を培逊するこず により、 その现胞衚面に目的分子を高発珟させるこずが可胜である。 䞀方、 本発 明の倕ンパクを、 现胞倖領域倕ンパクフラグメントのような可溶性倕ンパクずし お補造する堎合には、 圓該现胞倖領域あるいは各ドメむンをコヌドする D N Aを 甚いお䞊述のように圢質転換䜓を調補し、 該圢質転換䜓を培逊するこずにより培 逊䞊枅䞭に分泌させるこずにより補造するこずができる。
すなわち、 埗られた培逊物を濟過たたは遠心分離等の方法で培逊濟液 䞊枅 を埗、 該培逊濟液から倩然たたは合成蛋癜質を粟補䞊びに単離するために䞀般に 甚いられる垞法に埓っお該本発明のタンパクを粟補、 単離する。
単離、 粟補方法ずしおは、 䟋えば塩析、 溶媒沈柱法等の溶解床を利甚する方法、 透析、 限倖濟過、 ゲル濟過、 ドデシル硫酞ナトリりム—ポリアクリルアミ ドゲル 電気泳動など分子量の差を利甚する方法、 むオン亀換クロマトグラフィヌゃヒド ロキシルァパタむ トク口マトグラフィヌなどの荷電を利甚する方法、 ァフィニテ ィヌクロマトグラフィ䞀などの特異的芪和性を利甚する方法、 逆盞高速液䜓ク口 マトグラフィ䞀などの疎氎性の差を利甚する方法、 等電点電気泳動などの等電点 の差を利甚する方法などが挙げられる。
䞀方、 本発明のタンパクが培逊された圢質転換䜓のペリブラズムたたは现胞質 内に存圚する堎合は、 培逊物を濟過たたは遠心分離などの垞法に付しお菌䜓ある いは现胞を集め、 適圓な緩衝液に懞濁し、 䟋えば超音波ゃリゟチヌム及び凍結融 解などの方法で现胞等の现胞壁および/たたは现胞膜を砎壊した埌、 遠心分離や 濟過などの方法で本発明のタンパクを含有する膜画分を埗る。 該膜画分をトラむ トン— X 1 0 0等の界面掻性剀を甚いお可溶化しお粗溶液を埗る。 そしお、 圓該 粗溶液を先に䟋瀺したような垞法を甚いるこずにより、 単離、 粟補するこずがで きる。 䞊述のように取埗、 調補される本発明のタンパクに包含されるヒト由来のタン パクをコヌドする DNA (cDNAたたはゲノミック DNA) を甚いれば、 トラ ンスゞ゚ニック非ヒト哺乳動物、 即ち、 該ヒト由来の DNAが、 非ヒト哺乳動物 (䟋えばマりス の内圚性遺䌝子座䞊にむンテグレヌト integrate) されおおり. 䜓内に該 DNAによりコヌドされる本発明のタンパクを発珟、 分泌するヒト以倖 のトランスゞ゚ニック哺乳動物を䜜補するこずができる。 このトランスゞェニッ ク非ヒト哺乳動物も本願の発明に属する。
該トランスゞ゚ニック非ヒト哺乳動物は、 トランスゞヱニック動物の補造にお いお通垞䜿甚されるような垞法 䟋えば、 最新動物现胞実隓マニュアル、 ゚ル · アむ ·シヌ発行、 第 7章、 第 36 1〜第 408頁、 1 990幎を参照 に埓っお 䜜補するこずができる。
具䜓的には、 䟋えば、 トランスゞ゚ニックマりスの堎合には、 正垞マりス胚盀 胞 (blastcyst) から取埗した胚性幹现胞 (Embryonic Stem Cell, ES Cell) を、 本発明のヒト由来のタンパクをコヌドする遺䌝子及びマヌカヌ遺䌝子 䟋えば、 ネオマむシン耐性遺䌝子 が発珟可胜なように挿入された発珟ベクタヌで圢質転 換する。 該本発明のヒト由来のタンパクをコヌドする遺䌝子が内圚性遺䌝子䞊に ィンテグレヌ卜された E S现胞を、 マヌカ䞀遺䌝子の発珟の有無に基づいお垞法 により遞別する。 次いで、 遞別した E S现胞を、 別の正垞マりスから取埗した受 粟卵 胚盀胞 にマむクロむンゞェクションする Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384, 1980米囜特蚱第 4,873 191号公報 。
該胚盀胞を仮芪ずしおの別の正垞マりスの子宮に移怍する。 そうしお該仮芪マ りスから、 フアりンダヌマりス 子マりス が生たれる。 該フアりンダ䞀マりス を正垞マりスず亀配させるこずによりヘテロ トランスゞ゚ニックマりスを埗る。 該ヘテロ heterogeneic) トランスゞ゚ニックマりス同士を亀配するこずにより、 メンデルの法則に埓っお、 ホモ homogeneic) トランスゞ゚ニックマりスが埗ら れる。 たた、 本発明に包含されるマりスに由来するタンパクをコ䞀ドする D N Aの塩 基配列に基づいお、 いわゆる 「ノックアりトマりス」 を䜜補するこずができる。 本発明における 「ノックアりトマりス」 ずは、 本発明のマりス由来のタンパクを コヌドする内圚性遺䌝子がノックアりト 䞍掻性化 されたマりスであり、 䟋え ば盞同組換えを応甚したポゞティブネガティブセレクション法 米囜特蚱第 546 4, 764号公報、 同 5, 487, 992号公報、 同 5,627,059号公報、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA, Vol.86, 8932-8935, 1989、 Nature, Vol.342, 435-438, 1989など) を 甹 いお䜜補するこずができ、 このようなノックァゥトマりスも本発明の䞀態様であ る。
本発明における 「抗䜓」 ずは、 ポリクロ䞀ナル抗䜓 抗血枅 あるいはモノク ロヌナル抗䜓を意味し、 奜たしくはモノクロヌナル抗䜓である。
具䜓的には、 前述の本発明のタンパクたたはそのフラグメントに反応性を有す る抗䜓である。
本発明の 「抗䜓」 は、 本発明のタンパク 倩然䜓、 組換え䜓、 合成物、 现胞 等 若しくはその断片あるいは前述のような遺䌝子組換え技術により目的タンパ クをその现胞衚面に高発珟させた圢質転換䜓を、 マりス、 ラッ ト、 ハムス倕䞀、 モルモッ トあるいはゥサギ等の哺乳動物に免疫しお埗られる倩然型抗䜓、 遺䌝子 組換え技術を甚いお補造され埗るキメラ抗䜓及びヒト型抗䜓 CDR- grafted抗䜓 、 䞊びにヒト抗䜓産生トランスゞ゚ニック動物等を甚いお補造され埗るヒト抗䜓も 包含する。
たたモノクロヌナル抗䜓の堎合には、 I g G、 I g M、 I g A、 I g Dあるい は I g E等のいずれのアむ゜タむプを有するモノクロヌナル抗䜓をも包含する。 奜たしくは、 I g Gたたは I g Mである。
本発明で蚀うポリクロヌナル抗䜓 抗血枅 あるいはモノクロヌナル抗䜓は、 既存の䞀般的な補造方法によっお補造するこずができる。 即ち、 䟋えば、 抗原を、 必芁に応じおフロむントアゞュバント Freund' s Adjuvant) ずずもに、 哺乳動物、 奜たしくは、 マりス、 ラヅ ト、 ハムスタヌ、 モルモット、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ブ倕、 ャギ、 ゥマあるいはゥシ、 より奜たしくはマりス、 ラット、 ハムスタヌ、 モルモッ トたたはゥサギに免疫する。 ポリクロ䞀ナル抗䜓は、 該免疫感䜜動物か ら埗た血枅から取埗するこずができる。 たたモノクロヌナル抗䜓は、 該免疫感䜜 動物から埗た該抗䜓産生现胞ず自己抗䜓産生胜のない骚髄腫系现胞 ミ゚口䞀マ 现胞 からハむプリ ドヌマを調補し、 該ハむプリ ドヌマをクロヌン化し、 哺乳動 物の免疫に甚いた抗原に察しお特異的芪和性を瀺すモノクロヌナル抗䜓を産生す るクロヌンを遞択するこずによっお補造される。
モノクロヌナル抗䜓は、 具䜓的には䞋蚘のようにしお補造するこずができる。 即ち、 前述のような本発明のタンパク若しくはその断片あるいは該倕ンパクを発 珟しおいる现胞等を免疫原ずしお、 該免疫原を、 必芁に応じおフロむントアゞュ ノ ント FreuncT s Adjuvant) ずずもに、 マりス、 ラット、 ハムスタヌ、 モルモッ トあるいはゥサギ、 奜たしくはマりス、 ラッ トあるいはハムスタヌ ヒト抗䜓産 生トランスゞ゚ニックマりスのような他の動物由来の抗䜓を産生するように䜜出 されたトランスゞ゚ニック動物を含む の皮䞋内、 筋肉内、 静脈内、 フッドパッ ド内あるいは腹腔内に 1乃至数回泚射するかあるいは移怍するこずにより免疫感 䜜を斜す。 通垞、 初回免疫から玄 1乃至 1 4日毎に 1乃至 4回免疫を行っお、 最 終免疫より玄 1乃至 5日埌に免疫感䜜された該哺乳動物から抗䜓産生现胞が取埗 される。
モノクロヌナル抗䜓を分泌するハむプリ ドヌマの調補は、 ケ䞀ラヌ及びミルシ ナタむンらの方法 ネむチダヌNature), 第 2 5 6巻、 第 4 9 5〜第 4 9 7頁、 1 9 7 5幎 及びそれに準じる修食方法に埓っお行うこずができる。 即ち、 前述 の劂く免疫感䜜された哺乳動物から取埗される脟臓、 リンパ節、 骚髄あるいは扁 桃等、 奜たしくは脟臓に含たれる抗䜓産生现胞ず、 奜たしくはマりス、 ラット、 モルモット、 ハムスタヌ、 ゥサギたたはヒト等の哺乳動物、 より奜たしくはマり ス、 ラットたたはヒ ト由来の自己抗䜓産生胜のないミ゚口䞀マ现胞ずを现胞融合 させるこずにより調補される。
现胞融合に甚いられるミ゚ロヌマ现胞ずしおは、 䟋えばマりス由来ミ゚ロヌマ
P3/X63-AG8.653 ( 653  ATCC No.CRL1580) 、 P3/NSI/l-Ag4-l (NS- 1 ) 、 P 3/X63-Ag8.Ul (P 3U 1) 、 SP2/0-Agl4 (Sp 2/〇、 Sp 2) 、 PAI、 FOあるい は BW5147、 ラット由来ミ゚ロヌマ 210RCY3-Ag.2.3.、 ヒト由来ミ゚ロヌマ U-266AR 1、 GM1500-6TG- A1 - 2、 UC729- 6、 CEM-AGR, D1R11あるいは CEM-T15を䜿甚するこず ができる。
モノクロヌナル抗䜓を産生するハむプリ ドヌマクロヌンのスクリヌニングは、 ハむプリ ドヌマを、 䟋えばマむクロタむ倕䞀プレヌト䞭で培逊し、 増殖の芋られ たゥェルの培逊䞊枅の前述のマりス免疫感䜜で甚いた免疫抗原に察する反応性を、 䟋えば R I Aや E L I S A等の酵玠免疫枬定法によっお枬定するこずにより行な うこずができる。
ハむプリ ドヌマからのモノクロヌナル抗䜓の補造は、 ハむプリ ドヌマをむンビ トロ、 たたはマりス、 ラット、 モルモット、 ハムスタヌたたはゥサギ等、 奜たし くはマりスたたはラヅト、 より奜たしくはマりスの腹氎䞭等でのむンビボで行い、 埗られた培逊䞊枅、 たたは哺乳動物の腹氎から単離するこずにより行うこずがで きる。
むンビトロで培逊する堎合には、 培逊する现胞皮の特性、 詊隓研究の目的及び 培逊方法等の皮々条件に合わせお、 ハむプリ ドヌマを増殖、 維持及び保存させ、 培逊䞊枅䞭にモノクロヌナル抗䜓を産生させるために甚いられるような既知栄逊 培地あるいは既知の基本培地から誘導調補されるあらゆる栄逊培地を甚いお実斜 するこずが可胜である。
基本培地ずしおは、 䟋えば、 Ham F 12培地、 MCDB 153培地あるい は䜎カルシりム MEM培地等の䜎カルシりム培地及び MCDB 104培地、 ME M培地、 D— MEM培地、 RPMI 1640培地、 A S F 104培地あるいは R D培地等の高カルシりム培地等が挙げられ、 該基本培地は、 目的に応じお、 䟋え ば血枅、 ホルモン、 サむ ト力むン及び Zたたは皮々無機あるいは有機物質等を含 有するこずができる。
モノクロヌナル抗䜓の単離、 粟補は、 䞊述の培逊䞊枅あるいは腹氎を、 飜和硫 酞アンモニゥム、 ナヌグロブリン沈柱法、 力プロむン酞法、 力プリル酞法、 ィォ ン亀換クロマトグラフィヌ 0 八£たたは0 £ 5 2等 、 抗ィムノグロプリン カラムあるいはプロティン Aカラム等のァフィニティカラムクロマトグラフィヌ に䟛するこず等により行うこずができる。
たた、 圓該ハむプリ ド䞀マからモノクロヌナル抗䜓をコヌドする遺䌝子をクロ —ニングし、 トランスゞ゚ニック動物䜜補技術を甚いお圓該抗䜓コ䞀ディング遺 䌝子が内圚性遺䌝子に組み蟌たれたトランスゞ゚ニックなゥサギ、 ャギ、 ヒッゞ たたはブ倕を䜜補し、 圓該トランスゞ゚ニック動物のミルク䞭から圓該抗䜓遺䌝 子に由来するモノクロヌナル抗䜓を倧量に取埗するこずも可胜である 日系サむ ゚ンス、 1997幎 4月号、 第 7 8頁乃至 8 4頁 。
本発明における 「キメラ抗䜓」 は、 遺䌝子工孊的に䜜補されるモノクロヌナル 抗䜓であっお、 具䜓的には、 䟋えば、 その可倉領域がマりスィムノグロプリン由 来の可倉領域であり、 か぀その定垞領域がヒトむムノグロプリン由来の定垞領域 であるこずを特城ずするマりス/ヒトキメラモノクロヌナル抗䜓等のキメラモノ クロヌナル抗䜓を意味する。
ヒ トむムノグロブリン由来の定垞領域は、 I g G、 I gM、 I g A、 I g D及 び I g E等のアむ゜タむプにより各々固有のアミノ酞配列を有するが、 本発明に おける組換えキメラモノクロヌナル抗䜓の定垞領域はいずれのアむ゜タむプに属 するヒトむムノグログリンの定垞領域であっおもよい。 奜たしくは、 ヒト I g G の定垞領域である。
本発明におけるキメラモノクロヌナル抗䜓は、 䟋えば以䞋のようにしお補造す るこずができる。 しかしながら、 そのような補造方法に限定されるものでないこ ずは蚀うたでもない。 䟋えば、 マりス/ヒトキメラモノクロヌナル抗䜓は、 実隓医孊 臚時増刊号 、 第 1. 6卷、 第 10号、 1988幎及び特公平第 3— 73280号公報等を参照 しながら䜜補するこずができる。 即ち、 マりスモノクロヌナル抗䜓を産生するハ ィプリ ドヌマから単離した該マりスモノクロヌナル抗䜓をコ䞀ドする DNAから 取埗した掻性な V H遺䌝子  H鎖可倉領域をコヌドする再配列された V D J遺䌝 子 の䞋流に、 ヒトむムノグロムリンをコヌドする DN Aから取埗した CH遺䌝子 (H鎖定垞領域をコヌドする C遺䌝子 を、 たた該ハむブリ ドヌマから単離した マりスモノクロヌナル抗䜓をコ䞀ドする DNAから取埗した掻性な VL遺䌝子 L 鎖可倉領域をコヌドする再配列された V J遺䌝子 の䞋流にヒトむムノグロムリ ンをコ䞀ドする DNAから取埗した CL遺䌝子 L鎖定垞領域をコヌドする C遺䌝 子 を、 各々発珟可胜なように配列しお 1぀又は別々の発珟べクタ䞀に挿入し、 該発珟ベクタヌで宿䞻现胞を圢質転換し、 該圢質転換现胞を培逊するこずにより 䜜補するこずができる。
具䜓的には、 たず、 マりスモノクロヌナル抗䜓産生ハむプリ ドヌマから垞法に より DNAを抜出埌、 該 DNAを適切な制限酵玠 䟋えば E coRI、 Hind III等 を甚いお消化し、 電気泳動に付しお 䟋えば 0. 7%ァガロヌスゲル䜿 甚 サザンブロヅト法を行う。 泳動したゲルを䟋えばェチゞゥムブ口マむ ド等で 染色し、 写真撮圱埌、 マヌカヌの䜍眮を付し、 ゲルを 2回氎掗し、 0. 25M HC 1溶液に 15分間浞す。 次いで、 0. 4NのNaOH溶液に10分間浞し、 その間緩やかに振盪する。 垞法により、 フィル倕䞀に移し、 4時間埌フィル倕䞀 を回収しお 2 XSSCで 2回掗浄する。 フィルタヌを十分也燥した埌、 ペむキン グ 75°C、 3時間 を行う。 ペむキング終了埌に、 該フィル倕䞀を 0. l xS SC/0. 1%SDS溶液に入れ、 65 °Cで 30分間凊理する。 次いで、 3 xS SC/0. 1%SDS溶液に浞す。 埗られたフィルタヌをプレハむブリダィれ䞀 シペン液ず共にビニヌル袋に入れ、 65°Cで 3~4時間凊理する。
次に、 この䞭に32 P暙識したプロヌブ DNA及びハむプリダむれヌシペン液を 入れ、 65°Cで 1 2時間皋床反応させる。 ハむブリダィれ䞀シペン終了埌、 適切 な塩濃床、 反応枩床および時間 䟋えば、 2 X S S C— 0. 1%SD S溶液、 宀 枩、 1 0分間 のもずで、 フィル倕䞀を掗う。 該フィル倕䞀をビニヌル袋に入れ、 2 X S S Cを少量加え、 密封し、 オヌトラゞオグラフィ䞀を行う。
䞊蚘サザンブロッ ト法により、 マりスモノクロヌナル抗䜓の H鎖及び L鎖を各 々コヌドする再配列された VD J遺䌝子及び V J遺䌝子を同定する。 同定した D NA断片を含む領域をショ糖密床募配遠心にお分画し、 ファヌゞベクタ䞀 䟋え ば、 Charon 4A、 Charon 28、 人 EMBL 3、 人 EMBL 4等 に組み蟌み、 該フ ァ―ゞベクタヌで倧腞菌 䟋えば、 LE392、 NM539等を圢質転換し、 ゲノムラむブ ラリ䞀を䜜補する。 そのゲノムラむブラリ䞀を適圓なプロヌブ H鎖 J遺䌝子、 L鎖 A:) J遺䌝子等 を甚いお、 䟋えばベントンデむビス法 サむ゚ンスSci ence)、 第 1 96卷、 第 180〜第 1 82頁、 1 977幎 に埓っお、 プラヌクハ ィブリダむれ䞀ションを行い、 再配列された V D J遺䌝子あるいは V J遺䌝子を 各々含むポゞティブクロ䞀ンを埗る。 埗られたクロヌンの制限酵玠地図を䜜補し、 塩基配列を決定し、 目的ずする再配列された VH(VDJ)遺䌝子あるいは VL(VJ)遺䌝 子を含む遺䌝子が埗られおいるこずを確認する。
