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WO1999009060A1 - PROTEINE 1(3)mbt, POLYNUCLEOTIDE CODANT POUR LADITE PROTEINE, SON POLYNUCLEOTIDE ANTISENSE ET ANTICORPS RECONNAISSANT LADITE PROTEINE - Google Patents

PROTEINE 1(3)mbt, POLYNUCLEOTIDE CODANT POUR LADITE PROTEINE, SON POLYNUCLEOTIDE ANTISENSE ET ANTICORPS RECONNAISSANT LADITE PROTEINE Download PDF

Info

Publication number
WO1999009060A1
WO1999009060A1 PCT/JP1998/003551 JP9803551W WO9909060A1 WO 1999009060 A1 WO1999009060 A1 WO 1999009060A1 JP 9803551 W JP9803551 W JP 9803551W WO 9909060 A1 WO9909060 A1 WO 9909060A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mbt
sequence
gene
protein
polynucleotide
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/003551
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshihiko Kishimoto
Shin-Ichiro Niwa
Yasuko Nagamine
Hisashi Koga
Hideyuki Saya
Original Assignee
Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Electric Industries, Ltd. filed Critical Sumitomo Electric Industries, Ltd.
Priority to EP98936718A priority Critical patent/EP1004596A4/en
Priority to CA002300371A priority patent/CA2300371A1/en
Publication of WO1999009060A1 publication Critical patent/WO1999009060A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • the present invention relates to a homologous protein of Drosophila 1 (3) mbt protein or a homologue of a polynucleotide encoding the protein.
  • the present invention also relates to an antisense polynucleotide of the polynucleotide.
  • the present invention also relates to an antibody that recognizes the homolog protein.
  • the Drosophila 1 (3) mbt gene (hereinafter, this gene is abbreviated as d-1 (3) mbt gene) is encoded by the Drosophila 1 (3) mbt protein (hereinafter, the protein is referred to as d- 1 (3 abbreviated as mbt.)
  • d- 1 3 abbreviated as mbt.
  • the deletion of the d-1 (3) mbt gene causes malignant tumors of the adult optogenetic neuroblast (adult optic neur ob last) and ganglion mother cells (ganglion mothercell). It is known to cause hyperplasia of the imaginal disc. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a homologous gene (homolog gene) of the d-1 (3) mbt gene. It is an object of the present invention to retrieve, isolate, determine the nucleotide sequence of the gene, produce a protein (homolog protein) encoded by the gene, and obtain an antibody that recognizes the protein.
  • the EST database is searched based on the nucleotide sequence information of the dl (3) mbt gene, and a nucleotide sequence having homology with dl (3) mbt is selected. Furthermore, a primer consisting of a part of the nucleotide sequence of the nucleotide sequence was prepared, and a human fetal brain cDNA library was transformed into a type III PCR using the primers to obtain a homologous gene (hereinafter referred to as h- 1 (3) abbreviated as mbt gene) and discloses its nucleotide sequence.
  • h- 1 (3) abbreviated as mbt gene
  • the present invention also provides a mouse homologous gene of the d—l (3) mbt gene (hereinafter abbreviated as m—1 (3) mbt gene :) as h—1 (3)
  • m—1 (3) mbt gene a mouse homologous gene of the d—l (3) mbt gene
  • h—1 (3) a primer used in the process of isolating the mbt gene and a primer newly prepared from a part of the base sequence selected above.
  • a mouse neonatal brain cDNA library 1 was transformed into type III. It is isolated by PCR and discloses its nucleotide sequence.
  • the present invention similarly isolates a rat homologous gene of the dl (3) mbt gene (hereinafter abbreviated as r-1 (3) mbt gene) and discloses the nucleotide sequence thereof. Is what you do.
  • nucleotide sequences of the h-1 (3) mbt gene, the m-1 (3) mbt gene and the r-1 (3) mbt gene obtained by the present invention are those having a high homology in the mb trepeat portion. It is.
  • the present invention relates to a homolog of the d—l (3) mbt gene, the h—1 (3) mbt gene, the m—1 (3) mbt gene or the ⁇ —1 (3) mbt gene in other animals.
  • the present invention discloses a method for obtaining a cloning gene.
  • the homologues of the d—l (3) mbt gene in other animals are the h-1 (3) mbt gene, the m—1 (3) mbt gene, and the r—1 (3) mbt gene.
  • CDNA fragment obtained from the nucleotide sequence of the gene, or polynucleotide obtained from the nucleotide sequence of the cDNA fragment It can be obtained by hybridization using a cDNA library of the other animal as a probe.
  • genes which are the individual elements of the set of h-1 (3) mbt gene, m_l (3) mbt gene, r-1 (3) mbt, and their homolog genes are referred to as 1 (3) It is called mbt gene.
  • the present invention provides a protein encoded by the 1 (3) mbt gene.
  • the protein is a homolog protein of d-1 (3) mbt, h-1 (3) mbt, m-1 (3) mbt, or r-1 (3) mbt.
  • h-1 (3) mbt, m-1 (3) mbt, r-1 (3) mbt, and proteins that are individual elements of a set of homologous proteins are referred to as 1 (3 ) mbt protein or simply 1 (3) mbt.
  • the present invention also discloses an antisense polynucleotide comprising a complementary nucleotide sequence to the above nucleotide sequence.
  • the present invention also discloses a method for producing 1 (3) mbt using the above-mentioned transformant into which 1 (3) mbt gene has been introduced.
  • the present invention provides an antibody which recognizes the above 1 (3) mbt, and shows that it is possible to produce an antibody from 1 (3) mbt, that is, generally from 1 (3) mbt. It is shown. Furthermore, the present invention shows that it is possible to detect 1 (3) mbt from animal tissues or animal cell lines by analysis by the Western blot method ⁇ ELISA using the antibody. It is.
  • the present invention provides a Northern blot hybridizer using a gene probe. Analysis by the Chillon method demonstrates that 1 (3) mbt mRNA can be detected in human and mouse tissues and cell lines, and that 1 (3) mbt mRNA is naturally expressed in these animals. It is shown.
  • the present invention also discloses the chromosomal location of the h-1 (3) mbt gene.
  • FIG. 1 is a diagram comparing the amino acid sequences of h-1 (3) mbt, m-1 (3) mbt and r-1 (3) mbt.
  • FIG. 2 is a diagram comparing the amino acid sequences of h-1 (3) mbt and d-1 (3) mbt.
  • FIG. 3 is a diagram showing the positional relationship between cDNA fragments and EST obtained in the process of obtaining the h-1 (3) mbt gene.
  • FIG. 4 is a diagram showing the positional relationship of cDNA fragments obtained in the process of obtaining the m-1 (3) mbt gene.
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the results of Northern plate hybridization in which h-1 (3) mbt type 1 cDNA was hybridized to mRNA from human tissues. .
  • FIG. 6 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization in which mRNA of each human tissue was hybridized with h-1 (3) mbt type 1 cDNA.
  • FIG. 7 is an electrophoretogram showing the results of Northern plate hybridization of hRNA (3) mbt type 1 cDNA, which was hybridized for mRNA of human tissues. .
  • FIG. 8 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization of hRNA (3) mbt type 1 cDNA hybridized for mRNA of each human cell line.
  • FIG. 9 is an electrophoresis photograph showing the results of RT-PCR performed on human normal leukocytes and cancer cell lines.
  • Figure 10 is Aru £
  • Figure 11 is a diagram showing a 0 -21 1 11 base click evening one that ⁇ 031 1 gene, the antigen comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 of Sequence Listing Usagi
  • FIG. 4 is an electrophoretic photograph showing the results of a Western plot in which an antibody obtained by immunization was reacted with h-1 (3) mbt.
  • FIG. 12 is an electrophoretic photograph showing the results of a Western plot in which an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 in the sequence listing was reacted with h-1 (3) mbt. It is.
  • FIG. 13 is an electrophoresis showing the results of a Western blot in which an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was reacted with h-1 (3) mbt. It is a photograph.
  • FIG. 14 shows the results of measuring the absorbance by the ELISA method by reacting an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing with h-1 (3) mbt.
  • FIG. 14 shows the results of measuring the absorbance by the ELISA method by reacting an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing with h-1 (3) mbt.
  • FIG. 15 is a fluorescence micrograph showing the results of immunohistological staining of T98G-MG cells with an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
  • FIG. 16A is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of nuclear DNA in cells with PI.
  • FIG. 16B is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of recombinant h-1 (3) mbt type 1 in cells with FITC.
  • FIG. 16C is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI and intracellular recombinant h-1 (3) mbt type 1 with FITC.
  • FIG. 17A is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI.
  • TJP FIG. 17B is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of recombinant h-1 (3) mbt type 2 in cells with FITC.
  • FIG. 17C is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI and intracellular recombinant h-1 (3) mbt type 2 with FITC.
  • FIG. 18A is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI.
  • FIG. 18B is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of 1 (3) mbt in cells with FITC.
  • FIG. 18C is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of nuclear DNA in cells with PI and intracellular 1 (3) mbt with FITC.
  • FIG. 19 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization in which 0-1 DNA of m-1 (3) 111131 was hybridized with respect to the mRNA of each mouse adult tissue.
  • FIG. 20 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization in which mRNA of mouse fetal tissue was hybridized with 00-1 of m-1 (3) 111131.
  • FIG. 21 shows the results of Western blot hybridization in which an antibody obtained by immunizing a rabbit with an antigen consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 in the sequence listing was reacted with m-1 (3) mbt. It is an electrophoresis photograph.
  • FIG. 22A is a micrograph of the cells.
  • FIG. 22B is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI.
  • FIG. 22C is a fluorescence micrograph showing the result of tissue staining of intracellular recombinant m-1 (3) mbt with FITC.
  • FIG. 22D is a fluorescence micrograph showing the results of tissue staining of intracellular nuclear DNA with PI and intracellular recombinant m-1 (3) mbt with FITC.
  • the homologue of d-1 (3) mbt of the present invention is not limited to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 in the sequence listing.
  • the polynucleotide to be encoded or a part thereof in particular, a polynucleotide consisting of the whole or part of the base sequence of the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 in the sequence listing
  • the present invention also includes a protein encoded by cDNA obtained from a cDNA library of each animal.
  • the well-conserved nucleotide sequence is the portion containing the mbt repeat.
  • H- 1 (3) mbt described in SEQ ID NO: 2 of the nucleotide sequence is a portion from the 865th T to 1809th C of the nucleotide sequence, and m-l (SEQ ID NO: 6 shown in SEQ ID NO: 6) 3) The portion from the 1062th T to the 2006th C of the base sequence of the mbt gene, and the 1805th to 861th base of the base sequence of the r_l (3) mbt gene described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • a full-length 1 (3) mbt gene can be obtained from a cDNA library of the target animal by the following operation.
  • T4 polynucleotide kinase 3 Sephad exG—25 (registered trademark, manufactured by Pharmacia) equilibrated with T50E (50 mM Tris-C1 pH 8.0, ImMEDTA) was applied to a 1.5 ml polyprep column ( (Bio-Rad Co., Ltd.) so that the bed volume becomes 1 ml, and the DNA reaction solution heat-treated in 2) is loaded on the column.
  • the entire nucleotide sequence of the 1 (3) mbt homolog gene is determined by the dye-minine-one-one method. At this time, if the genes obtained from each plaque are not full-length, select the required number of overlapping genes, cut them with an appropriate restriction enzyme site in the overlapping part, and cut them to full-length. Combine so that 5. Determination of amino acid sequence
  • step 4 From the nucleotide sequence determined in step 4, determine the amino acid sequence of 1 (3) mbt homolog protein.
  • Example 2 Insert the 1 (3) mbt homolog gene obtained above in the same manner as 9 in Example 1 into an appropriate vector (for example, TA cloning vector), and then introduce it into a host (for example, Escherichia coli). Can be used to produce a transformant.
  • an appropriate vector for example, TA cloning vector
  • a host for example, Escherichia coli
  • the polynucleotide can be changed by a natural mutation or an artificial mutation (for example, a point mutation method) without changing the main function of the polypeptide encoded by the polynucleotide.
  • 1 (3) mbt of the present invention also comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 in the sequence listing have been substituted, deleted or added. It is possible to produce proteins, ie, 1 (3) mbt mutants.
  • the amino acid sequence of the 1 (3) mbt mutant of the present invention can be determined from the nucleotide sequence of the gene encoding the mutant.
  • a commercially available program for example, For example, it is possible to use Mac Vector (registered trademark, manufactured by Eastman Chemical Company).
  • the polynucleotide encoding 1 (3) mbt of the present invention includes all degenerate patterns.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is a naturally occurring human 1 (3) mbt (h-1 (3) mbt) type 1 gene, and is represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence described is a naturally occurring human 1 (3) mbt
  • (h-1 (3) mbt) is a type 2 gene, and the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is a naturally occurring mouse 1 (3) mbt (m-1 (3) mbt) gene, and the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing is a naturally occurring rat l (3) mbt (r-l (3) mbt) gene.
  • the present invention includes an antisense polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the antisense strand of the polynucleotide encoding 1 (3) mbt, and a derivative thereof.
  • the antisense polynucleotide is capable of hybridizing to a polynucleotide encoding 1 (3) mbt, and if the hybridizing polynucleotide is a polynucleotide of a coding region, the polynucleotide is used. Can inhibit the biosynthesis of the polypeptide that it encodes.
  • the antisense polynucleotide for inhibiting the biosynthesis of the polypeptide preferably comprises 15 or more bases.
  • the antisense polynucleotide of the present invention or a part thereof includes all of a plurality of nucleotides consisting of a base, a phosphate, and a sugar, including non-naturally occurring nucleotides. Typical are antisense DNA and antisense RNA.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be prepared by using known antisense technology to obtain various DNAs having high binding strength to target DNA or mRNA, tissue selectivity, cell permeability, nuclease resistance, and intracellular stability. Thus, a novel antisense polynucleotide derivative can be obtained.
  • an antisense polynucleotide or a derivative thereof having a base sequence complementary to the base sequence of the region forming the stem loop should be designed.
  • the antisense polynucleotide and the derivative thereof of the present invention can form a stem loop as necessary.
  • an antisense polynucleotide having a sequence complementary to the sequence near the translation initiation codon, the ribosome binding site, the cabling site, and the splice site can generally be expected to have a high expression suppressing effect. Accordingly, the antisense polynucleotide of the present invention or a derivative thereof, which is complementary to the 1 (3) mbt encoding gene or the vicinity of the translation initiation codon of mRNA, a ribosome binding site, a capping site, and a splice site. Those containing the sequence are expected to have a high expression suppressing effect.
  • the derivatives generally known at present are preferably derivatives having at least one of enhanced nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability, and avidity. Particularly preferred are derivatives having a phosphorothioate bond as a skeletal structure.
  • the polynucleotides and derivatives thereof of the present invention also include derivatives having these functions or structures.
  • Natural antisense polynucleotides can be synthesized using a chemical synthesizer.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be prepared by a PCR method using the gene encoding 1 (3) mbt as a ⁇ type. Some derivatives, such as methylphosphonate and phosphorothioate, can be chemically synthesized.
  • the desired antisense can also be obtained by performing the operation according to the instructions attached to the chemical synthesizer and purifying the obtained synthetic product by the HP LC method using reverse phase chromatography or the like.
  • a sense polynucleotide or a derivative thereof can be obtained.
  • the polynucleotide encoding 1 (3) mbt of the present invention, its antisense polynucleotide or a part thereof is used as a probe, It can be used as a probe for screening the 1 (3) mbt gene from cDNA libraries and the like. At this time, those having a GC content of 30 to 70% can be suitably used. Further, a polynucleotide comprising a continuous base sequence of 15 bases or more is particularly preferred.
  • the polynucleotide used as a probe may be a derivative. Usually, a sequence having the above number of bases or more is recognized as a sequence having specificity.
  • a cDNA library used in screening using the probe one prepared from mRNA can be preferably used.
  • a group of cDNAs selected by random sampling from one of these cDNA libraries can be used as a search sample. Also, commercially available products can be used.
  • a DNA consisting of a continuous base sequence of 12 or more bases in the base sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 or a polynucleotide (antisense polynucleotide) hybridizing to the DNA is: It can be used as a probe to screen 1 (3) mbt gene from cDNA library etc.
  • a polynucleotide encoding 1 (3) mbt of the present invention its antisense polynucleotide or a polynucleotide that is a part thereof is referred to as a probe. Then, by performing Northern blot hybridization on mRNA derived from each tissue, it is possible to find a tissue in which mRNA expressed from 1 (3) mbt gene is expressed.
  • a transformant by introducing the plasmid into an appropriate host such as Escherichia coli by a known method. It is possible to produce a 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutant by culturing a transformant of the present invention into which the 1 (3) mbt gene has been introduced and allowing the gene to be amplified or the protein to be expressed. It is. Next, the product is collected and, if necessary, concentrated, solubilized, dialyzed, various types of chromatography, etc., to obtain the 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutant of the present invention. It can be purified.
