WO1999064587A1 - Polypeptides possedant une activite de type beta-secretase - Google Patents
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Classifications
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- the present invention relates to new polypeptides and their pharmaceutical use. More particularly, the present invention relates to new polypeptides having a ⁇ -secretase activity, characterized in that they are capable of specifically cleaving the natural precursor of the ⁇ -amyloid peptide (APP).
- APP ⁇ -amyloid peptide
- Alzheimer's disease exhibit characteristic symptoms of memory impairment, loss of intellectual capacity and cognitive functions. These pathological changes are accompanied by neuronal atrophy, significant depletion of a certain type of receptor and also a reduction in synaptic connections.
- This syndrome involves the presence of senile plaques and neurofibrillary degeneration in very large quantities, mainly in the cerebral cortex, the hippocampus, the tonsil nucleus and in cortical blood vessels.
- senile plaques are spherical structures which are slowly established over a decade in the extracellular spaces of the hippocampus, the cortex and other brain regions. Their major constituent is the amyloid ⁇ peptide (A ⁇ ) associated with other abnormal proteins. These structures are surrounded by axons and abnormal neurons.
- a ⁇ amyloid ⁇ peptide
- Neurofibrillary degenerations are due to an accumulation of dense bundles of abnormal fibers in the cytoplasm of certain neurons and mainly pyramidal cells of the cortex. These neurofibrillary tangles are made up of a particular form of the protein tau which, associated with other proteins, gives pairs of helical neurofilaments which disturb the conduction of nerve impulses. Familial forms of this disease have been identified and seem to result from various genetic modifications, all of which cause the abnormal accumulation of the A ⁇ peptide. The latter, which are very heterogeneous, have in particular been associated with various mutations on chromosomes 1,14 and 21. The latter has all the more aroused the interest that it carries the gene coding for the precursor protein of A ⁇ . We therefore understand the early onset (55 years) of Alzheimer's disease in subjects with Down Syndrome (Down's syndrome).
- the human A ⁇ peptide is generated by proteolytic cleavages of its precursor (APP) at the Met 596 -Asp 597 and Val 636 - Ile 637 sites.
- the released molecule consists of 39 (to 42) amino acids, the protein sequence of which is as follows:
- the A ⁇ peptide is a natural product secreted by cells and detectable in the blood and cerebrospinal fluid. Although this peptide is neurotoxic, its production is however not sufficient for the formation of amyloid plaques. A altered "processing" or an overexpression of its precursor would predispose to the deposition of A ⁇ in the brain.
- the primary transcript of the ⁇ -amyloid peptide (APP) precursor undergoes alternative splicing to generate mRNAs encoding at least 5 isoforms of 563, 695, 714, 751 and 770 amino acids (aa), expressed ubiquitously in the tissues and the rate of which differs depending on the cell type.
- APP ⁇ -amyloid peptide
- the APP695 and 751 isoforms are however restricted exclusively to the central and peripheral nervous system (in particular at the level of synapses in astrocytes and neurons) where they can play a role in the physiological activity of synapses.
- the isoforms APP751, APP563 and APP770 contain a 56 a "insert" homologous to the protease inhibitor of the "Kunitz” type.
- the secreted form of 1 ⁇ PP751 is identical to nexin IL, a protease inhibitor involved in the regulation of extracellullary serine proteases.
- APP is a glycoprotein of around 120 kDa with the characteristics of an IL-type surface receptor. Although the actual function of APP has not yet been elucidated, studies have shown that this glycoprotein could play a role. role in the regulation of cell growth as well as in adhesion interactions in inflammation, regeneration and immune response.
- APP isoforms are inserted into the endoplasmic reticulum thanks to their "signal" sequence.
- the precursor is then targeted to the Golgi apparatus where it undergoes various post-translational modifications to be then anchored in the membrane.
- the APP Under the action of different proteases, the APP can then undergo various cleavages (see Figure 1), some of which are predominant: The protease activity, called ⁇ -secretase, cleaves within the sequence
- Protease activity called ⁇ -secretase. cleaves the peptide bond of the 96 5 97 doublet Met -Asp within the precursor to release an APP NH fragment - secreted terminal (designated sAPP ⁇ : soluble APP ⁇ ) completely deleted from A ⁇ .
- the 3rd protease activity could also act between residues Val 6 to Ile 637 of the precursor to generate a secreted APP ⁇ proform containing the ⁇ A.
- a ⁇ ⁇ -amyloid peptide
- proteases from humans, rats and monkeys have been studied by various authors and are believed to be involved in the maturation of the APP precursor.
- these enzymes mention may be made most particularly of serine proteases 1 and 2 (Abraham et al. (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 174, 790-796; Matsumoto et al. (1994), Biochemistry, 33, 3941-3948; Matsumoto et al. (1994), Neurosciences Letters, 195, 171-174) as well as G-like Cathepsin (Razzaboni et al. (1992), Brain Research, 589, 207-216).
- the present invention therefore results from the identification and characterization by the applicant of polypeptides having a catalytic activity vis-à-vis the precursor of the ⁇ -amyloid peptide (APP) of the ⁇ -secretase type. Unlike the other proteases identified, the polypeptides of the present invention have a specificity of action towards the natural form of APP.
- the present invention derives in particular from the discovery of a 70 kDa polypeptide capable of cleaving the non-mutated forms of APP.
- a first object of the invention therefore relates to polypeptides or their variants having a ⁇ -secretase type activity characterized in that they are capable of specifically cleaving the natural precursor of the ⁇ -amyloid peptide (APP).
- APP ⁇ -amyloid peptide
- variant designates any molecule having the same activity as the polypeptides of the invention, obtained by modification of a genetic and / or chemical nature of the peptide sequence.
- modification of a genetic and / or chemical nature one can hear any mutation, substitution, deletion, addition, and / or modification of one or more residues.
- Such variants can be generated for different purposes, such as that of improving its production levels, that of increasing its resistance to proteases, that of increasing and / or modifying its activity, or that of imparting new ones to it.
- biological properties may, for example, be made of chimeric polypeptides comprising an additional heterologous part linked to the end.
- the term variant also includes polypeptides homologous to the polypeptides described in the present invention, derived from other cellular sources and in particular from cells of other organisms.
- the substrate which cleaves the polypeptides of the invention does not have a mutation in its peptide sequence and in particular the precursor of the ⁇ -amyloid peptide does not carry the Swedish double mutation.
- the polypeptides of the invention or their variants are capable of selectively cleaving the peptide bond of the Met 596 -Asp 597 doublet within the native or natural form of APP.
- polypeptides according to the invention have been purified from human cells of subjects not suffering from Alzheimer's disease and are capable of exclusively cleaving APP in its natural form at the peptide bond of the Met 596 -Asp 597 doublet. .
- the polypeptides of the invention are characterized in that their activity is not dependent on a second substrate and / or on a ligand.
- ions and more particularly cations such as magnesium or calcium cations.
- other proteins such as serine proteases 1 and 2 or Cathepsin G-like having protease activity, require the presence of calcium to be active.
- the polypeptides according to the invention have a molecular mass of between 65 and 75 kDa and preferably their molecular mass is around 70 kDa.
- Their isoelectric point is between 6.0 and 7.0 and preferably is equal to 6.0.
- polypeptides are endopeptidases of the serine protease family.
- these endopeptidases are of the sensitive chymotrypsin type.
- the inhibition profile shows that these endopeptidases are totally inhibited by PMSF (Phenylmethane-sulfonil fluoride) and partially inhibited by pefablock, TPCK (Ll-Chloro-3- [4tosylamido] -4-phenyl-2- butanone), benzamidine.
- PMSF Phhenylmethane-sulfonil fluoride
- pefablock Phenylmethane-sulfonil fluoride
- TPCK Ll-Chloro-3- [4tosylamido] -4-phenyl-2- butanone
- benzamidine are completely resistant to inhibition by antipapain.
- polypeptides of the invention or their variants are characterized by a maximum ⁇ -secretase activity at a pH of between 7 and 8.
- a subject of the invention is also non-peptide or non-exclusively peptide compounds capable of cleaving at the Met 5 -Asp 5 7 site the precursor of the ⁇ -amyloid peptide.
- Such compounds are obtained by reproduction of the active motifs of the polypeptide according to the invention by non-peptide or non-exclusively peptide structures and which are compatible with pharmaceutical use.
- the invention relates to the use of polypeptides as described above for the preparation of non-peptide, or not exclusively peptide, pharmacologically active molecules, by determining the structural elements of these polypeptides which are important for their activity and the reproduction of these elements by non-peptide or non-exclusively peptide structures.
- the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising one or more molecules thus prepared.
- the polypeptides or their variants further comprise a signal sequence allowing precise cell localization.
- a signal sequence allowing precise cell localization.
- sequences which can be used mention may be made preferably of the sequence of the signal peptide of IgkB, the signal peptide of APP, the signal peptides of nicotinic muscle and central acetylcholine receptor subunits etc.