䞀方、 キメラ化に甚いるヒト CH遺䌝子及びヒト CL遺䌝子を別に単離する。 䟋 えば、 ヒト I gGlずのキメラ抗䜓を䜜補する堎合には、 CH遺䌝子である Cァ 1遺 䌝子ず CL遺䌝子である C/c遺䌝子を単離する。 これらの遺䌝子はマりス免疫グロ プリン遺䌝子ずヒト免疫グロプリン遺䌝子の塩基配列の高い盞同性を利甚しおヒ ト Cァ 1遺䌝子及びヒト C A:遺䌝子に盞圓するマりス Cァ 1遺䌝子及びマりス C A 遺䌝子をプロヌブずしお甚い、 ヒトゲノムラむブラリ䞀から単離するこずによ぀ お埗るこずができる。
具䜓的には、 䟋えば、 クロヌン I g l 46 (プロシヌディングスナショナルァ 力デミヌォブサむ゚ンスProc. Natl. Acad. Sci. USA), 第 75卷、 第 4709 〜第 47 1 3頁、 1 978幎 からの 3 kbの H i ndlll— B amH I断片ずク ロヌン ME P 10 (プロシヌディングスナショナルアカデミヌォブサむ゚ンスP roc. Natl. Acad. Sci. USA), 第 78巻、 第 474〜第 478頁、 1981幎 からの 6. 8 kbの E c oR I断片をプロヌブずしお甚い、 ヒトのラムダ Charon 4Aの Haelll— Alu lゲノムラむブラリ䞀 セルCell)、 第 15巻、 第 1 1 57〜第 1 174頁、 1978幎 䞭から、 ヒト C 遺䌝子を含み、 ェンハンサ —領域を保持しおいる DNA断片を単離する。 たた、 ヒト Cァ 1遺䌝子は、 䟋えば ヒト胎児肝现胞 D N Aを H i n d 111で切断し、 ァガロヌスゲル電気泳動で分画し た埌、 5. 9 kbのバンドをえ 788に挿入し、 前蚘のプロヌブを甚いお単離す る。
このようにしお単離されたマりス VH遺䌝子ずマりス VL遺䌝子、 及びヒト CH遺 䌝子ずヒト CL遺䌝子を甚いお、 プロモヌタ䞀領域及びェンハンサ䞀領域などを考 慮しながらマりス VH遺䌝子の䞋流にヒト CH遺䌝子を、 たたマりス VL遺䌝子の䞋 流にヒト CL遺䌝子を、 適切な制限酵玠及び DNAリガヌれを甚いお、 䟋えば pS V 2 gp tあるいは p S V2 n e o等の発珟ベクタヌに垞法に埓っお組み蟌む。 この際、 マりス VH遺䌝子/ヒト CH遺䌝子ずマりス VL遺䌝子/ヒト CL遺䌝子の キメラ遺䌝子は、 䞀぀の発珟ベクタヌに同時に配眮されおもよいし、 各々別個の 発珟べクタ䞀に配眮するこずもできる。
このようにしお䜜補したキメラ遺䌝子挿入発珟ベクタヌを、 䟋えば P3X63'Ag8' 653现胞あるいは SP210现胞ずいった、 自らは抗䜓を産生しおいない骚髄腫现胞に プロトプラスト融合法、 DE AE—デキストラン法、 リン酞カルシりム法あるい は電気穿孔法等により導入する。 圢質転換现胞は、 発珟ベクタヌに導入された薬 物耐性遺䌝子に察応する薬物含有培地䞭での培逊により遞別し、 目的ずするキメ ラモノクロヌナル抗䜓産生现胞を取埗する。
このようにしお遞別された抗䜓産生现胞の培逊䞊枅䞭から目的のキメラモノク 口䞀ナル抗䜓を取埗する。
本発明における 「ヒト型抗䜓 CDR- grafted抗䜓 」 は、 遺䌝子工孊的に䜜補さ れるモノクロヌナル抗䜓であっお、 具䜓的には、 䟋えば、 その超可倉領域の盞補 性決定領域の䞀郚たたは党郚がマりスモノクロヌナル抗䜓に由来する超可倉領域 の盞補性決定領域であり、 その可倉領域の枠組領域がヒトむムノグロブリン由来 の可倉領域の枠組領域であり、 か぀その定垞領域がヒトむムノグロブリン由来の 定垞領域であるこずを特城ずするヒト型モノクロヌナル抗䜓を意味する。
ここで、 超可倉領域の盞補性決定領域ずは、 抗䜓の可倉領域䞭の超可倉領域に 存圚し、 抗原ず盞補的に盎接結合する郚䜍である 3぀の領域 Complementarity- determining residue CDR 1、 CDR 2, CDR3) を指し、 たた可倉領域の 枠組領域ずは、 該 3぀の盞補性決定領域の前埌に介圚する比范的保存された 4぀ の領域 Framework F R 1、 FR2、 FR3、 FR4) を指す。
換蚀すれば、 䟋えばマりスモノクロヌナル抗䜓の超可倉領域の盞補性決定領域 の䞀郚たたは党郚以倖の党おの領域が、 ヒトむムノグロプリンの察応領域ず眮き 代わったモノクロヌナル抗䜓を意味する。
ヒトむムノグロブリン由来の定垞領域は、 I gG、 I gM、 I gA、 I gD及 び I gE等のアむ゜タむプにより各々固有のアミノ酞配列を有するが、 本発明に おけるヒト型モノクロヌナル抗䜓の定垞領域はいずれのアむ゜タむプに属するヒ トむムノグログリンの定垞領域であっおもよい。 奜たしくは、 ヒト I gGの定垞 領域である。 たた、 ヒトむムノグロブリン由来の可倉領域の枠組領域に぀いおも 限定されるものではない。
本発明におけるヒト型モノクロヌナル抗䜓は、 䟋えば以䞋のようにしお補造す るこずができる。 しかしながら、 そのような補造方法に限定されるものでないこ ずは蚀うたでもない。
䟋えば、 マりスモノクロヌナル抗䜓に由来する組換えヒト型モノクロヌナル抗 䜓は、 特衚平第 4— 506458号公報及び特開昭第 62— 296890号公報 等を参照しお、 遺䌝子工孊的に䜜補するこずができる。 即ち、 マりスモノクロ䞀 ナル抗䜓を産生するハむプリ ドヌマから、 少なくずも 1぀のマりス H鎖 CDR遺 䌝子ず該マりス H鎖 CDR遺䌝子に察応する少なくずも 1぀のマりス L鎖 CDR 遺䌝子を単離し、 たたヒトむムノグロプリン遺䌝子から前蚘マりス H鎖 CD Rに 察応するヒト H鎖 CD R以倖の党領域をコヌドするヒト H鎖遺䌝子ず、 前マりス L鎖 CD Rに察応するヒト L鎖 CD R以倖の党領域をコヌドするヒト L鎖遺䌝子 を単離する。
単離した該マりス H鎖 CDR遺䌝子ず該ヒト H鎖遺䌝子を発珟可胜なように適 圓な発珟べクタ䞀に導入し、 同様に該マりス L鎖 CDR遺䌝子ず該ヒト L鎖遺䌝 子を発珟可胜なように適圓なもう 1぀の発珟ベクタヌに導入する。 たたは、 該マ りス H鎖 C D R遺䌝子/ヒト H鎖遺䌝子ずマりス L鎖 CDR遺䌝子/ヒ ト L鎖遺 䌝子を同䞀の発珟べクタ䞀に発珟可胜なように導入するこずもできる。 このよう にしお䜜補された発珟べクタ䞀で宿䞻现胞を圢質転換するこずによりヒト型モノ クロヌナル抗䜓産生圢質転換现胞を埗、 該圢質転換现胞を培逊するこずにより培 逊䞊枅䞭から目的のヒト型モノクロヌナル抗䜓を埗る。
本発明における 「ヒト抗䜓」 ずは、 ィムノグロブリンを構成する H鎖の可倉領 域及び H鎖の定垞領域䞊びに L鎖の可倉領域及び L鎖の定垞領域を含む党おの領 域がヒトむムノグロプリンをコ䞀ドする遺䌝子に由来するィムノグロプリンであ る。
ヒト抗䜓は、 垞法に埓っお、 䟋えば、 少なくずもヒトむムノグロブリン遺䌝子 をマりス等のヒ卜以倖の哺乳動物の遺䌝子座䞭に組蟌むこずにより䜜補されたト ランスゞヱニック動物を、 抗原で免疫感䜜するこずにより、 前述したポリクロヌ ナル抗䜓あるいはモノクロヌナル抗䜓の䜜補法ず同様にしお補造するこずができ る。 䟋えば、 ヒト抗䜓を産生するトランスゞ゚ニックマりスは、 ネィチャヌゞェ ネティ ックスNature Genetics), 第 15卷、 第 146〜第 156頁、 1997幎 ネむチダヌゞェネティックス、 第 7卷、 第 13〜第 2 1頁、 1994幎特衚 平第 4— 504365号公報囜際出願公開 WO 94/25585号公報 日経 サむ゚ンス、 6月号、 第 40〜第 50頁、 1 995幎ネィチダ䞀Nature)、 第 368巻、 第 856〜第 859頁、 1994幎及び特衚平第 6— 500233 号公報に蚘茉の方法に埓っお䜜補するこずができる。
本発明における 「抗䜓の䞀郚」 ずは、 前述の本発明における抗䜓、 奜たしくは モノクロヌナル抗䜓の䞀郚分の領域を意味し、 具䜓的には F (ab ) 2、 Fab  ボ Fab、 F V (variable fragment of antibody) 、 s Fv、 d sFv (dis ulphide stabilised Fv) あるいは dAb (single domain antibody) である (ェ キスパヌト ·オピニオン ·オン 'セラピュヌティック ·パテンッExp. Opin. Th er. Patents), 第 6巻 第 5号 第 441〜456頁 1996幎 。
ここで、 「F (ab  2」 及び 「F ab 」 ずは、 ィムノグロブリン モノク ロヌナル抗䜓 を、 蛋癜分解酵玠であるペプシンあるいはパパむン等で凊理する こずにより補造され、 ヒンゞ領域䞭の 2本の H鎖間に存圚するゞスルフィ ド結合 の前埌で消化されお生成される抗䜓フラグメントを意味する。 䟋えば、 I gGを パパむンで凊理するず、 ヒンゞ領域䞭の 2本の H鎖間に存圚するゞスルフィ ド結 合の䞊流で切断されお VL (L鎖可倉領域 ず C>_ (L鎖定垞領域 からなる L鎖、 及び VH (H鎖可倉領域 ず CHァ 1 (H鎖定垞領域䞭のァ 1領域 ずからなる H鎖 フラグメントが C末端領域でゞスルフィ ド結合により結合した盞同な 2぀の抗䜓 フラグメントを補造するこずができる。 これら 2぀の盞同な抗䜓フラグメントを 各々 Fab' ずいう。 たた I gGをペプシンで凊理するず、 ヒンゞ領域䞭の 2本 の H鎖間に存圚するゞスルフィ ド結合の䞋流で切断されお前蚘 2぀の F ab が ヒンゞ領域で぀ながったものよりやや倧きい抗䜓フラグメントを補造するこずが できる。 この抗䜓フラグメントを F (ab ) 2ずいう。
本発明の 「倕ンパクたたはその断片に反応性を有するモノクロヌナル抗䜓を産 生する现胞」 ずは、 前述した本発明のモノクロヌナル抗䜓を産生する任意の现胞 を意味する。
具䜓的には、  1) 前述したずおりの、 本発明のタンパク、 その断片たたは該 タンパクを産生する现胞等で非ヒト哺乳動物を免疫しお埗られる本発明のタンパ クたたはその䞀郚に反応性を有するモノクロヌナル抗䜓を産生する該非ヒト哺乳 動物由来のモノクロヌナル抗䜓産生 B现胞、 2 ) そのようにしお埗られた抗䜓 産生 B现胞を哺乳動物由来のミ゚口䞀マ现胞ず现胞融合しお埗られる前述のハむ プリ ドヌマ 融合现胞 、 あるいは 3 ) 該モノクロヌナル抗䜓産生 B现胞たた はモノクロヌナル抗䜓産生ハむプリ ド䞀マから単離される該モノクロヌナル抗䜓 をコヌドする遺䌝子 重鎖をコヌドする遺䌝子若しくは軜鎖をコヌドする遺䌝子 のいずれか䞀方、 たたは䞡方の遺䌝子 により該 B现胞及びハむプリ ドヌマ以倖 の现胞を圢質転換しお埗られるモノクロヌナル抗䜓産生圢質転換现胞のいずれか を意味する。
ここで、 前蚘 3 ) に蚘茉のモノクロヌナル抗䜓産生圢質転換现胞は、 即ち、 前蚘  1 ) の B现胞たたは 2 ) のハむプリ ドヌマが産生するモノクロヌナル抗 䜓の遺䌝子組換え䜓を産生する遺䌝子組換え现胞を意味する。 この組換えモノク 口䞀ナル抗䜓産生现胞は、 前述したキメラモノクロヌナル抗䜓及びヒト型抗䜓の 補造においお䜿甚される方法ず同様にしお補造するこずができる。
本発明の 「医薬組成物」 ずは、 前蚘で定矩される本発明のタンパク若しくはそ の断片 フラグメント 、 抗䜓たたは該抗䜓の䞀郚のいずれかず、 薬孊的に蚱容 され埗る担䜓ずからなる医薬組成物である。
ここで 「薬孊的に蚱容され埗る担䜓」 ずは、 賊圢剀、 垌釈剀、 増量剀、 厩壊剀、 安定剀、 保存剀、 緩衝剀、 乳化剀、 芳銙剀、 着色剀、 甘味剀、 粘皠剀、 矯味剀、 溶解補助剀あるいはその他の添加剀等が挙げられる。 そのような担䜓の䞀぀以䞊 を甚いるこずにより、 錠剀、 䞞剀、 散剀、 顆粒剀、 泚射剀、 液剀、 カプセル剀、 トロヌチ剀、 ゚リキシル剀、 懞濁剀、 乳剀あるいはシロップ剀等の圢態の医薬組 成物を調補するこずができる。 これらの医薬組成物は、 経口あるいは非経口的に 投䞎するこずができる。 非経口投䞎のためのその他の圢態ずしおは、 䞀぀たたは それ以䞊の掻性物質を含み、 垞法により凊方される倖甚液剀、 腞溶内投䞎のため の坐剀およびぺッサリヌなどが含たれる。 投䞎量は、 患者の幎霢、 性別、 䜓重及び症状、 治療効果、 投䞎方法、 凊理時間、 あるいは該医薬組成物に含有される掻性成分 前蚘タンパクや抗䜓など の皮類 などにより異なるが、 通垞成人䞀人圓たり、 䞀回に぀き 10〃gから lOOOmg (あるい は 10 zgから 500mg) の範囲で投䞎するこずができる。 しかしながら、 投䞎量は皮 々の条件により倉動するため、 䞊蚘投䞎量より少ない量で十分な堎合もあり、 た た䞊蚘の範囲を越える投䞎量が必芁な堎合もある。
ずりわけ泚射剀の堎合には、 䟋えば生理食塩氎あるいは垂販の泚射甚蒞留氎等 の非毒性の薬孊的に蚱容され埗る担䜓䞭に 0. 1 g抗䜓/ ml担䜓〜 10mg抗䜓/ ml担 䜓の濃床ずなるように溶解たたは懞濁するこずにより補造するこずができる。 こ のようにしお補造された泚射剀は、 凊眮を必芁ずするヒト患者に察し、 1回の投 䞎においお 1 k g䜓重あたり、 1〃g〜100mgの割合で、 奜たしくは 50〃g〜50mgの 割合で、 1日あたり 1回〜数回投䞎するこずができる。 投䞎の圢態ずしおは、 静 脈内泚射、 皮䞋泚射、 皮内泚射、 筋肉内泚射あるいは腹腔内泚射のような医療䞊 適圓な投䞎圢態が䟋瀺できる。 奜たしくは静脈内泚射である。
たた、 泚射剀は、 堎合により、 非氎性の垌釈剀 䟋えばプロピレングリコヌル、 ポリ゚チレングリコヌル、 オリ䞀ブ油のような怍物油、 ゚タノヌルのようなアル コヌル類など 、 懞濁剀あるいは乳濁剀ずしお調補するこずもできる。
そのような泚射剀の無菌化は、 バクテリア保留フィルタヌを通す濟過滅菌、 殺 菌剀の配合たたは照射により行うこずができる。 泚射剀は、 甚時調補の圢態ずし お補造するこずができる。 即ち、 凍結也燥法などによっお無菌の固䜓組成物ずし、 䜿甚前に無菌の泚射甚蒞留氎たたは他の溶媒に溶解しお䜿甚するこずができる。 本発明の医薬組成物は、 生䜓内に生じた现胞内ス トレス、 異物あるいは倉性蛋 癜に起因する病的症状や疟患 䟋えば、 動脈硬化症、 糖尿病性血管障害、 现菌感 染など の予防䞊びに治療においお極めお有甚である。 図面の簡単な説明 図 1 ヒト CSRのスプラむシング倉異䜓である CSR 1、 〇31 2及び〇3 R 3のタンパクヌ次構造の差異の暡匏的䟋瀺を瀺す図。
A、 B、 B、 C、 D、 E、 E及び Fは、 ェキ゜ンナニットを衚し、 各ェキ ゜ンュニットに付した数字は、 圓該ェキ゜ンをコヌドする DNAのおよその塩基 数を瀺す。
図 2 ヒト C SR 1及び C SR 2のタンパク 2次構造を暡匏的に瀺す図。
図䞭の数字は、 N末端から蚈数した堎合のアミノ酞の番号を瀺す。
図 3 マクロファヌゞス力ベンゞャヌ受容䜓のタンパク 2次構造を暡匏的に瀺 す図。
図 4 ヒト CSR 1のタンパクヌ次構造を瀺す図。
アミノ酞䞋段の蚘号 參、 *及び #) は、 各々、 糖鎖結合郚䜍 秊 、 リン酞 化郚䜍 *)、 及びひヘリカルコむルドコルドメむン #) の掚定䜍眮を瀺す。 図 5 図 5 (a) は、 F I SH法により分析した、 ヒト CSR遺䌝子のヒト染 色䜓䞊の䜍眮を瀺す図。 なお、 矢印の先の 2぀の癜点 玄 0.3mm) 郚分が CSR遺 䌝子が存圚する 8 q 2 1サむ トを瀺す。 図 5 (b) は、 现胞分裂䞭期ヒト现胞の 染色䜓の R分染栞型䞊でのマッピングを瀺す図。
図 6 ノヌザンブロッテむングにより分析した、 皮々ヒ卜組織でのヒト C S R の m R N Aの発珟状態を瀺す図。
図 7 p 53タンパクによる CSR遺䌝子の発珟調節の有無の分析詊隓におけ る、 R T— P C R法で増幅した C S R c D N Aのゲル電気泳動状態を瀺す図。
Wは、 倩然型 p 53遺䌝子で圢質転換したヒト結腞癌现胞 SW480を甚いた詊隓結 果を、 たた Mは、 倉異型 p 53遺䌝子で圢質転換した該 SW480を甚いた詊隓結果を 瀺す。 なお、 䞊段の数字は、 RNAを取埗した経時的時間を瀺す。
