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WO1999064868A1 - Nouveau procede de dosage de la troponine i cardiaque - Google Patents

Nouveau procede de dosage de la troponine i cardiaque Download PDF

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Publication number
WO1999064868A1
WO1999064868A1 PCT/FR1999/001351 FR9901351W WO9964868A1 WO 1999064868 A1 WO1999064868 A1 WO 1999064868A1 FR 9901351 W FR9901351 W FR 9901351W WO 9964868 A1 WO9964868 A1 WO 9964868A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acids
troponin
antibodies
cardiac troponin
cardiac
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1999/001351
Other languages
English (en)
Inventor
Catherine Larue
Sylvie Trinquier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bio Rad Innovations SAS
Original Assignee
Pasteur Sanofi Diagnostics SA
Bio Rad Pasteur SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pasteur Sanofi Diagnostics SA, Bio Rad Pasteur SA filed Critical Pasteur Sanofi Diagnostics SA
Publication of WO1999064868A1 publication Critical patent/WO1999064868A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein

Definitions

  • the present invention relates to a new method for assaying cardiac troponin I in biological media making it possible to assay troponin I several days after biological sampling.
  • troponin is a myofibrillary protein complex, consisting of three proteins, troponins I, T and C. This protein complex helps to regulate the contraction of muscle by the Ca 2+ ion, by interacting with the myosin and actin. More precisely, it is known that when a nerve impulse arrives at the level of the motor plaque of a muscle, there is generation of an action potential which is transmitted to the sarcoplasmic reticulum. Ca 2+ is then released into the cytosol and binds to troponin C, which leads to a strengthening of the interaction between troponin I and troponin C and, consequently, a change in conformation of the troponin I, T complex. , C. There is then release of the actin-myosin interaction sites, which allows the muscle to contract.
  • the muscle When the muscle is damaged, irreversibly, it is the heart muscle, during myocardial necrosis following a myocardial infarction, or it is the skeletal muscle during prolonged physical exertion, the released troponins appear (more or less quickly) into the bloodstream.
  • the dosage of troponin has recently been recommended for the early diagnosis of myocardial infarction, whether that of troponin T in Circulation (1991), 83, pp. 902-912, or troponin I in Am. Heart J. (1987), 1_W, pp. 1333-1344, and Molecular Immunology (1992), 29 (2). pp. 271-278.
  • the assay of cardiac troponin T has been proposed to measure the success of thrombolytic therapy following a myocardial infarction in Br. Heart J., (1994), J ⁇ , pp. 242-248, as well as the assay of skeletal troponin I for the measurement of damage to skeletal muscles (D. Rama et al, Clinical Chemistry (1996), 42 no. 12. p. 2033). It should be noted that the dosage of different cardiac and skeletal troponins is today a very useful means for the diagnosis of various human and animal pathologies.
  • Patent application WO 96/22535 also describes an immunoenzymatic assay method of the sandwich type allowing the quantitative assay of cardiac troponin I.
  • This process uses for the enzymatic revelation a chemiluminescent substrate, chosen from derivatives of a diacylhydrazine and a derivative of 1, 2-dioxetane and can be carried out either by a manual system (diagnostic assay kit), or by an automated system .
  • a manual system diagnostic assay kit
  • Patent application WO 96/33415 also describes sandwich-type immunoassays for evaluating the amounts of troponin I and T or of troponin I, C and / or T complexes in biological media.
  • cardiac troponin I Being able to measure cardiac troponin I several days after collection is of obvious interest to the clinician. For example, if the tube is not dosed immediately, there is no doubt about storage. The same applies when a new confirmation assay must be carried out. The same sample can be dosed several times without any storage problems.
  • the present invention therefore relates to a method for assaying cardiac troponin I of the sandwich type, using at least two monocional antibodies recognizing the epitopic region comprised between amino acids 27 to 30 and amino acid 157, preferably between the acids amino acids 27 to 30 and amino acids 90 to 94, more particularly between amino acids 27 to 30 and amino acids 87 to 88 of the cardiac troponin I sequence.