- Another object of the invention consists in a method of enzymatic purification of the polypeptides of the invention, having an activity of ⁇ -secretase type and capable of specifically cleaving the natural precursor of APP. This process includes the following steps:
- the concentration product then undergoes the various stages of purification with in particular centrifugation on a tangential membrane followed by exclusion chromatography and ion exchange chromatography then by hydrophobic interaction chromatography and finally by a new exclusion chromatography.
- the present invention also relates to the use of a cell line.
- This line was selected from many other human lines (see Materials and Methods) coming from various origins but from subjects not affected by Alzheimer's disease. These lines were used to search for the polypeptides of the invention or their variants.
- these human cell lines are representative of the Central or Peripheral Nervous System and of the Immune System and are capable of carrying out the normal metabolism of the precursor of the amyloid ⁇ peptide leading to its production.
- the cell line selected is the THP1 line (ATCC TIB 202) derived from a monocyte.
- the cell lines described above are used in particular as a host for the detection of compounds (ligands, antagonists, agonists) capable of inhibiting the interaction between the polypeptides of the invention and their substrate.
- Another object of the invention resides in antibodies or fragment of polyclonal or monoclonal antibodies directed against a polypeptide as defined above.
- Such antibodies can be generated by methods known to those skilled in the art.
- these antibodies can be prepared by immunizing an animal against a polypeptide of the invention or one of its variants, then by drawing blood and isolating the antibodies.
- These antibodies can also be generated by preparing hybridomas according to techniques known to those skilled in the art.
- the antibodies or antibody fragments according to the invention can in particular be used for their ability to inhibit, at least in part, the interaction between said polypeptide and the precursor of the ⁇ -amyloid peptide and / or to inhibit at least in part the ⁇ -secretase activity of the polypeptides of the invention vis-à-vis the natural precursor of the ⁇ -amyloid peptide.
- these antibodies are used as a medicament, in particular for the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease.
- Another object of the present invention relates to a method for identifying compounds capable of inhibiting, at least in part, the interaction of the polypeptide and the precursor of the ⁇ -amyloid peptide and / or of modulating or inhibiting at least in part of the ⁇ -secretase activity of the polypeptides of the invention.
- a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified, is brought into contact with a recombinant cell such as expressing a polypeptide of the invention under conditions allowing the interaction between said polypeptide and said molecule in the case where that -this would have an affinity for said polypeptide, and,
- this method of the invention is suitable for the detection and / or isolation of agonists and antagonists of the ⁇ -secretase activity of the polypeptides of the invention. From these agonist or antagonist molecules, it is possible by conventional techniques known to those skilled in the art and in particular by sequencing to obtain their corresponding nucleotide sequences.
- agonist or antagonist molecules of the polypeptides of the invention expressed in situ from their nucleotide sequences.
- the preparation of these molecules and their expression in vivo, ex-vivo and / or in vitro, require that their nucleotide sequences are carried by a viral or plasmid vector and are transfected by means of said vector into appropriate host cells.
- the present invention also relates to the use of the polypeptides defined above or of their variants for the detection of ligands as well as of compounds capable of inhibiting, at least in part, the interaction between the polypeptide and the precursor of the ⁇ - peptide.
- the present invention also relates to a method for demonstrating molecules which can influence the activity of the polypeptides of the invention.
- This screening method involves the following steps:
- polypeptides of the invention which have a ⁇ -secretase type activity are brought into contact with a molecule or a mixture containing different molecules, possibly not identified.
- the reaction mixture described in the previous step is brought into contact with the substrate of the polypeptides of the invention which is preferably APP in its natural form - the ⁇ -secretase activity is measured on the APP
- the molecules which have had an effect on the ⁇ -secretase activity of the polypeptides of the invention are detected and / or isolated.
- Another object of the invention relates to the use of a ligand or of a modulator identified and / or obtained according to the process described above as a medicament.
- ligands or modulators by their capacity to interfere at the level of the ⁇ -secretase activity of the polypeptides of the invention vis-à-vis the natural precursor of the ⁇ -amyloid peptide may, in fact, make it possible to treat certain neurological conditions and in particular Alzheimer's disease.
- the subject of the invention is also any pharmaceutical composition comprising as active ingredient either a polypeptide as defined above or the agonist, antagonist or ligand molecules defined above.
- composition comprising as active ingredient at least one antibody or an antibody fragment as defined above, and / or an antisense oligonucleotide.
- compositions in which the peptides, antibodies, ligands and / or nucleotide sequences defined above are associated with each other or with other active ingredients.
- compositions according to the invention can be used to at least partially inhibit the interaction of the polypeptides of the invention or their variants with the natural precursor of the ⁇ -amyloid peptide and / or to at least partially inhibit the activity ⁇ -secretase and / or intervene on the metabolism of the precursor of the ⁇ -amyloid peptide to inhibit or slow down the production of the ⁇ -amyloid peptide. It is more preferably pharmaceutical compositions intended for the treatment of neurodegenerative diseases such as for example Alzheimer's disease.
- Another object of the present invention is the use of the molecules described above (ligands, antibodies or antibody fragments, antagonists, agonists) to at least partially inhibit the interaction of the polypeptides of the invention or their variants and the natural precursor of the ⁇ -amyloid peptide and / or to inhibit, at least in part, the ⁇ -secretase activity of the polypeptides of the invention or their variants and / or intervene in the metabolism of the precursor of the ⁇ -amyloid peptide to inhibit or slow the production of the ⁇ -amyloid peptide.
- the use of these molecules is envisaged as a medicament, in particular for the treatment of neurodegenerative diseases and in particular for the treatment of Alzheimer's disease.
- the polypeptides of the invention or their variants are used to intervene in the metabolism of the ⁇ -amyloid peptide.
- the polypeptides or their variants defined above are used to demonstrate ligands or compounds capable of at least partially inhibiting the interaction between the polypeptides of the invention or their variants and the natural precursor of the ⁇ -amyloid peptide and / or to inhibit, at least in part, the ⁇ -secretase activity of the polypeptides of the invention or their variants and / or intervene in the metabolism of the precursor of the ⁇ peptide - amyloid to inhibit or slow down the production of the ⁇ -amyloid peptide.
- polypeptides of the invention and especially their antagonists, agonists, antibodies and ligands are preferably associated with one or more pharmaceutically acceptable vehicles to be formulated for administration by topical, oral, parenteral route, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. They are preferably used in an injectable form.
- saline solutions monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts
- sterile, isotonic, or dry compositions in particular lyophilized, which, through addition according to the case of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
- Figure 1 APP topography and cleavage sites.
- FIG. 1 description of the process for purifying the polypeptides of the invention.
- Figure 3 analysis by immunoblotting of the cleavage by the polypeptides of the invention of complete precursors of membrane origin of the ⁇ -amyloid peptide "normal” (APP-K 595 M 596 ) and “double mutated” (APP-N 595 L 596 ). Demonstration of the specificity of cleavage of the polypeptides of the invention towards the precursor of membrane origin of the "normal” ⁇ -amyloid peptide (APP-KM).
- column 1 represents the membranes not incubated without enzyme
- column 2 represents the membranes incubated at 37 ° C without enzyme
- column 3 corresponds to the membranes incubated at 37 ° C with the polypeptides of the invention having a ⁇ -secretase activity.
- the cells After thawing, the cells, depending on their origin, are cultured either in “DMEM” medium or in “RPMI 1640” medium in the presence of 10% fetal calf serum. These cultures were carried out in 1 liter flasks at 37 ° C. with a renewal of the culture media every 2 to 3 days. Depending on the cell line studied, a period of 2 to 5 months is necessary to obtain a volume of 18 liters of culture medium. The last culture step is done for 48 hours in the absence of fetal calf serum and phenol red. These cell cultures are then centrifuged to recover the supernatant which will be used for the purification of the enzymes.
- the HMCB, U-373 MG, U-138 MG, MRC5 and Hs27 cell lines were cultured in “DMEM” medium while the lines SW 1088, SW 1783, K-562, H9, DAKIKI, THP1, RPMI 1788 and IM-9 were in the “RPMI 1640” environment.
- Enzyme purification The 18 liters of supernatant from each cell culture are concentrated on ULTRASETTE TM membranes (FILTRON) having a cut-off threshold of lOkDa, then the concentration product obtained was used for the purification of the proteolytic activities according to the following protocol: -
- the first step consists in a tangential membrane centrifugation at 7000 rpm. More particularly, the concentration is carried out on an ULTRAFREE® membrane (MILLIPORE) having a cut-off threshold of lOkDa
- an exclusion chromatography is carried out.
- the exclusion chromatography was carried out on a Sephacryl column S-100 (Pharmacia), the exclusion limits of which are 10 3 Da and 10 5 Da.
- - Ion exchange chromatography represents the third step of the process. It was used in particular a Q-Sepharose column (Pharmacia) whose gel consists of strong anions. The column is eluted by a salt gradient from 0 to 1 M using solvent A (25 mM Tris, pH 7.5) and solvent B (25 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.5).