  • Purification methods for purifying 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutants from the obtained culture include immunoprecipitation, salt precipitation, ultrafiltration, isoelectric point precipitation, and gel filtration. , Electrophoresis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, antibody chromatography, etc., various affinity chromatography, chromatofocusing, adsorption chromatography, and reversed phase There is a chromatography method and the like, which may be selected as appropriate.
  • the 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutant to be produced may be produced in a transformant as a fusion peptide with another polypeptide.
  • treatment with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as a protease to cut out the 1 (3) mbt or 1 (3) mbt mutant is performed. Will be needed.
  • the present invention relates to the antigenicity of 1 (3) mbt, as exemplified in Example 6, 7, 8 or 9, specific to 1 (3) mbt or 1 (3) mbt obtained by the above method.
  • the purpose of the present invention is to clarify that an antibody can be easily obtained by immunizing an animal derived from 1 (3) mbt and an animal other than human with an oligopeptide having a specific amino acid sequence. Therefore, the antibody of the present invention that recognizes 1 (3) mbt (hereinafter sometimes referred to as the 1 (3) mbt antibody) is composed of 1 (3) mbt and an animal from which the 1 (3) mbt is derived.
  • a part of the protein may be synthesized, for example, using a peptide synthesizer.
  • a part of the protein has eight or more amino acid residues.
  • the 1 (3) mbt antibody of the present invention also includes a monoclonal antibody within its scope.
  • antibodies also include active fragments.
  • the active fragment means a fragment of an antibody having an antigen-antibody reaction activity, the concrete, F (ab 7) 2, Fab ', Fab, F v , and the like.
  • F (ab,) 2 is obtained, and when digested with nodine pine, Fab is obtained.
  • F ab is a monovalent antibody active fragment in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked by a linker.
  • a chimeric antibody can be obtained by retaining these active fragments and substituting other portions with fragments of another animal.
  • the antibody of the present invention can be used for elucidation of functions such as 1 (3) mbt expression and elucidation of a mechanism of forming a malignant tumor.
  • Methods for detecting mbt include a method using an antibody and a method using an enzymatic reaction.
  • the method using an antibody include (1) a method for detecting 1 (3) mbt using a labeled 1 (3) mbt antibody, 1 (3) an mbt antibody and a labeled secondary antibody of the antibody. 1 (3) mbt detection method.
  • a label for example, a radioisotope (RI), an enzyme, avidin or biotin, or a fluorescent substance (FITC, rhodamine, etc.) is used.
  • Examples of the method utilizing an enzymatic reaction include an ELISA method, an immunoagglutination method, an estamplot method, a method for identifying an immunoreactive molecule using flow cytometry, or a method similar thereto.
  • primers were synthesized from a human cDNA library to obtain a DNA fragment consisting of a part of the nucleotide sequence of the above H23073 c5, P1 primer 5 as primer, -CCATCAAAGT GCAGGCGTAG G -3, (base sequence described in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing), 3 ′ primer as P 2 primer
  • 5′-TAGCCACATA CCTCAGCCAC G-3 (base sequence described in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing) was designed and synthesized using a DNA synthesizer (ABI, model 392).
  • the synthesized primer was adjusted to 2 O pmo with distilled water. Using this as a PCR primer, the following PCR operation was performed.
  • PCR was performed under the following conditions using a human fetal brain cDNA library 1 (Clontech).
  • a PCR was performed.
  • a liquid having the following composition was placed in a test tube, and mineral oil was layered on the test tube, and left at 94 ° C for 5 minutes.
  • reaction was repeated 50 times by repeating “a cycle of 60 ° C. for 30 seconds, followed by 72 ° C. for 1.5 minutes, and then at 94 ° C. for 30 seconds”.
  • reaction was repeated 40 times by repeating a cycle of “60 ° C. for 30 seconds, followed by 72 ° C. for 1 minute, and then 94 ° C. for 30 seconds”.
  • reaction was carried out at 55 ° C for 2 minutes and finally at 72 ° C for 10 minutes to carry out the extension reaction of the fragment to complete the PCR operation.
  • fragment A The DNA fragment obtained from the 5, extension reaction (abbreviated as “fragment A” hereinafter) was subjected to mini-gel electrophoresis (0.75% agarose gel), and the fragment A band was cut out from the gel.
  • Fragment A was recovered using Gene Clean (manufactured by Bio 101), and bands were checked by minigel electrophoresis. Fragment A was taken in 1 ⁇ 1 and diluted with 99/1 TE.
  • the absorbance at 260 nm (A260) was measured, and the DNA concentration was calculated (the DNA concentration when A260 was 1.0 was set to 50 ⁇ 1 / ml). Fragment A was diluted with TE so that the DNA concentration was 1 ⁇ g / ⁇ 1.
  • the extension reaction to the 3 'side was performed using the same method as the extension reaction to the 5' side in step 3.
  • the primers were P3 primer 5, -MGCTGTTTG ACCG CATGAA C-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing) as the 5' primer, and P4 primer 5, -MGCACCTGT TTGTGAGCCA G as the 3 'primer.
  • -3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 23 in the Sequence Listing) was designed, synthesized using a DNA synthesizer (ABI, model 392), and adjusted to 20 pmo1 / 1/1 with distilled water. Was used.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained by the above 3 ′ extension reaction (hereinafter sometimes referred to as fragment and B) was determined in the same manner as in 4. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • the PCR product was subjected to minigel electrophoresis (0.75% agarose gel). As a result, a band of about 2.4 kbp was observed.
  • the h-1 (3) mbt gene band obtained above was cut out from the gel.
  • Ge The h-1 (3) mbt gene was recovered using neC1ean (manufactured by Bio 101), and the band was checked by minigel electrophoresis.
  • a DNA sequence was performed on this diluted solution by using the T 7 primer, by the Dye-Mine-Mine-Eye method, and by using an automatic sequencer (ABI model 373A).
  • — 1 (3) The nucleotide sequence of the mbt gene was determined. As a result, it was found that the h-1 (3) mbt gene has an overnight splice form. The shorter one was named Type 1 and the longer one was named Type 2.
  • the nucleotide sequence of the h-1 (3) mbt type 1 gene is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the nucleotide sequence of the h-1 (3) mbt type 2 gene is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • Type 2 has 118 bases inserted near the C-terminus of type 1 and between the 2373th position and the 2374th position of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in terms of the base sequence.
  • FIG. 3 shows the positional relationship between fragments A and B obtained in the above process.
  • the amino acid sequence of h-1 (3) mbt was determined.
  • the amino acid sequence of h-1 (3) mbt type 1 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • the amino acid sequence of h-1 (3) mbt type 2 is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • Type 1 and type 2 differ in the amino acids after the 709th amino acid.
  • the amino acid sequences of d-1 (3) mbt and h-1 (3) mbt are shown in FIG.
  • the zinc finger domain, the mbt repeat and the protein-rich domain (SPM) are boxed.
  • the matching rate of d— 1 (3) mbt and h—l (3) mbt in the mb t repeat is 43.7%, Turned out to be quite preserved. Therefore, mbt-repeat is considered to play an important role in the function of this protein.
  • h-1 (3) mbt type 1 gene consisting of the above nucleotide sequence was inserted into a TA cloning vector, and the vector was introduced into Escherichia coli DH5 to prepare a transformant.
  • This transformant was named TA—h—1 (3) mbt, and on July 9, 1997, 1-3 1-3 Tsukuba East Higashi, Ibaraki, Japan, National Institute of Bioscience and Human Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. (Accession No.
  • P 7 primer one 5, -TGMCTCCTC CTCCTTGTAA CCT-3 ' ( nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 26 in Sequence Listing) and P 8 primers 5' -GTCCATGTAC TTCATCCTCA C-3 5 ( nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 in the Sequence Table ) was used to amplify a mouse neonatal brain cDNA (lambda ZAP II) library.
  • the DNA sequence was carried out by the auto-sequencer (881 model 3738) by the Dye-Mine-Mine-Eye-One method, and the nucleotide sequence of the obtained DNA was determined.
  • M13 reverse primer 5, -CAGGAAACAG CTATGAC-3 '(sequence in lambda ZAP II, base sequence described in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing) and P7 primer as primers and DNA synthesis It was synthesized using a machine (ABI, model 392). The synthesized primer was adjusted to 2 Opmo with distilled water. Using this as a PCR primer, the following PCR operation was performed.
  • a mouse neonatal brain cDNA library (Clontech) was used, and PCR was performed under the following conditions.
  • a liquid having the following composition was placed in a test tube, and mineral oil was layered on the test tube, and left at 94 ° C for 5 minutes.
  • Newborn mouse brain cDN A library (l ⁇ g / ⁇ l)
  • reaction was carried out at 55 ° C for 2 minutes and finally at 72 ° C for 10 minutes to carry out the extension reaction of the fragment to complete the PCR operation.
  • a second PCR operation was performed using CACTAAAGGG-3 ′ (sequence in lambda ZAP II, the base sequence described in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing) and P1 primer.
  • a liquid having the following composition was put into a test tube, and mineral oil was layered on it, and left at 94 ° C for 5 minutes.
  • PCR buffer 1 0-fold concentration (40 0 mM T ris- HC l (pH 8. 3), 1 MKC 1, 1 0 0 mM Mg C l 2, 1 0 0 mM DT T)
  • reaction was repeated 35 times by repeating "a cycle at 60 ° C for 30 seconds, then at 72 ° C for 1 minute, and then at 94 ° C for 30 seconds".
  • fragment D The DNA fragment obtained by the extension reaction obtained above (hereinafter referred to as fragment D) was subjected to mini gel electrophoresis (0.75% agarose gel), and the fragment A band was cut out from the gel. Fragment D was recovered using GeneClean (manufactured by Bio 101), and bands were checked by minigel electrophoresis. Fragment D was taken 11 and diluted with 99 ⁇ ⁇ 1 TE. The absorbance at 260 nm (A260) was measured, and the DNA concentration was calculated (the DNA concentration when A260 was 1.0 was set to 50/1 / ml). Fragment D was diluted with TE so that the DNA concentration was 1 ⁇ 1 / ⁇ 1.
  • This diluted solution was subjected to DNA sequencing using the Auto Sequencer (ABI model 373A) using the T3 primer and the P1 primer according to the Dye-Minute-Minus-Eye method.
  • the nucleotide sequence of D was determined. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
  • the extension reaction to the 3 'side was performed using the same method as the extension reaction to the 5' side in step 3.
  • Primers were designed with M13 and P8 primers for the first PCR, and T3 and P6 primers for the second PCR, using a DNA synthesizer (ABI, model 392), and used after being adjusted to 2 Opmo 1 / ⁇ 1 with distilled water. 6. Determination of nucleotide sequence (2)
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained by the above 3 ′ extension reaction (hereinafter sometimes referred to as fragment and E) was determined in the same manner as in 4. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 13 in the sequence listing. 7. Acquisition of m-1 (3) mbt gene
  • 5 Sense primer P 9 corresponding to a part of fragment D as 5 primer 5'-GTTGAAATGC TGGCGTAGTC-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing); 3, an antisense primer P 10 5'-CCCAGTCAGT CACTTAAAGA CATC-3' (corresponding to a part of fragment E as a primer)
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing) was synthesized using a DNA synthesizer (ABI model 392).
  • a PCR reaction was performed using a mouse neonatal brain cDNA library (Clontech) as type I and the above primers.
  • a liquid having the following composition was placed in a test tube, and a 20: 1 layer of mineral oil was layered thereon, and left at 94 ° C for 5 minutes.
  • Taq polymerase (5uni t s / ⁇ l) 0.5.1
  • reaction was repeated 40 times by repeating a cycle of “60 ° C. for 30 seconds, followed by 72 ° C. for 1 minute, followed by 94 ° C. for 30 seconds”. Then, the reaction was performed at 55 ° C for 2 minutes and finally at 72 ° C for 10 minutes to complete the PCR operation.
  • the PCR product was subjected to mini gel electrophoresis (0.75% agarose gel). As a result, a band of about 2.6 kbp was observed.
  • nucleotide sequence (3) The band of the m-1 (3) mbt gene obtained above was cut out from the gel. The m-1 (3) mbt gene was recovered using Gene C 1 ean (manufactured by Bio 101), and bands were checked by minigel electrophoresis.
  • m-1 (3) mbt gene 1 ⁇ 1 of m-1 (3) mbt gene was taken and diluted with 99 ⁇ 1 of TE.
  • the absorbance at 26 Onm (A260) was measured and the DNA concentration was calculated (the DNA concentration when A260 was 1.0 was 50 / l / ml).
  • the m-1 (3) mbt was diluted with TE so that the DNA concentration was ⁇ 1.
  • a DNA sequence was carried out using a T 7 primer, a dye quenching method, and a DNA sequencer (Hyo 1 model 373). 1 (3) The nucleotide sequence of mbt was determined. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • FIG. 4 shows the positional relationship between fragments C, D, and F obtained in the above process. 9. Determination of amino acid sequence
  • amino acid sequence of m-1 (3) mbt was determined. This amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • the homology between the h-1 (3) mbt gene and the m-1 (3) mbt gene is 87%, and the homology between the h-1 (3) mbt protein and the m-1 (3) mbt protein is 70%, a protein that is very well preserved across species.
  • m-1 (3) mbt gene comprising the above nucleotide sequence was inserted into a TA cloning vector, and the vector was introduced into Escherichia coli DH5 to prepare a transformant.
  • Example 3 Isolation of rat 1 (3) mbt (r-1 (3) mbt) gene and determination of its nucleotide sequence and amino acid sequence encoded by the gene
  • a rat neonatal brain cDNA library that was self-made using a kit (manufactured by GIBCO BRL) was used.
  • a kit manufactured by GIBCO BRL
  • the fragment F having high homology to H23073 was obtained.
  • the sequence of fragment F is shown as SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
  • nucleotide sequence of the full length r-1 (3) mbt gene was determined. This nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO: 8 in the sequence listing. 5. Determination of amino acid sequence
  • amino acid sequence of r-1 (3) mbt was determined. This amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • the homology between m-1 (3) mbt and r-1 (3) mbt is over 90%, and is a very well-conserved protein among species.
  • the amino acid sequences of h-1 (3) mbt and m-1 (3) 111131: p-1 (3) mbt are shown in FIG. In the figure, the point of the mbt repeat is indicated by a frame. The agreement rate of the amino acid in the mbt repeat among the three was 95.0%, indicating that it was very well conserved. Therefore, mbt repeats are thought to play an important role in the function of this protein.
  • mRNA human poly A + RNA
  • mRNA human various cells
  • poly A + RNA mRNA
  • 2 ⁇ g of each blotted membrane Human Tis sue Northern Blot I, II and Human Cel
  • l Line Mult iple Ti ssue Nort Hern Blot manufactured by Clonetech
  • mbt type 1 gene to Mo 1 ecu 1 ar Clonin AL aborat ory Manual Second Ed Ition was hybridized according to the description on pages 7.39 to 7.52, and analyzed by Northern plate hybridization method.
  • Figures 5 to 7 show photographs of the results for each tissue. From the photograph, it was found that h-1 (3) mbt (5.5 kb band) was expressed in all tissues.
  • FIG. 8 shows photographs of the results for various cells. From the photograph, expression was observed in all cells except SW480.
  • Example 5> h—1 (3) Expression of an overnight splice form of the mbt gene
  • h-1 (3) About the expression ratio of mbt type 1 gene and the same type 2 gene And analyzed by RT-PCR.
  • FIG. 9 shows the results.
  • the upper row of FIG. 9 shows the results for humans, and the alphabet in each lane is for identifying each volunteer.
  • the upper band is a type 2 band and the lower band is a type 1 band. From the figure, type 2 was predominantly expressed in five human normal leukocytes and cancer cell lines. Type 1 was predominantly expressed in one human normal leukocyte. The expression of type 1 was dominant in the other normal human leukocyte.
  • the full-length h_l (3) mbt gene type 1 was inserted into one pCGN vector and one pBJ-Myc vector, and the respective vectors were introduced into COS cells to prepare transformants. The following operations are the same for each.
  • This transformant was added to 1 ⁇ 10 6 cells in 50 mM Tris—HC1, 15 OmM NaCl, 1 Triton X—100, 50 mM rhodoacetamide, 2 mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 , 0.1% NaN 3 , A cell lysate consisting of 10 ⁇ g / ml soybean trypsin inhibitor, l / g / ml aprotinin, ImM PMS F (phenylmethylsulfonyl fluoride), 1 ⁇ g / ml leptin 100 ⁇ 1 was added and dissolved with good stirring. After being left on ice for 60 minutes, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • amino acid sequence of h-1 (3) mbt described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is an amino acid sequence obtained by adding cysteine (C) to the N-terminus of the amino acid sequence from positions 6 17 to 635 of the following amino acid sequence.