  • This pair of antibodies is used in patent application EP 752 426 for the determination of troponin I using a stable molecule serving as a standard, consisting of bovine serum albumin coupled to two peptides: a peptide of sequence 27-40 of troponin I and a peptide of sequence 69-85 of troponin I.
  • the present invention also relates to the use of at least two monocional antibodies which recognize the epitopic region comprised between amino acids 27 to 30 and amino acid 157, preferably between amino acids 27 to 30 and amino acids 90 to 94 of cardiac troponin I, for the implementation of a sandwich type assay method of cardiac troponin I having undergone proteolysis, or cardiac troponin I taken several days previously.
  • monocional antibodies which recognize the epitopic region comprised between amino acids 27 to 30 and amino acid 157, preferably between amino acids 27 to 30 and amino acids 90 to 94 of cardiac troponin I, for the implementation of a sandwich type assay method of cardiac troponin I having undergone proteolysis, or cardiac troponin I taken several days previously.
  • the 11 E12 antibodies described by C. Lame et al in Molecular Immunology (1992), vol. 29 n ° 2. pp. 271-278. This antibody recognizes the troponin I epitope located between amino acids 31 to 34 of the troponin I sequence.
  • the monoclonal antibody 10F4 (described by G. Ferrieres et al. In Clinical Chemistry (1998), vol. 44 n ° 3, pp. 487- 493) which recognizes the epitope located between amino acids 34 to 37 of the cardiac troponin I sequence or the antibody 19C7 (marketed by Hytest Turku, Finland) which recognizes the epitope located between amino acids 41 to 47 or still the antibodies 16E2, 17F3, 16A11 (marketed by Hytest Turku, Finland) and 8E10 (described by G. Ferrieres et al. in Clinical Chemistry (1998), vol. 44 no 3. pp. 487-493) epitope located between amino acids 88 to 94 of the cardiac troponin I sequence.
  • antibodies which can be used are the antibody 5F1, which recognizes the epitope of troponin I located between amino acids 91-94 of its sequence and the antibodies 13H7 and 20C5 which identify the epitope located between amino acids 91 100.
  • the cardiac decomposes in biological media both from its N-terminus and from its C-terminus. So in order to be able to assay troponin I accurately, it is necessary to choose antibodies which recognize epitopes located in the most stable part of troponin I. Such antibodies are those, as indicated above, which recognize epitopes located between amino acids 27 to 30 and 157, preferably between amino acids 27 to 30 and amino acids 90 to 94, more particularly between amino acids 27 to 30 and amino acids 87 to 88 of the cardiac troponin I sequence.
  • the assay methods according to the invention are immunoassays of the sandwich type, using at least two antibodies, as described above, and can be carried out in one or more stages (two stages, three stages, etc.).
  • the detection can be carried out in an immunoenzymatic manner using either chromogenic substrates such as tetramethylbenzydine or p-nitrophenylphosphate, or chemiluminescent substrates such as 1, 2-dioxetane derivatives or diacylhydrazine derivatives.
  • any suitable enzyme can be used, such as, for example, alkaline phosphatase or peroxidase.
  • the invention also relates to immunoassay kits for cardiac troponin I using at least two monocional antibodies recognizing the epitopic region of cardiac troponin I located between amino acids 27 to 30 and amino acid 157, preferably between amino acids 27 to 30 and amino acids 90 to 94, more particularly between amino acids 27 to 30 and amino acids 87 to 88 of the cardiac troponin I sequence.
  • the automated system used for the enzyme immunoassay is the "Access ® immunoassay" system, marketed by Beckman.
  • the assay is carried out as follows: into the assay cup are introduced 50 ⁇ l of the sample to be assayed, 25 ⁇ l of a mouse immunoglobulin solution at 4 mg / ml, 10 ⁇ l of succinate buffer and 50 ⁇ l ferric latex beads (Rhône Poulenc ref. MI-070/60) to which is fixed, by connections covalent, the first cardiac anti-troponin I monoclonal antibody used for the implementation of the method.