- the penultimate step consists of chromatography of hydrophobic interactions, in particular on a phenyl-sepharose-6 column (Pharmacia) having a high degree of substitution (40 ⁇ mol / g of gel).
- This column was eluted with a 1 to 0 M ammonium sulfate gradient using solvent A (25 mM Tris, (NH 4 ) 1 M SO 4 , pH 7.5) and solvent B (25 mM Tris, pH 7.5) .
- the last step is an exclusion chromatography, carried out in particular on a TSKgel G2000SW column (Interchim), the gel of which consists of rigid supports of silica, grafted with a hydrophilic group.
- the eluent is a 25 mM Tris buffer, pH 7.5 containing 250 mM NaCl.
- the enzymatic activity is determined by measuring the fluorescence of the free AMC chromophore at 460 nm.
- the reaction is stopped by adding 3 ⁇ l of 0.1N HCl, and the enzymatic activity is determined by measuring the optical density at 215 nm of the cleavage fragments previously separated by HPLC.
- the cleavage sites are deduced by determining the sequence of the fragments resulting from the cleavage.
- the percentage inhibition [% 100 (Io-Ij) / Io] of each substrate incubated in the presence of the enzyme was evaluated by measuring the absorbance at 215 nm for a peptide substrate or the fluorescence at 460 nm for the substrate Z-Val-Lys-Met-MCA in the absence (Io) and in the presence (L) of the inhibitor under the same experimental conditions.
- the precursors normal APP (APP-K 595 M 596 ) and APP having the double "Swedish” mutation (APP-N 595 L 596 ) were obtained from membrane extracts of cells of insects infected with baculovirus containing the genes humans coding for these precursors. These membrane extracts, incubated with the polypeptides of the invention having purified ⁇ -secretase activity, are analyzed by immunoblot using the antibody WO-2 (Ida N. et al. (1996) J. Biol Chem 271, 22908- 22914) directed against the first amino acids of the amyloid ⁇ peptide and the monoclonal antibody 22C11 (Boehringer Mannhein; Hilbich C. (1993) Journal of Biochemical Chemistry, 268, 26571-26577) directed against the NH2-terminal motif of the precursor.
- WO-2 Ida N. et al. (1996) J. Biol Chem 271, 22908- 22914
- the purpose of this example is to demonstrate enzymatic activities in human cell lines of subjects not affected by Alzheimer's disease.
- the search for enzymatic activities was carried out using the 22C11 monoclonal antibody to select the cell lines having the capacity to produce measurable amounts of APP at the level of the membrane and in the cell culture medium.
- the monoclonal antibody WO-2 was used to reveal and identify the different APP cleavage sites.
- the 22C11 monoclonal antibody made it possible to select 8 cell lines (HMCB, MRC5, Hs27, SW1088, SW1783, H9, THP1 and IM-9) out of the 13 tested in total.
- the immunoblot analysis also showed a difference in molecular mass between the membrane APP (120 kDa) and the soluble APP (110-100 kDa). This indicates that the precursor has undergone, at its COOH-terminal sequence, one or more enzymatic cleavage (s).
- this approach made it possible to select cell lines having the capacity to produce measurable amounts of APP at the membrane level and in the cell culture medium and to show enzymatic cleavages in the precursor of the A ⁇ peptide.
- a combined analysis (HPLC, amino acid composition and determination of the sequences) of the fragments generated by cleavage of the substrate [KMD] APP (-5, + 5) was carried out in the selected lines. Indeed, after incubation of the substrate [KMD] APP (-5, + 5) with the supernatants, the fragments generated were first separated by HPLC on a reverse phase RPCig column (VYDAC) eluted by a guard of 5-40 % acetonetrile / 0.05% TFA. The sequence and / or the amino acid composition of these fragments have been determined by conventional techniques.
- the purpose of this example is to describe the purification and to highlight the characteristics of the polypeptides of the invention having a ⁇ -secretase activity.
- the THP-1 cell line was chosen, because of its rapid cell cycle making it possible to obtain large quantities of proteins, to be used as a model for the purification of the ⁇ -secretase activity sought after according to the purification protocol described in "Materials and Methods".
- [KMD] APP (-5, + 5) made it possible to obtain a single fraction having a ⁇ -secretase activity. Its characterization was carried out by measuring the molecular weight by electrophoresis on polyacrilamide gel, measuring the isoelectric point, finding the maximum activity as a function of pH as well as the inhibition profile by conventional inhibitors ("Materials and Methods").
- the electrophoresis analysis was carried out on a 4- 20% polyacrylamide gel on Phast-system (Pharmacia) under denaturing or normal conditions and shows a band of molecular mass close to 70 kDa.
- the inhibition profile of this fraction shows that it is a serine protease: the percentages of inhibition calculated being respectively 100% for PMSF, 75% for pefablock, 25% for TPCK, 10% o for benzamidine and 0% for antipapain.
- This example therefore describes the purification process as well as the research and the demonstration of the various characteristics of the polypeptides of the invention having a ⁇ -secretase activity.
- Example 3 Specificity of the ⁇ -secretase activity This example describes the analysis of the ⁇ -secretase activity of the polypeptides of the invention.
- polypeptides of the invention were contacted with the various substrates and the percentage of cleavage of these substrates was calculated. The results are presented in Table 3.
- the residue of the P'i subsite is necessarily Asp or Glu (Part D Tab.3): In fact, the results have shown that the mutation of Asp by Asn or Gln does not eliminate the cleavage of the substrate; moreover, the cleavage occurs at the Ala-Glu site equivalent to the Met-Asp site; in addition, the Ala-Glu pseudo site is only accessible in the natural substrate because, under the same experimental conditions, the rate of cleavage of the APP fragment (1.5) is only 35%.
- this example demonstrates that the polypeptides of the invention isolated previously have a ⁇ -secretase type activity specific for the natural precursor of the amyloid ⁇ peptide.
- Table 1 table of peptides of different sizes mimicking or reproducing the ⁇ -secretase cleavage site, synthesized for use as a substrate in the characterization and enzymatic specificity of the polypeptide according to the invention.
- Table 2 Inhibition profile of the enzymatic activities of the 8 selected cell lines with respect to the Z-Val-Lys-Met-MCA peptide, expressed as a percentage of activity.
- Table 3 results of the analysis of the enzymatic specificity of the polypeptide of the invention using peptides mimicking or reproducing the amino acid sequence of the APP precursor, at the cleavage site.
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Abstract
La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides possédant une activité de type β-secrétase caractérisés en ce qu'ils sont capables de cliver de manière spécifique le précurseur naturel du peptide β-amyloïde (APP).
Description
POLYPEPTIDES POSSEDANT UNE ACTIVITE DE TYPE β-SECRETASE
La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et leur utilisation pharmaceutique. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides possédant une activité de type β-secrétase caractérisés en ce qu'ils sont capables de cliver de manière spécifique le précurseur naturel du peptide β-amyloïde (APP).
Les individus atteints par la maladie d'Alzheimer présentent des symptômes caractéristiques d'altérations de la mémoire, de perte des capacités intellectuelles et des fonctions cognitives. Ces changements pathologiques s'accompagnent d'une atrophie neuronale, d'une déplétion importante d'un certain type de récepteurs et également d'une réduction des connexions synaptiques. Ce syndrome comporte la présence de plaques séniles et de dégénérescences neurofibrillaires en quantités très importantes, principalement dans le cortex cérébral, l'hippocampe, le noyau amygdalien et dans les vaisseaux sanguins corticaux.
Les plaques dites séniles sont des structures sphériques qui s'établissent lentement sur une dizaine d'années dans les espaces extracellulaires de l'hippocampe, du cortex et d'autres régions cérébrales. Leur constituant majeur est le peptide β amyloïde (Aβ) associé à d'autres protéines anormales. Ces structures sont entourées par des axones et des neurones anormaux.
Les dégénérescences neurofibrillaires sont dues à une accumulation de faisceaux denses de fibres anormales dans le cytoplasme de certains neurones et principalement des cellules pyramidales du cortex. Ces enchevêtrements neurofibrillaires sont constitués d'une forme particulière de la protéine tau qui, associée à d'autres protéines, donne des paires de neurofilaments hélicoïdaux qui perturbent la conduction de l'influx nerveux.
Des formes familiales de cette maladie ont été répertoriées et semblent résulter de modifications génétiques variées qui toutes provoquent l'accumulation anormale du peptide Aβ. Ces dernières, très hétérogènes, ont été en particulier associées à diverses mutations sur les chromosomes 1,14 et 21. Ce dernier a d'autant plus suscité l'intérêt qu'il porte le gène codant pour la protéine précurseur du Aβ. On comprend donc l'apparition précoce (55 ans) de la maladie d'Alzheimer chez les sujets atteints du Syndrome de Down (trisomie 21).