  • amino acid sequence A (sequence described in SEQ ID NO: 17 of the Sequence Listing) and the amino acid sequence h- 1 (3) mbt described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing from positions 148 to 167 of the amino acid sequence A peptide consisting of the following amino acid sequence B (sequence described in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing), which is an amino acid sequence obtained by adding cysteine (C) to the N-terminus of the amino acid sequence of the above, was synthesized. The addition of cysteine was added to the squash to combine with mocyanin (KHL). Synthesis was outsourced to Iwaki Glass Co., Ltd.
  • the serum was salted out by adding saturated ammonium sulfate to a final concentration of 50%.
  • the sample was centrifuged to precipitate the fraction containing the antibody. Then, the precipitate was dissolved in PBS, and the salt was prayed to PBS.
  • the antibody was affinity purified using a protein G Sepharose column (Pharmacia). As a result, a total of 5 mg of the peptide-specific antibody was obtained.
  • the h-1 (3) mbt gene described in SEQ ID No. 2 in the sequence listing was inserted into the vector pGEX-2TH (see FIG. 10) incorporating the GST gene, and the vector was introduced into Escherichia coli DH5. Thus, a transformant was prepared. GST-h-1 (3) mbt in which GST was bound to the N-terminus of h-1 (3) mbt was produced in the transformant. In the same manner as in Example 4, GST-linked recombinant h-1 (3) mbt was purified.
  • Example 9 Confirmation of reactivity of h-1 (3) mbt antibody
  • hOS (3) mbt protein was produced in COS cells, and the protein was subjected to SDS-PAGE electrophoresis.
  • the electrophoresed gel was transferred to a nitrocellulose membrane using a transplot system (Marisol).
  • the nitrocellulose membrane was immersed in Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and left standing for 1 hour to block. Then, at 0.05% Tween 20 / PBS
  • Example 6 or 7 The reactivity of each of the antibodies prepared in Example 6 or 7 was confirmed by the Western protocol according to the following procedure. A solution diluted with PBS to 1 g / ml was added to the membrane, and reacted at room temperature for 2 hours. Then, remove the membrane
  • Peroxidase-labeled ⁇ egret IgG solution (manufactured by Caltag) is added to PBS with PBS.
  • the solution diluted 1:00 was added to the above-mentioned membrane, and further reacted for 1 hour at room temperature. Thereafter, the plate was washed three times with 0.05% Tween20 / PBS for 5 minutes.
  • antibody B The titer of an antibody (hereinafter sometimes referred to as antibody B) obtained by immunizing rabbits with the peptide comprising the amino acid sequence of sequence B prepared in Example 6 as an antigen was measured by ELISA.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence of Sequence B was dissolved in PBS to a concentration of 25 ⁇ g / ml, and the solution was added to each well of a 96-well ELISA plate (Xenobind, Xenopore). ⁇ Dispensed one at a time and allowed to stand at 4 ° C overnight.
  • Block Ace manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • distilled water was dispensed into each well at a ratio of 200/1, and allowed to stand at room temperature for 2 hours to perform blocking.
  • Antibody B was prepared in the following order from the first column of the plate: 10 ⁇ g / ml, 5 g / ml, 2.5 jug / m
  • a solution double-diluted with PBS so as to have a concentration of 1,..., 0.005 was dispensed into each well at a ratio of 50/1, and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • IgG purified from blood of a non-immunized egret was used.
  • a protein IgG antibody (manufactured by Vector One) was dispensed into each well in a volume of 50 ⁇ 1, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed four times with 0.05% Tween20 PBS, and OPD (orthophenylenediamine) -H 2 O 2 / PCB was dispensed at 100 ⁇ l / well into each well. After sufficient color development, the reaction was stopped with 2N sulfuric acid, and the absorbance at 490 nm was measured with a microplate reader (manufactured by Bio-Rad). C The measured absorbance was graphed in FIG. In the figure, the horizontal axis represents the concentration of the added antibody or the dilution ratio of the serum, and the vertical axis represents the absorbance at 490 nm. From the figure, it was found that the titer of antibody B was higher than that of control.
  • Antibody B was used to immunohistochemically evaluate the expression status of h-1 (3) mbt in T98G-MG cells (malignant glioma cell line) expressing h-1 (3) mbt type 1. It was examined by staining.
  • the slide-cultured cells were treated with 3.7% formaldehyde for 3 minutes, and then treated with methanol cooled at ⁇ 20 ° C. for 3 minutes to fix the cells. Thereafter, the slide was washed three times for 5 minutes each with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5).
  • Block Ace manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Block Ace was placed on the tissue on the slide glass, and left standing at room temperature for 1 hour to perform blocking. Thereafter, the slide was washed three times with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) for 5 minutes each.
  • mbt is a protein that exists in the nucleus, and is a protein that is unevenly distributed in the nucleus.
  • the full length h-1 (3) mbt type 2 gene was inserted into a pBJ-Myc vector, and the vector was introduced into VA13 cells to prepare a transformant.
  • the type 1 gene was also introduced into VA 13 cells. Recombinant proteins were expressed in these transformants. Intracellular nuclear DNA was stained with PI and intracellular recombinant protein was stained with FITC.
  • Figure 16A shows nuclear DNA in cells expressing h-1 (3) mbt type 1
  • FIG. 16B is a micrograph showing the result of staining for h-1 (3) mbt type 1 in the same cells.
  • FIG. 16C is a micrograph showing the result of simultaneously observing nuclear DNA in cells and h-1 (3) mbt type 1.
  • FIG. 17C is a micrograph showing the result of simultaneous observation of intracellular nuclear DNA and h-1 (3) mbt type 2.
  • FIG. 18A is a photomicrograph showing the result of PI staining of U20S cell nuclear DNA
  • FIG. 18B is a photomicrograph showing the result of staining for h-1 (3) mbt in U2OS cell cells.
  • FIG. 18C is a micrograph showing the result of simultaneous observation of nuclear DNA in cells and h-1 (3) mbt.
  • blot 2 g each of poly A + RNA (mRNA) in mouse (adult) tissue and poly A + RNA (mRNA) in mouse embryo.
  • Northern blot hybridization method as in Example 4 using the purified membrane (Mouse ssue Northern Blot (manufactured by Clontech)) and the labeled full-length ml (3) mbt gene. Analysis was performed.
  • a photograph of the results for each mouse adult tissue is shown in FIG. From the photograph, m-1 (3) mbt (6.3 kb band) was recognized specifically in the myocardium and skeletal muscle.
  • FIG. 20 shows a photograph of the result for the mouse fetus.
  • the m-l (3) mbt gene was introduced into COS cells to prepare a transformant, and the transformant was used to prepare a recombinant m-1 (3) mbt c -
  • Peptides having the following amino acid sequence C were synthesized, and antibodies recognizing m-1 (3) mbt were prepared in the same manner as in Example 8.
  • m-l (3) mbt protein produced in COS cells was subjected to SDS-PAGE electrophoresis.
  • the electrophoresed gel was transferred to a nitrocellulose membrane using a trans-blot system (Marisol).
  • Nitrocellulose membrane was immersed in Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and left standing for 1 hour to block. Thereafter, the plate was washed twice with 0.05% Tween20 / PBS for 5 minutes.
