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WO1999063085A1 - ADN ASSOCIE A UNE GLOMERULONEPHRITE A DEPOTS MESANGIAUX D'IgA - Google Patents

ADN ASSOCIE A UNE GLOMERULONEPHRITE A DEPOTS MESANGIAUX D'IgA Download PDF

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Publication number
WO1999063085A1
WO1999063085A1 PCT/JP1999/002855 JP9902855W WO9963085A1 WO 1999063085 A1 WO1999063085 A1 WO 1999063085A1 JP 9902855 W JP9902855 W JP 9902855W WO 9963085 A1 WO9963085 A1 WO 9963085A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
protein
seq
sequence
nephropathy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1999/002855
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuyoshi Ishiwata
Mikiko Sakurada
Ayako Kawabata
Satoshi Nakagawa
Tatsunari Nishi
Tetsuro Kuga
Shigemasa Sawada
Masami Takei
Kenji Shibata
Akiko Furuya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to AT99922568T priority Critical patent/ATE537257T1/de
Priority to JP2000552279A priority patent/JP4474496B2/ja
Priority to AU39563/99A priority patent/AU3956399A/en
Priority to EP99922568A priority patent/EP1085090B1/en
Priority to CA2329683A priority patent/CA2329683C/en
Publication of WO1999063085A1 publication Critical patent/WO1999063085A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention relates to a novel DNA whose expression fluctuates in leukocytes of a patient with Ig A nephropathy as compared to leukocytes of a healthy person, a method for obtaining the DNA, a novel protein encoded by the DNA, an antibody recognizing the protein, Method for detecting the protein and the DNA, and IgA assay
  • the present invention relates to a method for diagnosing and treating nephropathy.
  • IgA nephropathy is chronic glomerulonephritis characterized by the deposition of IgA immune complexes, which are thought to be of blood origin, in the glomeruli of the kidney. In Japan, it accounts for more than 30% of primary renal diseases, and is the single most common renal disease, of which 15 to 30% has a poor prognosis and shifts to renal failure. However, the underlying cause of the disease in Ig A nephropathy is still unknown, so there is no fundamental cure. In addition, definitive diagnosis of IgA nephropathy is a method in which a biopsy of a part of the kidney is used to confirm the deposition of the IgA immune complex in the mesangium by immunological staining. Is big.
  • T cells are responsible, and in 1 8 eight patient's peripheral ChoHoso cells, inter one is site force in Reports that the production of leukin 4, interleukin 5, interleukin 6, or TGF-, 3 (transforming growth factor- ⁇ ) is higher than in healthy subjects [Clinical & And 'Experimental'& Experimental Immuonlogy), 103, 125 (1996), Kidney International, 46, 862 (1994)], peripheral lymphocytes Reports that tegrins VLA (very late activation) -4 and VLA-5 are more strongly activated [Nephrology, Dialysis, Transplantation, iS, 1342 (1995 )] Power?
  • IgA nephropathy causes an excess of IgA production due to abnormalities in the immune system, and IgA immune complexes in the blood deposit on the glomeruli, thereby activating the complement system. There have been no reports of the cause of force IgA nephropathy that is thought to affect glomerular damage. Disclosure of the invention
  • a novel DNA involved in IgA nephropathy a method for obtaining the DNA, a novel protein involved in IgA nephropathy, a method for producing the protein, an antibody recognizing the protein, and the protein or the DNA, the protein, Therapeutic agents using antibodies ⁇ Diagnostic agents are desired.
  • the present invention is useful for these problems.
  • the present invention relates to the following (1) to (21).
  • An IgA nephropathy-related DNA having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 33 and SEQ ID NOs: 41 to 44, or a DNA that hybridizes with the DNA under stringent conditions.
  • An IgA nephropathy diagnostic agent comprising the DNA of (1), (2) or (3) above.
  • a therapeutic agent for IgA nephropathy comprising the DNA of (2) or (3) above.
  • a protein having an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 34 to 40, or an amino acid sequence having one or more amino acids deleted, substituted or added A protein consisting of a sequence and having an activity related to IgA nephropathy.
  • a protein characterized in that the transformant of (12) is cultured in a medium, the protein of (9) is produced and accumulated in the culture, and the protein is collected from the culture. Production method.
  • a diagnostic agent for Ig A nephropathy comprising the antibody of (14) above.
  • a therapeutic agent for IgA nephropathy comprising the antibody of the above (14).
  • composition comprising the DNA of (1), (2) or (3) and a diagnostically acceptable carrier.
  • composition comprising the DNA of (1) or (3) and a pharmacologically acceptable carrier.
  • a composition comprising the antibody of (14) and a carrier acceptable for diagnosis.
  • a composition comprising the antibody of (14) and a pharmacologically acceptable carrier.
  • the DNA of the present invention is an IgA nephropathy-related DNA, and includes, for example, a DNA having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 33 and SEQ ID NOs: 41 to 44, DNA that hybridizes under gentle conditions.
  • a DNA having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 33 and SEQ ID NOs: 41 to 44 and a DNA that hybridizes under stringent conditions are represented by SEQ ID NOs: 1 to 33 and SEQ ID NO: 4 DNA obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like as a probe with a DNA having a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences represented by 1 to 44.
  • hybridization was carried out at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 M sodium chloride using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized. Later, 0.1 to 2 times concentration SSC solution (The composition of 1 times concentration SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate. Using, 6
  • Examples of DNA that can be identified by washing the filter at 5 ° C can be given.
  • the hybridizable DNA has at least a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 33 and SEQ ID NOs: 41 to 44.
  • DNA with homology of 60% or more preferably D with homology of 80% or more NA, more preferably a DNA having a homology of 95% or more.
  • the DNA of the present invention also includes oligonucleotides and antisense oligonucleotides having a partial sequence of IgA nephropathy-related DNA.
  • oligonucleotide for example, consecutive 5 to 60 residues in a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 33 and SEQ ID NOs: 41 to 44, preferably 10 to Oligonucleotides having the same sequence as the base sequence of 50 residues can be used.
  • antisense oligonucleotides include antisense oligonucleotides of the oligonucleotides.
  • oligonucleotide include an oligonucleotide having a base sequence selected from the base sequences represented by SEQ ID NOS: 45 to 106.
  • a protein having an activity related to IgA nephropathy can be mentioned, and specifically, an amino acid selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 34 to 40.
  • a protein having an acid sequence or an amino acid sequence of the protein comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and has an activity associated with IgA nephropathy. You can give proteins.
  • the amino acid sequence of a protein having an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 34 to 40 comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, And a protein having an activity associated with Ig A nephropathy can be found in Molecular Cloning, 2nd Edition, Current 'Protocols' In-Molecula
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited. It is preferably 1 to several tens, particularly preferably 1 to several amino acids.
  • the amino acid sequence of a protein having an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 34 to 40 is required. It is preferable to have at least 60% or more, usually 80% or more, particularly 95% or more homology with the amino acid sequence.
  • the antibodies of the present invention include antibodies that recognize the above-mentioned proteins.
  • the differential 'display method [FEBS Letters, 351, 231 (1994)] was used to analyze Ig A nephropathy-related DNA. get. That is, the total RNA extracted from the cells was subjected to polymerase 'chain' reaction (PCR) using mRNA and various primers, and compared to leukocytes of healthy individuals, leukocytes of patients with IgA nephropathy. Obtain a cDNA amplified fragment of a novel gene whose expression level is significantly increased or decreased (hereinafter referred to as IgA nephropathy-related gene).
  • PCR polymerase 'chain' reaction
  • Total RNA or mRNA is prepared from leukocytes of patients with Ig A nephropathy and leukocytes of healthy persons.
  • guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987) 3] can be mentioned.
  • Examples of a method for preparing poly (A) + RNA from total RNA include an oligo (dT) -immobilized cellulose column method (Molecular 'Cloning, 2nd edition) and the like.
  • MRNA can also be prepared using a kit such as Kit;
  • CDNA was synthesized from RNA extracted from leukocytes of a patient with Ig A nephropathy and leukocytes of a healthy person by the above-mentioned method using an anchor primer in a conventional manner, and the cDN was synthesized.
  • PCR is performed on A using an anchor primer whose 5 ′ end is fluorescently labeled and an arbitrary primer to amplify cDNA.
  • An anchor primer is a primer that associates with the poly-A sequence at the 3 'end of the mRNA and has an adenine, guanine, or cytosine oligonucleotide, excluding thymidine, added to the 3, 3 end of the oligo dT sequence.
  • -It can be synthesized using a DNA synthesizer model 392 manufactured by Elmer).
  • An optional primer is an oligonucleotide that can amplify a variety of cDNA sequences and can obtain a large number of amplified DNA fragments in a single reaction, and can be obtained from Operon's Technologies. ) Co., Ltd. ⁇ PD-1 ⁇ 20, OPE-1 ⁇ 20, OPV-1 ⁇ 20.
  • the optional primer preferably has a length of about 10 bases.
  • Each of the above DNAs amplified by PCR was electrophoresed on a polyacrylamide gel, and the amount of fluorescence of the band obtained for each was measured using a fluoroimager.
  • the fluorescence intensity of each band was compared, and a gel was cut out from the region corresponding to the position of the band whose fluorescence intensity fluctuated between Ig A nephropathy patients and healthy subjects, and the DNA fragment contained in the gel was analyzed. Amplify by PCR.
  • the amplified DNA fragment is used as it is or after blunting the ends with DNA polymerase and then incorporated into a vector by a conventional method, and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)]
  • the DNA sequence of the DNA is analyzed by using a nucleotide sequence analyzer such as 373 ⁇ DNA sequencer (manufactured by Perkin Elmer). To determine.
  • Examples of the vector incorporating the amplified DNA fragment include pBluescript KS (+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) [Stratagene, Strategies, 5, 6264 (1992)], pT7Blue (Novagen), pCR ⁇ [manufactured by Invitrogen, Biotechnology, 657 (1991)] , CR-TRAP [Genehunter Co., Ltd.], pNoTA ⁇ 7 (5, ⁇ 3 ' Co., Ltd.) and the like.
  • the novelty of the base sequence determined in this way can be determined by searching base sequence databases such as GenBank, EMBL and DDBJ using a homology search program such as biast. This can be confirmed by the fact that there is no nucleotide sequence showing obvious homology, which is considered to coincide with the nucleotide sequence in one copy.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NOS: 8 to 33 and SEQ ID NOs: 41 to 44, etc. can be given.
  • the DNA fragment obtained by the above method is a partial DNA fragment of cDNA corresponding to the IgA nephropathy-related mRNA
  • the DNA obtained by the above method is used to obtain the following (1)
  • the full-length cDNA can be obtained by the method (2).
  • the entire cDNA can be obtained.
  • c Methods for preparing a DNA library include Molecular-Cloning 2nd Edition, Current Protocols “In” Molecular “Noology, and DNA loning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), or a commercially available kit, such as Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis. Four cDNA cDNA Synthesis And And Blast Cloning and Plasmid Cloning; Gibco BRL) or Zap-1 cDNA, synthesis kit (ZAP-cDNA Synthesis Kit, Stratagene). In addition, commercially available cDNA libraries such as human leukocytes c 'from Life Technologies A DNA library or the like can also be used.
  • any phage vector or plasmid vector can be used as long as it can replicate autonomously in the E. coli K12 strain.
  • ZAP Express [Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, ⁇ , 9494 (1989)]
  • Azapn (Stratagene), gtlO , Gtll
  • DNA Cloning, A Practical Approach, i, 49 (1985)] ⁇ TriplEx (Clontech), BlueMid (Clonetech), ExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia) Corp.
  • pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)]
  • pUC18 Gene, 33, 103 (1985)] and the like.
  • Escherichia coli microorganism can be used as the Escherichia coli to which the vector incorporating the cDNA is introduced.
  • Escherichia coli XL1-Blue MRF '[Smuagene, Strategies,, 81 (1992)] Escherichia coli C600
  • Escherichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] and the like can be used.
  • Selection of cDNA clones from a cDNA library can be performed using the colony-neutralization method or the plaque-hybridization method using isotopic or digoxigenin-labeled probes. (Moreki Yura I. Cloning 2nd edition).
  • the nucleotide sequence of DNA obtained by these methods can be determined by the above-described nucleotide sequence determination method.
  • the novelty of the sequence can also be confirmed by the method described above.
  • DNA having a novel nucleotide sequence obtained as described above for example, DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 7 and the like can be mentioned. it can.
  • the desired DNA can be prepared by chemical synthesis using a DNA synthesizer based on the determined nucleotide sequence of DNA.
  • the DNA synthesizer include a DNA synthesizer model 392 manufactured by Perkin-Elmer using the phosphoramidite method.
  • oligonucleotides having a partial sequence of gA nephropathy-related DNA and antisense oligonucleotides can be prepared.
  • the oligonucleotide include DNA having the same sequence as the consecutive 5 to 60 bases in the nucleotide sequence of the DNA or DNA having a sequence complementary to the DNA.
  • the melting temperature (Tm) and the number of bases of the oligos described above are not significantly changed. Creotide is preferred. Specific examples include oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOS: 45 to 106 and the like.
  • derivatives of these oligonucleotides can also be used as the oligonucleotide of the present invention.
  • a derivative oligonucleotide in which a phosphoric acid ester bond in the oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphoric acid diester bond in the oligonucleotide are N 3 ′ -P 5 ′ phosphoramide
  • Derivative Oligonucleotide converted to bond Derivative Oligonucleotide in which ribose and phosphoric acid diester bond in Oligonucleotide are converted to Peptide Nucleic acid bond, Peracyl in Oligonucleotide is C-5 propynylperacyl
  • the IgA nephropathy-related full-length DNA obtained by the method described in 1. encodes a protein having an activity related to IgA nephropathy (hereinafter referred to as IgA nephropathy-related protein) .
  • the IgA nephropathy-related protein of the present invention can be obtained by the method described in Molecular Cloning 2nd Edition or Relento Protocols 'In' Molecular Biology, etc.
  • the above Ig A nephropathy-related gene in host cells It can be expressed and manufactured.
  • DNA is prepared by substituting the nucleotide sequence of the portion encoding the protein of the present invention into a codon that is optimal for expression of a host cell. The DNA is useful for efficient production of the protein of the present invention.
  • An expression plasmid for the protein is constructed by inserting the DNA fragment or full-length cDNA into the expression vector downstream of the promoter.
  • any cells that can express the target gene such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, can be used.
  • those capable of autonomous replication in the above host cells or integration into the chromosome, and containing a promoter at a position where the DNA encoding the IgA nephropathy protein can be transcribed are used.
  • the IgA nephropathy protein-encoding DNA expression vector is capable of autonomous replication in the bacterium and has a promoter, a ribosome binding sequence, and an IgA nephropathy protein-encoding DNA. And a recombinant vector comprising a transcription termination sequence. A gene that controls a promoter may be included.
  • Expression base Kuta one for example, pBTrp2, pBTacU P BTac2 (all commercially available from Beri Nga one Mannheim), pKK233- 2 (Pharmacia Co.), pSE280
  • the promoter may be any promoter that functions in the host cell.
  • a promoter P iTE
  • promoter PI
  • P L promoter P L promoter
  • P R promoter promoters you derived from E. coli
  • file one di- such as T7 promoter, SP 0 1 promoter, SP 0 2 promoter
  • pen P Promoters can be given.
  • artificially designed and modified promoters such as a promoter (Ptre_x2) having two Ps in tandem (Ptre_x2), m ⁇ promoter, letl promoter [Gene, 4, 29 (1986)], and lacT7 promoter. Can be.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., for example, Escherichia coli XL 1 -Blue, Escherichia coli XL2-Blue , Escherichia coli DH1, Escherichia coli MCI 000, Escherichia coli KY3276,
  • Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum
  • acetoacidophilum ATCC 13870 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354,
  • Pseudomonas putida Pseudomonas sp. D-01 10 can open.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above-described host cells.
  • a method using calcium ions for example, a method using calcium ions
  • yeast When yeast is used as a host cell, expression vectors such as YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS 15 etc. can be exemplified.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast, for example, promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, Examples include the ga11 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFMF1 promoter, CUP1 promoter and the like.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the deviation can also be used.
  • the method of electrification Methods.
  • an animal cell is used as a host cell, as an expression vector, for example, pcDNA1, pcDM8 (manufactured by Funakoshi), pAGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990) ), PAS3-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pc DN AI / Amp (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen) , PAGE103 [J. Biochem .. 101.1307 (1987)], pAGE210 and the like.
  • pcDNA1, pcDM8 manufactured by Funakoshi
  • pAGE107 JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990)
  • PAS3-3 Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • pCDM8 [Nature, 3
  • any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • the promoter of the IE (immediate early) gene of cytomegalovirus (human CMV) and the early promoter of SV40 can be used.
  • SR promoter and the like can be mentioned. Further, the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Host cells include Namalwa cells, human cells, COS cells, monkey cells, CHO cells, Chinese hamster cells,
  • any method capable of introducing DNA into animal cells can be used.
  • an electoral poration method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • a calcium phosphate method Japanese Patent Application Laid-Open No. 227075/1995
  • the Lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84—, 7413 (1987)]
  • the transformant can be collected and cultured according to the method described in JP-A-2-22775 or JP-A-2-257789.
  • an insect cell for example, a baculovirus expression vector, a lab-laboratory manual (Baculovims Expression
  • Proteins can be expressed by the method described in, for example, Vectors, A Laboratory Manual), current 'Protocols' in Molecule-biology, BioTechnology, 47 (1988).
  • the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in the culture supernatant of insect cells, and then the recombinant virus is infected to insect cells to express the protein. Can be done.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacin (both manufactured by Invitrogen) and the like.
  • Autographa califormca nuclear polyhedrosis virus- # which is a virus that infects insects of the night moth family
  • Autographa califormca nuclear polyhedrosis virus- # can be used.
  • Insect cells include Sf9 and Sf21, which are ovarian cells of Spodoptera frugiperda (Baculovirus' Expression 'Vectors, A' Laboratories.Manual, Le (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual), WH Freeman and Company, New York
  • Co-transfection of the above-mentioned recombinant gene transfer vector into insect cells and the above baculovirus to prepare a recombinant virus includes, for example, the calcium phosphate method.
  • examples of the expression vector include Ti plasmid, a tobacco mosaic virus vector, and the like. Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the geneactin 1 promoter.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • host cells include plant cells such as octopus, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alf alfa, rice, wheat, and wheat.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into a plant cell.
  • Agrobacterium Agrobactenum
  • WO94 / 00977 Agrobacterium (Agrobactenum)
  • JP-A-60-251887 Agrobactenum
  • a method using a particle gun Gene gun
  • Patent No. 2606856, Patent No. 2517813 Patent No. 2606856, Patent No. 2517813
  • a method for expressing a gene in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular 'Cloning, 2nd edition.
  • a protein having a sugar chain or a sugar chain When expressed by yeast, animal cells, insect cells, or plant cells, a protein having a sugar chain or a sugar chain can be obtained.
  • the transformant of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, Ig A nephropathy-related protein is produced and accumulated in the culture, and the protein is collected from the culture to obtain Ig A nephropathy.
  • Related proteins can be produced.
  • the method for culturing the transformant for producing the Ig A nephropathy-related protein of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the medium for culturing these transformants may be a carbon source, a nitrogen source, an inorganic Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium contains salts and the like and can efficiently culture the transformant.