Il est à noter que les individus affectés par des formes familiales de la maladie ne représentent qu'un faible pourcentage parmi les sujets atteints. Dans la quasi-totalité des cas de maladie d'Alzheimer non liés aux formes familiales, les individus âgés de plus de 70 ans présentent des plaques séniles dans diverses régions du cerveau. Leur répartition est en revanche différente selon le type de démence concernée.
D'une masse moléculaire de 4 kDa, le peptide Aβ humain est généré par clivages protéolytiques de son précurseur (APP) aux sites Met596-Asp597 et Val636- Ile637. La molécule libérée est constituée de 39 (à 42) acides aminés dont la séquence protéique est la suivante :
10 20 30 40
DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV LA En solution aqueuse, ce peptide adopte un arrangement tridimensionnel de type feuillet β plissé. Sa partie COOH-terminal très hydrophobe lui confère des propriétés d'agrégation dont le taux d'oligomérisation est fonction du pH (formation maximale à pH=5.4) et de la concentration du peptide. De plus, la séquence comprise entre les résidus Gly25 et Met35 confère à ce peptide des propriétés neurotrophiques et neurotoxiques.
Le peptide Aβ est un produit naturel sécrété par les cellules et détectable dans le sang et le liquide cérébro-spinal. Bien que ce peptide soit neurotoxique, sa production n'est cependant pas suffisante à la formation des plaques amyloïdes. Un
"processing" altéré ou une surexpression de son précurseur prédisposeraient au dépôt du Aβ dans le cerveau.
Le transcrit primaire du précurseur du peptide β-amyloïde (APP) subit un épissage alternatif pour générer des ARNm codant pour au moins 5 isoformes de 563, 695, 714, 751 et 770 acides aminés (a.a.), exprimées de façon ubiquitaire dans les tissus et dont le taux diffère suivant le type cellulaire.
Les isoformes APP695 et 751 sont cependant restreintes exclusivement au système nerveux central et périphérique (notamment au niveau des synapses dans les astrocytes et des neurones) où ils peuvent jouer un rôle dans l'activité physiologique des synapses. Les isoformes APP751, APP563 et APP770 contiennent un "insert" de 56 a.a. homologue à l'inhibiteur de protéase de type "Kunitz". Par ailleurs, la forme sécrétée de 1ΑPP751 est identique à la nexine IL un inhibiteur de protéase impliqué dans la régulation des serines protéases extracellullaires.
L'APP est une glycoprotéine d'environ 120 kDa présentant les caractéristiques d'un récepteur de surface de type IL Bien que la fonction réelle de l'APP n'ait pas encore été élucidée, des études ont montré que cette glycoprotéine pourrait jouer un rôle dans la régulation de la croissance cellulaire ainsi que dans les interactions d'adhésion dans l'inflammation, la regénération et la réponse immunitaire.
Toutes les isoformes de l'APP sont insérées dans le réticulum endoplasmique grâce à leur séquence "signal". Le précurseur est ensuite ciblé vers l'appareil de Golgi où il subit différentes modifications post-traductionnelles pour être ensuite ancré dans la membrane. Sous l'action de différentes protéases, l'APP peut alors y subir divers clivages (voir figure 1), dont certains sont majoritaires : L'activité protéasique, appelée α-secrétase, clive à l'intérieur de la séquence
612 613
Aβ entre les résidus Lys et Leu de 1ΑPP695 pour générer un fragment NH - terminal sécrété (désigné sAPPα : APPα soluble) et contenant les 16 premiers a.a. du Aβ.
L'activité protéasique, appelée β-secrétase. clive la liaison peptidique du 96 597 doublet Met -Asp au sein du précurseur pour libérer un fragment APP NH - terminal sécrété (désigné sAPPβ: APPβ soluble) délété totalement du A β.
La 3eme activité protéasique, appelée γ-secrétase, pourrait aussi agir entre les résidus Val 6 à Ile637 du précurseur pour générer une proforme sécrétée APPγ contenant le A β.
Le constituant majeur des plaques séniles, qui apparaissent aussi bien dans les formes familiales que non familiales de la maladie d'Alzheimer est le peptide β- amyloïde (Aβ). Le peptide Aβ résulte du clivage de son précurseur, l'APP, au site Met596-
Asp597 de l'APP selon une activité protéasique de type β-secrétase et au site Val636 - Ile selon une activité protéasique de type γ-secrétase.
Parmi les formes les formes familiales de la maladie d'Alzheimer, une mutation en relation avec le site de clivage β-secrétase a été identifiée. Il s'agit de la double mutation "suédoise" de l'APP (Lys595-Met596=>Asn-Leu dans 1ΑPP695) et qui présente une production accrue du peptide Aβ (donc une augmentation de la maturation de l'APP en faveur de la voie amyloïdogénique).
Cependant, il n'en demeure pas moins que dans la très grande majorité des cas de maladie d'Alzheimer, l'APP est dans sa forme naturelle avec un site de clivage β- secrétase non muté.
Certaines protéases issues de l'homme, du rat ou du singe ont été étudiées par divers auteurs et sont supposées être impliquées dans la maturation du précurseur APP. Parmi ces enzymes on peut citer tout particulièrement les serine protéases 1 et 2 (Abraham et al. (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 174, 790-796; Matsumoto et al. (1994), Biochemistry, 33, 3941-3948; Matsumoto et al. (1994), Neurosciences Letters, 195, 171-174) ainsi que la Cathepsine G-like (Razzaboni et al. (1992), Brain Research, 589, 207-216). Ces enzymes d'origine humaine ou simienne, clivent au niveau du site Met596-Asp597 de l'APP selon une activité protéasique de type β-
secrétase, cependant, elles ont été mises en évidence ou partiellement purifiées à partir de patients atteints par la maladie d'Alzheimer.
Etant donné que la formation du peptide β-amyloïde résulte de l'action d'enzyme de type β-secrétase sur l'APP, on comprend l'importance de l'identification et de la caractérisation de système(s) enzymatique(s) de type β-secrétase responsable(s) sélectivement de la maturation post-traductionnelle du précurseur du peptide β-amyloïde au niveau du site Met596-Asp597 dans les cellules humaines ne provenant pas de patients atteints par la maladie d'Alzheimer. La connaissance de ces nouveaux systèmes enzymatiques permettent ainsi d'envisager la préparation de nouvelles molécules utilisables pharmaceutiquement et notamment capables d'intervenir sur le métabolisme du peptide β-amyloïde dans des formes non familiales de la maladie d'Alzheimer.
La présente invention résulte donc de l'identification et de la caractérisation par la demanderesse de polypeptides possédant une activité catalytique vis-à-vis du précurseur du peptide β-amyloïde (APP) de type β-secrétase. Au contraire des autres protéases identifiées, les polypeptides de la présente invention ont une spécificité d'action envers la forme naturelle de l'APP. La présente invention découle en particulier de la mise en évidence d'un polypeptide de 70 kDa, capable de cliver les formes non mutées de l'APP.
Un premier objet de l'invention concerne donc des polypeptides ou leurs variants possédant une activité de type β-secrétase caractérisés en ce qu'ils sont capables de cliver de manière spécifique le précuseur naturel du peptide β-amyloïde (APP).
Au sens de la présent invention, le terme variant désigne toute molécule ayant la même activité que les polypeptides de l'invention, obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion,
addition, et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels variants peuvent être générés dans des buts différents, tel que celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance aux protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés biologiques. Parmi les variants résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à l'extrémité. Le terme variant comprend également des polypeptides homologues aux polypeptides décrits dans la présente invention, issus d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'autres organismes. Le substrat que clivent les polypeptides de l'invention ne présente pas de mutation dans sa séquence peptidique et en particulier le précurseur du peptide β- amyloïde ne porte pas la double mutation suédoise. Les polypeptides de l'invention ou leurs variants sont capables de cliver sélectivement la liaison peptidique du doublet Met596-Asp597 au sein de la forme native ou naturelle de l'APP. En particulier, les polypeptides de l'invention ne clivent pas les formes d'APP ayant la mutation suédoise (Lys595-Met596= Asn-Leu). Cette dernière ayant été mise en évidence à partir de prélèvements réalisés sur le cerveau de patients atteints par la maladie d'Alzheimer.
Les polypeptides selon l'invention ont été purifiés à partir de cellules humaines de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer et sont capables de cliver exclusivement l'APP dans sa forme naturelle au niveau de la liaison peptidique du doublet Met596-Asp597.
Les polypeptides de l'invention sont caractérisés en ce que leur activité n'est pas dépendante d'un second substrat et/ou d'un ligand. On peut citer à titre d'exemples les ions et plus particulièrement des cations tels que les cations magnésiques ou calciques. En effet, d'autres protéines comme les serines protéases 1 et 2 ou la Cathepsine G-like ayant une activité protéasique, nécessitent la présence du calcium pour être actives.
Les polypeptides selon l'invention possèdent une masse moléculaire comprise entre 65 et 75 kDa et préférentiellement leur masse moléculaire est d'environ 70 kDa. Leur point isoéléctrique est compris entre 6.0 et 7.0 et de préférence est égal à 6.0.