  • Example 16 The reactivity of each of the antibody prepared in Example 16 and the anti-Myc antibody was confirmed by the Western blot hybridization method in the same manner as in Example 9.
  • FIG. 21 shows the result. As can be seen from the figure, as a result of the antibody reaction, a band was observed at a size similar to that of humans (at a position of 120 kD), indicating that the antibody prepared in Example 16 recognized m-l (3) mbt. confirmed. ⁇ Example 18> m-1 (3) mbt tissue staining
  • the mouse cell line SWI SS3T3 was transformed with the antibody prepared in Example 16 Tissue staining was performed in the same manner as in Example 12.
  • FIGS. 22A-D Photographs of the results are shown in FIGS. 22A-D.
  • FIG. 22A is a micrograph of the cells.
  • FIG. 22B shows the result of staining for m-1 (3) mbt in the same cells.
  • FIG. 22C shows the result of staining DNA in the cells with PI.
  • FIG. 22D is the result of superimposing FIG. 22A and FIG. 22B. As can be seen, nuclear chromatin was stained.
  • Example 19 1 (3) Cell trait change caused by mbt gene expression ⁇ 6/0? Expression of 1 (3) mbt was observed in the system, and changes in cell morphology were observed.
  • Cre / LoxP system please refer to the website of In-Yuichi Net of the Gene Analysis Facility of the Institute of Medical Science, The University of Tokyo (http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/idenshi/hpmain.html). Information can also be obtained from.
  • the antibody of the present invention that recognizes 1 (3) mbt, its gene or 1 (3) mbt is effective for analyzing the mechanism of malignant tumor formation.
  • the 1 (3) mbt gene and 1 (3) mbt are substances involved in nuclear transcription and cell division.

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Description

明糞田曞
1 (3) mbt蛋癜質、 該蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチド、 そのアンチ センスポリヌクレオチドおよび該蛋癜質を認識する抗䜓
技術分野
本発明は、 ショりゞペりバ゚ 1 (3) mbt蛋癜質のホモログ蛋癜質たたは 該蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチドのホモログに関する。 たた、 前蚘ポリヌ クレオチドのアンチセンスポリヌクレオチドに関する。 たた、 前蚘ホモログ蛋癜 質を認識する抗䜓に関する。
背景技術
脊怎動物の䞭でもヒトは最も高床に分化した神経系を持぀。 しかし、 神経系に ぀いおの解析はその機構が耇雑なために遅れおいる。 特に脳神経系に発生する 腫瘍に぀いおは、 他の腫瘍に比べその解析が遅れおいる。 脳神経系においおは、 悪性腫瘍はもちろんのこず、 良性腫瘍であっおも発生郚䜍によっおは患者の生呜 を脅かすこずがあり、 脳神経腫瘍の発生機序の解明の進展が埅たれおいる。
䞀方、 ショりゞペりバ゚では、 神経発生の解析の過皋で倚くの突然倉異䜓 が埗られおおり、 その遺䌝孊的解析がなされおいる。 ショりゞペりバ゚ 1 (3) mbt遺䌝子 以埌、 該遺䌝子を d— 1 (3) mb t遺䌝子ず略す。  がコヌド するショりゞペりバ゚ 1 (3) mb t蛋癜質 以埌、 該蛋癜質を、 d— 1 (3) mb tず略す。  は、 プロリンリヅチドメむンずゞンクフィンガヌドメむンずを 有し、 か぀、 特城的な玄 100アミノ酞からなる繰り返し配列 mb t - r e p e at) を 3力所持぀蛋癜質である。 たた、 d— 1 (3) mbt遺䌝子は、 その 欠倱により、 アダルトォプテむクニュヌロブラスト adu l t opt i c neur ob l as t) やガングリオン母现胞 (gang l i on mo t he r c e l l) の悪性腫瘍ず、 成虫原基の過圢成を生じるこずが知られおいる。 発明の開瀺
本発明は、 かかる d— 1 (3) mb t遺䌝子の盞同遺䌝子 ホモログ遺䌝子 を怜玢し、 単離し、 その塩基配列を決定し、 該遺䌝子がコヌドする蛋癜質 ホモ ログ蛋癜質 を䜜補し、 さらには該蛋癜質を認識する抗䜓を取埗するこずを課題 ずするものである。
すなわち、 本発明は、 d—l (3) mb t遺䌝子の塩基配列情報に基づいお E STデヌタベヌスを探玢し、 d— l (3) mbtずホモロゞ䞀を有する塩基配列 を遞び出す。 さらに、 該塩基配列の䞀郚の塩基配列からなるプラむマ䞀を䜜補し、 該プラむマヌを甚いたヒト胎児脳 cDNAラむブラリヌを錡型にした P CRによ り、 ヒトにおける盞同遺䌝子 以䞋、 h— 1 (3) mbt遺䌝子ず略する。  を 単離し、 その塩基配列を開瀺するものである。
たた、 本発明は、 同様に、 d— l (3) mb t遺䌝子のマりスにおける盞同遺 䌝子 以䞋、 m— 1 (3) mbt遺䌝子ず略する。  を、 h— 1 ( 3 ) mb t遺 䌝子を単離する過皋で甚いるプラむマヌ、 および前蚘遞び出される塩基配列の䞀 郚の塩基配列から新たに䜜補したプラむマヌず甚いお、 マりス新生仔脳 c DNA ラむブラリ䞀を鍊型にした P C Rにより単離し、 その塩基配列を開瀺するもので ある。
たた、 本発明は、 同様に、 d— l (3) mb t遺䌝子のラットにおける盞同遺 䌝子 以䞋、 r— 1 (3) mbt遺䌝子ず略する。  を単離し、 その塩基配列を 開瀺するものである。
本発明により埗られる、 h— 1 (3) mbt遺䌝子、 m— 1 (3) mb t遺䌝 子および r— 1 (3) mb t遺䌝子の塩基配列は、 mb t r e p e a tの郚分 におけるホモロゞ䞀が高いものである。
本発明は、 他の動物における、 d— l (3) mbt遺䌝子、 h— 1 (3) mb t遺䌝子、 m— 1 (3) mb t遺䌝子たたは Γ— 1 (3) mb t遺䌝子のホモ口 グ遺䌝子を取埗する方法を開瀺するものである。
すなわち、 他の動物における d— l (3) mb t遺䌝子のホモログ遺䌝子は、 h- 1 (3) mbt遺䌝子、 m— 1 (3) mbt遺䌝子、 r— 1 (3) mbt遺 䌝子の塩基配列から埗られる c D N Aフラグメント、 たたは該 c D N Aフラグメ ントの塩基配列より埗られるポリヌクレオチド 䞀本鎖 DNA、 cDNAに察す る RN Aたたはそれらが化孊修食されたものを含む をプロヌブずしお、 該他の 動物の c D N Aラむブラリ䞀を甚いたハむプリダむズにより埗るこずが可胜であ る。 たた、 cDNAラむブラリ䞀䞭の該郚分を PCRによっお増幅させおも圓該 動物における d— 1 (3) mb t遺䌝子のホモログ遺䌝子を取埗するこずが可胜 である。
本明现曞においおは、 h— 1 (3) mbt遺䌝子、 m_l (3) mbt遺䌝子、 r- 1 (3) mbt、 およびそれらのホモログ遺䌝子の集合の個々の芁玠である 遺䌝子を、 1 (3) mbt遺䌝子ずいう。
さらに、 本発明は、 前蚘 1 (3) mbt遺䌝子がコヌドする蛋癜質を提䟛する ものである。 前蚘蛋癜質は、 d— 1 (3) mbt、 h- 1 (3) mbt、 m— 1 (3) mbtたたは r— 1 (3) mb tのホモログ蛋癜質である。 本明现曞にお いお、 h— 1 (3) mbt、 m— 1 (3) mbt、 r- 1 (3) mbtおよびそ れらのホモログ蛋癜質の集合の個々の芁玠である蛋癜質を 1 (3) mbt蛋癜質 たたは単に 1 (3) mbtずいう。
たた、 本発明は、 前蚘塩基配列の盞補塩基配列からなるアンチセンスポリヌ クレオチドをも開瀺するものである。
たた、 本発明は、 前蚘の 1 (3) mbt遺䌝子を導入した圢質転換䜓を甚いお、 1 (3) mb tを䜜補する方法を開瀺するものである。
たた、 本発明は、 前蚘 1 (3) mbtを認識する抗䜓を䜜補し、 1 (3) mb tの抗原性、 すなわち䞀般に 1 (3) mbtから抗䜓を䜜補するこずが可胜であ るこずを瀺すものである。 さらに、 本発明は、 前蚘抗䜓を甚いたり゚スタンブ ロット法ゃ EL I SA法による解析により、 動物の組織たたは動物现胞株から 1 (3) mb tを怜出するこずが可胜であるこずを瀺すものである。
たた、 本発明は、 遺䌝子プロ䞀ブを甚いたノヌザンプロットハむプリダむれ䞀 シペン法による解析により、 ヒトおよびマりスの各組織や现胞株から 1 (3) m b tの mRNAを怜出できるこず、 およびこれらの動物で倩然に 1 (3) mb t の mRN Aが発珟しおいるこずを瀺すものである。
たた、 本発明は、 h— 1 (3) mb t遺䌝子に぀いお染色䜓䞊の䜍眮を開瀺 するものである。
図面の簡単な説明
第 1図は、 h— 1 (3) mbt、 m- 1 (3) mbtおよび r侀 1 (3) mb t のァミノ酞配列を察比させた図である。
第 2図は、 h— 1 (3) mbtず d— 1 (3) mb tのアミノ酞配列を察比させ た図である。
第 3図は、 h— 1 (3) mb t遺䌝子を取埗する過皋で埗られた cDNAフラグ メントおよび E S Tの䜍眮関係を瀺す図である。
第 4図は、 m— 1 (3) mb t遺䌝子を取埗する過皋で埗られた cDNAフラグ メントの䜍眮関係を瀺す図である。
第 5図は、 ヒト各組織の mRNAに぀いお、 h— 1 ( 3 ) mb tタむプ 1の c D N Aをハむブリダむズさせたノ䞀ザンプロヅトハむブリダむれ䞀ションの結果を 瀺す電気泳動写真である。
第 6図は、 ヒト各組織の mRNAに぀いお、 h— 1 ( 3 ) mb tタむプ 1の c D N Aをハむブリダむズさせたノ䞀ザンブロットハむブリダむれ䞀ションの結果を 瀺す電気泳動写真である。
第 7図は、 ヒト各組織の mRN Aに぀いお、 h— 1 (3) mbtタむプ 1の cD N Aをハむプリダむズさせたノ䞀ザンプロヅトハむブリダむれ䞀ションの結果を 瀺す電気泳動写真である。
第 8図は、 ヒト各现胞株の mRN Aに぀いお、 h—l (3) mbtタむプ 1の c DNAをハむブリダィズさせたノヌザンブロヅトハむブリダィれ䞀シペンの結果 を瀺す電気泳動写真である。 T/JP98/03551 第 9図は、 ヒト正垞癜血球ならびに癌现胞株に぀いお R T— P C Rを行った結果 を瀺す電気泳動写真である。
第 10図は、 0311遺䌝子を揷入した 0 —21111べク倕䞀を瀺す図でぁる£ 第 11図は、 配列衚の配列番号 17に蚘茉のアミノ酞配列からなる抗原をゥサギ に免疫しお埗られる抗䜓を h— 1 ( 3) mb tに反応させたり゚スタンプロット の結果を瀺す電気泳動写真である。
第 12図は、 配列衚の配列番号 18に蚘茉のアミノ酞配列からなる抗原をゥサギ に免疫しお埗られる抗䜓を h— 1 (3) mb tに反応させたり゚スタンプロット の結果を瀺す電気泳動写真である。
第 13図は、 配列衚の配列番号 1に蚘茉のアミノ酞配列からなる抗原をゥサギに 免疫しお埗られる抗䜓を h— 1 (3) mb tに反応させたり゚スタンブロッ トの 結果を瀺す電気泳動写真である。
第 14図は、 配列衚の配列番号 18に蚘茉のアミノ酞配列からなる抗原をゥサギ に免疫しお埗られる抗䜓を h— 1 (3) mbtに反応させ、 ELI SA法により 吞光床枬定した結果を瀺す図である。
第 15図は、 配列衚の配列番号 18に蚘茉のアミノ酞配列からなる抗原をゥサギ に免疫しお埗られる抗䜓で T 98 G— MG现胞を免疫組織染色した結果を瀺す蛍 光顕埮鏡写真である。
第 16 A図は、 现胞内の栞 DNAを P Iで組織染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写 真である。
第 16B図は、 现胞内の組み換え h— 1 (3) mbtタむプ 1を FITCで組織 染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写真である。
第 16C図は、 现胞内の栞 DNAを P Iで、 现胞内の組み換え h— 1 (3) mb tタむプ 1を F I T Cで組織染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写真である。
第 17A図は、 现胞内の栞 DNAを P Iで組織染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写 真である。 TJP 第 17B図は、 现胞内の組み換え h— 1 (3) mb tタむプ 2を F I TCで組織 染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写真である。
第 17C図は、 现胞内の栞 DNAを P Iで、 现胞内の組み換え h— 1 (3) mb tタむプ 2を F I TCで組織染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写真である。
第 18A図は、 现胞内の栞 DNAを P Iで組織染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写 真である。
第 18B図は、 现胞内の 1 (3) mb tを FIT Cで組織染色した結果を瀺す蛍 光顕埮鏡写真である。
第 18C図は、 现胞内の栞 DNAを P Iで、 现胞内の 1 (3) mbtをFI TC で組織染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写真である。
第 19図は、 マりス成䜓の各組織の mRNAに぀いお、 m— 1 (3) 111131の0 D N Aをハむブリダィズさせたノヌザンプロットハむブリダィれ䞀シペンの結果 を瀺す電気泳動写真である。
第 20図は、 マりス胎児の組織の mRNAに぀いお、 m— 1 (3) 111131の00 N Aをハむブリダィズさせたノヌザンブロットハむブリダィれ䞀シペンの結果を 瀺す電気泳動写真である。
第 21図は、 配列衚の配列番号 19に蚘茉のアミノ酞配列からなる抗原をゥサギ に免疫しお埗られる抗䜓を m— 1 (3) mb tに反応させたり゚スタンプロット ハむプリダむれ䞀ションの結果を瀺す電気泳動写真である。
第 22 A図は、 现胞の顕埮鏡写真である。
第 22B図は、 现胞内の栞 DNAを P Iで組織染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写 真である。
第 22 C図は、 现胞内の組み換え m— 1 (3) mb tを F I T Cで組織染色した 結果を瀺す蛍光顕埮鏡写真である。
第 22D図は、 现胞内の栞 DNAを P Iで、 现胞内の組み換え m— 1 (3) mb tを F I T Cで組織染色した結果を瀺す蛍光顕埮鏡写真である。 発明を実斜するための最良の圢態
本発明の d— 1 (3) mbtのホモ口グは、 配列衚の配列番号 1、 3、 5たた は 7に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質に限定されるこずはなく、 これらの蛋 癜質をコヌドするポリヌクレオチドたたはその䞀郚、 特には配列衚の配列番号 2、 4、 6たたは 8に蚘茉の塩基配列のコヌド領域の党郚たたはその䞀郚の塩基配列 からなるポリヌクレオチドをプロ䞀ブずしお、 各動物の cDNAラむブラリヌか ら埗られる cDNAがコヌドする蛋癜質も本発明に含たれる。