  • Any carbon source may be used as long as the transformant can assimilate, such as glucose, Fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • assimilate such as glucose, Fructose, sucrose, molasses containing these
  • carbohydrates such as starch or starch hydrolysate
  • organic acids such as acetic acid and propionic acid
  • alcohols such as ethanol and propanol
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or inorganic salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, and cornsprika. , Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells and digests thereof can be used.
  • potassium (I) phosphate potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin / tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • a microorganism transformed with an expression vector using a promoter such as isopropyl-1,, 3-D-thiogalactobyranoside (IPTG) can be used.
  • IPTG isopropyl-1,, 3-D-thiogalactobyranoside
  • IAA indoleacrylic acid
  • RPMI 1640 medium As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as host cells, commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association. 199. 519 (1967)], Eag 1 e MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium (Virology, 8.396 (1959)), 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine. 73, 1 (1950)], or fetal bovine serum, etc. Media or the like can be used.
  • Culture is carried out usually p H 6 ⁇ 8, 3 0 ⁇ 4 0 ° C, 5% C 0 2 under the conditions such as the presence 1-7 days.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • Insect cells as a medium for culturing the transformant obtained as the host cell, commonly used media such as TNM-FH medium [Pharmin g en Co.], Sf-900IISFM medium
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C, etc. for 1 to 5 days. If necessary, an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ.
  • a culture medium for culturing the transformant commonly used Murashige 'And' Scoog (MS) medium, white (White) medium, or a plant formone such as auxin or cytokinin added to these mediums Media or the like can be used.
  • the cultivation is usually performed at pH 5 to 9, 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector into which DNA encoding the protein of the present invention has been incorporated is cultured according to a conventional culture method.
  • the protein can be produced by producing and accumulating the protein and collecting the protein from the culture.
  • Gene expression methods include, besides direct expression, molecular.
  • Secretory production, fusion protein expression, etc. can be performed according to the method described in the second edition.
  • Methods for producing the protein of the present invention include a method of producing the protein in a host cell, a method of secreting the protein out of the host cell, and a method of producing the protein on the host cell outer membrane. by changing the structure, it can be this and force? to select the method.
  • the protein of the present invention is produced in a host cell or on a host cell outer membrane, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)] and the method of Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA.86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], or the methods described in JP-A-05-336963, JP-A-06-823021, etc.
  • the protein can be actively secreted out of the host cell.
  • the protein of the present invention is expressed in a form in which a signal peptide is added in front of the protein containing the active site of the protein of the present invention using a gene recombination technique, whereby the protein of the present invention is actively secreted outside the host cells. Can be done.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like. Furthermore, by redifferentiating the cells of the transgenic animal or plant, an animal into which the gene has been introduced (transgenic non-human animal) or a plant (transgenic plant) can be created.
  • the protein of the present invention can also be produced using an individual.
  • the protein is raised or cultivated according to a usual method to produce and accumulate the protein, and the protein is collected from the individual animal or plant to obtain the protein. Can be manufactured.
  • Methods for producing the protein of the present invention using animal individuals include, for example, known methods, American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996), Bio / Technology, 9, 830 (1991)], and a method for producing the protein of the present invention in an animal constructed by introducing a gene.
  • a transgenic non-human animal into which the DNA encoding the protein of the present invention has been introduced is bred, the protein is produced and accumulated in the animal, and the protein is collected from the animal.
  • a production / accumulation site in the animal where the protein can be produced for example, milk (JP-A-63-309192), eggs, etc. of the animal can be mentioned.
  • the promoter used in this case any promoter that can be expressed in animals can be used. Examples thereof include the ⁇ -casein promoter, which is a promoter specific to mammary cells,, 3-casein promoter overnight, and lactoglobulin. Promoter, whey acidic protein promoter and the like are preferably used.
  • a transgenic plant into which a DNA encoding the protein of the present invention has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, 20 (1994), tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], producing and accumulating the protein in the plant, and collecting the protein from the plant to obtain the protein. There is a method of producing.
  • the protein of the present invention when expressed in a dissolved state in cells, after completion of the culture, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated, a french press, a Mentongaulin homogenizer. The cells are disrupted using a Dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, , Getylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei) Anion exchange chromatography using resins such as W
  • a purified sample can be obtained by using the gel filtration method, affinity chromatography method, chromatofocusing method, or electrophoresis methods such as isoelectric focusing alone or in combination. If the insoluble form is formed in the cells, the cells are collected, crushed, and centrifuged to recover the insoluble protein as a precipitate fraction. The recovered insoluble form of the protein is solubilized with a protein denaturant.
  • a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia)
  • hydrophobic chromatography using a resin such as butyl sepharose, phenyl sepharose, molecular sieve
  • the solubilized solution is diluted or dialyzed to reduce the concentration of the protein denaturant in the solubilized solution, thereby returning the structure of the protein to a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample of the protein can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein or its derivative such as a sugar chain adduct can be recovered from the culture supernatant. That is, the culture supernatant is recovered from the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. be able to.
  • Examples of the protein thus obtained include a protein having an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 34 to 40.
  • the protein expressed by the above method can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (butyloxycarbonyl method).
  • a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (butyloxycarbonyl method).
  • Kuwawa Trading US Advanced ChemTech
  • Perkin-Elmer Japan US Perkin-Elmer
  • Pharmacia Biotech Suden Pharmacia Bioch
  • Aroka US Protein Technology Instrument
  • Kurabo Industries US Synthecell-Vega
  • Japan Perceptive 'Limited US Perceptive 'Limited
  • Shimadzu Corporation etc. It can also be synthesized by using a synthesizer.
  • a purified full-length or partial fragment of the protein obtained by the above method 2 or a peptide having a partial amino acid sequence of the protein of the present invention is used as an antigen.
  • the partial peptide for antigen a protein partial sequence of about 5 to 30 residues is selected.
  • a partial sequence existing on the surface of the protein in a three-dimensional structure is selected as an antigen peptide. Is preferred.
  • the part present on the protein surface in the three-dimensional structure is determined by the method of Kyte and Dooi ittle [Journal of Molecular Biology, 157, 105-132 (1982)] and the like.
  • a partial peptide When a partial peptide is used as an antigen, it can be crosslinked with another protein by adding a cysteine to the terminal.
  • the N-terminus of the peptide When the internal sequence of the protein is selected, the N-terminus of the peptide is acetylated and the C-terminus is amidated as necessary.
  • Partial peptides can be synthesized by a general liquid phase or solid phase peptide synthesis method, a method of appropriately combining them, or a method analogous thereto [International Journal of Peptide Protein Research, 35, 161]. -214 (1990), Methods in Enzymology, 289, (1997), Methods in Molecular Biology, 35, (1994)].
  • an automatic peptide synthesizer can be used.
  • Peptide synthesis using a peptide synthesizer is available from Shimadzu Beptide Synthesizer, Advanst. (Advanced ChemTech Inc., USA, hereafter abbreviated as ACT) N-sides appropriately protected on a commercially available peptide synthesizer such as a peptide synthesizer.
  • ACT Advanced ChemTech Inc.
  • -Fmoc-amino acid or N. -It can be carried out using Boc-amino acids according to the respective synthesis programs.
  • ABI Shimadzu, Kokusan Chemical, NovaBiochem, Watanabe Chemical, ACT, Anaspec Inc., or Peptide Research Laboratories It can be obtained from K.K.
  • a polyclonal antibody can be prepared by administering the antigen obtained by the above method to an animal.
  • Animals such as rabbits, goats, rats, mice, hamsters, and the like can be used for the administration.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to 100 g per animal.
  • Immunization involves administering the antigen subcutaneously, intravenously, or intraperitoneally to the animal along with an appropriate adjuvant (for example, Complete Freund's Adjuvant, aluminum hydroxide gel, and pertussis vaccine). This is done by If the antigen is a partial peptide, a conjugate is prepared with a carrier protein such as BSA (key serum albumin) or KLH (Keyhole Limpet hemocyanin) and used as an immunogen.
  • an appropriate adjuvant for example, Complete Freund's Adjuvant, aluminum hydroxide gel, and pertussis vaccine.
  • BSA key serum albumin
  • KLH Keyhole Limpet hemocyanin
  • the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Blood is collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and the reaction of the serum with the antigen is confirmed by enzyme immunoassay '/ £ [Ant ibodies-A Laboratory Manu, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] I do.
  • a serum is obtained from a non-human mammal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and a polyclonal antibody is obtained by separating and purifying the serum. can do.
  • Methods for separation and purification include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, and prillic acid precipitation (Antibodies, A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)), or DEAE-Cephalometric And column chromatography, anion exchange column, protein A or G-column or gel filtration column, etc., which are used alone or in combination.
  • Monoclonal antibodies are prepared by fusing the antibody-producing cells with non-human mammal-derived myeloma cells to produce hybridomas, and administering the hybridomas to animals culturing the hybridomas to cause the animals to develop ascites cancer. It can be prepared by separating and purifying the culture solution or ascites.
  • spleen cells As the antibody-producing cells, spleen cells, lymph nodes, and antibody-producing cells in peripheral blood, particularly splenocytes, are suitably used.
  • the spleen is removed 3 to 7 days after the last administration of the antigenic substance to the rat showing the antibody titer.
  • the spleen is shredded in MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with forceps, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded.
  • MEM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the spleen cells of the obtained sediment fraction were treated with Tris ammonium chloride buffer (pH 7.65) for 1 to 2 minutes to remove red blood cells, and then washed three times with MEM medium. Is used as an antibody-producing cell.
  • myeloma cells use cell lines obtained from mice or rats.
  • an 8-azaguanine-resistant mouse derived from BALB / c
  • myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (hereinafter abbreviated as P3—U1) [Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 8i, 1 (1978), Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) iJ. Immunol ..
  • the antibody-producing cells obtained in (a) and the myeloma cells obtained in (b) were mixed with MEM medium or PBS (1.83 g of disodium phosphate, 0.21 g of monopotassium phosphate, salt 7.
  • a 1% BSA-containing PBS solution (hereinafter abbreviated as 85-? 85) is dispensed into 100-200 O 1 Z holes, and the solution is left at room temperature for 1-2 hours or 1-2 at 4 ° C. ⁇ Leave the plate to block (block) the remaining protein binding residues on the plate.
  • the antibody After blocking, discard the BSA-PBS and wash the plate thoroughly with PBS.
  • a polyclonal antibody obtained by purifying from the immunized animal serum or antiserum, a hybridoma culture supernatant or a purified antibody obtained in (d) described below as the first antibody the antibody is used in an amount of 1 to 10 gZm. Dispense 1 to the plate in a 20 to 1001 Z well and leave it at room temperature for 2 to 3 hours or at 4 ° C overnight.
  • anti-immunoglobulin antibodies 1 to 50 ( «8 / / 111 1) labeled as second antibodies with biotin, enzymes, chemiluminescent substances or radioactive compounds Is dispensed in 50 to 1001 / well portions, and reacted at room temperature for 1 to 2 hours.
  • HT medium medium obtained by removing aminopterin from HAT medium
  • second time Uses a normal medium
  • the moon water is collected from the mouse having the water cancer and centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to remove solid matter.
  • a monoclonal antibody can be purified and obtained in the same manner as in the polyclonal method.
  • the antibody subclass is determined using a mouse monoclonal antibody evening kit or rat monoclonal antibody typing kit.
  • the protein content is calculated by the oral method or the absorbance at 280 nm.
  • the base sequence portion to be amplified may be any base sequence region of mRNA, but the length of the base sequence is 50 bp to 2 kbp, and the repetitive sequence is GC (guanine 'cytosine) salt.
  • GC guanine 'cytosine
  • RNA / DNA antisense-oligonucleotide
  • the antisense oligonucleotide (RNA / DNA) described in 1. is used, for example, as a part of the base sequence of DNA encoding the protein described in 2.
  • Antisense-oligonucleotides having a 50 base sequence can be mentioned.
  • the IgA-related protein of the present invention can be obtained using the DNA described in 1. and the method described in 2.
  • an antibody can be produced by the method described in 3.
  • the antibodies described in 3. can be used to immunologically detect or quantify Ig A nephropathy-related proteins.
  • Examples of the immunological detection method include an ELISA method using a microtiter plate, a fluorescent antibody method, a western blot method, and an immunohistological staining method.
  • Sanditsuchi EL I SA method Epitopu of antibodies using two different monoclonal antibodies reactive with the protein of the present invention in the liquid phase, labeled with a radioisotope such as 125 1 And a radioimmunoassay method using the protein of the present invention and an antibody that recognizes the protein of the present invention.
  • the antibody according to 3. can be used for the treatment or prevention of IgA nephropathy c
  • An acceptable carrier may be added.
  • FIG. 1 shows a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114 (compound
  • FIG. 2 is a diagram showing the results obtained by immunizing with a conjugate of 1) and KLH (manufactured by Calbiochem) and examining the binding reactivity of the obtained rat antiserum to the compound 1 by enzyme immunoassay.
  • the left shows the results of the binding reactivity with Compound 1 and the right shows the results of the binding reactivity with the control peptide.
  • R1 to R3 indicate antisera from three rats immunized with compound 1, and NRS indicates normal rat sera.
  • FIG. 2 shows a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115 (compound
  • FIG. 2 is a diagram showing the results obtained by immunizing with a conjugate of 2) and KLH, and examining the binding reactivity of the obtained rat antiserum to the compound 2 by enzyme immunoassay.
  • the left shows the results of the binding reactivity with Compound 2 and the right shows the results of the binding reactivity with the control peptide.
  • R1 to R3 represent antisera from three rats immunized with compound 2, and NRS represents normal rat sera.
  • FIG. 3 shows a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116 (compound
  • FIG. 6 shows the results of examining the binding reactivity of the obtained rat antiserum to compound 3 by immunization with a conjugate of 3) and KLH by enzyme immunoassay. on the left The results of the binding reactivity to compound 3 and the binding reactivity to the control peptide are shown on the right.
  • R1 to R3 represent antisera from three rats immunized with compound 3, and NRS represents normal rat sera.
  • FIG. 4 shows a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117 (compound
  • FIG. 4 shows the results of examining the binding reactivity of the obtained rat antiserum to the compound 4 by immunization with a conjugate of 4) and KLH by enzyme immunoassay.
  • the left shows the results of the binding reactivity with Compound 4 and the right shows the results of the binding reactivity with the control peptide.
  • R1 to 3 indicate antisera from three rats immunized with compound 4, and NRS indicates normal rat serum.
  • FIG. 5 shows a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 118 (compound
  • FIG. 5 is a diagram showing the results obtained by immunizing with a conjugate of 5) and KLH and examining the binding reactivity of the obtained rat antiserum to the compound 5 by enzyme immunoassay.
  • the left shows the results of the binding reactivity to Compound 5, and the right shows the results of the binding reactivity to the control peptide.
  • R1 to 3 indicate antisera from three rats immunized with compound 5, and NRS indicates normal rat serum.
  • FIG. 6 shows a peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 119 (compound
  • FIG. 6 shows the results of examining the binding reactivity of the obtained rat antiserum to compound 6 by immunization with a conjugate of 6) and KLH by enzyme immunoassay.
  • the left shows the results for the binding reactivity with compound 6, and the right shows the results for the binding reactivity with the control peptide.
  • R1 to 3 indicate antisera from three rats immunized with compound 6, and NRS indicates normal rat serum.
  • FIG. 7 shows a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 120 (compound
  • FIG. 7 shows the results obtained by immunizing with a conjugate of 7) and KLH, and examining the binding reactivity of the obtained rat antiserum to the compound 7 by enzyme immunoassay.
  • the left shows the results of the binding reactivity with Compound 7, and the right shows the results of the binding reactivity with the control peptide.
  • R1 to R3 were the antisera of three rats immunized with compound 7, Indicates normal rat serum.
  • FIG. 8 shows the immunoreactivity of a rat antiserum obtained by immunization with a conjugate of a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121 (compound 8) and KLH, and enzyme immunoassay. It is a figure showing the result checked by the method. The left shows the results of the binding reactivity with Compound 8, and the right shows the results of the binding reactivity with the control peptide. R1 to R3 show antisera from three rats immunized with compound 8, and NRS shows normal rat sera.
  • Example 1 Differential display of leukocytes from patients with Ig A nephropathy and healthy subjects
  • the buffy coat of the intermediate layer was transferred to another centrifuge tube as a leukocyte fraction.
  • RNAs were obtained using the AGPC method [Experimental Medicine 2, 1937, (1991)] or the RNA collection kit RNeasy (QIAGEN).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • reaction solution was added to a TE buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM ninatrium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) (pH 8.0)] 4
  • PCR was performed at 94 ° C for 3 minutes, at 40 ° C for 5 minutes, at 72 ° C for 5 minutes, and then at 95 ° C for 15 seconds, at 40 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C.
  • the reaction was carried out for 27 cycles, with the process consisting of 1 minute at ° C as one cycle, and finally the reaction was carried out under the condition of reacting at 72 ° C for 5 minutes.c
  • the optional primer is Operon's Technologies' PD-1-20, 0PE-1-20 and OPV-1-20.
  • a total of 180 sets of reactions combining one of the 60 types, and a total of 18 reactions of the combination of the fluorescently labeled anchor primer FGH and the optional primer OPB-2 (Operon 'Technologies) was performed for one entire RNA.
  • the PCR reaction solution 4 mu 1 of each electrophoresis sample solution was added (95% formamide, 0.1% Kishirenshiano Ichiru, 0.1% Brom phenol blue) 3 1, 2 minute at 10 5 ° C Immediately after heating, the mixture was ice-cooled, and electrophoresis was performed at 6% acrylamide gel, 1500 V for 2.5 hours.
  • As the electrophoresis buffer 89 mM Tris, 89 mM boric acid, and 2 mM EDTA were used. Fragments amplified by PCR were detected and compared by measuring the fluorescence of the gel after electrophoresis using a fluoromeasure (Molecular Dynamics, Inc.). Compared to the five healthy subjects, the band significantly increased or decreased was recorded in 5 leukocytes of Ig A nephropathy patients.
  • Approximately 1 Z4 of the excised gel contains distilled water 38 / _1, 10 XPCR buffer 5 / 2.5 mM dNTP4 / 1, anchor primer (no fluorescent labeling: Saudi Technology Inc.) 3 4, "M) 0.6 ⁇ I, 10 ⁇ Add optional primer 2 ⁇ 1, D ⁇ ⁇ Polymerase Gene Taq 0.51, heat at 94 ° C for 3 minutes, then 95 ° C Perform a 30-cycle reaction with a cycle consisting of 15 seconds at 40 ° C for 2 minutes and 72 ° C for 1 minute, and finally react at 72 ° C for 5 minutes to perform PCR.
  • the solution after the c reaction was extracted with phenol-chloroform (1: 1), After extraction with Moisoamyl alcohol (24: 1), ethanol precipitation was performed.
  • the obtained precipitate (amplified DNA fragment) was dissolved in a TE buffer and subjected to 1.5% low melting point agarose gel [SEA PLAQUE GTG (manufactured by FMC Bioproducts)] electrophoresis.
  • the obtained precipitate (amplified fragment) was dissolved in 101 TE buffer.
  • Amplified fragment 1 mu 1 and PCR fragment cloning vector one P T7BlueT- Vector a (Nova Gen Corp.) 1 1 were mixed, DNA ligase Chillon kit ver .1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) using a kit accompanying
  • the amplified fragment was incorporated into the plasmid according to the manual described in (1).