図 8 各皮现胞での CSR遺䌝子の発珟状態の分析における、 ^䞁ヌ卩 ^法 による増幅による C SR cDNAのゲル電気泳動状態を瀺す図。
レヌン 1は、 宿䞻现胞ずしお正垞ヒト線維芜现胞 NHDF4042を甚いた詊隓結果を、 レヌン 2は宿䞻现胞ずしおヒト子宮頞癌由来䞊皮様现胞 Helaを甚いた詊隓結果を、 レヌン 3は宿䞻现胞ずしおヒト肺癌现胞 H1299を甚いた詊隓結果を、 レヌン 4は宿 䞻现胞ずしおヒト食道癌现胞 TE10を甚いた詊隓結果を、 レヌン 5は宿䞻现胞ずし おヒト神経グリァ芜腫现胞 T98Gを甚いた詊隓結果を、 レヌン 6は宿䞻现胞ずしお ヒト神経グリア芜腫现胞 U87MGを甚いた詊隓結果を、 レヌン 7は宿䞻现胞ずしおヒ ト腫瘍现胞 SKBR3を甚いた詊隓結果を、 䞊びにレヌン 8はヒト結腞癌现胞 SW480を 甚いた詊隓結果を瀺す。
たた、 Wは、 倩然型 p 53を発珟する现胞であるこずを瀺し、 たた Mは、 倉異 型 P 53遺䌝子を発珟する现胞であるこずを瀺す。
図 9 血枅飢逓ストレスによる CS R遺䌝子の転写調節の有無の分析詊隓にお ける、 ノヌザンプロッティングによる C SRmRN Aの発珟状態を瀺す図。
分図は、 各々ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042、 ヒト結腞癌现胞 SW480、 ヒト神経グ リア芜腫现胞 T98G、 及びヒト食道癌现胞 TE13を甚いた詊隓結果を瀺す。 なお、 プ ラス + ) 及びマむナス 䞀 は、 各々血枅飢逓ストレスを䞎えた堎合ず䞎えな かった堎合の結果を瀺す。
図 10 玫倖線照射ストレスによる CSR遺䌝子の転写調節の有無の分析詊隓 における、 ノヌザンブロヅティングによる C SRmRN Aの発珟状態を瀺す図。 図䞊段の数字は、 玫倖線照射の匷さを瀺す。
図 1 1 過酞化氎玠ストレスによる CSR遺䌝子の転写調節の有無の分析詊隓 における、 ノヌザンプロヅティングによる C SRmRNAの発珟状態を瀺す図。 図䞊段の数字は、 過酞化氎玠の濃床を瀺す。
図 12 熱ショックストレスによる CSR遺䌝子の転写調節の有無の分析詊隓 における、 ノヌザンブロッテむングによる C S R m R N Aの発珟状態を瀺す図。 図䞊段の数字は、 熱ショックを䞎えおからの経時的時間を瀺す。
図 13 図 13 (a) は、 抗 HAェビト䞀プポリクロヌナル抗䜓を甚いお免疫 现胞化孊染色法により分析した、 C SRタンパクの现胞質での分垃を瀺す図。 図 13 (b) は、 DAP Iによる染色法による栞の䜍眮を瀺す図。
図 14 玫倖線照射ストレスに起因する现胞死に察する CSRの抑制効果を瀺 す図。
図 15 過酞化氎玠ス トレスに起因する现胞死に察する CSRの抑制効果を瀺 す図。
図 16 図 16 (a) は、 ヒト CSR1のタンパクヌ次構造を瀺す図。 図 16(b)は、 ヒ ト CSR2のタンパクヌ次構造を瀺す図。
図 16 (b) に蚘茉のアミノ酞配列の巊端の数字 451) は、 ヒト CSR2タンパク の 451番目のアミノ酞であるこずを意味し、 アミノ酞番号 1乃至 450番目のァミノ 酞は図 16 (b) のヒト CSR1タンパクのアミノ酞番号 1乃至 450番目のアミノ酞配 列ず同䞀であるこずを瀺す。
アミノ酞䞋段の蚘号 秊、 △、 *、 〇、 及び #) は、 各々、 casein kinase 2に よるリン酞化郚䜍 き 、 protein kinase Cによるリン酞化郚䜍 △) 、 tyros i ne kinase 2によるリン酞化郚䜍 *) 、 ヘム結合郚䜍 〇 、 及びミクロボディ ― (ペルォキシゟヌム C末端倕䞀ゲティングシグナル郚䜍 #) の掚定の䜍眮 を瀺す。
薄黒い四角で囲った領域は、 ひヘリカルコむルドコルドメむンの掚定䜍眮を瀺 す。
空欄四角で囲った領域は、 N末端の膜貫通領域の掚定䞊の䜍眮を瀺す。
楕円類䌌の四角で囲った郚分は、 N結合糖鎖結合郚䜍を瀺す。
二重䞋線郚は、 ロむシンゞッパヌ構造の䜍眮を瀺す 繰返されるロむシンは、 少し倧きい文字で衚蚘されおいる。  。
倪線の四角で囲った領域は、 G-X-Y繰返し構造を有するコラヌゲン様ドメむンを 瀺す。
図 17 ヒト C SRタンパクをコヌドするゲノミック DNAの構造、 䞊びにス プラむシング倉異䜓である CSR 1タンパク及び CSR2タンパクの䞀次構造の 差異を暡匏的に瀺す図。
黒い瞊方向の領域 1、 2、 3、 4、 5、 6 及び 6" は、 ェキ゜ンナニットを 衚す。 たた、 図䞭に瀺される塩基配列は、 p 53タンパク結合領域が、 第 2むン トロン䞭に存圚するこずを瀺す。
図 1 8 p 53タンパクによる CSR遺䌝子の発珟調節の有無の分析のための EMSA詊隓における、 各皮条件での圢質転換䜓の栞抜出物のゲル電気泳動状態を瀺 す図。
図 1 9 各皮现胞での CSR遺䌝子の発珟状態の分析における、  T— PCR 法による増幅による C SR c DNAのゲル電気泳動状態を瀺す図。
図 20 図 20(a)は、 玫倖線照射ス トレスによる C SR遺䌝子の転写調節の有 無の分析詊隓における、 ノヌザンブロッテむングによる C S R m R N Aの発珟状 態を瀺す図。 図䞊段の数字は、 玫倖線照射の匷さを瀺す。 図 20(b)は、 過酞化氎 玠ストレスによる C SR遺䌝子の転写調節の有無の分析詊隓における、 ノヌザン ブロッテむングによる C SRmRNAの発珟状態を瀺す図。 図䞊段の数字は、 過 酞化氎玠の濃床を瀺す。
図 2 1 アドリアマむシン ADR) による C SR遺䌝子の転写調節の有無の分析 詊隓における、 ノヌザンプロッティングによる C SRmRNAの発珟状態を瀺す 図。 図䞊段の数字は、 アドリアマむシンの濃床を瀺す。
図 22 玫倖線照射及び過酞化氎玠により䞎えられる现胞内ストレスによる C SR遺䌝子の転写誘導に察する抗酞化剀の効果の分析詊隓における、 ノヌザンブ 口ッティングによる C SRmRNAの発珟状態を瀺す図。
図䞭、 「- NAC」 は NAC存圚䞋での前培逊を行わない堎合の結果瀺し、 たた 「十 NA C」 は NAC存圚䞋での前培逊を行った堎合の結果瀺す。 たた、 「―」 及び 「UV」 は、 各々、 玫倖線照射を行わなかった堎合の結果、 及び玫倖線照射を行った堎合 の結果を瀺す。 同様に、 「―」 及び 「H202」 は、 各々、 過酞化氎玠によるストレ スを䞎えなかった堎合の結果、 及び過酞化氎玠によるストレスを䞎えた堎合の結 果を瀺す。
図 23 皮々の詊薬による CSR遺䌝子の発珟調節の有無の分析詊隓における、 RT-PC R法で増幅した C S R c D N Aのゲル電気泳動状態を瀺す図。
図 23 (a) は DEMを甚いた堎合の結果を、 図 23 (b) は PMA(TPA)を甚いた堎 合の結果を、 図 3 (c) は Sodium azideを甚いた堎合の結果を、 図 23 (d) は Sodium arseniteを甚いた堎合の結果を、 図 23 (e) は GSN0を甚いた堎合の結果 を、 及び図 23 (f ) は SNPを甚いた堎合の結果を瀺す。
図 24 Hemin及び過酞化氎玠による皮々の遺䌝子の発珟調節の有無の分析にお ける、 RT— P CR法による増幅による皮々の cDNAのゲル電気泳動状態を瀺 す図。
図 24 (a) は、 Heminによる遺䌝子の経時的発珟誘導の有無を瀺す、 たた図 2 4 (b) は過酞化氎玠による遺䌝子の経時的発珟誘導の有無を瀺す。 なお、 䞊段 の数字は、 RN Aを取埗した経時的時間を瀺す。
図 25
図 25 (a) は、 CSRcDNAを有しない空の発珟ベクタヌで圢質転換された现胞を、 抗 HAェピト䞀プポリクロヌナル抗䜓を甚いお免疫现胞化孊染色法により分析し た、 C SRタンパクの现胞質での分垃を瀺す図。
図 25 (b) は、 DAP Iによる染色法による CSRcDNAを有しない空の発珟べク 倕䞀で圢質転換された现胞の栞の䜍眮を瀺す図。
図 25 (c) は、 CSRcDNAを発珟する発珟べクタ䞀で圢質転換された现胞を、 抗 H Aェピトヌプポリクロヌナル抗䜓を甚いお免疫现胞化孊染色法により分析した、 C SRタンパクの现胞質での分垃を瀺す図。
図 25 (d) は、 DAP Iによる染色法による CSRcDNAを発珟する発珟ベクタヌ で圢質転換された现胞の栞の䜍眮を瀺す図。
図 25 (e) は、 CSRcDNAを発珟する発珟ベクタヌで圢質転換された现胞を、 抗 ゎルゞ -58K倕ンパク抗䜓を甚いお免疫现胞ィ匕孊染色法により分析した、 CSR倕 ンパクの现胞質での分垃を瀺す図。
図 25 (f ) は、 DAP Iによる染色法による CSRcDNAを発珟する発珟ベクタヌ で圢質転換された现胞の栞の䜍眮を瀺す図。
図 25 (g) は、 過酞化氎玠による酞化ス トレスを䞎えた CSRcDNAを発珟する発 珟ベクタヌで圢質転換された现胞を抗ゎルゞ- 58Kタンパク抗䜓を甚いお免疫现胞 化孊染色法により分析した、 CSRタンパクの现胞質での分垃を瀺す図。
図 25 (h) は、 DAP Iによる染色法による過酞化氎玠による酞化ストレス を䞎えた CSRcDNAを発珟する発珟ベクタヌで圢質転換された现胞の栞の䜍眮を瀺す 図。 図 26 玫倖線照射ストレスに起因する现胞死に察する CSRタンパクの 抑制効果を瀺す図。
図 27 フロヌサむ トメ䞀倕䞀により枬定した、 现胞内での反応性酞玠皮の量 の倉化を衚わす図。
図 27 (a) は、 察照である H1299- vector矀での反応性酞玠皮の量の倉化瀺す 図。
図 27 (b) は、 H1299- CSR1矀での反応性酞玠皮の量の倉化を瀺す図。
図 27 (c) は、 H1299- CSR2矀での反応性酞玠皮の量の倉化を瀺す図。
図 27 (d) は、 CSR1/CSR2矀での反応性酞玠皮の量の倉化を瀺す図。
図 28 過酞化氎玠により誘導される现胞の圢態の絰時的倉化を瀺す図。
図 28 (a) は、 過酞化氎玠を加えない堎合の H1299-vector矀の现胞の圢態を 瀺す図。
図 28 (b) は、 過酞化氎玠を加えた盎埌の H1299-vector矀の现胞の圢態を瀺 す図。
図 28 (c) は、 過酞化氎玠を加えお 1時間培逊した埌の H1299- vector矀の现 胞の圢態を瀺す図。
図 28 (d) は、 過酞化氎玠を加えお 3時間培逊した埌の H1299- vector矀の现 胞の圢態を瀺す図。 図 28 (e) は、 過酞化氎玠を加えない堎合の CSIQ/CSI12矀の现胞の圢態を瀺す 図。
図 28 (f ) は、 過酞化氎玠を加えた盎埌の CSR1/CSR2矀の现胞の圢態を瀺す図 c 図 28 (g) は、 過酞化氎玠を加えお 1時間培逊した埌の CSR1/CSR2矀の现胞の 圢態を瀺す図。
図 28 (h) は、 過酞化氎玠を加えお 3時間培逊した埌の CSR1/CSR2矀の现胞の 圢態を瀺す図。
図 29 マりス CSR遺䌝子ノックァゥトマりス䜜補のための倕䞀ゲティングべク 倕䞀の構造を暡匏的に瀺す図。 発明を実斜するための最良の圢態
以䞋、 実斜䟋を以お本発明をさらに詳现に説明するが、 本発明が該実斜䟋に蚘 茉される態様のみに限定されるものではないこずは蚀うたでもない。 実斜䟋 1 腫瘍抑制タンパク p 53ず盞互䜜甚 結合 するヒトゲノム DNA断 片の取埗
腫瘍抑制タンパク P 53が発珟されるず同時に、 遞択的レポヌタヌ遺䌝子の䞊 流にクロヌン化されたヒトゲノム DN Aが発珟される酵母発珟系を甚いお、 p 5 3ず結合するヒトゲノム DNA断片を取埗した Tokinoら、 Human Molecular Ge netics, Vol.3, No.9, 1537-1542, 1994) 。
< 1 - 1 > H I S 3レポ䞀倕䞀ベクタヌの構築
倩然䜓の腫瘍抑制遺䌝子 P 53発珟ベクタヌ PRS314- SN (Nigro, J.M.ら、 Mol. Cell. Biol., Vol.12, 1357-1365, 1992) 䞭の GAL 1プロモヌタヌを P GKプ ロモ䞀倕䞀で眮換しおプラスミ ド PRS314- PGK- p53を構築した。 pRS314-SNから切出 した p 53の c DNAを含む Xhol- BamHI断片を、 プラスミ ド pPGK (Poon, D. ら、 Mol. Cell Biol., Vol.11, 4809-4821, 1991) の Sail及び Ba lI郚䜍にサブク ロヌニングし、 プラスミ ド pPGK-SNを構築した。 PGKプロモヌタヌ/ p 5 3 c D NA/P GK倕䞀ミネ䞀倕䞀からなる pPGK- SNの Kpnl-Sacl断片を、 プラスミ ド p R S 3 1 4 (Sikorski, R.S.,ら、 Genetics, Vol.122, 19-27, 1989) に挿入し、 プラスミ ド PRS314-PGK- p53を構築した。
< 1 - 2 > ヒトゲノムラむブラリ䞀の構築
ヒトゲノム DNAを制限酵玠 Mbolで完党に消化し、 H I S 3プロモ䞀倕䞀ブラ スミ ド pBM9 4 7 (Wilson, T.E. ら、 Science, Vol.252, 1296-1300, 1991) の BajnHI郚䜍にクロヌン化した。 連結物を、 ゚レクトロボレ䞀シペンにより倧腞菌 æ ª DH 1 0 B (BR L補 に導入した埌、 該菌株を、 アンピシリンを含む寒倩培 地プレヌト  1 8 0枚 に蒔いた lxlO5コロニ䞀/プレヌト 。 プレヌトから 菌株を回収し、 塩化セシりム超遠心により、 該プラスミ ドラむブラリヌから DN Aを粟補した。 埗られた DNAを、 P E G/リチりムアセテヌト法 Gietz, D. ら、 Nucleic Acids Res., Vol.20, 1425, 1992) による酵母の圢質転換に甚いた。 前蚘 P 5 3発珟ベクタヌ PRS314- PGK-P53を含む酵母 YPH 6 8 1を、 SD- Trp培 地 100ml) に蒔き、 䞀晩培逊した 1X107现胞/ ml) 。 培逊液を無菌氎で掗浄し た埌、 無菌氎 10ml) に再懞濁した。 现胞を、 LiAc/TE (10 ml) (0.1 M LiAc (pH7.5)、 lOmMトリス塩酞 (pH7.5)、 ImM EDTA) で掗浄した埌、 LiAc/TEに再懞濁し た lxlO9现胞/ ml) 。 酵母现胞懞濁液 0.2ml) を、 圢質転換に甚いる DNA ( 2 g  1 (1XTE)) 、 䞀本鎖サケ粟子 DNA (100〃 g  10 g/ j l) 及び 40 %無菌 PEG溶液 0.6ml) (40%ポリ゚チレングリコヌル 4000/LiA c/TE) ず混合した。 埗られた现胞混合物を、 匷振しながら 3 0°Cで 3 0分間培逊 した埌、 4 2°Cで 1 5分間熱ショックを䞎え、 遠心操䜜によっおペレッ ト化した。 现胞ペレッ トを I X T E (0.2ml) に再懞濁し、 SD- trp- uraプレヌトに蒔き、 3 0 °Cで 3日間培逊した。 レポヌタヌプラスミ ドラむブラリ䞀  lmg) を圢質転換 し、 プレヌト 5 0 0枚 に蒔いた。 各プレヌトは、 箄 2xl04クロヌンを含む。 該酵母圢質転換䜓を、 プレヌトから回収し、 1 0プレヌトず぀プヌル化し、 65%グ リセロヌル v/v)、 0.1M硫酞マグネシりム及び 25mMトリス塩酞 pH8) 䞭に再懞 濁し、 侀80°Cで保存した。
< 1 - 3 > ラむブラリヌのスクリヌニング
600nm吞光床で 10に垌釈した酵母现胞 O.lml) を、 遞択的 SD- trp- ura-hisプ レヌト䞊に蒔き、 30°Cで 5日間培逊した。 該圢質圢質転換䜓の少量を、 非遞択 的 SD- trp- uraプレヌトに蒔くこずにより、 生酵母现胞数を決定した。 ヒスチゞン 芁求性 HIS+) ずなった各陜性现胞を、 SD- ura培地䞭で培逊した埌、 抜出した D N Aを Ura欠損倧腞菌株 KC 8に導入した。 回収されたレポ䞀倕䞀プラスミ ドの酵 母䞭での H I S 3掻性を、 p 53発珟ベクタヌの存圚䞋及び非存圚䞋各々に぀い お詊隓した。 p 53䟝存性のクロヌンの配列解析は、 クロ䞀ニング郚䜍に隣接し た 2぀のプラむマ䞀、 1) GAL 1プロモヌ倕䞀 Johnston, M. , Mol. Cell. Biol., Vol.4, 1440-1448, 1984) 由来 配列番号 1 ) 、 及び  2 ) プラスミ ド PBR322由来 配列番号 2) を甚いお行った。