Ces polypeptides sont des endopeptidases de la famille des serines protéases. Préférentiellement, ces endopeptidases sont de type chymotrypsine sensible. En effet, le profil d'inhibition montre que ces endopeptidases sont totalement inhibées par le PMSF (Phenylmethane-sulfonil fluoride) et partiellement inhibées par le pefablock, le TPCK(L-l-Chloro-3-[4tosylamido]-4-phenyl-2-butanone), la benzamidine. En outre, elles sont totalement résistantes à l'inhibition par l'antipapaïne.
Les polypeptides de l'invention ou leurs variants sont caractérisés par une activité β-secrétase maximale à un pH compris entre 7 et 8.
L'invention a également pour objet des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques capables de cliver au site Met5 -Asp5 7 le précurseur du peptide β-amyloïde. De tels composés sont obtenus par reproduction des motifs actifs du polypeptide selon l'invention par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques et qui soient compatibles avec une utilisation pharmaceutique. A cet égard, l'invention concerne l'utilisation de polypeptides tels que décrits ci-avant pour la préparation de molécules non peptidiques, ou non exclusivement peptidiques, actives pharmacologiquement, par détermination des éléments structuraux de ces polypeptides qui sont importants pour leur activité et la reproduction de ces éléments par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une ou plusieurs molécules ainsi préparées.
Selon une variante de l'invention, les polypeptides ou leurs variants comprennent en outre une séquence signal permettant une localisation cellulaire précise. Parmi les séquences utilisables, on peut citer de manière préférée, la séquence du peptide signal de IgkB, le peptide signal de l'APP, les peptides signal des
sous-unités des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine musculaires et centraux etc..
Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de purification enzymatique des polypeptides de l'invention, possédant une activité de type β- secrétase et capables de cliver de manière spécifique le précurseur naturel de l'APP. Ce procédé comporte les étapes suivantes :
- le surnageant de la culture cellulaire est tout d'abord concentré sur membranes.
- le produit de concentration subit ensuite les différentes étapes de la purification avec notamment une centrifugation sur membrane tangentielle suivie d'une chromatographie d'exclusion et d'une chromatographie échangeuse d'ions puis d'une chromatographie d'interactions hydrophobes et enfin d'une nouvelle chromatographie d'exclusion.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire. Cette lignée a été sélectionnée parmi de nombreuses autres lignées humaines (voir Matériel et Méthodes) provenant d'origines diverses mais de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer. Ces lignées ont été utilisées pour la recherche des polypeptides de l'invention ou de leurs variants. Ainsi, ces lignées cellulaires humaines sont représentatives du Système Nerveux Central ou Périphérique et du Système Immunitaire et sont capables de réaliser le métabolisme normal du précurseur du peptide β amyloïde conduisant à sa production. De manière préférée la lignée cellulaire sélectionnée est la lignée THP1 (ATCC TIB 202) issue de monocyte.
Les lignées cellulaires décrites précédemment sont notamment utilisées comme hôte pour la mise en évidence de composés (ligands, antagonistes, agonistes) capables d'inhiber l'interaction entre les polypeptides de l'invention et leur substrat.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier, ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide de l'invention ou de l'un de ses variants puis par prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour leur faculté à inhiber, au moins en partie, l'interaction entre le dit polypeptide et le précurseur du peptide β-amyloïde et/ou pour d'inhiber au moins en partie l'activité β-secrétase des polypeptides de l'invention vis- à-vis du précurseur naturel du peptide β-amyloïde. En particulier, ces anticorps sont utilisés comme médicament, notamment pour le traitement de maladies neurodégénératives tel que la maladie d'Alzheimer.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables d'inhiber, au moins en partie, l'interaction du polypeptide et le précurseur du peptide β-amyloïde et/ou de moduler ou d'inhiber au moins en partie l'activité β-secrétase des polypeptides de l'invention.
La mise en évidence et/ou l'isolement de tels composés est réalisé selon les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que exprimant un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'activité β-secrétase des polypeptides de l'invention. A partir de ces molécules agonistes ou antagonistes, il est possible par des techniques classiques connues de l'homme du métier et notamment par séquençage d'obtenir leurs séquences nucléotidiques correspondantes.
Ainsi selon une variante de l'invention, il peut être particulièrement avantageux de faire exprimer in situ des molécules agonistes ou antagonistes des polypeptides de l'invention à partir de leurs séquences nucléotidiques. La préparation de ces molécules et leur expression in vivo, ex-vivo et/ou in vitro, nécessitent que leurs séquences nucléotidiques soient portées par un vecteur viral ou plasmidique et soient transfectées au moyen dudit vecteur dans des cellules hôtes appropriées.
La présente invention concerne également l'utilisation des polypeptides définis précédemment ou de leurs variants pour la mise en évidence de ligands ainsi que de composés capables d'inhiber, au moins en partie, l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide β-amyloïde et/ou d'inhiber l'activité β- secrétase des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et/ou d'intervenir dans la métabolisme du précurseur naturel du peptide β-amyloïde et/ou de ralentir la production du peptide β-amyloïde.
En effet, la présente invention se rapporte également à une méthode de mise en évidence de molécules pouvant influencer l'activité des polypeptides de l'invention. Cette méthode de "screening" comporte les étapes suivantes :
- on met en contact les polypeptides de l'invention qui présentent une activité de type β-secrétase avec une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées.
- on met en contact le mélange réactionel décrit dans l'étape précédente avec le substrat des polypeptides de l'invention qui est préférentiellement l'APP dans sa forme naturelle
- on mesure l'activité β-secrétase sur l'APP
- on détecte et/ou on isole les molécules qui ont eu un effet sur l'activité β- secrétase des polypeptides de l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs de par leur capacité à interférer au niveau de l'activité β-secrétase des polypeptides de l'invention vis-à-vis du précurseur naturel du peptide β-amyloïde peuvent, en effet, permettre de traiter certaines affections neurologiques et notamment la maladie d'Alzheimer.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif soit un polypeptide tel que défini ci-avant soit les molécules agonistes, antagonistes ou ligands définis précédemment.
Elle a aussi pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps tel que défini ci-avant, et/ou un oligonucléotide antisens.
Par ailleurs, elle a aussi pour objet les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides, anticorps, ligands et/ou séquences nucléotidiques définis ci- avant sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées pour inhiber au moins en partie l'interaction des polypeptides de l'invention ou de leurs variants avec le précurseur naturel du peptide β-amyloïde et/ou pour inhiber au moins en partie l'activité β-secrétase et/ou intervenir sur le métabolisme du précurseur du peptide β-amyloïde pour inhiber ou ralentir la production du peptide β- amyloïde. Il s'agit plus préférentiellement de compositions pharmaceutiques destinées au traitement de maladies neurodégeneratives comme par exemple la maladie d'Alzheimer.
Un autre objet de la présente invention est l'utilisation des molécules décrites auparavant (ligands, anticorps ou fragments d'anticorps, antagonistes, agonistes) pour inhiber au moins en partie l'interaction des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et du précurseur naturel du peptide β-amyloïde et/ou pour inhiber, au moins en partie, l'activité β-secrétase des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et/ou intervenir sur le métabolisme du précurseur du peptide β-amyloïde pour inhiber ou ralentir la production du peptide β-amyloïde. De manière préférée l'utilisation de ces molécules est envisagée comme médicament, notamment pour le traitement des maladies neurodégeneratives et en particulier pour le traitement de la maladie d'Alzheimer.
Selon une variante de l'invention, les polypeptides de l'invention ou leurs variants sont utilisés pour intervenir sur le métabolisme du peptide β-amyloïde.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les polypeptides ou leurs variants définis ci-avant sont utilisés pour mettre en évidence des ligands ou des composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre les polypeptides de l'invention ou leurs variants et le précurseur naturel du peptide β-amyloïde et/ou pour inhiber, au moins en partie, l'activité β-secrétase des polypeptides de l'invention ou de leurs variants et/ou intervenir sur le métabolisme du précurseur du peptide β- amyloïde pour inhiber ou ralentir la production du peptide β-amyloïde.
Pour leur utilisation selon la présente invention, les polypeptides de l'invention et surtout leurs antagonistes, agonistes, anticorps et ligands sont préférentiellement associés à un ou des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour être formulés en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. Ils sont de préférence utilisés sous une forme injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par
addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
La présente invention sera plus amplement détaillée à l'aide des exemples ci dessous considérés de manière descriptive et non limitative.
Légende des figures
Figure 1 : Topographie et sites de clivage de l'APP.
Figure 2 : description du procédé de purification des polypeptides de l'invention.
Figure 3 : analyse par immunoblot du clivage par les polypeptides de l'invention des précurseurs complets d'origine membranaire du peptide β-amyloide "normal" (APP- K595M596) et "double muté" (APP- N595L596). Mise en évidence de la spécificité de clivage des polypeptides de l'invention envers le précurseur d'origine membranaire du peptide β-amyloide "normal" (APP- KM).