  • Escherichia coli DH5 «(manufactured by Gibco BRL) is transformed according to a known method, and the transformant is applied to an LB agar medium containing 50 g of ampicillin. Thereafter, the cells were cultured overnight at 37 ° C.
  • the grown transformant resistant to ampicillin was suspended in 20 u1 of distilled water, and 10 XPCR buffer 2.5 ⁇ ⁇ , 2.5 mM dNTP 2 ⁇ I, 34, "M anchor primer 0.3 1, 1 0 mu Micromax any primer 1 1, was added DNA polymerase one peptidase Gene Taq 0.5 mu 1, performing PCR and electrophoresis under the same conditions as above reamplification amplified fragments, as long as the time of the first differential. display The fragment was confirmed to amplify.
  • the nucleotide sequence of the amplified fragment was determined using DN Sequencing (PerkinElmer). In the determination of the nucleotide sequence, the method of PerkinElmer's Dye primer cvcle sequencing kit and the manual attached to the kit were used. Using a restriction enzyme that can cleave the restriction enzyme site present in the determined base sequence, cut the reaction product obtained during the above-mentioned Differential Display, perform electrophoresis, and perform electrophoresis corresponding to the cut amplified fragment. Band migration position changes and 7 o
  • the obtained base sequence is compared with the base sequence database GenBank, and the base sequence that does not exist in the existing base sequence in the database or the base sequence in the database that matches only with the expressed sequence tag is compared. 6 6 clones were selected.
  • Example 1 all RNs obtained from 5 patients with Ig A nephropathy and 5 healthy subjects
  • a Single-stranded cDNA was synthesized for 2 g of each using a single-stranded cDNA synthesis kit Superscript preamplification system (manufactured by BRL) according to the method attached to the kit.
  • RT-PCR was performed by the following method, and the expression level of mRNA corresponding to each amplified fragment was detected.
  • leukocyte single-stranded cDNA 101 distilled water 15.8 i, 10 XPCR buffer 41, 2.5 mM d NTP 3.2 / i, DMS O 21, 10 ⁇ ⁇ Gene-specific 5 'terminal sense primer 1-2 1 ⁇ Gene-specific 3, antisense primer 21, 1 unit DN DN diluted to 1 ⁇ Add 2 ⁇ 1 of polymerase GeneTaq ⁇ After heating at 97 ° C for 5 minutes and cooling in ice for 5 minutes, a cycle consisting of 30 seconds at 94 ° C, 1 minute at 65, and 2 minutes at 72 ° C is defined as 2 cycles. Eight cycles of PCR were performed.
  • the primers for these genes are reacted with the cDNA derived from the mRNA of the sample leukocyte by RT-PCR, and the gene amplification is observed, thereby making it possible to diagnose IgA nephropathy.
  • the cDNA containing the nucleotide sequence of the amplified fragment obtained by differential display was used for gene trapper analysis and plaque hybridization of the cDNA library.
  • 5'-RACE method was used to clone appropriately. C The method is described below.
  • the cDNA library was converted into single-stranded DNA (corresponding to the antisense strand side of the cDNA) by using Gene II protein and exonuclease II, followed by biotinylation specific to each gene. Oligonucleotides (using a 5'-side sense primer specific to each gene used for RT-PCR in Example 2) were used as probes for hybridization.
  • the single-stranded cDNA clone hybridized with the probe was isolated.
  • the double-stranded DNA is converted into double-stranded DNA using DNA polymerase, and E. coli is transformed with the double-stranded DNA, thereby containing the cDNA clone. A transformant was obtained.
  • the obtained transformant was suspended in distilled water 181, and 10 XPCR buffer solution 2.5 ⁇ l, 2.5 mM dNTP21, 10 M gene-specific 5, side sense primer 1 ⁇ 10 M gene-specific 3, side antisense primer 1 D Add DNA polymerase GeneTaq 0.5 ⁇ l13, perform ⁇ CR under the same conditions as for R PCR—PCR, and perform electrophoresis.
  • a transformant in which a fragment having a length deduced from the position of the primer was amplified was isolated as a cDNA clone.
  • Example 2 Before performing plaque hybridization on each library, the same procedure as in Example 2 was performed using the cDNA library 1 as a type II, using each gene-specific RT-PCR primer used in Example 2. Then, PCR was performed, and a library in which a fragment having a length deduced from the position of the primer was amplified was selected as a library containing a cDNA clone of the target gene.
  • plaque DNA was blotted onto a nylon membrane Hybond N + (Amersham).
  • Plasmid containing the amplified fragment of each gene obtained by differential display of Example 1 as type ⁇ was used as a primer, and a primer specific to each gene used in RT-PCR of Example 2 was used as a primer.
  • PCR DIG labeling-mix Boheringer Mannheim
  • Hybridization and detection of positive plaques were carried out according to the manual of Boehringer-Mannheim using the amplified and labeled gene-specific fragments as probes.
  • RNA was prepared by guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymology, J 4, 3 (1987)]. 320.7 g of total RNA was obtained from a total of 200 ml of blood. W 3085
  • RNA (272.6 g) was passed through an oligo dT cellulose column to obtain 10.7 ⁇ g of mRNA as poly (A) + RNA.
  • mRNA 6.9; g was obtained from another four patients with Ig A nephropathy.
  • the above specific method is a method according to the manual of Stramgene.
  • the cDNA was dissolved in 36 1 of distilled water, and a 10X reaction buffer [500 mM Tris—HC 1 (pH 7.6), 100 mM Mg C 15, , 100 mM DTT2.51, lOmM ATP2.51, 6 units // 1 T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) 4 ⁇ l!
  • the mixture was reacted at 30 ° C. for 30 minutes to phosphorylate the 5 ′ end of the applied Ec0RI adapter.
  • the eluate was put on a potassium acetate solution having a concentration gradient of 5 to 20%, ultracentrifuged at 500,000 rpm for 3 hours, and fractionated into 21 from the bottom using a peristaltic pump. I took it out.
  • Cloning vector ZAP ⁇ (Stratagene) 9 g (9 ⁇ I) in 10 ⁇ H restriction enzyme buffer (Takara Shuzo) 10 ⁇ 1, distilled water 75 ⁇ I, Ec0RI 90 units ( 6; 1) was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • the solution was extracted with black form, and the aqueous layer was precipitated with ethanol to recover vector DNA, which was dissolved in a TE buffer.
  • Packaging was performed using phage packaging kit Giga-Pack Gold II (Stratagene tt). Specific reagents and methods used were those described in the manual attached to the kit.
  • the obtained phage was infected with Escherichia coli XL 1 -B 1 ue MR F 'strain and assayed in Thailand.
  • the cDNA library was amplified once to obtain a final cDNA library.
  • the specific method of titer measurement and library amplification was in accordance with the manual provided with the sphage packaging kit. In the screening of the present invention, one library from the fraction (H) containing cDNA of about 3 kb or more was used.
  • the 5′-RACE was performed on the IgA nephropathy patient cDNA prepared in (B) using 5′RACE System ver.2 (manufactured by Life Technologies). The specific method followed the manual attached to the kit.
  • a method for cloning each of the obtained cDNA clones A: Gentrano, °-method, B: Plaque hybridization of a cDNA library, c: 5, one-RACE method.
  • the nucleotide sequence of the cDNA portion of each of the obtained cDNA clones was determined using 377 DNA sequencer manufactured by Parkin Elma. The specific reagents and methods for sequencing are as follows. Use PerkinElmer's Dyeprimer cycle sequensine FS Ready Reaction kit and use the attached kit. Followinged the manual. In addition, this base sequence was translated into an amino acid sequence in three frames, and it was examined whether or not an open reading frame (ORF) consisting of 100 amino acids or more was present.
  • ORF open reading frame
  • a specific primer corresponding to the portion near the 5 'end of the cDNA of GT I NP 303 A-41a (SEQ ID NO: 110, 11 5′-RACE was performed using the sequence shown) to obtain a cDNA clone INP303AR1.
  • another cDNA clone from the NB-1 cDNA library INP 303 A ph 1 was obtained by plaque hybridization. -Acquired 3.
  • nucleotide sequence of the cDNA of INP303A consisting of 4276 bp shown in SEQ ID NO: 1 was determined.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 41) of the fragment obtained by Differential 'Display matched the nucleotide sequence of the complementary strand corresponding to positions 2797 to 3101 of SEQ ID NO: 1. From this, the anchor primer was not the 3, terminal po1yA sequence of mRNA, but was annealed to the complementary strand of the sequence in which T existing at positions 2782 to 2795 of SEQ ID NO: 1 were continuous. it was thought.
  • 0 RF consisting of 230 amino acids (corresponding to positions 53 to 742 of SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 34). was done.
  • C OH l.1 which is one of the proteins predicted to encode C. elegans genomic clone C40H1
  • CPEBP mouse cytoplasmic Polyadenylation elememt binding protein
  • amino acid sequence immediately after the portion where these proteins show homology to the INP303A protein may show homology to the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence from positions 3346 to 3577 of SEQ ID NO: 1. all right. This indicates that the nucleotide sequence of INP 303A was aberrant splicing while the 2639 bp nucleotide sequence (corresponding to positions 7133 to 3352 of SEQ ID NO: 1), which is originally considered to be an intron, remained. It was assumed to be cDNA.
  • the nucleotide sequence of the fragment whose expression level was 5 'increased in IgA nephropathy patients obtained by Differential' Display was in this inserted sequence, and such abnormal splicing was observed in IgA nephropathy patients. It was found that the raised mRNA was elevated.
  • the protein translated from the mRNA that has undergone the abnormal splicing is a protein encoded by the original INP 303A gene, that is, a protein encoded by the nucleotide sequence excluding intron (estimated from homology) (295 amino acids). Has a different amino acid sequence from the 220th position onwards, and it is highly likely that it does not exert its original function.
  • the base sequence of the cDNA of the gene trapper method cDNA clone GT I NP 377A-46C was determined, and the obtained base sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of the fragment obtained by differential display was identical to the nucleotide sequence of the complementary strand corresponding to positions 759 to 1014 of SEQ ID NO: 2. This suggests that the anchor primer did not anneal to the 3'-terminal po1yA sequence of the mRNA, but to the complementary strand of the T-sequence sequence at positions 745 to 757 of SEQ ID NO: 2. Since the sequence of the fragment is considered to be present in the nucleotide sequence considered to be an intron of LUCA15, the mRNA having such abnormal splicing is elevated in IgA nephropathy patients. it was thought.
  • the protein encoded by GT I NP 377 A—46 C is 143 amino acids (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 35), and the protein encoded by the original LUCA 15 cDNA (8 15 amino acids) ) Is different from the amino acid sequence at positions 37 and beyond, and it is highly likely that the amino acid sequence does not exhibit its original function.
  • An I NP 379A cDNA clone PH I NP 379A-16-2 was obtained by plaque hybridization of a leukocyte cDNA library from an Ig A nephropathy patient.
  • the Xh0I site and the p01yT sequence were found on the side considered to be the 5 'end, and the clone in which the cDNA was inserted in the vector in the reverse direction. was thought to be.
  • the base sequence complementary to the obtained base sequence which is the base sequence of the original cDNA, is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence of the fragment obtained by differential display is shown in SEQ ID NO: 3.
  • INP40 1 A cDNA clones PH I NP 40 1 A—8–1 and PHINP 40 1 A—14 1 by black hybridisation of leukocyte cDNA library from IgA nephropathy patients Got one.
  • both cDNAs differed by only one base and that there was 0 R F consisting of the same 133 amino acids except that they differed by 1 amino acid.
  • the nucleotide sequences of the 5 ′ untranslated region and the 3 ′ untranslated region were also different, and the presence of mRNAs with different polymorphism and splicing of the gene was presumed.
  • the nucleotide sequence of PH I NP 40 1 A—8—1 is shown in SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence of PH I NP 401 A-14-1 is shown in SEQ ID NO: 5, and PHINP 40 1 A—8—1 is coded.
  • the amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by PHINP401A-14-1 is shown in SEQ ID NO: 38.
  • SEQ ID NO: 4 is SEQ ID NO: 4 from position 960 to 1217, and SEQ ID NO: 5 from 1313 to 1
  • the anchor primer is not the poly A sequence at the 3 'end of the mRNA, but rather the sequence of the T sequence at positions 947 to 959 in SEQ ID NO: 4 or 1302 to 1312 in SEQ ID NO: 5. It was considered to have been annealed to the complementary strand.
  • the nucleotide sequence of the fragment used was a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of PHINP401A-8-1 and PHINP401A-14-1.
  • the protein encoded by INP401A may be a secretory protein, in which case, the amino acid sequence at positions 1 to 15 of SEQ ID NO: 37 or 38 is Presumed to be a signal peptide.
  • the Jintoratsuba one method the force tries to get the c DN A clone I NP 332 A?, Is in the nucleotide sequence of the c DNA clones obtained GT I NP 332 A- 2 1, Di Faren of I NP 332 A There was no nucleotide sequence matching the Char-Display amplified fragment, and it was considered to be a cDNA clone of another gene.
  • a primer (based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 105 and 106) based on the nucleotide sequence was used to compare I and I with a healthy subject by the method described in Example 2.
  • the expression level of the gene by RT-PCR was examined in leukocytes of patients with gA nephropathy, the expression level of leukocytes in patients with IgA nephropathy was found to be 4.6 times higher than in healthy individuals .
  • SEQ ID NO: 6 shows the nucleotide sequence of the cDNA of PHGT I NP 332 A-221-1
  • SEQ ID NO: 39 shows the amino acid sequence of the protein encoded by the ORF.
  • the amino acid sequence of the ORF has a function of binding to phosphorylated tyrosine.
  • the protein was found to be homologous to the SH2 domain such as 3,4,5-trisphosphate-5-phosphatase.
  • nucleotide sequence of the INM063-7 consisting of 43443bp shown in SEQ ID NO: 7 was determined.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8) of the fragment obtained by Differential 'Display was identical to the nucleotide sequence of the complementary strand corresponding to SEQ ID NO: 7 at positions 2809 to 2964. From this, the anchor primer did not anneal to the po1yA sequence at the 3 'end of the mRNA, but to the complementary strand of the T-sequence sequence at positions 2965 to 2974 in SEQ ID NO: 7. was considered one.
  • the base sequence of the cDNA of INM06 3—7 consisting of 4 433 bp includes an ORF consisting of 343 amino acid (corresponding to the 1st to 109th positions of SEQ ID NO: 7; amino acid sequence). The sequence is shown in SEQ ID NO: 40.) was found.
  • the nucleotide sequence of INM063—7 has a nucleotide sequence of 288 bp (corresponding to nucleotides 104 to 3832 of SEQ ID NO: 7) which is originally considered to be an intron. Therefore, it was presumed that INM063-7 was cDNA resulting from abnormal splicing.
  • the amino acid sequence of each protein was analyzed, and a portion considered to be suitable as a peptide antigen was selected from the highly hydrophilic portion and the N-terminal and C-terminal amino acid sequences, and compounds 1 to 8 (SEQ ID NO: 1) were selected. 1 2) was synthesized from 14. The physicochemical properties of the compounds were measured by the following methods.
  • Mass spectrometry was performed by the FAB-MS method using JEOL JMS-HX110A.
  • Amino acid analysis was performed according to the method of Cohen, SA (Analytical Biochemistry, 222, 19 (1994)).
  • the hydrolysis was performed in hydrochloric acid vapor at 110 ° C. for 20 hours, and the amino acid composition of the hydrolyzate was analyzed using a Waters AccQ-Tag amino acid analyzer (manufactured by Waters).
  • Fm0c-I1e 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-1-L-isoleucine
  • carrier resin Wang resin, Nono resin Five
  • Biochem (52. lmg) was placed in a reaction vessel of an automatic synthesizer (ACT), 0.5 ml of DMF was added, the mixture was stirred for 3 minutes, and the solution was drained. I got it.
  • ACT automatic synthesizer
  • a solution obtained by adding 25% of piperidine to N, N-dimethylformamide (hereinafter abbreviated as DMF) (hereinafter abbreviated as a 25% piperidine-DMF solution) is applied to 1 ml of the mixture to form a mixture. Stir for minutes and drain the solution. Again, 1 ml of a 25% piperidine-DMF solution was added, the mixture was stirred for 10 minutes, and the solution was discharged.
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • NMP monohydrate NMP solution containing methylpyrrolidone
  • DIPC 1-diisopropylcarboimide
  • 2- (1H-benzotriazole-11-yl) -11,1,3,3-tetramethylperonium hexafluorophosphate (HBTU) is 0.5M
  • DIEA diisopropylethylamine
  • step (c) N "-191-fluorenylmethyloxycarbonyl-0-t-butyl-L-threonine instead of Fmo c—A sp (O t Bu) —OH [Hereinafter, it is abbreviated as Fmoc—Thr (tBu) OH]
  • step (d) Fm0c is repeated in the step (e).
  • Fmo c—P he OH Fluorenylmethyloxycarbinol L-Fenilalanine
  • Fmo c—P he—OH Fluorenylmethyloxycarbinol L-Fenilalanine
  • Fmo c—P he—OH Fluorenylmethyloxycarbinol L-Fenilalanine
  • N a - 9 Furuorenirumechi Ruo alkoxycarbonyl one L- glycine
  • Fmo c- G 1 y- OH Furuorenirumechi Ruo alkoxycarbonyl one L- glycine
  • Fmo c-a sp (O t B u) one OH N "- 9-Furuo Renylmethyloxycarbonyl-monoglutamic acid 7-t-butyl ester
  • the Fmoc group removal step of (b) was performed.
  • the obtained resin was washed sequentially with methanol and butyl ether, and dried under reduced pressure for 12 hours to obtain a carrier resin to which the side chain-protected peptide was bound.
  • trifluoroacetic acid hereinafter abbreviated as TFA
  • TFA trifluoroacetic acid
  • thioanisole 5% thioanisole 5%
  • water 5% ethyl methyl sulfide 3%
  • 1,2-ethanedithiol 2.5% 1,2-ethanedithiol 2.5%
  • thiophenol 2 % Of a mixed solution of lm 1 was added and left at room temperature for 8 hours to remove the side chain protecting groups and to cut out the peptide from the resin.
  • Fmo c—NH carrier resin to which 25 mo 1 is bound (Rink Amide BHA resin, manufactured by Novabiochem) Starting from 45.5 mg, mo c—G lu was obtained in the same manner as (1)-(i).
  • Fmo c—NH, 25 ⁇ mo I bound carrier resin (Rink Amide BHA resin, manufactured by Novabiochem) Starting from 45.5 mg, Fm 0 c—G was obtained in the same manner as (1)-(i). 1 y—OH, N.
  • Fm0c-Va11-OH One 9-fluorenylmethyloxycarbonyl-L-valin (hereinafter abbreviated as Fm0c-Va11-OH), Fmoc-Lys (Boc) -OH, N.
  • Fmo c—A 1 a—OH 9-fluorenylmethyloxyl-ponyl-l-alanine
  • Fmo c—C ys (T rt) -1 OH 9-fluorenylmethyloxyl-ponyl-l-alanine
  • TFA 9-fluorenylmethyloxyl-ponyl-l-alanine
  • T rt 9-fluorenylmethyloxyl-ponyl-l-alanine
  • Fmo c—P ys carrier resin to which 25 mo 1 is bound (Wang resin, manufactured by Novabiochem) 4 9.
  • Fmo c—L ys is obtained in the same manner as (1)-(i).