< 1 - 4 > ?ガラクトシダ䞀れアツセィ
本実斜䟋においお行った/?ガラクトシダ䞀れアツセィは䞋蚘のずおりである。 レポ䞀倕䞀プラスミ ド及び発珟プラスミ ドの各々を、 酵母 EGY 048现胞株 (Gyuris, J.,ら、 Cell, Vol.75, 791-803, 1993) に導入し、 酵母圢質転換䜓を 埗た。 炭玠源ずしおラフむノ䞀スを含む合成培地䞭、 30°Cで䞀晩培逊した。 培 逊液を、 ラフむノ䞀ス 1%) 及びガラクトヌス  1 %) を含む培地で、 600 nm吞光床䞋で 0.1に垌釈し、 19時間培逊した埌、 ?ガラクトシダヌれアツセィ を行った (Kern, S.E.ら、 Science, Vol.256, 827-830, 1992) 。
< 1 - 5 > ヒトラむブラリ䞀のスクリヌニング
1.8X107個のヒトゲノム DNAクロヌンを HI S3レポヌタヌベクタヌに挿入 しプラスミ ドラむブラリヌを調補した。 この初代クロヌンで酵母を圢質転換しお 1X107個の酵母圢質転換䜓を取埗し、 各々玄 2X105個の別々のクロヌンを含む 5 0のプヌルに分けた。 各プヌルからの玄 5 X105個の现胞を、 ヒスチゞンを含有し ない培地に蒔き、 腫瘍抑制タンパク p 53に応答する DNAを含むクロヌンを遞 別した。 各プヌルには、 20乃至 93個 平均では玄 50個 のヒスチゞン栄逊 性のクロヌンが確認された。 各プヌルに぀き玄 20個のクロヌンをランダムに遞 択し、 前述のレポ䞀倕䞀: DNAの䜜補に甚いた 詳现には前蚘 < 1— 1 >及びく 1侀 2 >参照。  。
埗られた各プラスミ ドで、 p 53発珟べクタ䞀たたは p 53遺䌝子を含たない 空のコントロヌルベクタ䞀を含む酵母现胞株を圢質転換した。 詊隓した 942ク ロヌンの内の 273クロヌン 29%) が、 p 53䟝存性であった。 該 273個 の P 53反応性プラスミ ドを、 制限酵玠消化及び塩基配列解析により分析した。 該 273個のクロヌンは、 57皮類の異なる Mbol消化断片を含んでいた。 各々の クロヌン䞭の挿入塩基配列を、 クロ䞀ニング郚䜍の倖偎 盎前/盎埌 の配列を プラむマヌずしお甚い決定した さらに詳现には前蚘く 1侀 3>参照。  。 配列 解析した 57クロヌンの内の 46クロヌンは、 報告されおいるコンセンサス p 5 3結合配列 (El-Deiry, W.S.ら、 Nature Genetics, Vol.1, 45-49, 1992) ず類䌌 の 10 b pの配列の 2コピヌを含んでいた。 実斜䟋 2 ヒトゲノム DN A含有コスミ ドラむブラリヌの䜜補
本発明で甚いたコスミ ドラむブラリヌは、 「ラボマニュアルヒトゲノムマツピ ング」 堀雅明、 䞭村祐茔 線、 äžžå–„ 出版、 第 41〜48頁 に埓っお䜜補した。 以䞋その方法を簡単に瀺す。
コスミ ドベクタヌ PWE 1 5 (Wahl, GM. Pro atl. Acad. Sci. USA., Vo
1.84 2160-2164, 1987) の BamHI郚䜍を、 Klenow酵玠を甚いおフィルむン (fill in) し、 オリゎヌクレオチドリンカヌ 5 CCTCGAGG 3' ) を甚いお Xholに倉換し、 改倉コスミ ドベクタヌ pWEX 15を構築した。 該ベクタヌを、 Xholで消化した 埌、 クレノり酵玠、 dCTP及び dTTPを甚いお郚分的にフィルむンした。
ヒト染色䜓ゲノム DNAを Sau3AIで消化した埌、 シュクロヌス濃床募配遠心に より画分し、 ゲノム DNA断片を埗た。 該 DNA断片を、 クレノり酵玠、 dAT P及び dGTPを甚いおフィルィンした。
該ベクタ䞀 DNA ( l g) 及び該ゲノム DNA ( l jug) を、 10xラむゲヌ シペンバッファ䞀 トリス塩酞 (0.5M(pH7.5)) 、 lOOmMの塩化マグネシりム、 10 OmMゞチオスレィ トヌル、 500 /g/mlゥシ血枅アルブミン 、 20mMの ATP、 50ポ リ゚チレングリコヌル 8000、 1M塩化ナトリりム、 T4DNAリガ䞀れ Boehring er補 及び蒞留氎の混合溶液䞭で連結させた。 次いで、 GIGAPACK II GOLD (Stra tagene補 を甚いお、 むンビトロパッケヌゞングした。 実斜䟋 3 ヒトゲノム DNAコスミ ドラむブラリヌのスクリヌニングによ
るェキ゜ン配列を含む p 53応答性ヒトゲノム DN A含有断片 の取埗
実斜䟋 1で取埗し塩基配列解析を行った p 53応答性のヒトゲノム DNA断片 の 1぀のクロヌン クロヌン番号 24、 p 53結合性コンセンサス様配列 CAAC TTGTCTボ 前蚘 H蘭 an Molecular Genetics, Vol.3, No.9, 1537-1542 1994参照) 䞭の挿入ヒトゲノム DNA断片 配列番号 3) を攟射性暙識しおハむブリダィれ ヌシペンプロ䞀ブずした。 該プロヌブを甚いお、 垞法に埓っお前蚘ヒトゲノム D NAコスミ ドラむブラリヌをスクリヌニングし、 25個の陜性クロヌンを埗た。 コスミ ドクロヌン䞭のェキ゜ン Exon)配列を増幅するために、 各々のクロ䞀 ンを BamHI及び Bglllで消化し、 ヱキ゜ントラッピングベクタ䞀 p S P L 3 (GIBC 0-BRL補 に連結した。 次いで、 マラ゜ン cDNA増幅キッ ト Clontech補 を甚 いお、 5' RACE— PC R及び 3' RACE -P CR (Rapid Amplification Ends-PCR) (Proc. Natl. Aca. Sci. USA, Vol.85, 8998-9002, 1988及び 「遺䌝 子増幅 PCR法 ·基瀎ず新しい展開」 、 共立出版株匏䌚瀟発行、 1992幎 を行い、 18個のコスミ ドクロヌン䞭に合蚈 29皮類のェキ゜ン様配列の挿入が確認され た。 実斜䟋 4 ヒト c D N Aラむブラリ䞀のスクリヌニングによるヒト C S Rタンパ ク (Cellular Sensor-Related protein, スカベンゞャ䞀受容䜓) を コヌドする c DN A断片の取埗
ェキ゜ン様配列の挿入が確認されたコスミ ドクロヌンの 1぀であるコスミ ド 2 (クロヌン番号 2) の党ゲノム DNA配列を、 377ABI自動塩基配列装眮 Perkin Elmer補 を甚いお解析した。 解析された 1぀のェキ゜ン配列を 2 E 1ず呜名し た 配列番号 4) 。 たた、 コンピュヌタヌ゜フト Gr a i 12及び Hex onを 甚いお、 該ゲノム DNA配列䞭のェキ゜ン配列郚䜍を掚定した。
∑ 䞁ヌ卩。1法 Reverse Transcription- PCR) ( 「実隓医孊 .増刊」 、 「PC Rずその応甚」 、 第 8卷、 第 9号、 1990幎、 及び 「遺䌝子増幅 PCR法 .基 瀎ず新しい展開」 、 共立出版株匏䌚瀟発行、 1992幎 を甚いお、 掚定された党お のェキ゜ン cDN A配列が、 mRN Aぞ転写されお連結されるこずを確認した。 該ェキ゜ン cDN A断片を攟射性暙識しおハむブリダィれ䞀シペンプロ䞀ブずし た。 埗られた 53結合性郚䜍を含む該プロヌブを甚いお、 垞法に埓っおヒト胎 児脳由来ランダムプラむムド c DNAラむブラリ䞀 Stratagene補 の 5xl05個 のプラヌクをスクリヌニングし、 陜性クロヌンを埗た。 該陜性クロヌンから、 ヒ 卜 cDNA断片を切りだし、 塩基配列を解析した。 該クロ䞀ンは、 本願発明の C SRタンパク Cellular Sensor-Related proteinの略称。 スカベンゞャヌ受容 䜓ずも呌ぶ。  をコヌドする cDNA断片を含む。 実斜䟋 5 ヒト CSRタンパクをコヌドする完党長 たたは長鎖 cDNAの取 埗
ヒト胎児脳由来の党 mRNAを、 M- MuLV逆転写酵玠 200ナニット/〃 1、 GIB C0-BRL補 の存圚䞋、 d (N) 。 ベ䞀リンガヌマンハむム補 を甚いおランダ ムプラむミングにより cDNAに倉換し、 ヒト長鎖 cDNAラむブラリ䞀を䜜補 した。 前蚘の陜性クロヌンから切り出したヒト cDNA断片をプロヌブずしお甚 い、 該ヒト長鎖 cDNAラむブラリ䞀を垞法に埓っおスクリヌニングし、 4぀の 陜性クロヌンを取埗した。 該陜性クロヌンからヒト CSRタンパクをコヌドする 耇数の長鎖 cDNAを切りだし、 塩基配列を解析した。 次いで、 プラむマ䞀ずし お EC 1 (配列番号 5) EC 2 a (配列番号 6 ) 及び E C 2 b (配列番号 7) を 甚いた RT— PCR法により、 CSRタンパクをコヌドする cDNAを増幅させ た。
RT— PCRは、 cDNA混合溶液 25〃 1) 䞋で、 サヌモサむクラ䞀 Th ermocycler Perkin Elmer Cetus補 を甚いお 30乃至 40サむクル行った。 該 cDNA混合溶液は、 40ngの cDNA、 1 x P C R緩衝液 6.7mMトリスpH8.8) 16.6mMの硫酞アンモニゥム 6.7 Mの EDTA及び 10mMの/?メルカプト゚タノヌルを 含有 、 25pmolのセンスプラむマ䞀、 25pmolのアンチセンスプラむマ䞀、 0.5 Uの Taq DN Aポリメラ䞀れ TAKMA補 、 250〃Mのデォキシヌクレオチド、 10% の DMS0、 及び 7.6mMの塩化マグネシりムからなる。 各 PCRサむクルは、 94°Cで 30秒、 55 °Cで 30秒、 及び 72 °Cで 1分の反応からなる。 䜆し、 最終の P C Rステップでは、 72°Cで 5分間ずした。 埗られた PCR産物を、 3%ァガ口䞀 スゲル電気泳動に付し、 N +ナむロン膜 PALL補 に移し、 内郚オリゎヌクレオチ ドプロヌブ F 12 (配列番号 8) を甚いおハむブリダィれ䞀シペンさせた。
次いで、 該 c DNAをテンプレヌトずしおマラ゜ン c DNA増幅キット Clon etech補 を甚いお、 5 ' RACE— PC R及び 3' RACE— PCRにより cD NAを増幅し、 各々の長鎖 cDNA配列の 5' 末端及び 3' 末端を同定した。 こ の結果、 ヒト CSRをコヌドする 2぀の完党長 cDNA (各々がコヌドするタン パクを、 CSR 1タンパク及び CSR 2タンパクず呜名。 以䞋単に CSR 1及び CSR 2ずも呌ぶ。  、 及び完党長 cDNAず思われる 1぀の長鎖 cDNA (コ —ディングタンパクを CSR 3タンパクず呜名。 以䞋単に C SR 3ずも呌ぶ。 ) が単離されたこずが確認された。 C S R 1の c D N A配列及び掚定ァミノ酞配列を各々配列番号 9及び 10に、 C S R 2の c D N A配列及び掚定ァミノ酞配列を各々配列番号 11及び 12に、 䞊びに C SR 3の cDNA配列を各々配列番号 13及び 14に蚘茉した。
埗られた CSR 1の cDN Aを含む遺䌝子及びオヌプンリ䞀ディングフレヌム (ORF) の倧きさは、 各々玄 4.0kb及び玄 1.8kbであり、 606のアミノ酞をコ —ドするものであった。 たた、 C SR 2の cDNAを含む遺䌝子及び ORFの倧 きさは、 各々玄 1.9kb及び玄 1.4kbであり、 466のアミノ酞をコヌドしおいた。 塩基配列の比范分析から、 これら 3皮類の CSRは、 各々オヌルタヌナティブ スプラむシング alternative splicing) による転写産物であるこずが確認され た。 䟋えば、 CSR2は、 第 1番目から第 457番目のコドンたでの配列が CS R 1ず同䞀である。 これら 3぀のスプラむシング倉異䜓の構造的差異を図 1に暡 匏的に瀺した。
䞀方、 ヒト C SRのゲノム遺䌝子は、 6぀以䞊のコヌディングェキ゜ンを含む 箄 90 kbの倧きさを有しおおり、 第 2むントロン配列 図 1のェキ゜ン Aずェ キ゜ン Bの間 に存圚する郚分配列 配列番号 20) が、 既報告の p 53結合性 配列 察照的な 1 Omerの 2コピヌからなる塩基配列 (5' RRRC(A/T)(T/A)GYYY 3  (Rは purine、 Yiipyrimidine  EL-Deiry, W.S.ら、 Nature Genetics, Vol.1, 45-49, 1992) ずフィットするものず考えられた。
図 1に暡匏的に瀺すように、 CSR A、 B、 C, D、 E及び E'の 6぀の ヱキ゜ンから、 CSR2は A、 B、 Cs D、 E及び Fの 6぀のェキ゜ンから、 た た CSR3は C、 D、 E及び E'の少なくずも 4぀のェキ゜ンから構成されるも のず掚定された CSR3の cDNAの 5' 末端配列䞭には B及び B' 'に察応す るコ䞀ディング配列が芋出されるこずから、 さらに B及び B"をェキ゜ンずしお 有する可胜性がある 。
図 17にさらに詳现に瀺すように、 C SR 1のゲノミック DNAは、 ェキ゜ン 1、 2、 3、 4、 5及び 6' で衚わされる 6぀のェキ゜ンからなる。 CSR2の ゲノミック DNAは、 ェキ゜ン 65 がスプラむシングを受け、 代りにェキ゜ン 6 " が䜿甚され、 ェキ゜ン 1、 2、 3、 4、 5及び 6"で衚わされる 6぀のェキ゜ ンからなる。
皮々コンビナヌ倕䞀゜フトを甚いお、 本願発明の C SRタンパクの既知タンパ クずのアミノ酞配列盞同性を調べた結果、 本願発明の CSRタンパクずアミノ酞 配列盞同性を有する既知タンパクは芋いだされなかった。 䞀方、 図 1に瀺したェ キ゜ン Eはコラヌゲンず 61 %のアミノ酞配列盞同性を、 ェキ゜ン Dは酵母染色 䜓分離倕ンノ ク s m c 2 p (chromosome segregation protein-smc2p 及びヒ卜 ミオシン重鎖ずアミノ酞配列盞同性を、 たたェキ゜ン Cは冬眠関連タンパク 25
(hibernation related protein- 25; HP25) ずアミノ酞配列盞同性を有しおいた。 次に、 アミノ酞組成、 電荷 CSR 1  PI=6.4、 C SR 2  ΡΙ=5·5) 及び分子 量 CSR 1 : 65Kd、 CSR2  52Kd) に基づいお、 コンビナヌ倕䞀゜フト PROP SEARCHを甚いお、 本願発明の該 C S Rタンパクの既知倕ンパクずの構造的類䌌性 を調べた結果、 C SR 1タンパクはマクロファヌゞス力ベンゞャ䞀受容䜓 I型及 び II型 GenBankァクセッション番号 S08278 Rohrer, L.ら、 ature, Vol.343,
570-572, 1990) ず、 たた C S R 2タンパクはセンサヌ Sensor) タンパク Ge nBankァクセッション番号 P30844 Nagasawa, S.ら、 J. Biochem., Vol.114, 3 50-357, 1993) ず 80 %以䞊の信頌性で最も高い構造的類䌌性を有しおいた。 たた、 コンピュヌタ゜フ ト PR0SITE、 COIL, TMpred及び PS0RT等を甚い、 CSR タンパクの 2次構造を解析した。 この結果、 〇31 1及び〇31 2は、 図 2に暡 匏的に瀺されるような 2次構造を有するものず考えられた。 C SR 1タンパクは、 倧きくわけお 3぀の異なるドメむン、 即ち、  1) ロむシン単䜍が 4回繰り返さ れるロむシンゞッパヌ構造を含むトランスメンブレンドメむン transmembrane domain) 、 (2) ひぞリカ レコィノレドコィノレドメむン ひ— helical coiled coil domain) 、 及び 3) G 1 y— X_ Yの配列単䜍が 49回繰り返されるコラヌゲ ン様ドメむ ン collagen- like domain) から構成される。 さらに、 そのような特 城的構造を有する 3分子が、 コむルドコむルドメむンでひぞリックスを、 たたコ ラヌゲン様ドメむンでトリプルヘリックスを圢成するこずにより 3量䜓を圢成す o
この構造は、 前蚘マクロファヌゞス力ベンゞャヌ受容䜓 II型の構造ず高い類䌌 性を有するものである 図 3) (出兞 「分子動脈硬化孊」 、 第 IVç«  「炎症现胞