Pour chacun des précurseurs (APP-NL et APP-KM), la colonne 1 représente les membranes non incubées sans enzyme, la colonne 2 représente les membranes incubées à 37° C sans enzyme, alors que la colonne 3 correspond aux membranes incubées à 37° C avec les polypeptides de l'invention présentant une activité de type β-secrétase.
MATERIELS ET METHODES
Origine des lignées cellulaires
On a utilisé 13 lignées cellulaires humaines d'origine variée pour la recherche des enzymes de maturation:
Système nerveux central SW 1088 ATCC HTB 12 Astrocytome
SW 1788 ATCC HTB 13 Astrocytome
U- 138 MG ATCC HTB 16 Glioblastome
U-373 MG ATCC HTB 17 Gliobastome,astrocytome,grade III Système nerveux périphérique HMCB ATCC CRL 9607 Bowes melanoma
Hs27 ATCC CRL 1634 Newborn foreskin
MRC5 ATCC CCL 171 Lung, diploid Système immunitaire
DAKIKI ATCC TIB 206 B-cell, Ig A secreting H9 ATCC HTB 176 T-cell lymphoma
IM-9 ATCC CCL 159 Lymphoblast g secreting
K-562 ATCC CCI 243 Chronic myelogenous leukemia
RPMI 1788 ATCC CCL 156 Peripheral blood, IgM secreting
THP1 ATCC TIB 202 Monocyte
Culture Cellulaire
Après décongélation, les cellules, selon leur origine, sont mises en culture soit dans le milieu «DMEM» soit dans le milieu «RPMI 1640» en présence de 10% de sérum de veau foetal. Ces cultures ont été réalisées dans des flacons de 1 litre à 37°C avec un renouvellement des milieux de cultures tous les 2 à 3 jours. Selon la lignée cellulaire étudiée, une période de 2 à 5 mois est nécessaire pour obtenir un volume de 18 litres de milieu de culture. La dernière étape de culture se fait pendant 48 heures en absence de sérum de veau foetal et de rouge de phénol. Ces cultures cellulaires sont ensuite centrifugées pour récupérer le surnageant qui servira à la purification des enzymes.
Les lignées cellulaires HMCB, U-373 MG, U-138 MG, MRC5 et Hs27 ont été cultivées dans le milieu «DMEM» alors que les lignées SW 1088, SW 1783, K-562, H9, DAKIKI, THP1, RPMI 1788 et IM-9 l'ont été dans le milieu «RPMI 1640».
Purification enzvmatique
Les 18 litres de surnageant de chaque culture cellulaire sont concentrés sur membranes ULTRASETTE™ (FILTRON) ayant un seuil de coupure de lOkDa, puis le produit de concentration obtenu a servi à la purification des activités protéolytiques selon le protocole suivant: - La première étape consiste en une centrifugation sur membrane tangentielle à 7000 rpm. Plus particulièrement, la concentration est réalisée sur membrane ULTRAFREE® (MILLIPORE) ayant un seuil de coupure de lOkDa
- Puis il est procédé à une chromatographie d'exclusion. Suivant un mode particulier de l'invention la chromatographie d'exclusion à été réalisée sur colonne séphacryl S- 100 (Pharmacia) dont les limites d'exclusion sont 103 Da et 105 Da.
- Une chromatographie d'échange d'ions représente la troisième étape du procédé. Il a été utlisé notamment une colonne Q-sépharose (Pharmacia) dont le gel est constitué d'anions forts. La colonne est éluée par un gradient salin de 0 à 1 M en utilisant le solvant A (Tris 25mM, pH 7.5) et le solvant B (Tris 25mM, NaCl 1M, pH 7.5). - L'avant dernière étape consiste en une chromatographie d'interactions hydrophobes, en particulier sur colonne phényl-sepharose-6 (Pharmacia) ayant un haut degré de substitution (40μmol/g de gel). Cette colonne a été éluée avec un gradient de sulfate d'ammonium de 1 à 0 M en utilisant le solvant A (Tris 25mM, (NH4) SO4 1 M, pH 7.5) et le solvant B (Tris 25mM, pH 7.5).
- Enfin, la dernière étape est une chromatographie d'exclusion, réalisée en particulier sur colonne TSKgel G2000SW (Interchim) dont le gel est constitué de supports rigides de silice, greffés avec un groupement hydrophile. L'éluant est un tampon Tris 25mM, pH 7.5 contenant 250mM NaCl.
Tests enzymatiques
Le suivi des activités β-secrétase a été réalisé par des tests utilisant différents peptides mimant ou reproduisant la séquence des acides aminés du précurseur APP au niveau du site de clivage enzymatique de type β-secrétase (Tableau 1).
Pour la réalisation du peptide chromophore, 5 μl de peptide Z-Val-Lys-Met-
MCA (7-amino-6-methylcoumarin), dilué au 1/1000, sont incubés avec 5 μl de surnageant pendant 6 heures à 37°C. La réaction est stoppée par addition de 3 μl de
HCl 0,1N, et l'activité enzymatique est déterminée par une mesure de la fluorescence du chromophore AMC libre à 460nm.
Des peptides synthétiques, de tailles différentes, mimant ou reproduisant le site de clivage enzymatique de type β-secrétase ont été synthétisés pour être utilisés comme substrats dans l'étude de la caractérisation et de la spécificité des enzymes. (tableau 1)
On incube 5 μl de surnageant avec 5 μl de peptide pendant 6 heures à 37°C.
La réaction est stoppée par addition de 3 μl de HCl 0,1N, et l'activité enzymatique est déterminée par mesure de la densité optique à 215 nm des fragments de clivage préalablement séparés par HPLC.
Les sites de clivage sont déduits par détermination de la séquence des fragments résultant du clivage.
Le pourcentage de clivage [%= 100(A0-Aj)/A0] de chaque substrat peptidique a été évalué en mesurant l'absorbance à 215 nm (A) du substrat incubé en l'absence (Ao) et en la présence (Aj) de l'enzyme dans des conditions expérimentales identiques (temps d'incubation, pH et concentration). Le pourcentage d'inhibition [%= 100(Io-Ij)/Io] de chaque substrat incubé en la présence de l'enzyme a été évalué en mesurant l'absorbance à 215 nm pour un substrat peptidique ou la fluorescence à 460 nm pour le substrat Z-Val-Lys-Met-MCA en l'absence (Io) et en la présence (L) de l'inhibiteur dans les mêmes conditions expérimentales.
Les précurseurs APP normal (APP-K595M596) et APP possédant la double mutation "suédoise" (APP-N595L596) ont été obtenus à partir d'extraits membranaires de cellules d'insectes infectées par le baculovirus contenant les gènes humains codant
pour ces précurseurs. Ces extraits membranaires, incubés avec les polypeptides de l'invention ayant une activité β-secrétase purifiés, sont analysés par immunoblot en utilisant l'anticorps WO-2 (Ida N. et al. (1996) J. Biol Chem 271, 22908-22914) dirigé contre les premiers acides aminés du peptide β amyloïde et l'anticorps monoclonal 22C11 (Boehringer Mannhein; Hilbich C. (1993) Journal of Biochemical Chemistry, 268, 26571-26577) dirigé contre le motif NH2-terminal du précurseur.
EXEMPLES
Exemple 1. Mise en évidence des activités enzymatiques
Cet exemple a pour but de mettre en évidence des activités enzymatiques dans des lignées cellulaires humaines de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer.
Deux approches ont été utilisées pour la mise en évidence des protéases susceptibles d'être impliquées dans la maturation de l'APP humain.
Approche Immunolosia e:
A partir des 13 lignées cellulaires humaines décrites dans Matériel et Méthodes, la recherche des activités enzymatiques a été réalisée à l'aide de l'anticorps monoclonal 22C11 pour sélectionner les lignées cellulaires ayant la capacité de produire des quantités mesurables d'APP au niveau de la membrane et dans le milieu de culture cellulaire. L'anticorps monoclonal WO-2 a été utilisé pour révéler et identifier les différents sites de clivage de l'APP.
Les résultats sont les suivants :
- l'anticorps monoclonal 22C11 a permis de sélectionner 8 lignées cellulaires (HMCB, MRC5, Hs27, SW1088, SW1783, H9, THP1 et IM-9) sur les 13 testées au total. Pour les cellules choisies, l'analyse par immunoblot a aussi montré une différence de masse moléculaire entre l'APP membranaire (120 kDa) et les APP solubles (110-100 kDa). Ceci indique que le précurseur a subi, au niveau de sa séquence COOH-terminale, un ou plusieurs clivage(s) enzymatique(s).
- L'analyse par immunoblot des entités moléculaires générées dans les 8 lignées sélectionnées à permis de révéler et d'identifier au moyen de l'anticorps monoclonal WO-2 les différents sites de clivage de l'APP et de montrer que le précurseur du peptide Aβ a subit une maturation différentielle.