  • (B oc) — OH, Fmo c— G ly— OH, Fmo c— P he— 0 H, Fmo c— H is (T rt) OH, Fmo c— L eu— OH, Fmo c— I le— OH , Fmo c—L eu—OH, Fmo c—Ser (tBu) _OH, Fmo c—V al—OH, Fmo c—A rg (Pmc) —OH, F moc—Lys (B oc) ⁇ OH, Fmo c—A sp (O t Bu) — OH, Fm oc-I 1 e -OH, Fm
  • Fmoc-Met-OH One 9-fluorenylmethyloxycarbonyl-L-methionine
  • Fmoc-Leu-OH Fmoc-Arg
  • Fmoc-Arg Pmc
  • Fmoc Fmoc
  • Fmoc—Ala-OH Fmoc—Ser (tBu)
  • Fmoc—Cys (Trt) a carrier resin to which the side-chain protected peptide was bound was obtained.
  • Bound carrier resin black port trityl resin, Nobabi Okemu Inc.
  • Bound carrier resin black port trityl resin, Nobabi Okemu Inc.
  • Bound carrier resin black port trityl resin, Nobabi Okemu Inc.
  • Bound carrier resin black port trityl resin, Nobabi Okemu Inc.
  • Bound carrier resin black port trityl resin, Nobabi Okemu Inc.
  • Bound carrier resin black port trityl resin, Nobabi Okemu Inc.
  • conjugates of compounds 1 to 8 obtained in (1) above and KLH were prepared by the following method and used as immunogens.
  • THY thyroglobulin
  • the 1% BSA-PBS was discarded, and the antiserum to be immunized was dispensed in 5017 wells and reacted for 2 hours.
  • Tween added to PBS with 0.05% Tween (hereinafter abbreviated as 0.05% Tween—PBS)
  • peroxidase-labeled heron anti-rat immunoglobulin manufactured by Dako was added at 501 / well and room temperature was added.
  • ABT Color is developed using S-substrate solution [2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazolu-l-6-sulfonic acid) ammonium], and the absorbance at OD4 15 nm is measured with a plate reader (Ema; Wako Pure Chemical Industries). It was measured.
  • the diagnosis and treatment of Ig A nephropathy can be performed by using the DNA, protein and antibody obtained by the present invention. Sequence listing free text

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Description

I g A腎症関連 DNA
技術分野
本発明は、 健常人の白血球と比較して Ig A腎症患者の白血球で発現が変動す る新規 DNA、 該 DNAの取得方法、 該 DNAによりコードされる新規蛋白質、 該蛋白質を認識する抗体、 該蛋白質および該 DNAの検出方法、 ならびに I gA 明
腎症の診断および治療法に関する。
田 背景技術
I g A腎症とは、 血中由来と考えられる I g A免疫複合体が腎臓の糸球体内に 沈着することを特徴とする慢性糸球体腎炎である。 日本では原発性腎疾患の 3 0%以上を占め、 単一の腎疾患としては最も多く、 そのうちの 1 5〜 3 0%は予 後不良で腎不全へ移行する。 しかしながら、 I g A腎症の疾患の原因はまだ不明 であるため、 根本的な治療法はない。 また、 I g A腎症の確定診断は、 腎臓の一 部を生検し、 メサンギゥムにおける I g A免疫複合体の沈着を免疫学的染色によ り確認する方法であるため、 患者への負担は大きい。
約 50%の 1 g A腎症の患者において血中 I g Aの値が高いことが報告されてい る [ディジージズ · ォブ ·ザ · キドニー （Diseases of the Kidney) 第 5版 (1993)、 ネフロン （Nephron) ,29, 170 (1981)] 。 血液中の I g Aの産生は B細胞が、 その 産生の制御は T細胞が担っているといわれており、 また、 1 8八患者の末梢丁細 胞において、 サイ ト力インであるインタ一ロイキン 4、 インターロイキン 5、 ィ ンターロイキン 6あるいは TGF— ,3 (transforming growth factor- β )の産生が健常 人に比べて高いという報告 〔クリニカル ' アン ド ' ェクスペリ メ ンタル ' ィムノ 口ジー（Clinical & Experimental Immuonlogy), 103, 125 (1996)、 キドニー · インター ナショナル (Kidney International), 46, 862 (1994)〕 、 末梢リンパ球において、 ィン テグリ ンである V L A (very late activation)— 4および V L A— 5がより強く活性 化しているという報告 〔ネフロロジー、 ダイアリシス、 トランスプランテーショ ン（Nephrology, Dialysis, Transplan tion)，iS， 1342 (1995)] 力？なされている。 これら のことから、 I g A腎症は免疫系の異常により I g Aの産生が過剰となり、 血液 中の I g A免疫複合体が糸球体に沈着し、 それによる補体系の活性化等が糸球体 の障害に影響を及ぼしていると考えられている力 I g A腎症の原因についての 報告はこれまでのところない。 発明の開示
I g A腎症の疾患原因の解明、 治療あるレ、は患者に負担のかからない診断が望 まれている。
I g A腎症に関与する新規 DNA、 該 DNAの取得方法、 I gA腎症に関与す る新規蛋白質、 該蛋白質の製造方法、 該蛋白質を認識する抗体、 および該蛋白質 あるいは上記 DNA、 蛋白質、 抗体を用いた治療薬 ·診断薬が望まれている。 本発明はこれらの課題に対し有用である。
本発明は、 以下 （ 1) 〜 （2 1 ) に関する。
( 1 ) 配列番号 1〜 33および配列番号 4 1〜 44で表される塩基配列から選ば れる塩基配列を有する I g A腎症関連 DNAまたは該 DNAとストリンジヱント な条件下でハイプリダイズする DNA。
(2) 配列番号 1〜33で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した 5〜60残基と同じ配列を有する DNAまたは該 DNAと相補的な配列を有する DNA。
(3) 配列番号 45〜 1 06で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有する DNA。
(4) 上記 （ 1) 、 （2) または （3) の DN Aを用いる、 I g A腎症関連遺伝 子の mRN Aを検出する方法。 (5) 上記 （ 1) 、 （2) または （3) の DNAを含む、 I gA腎症診断薬。
(6) 上記 （2) または （3) の DNAを用いる、 I gA腎症関連遺伝子の転写 または I g A腎症関連遺伝子の m R Aの翻訳を抑制する方法。
(7) 上記 （2) または （3) の DNAを含む、 I gA腎症治療薬。
(8) ディファレンシャル ' ディスプレイ法を用い、 I gA腎症患者白血球より I g A腎症関連 DNAを取得する方法。
(9) 配列番号 34〜40で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を 有する蛋白質、 または該蛋白質の有するアミノ酸配列とは 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換若しくは付加したァミノ酸配列からなり、 かつ I g A腎症に関 連する活性を有する蛋白質。
(10) 上記 （9) の蛋白質をコードする DNA。
(1 1) 上記 （ 1 0) の DN Aをベクターに組み込んで得られる組換え体 DN Ac
(12) 上記 （1 1) の組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる形質転換 体。
(13) 上記 （1 2) の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に上記 （9) の蛋 白質を生成蓄積させ、 該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質 の製造方法。
(14) 上記 （9) の蛋白質を認識する抗体。
(1 5) 上記 （14) の抗体を用いる、 上記 （9) の蛋白質の免疫学的検出方法 c
(16) 上記 （14) の抗体を含有する、 I g A腎症の診断薬。
(1 7) 上記 （14) の抗体を含有する、 I g A腎症の治療薬。
(18) 上記 （1) 、 （2) または （3) の DNAおよび診断に許容される担体 からなる組成物。
(1 9) 上記 （1 ) または （3) の DNAおよび薬理学的に許容される担体から なる組成物。
(20) 上記 （14) の抗体および診断に許容される担体からなる組成物。 (2 1 ) 上記 （ 1 4) の抗体および薬理学的に許容される担体からなる組成物。 本発明の DNAは I gA腎症関連 DNAであり、 例えば、 配列番号 1〜 33お よび配列番号 4 1〜 44で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有する D N A、 および、 該 DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA をあげることができる。
配列番号 1〜 33および配列番号 4 1〜 44で表される塩基配列から選ばれる 塩基配列を有する DNAと、 ストリンジェントな条件下でハイプリダイズする D N Aとは、 配列番号 1〜 33および配列番号 4 1〜 44で表される塩基配列から 選ばれる塩基配列を有する DN Aをプローブとして、 コロニー .ハイプリダイゼ —ション法、 プラーク · ハイブリダイゼーション法あるいはサザンプロッ トハイ プリダイゼーション法等を用いることにより得られる DNAを意味し、 具体的に は、 コロニーあるいはプラーク由来の DN Aを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜 1. 0Mの塩化ナトリウム存在下、 6 5 °Cでハイブリダィゼーシヨンを 行つた後、 0. 1〜 2倍濃度の S S C溶液 （ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 1 50 mM 塩化ナトリウム、 1 5 mM クェン酸ナトリウムよ りなる） を用い、 6
5 °C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる D N Aをあげることが できる。
ノヽィブリダイセーンョンは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以下、 モレキュラー ' クロー ニング 第 2版と略す） 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレン ト ' プロトコールズ ' イン ' モレキュラー ' ノ ィォロジ一と略す) 、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うこと ができる。 ハイブリダィズ可能な D N Aとして具体的には、 配列番号 1〜 33お よび配列番号 4 1〜44で表される塩基配列から選ばれる塩基配列と少なくとも
60 %以上の相同性を有する D N A、 好ましくは 80 %以上の相同性を有する D N A、 更に好ましくは 9 5 %以上の相同性を有する D N Aをあげることができる。 更に、 本発明の D N Aとして、 I g A腎症関連 D N Aの一部の配列を有するォ リゴヌクレオチドぉよびァンチセンス · オリゴヌクレオチドも含まれる。
該オリゴヌクレオチドとして、 例えば、 配列番号 1〜 3 3および配列番号 4 1 〜 4 4で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した 5〜 6 0残基、 好 ましくは 1 0〜 5 0残基の塩基配列と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドをあ げることができ、 アンチセンス · ォリゴヌクレオチドとして、 例えば、 該オリゴ ヌクレオチドのアンチセンス · オリゴヌクレオチドをあげることができる。 該ォ リゴヌクレオチドとして、 例えば、 配列番号 4 5〜 1 0 6で表される塩基配列か ら選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
本発明の蛋白質として、 I g A腎症に関連する活性を有する蛋白質をあげるこ と力 Ϊでき、 具体的には、 配列番号 3 4〜4 0で表されるァミノ酸配列から選ばれ るァミノ酸配列を有する蛋白質、 または該蛋白質の有するァミノ酸配列とは 1若 しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、 か つ I g A腎症に関連する活性を有する蛋白質をあげることができる。
配列番号 3 4〜 4 0で表されるァミノ酸配列から選ばれるァミノ酸配列を有す る蛋白質のアミノ酸配列とは 1以上のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加したァ ミノ酸配列からなり、 かつ I g A腎症に関連する活性を有する蛋白質は、 モレキ ユラ一 . クローニング 第 2版、 カレント ' プロ トコ一ルズ ' イン - モレキユラ
― ·ノ ィォロジ一、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の方法に準じて調製することが できる。 欠失、 置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されない力 \ 1 個から数十個、 特に 1個から数個のアミノ酸であることが好ましい。 また、 本発 明のポリペプチドが I g A腎症に関連する活性を有するためには、 配列番号 3 4 〜4 0で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミ ノ酸配列と少なくとも 6 0 %以上、 通常は 8 0 %以上、 特に 95 %以上の相同性 を有していることが好ましい。
本発明の抗体は、 上述の蛋白質を認識する抗体をあげることができる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1. I g A腎症関連 DN Aの調製
I g A腎症患者および健常人の白血球における mRNAの発現量の差異に注目 し、 ディファレンシャル ' ディスプレイ法 〔FEBS Letters, 351, 231 (1994)] を利 用し、 I g A腎症関連 DNAを取得する。 即ち、 細胞から抽出した全 RNAある レ、は mRNAと、 各種プライマーとを用い、 ポリメラーゼ 'チェイン ' リアクシ ヨン （PCR) を行い、 健常人の白血球に比べ I g A腎症患者の白血球で、 その 発現量が顕著に増加あるいは減少する新規な遺伝子 （以降 I g A腎症関連遺伝子 と呼ぶ） の c D N A増幅断片を取得する。
以下、 該方法について述べる。
I g A腎症患者の白血球および健常人の白血球から全 RNAあるいは mRNA を調製する。
全 RN Aを調製する方法としては、 チォシアン酸グァニジン一トリフルォロ酢 酸セシウム法 [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)3等をあげることができる。 全 RNAからポリ （A) + RNAを調製する方法としては、 オリゴ （dT) 固 定化セルロースカラム法 （モレキュラー ' クローニング 第 2版） 等をあげるこ とができる。
更に、 ファース ト ' トラック - mRNA - アイソレーション ' キッ ト 〔Fast Track mRNA Isolation Kit;ィンビトロジェン（Invitorgen)社製〕 、 クイック · プレツ プ - mRNA · ピユリフィケーシヨン · キッ ト （Quick Prep mRNA Purification
Kit； フアルマシア社製） 等のキッ トを用いて mRNAを調製することもできる。
I g A腎症患者の白血球および健常人の白血球から上記方法により抽出した R NAから、 アンカ一プライマーを用いて常法により c DNAを合成し、 該 c DN Aに対して 5'末端を蛍光標識したアンカープライマーと任意のプライマ一を用い て PC Rを行い、 c DNAを増幅する。
アンカープライマーとは、 mRNAの 3' 末端ポリ A配列に会合する、 オリゴ dT配列の 3， 末端に、 チミジンを除くアデニン、 グァニンあるいはシトシンの オリゴヌクレオチドを付加したプライマーであり、 パーキン 'エルマ一 （Perkin - Elmer) 社製の DN A合成機モデル （model) 392等を用いて合成することができ る。
任意のプライマーとしては、 多種類の c DN Aの配列に対して増幅し、 かつ一 度の反応で多数の DN A増幅断片を得ることができるオリゴヌクレオチドのこと であり、 オペロン ' テクノロジーズ (Operon Technologies)社製の〇 P D— 1〜 2 0、 OPE— 1〜2 0、 OPV— 1〜2 0等をあげることができる。 任意プライ マーは 1 0塩基程度の長さのものが好ましい。
PCRにより増幅された上記各々の DNAを、 ボリアクリルアミ ドゲルで電気 泳動し、 それぞれについて、 得られたバン ドの蛍光量をフルォロイメージヤー
(モレキュラー - ダイナミックス社製） を用いて測定する。
各々のバン ドの蛍光量を比較し、 I g A腎症患者および健常人とで蛍光量の変 動しているバンドの位置に相当する領域のゲルを切り出し、 ゲルに含まれる DN A断片を PC Rにより増幅する。
該増幅 DNA断片をそのままあるいは DNAポリメラ一ゼで末端を平滑化後、 常法によ りベクターに組み込み、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサン ガ一(Sanger)らのジデォキシ法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕 ある レ、は 373Α · DNAシークェンサ一 〔Perkin Elmer社製〕 等の塩基配列分析装 置を用いて分析することにより、 該 DN Aの塩基配列を決定する。
該増幅 DN A断片を組み込むベクタ一としては、 pBluescript KS (+) (Stratagene 社製） 、 pDIRECT [Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)] 、 pCR-Script Amp SK (+) [Stratagene社製、 Strategies, 5, 6264(1992)] 、 pT7Blue 〔Novagen社製〕 、 pCR Π 〔インビトロジェン社製、 Biotechnology, 657 (1991)] 、 CR-TRAP 〔Genehunter社製〕 、 pNoTA τ 7 (5， →3 ' 社製） などをあげることができる。 このようにして決定された塩基配列の新規性は、 b i a s t等の相同性検索プ ログラムを用いて、 G e nB a n k、 EMB Lおよび D D B Jなどの塩基配列デ —タベースを検索することにより、 データべ一ス中の塩基配列と一致すると考え られるような明らかな相同性を示す塩基配列がないことにより確認できる。
このようにして得られた、 I g A腎症関連遺伝子の c DNAの部分 DNA断片 として、 例えば、 配列番号 8〜 3 3および配列番号 4 1〜44で表される塩基配 列を有する DNA等をあげることができる。
上述の方法で得られた DN A力 I g A腎症関連 mRNAに対応する c DNA の部分 DNA断片であった場合には、 上述の方法で得られた DNAを用いて、 下 記 （ 1 ) または （2) の方法により c DN A全長を得ることができる。
(1) c DN Aライブラリーの利用
上記 DNA断片をプローブとして、 各種 c DNAライブラリーを用いたハイブ リダイゼ一ションによるスクリーニングを行うことにより、 c DNA全長を得る ことができる。
以下に c DNAライブラリ一の作製法について述べる。
c DNAライブラリ一作製法としては、 モレキュラー - クローニング 第 2版 やカレン ト · プロ トコ一ルズ ' イン ' モレキュラー 'ノ ィォロジ一、 DNA し loning 1： Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法、 あるいは市販のキッ ト、 例えばス一パースク リプト ' プラスミ ド ' システム . フォー · c D N A · シンセシス ' アン ド · 'ブラ ス ト · クローニング [Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning； Gibco BRL社製〕 やザップ一 c D N A · シンセシス · キッ ト 〔ZAP- cDNA Synthesis Kit, ス トラタジーン社製〕 を用いる方法などがあげられる。 更 に、 市販の c D N Aライブラリ一、 例えば Life Technologies社製のヒト白血球 c ' DNAライブラリ一等を利用することもできる。
c DNAライブラリーを作成するためのクローニングベクターとしては、 大腸 菌 K 1 2株中で自立複製できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミ ツ ド ベクタ一等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express 〔Stratagene社製、 Strategies, 5, 58 (1992)] 、 pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, Π, 9494 (1989)] 、 A zapn (Stratagene社製） 、 gtlO、ス gtll [DNA Cloning, A Practical Approach, i, 49 (1985)] 、 λ TriplEx (クローンテック社製） 、 ス BlueMid (ク ローンテック社製） 、 ス ExCell (フアルマシア社製） 、 pT7T318U (フアルマシ ァ社製） 、 pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)] 、 pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] 等をあげることができる。
c DNAを組み込んだベクターを導入する大腸菌と しては、 大腸菌に属する微 生物であればいずれでも用いることができる。 具体的には、 Escherichia coli XL1- Blue MRF' 〔Smuagene社製、 Strategies， ， 81 (1992)〕 、 Escherichia coli C600
[Genetics, 39,440(1954)] 、 Escherichia coli Y 1088 [Science, 222, 778 (1983)] 、 Escherichia coli Y 1090 [Science, 222, 778 (1983)] 、 Escherichia coli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)] 、 Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)] 、
Escherichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] 等を用いることができる。
c DNAライブラリーからの c DNAクローンの選択と しては、 アイソ トープ あるいはジゴキシゲニン （digoxigenin) 標識したプロ一ブを用いたコロニ一 ' ノヽ イブリダィゼ一シヨ ン法あるいはプラーク 'ハイブリダィゼーシヨ ン法 （モレキ ユラ一 . クローニング 第 2版） によ り選択することができる。
選択されたクローンよ り常法によ り目的とする DNAを取得することができる c (2) 上述の方法によ り mRNAよ り c DNAを合成し、 該 c DNAの両端にァ ダプターを付加し、 このアダプターの塩基配列と増幅断片の塩基配列に基づいた プライマーで PCRを行う 5'— RACE (rapid amplification of cDNA ends)および 3'— RACE [Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 85, 8998 (1988)] によ り目的とする DN " Aを取得することができる。
これらの方法により取得された DNAの塩基配列は、 上述の塩基配列の決定法 により決定することができる。 該配列の新規性に関しても上述の方法により確認 することができる。
上記のようにして取得された、 新規な塩基配列を有する I g A腎症関連全長 D NAとして、 例えば、 配列番号 1〜 7で表される塩基配列を有する DN A等をあ げることができる。
以上のようにして、 一旦 I g A腎症関連全長 DN Aが取得されその塩基配列が 決定された後は、 塩基配列に基づいたプライマーを調製し、 mRNAから合成し た c DN Aあるレ、は c DN Aライブラリ一を铸型として、 PCR法 （PCR
Protocols, Academic Press (1990)〕 により目的とする DNAを取得することができ る。 また、 決定された DN Aの塩基配列に基づいて、 DN A合成機で化学合成す ることにより目的とする DN Aを調製することもできる。 DNA合成機としては、 フォスフォアミダイ ト法を利用したパーキン 'エルマ一 （Perkin-Elmer) 社製の D N A合成機モデル （model) 392等をあげることができる。
上述の方法で取得した本発明の DNAおよび DNA断片を用いて、 モレキユラ ― · クロ—ニング第 2版等に記載の常法により、 あるいは該 DN Aの塩基配列情 報より DNA合成機により、 I g A腎症関連 DNAの一部の配列を有するオリゴ ヌクレオチドおよびアンチセンス · ォリゴヌクレオチドを調製することができる。 該オリゴヌクレオチドとしては、 上記 DN Aの有する塩基配列中の連続した 5 〜60塩基と同じ配列を有する DN Aまたは該 DN Aと相補的な配列を有する D N Aをあげることができ、 具体的には、 配列番号 1〜 7で表される塩基配列中の 連続した 5〜 60塩基と同じ配列を有する D N Aまたは該 D N Aと相補的な配列 を有する D N Aをあげることができる。
センスプライマ一およびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、 両者 の融解温度 （Tm) および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴズ クレオチドが好ましい。 具体的には、 配列番号 4 5〜 1 0 6等に示された塩基配 列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
更に、 これらォリゴヌクレオチドの誘導体 （以下、 誘導体ォリゴヌクレオチド という） も本発明のオリゴヌクレオチドと して利用することができる。
該誘導体オリゴヌクレオチドとしては、 オリゴヌクレオチド中のリ ン酸ジエス テル結合がホスフォロチォェ一ト結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のリ ン酸ジエステル結合が N 3 ' - P 5 ' ホスフォアミデ 一ト結合に変換された誘導体ォリゴヌクレオチド、 ォリゴヌクレオチド中のリボ 一スとリ ン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換された誘導体ォリゴヌク レオチド、 ォリゴヌクレオチド中のゥラシルが C - 5プロピニルゥラシルで置換 された誘導体ォリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5チ ァゾ一ルゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌク レオチド、 オリゴヌクレオチド 中のシトシンが C一 5プロピニルシトシンで置換された誘導体ォリゴヌクレオチ ド、 オリゴヌクレオチド中のシ トシンがフエノキサジン修飾シ トシン （ phenoxazme - modi f ied cytos ine)で置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、 オリ ゴヌクレオチド中のリボースが 2， 一 0—プロピルリボースで置換された誘導体 オリゴヌクレオチド、 あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが 2 ' —メ トキ シェトキシリボースで置換された誘導体ォリゴヌク レオチド等をあげることがで きる 〔細胞工学， 16, 1463 (1997) ] 。
2 . I g A腎症に関連する活性を有する蛋白質の製造
1 . に記載の方法により取得した I g A腎症関全長 D N Aは、 I g A腎症に関 連する活性を有する蛋白質 （以下、 I g A腎症関連蛋白質と呼ぶ） をコードして いる。
本発明の I g A腎症関連蛋白質は、 モレキュラー · クローニング第 2版や力レ ント · プロ トコールズ ' イン ' モレキュラー · バイオロジー等に記載された方法 等を用い、 例えば以下の方法によ り、 上記 I g A腎症関連遺伝子を宿主細胞中で 発現させて、 製造することができる。
全長 c D N Aをもとに、 必要に応じて、 該蛋白質をコードする部分を含む適当 な長さの D N A断片 （以下、 I g A腎症蛋白質コード D N Aと呼ぶ） を調製する c また、 必要に応じて、 本発明の蛋白質をコードする部分の塩基配列を、 宿主細 胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した D N Aを調製する。 該 D N Aは本発明の蛋白質の効率的製造に有用である。
該 D N A断片、 あるいは全長 c D N Aを発現べクタ一内のプロモーターの下流 に挿入することにより、 該蛋白質の発現プラスミ ドを造成する。
宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的とす る遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組込みが可能で、 I g A腎症蛋白質コード D N Aを転写できる位置にプロモ —ターを含有しているものが用いられる。
細菌等を宿主細胞として用いる場合は、 I g A腎症蛋白質コード D N A発現べ クタ一は該細菌中で自立複製可能であると同時に、 プロモーター、 リボソーム結 合配列、 I g A腎症蛋白質コード D N Aおよび転写終結配列より構成された組換 えベクターであることが好ましい。 プロモーターを制御する遺伝子が含まれてい てもよい。
発現べクタ一としては、 例えば、 pBTrp2、 pBTacU PBTac2 (いずれもベーリ ンガ一マンハイム社より市販） 、 pKK233- 2 (Pharmacia社製） 、 pSE280
(Invitrogen社製） 、 pGEMEX-1 (Promega社製） 、 pQE-8 (QIAGEN社製） 、 pKYPIO (特開昭 58-1 10600) 、 pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)) 、 pLSAl (Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)] 、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)] 、 pBluescript Π SK (-) (Stratagene社製） 、 pTrs30 f Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) より調製〕 、 pTrs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408) より調製〕 、 pGHA2 ί Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400) よ り調製、 特開昭 60-221091〕 、 pG A2 ί Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798) よ り調製、 特開昭 60- 221091〕 、 PTerm2 (US468619 K
US4939094、 US5160735) 、 pSupex, pUB1 10、 pTP5、 pC194、 pEG400 [J.
BacterioL. 172. 2392 (1990)] 、 pGEX (Pharmacia社製） 、 pETシステム (Novagen 社製） 等を例示することができる。
プロモータ—としては、 宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでも よレ、。 例えば、 プロモーター （P iTE) 、 プロモーター （P I ) 、 P Lプロ モーター、 P Rプロモーター、 T7プロモーター等の大腸菌やファ一ジ等に由来す るプロモーター、 S P 0 1 プロモーター、 S P 0 2プロモーター、 p e n Pプロ モーター等をあげることができる。 また P を 2つ直列させたプロモーター ( P tre_ x 2 ) 、 m ^プロモーター、 letlプロモーター 〔Gene, 4, 29 ( 1986) 〕 、 lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いるこ とができる。
リボソーム結合配列であるシャイン一ダルガノ （ S hine-Dalgarno ) 配列と開始 コ ドンとの間を適当な距離 （例えば 6 〜 1 8塩基） に調節したプラスミ ドを用い ることが好ましい。
本発明の I g A腎症関連遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではな いが、 好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。 宿主細胞としては、 ェシエリ ヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 ブレビバクテ リウム属、 コリネバクテリウム属、 ミクロバクテリウム属、 シユードモナス属等 に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XL 1 -Blue, Escherichia coli XL2-Blue、 Escherichia coli DH 1、 Escherichia coli MCI 000、 Escherichia coli KY3276、
Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB 101、
Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W31 10、 Escherichia coli NY49、 Escherichia coli GI698、 Escherichia coli TB 1ヽ Serratia ficaria、 Serratia fonticola、 Serratia liquefaciens、 Serratia marcescens. Bacillus subtilisゝ Bacillus amyloliquefacines、 Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066、 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869、 Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 ^ Corynebacterium glutamicum ATCC 13869、 Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC 13870、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354、
Pseudomonas putida 、 Pseudomonas sp. D-01 10等をあけ-ること力できる。
組換えベクターの導入方法としては、 上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法で あればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69, 21 10 ( 1972)] 、 プロ トプラス ト法 （特開昭 63- 248394) 、 または Gene, Π, 107 ( 1982)や Molecular & General Genetics, 168, 1 1 1 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 Y E p 1 3 (ATCC371 15) 、 Y E p 2 4 (ATCC37051 ) 、 Y C p 5 0 (ATCC37419) 、 p H S 1 9、 p H S 1 5等を例示することができる。
プロモーターとしては、 酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよ く、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 P H 0 5 プロモーター、 P G Kプロモーター、 G A Pプロモーター、 A D Hプロモータ一、 g a 1 1プロモーター、 g a l 1 0プロモーター、 ヒー トショ ック蛋白質プロ モーター、 M F « 1 プロモーター、 C U P 1 プロモーター等をあげることがで きる。
王 田胞とし は、 Saccharomyces ¾、 Schizosaccharomvce 厲、 Kluyveromyces 属、 Trichosporon 、 Schwanniomvces 、 Pichia属、 Candida 等に ¾す ! ¾生 物 、 例 ん は 、 Saccharomyces cerevisiae 、 Schizosaccharomvces pombe 、 Kluyveromyces lactisゝ Ί nchosporon pullulans , Schwanniomvces alluvius ^ Candida utilis等をあげることができる。
組換えべクタ一の導入方法と しては、 酵母に D N Aを導入する方法であればい ずれも用いることができ、 例えば、 エレク トロボレ一シヨン法 [Methods.
Enzymol., 194, 182 (1990] 、 スフエロプラスト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)] 、 酢酸リチウム法 [J. BactenoL, 153, 163 (1983)〕 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 p c DNAl、 p c DM 8 (フナコシ社製） 、 pAGE 1 07 〔特開平 3-22979 ; Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕 、 p A S 3 - 3 (特開平 2-227075) 、 p C DM8 [Nature, 329, 840,(1987)] 、 p c DN A I / Amp (Invitrogen社製） 、 p RE P 4 (Invitrogen社製) 、 p AG E 1 03 [J. Biochem..101.1307 (1987)] 、 p A GE 2 1 0等を例示することができる。
プロモーターとしては、 動物細胞中で機能するものであればいずれも用いるこ と力でき、 例えば、 サイ トメガロウィルス （ヒ ト CMV) の I E (immediate early) 遺伝子のプロモーター、 S V 4 0の初期プロモータ一、 レトロウイルスの プロモ一ター、 メタ口チォネインプロモ一ター、 ヒートショ ックプロモ一ター、
S Rひプロモーター等をあげることができる。 また、 ヒ ト CMVの I E遺伝子の ェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒ トの細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞 である COS細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CHO細胞、
HBT5637 (特 開昭 63-299) 等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、 動物細胞に DN Aを導入でき るいかなる方法も用いることができ、 例えば、 エレク ト口ポーレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2— 22 707 5) 、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84—, 7413 (1987)〕 、
Virology, 12， 456 (1973)に記載の方法等を用いることができる。 形質転換体の取 ί: および培養は、 特開平 2— 22 70 7 5号公報あるいは特開平 2— 2 5789 1 号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばバキュロウィルス 'ェクスプレ ッシヨ ン . ベクタース， ァ . ラボ-ラ ト リー . マニュアル (Baculovims Expression
Vectors, A Laboratory Manual) 、 カレン ト ' プロ ト コールズ ' イン · モレキユラ 一 -バイオロジー、 BioTechnology, ，47 (1988)等に記載された方法によって、 蛋 白質を発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入べクタ一およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆 虫細胞に感染させ、 蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 p VL 13 92、 p VL 1 393、 p B l u e B a c in (と もにイ ンビトロジェン社製） 等をあげることができる。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである アウ トグラファ · カリ フォルニ力 · ヌク レア一 · ポリへドロシス · ウィルス (Autographa califormca nuclear polyhedrosis virus)-# 用い とせ- きる。
昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞である S f 9、 S f 2 1 〔バキュロウィルス 'エクスプレッショ ン ' ベクターズ、 ァ ' ラボラ ト リ一 . マ ニュ , ル (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual) 、 ダズリュー エイチ . フリーマン . アン ド . カンパニー （w.H.Freeman and Company ) 、 ニュ
—ヨーク （New York) 、 (1992)] 、 Trichoplusia niの卵巣細胞である H i g h 5
(インビトロジェン社製） 等を用いることができる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べクタ —と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法
(特開平 2-227075) 、 リポフエクシヨ ン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 T iプラスミ ド、 タバコモザイクウィルスベクタ一等をあげることができる。 プロモーターとしては、 植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 35S プロモ 一ター、 ィネアクチン 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タノくコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 ァブラ ナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞等をあげることがで きる。
組換えベクターの導入方法としては、 植物細胞に D N Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 ァグロバクテリウム ( Agrobactenum) (特開昭 59-140885、 特開昭 60-70080、 WO94/00977) 、 エレク ト口ポレーショ ン法 （特開昭 60-251887) 、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （特許 第 2606856、 特許第 2517813 ) 等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー ' クローニング 第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合蛋白質発現等を行うこ とができる。
酵母、 動物細胞、 昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、 糖ある レ、は糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
上記で取得された本発明の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に I g A腎症 関連蛋白質を生成蓄積させ、 該培養物より該蛋白質を採取することにより、 I g A腎症関連蛋白質を製造することができる。
本発明の I g A腎症関連蛋白質製造用の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、 酵母等の真核生物である場合、 こ れら形質転換体を培養する培地は、 該形質転換体が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、 該形質転換体が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン 加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパ ノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸ァ ンモニゥム、 リ ン酸アンモニゥム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他含窒素化合物、 並びに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチー プリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体 およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシ ゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナト リウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培養温 度は 1 5〜 4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 1 6時間〜 7日間である。 培養中 p Hは、 3 . 0〜9 . 0に保持する。 p Hの調整は、 無機あるいは有機の酸、 アル カリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、 アンピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培 地に添加してもよい。