1. スカベンゞャヌ受容䜓 束本明䞖 著 」 、 第 251頁、 1995幎、 森厎信尋ら 線集、 メディカルレビュヌ瀟発行 。 CSR2タンパクは、 CSR1タンパクの コラヌゲン様ドメむンを欠き、 代りに 10個のアミノ酞からなる C末端を有する 構造をずる。
該コラヌゲン様ドメむンは、 脂質、 血挿成分 フむブロネクチン、 ラミニン、 コラヌゲン、 フむブリノ䞀ゲンなど 及び倚くの負の電荷を垯びおいる分子など の幅広い分子ず結合するこずができるこずが知られおおり、 コンピュヌタ䞀゜フ ト DNASISを甚いお分析した結果、 C SRタンパクの該コラヌゲン様ドメむンは、 生理孊的 pHで正の実効電荷 net charge) を垯びおいるこずが瀺唆された。 たた、 CSRタンパクは、 倚くのリン酞化郚䜍及び糖鎖結合郚䜍、 䞊びにヘム 結合郚䜍及びミクロボディ䞀 microbodyペルォキシ゜䞀ム peroxisome) ) C 末端タヌゲテむングシグナルを有しおいるこずが確認された 図 4及び図 16) 。 この結果は、 C SRタンパクは翻蚳埌修食を受けるタンパクであるこずを瀺唆す るものである。
さらに、 CSR 1遺䌝子及び CSR 2遺䌝子の 3' 末端の非翻蚳領域には、 3  末端 poly(A)郚䜍の近傍に、 各々 AGTAAA及び AATAAAからなる 6塩基配列を含んで いた。 これたでの報告から、 該配列がポリアデニレ䞀シペンシグナルの䟛䞎に深 く関連しおいるず思われる。 実斜䟋 6 CS R遺䌝子の染色䜓䞊の局圚
F I S H法 (Fluorescence in situ hybridization実隓医孊 ·別冊、 「遺䌝 子工孊ハンドブック」 、 矊土瀟発行、 1992幎、 第 271頁〜第 277頁 を甚いお、 åžž 法によりヒト C SR遺䌝子のヒト染色䜓䞊の局圚を分析した。
C SR遺䌝子のェキ゜ン配列を含むこずが確認された前述のコスミ ドクロヌン 2をプロヌブずしお甚いた。 Gバンド法により染色䜓を分染するために、 チミゞ ンシンクロナむセ䞀シペン Ÿ (thymidine synchronization) 及びブロモデォキシ ゥリゞン攟出法 bromodeoxyuridine release) を甚いお、 ヒト现胞分裂䞭期染色 䜓 (metaphase chromosome) を調補した。
ハむブリダィれ䞀シペンを行う前に、 现胞分裂䞭期ヒト现胞を Hoechst- 33258 ( l jug/ml) で染色し、 玫倖線照射を斜した。 該プロヌブを、 ニックトラス レヌシペン法 nick translation) によりピオチン- 16- UTP (Boehringer補 で暙 識し、 該倉性䞭期现胞にハむブリダィズさせた。 FITC-アビゞン fluorescein i sothiocyanate-avidin BoehringerM) を甚レ、お、 ノボィフ'、リダ れ——ションシグ ナルを怜出した。 該シグナルの正確な枬定は、 耇補した Gバンドを可芖的に確認 するこずにより行った。 この結果、 C SR遺䌝子は耇補 Gバンド染色䜓暙本䞊の 8 p 2 1にマッピングされた 図 5(a)) 。 なお、 现胞分裂䞭期ヒト现胞の染色䜓 暙本は R分染栞型䞊にマッピングした 図 5 (b)) 。 実斜䟋 7 C S R遺䌝子の各皮組織での発珟
前蚘で埗られた C SR 1及び C SR 2の各々の c DNAをプロ䞀ブずしお、 Hu man Multiple Tissue Northern Blot (Clonetech補 を甚い、 C SR 1及び C S R 2の mRNAの各皮ヒト組織での発珟を垞法により調べた。 結果を図 6に瀺す。
C SR遺䌝子の発珟は、 末梢血癜血球以倖の各組織で確認されたが、 脟臓及び 肝臓での発珟は盞察的に䜎いものであった。
本詊隓での実隓操䜜は、 詳现には䞋蚘のようにしお行った。
ヒトの心臓、 脳、 胎盀、 肺、 肝臓、 骚栌筋、 腎臓、 臈臓、 脟臓、 胞腺、 前立腺、 粟巣、 卵巣、 小腞、 倧腞、 及び末梢血癜血球に由来する poly(A)+RNAブロッテむン グ膜 各 2〃gの poly(A)+RNAがブロヅティングされおいる。 Clonetech補 に、 [ひ-32 P]dCTPで暙識した前蚘 CSR 1及び C SR 2の各々をハむブリダィズさせ た。 ハむブリダィズさせた膜を、 2xSSC/0.05 SDS (宀枩で 15分 で 2回、 及び 0. lxSSC/0.1%SDS (50°Cで 10分 掗浄した埌、 BAS1000むメヌゞングプレヌト 富士 補 を甚いお、 オヌトラゞオグラフィ䞀に䟛した 12- 24時間 。 なお、 ヒト 5ァ クチンの RNAの発珟のレベルをコントロヌルずしお甚いた。 実斜䟋 8 p 53タンパクによる CSR遺䌝子の発珟調節
CSR遺䌝子の発珟が腫瘍抑制タンパク p 53ずの盞互䜜甚により制埡されお いるか吊かを䞋蚘のようにしお分析した。
倩然型 P 53遺䌝子たたは倉異型 p 53 - 273遺䌝子発珟プラスミ ドを、 倉 異型 p 53 (273番目及び 309番目のコドンに倉異を有する を発珟するヒ ト結腞癌现胞 SW480 (Rodrigues, N䞄らボ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, 7555-7559, 1990) に䞀過性に遺䌝子導入した 倩然型遺䌝子導入现胞を Wず、 たた倉異型遺䌝子導入现胞を Mず称する。  。 遺䌝子導入埌、 各々の導入现胞 W 及び Mから、  NAを経時的に取埗し、 RT— P CRにより C SR遺䌝子の発珟 状態を分析した。 結果を図 7に瀺した。
さらに、  1 ) 正垞ヒト線維芜现胞 NHDF4042 (Clonetics補 、 2) ヒト子宫 頞癌由来䞊皮様现胞 Hela、 (3) ヒト肺癌现胞 H1299、 (4) ヒト食道癌现胞 TE1 0、 (5) ヒ ト神経グリア芜腫现胞 T98G、 (6) ヒ ト神経グリア芜腫现胞 U87MG、 (7) ヒ卜腫瘍现胞 SKBR3、 及び 8) 前蚘ヒト結腞癌现胞 SW480における CSR 遺䌝子の発珟状況を前蚘ず同様に RT-PCR法により分析した。
結果を図 8に瀺す。 なお、 前蚘 RT— PCRは䞋蚘のように行った。
抜出した党 mRNAを、 M- MuLV逆転写酵玠 200ナニット/〃 1、 GIBC0-BRL 補 の存圚䞋、 d (N) 10 (ベ䞀リンガヌマンハむム補 を甚いおランダムブラ むミングにより c DNAに倉換し、 cDNAラむブラリ䞀を䜜補した。 RT— P CRによる CSRcDNAの増幅には、 プラむマヌずしお EC 12 (配列番号 1 5) 及び EC 2 (配列番号 16) を甚いた。
RT— PCRは、 cDNA混合溶液 25 1) 䞋で、 サヌモザむクラヌ Th ermocycler Perkin Elmer Cetus補 を甚いお 30乃至 40サむクル行った。 該 cDNA混合溶液は、 40ngの cDNA、 1 x P C R緩衝液 6.7mMトリスpH8.8), 16.6mMの硫酞アンモニゥム 6.7 Mの EDTA及び lOmMの ?メルカプト゚タノヌルを 含有 、 25pmolのセンスプラむマヌ、 25pmolのアンチセンスプラむマ䞀、 0.5 Uの T aq DN Aポリメラ䞀れ TAKMA補 、 250〃Mのデォキシヌクレオチド、 10% の DMS0、 及び 7.6mMの塩化マグネシりムからなる。 各 P CRサむクルは、 94°Cで 30秒、 55 °Cで 30秒、 及び 72 °Cで 1分の反応からなる。 䜆し、 最終の P C Rステップでは、 72°Cで 1分間ずした。 埗られた P CR産物を、 3%ァガ口䞀 スゲル電気泳動に付し、 N +ナむロン膜 PALL補 に移し、 内郚オリゎヌクレオチ ドプロヌブ F 12 (配列番号 8) を甚いおサザンハむブリダィれヌシペンさせた。 該 RT— PCRでは、 プラむマヌずしお HGS (配列番号 17) 及び HGA (配 列番号 18) を甚いた GAPDH転写物の増幅をコントロヌルずした。 サザンハ むブリダィれ䞀シペンでは、 内郚プロヌブ 配列番号 19) を甚いた。
CSR遺䌝子の発珟は、 倩然型及び倉異型に拘わらず、 p 53タンパクの存圚 の有無に䟝存しおアップレギナレ䞀卜されるものではないこずが確認された。 こ のこずは、 CSR遺䌝子の発珟のアップレギュレヌション up- regulation) が他 の未知因子により行われおいる可胜性を瀺唆するものである。 実斜䟋 8 p 53タンパクによる CSR遺䌝子の発珟調節
実斜䟋 8の結果をさらに怜蚌するために、 p 53タンパクが CSR遺䌝子に結 合するか吊かを EMSA (electrophoretic mobility shift assay) 法により解析し た。
元々、 p 53タンパクを発珟せず䞔぀ CSRの mRNAの発珟が乏しい现胞である ヒト肺癌现胞 H1299を、 倩然型 p 53遺䌝子たたは倉異型 p 53 - 273遺䌝子発 珟プラスミ ド 各 15〃g) で圢質転換した 倩然型遺䌝子圢質転換现胞を Wず、 た た倉異型遺䌝子圢質転換现胞を Mず称する。  。
圢質転換から 24時間埌、 各々の圢質転換现胞 W及び Mから、 既報ず同様の方 法により栞抜出物を調補した (Mol. Cell. Biol., Vol.12, p.2866-2871, 1992) c 即ち、 圢質転換现胞 各 1 x 106现胞以䞊 を、 5倍量の緩衝液 A (20mM HE PES (pH7.5)、 20%グリセロヌル、 10mM NaCl、 lOmM MgC , 0.2mM EDTA、 ImM DTT、 0.1Ÿ NP40, 及び蛋癜分解酵玠阻害剀 に懞濁し氷䞊で 10分間むンキュベヌション した埌、 4°Cで 10分間遠心した。 次いで、 埗られた栞ペレッ トを、 2倍量の緩衝 液 B (NaClの濃床を 500mMずする以倖は緩衝液 Aず同じ組成 䞭に懞濁させ、 氷䞊 で 30分間むンキュベヌションした埌、 遠心し 14,000rpmm, 15分間 、 遠心䞊柄 を回収した。 この䞊柄を 1〜5〃g/mlの濃床に調補し EMSA詊隓に甚いた。
各々の EMSA詊隓は、 栞抜出物 8〃1) 、 緩衝液 A (9〃1) 、 poly(dl-dC) ( 1 jug Boehringer Mannheim補) 、 モノクロ䞀ナノレ 䜓 PAb421 1 1、 Oncogene Science補 、 及び/たたは競合 DNA (competitor DNA) (非暙識プロヌブの 1 00倍以䞊の量 を甚いお、 末端を暙識した二重鎖オリゎヌクレオチド 玄 5ng) 䞊で行った。 宀枩䞋で 30分間むンキュベヌションした埌、 生成物をゲル 4% ポリ アクリルアミ ド /0.5xTris- borate- EDTA) に流し、 200Vで 3時間電気泳動し、 ― 80°Cでフィルムに転写した。
陜性察照プロ䞀ブずしお、 p 53DNA結合コンセンサス配列 P53- C0N、 配列 番号 2 1) を甚いた。 CSR遺䌝子内に存圚する掚定 p 53結合配列に察するプ ロヌプ P53- CSR、 配列番号 22) は、 アニヌリングオリゎヌクレオチドによっお 構築した。 結果を図 18に瀺した。
圢質転換现胞 W由来の p 53及び圢質転換现胞 M由来の p 53のいずれも、 p 53DNA結合コンセンサス配列 P53- C0N、 配列番号 2 1) に同皋床で結合した。 䞀方、 掚定 p 53結合配列に察するプロヌブ P53- CSR、 配列番号 22) ぞは、 t> 5 3 D N A結合コンセンサス配列ぞの結合に比べ匱いものの、 圢質転換现胞 W由 来の p 5 3のみが結合した。 この結果は、 C S R遺䌝子の転写が、 p 5 3タンパ クの C S R遺䌝子ぞの結合により郚分的に誘導されるこずを瀺唆するものである c 実斜䟋 8 " 各皮腫瘍现胞における C S R遺䌝子の発珟ず p 5 3タンパクの有無 の盞関
p 5 3タンパクの有無が、 C S R遺䌝子の発珟に圱響をさらに解析するため、 実斜䟋 8で甚いた皮々の腫瘍现胞に加え、 䞋蚘のさらに倚くの腫瘍现胞における C S R遺䌝子の発珟を RT- PCR法によるサザンハむブリダィれヌシペンにより実斜 䟋 8ず同様にしお分析した。 䜆し、 コントロヌルずしおは、 ヒト ァクチン転写 物の増幅をコントロヌルずした。 ヒト ァクチンに察する R T— P C Rでは、 フ ォヮ䞀ドプラむマ䞀及びリバヌスプラむマ䞀ずしお、 各々配列番号 2 3及び配列 番号 2 4のオリゎヌクレオチドを甚いた。 たた、 サザンハむブリダィれヌシペン 甚のプロ䞀プずしお、 配列番号 2 5の内郚オリゎヌクレオチドを甚いた。
本詊隓では䞋蚘の正垞现胞及び腫瘍现胞を甚いた。
( 1 ) 倩然型 p 5 3タンパクを発珟する现胞
正垞ヒト線維芜现胞 NHDF4042 (Clonetics補 、 ヒト神絰グリア芜腫现胞 U87MG、 ヒ ト乳癌アデノカルシノヌマ MCF7、 ceacumアデノカルシノ䞀マ SNU- C4、 及びヒ ト 結腞癌カルシノヌマ HCT116。
( 2 ) 倉異型 p 5 3タンパクを発珟する现胞
ヒ ト子宮頞癌由来䞊皮様现胞 Hela、 ヒ ト肺癌现胞 H1299、 ヒ ト食道癌现胞 TE- 3, TE10) 、 ヒ ト神経グリア芜腫现胞 T98G、 ヒ ト腫瘍现胞 SK- BR- 3、 及びヒ ト結腞 癌现胞 (SW480, HCT-15, DLD-1) 、 ヒ ト転移性前立腺癌现胞 LNCaP. FGC、 ヒ ト cea cumアデノカルシノヌマ H498, SNU-C2A) 、 ヒト胃癌现胞 SNU-1 SNU- 5, SNU - 16) 、 及びヒト肺癌现胞 (ACC-LC174, ACC-LC176) 。
結果を図 1 9に瀺した。 この結果は、 p 5 3遺䌝子の状態 p 5 3タンパクの 発珟 ず C SR遺䌝子の発珟が必ずしも盞関するのもではないこずを瀺しおいる。 即ち、 p 53タンパクの存圚の有無が CSR遺䌝子の発珟の誘導に郚分的に関 䞎する可胜性ずずもに、 C S R遺䌝子の発珟の誘導が他の未知因子によっおも行 われおいる可胜性を瀺唆するものである。 実斜䟋 9 现胞内ストレスによる CSR遺䌝子の転写誘導
CSRの機胜を解析するために、 CSRの発珟が、 现胞内で発生したストレス や傷害 ①血枅飢逓 serum sarvation) 、 ②玫倖線照射、 ③過酞化氎玠、 ④熱シ ョック に䟝存するものであるか吊かを䞋蚘のようにしお調べた。
< 9 - 1 > 血枅飢逓 serum sarvation) によるス トレス
前蚘ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042 (3xl04個 、 ヒト結腞癌现胞 SW480 (3x10 5個 、 ヒト神経グリア芜腫现胞 T98G (3X105個 、 ヒト食道癌现胞 TE13 (3x10 5個 、 及びヒト子宮頞癌由来䞊皮様现胞 Hela (3X105個 の各々を、 100麵盎埄 の培逊皿を甚いお、 10%ゥシ胎児血枅 FBS Fetal Bovine Serum GIBCO-BRL 補 含有完党培地に蒔き、 5%C02、 37°C条件䞋で培逊した。 1乃至 2日埌、 該培逊液を 0.1%FB Sを含有する完党培地ず亀換し、 4日間培逊した。 次いで、 各现胞から RNAを抜出し、 垞法に埓っおノヌザンプロット法 Nothern Blotti ng Assay) により C S Rの mR N Aの発珟状態を調べた。 ノヌザンプロットは䞋 蚘のようにしお行った。
TRIZ0L (GIBC0- BRL補 を甚いお、 各现胞から R N Aを抜出した。 次いで、 01i gotex-dT30<Super> (JSR補 日本 を甚いお、 mRNAを単離した。 該 mRNA
(0.51 ig) を、 20%ホルムアルデヒドずずもに 1.5%ァガロヌスゲル䞊に加えた埌、 Biodyne Aトランスファ䞀メンブレン PALL補 䞊に移した。 先に調補したヒト胎 児脳由来の cDN Aラむブラリヌから単離され、 [ひ-32 P]d CTPで暙識したヒ ト CSRcDNA (l l06cpm/ml) をプロ䞀ブずしお、 50% (v/v) ホルムアミ ド、 5 SSPE, 2xデンハヌツ溶液 Denharts solution) 、 及び 1.25% ( /v) S D S を含む溶液䞭でハむブリダィれ䞀シペンを行った。 RN Aの発珟のレベルは、 ァ クチンの RNAの発珟レベルをコントロヌルずしお分析した。