h- 1 (3) mb t遺䌝子、 m— l (3) mb t遺䌝子および r— 1 (3) m bt遺䌝子の間で、 よく保存されおいる塩基配列は mbtリピヌトを含む郚分で あり、 配列衚の配列番号 2に蚘茉の h— 1 (3) mb t遺䌝子の塩基配列の 86 5番目の Tから 1809番目の Cたでの郚分であり、 配列衚の配列番号 6に蚘茉 の m— l (3) mb t遺䌝子の塩基配列の 1062番目の Tから 2006番目の Cたでの郚分であり、 配列衚の配列番号 8に蚘茉の r_l (3) mbt遺䌝子の 塩基配列の 861番目の䞁から 1805番目の Cたでの郚分に盞圓する。
この塩基配列からなる DNAフラグメントをプロ䞀ブずしお甚いお、 以䞋の操 䜜により、 目的ずする動物の cDNAラむブラリ䞀から党長の 1 (3) mbt遺 䌝子を埗るこずができる。
1) プロ䞀プずする DNAを Takara MEGA LABELキット (登録商暙、 宝酒造瀟補 を甚いお取扱説明曞の通りに暙識する。
2 ) 次に、 䞋蚘の組成の DNA反応液を調補し、 この液を 37°Cで 30分間 むンキュベヌトした埌、 70°Cで 10分間熱凊理し、 酵玠を倱掻させる。
DNAプロ䞀ブ 2pmo l/〃l) 2〃1
10倍ホスホラィレむシペン緩衝液 2ΌΛ
〔ァ— 32P〕 ATP (37 OMBq/ml) (アマシャム補
5 / 1
T 4 ポリヌクレオチドキナヌれ 3) T 50 E (50 mM T r i s -C 1 pH 8. 0, ImM ED T A) で平衡化された S ephad exG— 25 (登録商暙、 フアルマシア瀟補 を 1. 5 m 1ポリプレップカラム バむオラッド瀟補 にべヅドボリュ䞀ムが 1 mlになるように詰め、 2) で熱凊理をした DNA反応液を該カラムに茉せる。
4) その埌、 200〃 1 T 50 Eをカラムに 4回流し、 2回目の 200^ 1 で溶出した画分から暙識化 DN Aプロヌブを埗る。
5) 䞊蚘で埗られた暙識化 DN Aプロヌブ画分のうち 150〃 1を、 ニトロ セルロヌス膜䞊に固定したプラヌクの c DN Aプロ䞀ブ  c DNAラむブラリヌ のニトロセルロヌス膜䞊ぞの固定は、 、 Mo 1 e c u 1 a r C l on i n nd E d i t i on (Co l d Spr i n Ha rb o r Lab o r at o ry P r e s s、 1989幎 9. 38-9. 4 1ペヌゞに蚘茉の方法 にしたがっお行える。  ず以䞋の条件でハむブリダィズさせる。
①プレハむプリダむれヌシペン
6 X S S C
5 xD enha l d t ' s
0. 05% ピロリン酞ナトリりム
1 0 j g/ m 1 d enat ur e d he r r i ng s p e rm
DNA
0. 5 % SD S
総液量 50ml
反応枩床 37 °C
反応時間 1時間
②ハむブリダむれ䞀シペン
6 X S S C
l xD enha la t 5 s 0. 05% ピロリン酞ナトリりム
100 g/ m 1 denatured herr in sperm
DNA
1 x 106 cpm/ml cDNAプロヌブ
総液量 50ml
反応枩床 42°C
反応時間 18時間
6) ハむブリダィズの終了したニトロセルロヌス膜を以䞋の条件で 1回ず぀ 掗浄する。
① 6xSS 0. 1 %SD S 500ml
枩床 40。C
時間 20分間
② 3xSSC、 0. 1 %SD S 500ml
時間 42。C
時間 20分間
7) 掗浄したニトロセルロヌス膜を X線フィルム 䟋えば、 コダック瀟補 X AR5フィルム に䞀 80°Cでヌ晚露光し、 オヌトラゞオグラフを撮圱する。
8)埗られたォ䞀卜ラゞオグラフから、 陜性のプラヌクの䜍眮を決定し、 察 応する寒倩䞊のプラヌクを SM溶液に回収する。
9) 回収したプラヌクは、 垞法により再床 NZY寒倩培地䞊にプラヌク圢成 を行わせ、 ニトロセルロヌス膜䞊に固定する。
10) 5) 〜9) の過皋を 3回繰り返し、 陜性のプラヌクを単䞀なものにす る。 該プラヌクを回収し、 100〃1の SM溶液に懞濁し、 ファヌゞを安定化さ せる。 該プラヌクから単離した遺䌝子が 1 (3) mbtホモログ遺䌝子である。
3. 1 (3) mbtホモログ遺䌝子の倧量調補 1 ) SM溶液に懞濁したプラヌクのファヌゞ 50 1ず Y 1090 r—倧腞 菌 20 / 1を混合し、 37。 15分間攟眮する。
2) その埌、 100〃g/mlアンピシリンを含む 10ml NZ Y培地に 1) で混合した溶液を移し、 37°Cで 6時間培逊する。
3) 8000 rpm、 5分間遠心分離し、 䞊枅を回収する。
4) 該䞊枅に、 5M NaC 1を lml、 ポリ゚チレングリコ䞀ル 6000 を 1. 1 gを加え、 溶かす。
5) 該溶液を氷䞊に 1時間眮き、 その埌 10000 rpm、 4°Cで 20分間 遠心分離を行う。
6) 沈殿を回収し、 700 z 1の SM溶液に懞濁する。
7) クロ口ホルムを 500 / 1加えお撹拌し、 残った倧腞菌を溶かす。
8) 5000 rpm、 10分間遠心分離し、 氎局を回収する。
9) これに、 lmg/ml RNa s eA、 5 mg/m 1 DNas e l (共にシグマ補 を各 1〃1ず぀加え、 37°Cで 1時間攟眮したのち、 20%ポ リ゚チレングリコ䞀ル 6000 (0. 8M NaC 1) を 600〃 1加え、 氷䞊 に 30分間攟眮する。
10) 4°Cで、 15000 rpm、 20分間遠心分離した埌、 沈殿を回収す る。
1 1 ) この沈殿に 500〃 1の S M溶液、 50 1の 5M NaC l、 50 1の 0. 5M EDTAを加え、 曎に、 400〃 1のプノヌルを加えお撹袢 し、 ファヌゞを溶かしお cDNAを遊離させる。
12) 該溶液を宀枩で 15000 r pm、 5分間遠心分離した埌、 氎局を回 収する。 これに lmlの゚タノヌルを加え、 15000 rpm、 20分間遠心分 離し、 液局を捚おる。
13) 70 %゚タノヌル lmlで沈殿を掗浄し、 100〃1の䞁 溶液 䞁 r i s -C 1 pH 8. 0 10 mM、 1 mM E D T A) に沈殿を溶かし、 D NA溶液を埗る。
4. 1 (3) mbtホモログ遺䌝子の塩基配列の決定
実斜䟋 1ず同様にしおダむ倕䞀ミネ䞀倕䞀法により 1 (3) mbtホモログ 遺䌝子の党塩基配列を決定する。 このずき、 各プラヌクから埗られた遺䌝子が完 党長でない堎合、 オヌバ䞀ラップする遺䌝子を必芁な数だけ遞びだし、 オヌバ䞀 ラップする郚分の適圓な制限酵玠サむ トで切断しおそれらを完党長になるように 結合する。 5. アミノ酞配列の決定
4. で決定した塩基配列から、 1 (3) mbtホモログ蛋癜質のアミノ酞配列 を決定する。
6. 圢質転換䜓の䜜補
実斜䟋 1の 9. ず同様にしお䞊蚘で埗た 1 (3) mbtホモログ遺䌝子を適 圓なベクタ䞀 䟋えば、 TAクロヌニングベクタヌ に挿入した埌、 宿䞻 䟋え ば、 倧腞菌 に導入するこずで圢質転換䜓を䜜補するこずができる。
自然の倉異によりたたは人工の倉異 䟋えば、 ポむントミュ䞀テヌシペンの手 法 により、 ポリヌクレオチドがコヌドするポリペプチドの䞻たる機胜に倉化を 䞎えるこずなく、 該ポリヌクレオチド倉化させるこずが可胜である。 この方法に より、 本発明の 1 (3) mbtに぀いおも配列衚の配列番号 1、 3、 5たたは 7 に蚘茉のアミノ酞配列における䞀たたは耇数のアミノ酞を眮換、 欠倱たたは付加 したアミノ酞配列からなる蛋癜質、 すなわち 1 (3) mbt倉異䜓を䜜補するこ ずが可胜である。
本発明の 1 (3) mbt倉異䜓のアミノ酞配列は、 該倉異䜓をコヌドする遺䌝 子の塩基配列から決定するこずが可胜である。 䟋えば、 垂販のプログラム 䟋え ば、 Ma cVe c t o r (登録商暙、 むヌス トマンケミカル瀟補 を甚いお可胜 である。
遺䌝暗号の瞮重により、 ポリヌクレオチドから生産されたポリペプチドのアミ ノ酞配列を倉えるこずなく、 該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくずも䞀郚の 塩基を他の皮類の塩基に眮換するこずができる。 したがっお、 本発明の 1 (3) m b tをコヌドするポリヌクレオチドずは、 瞮重の党おのパ倕䞀ンを含むもので ある。
配列衚の配列番号 2に蚘茉の塩基配列からなる DN Aは、 倩然に存圚するヒト 1 (3) mbt (h— 1 (3) mbt) タむプ 1遺䌝子であり、 配列衚の配列番 号 4に蚘茉の塩基配列からなる DNAは、 倩然に存圚するヒト 1 (3) mb t
(h- 1 (3) mbt) タむプ 2遺䌝子であり、 配列衚の配列番号 6に蚘茉の塩 基配列からなる DNAは、 倩然に存圚するマりス 1 (3) mb t (m- 1 (3) mbt) 遺䌝子であり、 配列衚の配列番号 8に蚘茉の塩基配列からなる DNAは、 倩然に存圚するラット l (3) mbt (r— l (3) mbt) 遺䌝子である。
本発明は、 前蚘 1 (3) mbtをコヌドするポリヌクレオチドのアンチセン ス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導䜓を含む ものである。 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 1 (3) mbtをコヌドする ポリヌクレオチドにハむプリダむズするこずが可胜なものであり、 それがハむブ リダむズするポリヌクレオチドがコ䞀ド領域のポリヌクレオチドであれば該ポリ ヌクレオチドがコ䞀ドするポリべプチドの生合成を阻害するこずが可胜である。 ポリべプチドの生合成を阻害するためのアンチセンスポリヌクレオチドは、 1 5塩基以䞊からなるこずが奜たしい。 䞀方、 现胞内に党長のアンチセンスポリヌ クレオチドを取り蟌たせるのは、 あたりに長くおも䞍適である。 现胞内にアンチ センスポリヌクレオチドを取り蟌たせ、 1 (3) mb tの生合成を阻害させる堎 合、 12塩基以䞊 30塩基以䞋、 奜たしくは 15塩基以䞊 25塩基以䞋、 より奜 たしくは 18塩基以䞊 22塩基以䞋の塩基からなるアンチセンスポリヌクレオチ ドを甚いるのがよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドたたはその䞀郚分は、 塩基、 リン酞、 糖からなるヌクレオチドが耇数結合したものが、 倩然には存圚しないものを含め お党お含たれる。 代衚的なものは、 アンチセンス D NAずアンチセンス R N Aで ある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに぀いお、 公知のアンチセンス技術を 甚いお、 目的の D N Aや mR N Aずの結合力、 組織遞択制、 现胞透過性、 ヌクレ ァ䞀れ耐性、 现胞内安定性の高い様々なアンチセンスポリヌクレオチド誘導䜓が 埗られる。
ハむブリダィズのし易さの点では、 䞀般的には、 ステムルヌプを圢成しおいる 領域の塩基配列に盞補的な塩基配列を持぀アンチセンスポリヌクレオチドたたは その誘導䜓を蚭蚈するずよいずされおいる。 本発明のアンチセンスポリヌクレオ チドおよびその誘導䜓は、 必芁に応じ、 ステムルヌプを圢成するこずが可胜であ る。
たた、 翻蚳開始コドン付近、 リボ゜ヌム結合郚䜍、 キダッビング郚䜍、 スプラ ィス郚䜍の配列に盞補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチドは、 䞀般に高い発珟抑制効果が期埅できる。 したがっお、 本発明のアンチセンスポリ ヌクレオチドたたはその誘導䜓であっお、 1 ( 3 ) mb tをコヌドする遺䌝子た たは mR N Aの翻蚳開始コドン付近、 リボ゜ヌム結合郚䜍、 キダッビング郚䜍、 スプラむス郚䜍の盞補的な配列を含むものは、 高い発珟抑制効果が期埅される。 珟圚䞀般的に知られおいる誘導䜓は、 ヌクレアヌれ耐性、 組織遞択性、 现胞透 過性、 結合力の少なくずも䞀が高められた誘導䜓であるこずが奜たしい。 特に奜 たしくは、 フォスフォロチォェ䞀ト結合を骚栌構造ずしお有する誘導䜓である。 本発明のポリヌクレオチドおよびその誘導䜓に぀いおも、 これらの機胜たたは構 造を有する誘導䜓が含たれる。
倩然型のアンチセンスポリヌクレオチドであれば、 化孊合成機を䜿甚しお合 成したり、 1 (3) mbtをコヌドする遺䌝子を錶型ずする PCR法により本発 明のアンチセンスポリヌクレオチドを䜜補するこずができる。 たた、 メチルフォ スフォネヌト型やフォスフォロチォェ䞀ト型等、 誘導䜓の䞭には、 化孊合成でき るものもある。 この堎合には、 化孊合成機に添付されおいる説明曞にしたがっお 操䜜を行い、 埗られた合成産物を逆盞クロマトグラフィヌ等を甚いた HP LC法 により粟補するこずによ぀おも、 目的のアンチセンスポリヌクレオチドたたはそ の誘導䜓を埗るこずができる。
本発明の 1 (3) mb tをコヌドするポリヌクレオチド、 そのアンチセンス ポリヌクレオチドたたはそれらの䞀郚 連続する 12塩基以䞊の塩基配列からな るポリヌクレオチド であるポリヌクレオチドをプロ䞀ブずしお、 cDNAラむ ブラリヌ等から 1 (3) mb t遺䌝子をスクリヌニングするためのプロヌブずし お䜿甚可胜である。 このずき GC含有率が 30ないし 70%のものが奜適に䜿甚 可胜である。 たた、 連続する 15塩基以䞊の塩基配列からなるポリヌクレオチド が特に奜たしい。 プロヌブずしお甚いる該ポリヌクレオチドは誘導䜓であっおも よい。 通垞、 䞊蚘の塩基数以䞊の配列は特異性のある配列であるず認識されおい る。 該プロヌブを甚いたスクリヌニングにおいお䜿甚する cDNAラむブラリヌ ずしおは、 mRNAから䜜補されたものが奜たしく䜿甚できる。 これらの cDN Aラむブラリ䞀からランダムサンプリングにより遞択された䞀矀の cDN Aを怜 玢の詊料ずするこずができる。 たた、 垂販のものでも䜿甚可胜である。
䟋えば、 配列衚の配列番号 2、 4、 6たたは 8に蚘茉の塩基配列のうちの連続 する 12塩基以䞊の塩基配列からなる D N Aたたは該 D N Aにハむブリダィズす るポリヌクレオチド アンチセンスポリヌクレオチド は、 cDNAラむブラリ —等から 1 (3) mb t遺䌝子をスクリヌニングするためのプロヌブずしお䜿甚 可胜である。
たた、 本発明の 1 (3) mb tをコヌドするポリヌクレオチド、 そのアンチセ ンスポリヌクレオチドたたはそれらの䞀郚であるポリヌクレオチドをプロヌブず しお、 各組織由来の mRN Aに぀いおノヌザンブロヅ トハむブリダィれヌシペン を行うこずにより、 1 (3) mb t遺䌝子由来の mRN Aが発珟しおいる組織を 芋出すこずが可胜である。
プラスミ ドを倧腞菌等の適圓な宿䞻に導入しお、 圢質転換䜓を埗るこずは公知 の方法により可胜である。 本発明の 1 (3) mb t遺䌝子を導入した圢質転換䜓 を培逊しお遺䌝子の増幅たたは蛋癜質の発珟を行わせ、 1 (3) mbtたたは 1 (3) mbt倉異䜓を䜜補させるこずが可胜である。 次に䜜補物を回収し、 必芁 に応じお濃瞮、 可溶化、 透析、 各皮クロマトグラフィヌ等の操䜜を行うこずによ り、 本発明の 1 (3) mbtたたは 1 (3) mb t倉異䜓を粟補するこずが可胜 である。
圢質転換䜓の培逊に぀いおは、 各皮の教科曞があり、 本発明に蚘茉の塩基配列 に基づいお 1 (3) mbtたたは 1 (3) mb t倉異䜓を䜜補させるこずは、 公 知の方法により可胜である。 このずき、 宿䞻ずしおは、 倧腞菌等の最近、 酵母、 動物现胞のいずれも䜿甚可胜であるが、 特には動物现胞が奜たしい。 现胞に遺䌝 子を導入するには、 リボ゜ヌム法、 ゚レクトロボ䞀レ䞀シペン法等を甚いるこず ができる。 特に、 栞内埮量泚入法を甚いるこずが奜たしい。
埗られた培逊物から 1 (3) mbtたたは 1 (3) mbt倉異䜓を粟補する粟 補方法には、 免疫沈降法、 塩析法、 限倖濟過法、 等電点沈殿法、 ゲル濟過法、 電 気泳動法、 ィオン亀換ク口マトグラフィ䞀法、 疎氎性クロマトグラフィ䞀法ゃ抗 䜓クロマトグラフィヌ法等の各皮ァフィ二ティ䞀クロマトグラフィヌ、 クロマト フォ䞀カシング法、 吞着ク口マトグラフィ䞀法および逆盞クロマトグラフィ䞀法 等があり、 適宜遞択しお行えばよい。
たた、 補造段階においお、 補造する 1 (3) mbtたたは 1 (3) mbt倉異 䜓は、 他のポリぺプチドずの融合べプチドずしお圢質転換䜓に䜜補させおもよい。 この堎合は、 粟補工皋においお、 ブロムシアン等の化孊物質やプロテアヌれ等の 酵玠で凊理しお、 1 (3) mbtたたは 1 (3) mb t倉異䜓を切り出す操䜜が 必芁になる。
本発明は、 1 (3) mb tの抗原性に぀いお、 実斜䟋 6、 7、 8たたは 9に 䟋瀺するように、 前蚘方法により埗られた 1 (3) mbtたたは 1 (3) mb t に特異的なアミノ酞配列からなるオリゎペプチドを 1 (3) mb tが由来する動 物およびヒト以倖の動物に免疫するこずで容易に抗䜓が埗られるものであるこず を明らかにするものである。 したがっお、 本発明の 1 (3) mb tを認識する抗 䜓 以降、 1 (3) mbt抗䜓ずいうこずがある は、 1 (3) mbtを該 1 (3) mb tが由来する動物およびヒト以倖の動物に免疫感䜜するこずにより埗 られる抗䜓であっお、 該抗䜓が本発明の 1 (3) mb tを認識するこずがりェス タンプロット法、 EL I SA法や免疫染色法 䟋えば FACSでの枬定 等によ り確認される抗䜓をその範囲内に含む。