プロモ—ターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換 した微生物を培養するときには、 必要に応じてインデューサーを培地に添加して もよい。 例えば、 プロモーターを用いた組換えべクタ一で形質転換した微生 物を培養するときにはィソプロピル一 ,,3— D—チォガラク トビラノシド （ I P T G ) 等を、 プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養 するときにはインドールアクリル酸 （ I A A ) 等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されてレ、る R P M I 1 6 4 0培地 〔The Journal of the American Medical Association. 199. 519 ( 1967)] 、 E a g 1 eの M E M培地 [Science, 122， 501 (1952)〕 、 ダルベッコ改変 MEM培地 (Virology, 8.396 (1959)] 、 1 9 9培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine.73, 1 (1950)] またはこれら培 地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 6〜 8、 3 0〜 4 0 °C、 5 % C 02存在下等の条件下で 1〜 7日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリ ン等の抗生物質を培地に 添加してもよレ、。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている TNM—FH培地 〔Pharmingen社製〕 、 Sf-900IISFM培地
(Life Technologies社製) 、 ExCell400、 ExCell405 〔いずれも JRH Biosciences社 製〕 、 Grace's Insect Medium [Nature.195.788 (1962)] 等を用いることができる。 培養は、 通常 p H 6〜7、 2 5〜 3 0°C等の条件下で、 1〜 5日間行う。 また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、 細胞として、 または植物の細胞 や器官に分化させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地として は、 一般に使用されているムラシゲ ' ア ン ド ' スクーグ (MS)培地、 ホワイ ト (White)培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイ トカイニン等、 植物ホルモ ンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 pH 5〜9、 2 0〜4 0°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。
上記のとおり、 本発明の蛋白質をコードする DN Aを組み込んだ組換え体べク 夕—を保有する微生物、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常 の培養方法に従って培養し、 該蛋白質を生成蓄積させ、 該培養物より該蛋白質を 採取することにより、 該蛋白質を製造することができる。 遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー . クローニング第
2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合蛋白質発現等を行うこと ができる。
本発明の蛋白質の生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞 外に分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用す る宿主細胞や、 生産させる蛋白質の構造を変えることにより、 該方法を選択する こと力 ?できる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポー ルソンらの方法 〔J. Biol. Chem.， 264, 17619 ( 1989)] 、 ロウらの方法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 8227 ( 1989), Genes Develop., 4, 1288 ( 1990)〕 、 または特開平 05-336963、 特開平 06-823021 等に記載の方法を準用することによ り、 該蛋白質 を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
即ち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質 の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、 本発明の蛋白 質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、 特開平 2-227075 に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵 素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。 さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺 伝子が導入された動物個体 （トランスジエニック非ヒ ト動物） または植物個体 (トランスジエニック植物） を造成し、 これらの個体を用いて本発明の蛋白質を 製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育ま たは栽培し、 該蛋白質を生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該蛋白質 を採取することにより、 該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、 例えば公知の方法 し American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S ( 1996)、 American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S ( 1996)、 Bio/Technology, 9, 830 ( 1991 )] に準じて遺伝子 を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、 例えば、 本発明の蛋白質をコードする D N Aを導入したト ランスジエニック非ヒト動物を飼育し、 該蛋白質を該動物中に生成 ·蓄積させ、 該動物中より該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を製造することができる 該動物中の生成 · 蓄積場所と しては、 例えば、 該動物のミルク （特開昭 63- 309192) 、 卵等をあげることができる。 この際に用いられるプロモーターとして は、 動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、 例えば、 乳 腺細胞特異的なプロモーターである αカゼィンプロモーター、 ,3カゼィンプロモ 一夕一、 ラク トグロブリ ンプロモーター、 ホエー酸性プロテインプロモーター 等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、 例えば本発明の蛋 白質をコードする D N Aを導入したトランスジヱニック植物を公知の方法 〔組織 培養， 20 (1994)、 組織培養， 21 (1995)、 Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)〕 に準 じて栽培し、 該蛋白質を該植物中に生成 ·蓄積させ、 該植物中より該蛋白質を採 取することにより、 該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造された本発明の I g A腎症に関連する活性を有 する蛋白質を単離精製するためには、 通常の酵素の単離精製法を用いることがで きる。
例えば、 本発明の蛋白質が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了 後、 細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、 超音波破砕機、 フレン チプレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清か ら、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル （D E A E ) —セファロ一ス、 DIAION HPA-75 (三菱化成社製） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラ W
フィ一法、 S-Sepharose FF (ファルマシァ社製)等のレジンを用いた陽ィォン交換ク 口マトグラフィ一法、 ブチルセファロース、 フエ二ルセファロース等のレジンを 用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティ 一クロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気 泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができる また、 該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 細胞を回収後、 破砕し、 遠心分離することによ り、 沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。 回収した該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、 希釈あるいは透析し、 該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下 げることによ り、 該蛋白質の構造を正常な立体構造に戻す。 該操作の後、 上記と 同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体力細胞外に分泌された場合に は、 培養上清から、 該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収すること ができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により培養上清を回 収し、 該培養上清から、 上記と同様の単離精製法を用いることによ り、 精製標品 を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、 例えば、 配列番号 3 4 〜 4 0に表さ れるァミノ酸配列から選ばれるァミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができ る。
また、 上記方法により発現させた蛋白質を、 F m o c法 （フルォレニルメチル ォキシカルボニル法） 、 t B o c法 （ ブチルォキシカルボニル法） 等の化学合 成法によっても製造することができる。 また、 桑和貿易 （米国 Advanced chemTech社製） 、 パーキンエルマ一ジャパン （米国 Perkin-Elmer社製） 、 ファ ルマシアバイオテク （スゥユ ーデン Pharmacia Bio ch社製） 、 ァロカ （米国 Protein Technology Instrument社製) 、 クラボウ （米国 Synthecell-Vega社製） 、 日 本パーセプティブ ' リ ミテツ ド （米国 PerSepdve社製） 、 島津製作所等のぺプチ 一つつ一 ド合成機を利用し合成することもできる。
3 . 本発明の蛋白質を認識する抗体の調製
( 1 ) 抗原の調製
上記 2 . の方法により取得した蛋白質の全長または部分断片精製標品、 あるい は本発明の蛋白質の一部のァミノ酸配列を有するぺプチドを抗原として用いる。 抗原用部分べプチドとしては、 5〜30残基程度の蛋白質部分配列が選択される。 変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得す るためには、 立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ぺプチドと して選択することが好ましい。 立体構造上蛋白質表面に存在する部分は、 Kyte と Dooi i tt le の方法 〔ジャーナル · ォブ ' モレキュラー · ノ ィ ォロジー (Journal of Molecular Biology) , 157， 105-132 ( 1982) ] などによ り、 親水性 の高い部分配列を予測することで推測することができる。 即ち、 一般的に親水性 の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、 親水性の高い部分 は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。 また、 蛋白質の N末端、 C末端 は蛋白質表面に存在する場合が多い。 しかしながら、 このように選択した部分べ プチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らなレ、。
部分べプチドを抗原として用いる場合には、 末端にシスティンを付加すること により、 他の蛋白質と架橋することができる。 蛋白質の内部配列を選択した場合 には、 必要に応じペプチドの N末端はァセチル化、 C末端はアミ ド化する。
部分べプチドは一般的な液相、 固相べプチド合成法およびそれらを適宜組み合 わせる方法、 またはそれらに準じる方法によって合成することができる [Internat ional Journal of Pept ide Protein Research, 35， 161-214 (1990)、 Methods in Enzymology, 289, (1997)、 Methods in Molecular Biology, 35， (1994)〕 。
また、 自動ペプチド合成機を用いることもできる。 ペプチド合成機によるぺプ チドの合成は、 島津製作所製べプチド合成機、 ァドバンスト . ケムテック社 (Advanced ChemTech Inc. , USA, 以後 ACT社と略称する） 製ペプチド合成機等 の市販のぺプチド合成機上で、 適当に側鎖を保護した N。- Fmoc -ァミノ酸あるい は N。- Boc-アミノ酸等を用い、 それぞれの合成プログラムに従って実施するこ とができる。 原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、 ABI 社、 島津製作所、 国産化学 （株） 、 ノバビオケム社 （NovaBiochem) 、 渡辺化学 （株） 、 ACT社、 アナスペック社 （AnaSpec Inc. ) 、 またはペプチド研究所 （株） 等から入手する ことができる。
( 2 ) 動物の免疫と抗体の調製
( i ) ポリクローナル抗体の作製
上記の方法により取得した抗原を動物に投与することによりポリクローナル抗 体を作製することができる。
投与する動物として、 ゥサギ、 ャギ、 ラッ ト、 マウス、 ハムスター等を用いる ことができる。
該抗原の投与量は動物 1匹当たり 5 0〜 1 0 0 gが好ましい。
免疫は、 動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、 適当なアジュバント 〔例えば、 フロイン ドの完全アジュバン ト （Complete Freund' s Adjuvant) や水 酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕 とともに抗原を投与することに より行う。 抗原が部分べプチドである場合には、 B S A (ゥシ血清アルブミン） や K L H (Keyhole Limpet hemocyanin) などのキャリア蛋白質とコンジユゲー トを作製し、 これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜 2週間おきに 3〜 1 0回行う。 各投与後 3〜 7日目に眼底静脈叢より採血し、 その血清が抗原と反応することを酵素免疫 測定'/ £ [Ant ibodies - A Laboratory Manu l , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、 その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物よ り血清を取得し、 該血清を分離、 精製することによりポリクロ一ナル抗体を取得 することができる。
分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 4 0〜 5 0 %飽和硫酸アンモニゥム による塩析、 力プリル酸沈殿 (Antibodies, A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, ( 1988)] 、 または D E A E—セファロ一スカラム、 陰イオン交 換カラム、 プロティン Aまたは G—カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるク ロマトグラフィ一等を、 単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
(ii) モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体は、 該抗体産生細胞と非ヒ トほ乳動物由来の骨髄腫細胞と を融合させてハイプリ ドーマを作製し、 該ハイプリ ドーマを培養するカ 動物に 投与して該動物を腹水癌化させ、 該培養液または腹水を分離、 精製することによ り調製することができる。
抗体産生細胞としては、 脾細胞、 リンパ節、 末梢血中の抗体産生細胞、 特に脾 細胞が好適に用いられる。
以下、 脾細胞を用いるモノクローナル抗体の作製法について詳述する力 他の 抗体産生細胞についても同様の方法で実施することができる。
該抗体価を示したラッ トに抗原物質を最終投与した後 3〜 7日目に、 脾臓を摘 出する。
該脾臓を M E M培地 （日水製薬社製） 中で細断し、 ピンセッ トでほぐし、 1， 2 0 0 r p mで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス一塩化アンモニゥム緩衝液 （p H 7 . 6 5 ) で 1 〜 2分間処理し赤血球を除去した後、 M E M培地で 3回洗浄し、 得られ た脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
(b)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、 マウスまたはラッ トから取得した株化細胞を使用する。 例えば、 8—ァザグァニン耐性マウス （BALB/c由来） 骨髄腫細胞株 P3-X63Ag8- U1 (以下、 P 3 — U 1 と略す） [Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 8i, 1 (1978)、 Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)] 、 SP2/0-Agl4(SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)] 、 P3-X63-Ag8653(653) iJ. Immunol.. 123. 1548 (1979)] 、 P3-X63-Ag8(X63) [Nature, 256.495 (1975)] 等を用いることができる。 これらの細胞株は、 8—ァザグァニ ン培地 〔RPMI— 1 64 0培地にグルタミ ン （ 1. 5mM) 、 2—メルカプト エタノール （ 5 X 1 (Γ5 M) 、 ジェンタマイシン （ 1 0 g /m 1 ) および牛胎 児血清 （FC S) (C S L社製、 1 0 %) を加えた培地 （以下、 正常培地とい う） に、 さらに 8—ァザグァニン （ 1 5 g/m l ) を加えた培地〕 で継代する せ、 細胞融合の 3〜 4日前に正常培地で培養し、 融合には該細胞を 2 X 1 0 7個 以上用いる。
(c)ハイブリ ドーマの作製
(a)で取得した抗体産生細胞と（b)で取得した骨髄腫細胞を M E M培地または P B S (リ ン酸ニナトリウム 1. 83 g、 リ ン酸一カリウム 0. 2 1 g、 食塩 7.
6 5 g、 蒸留水 1 リ ッ トル、 p H 7. 2) でよく洗浄し、 細胞数が、 抗体産生細 胞：骨髄腫細胞 = 5〜 1 0 ： 1になるよう混合し、 1， 2 00 r p mで 5分間遠 心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、 該細胞群に、 攪拌しながら、 3 7 °C で、 1 0 8抗体産生細胞あたり、 ポリエチレングライコール _ 1 000 (PEG — 1 000) 2 g、 MEM2 m 1およびジメチルスルホキシド （DMS 0) 0.
7 m 1を混合した溶液を 0. 2〜 1 m 1添カ卩し、 さらに 1〜 2分間毎に MEM培 地 1〜 2 m 1 を数回添加する。
添加後、 MEM培地を加えて全量が 50 m 1 になるように調製する。 該調製液 を 900 r pmで 5分間遠心分離後、 上清を捨てる。 得られた沈殿画分の細胞を、 ゆるやかにほぐした後、 メ スピペッ トによる吸込み、 吹出しでゆるやかに HAT 培地 〔正常培地にヒポキサンチン （ 1 0—4 M) 、 チミジン （ 1. 5 X 1 0-5 M) およびアミノプテリン （4 X 1 0—7M) を加えた培地〕 1 00m l中に懸濁する。 該懸濁液を 96穴培養用プレートに 1 00 1 /穴ずつ分注し、 5%CO 2ィ ンキュベータ一中、 3 7°Cで 7〜 1 4日間培養する。
培養後、 培養上清の一部をとりアンチボディィズ [Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)] 等に述べられている酵素 免疫測定法により、 本発明の蛋白質の部分断片蛋白質に特異的に反応するハイブ リ ドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、 以下の方法をあげることができる。
免疫の際に用いた抗原を 96穴の E I A用プレートに 1〜 50 /m 1で 1 0〜 1 00 1 /穴ずつ分注し、 4 °Cでー晚放置してプレートにコ一トする。 放置後、 1 %B S Aを含む P B S溶液 （以下、 85八ー？85と略す） を 1 0 0〜 2 0 O 1 Z穴分注し、 室温 1〜 2時間または、 4°Cで 1〜2晚放置して、 プレート上に残った蛋白質との結合残基をブロック （ブロッキング） する。
ブロッキング後、 B SA— PB Sを捨て、 P B Sでプレートをよく洗浄する。 被免疫動物血清、 抗血清より精製して得られたボリクロ—ナル抗体、 ヽィブリ ドーマ培養上清もしくは後述の (d)で得られる精製抗体を第一抗体として用い、 該抗体 1〜1 0 gZm 1 を該プレートに 2 0〜 1 00 1 Z穴分注し、 室温で 2〜 3時間または、 4 °Cで一晩放置する。
P B Sまたは、 P B S— 0.0 5 % T w e e nで、 よく洗浄した後、 第二抗体 としてピオチン、 酵素、 化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ィム ノグロプリン抗体 1〜 50 (« 8//111 1 を 50〜 1 00 1 /穴ずつ分注し、 室温 1〜 2時間反応させる。
PB S-Twe e nでよく洗浄した後、 第二抗体の標識物質に応じた反応を行 なう。
該反応により、 本発明の蛋白質に特異的に反応するものを本発明のモノクロ一 ナル抗体を生産するハイプリ ドーマとして選択する。