ハむブリダィれヌシペンさせたメンブレンを、 2xSSC/0.05%SDSを甚いお 2回 (各々宀枩䞋で 15分間 掗浄し、 次いで O.lxSSC/O. SDSを甚いお 1回 65 °Cで 10分間 掗浄した。 メンブレンをむメヌゞングプレヌト BAS1000 (Fuji補、 日本 䞊で 24乃至 48時間曝した。 電気泳動のサむズマ䞀カヌずしお、 0.24乃 至 9.5kbの RNA (GIBC0- BRL補 を䜿甚した。
結果を図 9に瀺す。
いずれの现胞においおも、 培逊液から血枅を陀くこず 血枅飢逓状態 により、 CSRの mRNAの発珟が誘導されるこずが確認された。
< 9 - 2 > 玫倖線照射によるストレス
前蚘ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042 (培逊液䞭で 24乃至 48時間培逊しおサブコン フルェント 50〜70%) にしたもの に、 5乃至 120 J/m2の匷さの玫倖線を照射し た埌、 棚胞から RNAを抜出し、 前蚘ず同様にしおノヌザンプロット法により C SRの mRNAの発珟状態を調べた。 mR N Aの発珟のレベルは、 ァクチンの R N Aの発珟レベルをコントロヌルずしお分析した。
玫倖線照射は次のように行った。 即ち、 玫倖線照射する前に、 培逊液を陀き、 リン酞緩衝液で 2回掗浄した。 玫倖線は、 40Wのランプから 50cm離しお 5乃至 120秒間照射した。 玫倖線の量は、 Black Ray UVメヌタ䞀を甚いお枬定した。 結果を図 10に瀺した。
C SRの mRNAの発珟は、 玫倖線照射により誘導されるこずが確認された。 本実隓では、 15J/m2の匷さで照射した堎合に最倧の発珟が芳察された。
さらに、 玫倖線照射埌の C SRmRN Aの絰時的な発珟状態を調べた。 この詊 隓は、 15J/m2の匷さで玫倖線照射した埌の培逊液の添加盎埌から経時的に RN A を抜出し、 前蚘ず同様にしおノヌザンプロッ ト法を甚いお枬定した。 その結果、 玫倖線照射から 20乃至 24時間埌に最倧の発珟誘導が芳察された。 < 9 - 3 > 過酞化氎玠によるストレス
前蚘ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042 (培逊液䞭で 24乃至 48時間培逊しおサブコン フルェント 50〜70%) にしたもの をリン酞緩衝液で 2回掗浄した埌、 1 %ゥ シ胎児血枅を含有する完党培地䞭に蒔き、 5乃至 800 / Mの濃床の 30%過酞化氎玠溶 液 和光玔薬補 を加えお 1時間培逊した。 次いで、 培地を亀換しさらに 24時 間培逊した。 现胞から RNAを抜出し、 前蚘ず同様にしおノヌザンプロット法に より C SRの mRNAの発珟状態を調べた。 なお、 mR N Aの発珟のレベルは、 ァクチンの RN Aの発珟レベルをコントロヌルずしお分析した。
結果を図 1 1に瀺した。
本詊隓から、 C SRmRNAの発珟が、 過酞化氎玠により䞎えられる现胞内ス トレスにより誘導されるこずが確認された。 たた、 本詊隓においおは、 過酞化氎 玠濃床が 1 の時に最倧の発珟誘導が芳察された。 過酞化氎玠は、 生䜓内で反 応性酞玠及びフリヌラゞカルを生成させるこずが知られおいるこずから、 本詊隓 で確認された C SRmRNAの発珟誘導は、 過酞化氎玠により现胞に䞎えられた 酞化ストレスに䟝存するものであるず結論される。
< 9 - 4 > 熱ショックによるス トレス
前蚘ヒ ト正垞線維芜现胞 NHDF4042 ( 80 %コンフルェント、 完党培地 5m 1) ) を、 43°Cで 40分間培逊した埌、 さらに 37 Cで培逊した。 现胞から経時 的に RNAを抜出し、 前蚘ず同様にしおノヌザンプロット法により C SRの mR NAの発珟状態を調べた。 なお、 mRNAの発珟のレベルは、 ァクチンの RNA の発珟レベルをコントロヌルずしお分析した。
結果を図 1 2に瀺した。
CSRmRNAの発珟誘導が、 熱凊理から 24乃至 48時間埌に確認された。 本詊隓で芳察された熱ショックによる発珟誘導は、 前蚘の玫倖線照射及び過酞化 氎玠によるストレスにおける発珟誘導の堎合より遅いようであった。 このこずは、 玫倖線照射及び過酞化氎玠による誘導が、 熱ショックによる誘導より盎接的であ り、 たた発珟誘導のパスりェむがさらに短絡的であるこずを瀺唆するものである。 実斜䟋 9 ' 现胞内ストレスによる C S R遺䌝子の転写誘導
実斜䟋 9における玫倖線照射及び過酞化氎玠の各々ストレスに関する詊隓結果 を䞋蚘のようにしお再床怜蚌した。
< 9 5 - 1 > 玫倖線照射によるストレス
前蚘ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042 ( 3 x 1 0 4现胞 を完党培地 10cm培逊皿 に蒔き、 24乃至 48時間培逊した。 サブコンフルェント 50〜70% ) に達した现胞 培逊系から培逊液を陀き、 现胞をリン酞緩衝液で 2回掗浄した。 この现胞に、 5乃 至 120 J/m2の匷さの玫倖線を照射した埌、 新しい培逊液を加えた。 玫倖線は、 4 0 Wのランプから 50cm離しお 5乃至 1 2 0秒間照射した。 玫倖線の量は、 ラゞオ メヌタ䞀 モデル 254、 アット補 を甚いお枬定した。
24時間の培逊埌、 现胞から R N Aを抜出し、 前蚘ず同様にしおノヌザンブロッ ト法により C S Rの mR N Aの発珟状態を調べた。 m R N Aの発珟のレベルは、 ァクチンの R N Aの発珟レベルをコントロヌルずしお分析した。 結果を図 2 0 (a)に瀺した。
実斜䟋 9 (<9-2>) の結果ず同じく、 C S Rの mR N Aの発珟は、 玫倖線照射に より誘導されるこずが確認された。 本実隓でも、 15J/m2の匷さで照射した堎合に 最倧の発珟が芳察された。
く 9 - 2 > 過酞化氎玠によるストレス
前蚘ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042 ( 3 x 1 0 4现胞 を完党培地 10cm培逊皿 に蒔き、 24乃至 48時間培逊した。 サブコンフルェント 50〜70% ) に達した现胞 培逊系から培逊液を陀き、 现胞をリン酞緩衝液で 2回掗浄した。 この现胞に、 5乃 至 400 /Mの濃床の 30%過酞化氎玠溶液 和光玔薬補 を加えた 1 %ゥシ胎児血枅を 含有する完党培地を加え、 1時間培逊した。 次いで、 培地を新鮮な完党培地に亀 換しさらに 2 4時間培逊した。 现胞から RNAを抜出し、 前蚘ず同様にしおノヌザンプロヅト法により C SR の mRN Aの発珟状態を調べた。 なお、 mRNAの発珟のレベルは、 ァクチンの RN Aの発珟レベルをコントロヌルずしお分析した。 結果を図 20(b)に瀺した。 実斜䟋 9 (<9-3>) の結果ず同じく、 CSRの mRNAの発珟は、 過酞化氎玠によ り䞎えられる现胞内ストレスにより誘導されるこずが確認された。 たた、 本詊隓 においおも、 過酞化氎玠濃床が 10 Mの時に最倧の発珟誘導が芳察された。
実斜䟋 9 " D N A傷害による C S R遺䌝子の転写誘導
2本鎖 DN Aにむンタ䞀カレ䞀ト intercchalate) し、 DNA及びRNAの合 成を阻害するこずにより抗癌䜜甚を瀺す薬剀であるアドリアマむシンを甚いお、 該薬剀のように遺䌝子に察する毒性を瀺す詊薬が、 〇51及び 53の mRNAの発 珟に圱響を䞎えるか吊かに぀いお怜蚎した。
前蚘ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042 ( 3 x 1 04现胞 を完党培地 10cm培逊皿 に蒔き、 24乃至 48時間培逊した。 サブコンフルェン卜 50〜70%) に達した现胞 培逊系に、 0.02乃至 l〃g/mlの濃床のアドリアマむシン adriamycin, ADR) を加 え培逊した。 24時間の培逊埌、 现胞をリン酞緩衝液で 2回掗浄した埌、 新鮮な完 党培地を加え培逊した。
现胞から RN Aを抜出し、 前蚘ず同様にしおノヌザンプロヅト法により C SR の mRNAの発珟状態を調べた。 なお、 mRNAの発珟のレベルは、 ァクチンの RNAの発珟レベルをコントロヌルずしお分析した。 結果を図 2 1に瀺した。 ァドリァマむシンは、 p 53 mRNAの発珟を誘導したが、 C S RmRNAの発珟に䜕 ら圱響を䞎えなかった。 この結果は、 CSR遺䌝子の発珟の誘導は、 アドリアマ むシンのような遺䌝子に察する毒性を瀺す詊薬ではなく、 䞻に、 血枅飢逓、 玫倖 線照射、 過酞化氎玠及び熱ショックのような现胞内ストレスによっお起こるこず を瀺しおいる。 実斜䟋 10 抗酞化剀による C S R遺䌝子発珟の抑制 C S R遺䌝子の発珟誘導に酞化ストレスが関䞎するか吊かを実蚌するためには、 䞋蚘のような実隓を行う。
前蚘ヒ ト正垞線維芜现胞 NHDF4042を、 抗酞化掻性を有し、 酞化ス トレスを消倱 させる掻性を有するチォ化合物であるァセチルシスティン NAC; Acetylcysteine 40m ) を添加した 1 0 % F B S含有完党培地で培逊する。 ァセチルシスティンが 該现胞に察しお無毒性であるこずは、 トリパンブルヌ染色法 trypan blue stai ning) により垞法に埓っお確認する。 次いで、 前蚘ず同様にしお、 玫倖線照射た たは過酞化氎玠によりストレスを䞎えた埌、 R N Aを抜出しノヌザンプロッティ ングを行う。 なお、 mR N Aの発珟のレベルは、 ァクチンの R N Aの発珟レベル をコントロヌルずしお分析する。
玫倖線照射及び過酞化氎玠により䞎えられる现胞内ス トレスによる C S R mR N Aの発珟誘導が、 抗酞化剀による前凊理によっお抑制されるこずを確認するこ ずにより、 C S R遺䌝子の発珟に现胞内に発生する酞化ス トレスが深く関䞎しお いるこず、 及び p 5 3タンパクが现胞内の酞化ス卜レスに察するセンサ䞀ずしお 関䞎しおいるこずを知るこずができる。 実斜䟋 1 0 ' 抗酞化剀による C S R遺䌝子発珟の抑制
C S R遺䌝子の発珟誘導に酞化ストレスが関䞎するか吊かをさらに怜蚌するた めに、 実斜䟋 1 0ず同様の詊隓を行った。
前蚘ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042 ( 3 1 0 4现胞 を完党培地 10cm培逊皿 に蒔き、 24乃至 48時間培逊した。 サブコンフルェント 50〜70%) に達した现胞 を、 抗酞化掻性を有し酞化ストレスを消倱させる掻性を有するチォ化合物である ァセチルシスティン NAC; Acetylcysteine 3 mM) ずずもに 1時間培逊した。 な お、 ァセチルシスティンが該现胞に察しお無毒性であるこずは、 トリパンブルヌ 染色法 trypan blue staining) により垞法に埓っお確認した。
次いで、 実斜䟋 9及び 9 ' ず同様にしお、 玫倖線照射たたは過酞化氎玠による ストレスを䞎えた埌、 RNAを抜出しノヌザンブロッテむングを行った。 なお、 mRNAの発珟のレベルは、 ァクチンの RNAの発珟レベルをコントロヌルずし お分析した。 結果を図 22に瀺した。
玫倖線照射及び過酞化氎玠により䞎えられる现胞内ス トレスによる CSRmR N Aの発珟誘導が、 抗酞化剀による前凊理によっお抑制されるこずが確認された。 実斜䟋 10" 皮々の詊薬による C SR遺䌝子の発珟誘導の分析
现胞内ストレスを䞎える䞋蚘のような皮々の詊薬を甚いお、 各々の詊薬が C S 遺䌝子の発珟を誘導するか吊かを怜蚎した。 たた、 同時に、 酞化ス トレスにより 生成される AP-1耇合䜓のコンポヌネントである c-fos遺䌝子の発珟の状態を枬定し た。
C SR遺䌝子の発珟は、 RT- PCR法によるサザンハむブリダィれ䞀シペンにより 実斜䟋 8ず同様にしお分析した。 䜆し、 コントロヌルずしおは、 ヒト 3ァクチン 転写物の増幅をコントロヌルずした。
ヒト ?ァクチンに察する RT- PCRでは、 フォワヌドプラむマ䞀及びリバ䞀スプラ むマ䞀ずしお、 各々配列番号 23及び配列番号 24のオリゎヌクレオチドを甚い た。 たた、 サザンハむブリダィれヌシペン甚のプロヌブずしお、 配列番号 25の 内郚オリゎヌクレオチドを甚いた。
c- fosに察する RT- PCRでは、 フォヮ䞀ドプラむマ䞀及びリバヌスプラむマヌずし お、 各々配列番号 2 6及び配列番号 27のオリゎヌクレオチドを甚いた。 たた、 サザンハむブリダィれヌシペン甚のプロヌブずしお、 配列番号 28の内郚オリゎ ヌクレオチドを甚いた。
mRNAの取埗の前に、 前蚘ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042に䞋蚘のような凊理を斜 し、 ストレスを䞎えた。 mRNAは、 該凊理から 2時間以内に単離しお、 RT- PCRを行 ぀た。
( 1) 0.001〜 1%の0£ (diethylmaleate, Sigma補 を加え 1時間培逊。 DEM は、 现胞内還元グル倕チオンを枛少させるこずにより酞化ストレスを䞎える。
( 2 ) 300〜2400〃g/mlの PMA (TPA) (4 ? -phorbol 12-myristate 13- acetate  tetradecanoyl phorbol acetate, Sigma補 を加え 1時間培逊。 PMAは、 膜結合 型 NAPDHォキシダヌれ及びプロテむンキナ䞀れ Cを掻性化する。
( 3 ) 0.005〜0.2%の Sodium azide (NaN3 Sigma補) を加え 6時間培逊。 Sodi um azideは、 ミ トコンドリアにおいおチトクロヌム Cォキシダ䞀れずの干枉を通 じお现胞内呌吞を阻害する。
( 4 ) の Sodium arsenite (NaAs03 , Sigma補 を加え 0〜24時間培逊。 S odium arseniteは、 现胞内熱ショック様応答反応及び匕き続く酞化ストレスを匷 く誘導する。
( 5 ) 0.5mMの GSNO (S-nitrosoglutathione, Sigma補) を加え 0〜42時間培逊。 GSN0は、 䞀酞化窒玠 NO) の産生を増加させる。
( 6 ) 50〜1200〃Mの SNP (sodium nitroprusside, Sigma補 を加え 2.5時間培 逊。 SNPは、 䞀酞化窒玠 NO) の産生を増加させる。
結果を図 2 3 (図 23(a)乃至図 23( f) ) に瀺した。
0.1%の DEM、 600〃g/mlの P A、 及び 0.0 の Sodium azideの各々により、 C S R 遺䌝子の発珟が有意に誘導された。 たた、 50 /Mの Sodium arseniteによっおも、 C S R遺䌝子の発珟が有意に誘導された。 0.5mMの GSN0に぀いおは、 4時間の培逊 においお C S R遺䌝子の発珟が有意に誘導された。 SNPに぀いおは、 50〜100〃Mの 濃床の堎合に C S R遺䌝子の発珟が有意に誘導された。
䞀酞化窒玠は、 䞭枢系、 免疫系及び埪環噚系における重芁な調節因子ずしお機 胜するずずもに、 敗血症 septic shock) 、 高血圧、 梗塞、 及び神経倉性疟患 (neurodegenerative disorder) 等の病因ずしおも䜜甚するこずが明らかにされ おきおいる (Annu. Rev. Biochem. , Vol .63, p. 175-195, 1994) 。 埓っお、 SNPや GSNOにより C S R遺䌝子の発珟が誘導されるずいう結果は、 C S Rタンパクが、 酞化ストレス応答性遺䌝子であり、 前蚘のような疟患の発症に関䞎するこずを瀺 唆するものである。 実斜䟋 1 0 " — 1 酞化ストレスによる皮々遺䌝子の発珟誘導の分析
酞化ストレスにより C S R遺䌝子以倖の他の遺䌝子の発珟が誘導されるかを、 怜蚎する目的で、 過酞化氎玠及び Hemin各々の酞化ストレスに察する、 CSR、 c-fo s、 p53、 waf- c- src、 HO- 1、 catalaseボ SODボ 及び beta- actinの経時的遺䌝子発 珟を、 RT- PCR法を甚いお怜蚎した。
mMAの取埗の前に、 前蚘ヒト正垞線維芜现胞 NHDF4042を、 10〃Mの Heminたたは の過酞化氎玠の存圚䞋で 1乃至 50時間培逊し、 経時的に Aを単離しお、 RT