たた、 免疫原ずしお、 蛋癜質の䞀郚であっおも該蛋癜質の䞀郚をゥシ血枅ァ ルブミンなどの他のキダリァ䞀蛋癜質に結合させたものを甚いるこずは、 よく甚 いられる方法である。 該蛋癜質の䞀郚は、 䟋えばペプチド合成機を甚いお合成し おもよい。 なお、 蛋癜質の䞀郚ずしおは、 8アミノ酞残基以䞊であるこずが奜た しい。
抗原性が明らかずなった物質に぀いおは、 免疫感䜜によっおポリクロ䞀ナル抗 䜓が埗られるならば、 該免疫した動物のリンパ球を甚いたハむプリ ドヌマにより モノクロヌナル抗䜓が産生されるこずはよく知られおいる  『Ant ib o d i e s A Labo rat o ry Manua l』 (Co l d S r ing Harbo r Lab o rat o ry Pr e s s、 1988) Chapt e r 6) 。 したがっお本発明の 1 (3) mb t抗䜓はモノクロヌナル抗䜓もその範囲 内に含むものである。
本発明においおは、 抗䜓は掻性フラグメントをも包含するものである。 掻性 フラグメントずは、 抗原抗䜓反応掻性を有する抗䜓のフラグメントを意味し、 具 䜓的には、 F (ab7 ) 2、 Fab'、 Fab, F vなどを挙げるこずができる。 䟋えば、 本発明の抗䜓をペプシンで分解するず F (ab ) 2 が埗られ、 ノボ' パむンで分解するず Fabが埗られる。 F (ab ) 2を 2—メルカプトェ倕ノ —ルなどの詊薬で還元しお、 モノョ䞀ド酢酞でアルキル化するず F ab が埗ら れる。 Fvは重鎖可倉領域ず軜鎖可倉領域ずをリンカヌで結合させた䞀䟡の抗䜓 掻性フラグメントである。
これらの掻性フラグメントを保持し、 その他の郚分を他の動物のフラグメント に眮換するこずでキメラ抗䜓が埗られる。
本発明の抗䜓は、 1 (3) mbtの発珟等の機胜の解明や悪性腫瘍の圢成機 構の解明のために䜿甚可胜である。
1 (3) mbtの怜出に぀いおは、 抗䜓を甚いる方法、 酵玠反応を利甚する 方法が挙げられる。
抗䜓を甚いる方法ずしおは具䜓的には、 ①暙識された 1 (3) mbt抗䜓を甚 いお 1 (3) mbtを怜出する方法、 1 (3) mb t抗䜓および該抗䜓の暙識 二次抗䜓を甚いお 1 (3) mbtを怜出する方法が挙げられる。 暙識ずしおは、 䟋えば攟射性同䜍元玠 RI)、 酵玠、 アビゞン又はビォチン、 もしくは蛍光物 質 F I T Cやロヌダミン等 が利甚される。
酵玠反応を利甚する方法ずしおは、 䟋えば、 EL I SA法、 免疫凝集法、 ゥ ゚スタンプロット法、 フロヌサむ トメ トリヌを甚いた免疫反応分子の同定方法又 はそれらに類䌌する方法が挙げられる。
以䞋に実斜䟋を挙げお、 より詳现に本発明を説明するが、 本発明は以䞋の実斜 䟋に限定されるものではない。
<実斜䟋 1> h— 1 (3) mbt遺䌝子の単離および塩基配列の決定 1. E S Tデ䞀倕ベヌスの怜玢
むン倕䞀ネットの E S Tデ䞀倕ベヌス mRN Aの断片の配列を登録しおある デ䞀倕べ䞀ス、 h t t p / / www. ncbi. n 1 m. nin. ov. / i html) に登録された配列 EST) から、 ショりゞペりバ゚の 1 (3) mb t遺䌝子ずホモロゞ䞀のある配列を探玢したずころ、 H 23073ずしお登 録されおいる配列がヒッ卜した。
2. プラむマ䞀の合成
ヒト cDN Aラむブラリ䞀から、 䞊蚘の H 23073の塩基配列の䞀郚の塩基 配列からなる DN Aフラグメントを取埗するために以䞋のブラむマヌを合成した c 5 プラむマヌずしお P 1プラむマヌ 5 -CCATCAAAGT GCAGGCGTAG G- 3 配 列衚の配列番号 20に蚘茉の塩基配列 、 3' プラむマ䞀ずしお P 2プラむマ䞀
5' -TAGCCACATA CCTCAGCCAC G- 3 配列衚の配列番号 2 1に蚘茉の塩基配列 を蚭蚈し、 DNA合成機 AB I瀟補、 モデル 392) にお合成した。 合成した プラむマ䞀は、 蒞留氎で 2 O pmo に調補した。 これを P C Rプラむマ —ずしお甚いお、 以䞋の P CR操䜜を行った。
3. P CR ( 1)
c DN Aラむプラリヌには、 ヒト胎児脳の cDNAラむブラリ䞀 クロ䞀ンテ ック瀟補 を甚い、 以䞋の条件で P CRを行った。
プラむマ䞀ずしお P 2プラむマ䞀のみを䜿甚し、 5' 方向ぞの䞀方向のみの
P CRを行った。 PCR操䜜は、 以䞋の組成からなる液を詊隓管に入れ、 その䞊 にミネラルオむルを 1 5〃 1重局し、 94 °Cで 5分間攟眮した。
cDNAラむブラリ䞀  l〃g/〃 l) 2〃 1
dNTP混合液 各 NTPを 20 pmo 1 /〃 1にお蒞留氎䞭に溶解
1 JLL 1
P 2プラむマ䞀 20 pmo 1/〃 1) ΙΌ.1
10倍濃床の P CR緩衝液 400 mM T r i s -HC 1 (pH8. 3) 、 1 M KC Is l O OmM MgCl2、 l O OmM DTT)
Figure imgf000020_0001
蒞留氎 9 1
T a qポリメラ䞀れ 5 un i t/ / l) 0. 5 ju 1 合蚈 15〃 1
その埌、 「60°Cで 30秒間、 続いお 72°Cで 1. 5分間、 続いお 94°Cで 3 0秒間のサむクル」 を 50回繰り返しお反応を行った。
次いで 55°Cで 2分間、 最埌に 72°Cで 10分間反応させお、 断片の䌞長反 応を行い P CR操䜜を完了した。
その埌、 䞊蚘で埗た PCR産物を錶型ずしお、 P 1プラむマ䞀を甚いお 2床目 の PCR操䜜を行った。 2床目の PCR操䜜は、 以䞋の組成からなる液を詊隓管 に入れ、 その䞊にミネラルオむルを 20〃1重局し、 94 °Cで 5分間攟眮した。 䞊蚘で埗た PCR産物  l〃g/〃l) 5 zl
dNTP混合液 2 zl
P 1プラむマヌ  20 pmo 1/〃 1 ) 1 ÎŒ.1
10倍濃床の P CR緩衝液 40 OmM T r i s -HC 1 (pH8. 3) 、 1M KC 1、 10 OmM MgC l2、 100 mM DTT) 2ÎŒ. Ι 蒞留氎 9. 5 1
Taqポリメラ䞀れ 5un i t s/〃 l) 0. 5〃1
合蚈 20 1
その埌、 「 60 °Cで 30秒間、 続いお 72 °Cで 1分間、 続いお 94 °Cで 30秒 間のサむクル」 を 40回繰り返しお反応を行った。
次いで 55°Cで 2分間、 最埌に 72 °Cで 10分間反応させお、 断片の䌞長反 応を行い P C R操䜜を完了した。
4. 塩基配列の決定  1 )
䞊蚘で埗た 5 䌞長反応による DN A断片 以降、 フラグメント Aずいうこ ずがある をミニゲル電気泳動 0. 75%ァガ口䞀スゲル させお、 フラグメ ント Aのバンドをゲルから切り出した。 Gene C l ean (バむオ 101瀟 補 でフラグメント Aを回収しお、 ミニゲル電気泳動でバンドをチェックした。 フラグメント Aを 1〃 1取り、 99 / 1の TEにお垌釈した。 260 nmでの 吞光床 A260) を枬定し、 DNA濃床を蚈算した A 260が 1. 0のずき の DNA濃床を 50〃 1/mlずした。  。 D N A濃床が 1〃 g/〃 1になるよ うに TEでフラグメント Aを垌釈した。
この垌釈液に぀いお、 T 7プラむマ䞀を甚いお、 ダむ倕䞀ミネ䞀倕䞀法によ り、 オヌトシ䞀クェンサヌ 八ョ 1モデル373八 を甚いお、 DNAシヌクェ ンスを行い、 フラグメント Aの塩基配列を決定した。 この塩基配列を配列衚の配 列番号 9に瀺す。 5. PCR (2)
3 ' 偎ぞの䌞長反応を 3. の 5' 偎ぞの䌞長反応ず同様の手法を甚いお行぀ た。 プラむマヌは、 5' プラむマヌずしお P 3プラむマヌ 5- MGCTGTTTG ACCG CATGAA C-3' (配列衚の配列番号 22に蚘茉の塩基配列 を、 3' プラむマヌず しお P 4プラむマヌ 5- MGCACCTGT TTGTGAGCCA G-3' (配列衚の配列番号 23 に蚘茉の塩基配列 を蚭蚈し、 DNA合成機 AB I瀟補、 モデル 392) にお 合成し、 蒞留氎で 20 pmo 1/〃 1に調補したものを甚いた。
6. 塩基配列の決定  2 )
前蚘の 3' 䌞長反応により埗られた DNA断片 以降、 フラグメンず Bずい うこずがある に぀いお、 4. ず同様の手法で塩基配列を決定した。 この塩基配 列を配列衚の配列番号 10に瀺す。
7. h- 1 (3) mbt遺䌝子の取埗
5 プラむマ䞀ずしおフラグメント Aの䞀郚に盞圓するセンスプラむマヌ P 5 プラむマヌ 5-ATGAGGCGM GAGAGGGCCA TG-3' (配列衚の配列番号 24に蚘茉の 塩基配列 を、 3 プラむマ䞀ずしおフラグメント Bの䞀郚に盞圓するアンチセ ンスプラむマ䞀 P 6プラむマ䞀 5 -GTTAGGATCC TTGCAGTAAA TCAC-3' (配列衚 の配列番号 2 5に蚘茉の塩基配列 を DNA合成機 AB Iモデル 3 9 2) で合 成した。 ヒト胎児脳 cDNAラむブラリヌ クロヌンテック瀟補 を錡型ずしお䞊蚘の プラむマ䞀を甚いお P CR反応を行った。 以䞋の組成からなる液を詊隓管に入れ、 その䞊にミネラルオむルを 2 0〃 1重局し、 94 °Cで 5分間攟眮した。
ヒ ト胎児脳 c DNAラむブラリ䞀  l〃g/〃 l) 5 1
dNTP混合液 各 NTPを 20 pmo 1 /〃 1に蒞留氎䞭に溶解 1〃 1 P 5センスプラむマ䞀 2 0 pmo 1/〃 1) 1 j 1
P 6アンチセンスプラむマヌ 2 0 pmo 1/〃 1) 1 ÎŒ.1
1 0倍濃床の P CR緩衝液 40 OmM T r i s— HC 1 (pH 8. 3) 、 1 M K C 1、 1 0 OmM MgC l 2、 1 0 OmM D TT) T aqポリメラヌれ  5 un i t s/〃 1) 0. 5 1
蒞留氎 9. 5 1
合蚈 2 0〃 1
その埌、 「6 0°Cで 3 0秒間、 続いお 7 2°Cで 1分間、 続いお 94 °Cで 3 0秒間のサむクル」 を 40回繰り返しお反応を行った。 次いで、 5 5°Cで 2分間、 最埌に 7 2°Cで 1 0分間反応させお P CR操䜜を完了した。
䞊蚘の反応埌、 P CR産物に぀いお、 ミニゲル電気泳動 0. 7 5%ァガロ —スゲル を行った。 その結果、 箄 2. 4 kbpのバンドが芳察された。
䞊蚘により h— 1 (3) mb t遺䌝子が単離された。
8. 塩基配列の決定 3)
䞊蚘で埗た h— 1 (3) mb t遺䌝子のバンドをゲルから切り出した。 Ge ne C 1 e an (バむオ 101瀟補 で h— 1 (3) mb t遺䌝子を回収しお、 ミニゲル電気泳動でバンドをチェックした。
h- 1 ( 3) mb t遺䌝子を 1〃 1取り、 99〃 1の T Eにお垌釈した。 2 6 Onmでの吞光床 A260) を枬定し、 DNA濃床を蚈算した A260が 1. 0のずきの DNA濃床を ήΟ^ΐΖπιΙずした。  。 DNA濃床が l /g/ 1になるように TEで h— 1 (3) mbtを垌釈した。
この垌釈液に぀いお、 T 7プラむマ䞀を甚いお、 ダむ倕䞀ミネ䞀倕䞀法によ り、 ォ䞀トシ䞀クェンサ䞀 AB Iモデル 373A) を甚いお、 DNAシ䞀クェ ンスを行い、 h— 1 (3) mb t遺䌝子の塩基配列を決定した。 この結果、 h— 1 (3) mb t遺䌝子にはォ䞀倕ナティブスプラむスフォヌムが存圚するこずが 分かった。 短い方をタむプ 1、 長い方をタむプ 2ず名付けた。 h— 1 (3) mb tタむプ 1遺䌝子の塩基配列を配列衚の配列番号 2に、 h— 1 (3) mbtã‚¿ã‚€ プ 2遺䌝子の塩基配列を配列衚の配列番号 4に瀺す。 タむプ 2は、 タむプ 1の C 末端近く、 塩基配列でいうず配列番号 2に蚘茉の塩基配列の 2373番目ず 23 74番目の間に 118塩基が挿入されおいる。
前蚘過皋で埗られたフラグメント A、 Bの䜍眮関係を図 3に瀺す。
9. アミノ酞配列の決定
䞊蚘の塩基配列より、 h— 1 (3) mbtのアミノ酞配列を決定した。 h— 1 (3) mbtタむプ 1のァミノ酞配列を配列衚の配列番号 1に、 h— 1 (3) mbtタむプ 2のァミノ酞配列を配列衚の配列番号 3に瀺す。 タむプ 1ずタむプ 2ずは 709番目以降のアミノ酞が異なる。
d— 1 (3) mbtず h— 1 (3) mb tのアミノ酞配列を図 2に瀺す。 図䞭、 ゞンクフィンガヌドメむン、 mb tリピヌトおよびプロティンリッチドメむン (SPM) の箇所を枠で囲っお瀺す。 d— 1 (3) mbtず h—l (3) mbt の mb tリピヌトでの䞀臎率は 43. 7%であり、 mb tリピヌトにおいお䞡者 はかなり保存されおいるこずが分かった。 したがっお、 mbt— r ep e atは、 この蛋癜質が機胜を発揮する䞊で重芁な働きをしおいるず考えられる。
10. 圢質転換䜓の䜜補
䞊蚘の塩基配列からなる党長の h—1 (3) mb tタむプ 1遺䌝子を TAク ロヌニングベクタヌに挿入し、 該ベクタ䞀を倧腞菌 DH 5ひに導入しお圢質転換 䜓を䜜補した。 この圢質転換䜓を TA— h— 1 (3) mb tず名付け、 平成 9幎 7月 9日に、 日本囜茚城県぀くば巿東 1䞁目 1番 3号、 工業技術院生呜工孊工業 技術研究所に寄蚗し 受蚗番号 FERM P— 16317) 、 さらに、 平成 10 幎 7月 13日に囜際寄蚗圓局である、 日本囜茚城県぀くば巿東 1䞁目 1番 3号、 工業技術院生呜工孊工業技術研究所に移管した 受蚗番号 FERM BP— 64 18) 。 く実斜䟋 2〉m— 1 (3) mb t遺䌝子の単離ならびにその塩基配列および 該遺䌝子がコヌドするァミノ酞配列の決定
1. DN A断片の取埗
P 7プラむマ䞀 5-TGMCTCCTC CTCCTTGTAA CCT-3' (配列衚の配列番号 26 に蚘茉の塩基配列 および P 8プラむマヌ 5' -GTCCATGTAC TTCATCCTCA C-35 (配列衚の配列番号 27蚘茉の塩基配列 を甚いお、 マりス新生仔脳 cDNA (ラムダ ZAP I I) ラむブラリヌを増幅した。 T 7プラむマヌを甚いお、 ダむ 倕䞀ミネ䞀倕䞀法により、 オヌトシヌクェンサ䞀 八81モデル373八 を甚 いお、 DNAシヌクェンスを行い、 埗られた DNAの塩基配列を決定した。 この 結果、 前蚘の H 23073の塩基配列の䞀郚に盞同性のある塩基配列からなる D NA断片を取埗するこずができた 以降、 この DNA断片をフラグメント Cずい うこずがある。 フラグメント Cの塩基配列を配列衚の配列番号 1 1に瀺す。  。 2. プラむマヌの合成
プラむマ䞀ずしお M 1 3リバ䞀スプラむマヌ 5 -CAGGAAACAG CTATGAC-3' (ラムダ ZAP I I内にある配列、 配列衚の配列番号 28に蚘茉の塩基配列 ず P 7プラむマ䞀を蚭蚈し、 DNA合成機 AB I瀟補、 モデル 392) にお合成 した。 合成したプラむマ䞀は蒞留氎で 2 Opmo に調補した。 これを P CRプラむマ䞀ずしお甚いお、 以䞋の P CR操䜜を行った。
3. P CR ( 1)
cDNAラむブラリ䞀には、 マりス新生仔脳 cDN Aラむブラリ䞀 クロ䞀ン テック瀟補 を甚い、 以䞋の条件で P CRを行った。
PCR操䜜は、 以䞋の組成からなる液を詊隓管に入れ、 その䞊にミネラルオむ ルを 1 5 1重局し、 94 °Cで 5分間攟眮した。
マりス新生仔脳 cDN Aラむブラリ䞀  l〃g/〃 l)
2 z 1
dNTP混合液 各 NTPを 20 pmo 1 / / 1に蒞留氎䞭に溶解
1 JLL 1
M 13リバヌスプラむマ䞀 20pmo l/〃 l)
1 /a 1
P 7プラむマ䞀 20 pmo l/〃l)
1 pi 1
10倍濃床の P CR緩衝液 400 mM T r i s— HC l (pH8. 3) 、 1 M KC 1、 l O OmM MgC l2、 10 OmM DTT)
1. 5// 1
䞁& ポリメラ䞀れ 511111䞃 3/ / 1) 0. 5〃 1
蒞留氎 8 j 1
合蚈 15 1 P / 551 その埌、 「6 0°Cで 3 0秒間、 続いお 72°Cで 1. 5分間、 続いお 9 4°Cで 3 0秒間のサむクル」 を 3 0回繰り返しお反応を行った。
次いで 5 5°Cで 2分間、 最埌に 7 2 °Cで 1 0分間反応させお、 断片の䌞長反 応を行い P CR操䜜を完了した。
その埌、 䞊蚘で埗た P C R産物を鎵型ずしお、 T 3プラむマ䞀 5' -AATTAACCCT
CACTAAAGGG-3' (ラムダ ZAP I I内にある配列、 配列衚の配列番号 2 9に蚘 茉の塩基配列 ず P 1プラむマヌを甚いお 2床目の P CR操䜜を行った。 2床目 の P C R操䜜は、 以䞋の組成からなる液を詊隓管に入れ、 その䞊にミネラルオむ ルを 2 0 1重局し、 9 4°Cで 5分間攟眮した。
䞊蚘で埗た P C R産物  1〃 g//JL 1 ) 5〃 1
dNTP混合液 2 1
T 3プラむマ䞀 20 11101/〃 1) 1 ju 1
P 1プラむマ䞀 2 ◩ pmo 1) 1 JL 1