  • the mixture is incubated for 5 minutes at 37 ° C., then the ferric latex beads are separated using a magnetic field. Washing is carried out using a Tris pH 8 buffer solution, and then 200 ⁇ l of Lumi-Phos (R) 530 substrate are added. The development is carried out at 37 ° C. and the luminescence generated by the reaction is measured. with a luminometer.
  • the 10F4 antibody was fixed on the ferric latex beads.
  • the couple 10F4 / 8E10 it is the antibody 8E10 which was fixed on the ferric latex beads
  • the couple 7F4 / 8E10 it is the antibody 8E10 which is fixed on the microbeads.
  • the antibody 10B11 supplied by Hytest recognizes the epitope located between amino acids 14 to 22 of the cardiac troponin I sequence and the antibody 7F4 supplied by the same company recognizes the epitope situated between amino acids 190 to 194.
  • the epitopes recognized by the antibodies 8E10 and 10F4 have been described previously.
  • the test described in example 1 was repeated with a certain number of pairs of monocional antibodies in order to refine the localization of the sites of the cardiac troponin I, at which the cleavage takes place, which leads to the degradation of cardiac troponin I after storage of biological samples containing it.
  • the different antibodies used, as well as the position of the epitope that they recognize on the troponin I sequence are given in Table II.
  • MAb MP antibody linked to ferric latex microbeads
  • mAb PAL antibody linked to alkaline phosphatase

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Abstract

La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de la troponine I cardiaque dans les milieux biologiques permettant de doser la troponine I plusieurs jours après le prélèvement biologique. Ce procédé met en oeuvre des couples d'anticorps monoclonaux reconnaissant la région épitopique entre les acides aminés (27 à 30) et l'acide aminé (157), de préférence entre les acides aminés (27 à 30) et les acides aminés (90 à 94), plus particulièrement entre les acides aminés (27 à 30) et les acides aminés (87 à 88), de la séquence de la troponine I cardiaque.

Description

NOUVEAU PROCÈDE DE DOSAGE DE LA TROPONINE I CARDIAQUE
La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de la troponine I cardiaque dans les milieux biologiques permettant de doser la troponine I plusieurs jours après le prélèvement biologique.
On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire, constitué de trois protéines, les troponines I, T et C. Ce complexe protéique permet de contribuer à la régulation de la contraction du muscle par l'ion Ca2+, en interagissant avec la myosine et l'actine. De façon plus précise, on sait que lorsqu'un influx nerveux arrive au niveau de la plaque motrice d'un muscle, il y a génération d'un potentiel d'action qui est transmis au réticulum sarcoplasmique. Le Ca2+ est alors libéré dans le cytosol et se fixe sur la troponine C, ce qui entraîne un renforcement de l'interaction entre la troponine I et la troponine C et, par suite, un changement de conformation du complexe troponine I, T, C. Il y a alors libération des sites d'interaction actine - myosine, ce qui permet le mouvement de contraction du muscle.
Lorsque le muscle est endommagé, de manière irréversible que ce soit le muscle cardiaque, lors d'une nécrose myocardique consécutive à un infarctus du myocarde, ou que ce soit le muscle squelettique lors d'efforts physiques prolongés, les troponines alors libérées apparaissent (plus ou moins rapidement) dans la circulation sanguine.
Ainsi, on a récemment préconisé le dosage de la troponine pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde, que ce soit celui de la troponine T dans Circulation (1991), 83, pp. 902-912, ou de la troponine I dans Am. Heart J. (1987), 1_W, pp. 1333-1344, et Molecular Immunology (1992), 29 (2). pp. 271-278. De même, on a proposé le dosage de la troponine T cardiaque pour mesurer le succès de la thérapie thrombolytique suite à un infarctus du myocarde dans Br. Heart J., (1994), J±, pp. 242-248, ainsi que le dosage de la troponine I squelettique pour la mesure du dommage des muscles squelettiques (D. Rama et al, Clinical Chemistry (1996), 42 n° 12. p. 2033). Il est à noter que le dosage des différentes troponines cardiaques et squelettiques est aujourd'hui un moyen très utile pour le diagnostic de diverses pathologies humaines et animales.