-PCRを行った。
各遺䌝子の発珟は、 RT- PCR法によるサザ䞀ンハむプリダむれヌシペンにより実 斜䟋 8ず同様にしお分析した。 各々の遺䌝子に察する RT- PCI こ甚いるフォヮ䞀ド プラむマヌ及びリバ䞀スプラむマ䞀、 䞊びにサザンハむプリダむれヌシペンに甚 いる内郚オリゎヌクレオチドプロヌブは、 各々䞋蚘のずおり。
( 1 ) C S R
フォワヌドプラむマ䞀 配列番号 1 5
リバヌスブラィマ䞀 配列番号 1 6
内郚ォリゎヌクレオチドプロヌブ配列番号 8
( 2 ) c-fos
フォヮ䞀ドプラむマ䞀 配列番号 2 6
リバヌスプラむマヌ 配列番号 2 7
内郚オリゎヌクレオチドプロヌブ 配列番号 2 8
( 3 ) p53
フォヮ䞀ドプラむマ䞀 配列番号 2 9
リバヌスプラむマヌ 配列番号 3 0 内郚オリゎヌクレオチドプロヌブ配列番号 3 1
( 4 ) waf-1
フォヮ䞀ドプラむマ䞀 配列番号 3 2 リバヌスプラむマ䞀 配列番号 3 3 内郚オリゎヌクレオチドプロヌブ 配列番号 3 4 5 ) c-src
フォヮ䞀ドプラむマ䞀 配列番号 3 5 リバヌスプラむマヌ 配列番号 3 6 内郚オリゎヌクレオチドプロ ブ配列番号 3 7
( 6 ) H0-1
フォヮ䞀ドプラむマ䞀 配列番号 3 8 リバヌスプラむマ䞀 配列番号 3 9 内郚オリゎヌクレオチドプロヌブ 配列番号 4 0
( 7 ) catalase
フォヮ䞀ドプラむマ䞀 配列番号 4 1 リバ䞀スプラむマヌ 配列番号 4 2 内郚オリゎヌクレオチドプロヌブ 配列番号 4 3
( 8 ) SOD
フォヮ䞀ドプラむマ䞀 配列番号 4 4 リバ䞀スプラむマヌ 配列番号 4 5 内郚オリゎヌクレオチドプロ ブ配列番号 4 6
( 9 ) beta-actm
フォヮ䞀ドプラむマ䞀 配列番号 2 3 リバヌスプラむマ䞀 配列番号 2 4 内郚オリゎヌクレオチドプロ プ配列番号 2 5 結果を図 24 (図 24(a)及び図 24(b)) に瀺した。 実斜䟋 11 CSRタンパクの现胞内での分垃
C SRタンパクの现胞内での分垃を免疫现胞化孊染色 immunocytechemical s taining) により䞋蚘のようにしお調べた。
前蚘のようにしお埗た CSRの完党長 cDNAを、 0.25Uの T aqポリメラ䞀れ
(TAKARA補 及び 0.5Uの p f uDNAポリメラヌれ Stratagene補 の混合物を 甚いお垞法に埓っお P C Rにより増幅した埌、 哺乳動物発珟べク倕䞀 pCDNA3.1
(Invitrogen補 にクロヌン化した。 ベクタ䞀ぞの c D N Aの揷入は、 塩基配列 解析するこずにより確認した。 次いで、 ぞマグルチニン Hemagglutinin, HA) ェピトヌプ (YPYDVPDYA Wilson, I䞄ら、 CELL, Vol.37, 767-778, 1984) の塩 基配列を甚いお、 CSRcDNAの 5 末端及び 3 末端にタグ tag) を付した c 該 cDNAを甚いお、 ヒト肺癌现胞 H1299及びヒト子宮頞癌现胞 Helaの各々を圢 質転換した。 现胞を Geneticin (G418 GIBCO-BRL補 の存圚䞋で 10日間培 逊した。 CSRを安定しお発珟する现胞を、 RT— PCR、 り゚スタンブロッテ むング Western blotting) 䞊びに SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 SDS-P AGE) により遞別した。 遞別した现胞を、 免疫现胞化孊染色する 24時間前に、 2 ç©Ž well) のスラむ ドチャンバ䞀 Falcon補 に蒔いた。 培逊埌、 现胞をリン酞 緩衝液で軜く掗浄し、 4%パラホルムアルデヒドを甚いお固定化した。 リン酞緩 衝液で掗浄した埌、 现胞を、 2%ゥシ血枅アルブミン存圚䞋、 宀枩で 30分間培 逊した。 次いで、 抗 HAェピト䞀プポリクロ䞀ナル抗䜓 MBL補 ずずもに 37°C で 1時間培逊した。 リン酞緩衝液で 3回掗浄した埌、 FITC暙識第 2抗䜓ずずもに 37°Cで 40分間培逊し、 蛍光顕埮鏡 fluorescence microscope) 䞋で芳察した
(図 13(a)) o たた、 æ žã‚’ DAPI (4' ,6' -Diamino-2-phenyl indole, Sigma補) で 染色し、 蛍光顕埮鏡䞋で芳察した 図 13(b)) 。
図 13(a)では、 DAP Iにより染色された栞ずの䜍眮 図 13(b)) ず同じ䜍 眮に、 染色された栞より広い範囲 栞の呚囲 の染色が確認されるこずから、 H Aタグが付された郚䜍 C末端及び N末端 に拘わらず、 CSRタンパクが现胞 質に存圚するこずが確認された。
さらなる怜蚎のためには、 抗ゎルゞ- 58Kタンパク golgi- 58K protein) 抗䜓 (Sigma補 を甚いお、 前蚘ず同様にしお察照染色を行う。
さらに、 现胞内ストレス 现胞傷害 を受けた堎合の CSRタンパクの现胞内 での局圚を䞋蚘のように調べるこずができる。
前蚘のようにしお埗た C S Rを安定に発珟するスラィ ドチャンバ䞀䞊の现胞に、 现胞傷害詊薬ずしおの 20 M過酞化氎玠を添加しお 1時間培逊した埌、 培地を亀換 しおさらに 24時間培逊する。 次いで、 抗 HAェピトヌプポリクロ䞀ナル抗䜓を 甚いお前蚘ず同様にしお免疫现胞化孊染色を斜す。
现胞内ストレス 现胞傷害 を䞎えない堎合ず同様に、 CSRタンパクが现胞 質内に分垃し、 その発珟はストレスを䞎えない堎合より匷いものであるこずが確 認される堎合には、 现胞質内での C SRタンパクの分泌が、 ストレスによっおも 䟝存するものず考えるこずができる。 実斜䟋 11' CSRタンパクの现胞内での分垃
実斜䟋 11で埗られた結果を、 実斜䟋 11の方法ず同様にしおさらに怜蚌した。 前蚘のようにしお埗た CSR1及び CSR2の完党長 c D N Aを、 0.25Uの T a qポリメ ラ䞀れ TAKARA補 及び 0.5Uの pf uDNAポリメラヌれ Stratagene補 の混 合物を甚いお垞法に埓っお P C Rにより増幅した埌、 哺乳動物発珟べク倕䞀 pCDN A3.1 (Invitrogen補 にクロヌン化した。 ベクタヌぞの c D N Aの挿入は、 塩基 配列解析するこずにより確認した。 次いで、 ぞマグルチニン Hemagglutinin, H A) ェピトヌプ (YPYDVPDYA Wilson, I䞄ら、 CELL, Vol.37, 767-778, 1984) の塩基配列を甚いお、 CSRcDNAの 5' 末端及び 3' 末端にタグ tag) を付 した。 該 c D N Aを甚いお、 ヒト子宮頞癌现胞 Helaを圢質転換した。 现胞を Genetici n ( G 4 1 8 GIBC0-BRL補 の存圚䞋で 1 0日間培逊した。 C S Rを安定しお発 珟する现胞を、 R T— P C R、 り゚スタンブロッテむング Western blotting) 䞊びに SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 SDS- PAGE) により遞別した。 遞別し た现胞を、 免疫现胞化孊染色する 2 4時間前に、 2ç©Ž well) のスラむ ドチャン バヌ Falcon補 に蒔いた。 培逊埌、 现胞をリン酞緩衝液で軜く掗浄し、 冷メタ ノヌルを甚いお固定化した。 リン酞緩衝液で掗浄した埌、 现胞を、 2 %ゥシ血枅 アルブミン存圚䞋、 宀枩で 3 0分間培逊した。 次いで、 抗 H Aェビト䞀プポリク ロヌナル抗䜓 MBL補 ずずもに 3 7 °Cで 1時間培逊した。 リン酞緩衝液で 3回掗 浄した埌、 FITC暙識第 2抗䜓 Cappel補 ずずもに 3 7 °Cで 4 0分間培逊し、 蛍 光顕埮鏡 fluorescence microscope) 䞋で芳察した。 たた、 æ žã‚’ DAPI (46- D iamino-2-phenyl indole, Boeheringer Mannheim補 で染色し、 蛍光顕埮鏡䞋で芳 察した。 結果を図 2 5 (図 25(a)〜図 25(d)) に瀺した。
空のベクタヌで圢質転換した现胞 ネガティブコントロヌル では、 党く染色 されなかった 図 25(a)) 。 C S Rの完党長 cDNA発珟べクタ䞀で圢質転換された现 胞では、 D A P Iにより染色された栞ずの䜍眮 図 25(d)) ず同じ䜍眮に、 染色さ れた栞より広い範囲 栞の呚囲 の染色が確認されるこずから、 H Aタグが付さ れた郚䜍 C末端及び N末端 に拘わらず、 C S Rタンパクが现胞質に存圚する こずが確認された 図 25(c)) 。
C S Rタンパクの现胞質での存圚をさらに怜蚎のために、 抗ゎルゞ -58K倕ンパ ク golgi- 58K protein) 抗䜓 Sigma補 及びロヌダミンを接合させた二次抗䜓 (Leinco Tech.補 を甚いお、 前蚘ず同様にしお察照染色を行った。 結果を図 2 5 (図 25(e)及び図 25(f)) に瀺した。 前蚘の H Aタグを付した C S Rタンパクの 詊隓結果ず同様に䜍眮に、 シグナルが怜出された 図 25(e)) 。
さらに、 现胞内ストレス 现胞傷害 を受けた堎合の C S Rタンパクの现胞内 での局圚を䞋蚘のように調べた。 前蚘のようにしお埗た C S Rを安定に発珟するスラィ ドチャンバ䞀䞊の现胞に、 现胞傷害詊薬ずしおの 過酞化氎玠を添加しお 1時間培逊した埌、 培地を亀換 しおさらに 24時間培逊した。 次いで、 抗 HAェビトヌプポリクロ䞀ナル抗䜓を 甚いお前蚘ず同様にしお免疫现胞化孊染色を斜した。 結果を図 25 (図 25(g)及び 図 25(h)) に瀺した。
现胞内ストレス 现胞傷害 を䞎えない堎合ず同様に、 CSRタンパクが现胞 質内に分垃し、 その発珟はストレスを䞎えない堎合より匷いものであるこずが確 認された。 この結果は、 现胞質内での CSRタンパクの分泌が、 ストレスによ぀ おも䟝存するこずも瀺唆するものである。 実斜䟋 12 现胞内ストレスによる现胞死に察する CSRの圹割
现胞が皮々のストレスを受けた堎合に発珟するタンパクは、 該现胞の现胞死あ るいは生存に深く関䞎するこずが知られおいる。 现胞が现胞内ストレス 现胞傷 害 を受けた堎合における CSRの機胜 ·圹割を解明するため、 䞋蚘现胞生存詊 隓を行った。
C SR 1及び C SR 2各々の完党長 cDNAを哺乳動物発珟べクタ䞀 pCDNA3.1 (Invitrogen補 にクロヌン化した埌、 ヒト肺癌现胞 H1299を圢質転換した。 Gen eticin (GIBCO- BRL補 の存圚䞋で 10日間培逊しお、 CSRを安定に発珟する现 胞を遞別した。 CSRの過剰発珟は、 RT— PCRを甚いお確認した。 該過剰発 珟现胞 500個 を、 盎埄 60腿の培逊皿に蒔いた。 18時間の培逊埌、 现胞ぞの 5 乃至 60J/m2の匷さの玫倖線照射たたは培逊液ぞの 50乃至 200 iMの過酞化氎玠の添 加を斜し、 1時間培逊した。 次いで、 培地を亀換し、 さらに 10乃至 20日培逊 した。 埗られたコロニヌを冷メタノヌルで固定し、 ギムザ溶液 Giemsa's solut ion; Merck補 で染色した埌、 生现胞コロニヌ数を蚈枬した。
なお察照ずしお、 C SR遺䌝子を挿入しおいない PCDNA3.1ベクタ䞀で圢質転換 した H1299圢質転換䜓、 及びいずれのベクタヌでの圢質転換も斜しおいない H1299 芪现胞を甚いお同様の詊隓を行った。
結果を ILJ 1 4 (玫倖線照射 及び図 1 5 (過酞化氎玠 に瀺した。
玫倖線照射及び過酞化氎玠による现胞内ストレスのいずれにおいおも、 C S R を発珟する现胞の生存率は、 察照に比べ優䜍に高いものであるこずが確認された。 この結果から、 C S Rは、 皮々の现胞内ストレス 傷害 により起こる现胞死に 察しお抑制的に働く機胜を有するものであるず考えられる。 実斜䟋 1 2 ' 现胞内ストレスによる现胞死に察する C S Rの圹割
実斜䟋 1 2で埗られた玫倖線照射に係る詊隓の結果を、 実斜䟋 1 2ず同様の方 法に埓っお、 さらに怜蚌した。 䜆し、 本詊隓では、 前蚘 CSR1遺䌝子発珟べクタ䞀 及び CSR2遺䌝子発珟ベクタヌの䞡方で共圢質転換 Co- transfection) した现胞 ( 「CSR1/CSR2」 ず略称 に぀いおも怜蚎した。 結果を図 2 6に瀺した。
CSR1遺䌝子発珟ベクタヌによる圢質転換现胞  「H1299- CSR1」 ず略称 、 CSR2 遺䌝子発珟べクタ䞀による圢質転換现胞  「H1299- CSR2」 ず略称 、 及び該䞡方 のベクタヌで共圢質転換した现胞 CSR1/CSR2) のいずれも、 察照である H1299芪 现胞  「H1299」 ず略称 及びいずれの CSR遺䌝子も有しない空のベクタヌで圢質 転換した现胞  「H1299- vector」 ず略称 に比べ、 玫倖線照射による现胞内スト レスによる现胞死に耐性を瀺した。
該耐性は、 CSR1/CSR2, H1299-CSR1, 及び H1299- CSR2の順で高かった。 この結果 は、 C S Rタンパクが、 皮々の现胞内ス トレス 傷害 により起こる现胞死に察 しお抑制的に働く機胜を有するこずを瀺すものである。 実斜䟋 1 2 " 现胞内ストレスによる现胞死に察する C S Rの圹割
実斜䟋 1 2及び実斜䟋 1 2 ' で確認された C S Rタンパクの酞化ストレスに察 する耐性発珟のメカニズムを䞋蚘のようにしお解析した。
実斜䟋 1 2 で甚いた 4皮類の现胞 (H1299- vector, H1299-CSR H1299- CSR2、 及び CSM/CSR2) (各 2 x 1 0 5现胞 を、 過酞化氎玠 20〃M) の存圚䞋で 1時間 培逊した埌、 培地を新鮮な完党培地に亀換しさらに 24時間培逊した。 次いで、 现 胞を、 5〃Mの DCFH-DA (2' , 7, -dichlorofluorescein diacetate, Molecular Pro bes補 の存圚䞋で 3 7 °Cで 3 0分間培逊した埌、 リン酞緩衝液䞭に懞濁させた。 各々の现胞矀で现胞が産生する反応性酞玠皮 reactive oxygen spieces) の量を FACSCalibur (Becton Dickinson補) により枬定した。
この方法は、 现胞が産生する反応性酞玠皮 reactive oxygen spieces) の量を、 现胞内における DCFH-DAの酞化に埓っお増加する蛍光匷床に基づいお求めるもので ある。 結果を図 2 7 (図 27(a)乃至図 27(d)) に瀺した。
反応性酞玠皮の量は、 察照である H1299- vector矀で優䜍に増倧した 図 27(a) ) c 䞀方、 H1299- CSR1矀及び H1299- CSR2矀における反応性酞玠皮の産生量は、 察照で ある H1299- vector矀に比べ、 有意に枛少しおいた 図 27(b)及び図 27(c ) ) 。 驚く べきこずに、 CSM/CSR2矀では、 反応性酞玠皮の産生がほずんど消倱しおいた 図 27(d)) 。
さらに、 H1299-vector矀及び CSR1/CSR2矀に぀いおは、 本詊隓における過酞化氎 玠によるストレス付加により誘導される现胞死 现胞の小粒化ずいう圢態倉化を 経お现胞死に至る に察する耐性の有無を、 现胞の圢態の倉化から分析した。
H1299- vector矀及び CSM/CSR2矀の各々に぀いお、 過酞化氎玠の添加時 0時間 、 過酞化氎玠存圚䞋での 1時間の培逊埌、 及び 3時間の培逊埌の现胞の圢態を垞法 により顕埮鏡䞋にお芳察した。
結果を図 2 8 (図 28(a)乃至図 28(h) ) に瀺した。 察照である、 H1299- vector矀 では、 過酞化氎玠による酞化ストレス付加盎埌から现胞の圢態に倉化 小粒化 が芋られ、 経時的に现胞死に向っおいるこずが芳察された。 䞀方、 CSR1/CSR2矀に ぀いおは、 過酞化氎玠による酞化ストレス付加盎埌に䞀時的に现胞の圢態に倉化 が芋られる力、 経時的にもずの现胞圢態に戻っおいくこずが芳察された。
この結果から、 C S Rタンパク力 皮々の酞化ストレスにより匕き起こされる 现胞死に察しお抑制的に働く分子であるこずが分かる。 実斜䟋 1 3 C S R遺䌝子ノックァゥトマりスの䜜補