1 0倍濃床の P C R緩衝液 40 0 mM T r i s— HC l (pH 8. 3) 、 1 M K C 1、 1 0 0 mM Mg C l 2、 1 0 0 mM DT T)
2 ju l
T aqポリメラ䞀れ  5 un i t s/〃 1) 0. 5〃1
蒞留氎 8. 5 z l
合蚈 2 0〃 1
その埌、 「 6 0 °Cで 3 0秒間、 続いお 7 2 °Cで 1分間、 続いお 94 °Cで 3 0秒 間のサむクル」 を 3 5回繰り返しお反応を行った。
次いで 5 5°Cで 2分間、 最埌に 7 2 °Cで 1 0分間反応させお、 断片の䌞長反 応を行い P C R操䜜を完了した。 4. 塩基配列の決定  1 )
䞊蚘で埗た 5 䌞長反応による DNA断片 以降、 フラグメント Dずいうこ ずがある をミニゲル電気泳動 0. 75%ァガロヌスゲル させお、 フラグメ ント Aのバンドをゲルから切り出した。 GeneCl ean (バむオ 101瀟 補 でフラグメント Dを回収しお、 ミニゲル電気泳動でバンドをチェックした。 フラグメント Dを 1 1取り、 99〃 1の TEにお垌釈した。 260 nmでの 吞光床 A260) を枬定し、 DNA濃床を蚈算した A260が 1. 0のずき の DNA濃床を 50〃 1/mlずした。  。 D N A濃床が 1〃 1/〃 1になるよ うに TEでフラグメント Dを垌釈した。
この垌釈液に぀いお、 T 3プラむマヌず P 1プラむマ䞀を甚いお、 ダむ倕䞀ミ ネヌ倕䞀法により、 オヌトシヌクェンサ䞀 AB Iモデル 373 A) を甚いお、 DN Aシヌクェンスを行い、 フラグメント Dの塩基配列を決定した。 この塩基配 列を配列衚の配列番号 12に瀺す。
5. PCR (2)
3' 偎ぞの䌞長反応を 3. の 5' 偎ぞの䌞長反応ず同様の手法を甚いお行぀ た。 プラむマヌは、 1床目の P CRには M 13プラむマヌず P 8プラむマ䞀を、 2床目の P CRには T 3プラむマ䞀ず P 6プラむマ䞀を蚭蚈し、 DNA合成機 (AB I瀟補、 モデル 392) にお合成し、 蒞留氎で 2 Opmo 1/〃 1に調補 したものを甚いた。 6. 塩基配列の決定 2)
前蚘の 3' 䌞長反応により埗られた DNA断片 以降、 フラグメンず Eずい うこずがある に぀いお、 4. ず同様の手法で塩基配列を決定した。 この塩基配 列を配列衚の配列番号 13に瀺す。 7. m- 1 (3) mb t遺䌝子の取埗
55 プラむマ䞀ずしおフラグメント Dの䞀郚に盞圓するセンスプラむマ䞀 P 9 5' -GTTGAAATGC TGGCGTAGTC-3' (配列衚の配列番号 30に蚘茉の塩基配列 を、 3 プラむマヌずしおフラグメント Eの䞀郚に盞圓するアンチセンスプラむマヌ P 10 5' -CCCAGTCAGT CACTTAAAGA CATC- 3' (配列衚の配列番号 31に蚘茉の 塩基配列 を DNA合成機 AB Iモデル 392) で合成した。
マりス新生仔脳 cDN Aラむブラリヌ クロヌンテック瀟補 を鎵型ずしお䞊 蚘のプラむマヌを甚いお P CR反応を行った。 以䞋の組成からなる液を詊隓管に 入れ、 その䞊にミネラルオむルを 20〃 1重局し、 94 °Cで 5分間攟眮した。 マりス新生仔脳 cDNAラむブラリ䞀 l〃g/〃l) 5〃1
dNTP混合液 各 NTPを 20 pmo 1 /〃 1に蒞留氎䞭に溶解
1 JLL 1
P 9センスプラむマ䞀 20 pmo 1 j 1
P 10アンチセンスプラむマ䞀 20 pmo 1/ 1) 1 ÎŒ.1
10倍濃床の P CR緩衝液 40 OmM Tr i s— HC1 ( H 8. 3) 、 1 M KC1、 10 OmM MgCl2、 100 mM DTT)
2ÎŒ. Ι
Taqポリメラ䞀れ 5uni t s/〃l) 0. 5〃1
蒞留氎 9. 5〃1
合蚈 20 1
その埌、 「60°Cで 30秒間、 続いお 72°Cで 1分間、 続いお 94 °Cで 30 秒間のサむクル」 を 40回繰り返しお反応を行った。 次いで、 55°Cで 2分間、 最埌に 72°Cで 10分間反応させお PC R操䜜を完了した。
䞊蚘の反応埌、 PCR産物に぀いお、 ミニゲル電気泳動 0. 75%ァガロ ヌスゲル を行った。 その結果、 箄 2. 6 kbpのバンドが芳察された。
䞊蚘により m— 1 (3) mb t遺䌝子が単離された。
8. 塩基配列の決定  3 ) 䞊蚘で埗た m— 1 (3) mb t遺䌝子のバンドをゲルから切り出した。 Ge ne C 1 e an (バむオ 101瀟補 で m— 1 (3) mb t遺䌝子を回収しお、 ミ二ゲル電気泳動でバンドをチェックした。
m— 1 (3) mb t遺䌝子を 1〃 1取り、 99〃 1の T Eにお垌釈した。 2 6 Onmでの吞光床 A 260) を枬定し、 DNA濃床を蚈算した A260が 1. 0のずきの DNA濃床を 50 /l/mlずした。  。 DNA濃床が 〃 1になるように TEで m— 1 (3) mbtを垌釈した。
この垌釈液に぀いお、 T 7プラむマ䞀を甚いお、 ダむ倕䞀ミネ䞀倕䞀法によ り、 ォ䞀トシ䞀クェンサ䞀 八ョ 1モデル373  を甚いお、 DNAシヌクェ ンスを行い、 m— 1 (3) mbtの塩基配列を決定した。 この塩基配列を配列衚 の配列番号 6に瀺す。
たた、 前蚘過皋で埗られたフラグメント C、 Dおよび Fの䜍眮関係を図 4に 瀺す。 9. アミノ酞配列の決定
䞊蚘の塩基配列より、 m— 1 (3) mb tのアミノ酞配列を決定した。 この ァミノ酞配列を配列衚の配列番号 5に瀺す。
h- 1 (3) mbt遺䌝子ず m—1 (3) mb t遺䌝子のホモロゞ䞀は、 8 7%であり、 h— 1 (3) mbt蛋癜質ず m—1 (3) mbt蛋癜質のホモロゞ —は 70%であり、 皮間で倧倉よく保存された蛋癜質である。
10. 圢質転換䜓の䜜補
䞊蚘の塩基配列からなる党長の m— 1 (3) mbt遺䌝子を T Aクロヌニン グベクタ—に挿入し、 該ベクタヌを倧腞菌 D H 5ひに導入しお圢質転換䜓を䜜補 した。 <実斜䟋 3 >ラット 1 (3) mbt (r- 1 (3) mbt) 遺䌝子の単離な らびにその塩基配列および該遺䌝子がコ䞀ドするアミノ酞配列の決定
前蚘の実斜䟋 2のマりスの堎合ず同様にしお、  r— 1 (3) mb t遺䌝子の 単離、 その塩基配列の決定を行った。 以䞋にその抂芁を述べる。
1. DN A断片の取埗
cDNAラむブラリ䞀は、 キット GIBC0BRL瀟補 を䜿甚しお自䜜したラッ ト新生仔脳 cDNAラむブラリ䞀を甚いた。 前蚘 P 8プラむマ䞀ず P 1 1プラむ マ䞀 5 - ATCCAGAMT CATAGCCATG ACT- 3 配列衚の配列番号 32に蚘茉の塩基 配列 を甚いた PCRにより、 H 23073ず盞同性の高いプラグメント Fを埗 た。 フラグメント Fの配列を配列衚の配列番号 14に瀺す。
2. P CR ( 1 )
5 方向ぞのクロ䞀ニングは、 前蚘 P 1 1プラむマ䞀ず P 12プラむマ䞀 5 -GTTGAAATGC TGGCGTAGTC C-3' (配列衚の配列番号 33に蚘茉の塩基配列 を甚 いた 1床だけの P CRにより行った。 P CRのサむクル数は 40回ずした。 この 結果、 フラグメント Gを埗た。 フラグメント Gの配列を配列衚の配列番号 1 5に 瀺す。
3. P CR (2)
3 方向ぞのクロ䞀ニングは、 1床目の P CRを前蚘 P 8プラむマ䞀のみを 甚いおサむクル数を 50回ずしお行い、 2床目の PCRを前蚘 P 5プラむマヌず P 13プラむマ䞀 5 -GGCCACGCGT CGACTAGTAC-3' (3' RACEキット ベヌ リンガヌマンハむム瀟補 のアダプタ䞀プラむマ䞀、 配列衚の配列番号 34に瀺 す塩基配列 を甚いおサむクル数を 40回ずしお行った。 この結果、 フラグメン ト Hを埗た。 フラグメント Hの配列を配列衚の配列番号 16に瀺す。 4. 塩基配列の決定
䞊蚘で埗たフラグメント F、 Gおよび Hから党長の r— 1 (3) mbt遺䌝 子の塩基配列を決定した。 この塩基配列を配列衚の配列番号 8に瀺す。 5. アミノ酞配列の決定
䞊蚘の塩基配列より、 r— 1 (3) mb tのアミノ酞配列を決定した。 この ァミノ酞配列を配列衚の配列番号 7に瀺す。
m— 1 (3) mbtず r— 1 (3) mb tのホモロゞ䞀は、 90%以䞊であ り、 皮間で倧倉よく保存された蛋癜質である。 h— 1 (3) mbt、 m— 1 (3) 111131:ぉょび ヌ1 (3) mbtのアミノ酞配列を図 1に瀺す。 図䞭、 m b tリピヌトの箇所を枠で囲っお瀺す。 3者の間で mbtリピヌトにおけるアミ ノ酞の䞀臎率は 95. 0%であり、 倧倉よく保存されおいるこずが分かった。 し たがっお、 mbtリピヌトは、 この蛋癜質が機胜を発揮する䞊で重芁な働きをし おいるず考えられる。
<実斜䟋 4>h— 1 (3) mb tの各組織における発珟
ヒトの各組織のポリ A + RNA (mRNA) およびヒトの各皮现胞のポリ A + RNA (mRNA) それぞれに぀いお、 各 2〃 gをブロットしたメンプレン (Human Tis sue Northern B lot I、 同 I Iおよび Human Cel l Line Mult iple Ti ssue Nort hern Bl ot (クロヌンテック瀟補  に、 暙識化した党長の h— 1 ( 3 ) mb tタむプ 1遺䌝子を、 M o 1 e c u 1 a r Clonin A L aborat ory Manual Second Ed i t ion 7. 39 ペヌゞないし 7. 52ペヌゞの蚘茉にしたがっおハむブリダィズさせ、 ノヌザン ブロヅトハむブリダィれ䞀シペン法による解析を行った。
h— 1 (3) mbt遺䌝子の暙識化は以䞋の操䜜により行った。 1) Takara MEGA LAB ELキット 登録商暙、 宝酒造瀟補 を甚いお取扱説明曞の通りに暙識した。
2) 次に、 䞋蚘の組成の DN A反応液を調補し、 この液を 37°Cで 30分間 むンキュベヌトした埌、 70°Cで 10分間熱凊理し、 酵玠を倱掻させた。
DNAプロヌブ  2 pmo 1 ) 2 ÎŒ.\
10倍ホスホラィレむシペン緩衝液 2〃1
〔ァ䞀32 Ρ〕 Α΀Ρ (37 OMBq/ml) (アマシャム補
T 4 ポリヌクレオチドキナヌれ 1 a 1
合蚈 10〃 1
3) T 50 E (5 OmM T r i s -C 1 pH8. 0, 1 mM ED T A) で平衡化された SephadexG— 25 (登録商暙、 フアルマシア瀟補 を 1. 5mlポリプレップカラム バむオラッド瀟補 にベッ ドボリュヌムが 1 mlになるように詰め、 2) で熱凊理をした DNA反応液を該カラムに茉せた。
4) その埌、 200〃 1 T 50 Eをカラムに 4回流し、 2回目の 200〃1 で溶出した画分から暙識化 DN Aプロヌブを埗た。
各組織に぀いおの結果の写真を、 図 5ないし図 7に瀺す。 写真より、 h— 1 (3) mbt (5. 5kbのバンド が党おの組織で発珟しおいるこずが分か ぀た。
各皮现胞に぀いおの結果の写真を図 8に瀺す。 写真より、 SW480を陀く 党おの现胞に発珟が認められた。 く実斜䟋 5>h— 1 (3) mb t遺䌝子のォ䞀倕ナティブスプラむスフォヌ ムの発珟
h- 1 (3) mbtタむプ 1遺䌝子および同タむプ 2遺䌝子の発珟割合に぀い お RT— P CRで解析した。
ヒト正垞癜血球 7名のボランティア ならびに癌现胞株 U2 OS、 T 98 G、 RBR 17 Tおよび U251) の mRNAを、 前蚘 P 5プラむマ䞀および P 6プラむマヌを甚いお RT— PC Rを行った埌、 P CR産物を電気泳動した。 こ の結果を、 図 9に瀺す。 図 9の䞊段はヒトに぀いおの結果を瀺し、 各レヌンのァ ルフアベットは各ボランティアを識別するためのものである。 䞊のバンドがタむ プ 2のバンドであり、 䞋のバンドがタむプ 1のバンドである。 図から 5名のヒト 正垞癜血球ならびに癌现胞株ではタむプ 2が優䜍に発珟しおいた。 そしお、 1名 のヒト正垞癜血球ではタむプ 1が優䜍に発珟しおいた。 他の 1名のヒト正垞癜血 球に぀いおは、 ややタむプ 1の発珟が優䜍であった。 く実斜䟋 6>組み換え h— 1 (3) mbt蛋癜質の䜜補 1)
党長の h_l (3) mb t遺䌝子タむプ 1を p CGNベクタ䞀および pB J — My cベクタ䞀に挿入し、 該ベクタヌをそれぞれ COS现胞に導入しお圢質転 換䜓を䜜補した。 以䞋の操䜜はそれぞれに぀いお同じである。
この圢質転換䜓を 1 X 106個に、 50 mM Tr i s— HC1、 15 OmM NaCl、 1 T r i t o n X— 100、 50 mMョヌドアセトアミ ド、 2 mM MgCl2、 2mM CaCl2、 0. 1 % NaN3、 10〃g/ml倧 豆トリプシンむンヒビ倕䞀、 l /g/mlァプロチニン、 ImM PMS F (フ ェニルメチルスルホニルフロラむ ド 、 1〃g/mlロむぺプチンからなる組成 の现胞溶解液 100〃 1を、 加えおよく攪拌しお溶解した。 氷䞊に 60分間攟眮 した埌、 15, 000 r pmで 10分間遠心分離し、 䞊枅液を回収した。
回収した䞊枅液に、 免疫しおいないゥサギの I gG lmgを結合させた C NB r掻性化セファロ䞀スビヌズ フアルマシア瀟補 抗䜓濃床 lmg/ml 暹脂 50mlを添加した。 4°Cで䞀晩反応埌、 遠心分離を行い、 ビヌズに結合 する非特異的結合蛋癜質を陀去し、 䞊枅を回収した。 この䞊枅 10〃1を、 等量の SD S— PAGE甚サンプルバッファ䞀および 1 〃 1の 2—メルカプト゚タノヌル 2ME) ず混和し、 95°Cで熱凊理を 5分間 行った。 その埌、 5— 20%のグラディ゚ントゲルで電気泳動した。
電気泳動埌、 ゲルをクマシ䞀染色した。 その結果、 箄 12 O kDの䜍眮にバン ドが芳察され、 組み換え h— l (3) mbtが䜜補されたこずが確認された。 なお、 h— l (3) mb tの蚈算䞊の分子量は 86 kDであるが、 組み換え h — 1 (3) mb tの分子量は玄 1 20 kDであった。 く実斜䟋 7 > h— l (3) mb tを認識する抗䜓の䜜補  1)
1. 抗原の䜜補
配列衚の配列番号 1に蚘茉の h— 1 (3) mb tのアミノ酞配列の 6 1 7䜍 から 63 5䜍たでのアミノ酞配列の N末端にシスティン C) を付加したァミノ 酞配列である䞋蚘のアミノ酞配列 A (配列衚の配列番号 1 7に蚘茉の配列 およ び配列衚の配列番号 1に蚘茉の h— 1 (3) mb tのァミノ酞配列の 148䜍か ら 1 67䜍たでのアミノ酞配列の N末端にシスティン C) を付加したアミノ酞 配列である䞋蚘のアミノ酞配列 B (配列衚の配列番号 18に蚘茉の配列 からな るペプチドをそれぞれ合成した。 システィンの付加はスカシ貝ぞモシァニン K HL) ず結合させるために付加した。 合成は岩城硝子 株 に委蚗した。
配列 A  CGR I GRPPKYRK I PQEDFQT
配列 B : CMKKRKRREYQSP SEEE SEPE
合成したペプチド 2mgをマレむミ ド化 KLH (ピアス瀟補 2mgに結合 させた。 反応はピアス瀟のキットの説明曞に蚘茉の方法にしたがった。
2. 免疫
配列 Aからなる抗原、 配列 Bからなる抗原に぀いお、 それぞれ抗原液 ( 1 jug
/ml) 100 i l PB S 0. 5 m 1を及びフロむントコンプリヌトアゞュ バンド ディフコ瀟補 0. 5mlをシリンゞに取り、 混合しおェマルゞペンず し、 ゥサギの背に 4箇所に分けお皮䞋接皮した。
1週間埌、 2回目の免疫を行った。 2回目からはアゞュバンドをフロむントむ ンコンプリヌトアゞュバンド ディフコ瀟補 に倉えお免疫を行った。 その他の 操䜜は 1回目ず同様である。 2回目以降は 1週間間隔を開けお、 合蚈 6回免疫を 打った。
3. 抗䜓の粟補
最終免疫の 1週間埌、 採血した。 この血液を宀枩で 3時間静眮し、 十分に血液 凝固を行った埌、 3 000 rpmで 5分間遠心分離を行い、 䞊枅 血枅 を回 収した。
この血枅に飜和硫安を最終濃床が 50%になるように加えお塩析した。 この サンプルを遠心分離しお、 抗䜓が含たれる画分を沈殿させた。 その埌、 沈殿物を PBSに溶解し、 さらに PB Sに察しお塩祈した。
その埌、 プロテむン Gセファロヌスカラム フアルマシア瀟補 を甚いお、 抗 䜓をァフィ二ティヌ粟補した。 その結果、 党量で 5 m gのペプチド特異的抗䜓が 埗られた。
<実斜䟋 8>h— 1 (3) mbtを認識する抗䜓の䜜補 2)
1. 抗原の䜜補
GS T遺䌝子を組み蟌んだベクタ䞀 pGEX— 2 TH (図 10参照 に配列 衚の配列番号 2に蚘茉の h— 1 (3) mbt遺䌝子を挿入し、 該ベクタヌを倧腞 菌 DH 5ひに導入しお圢質転換䜓を䜜補した。 該圢質転換䜓に h— 1 (3) mb tの N末端に GSTを結合させた GST— h— 1 (3) mb tを䜜補させた。 実 斜䟋 4ず同様にしお GST結合組み換え h— 1 (3) mbtを粟補した。
䜜補したペプチド 2mgをマレむミ ド化 KLH (ピアス瀟補 2mgに結合 させた。 反応はピアス瀟のキットの説明曞に蚘茉の方法にしたがった。 TJP /03551
2. 免疫