Ainsi, cette approche a permis de sélectionner des lignées cellulaires ayant la capacité de produire des quantités mesurables d'APP au niveau de la membrane et dans le milieu de culture cellulaire et de montrer des clivages enzymatiques dans le précurseur du peptide Aβ .
Substrats peptidiques:
Les peptides [KMD]APP(-5,+5) et Z-Val-Lys-Met-MCA (voir Matériel et Méthodes), dérivés de l'APP et mimant le site de clivage, ont été utilisés comme substrats pour la mise en évidence des différentes activités enzymatiques présentes dans les 8 lignées cellulaires.
Une analyse combinée (HPLC, composition en acides aminés et détermination des séquences) des fragments générés par clivage du substrat [KMD]APP(-5,+5) a été réalisée dans les lignées sélectionnées. En effet, après incubation du substrat [KMD]APP(-5,+5) avec les surnageants, les fragments générés ont été d'abord séparés par HPLC sur une colonne reverse phase RPCig (VYDAC) éluée par un gardient de 5-40% d'acétonétrile / 0.05% TFA. La séquence et/ou la composition en acides aminés de ces fragments ont été déterminés par les techniques classiques.
Les résultats de cette analyse ont permis d'identifier un clivage majoritaire au niveau de la liaison peptidique Met''-Asp+1 (correspondant au site Met596-Asp597 dans l'APP entier) et 2 clivages minoritaires au niveau des liaisons Ser"5-Glu"4
(correspondant au site Ser592-Glu593 dans l'APP entier) et Ala+2-Glu+3 (correspondant au site Ala -Glu5 dans l'APP entier) dans chacune des 8 lignées sélectionnées.
Une analyse du profil d'inhibition des activités enzymatiques des 8 lignées cellulaires, vis à vis du substrat fluorescent Z-Val-Lys-Met-MCA, a été également effectuée (Tableau 2).
Les résultats de cette dernière analyse ont permis de révéler l'existence d'activités enzymatiques majeures de type serine (inhibition par l'aprotiniηe et le pefabloc) et métallo-protéase (inhibition par l'EDTA et le phosphoramidon) dans chacune des 8 lignées sélectionnées (Tableau 2)
Exemple 2. Purification et caractérisation de l'activité β-secrétase
Cet exemple a pour but de décrire la purification et de mettre en évidence les caractéristiques des polypeptides de l'invention ayant une activité β-secrétase.
Sur la base de la sélection des 8 lignées cellulaires humaines et des résultats obtenus dans l'exemple 1, la lignée cellulaire THP-1 a été choisie, en raison de son cycle cellulaire rapide permettant d'obtenir de grandes quantités de protéines, pour être utilisée comme modèle pour la purification de l'activité β-secrétase recherchée selon le protocole de purification décrit dans "Matériels et Méthodes".
Une analyse de l'activité résiduelle des fractions présentant des activités protéolitiques vis-à-vis des substrats Z-Val-Lys-Met-MCA et [KMD]APP(-5,+5) a été réalisé dans le but de poursuivre la purification des polypeptides de l'invention. A chaque étape de purification, les différentes fractions ont été d'abord mises en contact avec le peptide Z-Val-Lys-Met-MCA afin d'isoler les fractions présentant des activités endoprotéolytiques. Ces dernières fractions sont ensuite testées vis-à-vis du
peptide [KMD]APP(-5,+5) afin d'isoler celles qui clivent préférentiellement ce substrat peptidique au niveau de la liaison peptidique Met"'-Asp+I (corcespondant au site Met596-Asp597 dans l'APP entier). Les résultats de ces travaux ont permis de mettre en évidence différentes fractions présentant des activités endoprotéolytiques, isolées à partir de surnageants des 8 cultures cellulaires sélectionnées, en utilisant en parallèle ces deux substrats.
Lors de la dernière étape du procédé de purification qui est une chromotographie d'exclusion sur colonne TSK 2000 (voir dans Matériel et Méthodes pour les caractéristiques), plusieurs fractions protéiques ont été obtenues. La mesure de l'activité résiduelle de ces fractions vis-à-vis du peptide
[KMD]APP(-5,+5) a permis d'obtenir une seule fraction ayant une activité de type β- secrétase. Sa caractérisation a été effectuée par la mesure du poids moléculaire en éléctrophorèse sur gel de polyacrilamide, la mesure du point isoéléctrique, la recherche de l'activité maximale en fonction du pH ainsi que le profil d'inhibition par des inhibiteurs classiques ("Matériels et Méthodes").
L'analyse par éléctrophorèse a été réalisée sur un gel de polyacrylamide 4- 20% sur Phast-system (Pharmacia) en conditions dénaturantes ou normales et montre une bande de masse moléculaire voisine de 70 kDa.
Le maximun d'activité, vis-à-vis du peptide [KMD]APP(-5,+5), a été observé à des pH situés entre 7 et 8.
Le profil d'inhibition de cette fraction, vis à vis du peptide [KMD]APP(- 5,+5), montre qu'il s'agit d'une serine protéase: les pourcentages d'inhibition calculés étant respectivement de 100% pour le PMSF, 75% pour le pefablock, 25% pour le TPCK, 10%o pour la benzamidine et de 0% pour l'antipapaïne. Cet exemple décrit donc le procédé de purification ainsi que la recherche et la mise en évidence des différentes caractéristiques des polypeptides de l'invention ayant une activité β-secrétase.
Exemple 3. Spécificité de l'activité β-secrétase
Cet exemple décrit l'analyse de l'activité β-secrétase des polypeptides de l'invention.
Cette spécificité a été analysée en utilisant différents substrats, tel que :
- des peptides mimant ou reproduisant la séquence des acides aminés du précurseur au niveau du site de clivage et décrits dans le tableau 1.
- le précurseur du peptide β amyloïde dans sa forme naturelle et mutée (mutation suédoise)
Les polypeptides de l'invention ont été mis en contact avec les différents substrats et le pourcentage de clivage de ces substrats à été calculé. Les résulats sont présentés dans le Tableau 3.
Pour les peptides synthétiques, l'analyse des données, regroupées dans le tableau 3, fait apparaître les caractéristiques concernant l'importance de quelques sous-sites impliqués dans la reconnaissance du substrat par cette β secrétase et permettent du conclure que :
1) Les sous-sites Pi et P sont essentiels (Partie A du tableau 3) et ce quelque soit la taille des substrats. Il a été remarqué que la double mutation (Lys-Met=>Asn- Leu) abolit totalement le clivage enzymatique.
2) Les sous-sites P et Pi sont interactifs ou coopératifs (Partie B du tableau 3) En effet, une simple substitution en P2 (Lys=>Asn) ou en Pi (Met=>Leu) décroît uniquement le taux de clivage alors que la double mutation dite "suédoise" abolit la reconnaissance du substrat.
La substitution du résidu en P2 (Lys= Arg) se traduit par une différence entre les taux de clivage des peptides ayant Leu en Pi ([KLD]-APP(-5,+5) et [RLD]-APP(-5,+5)) plus importante que celle observée pour les substrats ayant Met en Pi ([KMD]-APP(-
5,+5) et [RMDJ-APP(-5,+5))
3) La taille et/ou le volume du résidu en Pi sont importants (Partie C Tabl.3):
Le taux de clivage enzymatique décroît quand la contrainte exercée sur le squelette peptidique par la chaine latérale du sous-site Pi augmente. En effet, les expériences réalisée permettent d'obtenir un classement du taux de clivage en fonction de la substitution effectuée : [KMD]-APP(-5,+5) > [KLD]-APP(-5,+5) > [KID]-APP(-5,+5) > [KVD]-APP(-5,+5)
4) Le résidu du sous-site P'i est nécessairement Asp ou Glu (Partie D Tab.3): En effet,les résultats ont montrés que la mutation de Asp par Asn ou Gin n'abolit pas le clivage du substrat; de plus,le clivage se produit au site Ala-Glu équivalent du site Met-Asp; en outre, le pseudo site Ala-Glu n'est accessible que dans le substrat naturel car, dans les mêmes conditions d'expériences, le taux de clivage du fragment APP(l,5) n'est que de 35%. Ainsi, sur la base des résultats obtenus précédemment avec les polypeptides de l'invention au niveau de la spécificité de clivage de type β-secrétase, on peut envisager l'obtention d'inhibiteurs compétitifs avec le site de clivage Met-Asp de nature peptidique, pseudo-peptidique ou non peptidique.
Pour les précurseurs d'origine membranaire du peptide β amyloïde, les produits de clivage des précurseurs complets (fùll-length) "normal" (APP- K595M596) et "double muté" (APP- N595L596) par les polypeptides pour lesquels l'activité β- secrétase a mise en évidence dans les exemples 1 et 2, ont été révélés par immunoblot en utilisant les anticorps 22C11 et WO-2 (voir Matériel et Méthodes).