On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la détermination de la troponine I cardiaque. Larue C. et al dans Mol. Immunol. (1992), 29(2). pp. 271-278 et Clin. Chem. (1993), 39/6. pp. 972-979 décrivent un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich qui utilise pour la révélation enzymatique le substrat chromogène tetraméthylbenzydine (TMB)- H2O2. Après la révélation, la lecture de l'absorbance est faite à 450 nm et la limite de détection, selon les auteurs, est de 0,2 μg/l. Une trousse de dosage mettant en oeuvre cette méthode est disponible dans le commerce (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France). La limite de détection de cette trousse est de l'ordre de 0,03 à 0,04 μg/l (J. Mair et al. Clin. Chim. Acta. (1996), 245, pp. 19- 38).
Un autre procédé immunoenzymatique de la troponine I est décrit par Bodor et al. Ce procédé permet de détecter cette dernière à des concentrations de l'ordre de 1 ,5 à 3,1 μg/l (Bodor et al, Clin. Chem. (1992), 38/11. p. 2203-2214 ; Adams J. et al, Circulation (1993), 88(1). pp. 101-106). Ce dosage utilise pour la révélation enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, le p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm.
La demande de brevet WO 96/22535 décrit également un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich permettant le dosage quantitatif de la troponine I cardiaque. Ce procédé utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent, choisi parmi des dérivés d'une diacylhydrazine et un dérivé de 1 ,2-dioxetane et peut être réalisé soit par un système manuel (kit de dosage de diagnostic), soit par un système automatisé. Selon le mode de réalisation, il est possible d'effectuer soit un dosage en un temps, soit un dosage en deux temps.
La demande de brevet WO 96/33415 décrit également des procédés d'immunodosage de type sandwich permettant d'évaluer les quantités de la troponine I et T ou de complexes de troponine I, C et/ou T dans les milieux biologiques.
Plus récemment, il a été démontré que la troponine I cardiaque, lorsqu'elle est contenue dans des sérums des patients, subit une dégradation rapide. En effet, Katrukha A. et al (« Stability of cardiac troponin I in human sérum » IFCC, Basel 1997) ont observé que la troponine I cardiaque telle qu'elle est dans le sérum subit une dégradation d'environ 81 % quand elle est conservée à 7°C pendant 10 jours.
Il a maintenant été trouvé que pour les essais de type sandwich, en fonction des anticorps monoclonaux utilisés pour le dosage, il est possible de surmonter les problèmes de la dégradation de la troponine I cardiaque dans les milieux biologiques et de pouvoir doser cette dernière dans le plasma et le sérum de malades avec précision même plusieurs jours après le prélèvement.
Le fait de pouvoir doser la troponine I cardiaque plusieurs jours après le prélèvement présente un intérêt évident pour le clinicien. Par exemple, si le tube n'est pas dosé immédiatement, il n'y a pas de doute quant à la conservation. Il en est de même lorsqu'un nouveau dosage de confirmation doit être effectué. Le même prélèvement peut être dosé plusieurs fois sans que des problèmes de conservation se posent.
La présente invention concerne donc un procédé de dosage de la troponine I cardiaque de type sandwich, mettant en oeuvre au moins deux anticorps monocionaux reconnaissant la région épitopique comprise entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94, plus particulièrement entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88 de la séquence de la troponine I cardiaque.
Est exclu le couple d'anticorps décrit dans la demande de brevet EP 752
426, l'un des anticorps reconnaissant spécifiquement l'épitope 27-40 et l'autre reconnaissant spécifiquement l'épitope 69-85 de la séquence de la troponine I cardiaque.