実斜䟋 6ず同様にしお、 抗原液 l〃g/ml) 100〃1、 PBS 0. 5 mlを及びフロむントコンプリヌトアゞュバンド ディフコ瀟補 0. 5 mlを シリンゞに取り、 混合しおェマルゞペンずし、 ゥサギの背に免疫した。
3. 抗䜓の粟補
実斜䟋 6ず同様にしお、 ゥサギの血液から抗䜓を粟補した。 <実斜䟋 9>h— 1 (3) mbt抗䜓の反応性の確認
実斜䟋 6ず同様にしお、 COS现胞に h—l (3) mbt蛋癜質を䜜補させ、 該蛋癜質を SD S— PAGE電気泳動した。 電気泳動したゲルをトランスプロッ トシステム マリ゜ル瀟補 を甚い、 泳動された蛋癜質をニトロセルロヌスメン プレンに転写した。
ニトロセルロヌスメンブレンをブロック゚ヌス 倧日本補薬瀟補 に浞し、 1 時間静眮しおブロッキングした。 その埌、 0. 05 %Twe e n 20/PB Sで
5分間、 2回掗浄した。
実斜䟋 6たたは 7で䜜補した抗䜓それぞれに぀いお以䞋の操䜜でり゚スタン プロヅト法により反応性を確認した。 1 g/m 1になるように P B Sで垌釈し たものを、 メンブレンに加え、 宀枩で 2時間反応させた。 その埌、 メンブレンを
0. 05%Twe e n 20/PB Sで 5分間 x 3回掗浄した。
ペルォキシダ䞀れ暙識化ゥサギ I gG溶液 カルタグ瀟補 を PBSで 10
00倍に垌釈した液を、 䞊蚘メンブレンに加え、 さらに 1時間宀枩にお反応させ た。 その埌、 0. 05%Tween20/PBSで 5分間 X 3回掗浄した。
ECLキット アマシャム瀟補 の発色液 5mlをメンブレンに加えお 1分間 反応させた。 その埌、 このメンブレンを X線フィルムに 20秒間露光しお珟像し た。 結果を図 1 1ないし 13に瀺す。 この結果、 いずれの抗䜓を反応させおも、 1 20 kDの䜍眮にバンドが芳察され、 抗䜓が h— 1 (3) mb tを認識するこ ずが確認された。 <実斜䟋 10 >抗䜓の力䟡の枬定
実斜䟋 6で䜜補した配列 Bのァミノ酞配列からなるペプチドを抗原ずしおゥ サギに免疫しお埗られた抗䜓 以降、 抗䜓 Bずいうこずがある の力䟡を EL I S A法にお枬定した。
1. 抗原の䜜補
配列 Bのアミノ酞配列からなるペプチドを 25〃 g/mlの濃床ずなるよう に PB Sに溶解しお、 96ゥ゚ル E L I S Aプレヌト キセノバむンド Xen ob i nd) 、 キセノポア瀟補 の各ゥ゚ルに 50〃 1ず぀分泚し、 4°Cで䞀晩 静眮した。
抗原液を捚お、 蒞留氎で 4倍に垌釈したブロック゚ヌス 倧日本補薬瀟補 を 各ゥ゚ルに 200 / 1ず぀分泚し、 宀枩で 2時間静眮しおブロッキングを行った c
2. —次抗䜓反応
ブロッキング液を捚お、 䞀次抗䜓ずしお抗䜓 Bを添加した。 抗䜓 Bは、 プレ —卜の 1列目から順に、 1 0〃g/ml、 5 g/ml、 2. 5jug/m
1、 · · ·、 0. 005の濃床になるように PB Sで倍々垌釈した液を、 各ゥェ ルに 50 / 1ず぀分泚し、 宀枩で 1時間静眮しお反応させた。 コントロヌルには、 免疫しおいないゥサギの血液から粟補した I gGを甚いた。
3. 二次抗䜓反応
反応埌、 抗䜓液を捚お、 0. 05%Twe e n 20/PB Sでプレヌトを 4 回掗浄し、 次いで二次抗䜓ずしお PB Sで 1000倍垌釈したピオチン化抗ゥサ ギ I gG抗䜓 ベクタ䞀瀟補 を各ゥ゚ルに 50〃1ず぀分泚し、 宀枩で 1時間 静眮した。
4. 発色反応
二次抗䜓を捚おた埌、 0. 05%Twe en20 PBSでプレヌトを 4回 掗浄し、 OPD (オルトプ二レンゞァミン 侀 H 202/PCBを各ゥ゚ルに 100〃 1ず぀分泚した。 十分に発色埌、 2 Nの硫酞で反応を止めた埌、 490 nmでの吞光床をマむクロプレヌトリヌダ䞀 バむオラッド瀟補 にお枬定した c 枬定した吞光床をグラフにしお図 14に瀺す。 図䞭、 暪軞は加えた抗䜓の濃床 たたは血枅の垌釈倍率を衚しおおり、 瞊軞は 490 nmにおける吞光床を衚しお いる。 図から抗䜓 Bの力䟡はコントロヌルに比べお高いこずが分かった。
<実斜䟋 11>組織染色
抗䜓 Bを甚いお、 h— 1 (3) mb tタむプ 1が発珟しおいる T 98 G— MG 现胞 悪性グリオ䞀マ现胞株 における h— 1 (3) mbtの発珟状態を免疫組 織染色により怜蚎した。
现胞をラプチ゚ックチダンバ䞀ズスラむ ド䞭で培逊した。
次いで、 スラむ ド培逊した现胞を 3. 7%ホルムアルデヒドで 3分間凊理した 埌、 — 20°Cで冷华したメタノヌルで 3分間凊理を行い固定した。 その埌、 スラ ã‚€ ドを 50mM Tr i s-HCl (pH7. 5 ) で 5分間ず぀ 3回掗浄した。
次いで、 ブロック゚ヌス 倧日本補薬瀟補 をスラむ ドグラス䞊の組織に茉 せ、 宀枩で 1時間静眮しおブロッキングを行った。 その埌、 スラむ ドを 50 mM Tr i s-HCl (pH7. 5) で 5分間ず぀ 3回掗浄した。
抗䜓 Bを 1 g/m 1になるように P B Sで垌釈した抗䜓液をスラィ ド䞊の现 胞に滎䞋し、 宀枩で 1時間反応させた。 その埌、 スラむ ドを 50 mM Tr i s -HC 1 (pH7. 5) で 5分間、 3回掗浄した。 PB Sで 1000倍に垌釈した F I T C暙識化抗ゥサギ I gG抗䜓液 カル タグ瀟補 をスラむ ド䞊の现胞に加え、 宀枩で 1時間反応させた。 その埌、 スラ ã‚€ ドを 50mM T r i s -HC 1 (pH7. 5) で 5分間、 3回掗浄した。 発色埌、 スラむ ドを蛍光顕埮鏡で芳察した。 この顕埮鏡写真を図 15に瀺す。 図 15より、 现胞内の栞が染たっおおり、 しかも栞のなかでも栞クロマチンが染 たっおいるこずが分かった。 これより 1 (3) mbtは栞に存圚する蛋癜質であ り、 しかも栞においお偏圚しおいる蛋癜質であるこずが分かった。
<実斜䟋 12>組み換え h— 1 (3) mbt蛋癜質の組織染色
党長の h— 1 (3) mbtタむプ 2遺䌝子を pBJ— My cベクタヌに揷入 し、 該ベクタヌを VA 13现胞に導入しお圢質転換䜓を䜜補した。 たた、 タむプ 1遺䌝子に぀いおも VA 13现胞に導入した。 これらの圢質転換䜓に、 組み換え 蛋癜質を発珟させた。 现胞内の栞 DNAを P Iで、 现胞内の組み換え蛋癜質を F I TCで組織染色した。
図 16Aは h— 1 (3) mbtタむプ 1を発珟させた现胞内の栞 DNAを P
I染色した結果を、 図 16Bは同现胞内の h— 1 (3) mbtタむプ 1を染色し た結果を瀺す顕埮鏡写真である。 図 16Cは、 现胞内の栞 DNAず h— 1 (3) mb tタむプ 1ずを同時に芳察した結果を瀺す顕埮鏡写真である。
図 17八は11—1 (3) mbtタむプ 2を発珟させた现胞内の栞 DN Aを P I染色した結果を、 図 17Bは同现胞内の h— 1 (3) mbtタむプ 2を染色し た結果を瀺す顕埮鏡写真である。 図 17Cは、 现胞内の栞 DNAず h— 1 (3) mbtタむプ 2ずを同時に芳察した結果を瀺す顕埮鏡写真である。 図 18 Aは、 U20S现胞の栞 DNAを PI染色した結果を、 図 18Bは、 U2 OS现胞の现 胞内の h— 1 (3) mbtを染色した結果を瀺す顕埮鏡写真である。 図 18Cは、 现胞内の栞 DNAず h— 1 (3) mbtずを同時に芳察した結果を瀺す顕埮鏡写 真である。 これらの図から、 h— 1 (3) mbtタむプ 2は、 タむプ 1に比べお、 より 凝集した栞 DN Aに沿っお発珟するこずが分かった。
<実斜䟋 13 >染色䜓マッピング
h-1 (3) mb tの党長遺䌝子の染色䜓マッピングを行った。 h— 1 (3) mb tの遺䌝子の䞀郚をプロヌブずした F I SHおよび P CR法に基づいた r a d iat ion hybr id (リサ䞀チゞ゚ネテむクス瀟補 のいずれの解析 法においおも結果は䞀臎し、 染色䜓 20q l 1に䜍眮づけられた。 く実斜䟋 14>m— 1 (3) mb tの各組織における発珟
マりス 1 (3) mb t遺䌝子の発珟に぀いお、 マりス 成䜓 の各組織のポ リ A + RNA (mRNA) およびマりス胎児のポリ A + RN A (mRNA) それ ぞれに぀いお、 各 2 gをブロットしたメンブレン Mous e Ti s sue Northern Blot (クロ䞀ンテック瀟補  ならびに暙識化した党 長の m—l (3) mbt遺䌝子を甚いお、 実斜䟋 4ず同様しおノヌザンプロット ハむブリダむれ䞀ション法による解析を行った。 マりス成䜓各組織に぀いおの結果の写真を、 図 19に瀺す。 写真より、 m— 1 (3) mbt (6. 3kbのバンド を心筋および骚栌筋特異的に認めた。 マりス胎児に぀いおの結果の写真を図 20に瀺す。 写真より、 胎児では、 䜓性 5日頃から筋特異的 b—ァクチンの発珟ず䞊行しお 6. 3 kbのバンドの発珟を 認めた。 く実斜䟋 15 >組み換え m—l (3) mbt蛋癜質の䜜補
実斜䟋 6ず同様にしお、 COS现胞に m—l (3) mbt遺䌝子を導入し、 圢質転換䜓を䜜補し、 該圢質転換䜓に組み換え m— 1 (3) mbtを䜜補させた c -
<実斜䟋 16 >m- 1 (3) mb tを認識する抗䜓の䜜補
配列衚の配列番号 7に蚘茉の m_ 1 (3) mb tのアミノ酞配列の C末端郚 分である 804䜍から 826䜍たでのアミノ酞配列の N末端にシスティン C) を付加したアミノ酞配列である䞋蚘のアミノ酞配列 C (配列衚の配列番号 19に 蚘茉の配列 からなるペプチドをそれぞれ合成し、 実斜䟋 8ず同様にしお、 m— 1 (3) mbtを認識する抗䜓を䜜補した。
配列 C KLGPALKIYNAILMFKNNDDVFK <実斜䟋 17>m— 1 (3) mbt抗䜓の反応性の確認
実斜䟋 10ず同様にしお、 COS现胞に䜜補させた m—l (3) mbt蛋癜 質を SD S— PAGE電気泳動した。 電気泳動したゲルをトランスブロットシス テム マリ゜ル瀟補 を甚い、 泳動された蛋癜質をニトロセルロヌスメンプレン に転写した。
ニトロセルロヌスメンプレンをブロック゚ヌス 倧日本補薬瀟補 に浞し、 1 時間静眮しおブロッキングした。 その埌、 0. 05%Twe e n20/PB Sで 5分間、 2回掗浄した。
実斜䟋 16で䜜補した抗䜓および抗 My c抗䜓それぞれに぀いお実斜䟋 9ず 同様にしお、 り゚スタンブロヅトハむブリダィれ䞀シペン法により反応性を確認 した。
この結果を図 21瀺す。 図から分かるように、 抗䜓を反応させた結果、 ヒトず ほが同様のサむズ 120kDの䜍眮 にバンドが芳察され、 実斜䟋 16で䜜補 した抗䜓が m—l (3) mbtを認識するこずが確認された。 <実斜䟋 18>m— 1 (3) mbtの組織染色
マりス现胞株 SWI SS 3T3を、 実斜䟋 16で䜜補した抗䜓により、 実 斜䟋 12ず同様にしお、 組織染色した。
結果の写真を図 22 A— Dに瀺す。 図 22 Aは、 现胞の顕埮鏡写真である。 図 22Bは、 同现胞䞭の m— 1 (3) mb tを染色した結果である。 図 22 Cは、 同现胞䞭の DNAを P Iで染色した結果である。 図 22Dは、 図 22Aず図 22 Bずを重ねた結果である。 図から分かるように、 栞クロマチンが染色された。
<実斜䟋 19 > 1 (3) mbt遺䌝子の発珟がもたらす现胞圢質倉化 〇 6/ 0 系にょり 1 (3) mbtを発珟させお、 现胞圢態の倉化を芳 察した。 Cr e/LoxP系に぀いおは、 東京倧孊医科孊研究所遺䌝子解析斜蚭 のむン倕䞀ネットのホヌムペヌゞ (h t t p  / /www. ims. u - t o k y o . a c . j p/ i d e n s h i/h pma i n. html) からも情報が埗 られる。
◩ N/OFF発珟甚カセッ トプラスミ ド pCALNLw (東京倧孊医科孊研 究所遺䌝子解析斜蚭から譲受した に] —1 (3) mbtタむプ 1 cDNAおよ びタむプ 2 c DNAをそれぞれ組み蟌み、 それぞれ h— 1 (3) mbtの発珟が 認められない VA13および U 25 1现胞株に導入しお安定発珟株を埗た。 この 现胞株に察しお C r eリコンピナ䞀れ発珟アデノりィルスを感染させ、 现胞圢態 の倉化を芳察した。 その結果、 2皮の现胞株ならびにタむプ 1およびタむプ 2の いずれでも倚栞现胞の出珟が認められた。
この結果から、 1 (3) mb t遺䌝子および 1 (3) mb tは现胞分裂に関 䞎しおおり、 1 (3) mb tの発珟が癌化における重芁な過皋であるこずが分か ぀た。
産業䞊の利甚可胜性
本発明の 1 (3) mbt、 その遺䌝子たたは 1 (3) mb tを認識する抗䜓 は悪性腫瘍の圢成の機序解析に有効である。
たた、 1 (3) mbt遺䌝子および 1 (3) mbtは、 栞内での転写および 现胞分裂に関䞎する物質である。

Claims

請求の範囲
1. 配列衚の配列番号 1、 3、 5たたは 7のいずれかに蚘茉のァミノ 酞配列を少なくずも有するァミノ酞配列からなる蛋癜質。
2. 配列衚の配列番号 1、 3、 5たたは 7に蚘茉のアミノ酞配列にお ける䞀たたは耇数のアミノ酞配列を眮換、 欠倱たたは付加しおなるアミノ酞配列 からなる蛋癜質。
3. 請求項 1たたは 2に蚘茉の蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチド。
4. 請求項 3に蚘茉のポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列 からなるアンチセンスポリヌクレオチドたたは該アンチセンスポリヌクレオチド の誘導䜓。
5. 請求項 3に蚘茉のポリヌクレオチドたたは請求項 4に蚘茉のァン チセンスポリヌクレオチドのうちの䞀郚であっお、 連続する 12塩基以䞊からな るポリヌクレオチド。
6. 化孊修食された請求項 3ないし 5のいずれか䞀項に蚘茉のポリ ヌクレオチド。
7. 配列衚の配列番号 2、 4、 6たたは 8のいずれかに蚘茉の塩基 配列からなる D N Aのホモログである c D N Aを取埗する方法であっお、 請求項 4ないし 6のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチドをプロ䞀ブずしお、 cDNAラ ィブラリ䞀から該プロヌブずしたポリヌクレオチドずハむプリダむズする c D N Aを取埗する方法。
8. プロヌブずするポリヌクレオチドが、 配列衚の配列番号 2に蚘茉 の塩基配列の 865番目の Tから 1809番目の Cたでの郚分の塩基配列からな る DNA、 配列衚の配列番号 6に蚘茉の塩基配列の 1062番目の Tから 200 6番目の Cたでの郚分の塩基配列からなる DNAたたは配列衚の配列番号 8に蚘 茉の塩基配列の 861番目の䞁から 1805番目の Cたでの郚分の塩基配列から なる DN Aのいずれかである請求項 7に蚘茉の cDN Aを取埗する方法。
9. 配列衚の配列番号 2、 4、 6たたは 8のいずれかに蚘茉の塩基配 列からなる DN Aのホモログであっお、 請求項 7たたは 8に蚘茉の方法によっお 取埗される cDNA。
10. 請求項 1に蚘茉の蛋癜質のホモログであっお、 請求項 9に蚘 茉の cDNAがコ䞀ドするアミノ酞配列からなる蛋癜質。
11. 請求項 1、 2たたは 10のいずれか䞀項に蚘茉の蛋癜質を認
BB Ÿ る几䜓。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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GATEFF E., LOEFFLER T., WISMAR J.: "A TEMPERATURE-SENSITIVE BRAIN TUMOR SUPPRESSOR MUTATION OF DROSOPHILA MELANOGASTER: DEVELOPMENTAL STUDIES AND MOLECULAR LOCALIZATION OF THE GENE.", MECHANISMS OF DEVELOPMENT., ELSEVIER SCIENCE IRELAND LTD., IE, vol. 41., 1 January 1993 (1993-01-01), IE, pages 15 - 31., XP002915043, ISSN: 0925-4773, DOI: 10.1016/0925-4773(93)90052-Y *
See also references of EP1004596A4 *
WISMAR J., ET AL.: "THE DROSOPHILA MELANOGASTER TUMOR SUPPRESSOR GENE LETHAL(3) MALIGNANT BRAIN TUMOR ENCODES A PROLINE-RICH PROTEIN WITH A NOVEL ZINC FINGER.", MECHANISMS OF DEVELOPMENT., ELSEVIER SCIENCE IRELAND LTD., IE, vol. 53., 1 January 1995 (1995-01-01), IE, pages 141 - 154., XP002915042, ISSN: 0925-4773, DOI: 10.1016/0925-4773(95)00431-9 *

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