L'analyse des molécules par ces anticorps montre que le pourcentage de clivage du précurseur APP-KM augmente alors que celui du précurseur APP-NL reste quasiment nul, et ce quel que soit les temps d'incubation au contact de l'enzyme. En effet, les résulats présentés dans la figure 3, montrent que :
. pour les membranes bac.NL, c'est à dire les membranes incubées comportant le précurseur APP-NL, les mêmes bandes sont retrouvées quelquesoit les conditions d'expérience (colonnes 1, 2, et 3 ). Ainsi on ne constate pas de clivage par les polypeptides de l'invention .
pour les membranes bac.WT, c'est à dire les membranes incubées comportant le précurseur naturel APP-KM, une nouvelle bande vers 12 kDa est apparue dans la colonne 3 par comparaison aux deux autres colonnes. La colonne 1 représente les membranes non incubées sans enzyme, la colonne 2 représente les membranes incubées à 37° C sans enzyme, alors que la colonne 3 corcespond aux membranes incubées à 37° C avec les polypeptides de l'invention présentant une activité de type β-secrétase. Il est à noter que la différence d'intensité des bandes entre les colonnes 1 et 2 des membranes bac.WT est due à la quantité de produit de départ déposé sur le gel.
L'analyse par l'anticorps WO-2 à permis de révéler cette nouvelle bande de masse moléculaire d'environ 12 kDa et qui correspond au fragment COOH terminal issu du clivage du précurseur par la β secrétase au niveau de la liaison Met-Asp. Cette analyse permet de conclure au clivage du précurseur naturel APP-KM par les polypeptides de l'invention .
Ce résultat indique donc que le précurseur APP-KM, et non le précurseur APP-NL, a été clivé de façon sélective, et confirme les données obtenues avec les peptides substrats APP de 10, 20 ou 40 acides aminés.
En outre, cet exemple démontre que les polypeptides de l'invention isolés précédemment ont une activité de type β-secrétase spécifique du précurseur naturel du peptide β amyloïde.
Tableau 1: tableau des peptides de différentes tailles mimant ou reproduisant le site de clivage de la β-secrétase, synthétisés pour être utilisés comme substrat dans la caractérisation et la specifité enzymatique du polypeptide selon l'invention.
Tableau 2: Profil d'inhibition des activités enzymatiques des 8 lignées cellulaires sélectionnées vis à vis du peptide Z-Val-Lys-Met-MCA, exprimé en pourcentage d'activité.
Tableau 3 : résultats de l'analyse de la spécificité enzymatique du polypeptide de l'invention en utilisant des peptides mimant ou reproduisant la séquence des acides aminés du précurseur APP, au niveau du site de clivage.
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12)-Schonlein et al., (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 45-53 13)- Ida N.et al.(1996) J. Biol Chem 271, 22908-22914 "Analysis of heterogeneous βA4 peptides in human cerebrodpinal fluid and blood by a newly-developed sensitive Western blot assay".
Claims
1. Polypeptide possédant une activité de type β-secrétase caractérisé en ce qu'il est capable de cliver de manière spécifique le précuseur naturel du peptide β- amyloïde (APP).
2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que le précurseur du peptide β-amyloïde (APP) ne porte pas de mutation dans sa séquence protéique.
3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide purifié à partir de cellules humaines de sujet non atteint par la maladie d'Alzheimer.
4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il :
- possède une masse moléculaire d'environ 70 Kda.
- possède un point isoéléctrique d'environ 6.0
- est une endopeptidase de la famille des serines protéases
- est une endopeptidase de type chymotrypsine sensible - atteint une activité maximale à un pH compris entre 7 et 8.
5. Polypeptide selon la revendication 4 caractérisé en ce que son activité n'est pas dépendante d'un second subtrat et/ou ligand.
6. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce que son activité n'est pas dépendante d'ions et de préférence de cations calciques ou magnésiques.
7. Composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable de cliver au site β-secrétase le précurseur du peptide β-amyloïde, obtenu par reproduction des
motifs actifs du polypeptide selon les revendications 1 à 6 par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques.
8. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence signal.
9. Polypeptide selon la revendication 8 caractérisé en ce que la séquence signal est choisie parmi la séquence du peptide signal de IgkB, le peptide signal de l'APP, les peptides signal des sous-unités des récepteurs nicotiniques de Facétylcholine musculaires et centraux .
10. Procédé de purification à partir de cellules provenant de sujets non atteints par la maladie d'Alzheimer, d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'on réalise les étapes suivantes :
-le surnageant de la culture cellulaire est prélevé puis concentré
-le produit de concentration est à nouveau concentré sur membrane tangentielle -le produit obtenu est ensuite purifié par chromatographies successives et notamment par chromatographies d'exclusion, échangeuses d'ions et d'interaction hydrophes.
11. Utilisation d'une lignée cellulaire humaine représentative du Système Nerveux Central ou Périphérique et du Système Immunitaire et capable de réaliser le métabolisme normal du précurseur du peptide β amyloïde pour la production des polypeptides de l'invention définis selon les revendications 1 à 9. De manière préférée la lignée cellulaire sélectionnée est la lignée THP1 (ATCC TIB 202) issue de monocyte.
12. Utilisation d'une lignée cellulaire humaine représentative du Système Nerveux Central ou Périphérique et du Système Immunitaire et capable de réaliser le
métabolisme normal du précurseur du peptide β amyloïde pour la mise en évidence de composés capables d'inhiber l'interaction entre le polypeptide selon les revendications 1 à 9 et son substrat. De manière préférée la lignée cellulaire sélectionnée est la lignée THP1 (ATCC TIB 202) issue de monocyte.
13. Anticorps ou fragment d'anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 et en ce qu'il possède la faculté d'inhiber au moins en partie l'interaction entre le dit polypeptide et le précurseur du peptide β-amyloïde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide tel que défini selon la revendication 1 et/ou d'intervenir sur le métabolisme du peptide β-amyloïde .
14. Procédé de mise en évidence ou d'isolement de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction du polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 et le précurseur du peptide β-amyloïde et/ou d'inhiber l'activité dudit polypeptide, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes : a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée exprimant un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 9 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle- ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.
15. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 1 à 9, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 14.
16. Ligand selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un antagoniste, d'un agoniste ou d'un inhibiteur du polypeptide défini selon les revendications 1 à 9.
17. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un inhibiteur du polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9.
18. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 13 et/ou un ligand selon la revendication 15.
19. Compositions pharmaceutiques dans lesquelles les peptides, anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 13, ligands et/ou séquences nucléotidiques correspondantes définis selon la revendication 15 sont associés entre-eux ou avec d'autres principes actifs.
20. Composition selon l'une des revendications 17 à 19 destinée à inhiber au moins en partie l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide β- amyloïde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide.
21. Composition selon l'une des revendications 17 à 20 destinée à intervenir sur le métabolisme du peptide β-amyloïde et de préférence pour inhiber ou ralentir la production de peptide β-amyloïde.
22. Composition selon l'une des revendications 17 à 21 destinée au traitement des maladies neurodégeneratives.
23. Composition selon la revendication 22 destinée au traitement de la maladie d'Alhzeimer .
24. Utilisation d'un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication
13 et/ou un ligand selon la revendication 15 pour inhiber au moins en partie l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide β-amyloïde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide et/ou intervenir sur le métabolisme du peptide β- amyloïde.
25. Utilisation d'un anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 13 et/ou un ligand selon la revendication 15 comme médicament, notamment pour le traitement des maladies neurodégeneratives et en particulier la maladie d'Alhzeimer.
26. Utilisation des polypeptides selon les revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies neurodégeneratives et notamment la maladie d'Alhzeimer.
27. Utilisation des polypeptides selon les revendications 1 à 9 pour la mise en évidence de ligands des polypeptides et/ou de composés capables d'inhiber au moins en partie l'interaction entre le polypeptide et le précurseur du peptide β- amyloïde et/ou d'inhiber l'activité du polypeptide et/ou d'intervenir sur le métabolisme du peptide β-amyloïde.
28. Méthode de mise en évidence de molécules qui modifient l'activité des polypeptides de l'invention, comportant les étapes suivantes :
- on met en contact les polypeptides de l'invention qui présente une activité de type β-secrétase avec une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées.
- on met en contact le mélange réactionnel décrit dans l'étape précédente avec le subtrat des polypeptides de l'invention qui est préférentiellement l'APP dans sa forme naturelle
- on mesure l'activité β-secrétase sur l'APP
- on détecte et/ou on isole les molécules qui modifient l'activité β-secrétase des polypeptides de l'invention.
29. Vecteur viral ou plasmidique contenant les séquences nucléotidiques des molécules agonistes ou antagonistes des polypeptides de l'invention pour la transfection dans des cellules hôtes appropriées, des dites séquences et l'expression in vivo, ex-vivo et/ou in vitro des dites molécules agonistes ou antagonistes des polypeptides de l'invention
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