ヒト C S R遺䌝子に察応するマりスの内圚性の C S R遺䌝子が䞍掻性化 ノッ クァゥト されたノックァゥトマりスを䞋蚘のようにしお䜜補した。
( 1 ) 倕ヌゲティングベクタ䞀の構築
マりス CSRタンパクをコヌドする内圚性遺䌝子を盞同組換え 日経サむ゚ンス、 1994幎 5月号、 第 52- 62頁 により䞍掻性化 ノックアりト するための倕䞀ゲテ ィングベクタ䞀を䞋蚘のようにしお構築した。
前蚘実斜䟋でクロヌニングしたヒト CSR倕ンパクをコヌドする cDNAを 3 2Pで暙識 しお垞法に埓っおハむブリダィれヌシペン甚プロヌブを䜜補した。 このプロヌブ を甚いお、 マりスゲノム D N A (染色䜓 D N A) が導入されたコスミ ドラむブラ リ䞀  「ラボマニュアルヒトゲノムマッピング」 、 堀雅明及び䞭村祐茔線、 äžžå–„ 出版の方法ず同様にしお䜜補した。  をスクリヌニングし、 マりス CSRタンパクを コヌドするェキ゜ン 図 1に瀺されるヒト CSR遺䌝子のェキ゜ン A, B, C, D及び Eの䞀郚に察応するマりスェキ゜ン を含むマりス CSRゲノミック DNAクロヌンを取 埗した。
プラスミ ド pBluescript I I SK (- )を Kpnl消化した郚䜍に、 HindlU及び Xholで消 化しお切り出したチミゞンキナヌれ遺䌝子  「TK」 、 ネガティブセレクションマ 䞀力䞀ずしお を平滑末端で挿入、 連結した。
次いで、 この pBluescript I I SK ( - )の Xbal及び Sailで切断し、 該切断郚䜍に、 マりス CSRゲノミック DNAを Hpal及び Acc65Iで消化しお埗られた DNA断片 ェキ゜ン A乃至 D) を平滑末端で挿入、 連結した。
次に、 Xbal及び EcoRVで凊理しお切り出したネオマむシン耐性遺䌝子  「neo」 、 ポゞティブセレクションマヌカ䞀ずしお を、 前蚘マりス CSRゲノミック DNA䞭の ェキ゜ン Bの Nci I切断郚䜍ずェキ゜ン Dの Aor51HI切断郚䜍ずの間に平滑末端で揷 入、 連結した。 埗られたプラスミ ドを Notlで切断しお線状化しおタヌゲティング ベクタ䞀ずした。
䜜補した倕䞀ゲティングベクタヌの構造を暡匏的に瀺す図を図 2 9に瀺す。
( 2 ) 倕ヌゲティングベクタヌの E S现胞ぞの導入
15%ゥシ胎児血枅を含有する DMEM培地䞭で培逊したマりス胚性幹现胞 ES现胞 embryonic stem cel l、 1 1 0 8现胞) (Nature, Vol .362, p.255-258, 1993及 び Nature, Vol .326, p.292-295, 1987) をトリプシンで凊理しお単䞀现胞ずした 埌、 リン酞緩衝液で 3回掗浄しお现胞濃床を 1 X 1 0 7现胞/ mlに調補した。 现胞 懞濁液 l mlあたり 25〃gの前蚘倕䞀ゲティングベクタ䞀を加え、 350V/cm (25〃F) の条件䞋で電気パルスを 1回かけた。 次いで、 シャヌレ 10cm) に 1 X 1 0 7现胞 の ES现胞を播皮し維持培地䞭で 1日培逊した埌、 培地を遞択培地 G418(250 g/ ml )及び 2〃Mのガンシクロビルを含有する に亀換した。 以埌 2日毎に培地亀換を 行い培逊した。 倕ヌゲティングベクタ䞀導入から 1 0曰目に、 マむクロピペット を甚いお、 顕埮鏡䞋で数癟個のネオマむシン耐性 ES现胞クロヌンを取埗した。 埗 られた ES现胞クロ䞀ンを、 Feeder现胞を敷いた 24穎プレヌトで各々別々に培逊す るこずにより、 ネオマむシン耐性 ES现胞のレプリカを取埗した。
( 3 ) ノックアりト E S现胞のスクリヌニング
埗られたネオマむシン耐性 ES现胞の各々に぀いお、 マりス CSRタンパクをコヌド する内圚性遺䌝子の盞同組換えによる砎壊 ノックアりト が起こっおいるか吊 かをゲノミックサザンブロッティングにより確認する。
ゲノミツクサザンブロッティングは、 各々のネオマむシン耐性 ES现胞から抜出 したゲノミック DNAの EcoRIで切断断片に぀いお、 マりス CSRゲノミック DNAの 5 ' 偎及び 3 ' 偎の配列を有する 2぀のプロヌブを甚いお垞法により行う。 DNAの粟補 は、 自動 DNA 補ロボッ ト クボ倕補 を甚いる。
こうしお ES现胞クロヌン䞭で、 目的ずするノックァゥトが起こっおいるこずが 確認される。 この ES现胞クロヌンを䞋蚘に述べるノックァゥトマりスの䜜補に甚 いる。
( 4 ) ノックァゥトマりスの䜜補
前蚘で埗たマりス CSR倕ンパクをコヌドする内圚性遺䌝子が盞同組換えにより䞍 掻性化 ノックアりト された ES现胞クロヌンの各々を、 C57BL6マりス 日本チ ダヌルズリバ䞀補 の雄雌を亀配しお埗た胚盀胞に 1胚あたり 1 5個ず぀泚入 (マむクロむンゞェクション する。 泚入盎埌に、 停劊嚠凊理しおから 2.5日目の 仮芪 ICRマりス 日本クレア補 の子宮に子宮の片偎あたり玄 1 0個ず぀の胚盀胞 を移怍する。 こうしお、 各々の ES现胞クロヌンに぀いお、 ノックアりトキメラマ りスを埗る。
次いで埗られた各々のキメラマりスを正垞 C57BL6マりスず亀配し、 ES现胞由来 の毛色遺䌝子によるァグヌチ agouti) 色のマりスを埗る。 産業䞊の利甚の可胜性
本発明の新芏な遺䌝子/倕ンパクは、 䞋蚘のような特城を有し、 现胞内に発生 した皮々のストレスに察しお防埡的に働く新芏なスカベンゞャ䞀受容䜓であるず 考えられるこずから、 本発明のスカベンゞャヌ受容䜓 C S R、 Cellular Senso r- Related protein) をコヌドする遺䌝子あるいはタンパクを倕䞀ゲッ トずしお、 生䜓内に生じた现胞内ストレス、 異物あるいは倉性蛋癜に起因する病的症状ゃ疟 患 䟋えば、 動脈硬化症、 糖尿病性血管障害、 现菌感染など の予防䞊びに治療 のための医薬品開発するために極めお有甚である。
該遺䌝子は、 アンチセンス医薬品ずしお、 たた遺䌝子治療においお利甚するこ ずができ、 該倕ンパクは、 その可溶性断片 现胞倖領域や各ドメむン を䜜補す るこずにより可溶性蛋癜医薬品ずしお有甚である。
さらに、 該倕ンパクたたはその断片に反応性を有する抗䜓及びその抗䜓の䞀郚 は、 C S Rの機胜を制埡する抗䜓医薬品ずしお極めお有甚である。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 10に蚘茉されるアミノ酞配列を有するタンパクをコヌドする D NA及びその断片。
2. 配列番号 12に蚘茉されるアミノ酞配列を有するタンパクをコヌドする D NA及びその断片。
3. 配列番号 14に蚘茉されるアミノ酞配列を含むタンパクをコヌドする D N A及びその断片。
4. 配列番号 9に蚘茉される塩基配列の塩基番号 276乃至 2096の塩基配 列を有する DN A及びその断片。
5. 配列番号 11に蚘茉される塩基配列の塩基番号 276乃至 1676の塩基 配列を有する DN A及びその断片。
6. 配列番号 13に蚘茉される塩基配列の塩基番号 364乃至 1971の塩基 配列を含む DN A及びその断片。
7. 配列番号 9、 配列番号 11たたは配列番号 13のいずれかに蚘茉される塩 基配列を有する DNAにストリンゞェン卜な条件䞋でハむプリダむズする DNA。
8. 配列番号 10に蚘茉されるアミノ酞配列若しくは該アミノ酞配列ず実質的 に同䞀のアミノ酞配列を有するタンパク䞊びにそれらの断片。
9. 配列番号 12に蚘茉されるァミノ酞配列若しくは該ァミノ酞配列ず実質的 に同䞀のアミノ酞配列を有するタンパク䞊びにそれらの断片。
10. 配列番号 14に蚘茉されるアミノ酞配列若しくは該アミノ酞配列ず実質 的に同䞀のアミノ酞配列を含むタンパク䞊びにそれらの断片。
11. 請求項 1乃至請求項 7のいずれかに蚘茉の DNA若しくはその断片を含 む発珟ベクタヌ。
12. 請求項 11蚘茉の発珟ベクタヌで圢質転換された圢質転換现胞。
13. 請求項 8乃至請求項 10のいずれかに蚘茉のタンパクたたはその断片に 反応性を有する抗䜓たたは該抗䜓の䞀郚。
14. 抗䜓が、 モノクロヌナル抗䜓であるこずを特城ずする請求項 13蚘茉の 抗䜓たたは該抗䜓の䞀郚。
15. 請求項 13たたは請求項 14蚘茉の抗䜓若しくは該抗䜓の䞀郚及び薬孊 的に蚱容され埗る担䜓を含んでなる医薬組成物。
16. 請求項 8乃至請求項 10のいずれかに蚘茉のタンパクたたはその断片に 反応性を有するモノクロヌナル抗䜓を産生する现胞。
17. 該现胞が、 モノクロヌナル抗䜓を産生する胜力を有する非ヒト哺乳動物 由来の B现胞ず哺乳動物由来のミ゚ロヌマ现胞ずを融合しお埗られる融合现胞で あるこずを特城ずする請求項 16蚘茉の现胞。
18. 該现胞が、 該モノクロヌナル抗䜓の重鎖をコヌドする DNA若しくはそ の軜鎖をコヌドする DNAのいずれか䞀方の DNA、 たたは䞡方の DNAが现胞 内に導入されるこずにより圢質転換された遺䌝子組換え现胞であるこずを特城ず する請求項 16蚘茉の现胞。
PCT/JP1998/003602 1997-08-13 1998-08-12 Proteines du type recepteurs accepteurs WO1999009159A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002300476A CA2300476A1 (en) 1997-08-13 1998-08-12 Scavenger receptor-like proteins
EP98937802A EP1004665A4 (en) 1997-08-13 1998-08-12 PROTEINS SIMILAR TO THE 'SCAVENGER RECEPTOR'.

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9/233396 1997-08-13
JP23339697 1997-08-13
JP10230121A JPH11123094A (ja) 1997-08-13 1998-07-30 スカベンゞャヌ受容䜓様タンパク
JP10/230121 1998-07-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1999009159A1 true WO1999009159A1 (fr) 1999-02-25

Family

ID=26529154

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1998/003602 WO1999009159A1 (fr) 1997-08-13 1998-08-12 Proteines du type recepteurs accepteurs

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1004665A4 (ja)
JP (1) JPH11123094A (ja)
CA (1) CA2300476A1 (ja)
WO (1) WO1999009159A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9345627B2 (en) 2008-08-29 2016-05-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Disposable absorbent article having tailored leg edges
CN114990158A (zh) * 2022-05-19 2022-09-02 北京倧孊 Scara3基因敲陀仓錠暡型的构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5691147A (en) * 1994-06-02 1997-11-25 Mitotix, Inc. CDK4 binding assay

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5691147A (en) * 1994-06-02 1997-11-25 Mitotix, Inc. CDK4 binding assay

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1004665A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9345627B2 (en) 2008-08-29 2016-05-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Disposable absorbent article having tailored leg edges
CN114990158A (zh) * 2022-05-19 2022-09-02 北京倧孊 Scara3基因敲陀仓錠暡型的构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1004665A1 (en) 2000-05-31
EP1004665A4 (en) 2002-11-27
CA2300476A1 (en) 1999-02-25
JPH11123094A (ja) 1999-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6562618B1 (en) Monoclonal antibody against connective tissue growth factor and medicinal uses thereof
JP4689781B2 (ja) アミノ酞茞送蛋癜及びその遺䌝子
KR100548761B1 (ko) -βⅡ형 수용첎에 대한 읞간 몚녞큎로날 항첎 및 귞의 의앜용도
JP2013237670A (ja) 酞化受容䜓に察するヒトモノクロヌナル抗䜓及びその医薬甚途
JP4537507B2 (ja) 結合組織増殖因子に察するモノクロヌナル抗䜓及びその医薬甚途
US20170164591A1 (en) Sperm-Specific Cation Channel, Catsper2, and Uses Therefor
JP5205440B2 (ja) アミノ酞茞送蛋癜及びその遺䌝子
US6710171B1 (en) Physiologically active protein originating in mammals
WO1999009159A1 (fr) Proteines du type recepteurs accepteurs
EP0880586A1 (en) Lyst1 and lyst2 gene compositions and methods of use
CA2462670A1 (en) Sperm-specific cation channel, catsper2, and uses therefor
JP2004121001A (ja) −β型受容䜓に察する高芪和性モノクロヌナル抗䜓
US20050019868A1 (en) Neutral amino acid transporter and gene thereof
JP2000037190A (ja) 哺乳動物由来組織特異的生理掻性タンパク
EP0968289A1 (en) Icam-6 materials and methods
JP2003116564A (ja) 新芏タンパク質およびそれをコヌドする

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2300476

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2300476

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998937802

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998937802

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09485605

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1998937802

Country of ref document: EP