Ce couple d'anticorps est utilisé dans la demande de brevet EP 752 426 pour le dosage de la troponine I à l'aide d'une molécule stable servant d'étalon, constituée par de la sérumalbumine bovine couplée à deux peptides : un peptide de séquence 27-40 de la troponine I et un peptide de séquence 69-85 de la troponine I.
La présente invention vise également l'utilisation d'au moins deux anticorps monocionaux qui reconnaissent la région épitopique comprise entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94 de la troponine I cardiaque, pour la mise en œuvre d'un procédé de dosage de type sandwich de la troponine I cardiaque ayant subi une protéolyse, ou de la troponine I cardiaque prélevée plusieurs jours auparavant. Parmi les anticorps d'intérêt conformément à la présente invention, on peut citer les anticorps 11 E12 décrits par C. Lame et al dans Molecular Immunology (1992), vol. 29 n° 2. pp. 271-278. Cet anticorps reconnaît l'épitope de la troponine I situé entre les acides aminés 31 à 34 de la séquence de la troponine I. Cette séquence a été décrite par Vallins et al dans FEBS Letters (1990), vol. 270 n° 1. 2, pp. 57-61. D'autres anticorps monocionaux, qui reconnaissent le même epitope, sont les anticorps 19G5, 17F11 et 14C3.
Lors des procédés de dosage, selon l'invention, on peut également mettre en oeuvre l'anticorps monoclonal 10F4, (décrit par G. Ferrieres et al. dans Clinical Chemistry (1998), vol. 44 n°3, pp.487-493) qui reconnaît l'épitope situé entre les acides aminés 34 à 37 de la séquence de la troponine I cardiaque ou l'anticorps 19C7 (commercialisé par Hytest Turku, Finlande) qui reconnaît l'épitope situé entre les acides aminés 41 à 47 ou encore les anticorps 16E2, 17F3, 16A11 (commercialisés par Hytest Turku, Finlande) et 8E10 (décrit par G. Ferrieres et al. dans Clinical Chemistry (1998), vol. 44 n°3. pp.487-493) qui reconnaissent l'épitope situé entre les acides aminés 88 à 94 de la séquence de la troponine I cardiaque.
D'autres anticorps pouvant être utilisés sont l'anticorps 5F1 , qui reconnaît l'épitope de la troponine I situé entre les acides aminés 91-94 de sa séquence et les anticorps 13H7 et 20C5 qui identifient l'épitope situé entre les acides aminés 91 à 100.
Les différents résultats des essais effectués ont démontré que la troponine
I cardiaque se décompose dans les milieux biologiques aussi bien à partir de son extrémité N-terminaie qu'à partir de son extrémité C-terminale. Donc pour pouvoir doser la troponine I de manière exacte, il faut choisir des anticorps qui reconnaissent des épitopes situés dans la partie de la troponine I la plus stable. De tels anticorps sont ceux, comme indiqué précédemment, qui reconnaissent des épitopes situés entre les acides aminés 27 à 30 et 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94, plus particulièrement entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88 de la séquence de la troponine I cardiaque.
Les procédés de dosage selon l'invention sont des immunodosages de type sandwich, mettant en œuvre au moins deux anticorps, tels que décrits précédemment, et peuvent être réalisés en un ou plusieurs temps (deux temps, trois temps, etc). La détection peut être effectuée de manière immunoenzymatique en mettant en oeuvre soit des substrats chromogènes comme la tetraméthylbenzydine ou le p-nitrophénylphosphate, soit des substrats chimiluminescents tels que les dérivés de 1 ,2-dioxétane ou les dérivés de diacylhydrazine.
Comme enzymes, on peut utiliser toute enzyme appropriée comme par exemple la phosphatase alcaline ou la peroxydase.
L'invention vise également des trousses d'immunodosage de la troponine I cardiaque mettant en oeuvre au moins deux anticorps monocionaux reconnaissant la région épitopique de la troponine I cardiaque située entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94, plus particulièrement entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88 de la séquence de la troponine I cardiaque.