該ハイプリ ドーマを用いて、 限界希釈法によりクローニングを 2回繰り返し 〔1回目は、 HT培地 （HAT培地からアミノプテリンを除いた培地） 、 2回目 は、 正常培地を使用する〕 、 安定して強い抗体価の認められたものを本発明のモ ノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ株として選択する。
(d)モノクロ一ナル抗体の調製
プリスタン処理 〔2， 6 , 1 0， 14—テ トラメチルペン夕デカン （P r 1 s t a n e) 0. 5m iを腹腔内投与し、 2週間飼育する〕 した 8〜 1 0週令のマ ウスまたはヌードマウスに、 （c)で取得した本発明の蛋白質モノクローナル抗体 産生ハイプリ ドーマ細胞 5〜 20 X 1 0 6細胞 Z匹を月复腔内に注射する。 1 0〜 2 1日間でハイプリ ドーマは腹水癌化する。
該月复水癌化したマウスから月复水を採取し、 3， 000 r p mで 5分間遠心分離 して固形分を除去する。
得られた上清より、 ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナ ル抗体を精製、 取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、 マウスモノクローナル抗体夕イビングキッ トまた はラッ トモノクローナル抗体タィピングキッ トを用いて行う。 蛋白質量は、 口一 リ一法あるいは 280 n mでの吸光度より算出する。
4. I gA腎症関連の、 DNA、 蛋白質または抗体の利用
(1) 1. 記載の DNAを用い、 ノーザン 'ハイブリダィゼ一シヨン法 （モレ キユラ一 . クロ一ニング 第 2版） 、 P C R法 〔PCR Protocols, Academic Press (1990)〕 、 R T (reverse-transcribed) —PC R法等により、 本発明の I g A腎症 関連遺伝子の m R N Aを検出することができる。 特に R T— P C R法は簡便であ り、 I g A腎症の診断に利用することができる。
例えば、 検出したい mRNAに対応する 1. 記載の DNAを一組のオリゴヌク レオチドプライマーとして用い、 PCRを行い、 増幅断片を検出することにより I gA腎症を診断する方法をあげることができる。 この場合、 増幅させる塩基配 列部分としては mRN Aのいかなる塩基配列領域でもよいが、 塩基配列の長さが 50 b pから 2 k b pであり、 反復配列あるレ、は G C (グァニン ' シトシン） 塩 基に富む配列を含まない塩基配列領域が好ましい。
(2) 1. 記載のアンチセンス - オリゴヌクレオチド （RNA/DNA) を用 いて 〔化学、 46, 681 (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992)] 、 DNAの転写もしく は mRN Aの翻訳を抑制することにより、 I g A腎症の治療に利用することがで きる。
この場合に使用する、 1. 記載のアンチセンス ' オリゴヌクレオチド （RNA /DNA) として、 例えば、 2. 記載の蛋白質をコードする DNAの一部の塩基 配列、 好ましくは翻訳開始領域にある 1 0〜 50塩基配列を有するアンチセン ス - オリゴヌクレオチドをあげることができる。
(3) 1. 記載の DNAを用い、 2. 記載の方法により本発明の I gA関連蛋 白質を取得することができる。
(4) 2. 記載の蛋白質を抗原として用い、 3. 記載の方法により抗体を製造 することができる。
(5) 3. 記載の抗体を用いて、 I g A腎症関連蛋白質を免疫学的に検出また は定量することができる。
免疫学的に検出する方法として、 マイクロタイタープレー卜を用いる EL I S A法、 蛍光抗体法、 ウェスタンプロッ ト法、 免疫組織染色法等をあげることがで きる。
免疫学的に定量する方法としては、 液相中で本発明の蛋白質と反応する抗体の うちェピトープが異なる 2種類のモノクローナル抗体を用いたサンドィツチ EL I SA法、 1251等の放射性同位体で標識した本発明の蛋白質と本発明の蛋白質 を認識する抗体とを用いるラジオィムノアツセィ法等があげられる。
(6) 3. 記載の抗体を用いて、 健常者および被験者の白血球細胞に存在する I gA腎症関連蛋白質を免疫学的に検出または定量し、 その量を健常者と被験者 とで比較し、 その量的な変動を調べることにより被験者が I gA腎症に罹病して いるか否かを診断することができる。 具体的に検体としては、 健常者および被験 者から末梢血液を採取し、 その血液から分離した白血球細胞を用いることができ る。 また、 検出する I g A腎症関連蛋白質が白血球細胞外に分泌される蛋白質の 場合は健常者および被験者の血漿を検体として、 血漿中の該蛋白質の量を免疫学 的に検出または定量し、 その量を健常者と被験者とで比較し、 その量的な変動を 調べることにより被験者が I g A腎症に罹病しているか否かを検出 .診断 することができる。
( 7 ) 3 . 記載の抗体を I g A腎症の治療または予防に利用することができる c 本発明の D N A、 蛋白質および抗体を、 診断、 治療、 予防に用いる場合、 診断 または薬理学的に許容される担体を添加してもよレ、。 図面の簡単な説明
第 1図は、 配列番号 1 1 4に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物
1 ) と K L H (カルビオケム社製） とのコンジュゲートで免疫し、 取得したラッ ト抗血清の該化合物 1に対する結合反応性を、 酵素免疫測定法により調べた結果 を示す図である。 左に化合物 1に対する結合反応性、 右にコン トロールペプチド に対する結合反応性の結果を示した。 R 1 〜 3は化合物 1で免疫した 3匹のラッ トの抗血清を、 N R Sは正常ラッ ト血清をそれぞれ示す。
第 2図は、 配列番号 1 1 5に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物
2 ) と K L Hとのコンジュゲートで免疫し、 取得したラッ ト抗血清の該化合物 2 に対する結合反応性を、 酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。 左に 化合物 2に対する結合反応性、 右にコントロールぺプチドに対する結合反応性の 結果を示した。 R 1 〜 3は化合物 2で免疫した 3匹のラッ トの抗血清を、 N R S は正常ラッ ト血清をそれぞれ示す。
第 3図は、 配列番号 1 1 6に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物
3 ) と K L Hとのコンジュゲートで免疫し、 取得したラッ ト抗血清の該化合物 3 に対する結合反応性を、 酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。 左に 化合物 3に対する結合反応性、 右にコン トロールべプチドに対する結合反応性の 結果を示した。 R 1 〜 3は化合物 3で免疫した 3匹のラッ トの抗血清を、 N R S は正常ラッ ト血清をそれぞれ示す。
第 4図は、 配列番号 1 1 7に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物
4 ) と K L Hとのコンジュゲートで免疫し、 取得したラッ ト抗血清の該化合物 4 に対する結合反応性を、 酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。 左に 化合物 4に対する結合反応性、 右にコン トロールぺプチドに対する結合反応性の 結果を示した。 R 1 〜 3は化合物 4で免疫した 3匹のラッ トの抗血清を、 N R S は正常ラッ ト血清をそれぞれ示す。
第 5図は、 配列番号 1 1 8に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物
5 ) と K L Hとのコンジュゲートで免疫し、 取得したラッ ト抗血清の該化合物 5 に対する結合反応性を、 酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。 左に 化合物 5に対する結合反応性、 右にコントロールべプチドに対する結合反応性の 結果を示した。 R 1 〜 3は化合物 5で免疫した 3匹のラッ トの抗血清を、 N R S は正常ラッ ト血清をそれぞれ示す。
第 6図は、 配列番号 1 1 9に記載のァミノ酸配列を有するぺプチド （化合物
6 ) と K L Hとのコンジュゲートで免疫し、 取得したラッ ト抗血清の該化合物 6 に対する結合反応性を、 酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。 左に 化合物 6に対する結合反応性、 右にコン トロールべプチドに対する結合反応性の 結果を示した。 R 1 〜 3は化合物 6で免疫した 3匹のラッ トの抗血清を、 N R S は正常ラッ ト血清をそれぞれ示す。
第 7図は、 配列番号 1 2 0に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物
7 ) と K L Hとのコンジュゲートで免疫し、 取得したラッ ト抗血清の該化合物 7 に対する結合反応性を、 酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。 左に 化合物 7に対する結合反応性、 右にコン トロールべプチドに対する結合反応性の 結果を示した。 R 1 〜 3は化合物 7で免疫した 3匹のラッ トの抗血清を、 N R S- は正常ラッ ト血清をそれぞれ示す。
第 8図は、 配列番号 12 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物 8) と K L Hとのコンジュゲートで免疫し、 取得したラッ ト抗血清の該化合物 8 に対する結合反応性を、 酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。 左に 化合物 8に対する結合反応性、 右にコン トロールペプチドに対する結合反応性の 結果を示した。 R 1〜 3は化合物 8で免疫した 3匹のラッ トの抗血清を、 NRS は正常ラッ ト血清をそれぞれ示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施例を示す。
実施例 1 I g A腎症患者および健常人の白血球のディファレンシャル ·デイス プレイ
(1) 1 g A腎症患者および健常人の白血球からの全 RN Aの取得
I g A腎症の患者 5名および健常人 5名より各々 20 m 1採血した。
1000単位/ m 1 へパリ ン 500 1を添力!]し、 凝固を抑制後、 遠心チュ
—ブに移し、 室温で 3， 300 r pm、 1 5分間遠心後、 白血球画分として中間 層のバフィーコートを別の遠心チューブに移した。
AG PC法 〔実験医学 2, 1937，（1991)〕 または R N A回収用キッ ト R N A e a s y (QIAGEN社製） を用い全 R N Aを取得した。
(2) I g A腎症患者および健常人の白血球全 RNAを用いた蛍光ディファレン シャル · ディスプレイ
上記 （1) で取得した全 RNA2. 5 g各々について蒸留水を全体が 9 1 になるように添加し、 5' 末端をフルォレセインイソチオシァネート （以下、 F I TCと称す） で蛍光標識したアンカープライマー 〔サヮディー .テクノロジー
(Sawady Technology) 社製、 50 M〕 1 1を加えて 70 °Cで 5分間加熱後、 直ちに氷冷した。 5 ' 末端蛍光標識アンカープライマーとして、 F AH (塩基配列を配列番号 1 0 7に示した。 ） 、 F GH (塩基配列を配列番号 1 0 8に示した。 ） 、 F C H (塩基配列を配列番号 1 0 9に示した。 ） の 3種類をそれぞれ用い、 1サンプル の全 RN Aについて計 3組の反応を行った。
5 X逆転写酵素反応用緩衝液 〔 2 5 0 mM トリス （ヒ ドロキシメチル） アミ ノメタン （T r i s ) -H C l (p H 8. 3)、 3 7 5 mM KC 1 5 mM Μ g C 1 2〕 4 μ 1 0 O mM ジチオスレィ トール （D TT) 2 μ 1 0 mM d NT P ( d AT P、 d G T P、 d T T Pおよび d C T P ) 1 μ 蒸留水 1 μ 1、 逆転写酵素 SUPERSCRIPT Π RNase H- Reverse Transcriptase (Life Technologies社 製） 1 ,« 1 ( 2 0 0単位） を添加して混合し、室温で 1 0分間静置後、 4 2 °Cで 5 0分間反応させて c DNAを合成し、 9 0 °Cで 5分間加熱して反応を停止させ た。
反応後、 該反応液に T E緩衝液 〔 1 0 mM T r i s —H C l ( p H 8. 0) 、 1 mM エチレンジァミ ン四酢酸ニナト リウム （E DT A) ( p H 8. 0 ) ] 4
0 μ 1を添加した。
上記により合成された各々の c DN A に、 蒸留水 1 4. 7 μ 1 , 1 0 X P C R用緩衝液 〔 1 0 0 mM T r i s— H C 1 ( p H 8. 8) 、 5 0 0 mM KC 1 、 1 5 mM M g C 1 1 % T r i t o n X - 1 0 0] 2 ," 1 、 2. 5 mM d NT P 0. 8 し、 蛍光標識アンカープライマ一 （FAH、 F GH、 F GHのうち c DNA合成時に用いたのと同じ種類のもの） 0. 3 ," 1 、 1 0 M任意プライマ一 （0 p e r 0 n社製） 1 1 、 DNAポリメラ一ゼ G e n e T a q (二ツボンジーン社製、 5単位 1 ) 0. 2 μ 1 を添カロし、 サーマルサイクラ一にセッ トし P C Rを行った。
P C Rは、 9 4 °Cで 3分間、 4 0 °Cで 5分間、 7 2 °Cで 5分間反応させた後、 9 5 °Cで 1 5秒間、 4 0 °Cで 2分間、 7 2 °Cで 1分間からなる工程を 1サイクル として 2 7サイクル反応を行い、 最後に 7 2 °Cで 5分間反応させる条件で行った c 蛍光標識アンカープライマーとしては前述した 3種類のうちから 1種類、 任意 プライマーとしては、 オペロン ' テクノロジーズ社製の〇 P D— 1 〜 2 0、 0 P E— 1 〜 2 0および O P V— 1 〜 2 0の 6 0種類のうちから 1種類を組み合わせ た合計 1 8 0組の反応、 および、 蛍光標識ァンカープライマー F G Hと任意ブラ イマ一 O P B— 2 (オペロン ' テクノロジーズ社製） の反応の合計 1 8 1組の反 応を、 1つの全 RN Aについて行った。
各々の P C R反応液 4 μ 1 に電気泳動サンプル用溶液 （ 9 5 %ホルムアミ ド、 0. 1 %キシレンシァノ一ル、 0. 1 %ブロムフエノールブルー） 3 1 を添加 し、 9 5 °Cで 2分間加熱後すぐ氷冷し、 6 %アクリルアミ ドゲル、 1 5 0 0 V、 2. 5時間で電気泳動を行った。 電気泳動用緩衝液としては 8 9 mM T r i s、 8 9 mM ホウ酸、 2 mM E D TAを用いた。 フルォロイメ一ジャー （モレキュ ラー . ダイナミックス社製） を用いて電気泳動後のゲルの蛍光を測定することに より、 P C Rで増幅した断片を検出し、 比較した。 健常人 5例に比較して、 I g A腎症患者の白血球 5例で共通して顕著に増加あるいは減少したバンドを記録し た。
I g A腎症の患者 3名および健常人 3名について、 同様に上記 （ 1 ) の全 RN Aの取得、 および （ 2 ) の蛍光ディファレンシャル · ディスプレイを行った。 健常人と比較して、 上記 2度のディファレンシャル · ディスプレイでともに増 加あるいは減少がみられた 1 9 7バンドをゲルから切り出した。
切り出したゲルの約 1 Z 4に蒸留水 3 8 /_ 1 、 1 0 X P C R用緩衝液 5 / し 2. 5 mM d NT P 4 / 1 、 アンカープライマー （蛍光標識なし：サヮディ 一 · テクノロジ一社製 3 4 ," M) 0. 6 μ I , 1 0 Μ任意プライマー 2 μ 1 、 D Ν Αポリメラーゼ Gene Taq 0. 5 1 を添加し、 9 4 °Cで 3分間加熱後、 9 5 °Cで 1 5秒間、 4 0 °Cで 2分間、 7 2 °Cで 1分間からなる工程を 1サイクルと して 3 0サイクル反応を行い、 最後に 7 2 °Cで 5分間反応させて P C Rを行った c 反応後の液をフエノールークロロホルム （ 1 ： 1 ) 抽出し、 さらにクロ口ホル ムーイソアミルアルコール （24 ： 1 ) 抽出後、 エタノール沈殿を行った。 得られた沈殿 （DNA増幅断片） を TE緩衝液に溶解後、 1. 5%低融点ァガ ロースゲル 〔シ一プラーク G T G (SEA PLAQUE GTG： FMC バイオプロダクッ 社製） 〕 電気泳動にかけた。
泳動後、 ェチジゥムブロマイ ド染色し、 増幅断片部分のゲルを切り出した。 該ゲルを 6 5°Cで 1 5分間加熱してァガロースを融解後、 フエノールークロロ ホルム抽出およびクロ口ホルムーィソアミルアルコール抽出を行った。
得られた抽出液を用い、 エタノール沈殿を行った後、 得られた沈殿 （増幅断 片） を 1 0 1の TE緩衝液に溶解させた。
該増幅断片 1 μ 1と PCR断片クローニング用ベクタ一 PT7BlueT- Vector (ノバ ジェン社製） 1 1を混合し、 D N Aライゲーシヨンキッ ト ver.1 (宝酒造社 製） を用いて、 キッ ト添付のマニュアルに従い、 プラスミ ドに増幅断片を組み込 んだ。
得られた組換え体プラスミ ドを用い、 公知の方法に従って大腸菌 DH 5 « (ギ ブコ BRL社製） を形質転換し、 該形質転換体をアンピシリ ン 50 gノ m 1を 含む LB寒天培地に塗布後、 3 7°Cで一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体を蒸留水 2 0 u 1に懸濁し、 1 0 X P C R用緩衝液 2. 5 μ \ , 2. 5mM dNTP 2 μ I , 34 , "M アンカ 一プライマー 0. 3 1、 1 0 μ Μ 任意プライマー 1 1、 DNAポリメラ一 ゼ Gene Taq 0.5 μ 1を添加し、 増幅断片の上記再増幅と同じ条件で P C Rおよび 電気泳動を行い、 最初のディファレンシャル . ディスプレイ時と同じ長さの断片 力増幅することを確認した。
増幅断片の塩基配列は DN Αシークェンサ一 （パーキンエルマ一社製） を用い て決定した。 塩基配列決定において、 パーキンエルマ一社のダイプライマ一サイ クルシークェンンシンク (Dye primer cvcle sequencing) キッ トおよびキッ トに 付のマニュアルの方法を用いた。 決定された塩基配列中に存在する制限酵素部位を切断できる制限酵素を用い、 上記ディファレンシャル ' ディスプレイ時で得られた反応物を切断後、 電気泳動 を行い、 切り出した増幅断片に相当する電気泳動のバンドの泳動位置が変化する し 7 o
得られた塩基配列を塩基配列データベース GenBankと比較し、 一致する塩基 配列がデータベース中の既存の塩基配列にはないもの、 データべ一スの塩基配列 の中で expressed sequence tagとのみ一致するものを 6 6クローン選択した。 実施例 2 R T— P C Rによる mRNAの発現の特異性の検出
実施例 1において I g A腎症の患者 5名および健常人 5名より取得した全 RN
A各々 2 gに対して、 一本鎖 c DNA合成キッ ト Superscript preamplification system (B R L社製） を用いて、 キッ トに添付のマニュアルの方法に従い、 一本 鎖 c DNAを合成した。
得られた一本鎖 c DN Aを含む溶液 2 1 1に、 4 2 0 1になるように蒸留 水を添加した。
得られた溶液 1 0 μ 1 を用いて、 以下の方法で R T— P C Rを行い、 各増幅断 片に対応する mRNAの発現量を検出した。
即ち、 白血球一本鎖 c DNA 1 0 1 に、 蒸留水 1 5. 8 i、 1 0 X P C R用緩衝液 4 1、 2. 5 mM d NT P 3. 2 / i 、 DMS O 2 1、 1 0 μ Μ 遺伝子特異的 5 ' 末端側センスブライマ一 2 し 1 0 Μ 遺伝子特異的 3， 側アンチセンスプライマ一 2 1 、 1単位 Ζ 1 に希釈した DN Αポリメラ ーゼ GeneTaq 2 μ 1を添力 Πし、 9 7 °C 5分間加熱し、 氷中で 5分間冷却した後、 9 4 °Cで 3 0秒間、 6 5でで1分間、 7 2 °Cで 2分間からなる工程を 1サイクル として 2 8サイクルの P C Rを行った。
P C R後、 2 %ァガロースゲル電気泳動を行い、 0. 0 1 %サイバーグリーン (宝酒造社製） で染色し、 染色された増幅断片の量をフルォロイメージヤーで定 量し、 mRNAの相対発現量とした。
mRNAの量を校正するために、 ハウスキーピング遺伝子であるグリセルァル デヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ （G 3 PDH) 遺伝子について特異的プライ マー （配列番号 1 1 2、 配列番号 1 1 3) を用いて上記と同様の反応を行い、 各 遺伝子の mRNAの発現量を G 3 PDH m R N Aの発現量に対する比で校正し た後、 I g A腎症患者 5例の平均値と健常者 5例の平均値を比較し、 その値に差 のある遺伝子 30クローンについて I g A腎症患者で発現量が変化している遺伝 子として選択した。 第 1一 1表および第 1一 2表に選択された遺伝子についてま とめた。 第 1一 1表
増幅プラィ RT-PCRプ 配列表の
No. 遺伝子 マー 1) bp2) ライマー." 番号5)
1 雇 063- 7 FGH/0PB-2 155 12.5 45,46 8 28
2 INP303A FAH/0PD-5 305 9.9 47， 48 41 28
3 INM315-10 FAH/0PD 9 278 2.8 49,50 9 35
4 INP319-3 FAH/0PD-10 135 14.4 51,52 10 28
5 INP324A FAH/0PD-12 197 19.9 53,54 11 28
6 INP332A FAH/0PD-16 137 16.6 55, 5D 12 28
7 擺 335 - 3 FAH/0PD-17 274 4.2 57,58 13 28
¾
8 INM336A FAH/0PD-17 171 0.14 59,60 14 28
9 應 351- 10 FCH/0PD-4 161 1.8 61,62 15 28 ^
10 網 56- 4 FCH/0PD-7 323 18.5 63,64 16 35
11 INP364A FCH/0PD - 12 138 3.8 65,66 17 28
12 INP377A FGH/0PD-1 256 5.0 67,68 42 28
13 INP379A FGH/0PD-2 244 8.6 69,70 43 35
14 INP380A FGH/0PD-2 135 15.7 71,72 18 35
15 INP401A FGH/0PD-20 258 16.7 73,74 44 24
16 INM403A FAH/0PE-3 219 2.3 75,76 19 28
17 INP407A FAH/0PE-5 191 9.1 77,78 20 28
18 INM408A FAH/0PE-5 148 0.65 79,80 21 28
19 腿 10- 5 FAH/0PE-6 306 2.0 81,82 22 28
20 擺 419- 14 FAH/0PE-11 357 0.064 83,84 23 35 5
第 1— 2表
Figure imgf000040_0001
1 ) ディファレンシャル · ディスプレイ時に用いたアンカープライマーと任意プ ライマ一の組み合せを示した。
2 ) ディファレンシャル ' ディスプレイ時の増幅断片の長さを示した。
3) ( I g A腎症患者 5例の m NAの発現量の平均値） (健常人 5例の m NAの 発現量の平均値） の値を発現変動の値として示した。
4 ) RT-PCRに用いたプライマーに対応する配列表の配列番号を示した。
5 ) 実施例 1記載のディファレンシャル ' ディスプレイにより得られた増幅断片 の塩基配列に対応する配列表の配列番号を示した。
これらの遺伝子についてのプライマーと、 検体白血球の mRNA由来 c DNA とを、 RT— PCR法により反応させて、 遺伝子増幅を観察することで、 I gA 腎症の診断が可能となる。
実施例 3 完全長 c DNAのクローン化と各 c DNAクローンの解析
(1) 完全長 c DNAのクローン化
ディファレンシャル · ディスプレイで得られた増幅断片の塩基配列を含む c D NAを、 ジーントラッパ一法、 c DN Aライブラリーのプラークハイブリダィゼ ーシヨン、 5 ' —RAC E法を適宜用いることによりクローン化することにした c 以下にその方法について記載する。
(A) ジーントラッパ一法