Est là encore exclu le couple d'anticorps décrit dans la demande de brevet EP 752 426, l'un des anticorps reconnaissant spécifiquement l'épitope 27-40 et l'autre reconnaissant spécifiquement l'épitope 69-85 de la séquence de la troponine I cardiaque.
Les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif pour illustrer l'invention.
EXEMPLE 1
Dosage de la troponine I cardiaque en utilisant différents couples d'anticorps
Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système "Access® immunoassay", système commercialisé par Beckman. Le dosage est effectué de la manière suivante : dans la cupule du dosage sont introduits 50 μl de l'échantillon à doser, 25 μl d'une solution d'immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10 μl de tampon succinate et 50 μl de billes de latex ferriques (Rhône Poulenc réf. MI-070/60) sur lesquelles est fixé, par des liaisons covalentes, le premier anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque utilisé pour la mise en oeuvre du procédé.
Après incubation pendant 5 minutes à 37°C, sont introduits 50 μl d'un conjugué constitué du deuxième anticorps anti-troponine I cardiaque, utilisé pour le dosage, et de la phosphatase alcaline (C = 5 μg/ml).
Le mélange est incubé pendant 5 minutes à 37°C, puis les billes de latex ferriques sont séparées à l'aide d'un champ magnétique. On procède au lavage à l'aide d'une solution tampon Tris pH 8, et on ajoute ensuite 200 μl de substrat Lumi-Phos (R) 530. La révélation est effectuée à 37°C et on mesure la luminescence générée par la réaction avec un luminomètre.
Pour la gamme d'étalonnage, on utilise des solutions de la troponine I cardiaque humaine.
Comme couples d'anticorps monocionaux, on utilise les couples
10B11/10F4, 7F4/8E10 et 10F4/8E10. Pour le couple 10B11/10/F4, l'anticorps 10F4 a été fixé sur les billes de latex ferriques. Pour le couple 10F4/8E10, c'est l'anticorps 8E10 qui a été fixé sur les billes de latex ferriques, et pour le couple 7F4/8E10, c'est l'anticorps 8E10 qui est fixé sur les microbilles. L'anticorps 10B11 fourni par Hytest reconnaît l'épitope situé entre les acides aminés 14 à 22 de la séquence de la troponine I cardiaque et l'anticorps 7F4 fourni par la même société reconnaît l'épitope situé entre les acides aminés 190 à 194. Les épitopes reconnus par les anticorps 8E10 et 10F4 ont été décrits précédemment.
Lors de cet essai ont été testés 3 pools de sérums positifs S1 , S2 et S3. Par ailleurs, du sérum humain a été surchargé, soit avec de la troponine I cardiaque humaine, soit avec un complexe tertiaire des troponines ITC. La troponine I cardiaque humaine et le complexe des troponines ITC ont été fournis par Hytest. Les deux échantillons ont été nommés respectivement S4 et S5. Les échantillons ont été dosés immédiatement (T0) et après conservation pendant 8 jours, soit à température ambiante, soit après conservation pendant 8 jours à 4°C.
Les résultats de cette étude sont donnés dans le tableau I. Tableau I
Figure imgf000009_0001
C 8 jours TA o/0 . (Concentration trouvée après 8 jours de conservation T0 à température ambiante / Concentration trouvée à
T0) x 100.
* C 8 jours 4°C o/0 (Concentration trouvée après 8 jours de conservation T0 à 4°C/Concentration trouvée à T0) x 100.
*** Immunoréactivité trop basse non exploitable.
Les données du tableau I démontrent que le couple 10F4/8E10 donne de très bons résultats.
Une augmentation de l'immunoréactivite est observée au cours du temps sur l'échantillon S4, augmentation due probablement à la dissociation du complexe des troponines ITC. Le couple 10B11/10F4 donne de mauvais résultats, malgré des épitopes très proches, reconnus par les deux anticorps, ce qui démontre que ces deux épitopes se trouvent d'un côté et de l'autre du site, où le clivage de la troponine I cardiaque est effectué, lors de sa dégradation ( côté N-terminal).
Des résultats insatisfaisants ont également été observés pour le couple 7F4/8E10. L'anticorps 7F4 reconnaît la partie C-terminale de la troponine I qui doit se dégrader lors de la conservation des échantillons.
EXEMPLE 2
Etude de la dégradation de la troponine I
L'essai décrit dans l'exemple 1 a été répété avec un certain nombre de couples d'anticorps monocionaux dans le but d'affiner la localisation des sites de la troponine I cardiaque, auxquels le clivage a lieu, qui conduit à la dégradation de la troponine I cardiaque après un certain temps de conservation des échantillons biologiques la contenant. Les différents anticorps utilisés, ainsi que la position de l'épitope qu'ils reconnaissent sur la séquence de la troponine I sont donnés dans le tableau II.
La localisation de différents épitopes a été effectuée selon la technique décrite par G. Ferrieres et al. dans Clinical Chemistry (1998), vol. 44 n°3. pp.487- 493.
Tabieau II
Figure imgf000011_0001
Les résultats obtenus avec les différents couples d'anticorps sont donnés dans le tableau III.
Les résultats du tableau III démontrent que les couples d'anticorps présentant la meilleure stabilité sont les couples qui reconnaissent des épitopes situés entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157 de la séquence de la troponine I cardiaque humaine. Grâce aux anticorps 4C2 et 14G5, il a été confirmé le clivage de la troponine I cardiaque à l'extrémité N-terminale. A l'extrémité C-terminale, le clivage devrait avoir lieu après l'acide aminé 157. Tableau III
Figure imgf000012_0001
*AcM MP : anticorps lié aux microbilles de latex ferriques **AcM PAL : anticorps lié à la phosphatase alcaline
Rapport de concentration (C) trouvé C après conservation pendant 24 heures à température ambiante / C à T0. Rapport de concentration (C) trouvé C après conservation pendant 7 jours à 4°C / C à T0. nd : non déterminé

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque de type sandwich, mettant en oeuvre au moins deux anticorps monocionaux qui reconnaissent la région épitopique comprise entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94, à l'exception d'un couple d'anticorps dont l'un reconnaît spécifiquement l'épitope 27- 40 et l'autre reconnaît spécifiquement l'épitope 69-85 de la séquence de la troponine I cardiaque.
2. Procédé de dosage selon la revendication 1 , mettant en oeuvre au moins deux anticorps monocionaux qui reconnaissent la région épitopique comprise entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88.
3. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque de type sandwich, mettant en oeuvre au moins deux anticorps choisis parmi les anticorps 11E12, 19G5, 17F11 , 14C3, 10F4, 19C7, 16E2, 17F3, 16A11 , 8E10, 5F1 , 13H7 et 20C5.
4. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque de type sandwich selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 réalisé en un ou plusieurs temps.
5. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, de type sandwich immunoenzymatique, mettant en oeuvre des substrats chromogènes ou des substrats chimiluminescents.
6. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, de type sandwich immunoenzymatique, mettant en oeuvre comme enzyme la phosphatase alcaline ou la peroxydase.
7. Trousse d'immunodosage de la troponine I cardiaque comportant au moins deux anticorps monocionaux qui reconnaissent la région épitopique de la troponine I cardiaque située entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94, plus particulièrement entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88, à l'exception d'un couple d'anticorps dont l'un reconnaît spécifiquement l'épitope 27- 40 et l'autre reconnaît spécifiquement l'épitope 69-85 de la séquence de la troponinel cardiaque.
8. Utilisation d'au moins deux anticorps monocionaux qui reconnaissent la région épitopique comprise entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94 de la troponine I cardiaque, pour la mise en œuvre d'un procédé de dosage de type sandwich de la troponine I cardiaque ayant subi une protéolyse.
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