ベクターに pCMV- SPORT (Life Technologies社製） を用いたヒト白血球 c D N A ライブラリー （Life Technologies社製） から、 GENE TRAPPER cDNA Positive Selection Sysytem (Life Technologies社製） を用いて、 以下のようにして c DNA クローンを取得した。
即ち、 c DNAライブラリーを G e n e Π蛋白とェクソヌクレアーゼ ΙΠを用 いて、 一本鎖 DNA ( c DNAのアンチセンス鎖側に相当する） にした後、 各遺 伝子特異的なピオチン化したオリゴヌクレオチド （実施例 2で RT— P C Rに用 いた各遺伝子に特異的な 5 ' 側センスプライマ一を用いた） をプローブとしてハ イブリダイズさせた。
ストレプトァビジンを結合させたマグネテイ ツクビーズにピオチン化プローブ を結合させることにより、 プローブとハイプリダイズしていた上記一本鎖 c DN Αクローンを単離した。
該一本鎖 c DNAクローンをプローブからはずした後、 DNAボリメラ一ゼを 用い二本鎖 D N Aにし、 該ニ本鎖 D N Aを用いて大腸菌を形質転換することによ り、 c DNAクローンを含有する形質転換株を取得した。
具体的方法はキッ トに添付のマニュアルの方法に従った。
得られた形質転換株を蒸留水 1 8 1 に懸濁し、 1 0 X P C R用緩衝液 2. 5 μ 1 , 2. 5 mM d NT P 2 1、 1 0 M 遺伝子特異的 5， 側センスプライ マー 1〃 し 1 0 M 遺伝子特異的 3， 側アンチセンスプライマー 1 し D NAポリメラーゼ GeneTaq 0. 5 μ 1 を添力 13し、 R Τ— P C Rと同じ条件で Ρ C Rを行った後、 電気泳動を行い、 プライマーの位置から推定される長さの断片 の増幅した形質転換株を c DNAクローンとして単離した。
(B) c DNAライブラリーのスクリーニング I g A腎症患者白血球の c D N Aライブラリー、 神経芽細胞腫系セルライン N B— 1の c DN Aライブラリーを用いて、 プラークハイブリダイゼーシヨンによ る c DNAクローンのスクリーニングを行った。
なお、 各ライブラリーに対してプラークハイプリダイゼーションを行う前に、 c D N Aライブラリ一を鍩型として、 実施例 2で用いた各遺伝子特異的な R T— PCRのプライマーを用いて実施例 2と同様にして、 PCRを行い、 プライマー の位置から推定される長さの断片が増幅するライブラリーを目的の遺伝子の c D N Aクローンを含むライブラリーとして選択した。
該ライブラリーについて、 プラークの DNAをナイロンメンブレン Hy b o n d N+ (アマシャム社製） にブロッテイ ングした。
铸型として実施例 1のディファレンシャル · ディスプレイで得られた、 各遺伝 子の増幅断片を含有するプラスミ ドを、 プライマーとして実施例 2の RT— PC Rで用いた各遺伝子特異的なプライマーを用い、 PCR D I G ラベリング - ミ ックス （Boheringer Mannheim社製） を添加して、 P C Rを行い、 各遺伝子特異 的な断片を、 増幅し標識した。
該増幅標識した各遺伝子特異的な断片をプローブとして用い、 ベ一リンガー - マンハイム社のマニュアルに従ってハイブリダイゼーションおよび、 ポジティブ プラークの検出を行った。
検出には D I G 核酸検出キッ ト （ベーリ ンガ一 · マンハイム社製） を用いた。 (B— 1) I g A腎症患者白血球 c DN Aライブラリーの作製
I g A腎症患者 4名から 50m lずつ血液を採取し、 それぞれの血液に対し、 Polymorphprepを用いて遠心し白血球画分を単離した。 具体的な方法は
Polymorphprepに添付のマニュアルに従った。
単離した白血球に対し、 チォシアン酸グァニジン一トリフルォロ酢酸セシウム 法 〔MethodsinEnzymology，J 4，3 (1987)〕 により、 全 RN Aを調製した。 計 20 0m lの血液から 320. 7 gの全 RNAを取得した。 W 3085
得られた全 RN A 2 7 2. 6 gをオリゴ d T セルロースカラムに通塔する ことにより、 p o l y (A) + RNAとして mRNA 1 0. 7 μ gを取得した。 同様に、 別の I g A腎症患者 4名から mRNA 6. 9； gを取得した。
取得した mRNA各々 1 0. 0〃 g、 6. 4 gについて、 uniZAP-cDNA合 成キッ ト （Stratagene社製） を用いて、 c DNA合成、 E c o R Iアダプターの 付加、 X h 0 I切断反応を行い、 λ Z a Πの E c o R I ZX h o I間にライ ゲ一シヨンすることにより、 c DNAの 5， 端が常にべクタ一の E c 0 R Iサイ ト側にあるような方向性で挿入された c DNAライブラリーを作製した。
以上の具体的な方法は Stramgene社のマニュアルに従った方法である。
スファーンノ、0ッケ一ンングキッ ト Gigapack ΙΠ Gold packaging extract (Stratagene 社製） を用いてパッケージング後、 大腸菌 XU- Blue MRFに感染させて最終的な c DN Aライブラリーとして用いた。 パッケージングと感染の具体的な方法は、 Stratagene社のマニュアルに ί/ϊつた。
(Β - 2 ) ニューロブラス トーマ系セルライン Ν Β— 1 c D Ν Αライブラリ一 の作製
10%ゥシ胎児血清 （Biotech Internationa 土製） 、 2 %ペニシリ ン （ 5, 0 0 0 units/ m l ' ス トレフ トマイシン ( SmgZm l ) 容?仪 (Life Technologies社 製） および 0. 1 9% N a HC03 (Sigma社製） 、 4 mM グルタ ミ ンを含む R PM I 1 6 4 0培地 （日水製薬製） を用い、 5 % C 02、 3 7°Cの条件で、 ニューロブラス トーマ系セルライン NB— 1 [The Autonomic Nervous System 10, 115 (1973)、 ヒューマンサイエンス研究資源バンクよ り入手可能 JCRB0621〕 の 培養および継代を行い、 1. 2 5 X 1 08個のコンフルェン ト状態の細胞を回収 した。
回収した細胞を P B Sで洗浄後、 Fast Track mRNA Isolation Kit (invitrogen社 製） を用いて mRNA 1 0. 2 gを精製、 取得した。
取得した mRNA 6 a gおよび N o t I一プライマー一アダプター (Promega社製） 1. 5 gを入れた容器に蒸留水を添加して 7 Λ 1 とし、 7 0 °Cで 1 0分間加熱後、 氷中に移し急冷した。
急冷した該溶液に、 5 X逆転写酵素反応用緩衝液 （酵素に添付されていたも の） 4 / し l O O mM D T T 2 / 1 l O mM d NT P 1 μ I , トレーサ 一として 〔α— 32 P〕 d C T P ( 1 1 0 TB q/mm o 1 ； Amersham社製） 1 μ 1を添加し、 3 7 °Cで 2分間加温後、 逆転写酵素 Superscript Π RNase H
Reverse Transcriptase 5 μ 1 ( 1 0 0 0単位） を添加して 4 4 °Cで 1時間反応させ、 c DNAを合成した。
該反応液に蒸留水 8 2 5 X反応用緩衝液 〔 1 0 0 mM T r i s —HC 1 、 5 0 O mM K C 1 2 5 mM M g C 1 5 0 mM (NH.J 2 S 04、 1 O mM DTT 2 5 0 m g/ m 1 ゥシ血清アルブミ ン （B S A) 7 5 0 mM /?一ニコチンアミ ドジヌクレオチド〕 3 2 1 1 0 mi d NT P 2. 7 5 // し 32 P〕 d C T P 2. 7 5 / 、 1 0 O mM D TT 5. 5 μ I , 6 単位/ 1 E.coh DNAリガ—ゼ （宝酒造社製） 2. 5 1 3. 5単位 Z 1 E.coli DNAポリメラ一ゼ （宝酒造社製） 1 1. 5 / 1 、 0. 6単位 Z/ 1 E.coli リボヌクレアーゼ H (宝酒造社製） 2 μ 1 を添加し、 1 6 °Cで 3時間反 応させ、 mRNAを分解し c DN Aを 2本鎖にした。
該反応液に、 1単位 Z 1 T 4 DN Aポリメラ—ゼ （宝酒造社製） 4. 8 μ 1 を添加し、 1 6 °Cで 5分間反応させて、 両端を平滑化した。
該反応液に、 5 0 0 mM E D T A ( p H 8. 0 ) 2 i と 1 0 %ドデシル硫 酸ナトリウム （S D S) 2 i を添加して反応を停止し、 フエノールークロロホ ルム抽出を行った。 該抽出で変成した酵素を除き、 水層を取得した。
4 0 0 b p以下の長さの c DNAおよび未反応の N o t I 一プライマー—ァダ プターとヌクレオチドを除くため、 T E緩衝液で平衡化させた SizeSep-400 スパ ンカラム （Pharmacia社製） に該水層を乗せて 4 0 0 gで 2分間遠心分離し、 溶 出液をエタノール沈殿し c DN Aを回収した。 該 c D N Aに E c o R Iアダプター （Promega社製） 5 ," 1 ( 5 0 p m o 1 ) を添加して溶解させ、 ライゲーシヨンキッ ト Ver.l (宝酒造社製） の (A)液 4 0 μ 1 を添加後、 （Β)液 5 μ 1 を添加して 1 5 °Cで 2時間反応させ、 E c 0 R Iァ ダブターを c DN Aの両末端に付与した。
該反応液に、 1 0 mM E DTA ( p H 8. 0 ) 4 0 1 を添加し 6 5 °Cで 1 5分間加熱して反応を停止し、 エタノール沈殿により c DNAを回収した。
該 c D N Aを蒸留水 3 6 1 に溶解させ、 1 0 X反応用緩衝液 〔 5 0 0 mM T r i s — HC 1 ( p H 7. 6) 、 1 0 0 mM M g C 1 5 ,ノ 1 、 1 0 0 m M DTT 2. 5 1 、 l O mM AT P 2. 5 1 、 6単位/,〃 1 T 4ポリ ヌクレオチドキナーゼ （宝酒造社製） 4 μ 1を添力!]し、 3 7 °Cで 3 0分間反応さ せ、 付与した E c 0 R Iァダブターの 5 ' 末端をリン酸化した。
該反応液に、 蒸留水 7. 2 μ \ , 5 Μ N a C 1 1. 8 / し N o t I 8単 位 （1 1 ) を添力!]し、 3 7 °Cで 2時間反応させ、 N o t I 一プライマーーァダ プター内の N 0 t Iサイ トを切断した。
該反応液に、 5 0 O mM E DTA 6 μ 1 を添加して反応を停止させ、 2 0 g/ μ 1 t RN A 1 1 を添加後フエノールークロロホルム抽出を行った。 該 抽出で変成した酵素を除き、 水層を取得した。
未反応の E c 0 R Iアダプターを除くため、 T E緩衝液で平衡化させた S i z e S e p - 4 0 0スパンカラムに該水層を乗せて 4 0 0 gで 2分間遠心分離し、 溶出液を回収した。
5〜 2 0 %濃度勾配を有する酢酸カリ ウム溶液上に、 該溶出液を乗せ、 5 0， 0 0 0 r p mで 3時間超遠心分離し、 底からペリスタポンプを用いて 2 1に分画 して分取した。
それぞれの分画をエタノール沈殿して c DNAを回収し、 それらの一部をァガ ロースゲル電気泳動後ォートラジオグラフィーをすることにより各分画に含まれ る c DN Aの長さを測定し、 約 3 k b以上の c DNAを含む画分 （H) 、 1〜 3· k bの c DN Aを含む画分 （M) 、 l k b以下の c DN Aを主に含む画分 （L) の 3画分に分けて集めた。
クローニングベクター Z A P Π (Stratagene社製） 9 g ( 9 μ I ) に 1 0 Χ H制限酵素緩衝液 （宝酒造社製） 1 0 ^ 1、 蒸留水 7 5 μ I , E c 0 R I 9 0 単位 （6； 1 ) を添カ卩し、 3 7 °Cで 2時間反応させた。
該反応液に、 5 M N a C l 1 i と N o t l 4 0単位 （5 1 ) を添力 [1し、 さらに 3 7 °Cで 2時間反応させ、 さらに N o t I 8単位 （ 1 1 ) を添加して 3 7 で 1時間反応させ、 ベクタ一の E c 0 R Iサイ トと N 0 t Iサイ トを切断 した。
該反応液に、 2 M T r i s — H C 1 ( p H 8. 0 ) 1 0 0.« 1 と E. coli C75 由来アルカリ フォスファターゼ （宝酒造社製） 1単位 （2 1) を添力 αし、 6 0 °Cで 3 0分間反応させてベクタ一の E c 0 R I切断末端と N 0 t I切断末端の 5' 端を脱リン酸化後、 フヱノール一クロ口ホルム抽出を 2回繰り返して行い酵 素を除いた。
酵素を除去後、 クロ口ホルム抽出をし、 水層をエタノール沈殿してベクタ一 D N Aを回収し、 T E緩衝液に溶解させた。
3画分に分けて集めた c DN Aそれぞれにベクター DN A 1 μ g分を加えて エタノール沈殿を行い、 回収したベクター DNAと c DNAをリガーゼ緩衝液 [ 1 0 O mM T r i s -H C 1 ( p H 7. 6) 、 5 mM M g C l 2、 3 0 0 m M N a C 1 ] 4 μ 1に溶解させ、 ライゲーシヨ ンキッ ト Ver.lの（B)液 4 μ 1を 添加して 2 61：で 1 0分間反応させ、 ベクター DNAに c DNAを結合させた。
亥 t Kiを 4 1すつス phage packaging kit Giga-Pack Gold Π (Stratagene tt 製） を用いてパッケージングを行った。 具体的試薬および方法は、 キッ トに付与 されているマニュアルに記載されているものを用いた。
得られたファージを大腸菌 X L 1 — B 1 u e MR F' 株に感染させてタイ夕 一を測定した。 さらに、 ファージをプレート上で増殖させた後に S M緩衝液中に 回収することにより c DNAライブラリーを 1回増幅し、 最終的な c DNAライ ブラリーとした。 タイターの測定およびラィブラリ一増幅の具体的な方法は、 ス ファージパッケージングキッ トに付与されているマニュアルに従った。 本発明の スクリーニングには約 3 k b以上の c DNAを含む画分 (H)由来のライブラリ一 を用いた。
(C) 5 ' -RACE
( B ) で作製した I g A腎症患者 c D N Aに対して、 5'RACE System ver.2 (Life Technologies社製） を用いて 5' — R A C Eを行った。 具体的な方法は、 キッ トに添付のマニュアルにしたがった。
以上の （A) 〜 （C) の方法を用いて、 第 2表に示す 7種類の遺伝子について- c DN Aをクローン化することができた。 第 2表
Figure imgf000047_0001
1 ) 得られた各 c DNAクローンのクローン化方法で 、 A： ジーントラッノ、°— 法、 B ： c D N Aライブラリ一のプラークハイプリダイゼーシヨン、 c ： 5， 一 RACE法である。 得られたそれぞれの c DNAクローンの c DNA部分の塩基配列は、 パ一キン エルマ一社の 377 DN Aシークェンサ一を用いて决定した。 塩基配列決定のた めの具体的試薬および方法はパーキンエルマ一社のダイプライマーサイクルシー クェンシング P ;：>レディーリアクンヨ ン (Dyeprimer cycle sequensine FS Ready Reaction) キッ トを使用し、 キッ トに添付のマニュアルに従った。 また、 この塩 基配列を 3フレームでァミノ酸配列に翻訳し 1 00アミノ酸以上からなるオーブ ンリーディングフレーム （ORF) が存在するかどうかを調べた。
( 1 ) I NP 303 A
ジーントラッパー法で c DNAクローン GT I NP 303 A— 4 1 aが得られ たせ、 その c DNAの塩基配列中には 1 00アミノ酸以上からなる OR Fはなく、 非完全長の c DNAクローンと考えられた。
完全長の c DN Aクローンを取得するために、 GT I NP 303 A—4 1 aの c DNAの 5' 端に近い部分に対応する特異的プライマー （配列番号 1 1 0， 1 1 1に塩基配列を示した） を用いて 5' —RACEを行い、 c DNAクローン I NP 303 A-R 1を取得した。 また、 GT I NP 303A— 4 1 aの c DNA の塩基配列は一部決定できなかったため、 NB— 1の c DNAライブラリ一から プラークハイブリダィゼーシヨンにより別の c D N Aクローン I N P 303 A p h 1 - 3を取得した。
これら取得された c DN Aクローンの塩基配列を組み合わせることにより、 配 列番号 1に示した 4276 b pからなる I NP 303 Aの c DN Aの塩基配列を 決定した。
ディファレンシャル ' ディスプレイにより得られた断片の塩基配列 （配列番号 4 1) は配列番号 1の 2797〜3 1 0 1番目に相当する相補鎖の塩基配列と一 致した。 このことから、 アンカープライマ一は mRN Aの 3， 末端の p o 1 y A配列ではなく、 配列番号 1の 2782〜 2795番目に存在する Tが連続する 配列の相補鎖にァニ一リングしたものと考えられた。 I NP 303 A— R lの c DN Aの塩基配列には、 230アミノ酸からなる 0 RF (配列番号 1の 53〜742番目に相当する。 アミノ酸配列を配列番号 34 に示した。 ） が見出された。
該 ORFのアミノ酸配列をアミノ酸配列のデータベースと比較したところ、 線 虫のゲノム遺伝子クローン C 40 H 1がコ一ドしていると推定された蛋白質の一 つである C OH l. 1、 マウス cytoplasmic polyadenylation elememt binding protein (CPEBP) 、 ショウジヨウバエ o r b遺伝子と相同性をもつことがわかつ た。
また、 これらの蛋白質が I NP 303 A蛋白質と相同性を示している部分の直 後のアミノ酸配列は、 配列番号 1の 3346〜 3577番目の塩基配列がコード するアミノ酸配列と相同性を示すことがわかった。 このことから I NP 303A の塩基配列には、 本来はィン トロンと考えられる 2639 b pの塩基配列 （配列 番号 1の 7 1 3〜 3352番目に相当） が残つたままの異常なスプライシングを 起こした c DNAであると推定された。
ディファレンシャル ' ディスプレイにより得られた、 I g A腎症患者で発現量 力5'上昇していた断片の塩基配列はこの挿入配列中にあり、 I gA腎症患者ではこ のような異常なスプライシングを起こした m R N Aが上昇していることがわかつ た。 該異常なスプライシングを起こした mRN Aから翻訳された蛋白質は、 本来 の I NP 303 A遺伝子がコードする蛋白質、 即ち相同性から推定したィントロ ンを除いた塩基配列がコードする蛋白質 （295アミノ酸） とは 220番目以降 のアミノ酸配列が異なっており、 本来の機能を発揮していない可能性が高い。 (2) I NP 377 A
ジーン トラッパ一法 c DNAクローン GT I NP 377A— 46 Cの c DNA の塩基配列を決定し、 得られた塩基配列を配列番号 2に示した。
I NP 377 Aの c DNAの塩基配列を塩基配列データベースと比較したとこ ろ、 ショウジヨウバエのガン抑制遺伝子 S X 1 と相同性をもつヒ トの遺伝子 Lひ C A 1 5 (GenBank； accession No. U23946) の 1〜 552番目の配列が、 G T I NP 377 A-46 Cの塩基配列の 50〜 527番目、 および 1 0 10〜 108 3番目の塩基配列と一致することがわかった。 従って GT I NP 377A— 46 Cは LUC A 1 5のイントロンが残った異常なスプライシングを起こした c DN Aクローンであると推定された。
ディファレンシャル · ディスプレイにより得られた断片の塩基配列 （配列番号 42) は配列番号 2の 759〜 1 0 14番目に相当する相補鎖の塩基配列と一致 した。 このことから、 アンカープライマーは mRNAの 3， 末端の p o 1 y A 配列ではなく、 配列番号 2の 745〜 757番目に存在する Tが連続する配列の 相補鎖にアニーリングしたものと考えられた。 該断片の配列は LUCA 1 5のィ ントロンと考えられる塩基配列中に存在していると考えられるため、 I gA腎症 患者ではこのような異常なスプライシングを起こした mRNAが上昇しているこ と考えられた。
GT I NP 377 A— 46 Cがコードする蛋白質は 143アミノ酸であり （配 列番号 35にアミノ酸配列を示した。 ） は、 本来の LUCA 1 5 c DNAがコ —ドする蛋白質 （8 1 5アミノ酸） とは 1 37番目以降のアミノ酸配列力 ?異なつ ており、 本来の機能を発揮していない可能性が高い。
(3) I NP 379 A
I g A腎症患者の白血球 c D N Aライブラリーのプラークハイブリダィゼーシ ヨンにより、 I NP 379A c DNAクローン PH I NP 379A— 16— 2 を取得した。
該 c DNAの塩基配列を決定したところ、 5' 末と考えられた側に X h 0 Iサ イ トおよび p 0 1 y T配列があり、 c DNAがベクターに逆向きに挿入されたク ローンであると考えられた。
従って、 本来の c DNAの塩基配列である、 得られた塩基配列に相補的な塩基 配列を配列番号 3に示した。 ディファレンシャル ·ディスプレイにより得られた断片の塩基配列 （配列番号
43 ) は配列番号 3の 2706〜 2949番目の塩基配列と一致した。 この塩基 配列中には 1 04アミノ酸からなる 0 R F (ァミノ酸配列を配列番号 36に示し た。 ） が存在した。
アミノ酸配列データベース中には、 このアミノ酸配列と相同性のある配列は見 出されず、 新規な蛋白質をコ一ドする遺伝子と考えられた。
(4) I NP 40 1 A
I gA腎症患者の白血球 c DNAライブラリーのブラ一クハイプリダイゼ一シ ヨンによ り I NP 40 1 A c DNAクローン PH I NP 40 1 A— 8— 1およ び P H I N P 40 1 A— 1 4一 1を取得した。
両者の c D N Aの塩基配列を決定したところ、 両者は 1塩基だけが異なり、 1 ァミノ酸が異なる以外は同一の 1 33アミノ酸からなる 0 R Fが存在すること力 わかった。 また両者は、 5' 非翻訳領域および 3' 非翻訳領域の塩基配列も異な つており、 遺伝子のポリモルフイズムおよびスプライシングの異なった m R N A の存在が推定された。
PH I NP 40 1 A— 8— 1の塩基配列を配列番号 4に、 PH I NP 401 A - 14 - 1の塩基配列を配列番号 5に示し、 P H I N P 40 1 A— 8— 1がコー ドする蛋白質のァミノ酸配列を配列番号 3マに、 PH I NP 401 A— 14— 1 がコードする蛋白質のァミノ酸配列を配列番号 38に示した。
ディファレンシャル . ディスプレイにより得られた断片の塩基配列 （配列番号
44 ) は配列番号 4の 960〜 12 1 7番目、 および配列番号 5の 1 3 1 3〜 1
570番目に相当する相補鎖の塩基配列と一致した。 このことから、 アンカープ ライマ一は mRNAの 3' 末端の p o l y A配列ではなく、 配列番号 4の 94 7〜959番目あるいは配列番号 5の 1302〜 13 1 2番目に存在する Tが連 続する配列の相補鎖にァニーリングしたたものと考えられた。
ディファレンシャル ' ディスプレイで得られた I g A腎症患者で発現量の上昇
― 4Q― している断片の塩基配列は PH I NP 40 1 A— 8— 1および PH I NP 401 A— 14— 1の塩基配列と相補的な塩基配列を有していた。
PH I NP 40 1 A— 8— 1および P H I N P 40 1 A— 14— 1がコードす る蛋白質の相同性を調べた力、 アミノ酸配列データベース中には相同性のある配 列は見出されず、 新規な蛋白質をコ一ドしていると考えられた。
ァミノ酸配列から推定した親水性の解析から、 I NP 40 1 Aのコードする蛋 白質は分泌蛋白質である可能性があり、 その場合、 配列番号 37あるいは 38の 1〜 1 5番目のアミノ酸配列がシグナルべプチドと推定された。
(5) GT I NP 332A-2 1
ジーントラツバ一法により、 I NP 332 Aの c DN Aクローンの取得を試み た力 ?、 得られた c DNAクローン GT I NP 332 A— 2 1の塩基配列中には、 I NP 332 Aのディ ファレンシャル · ディスプレイ増幅断片と一致する塩基配 列はなく、 別の遺伝子の c D N Aクローンと考えられた。
GT I NP 332 A-2 1については、 その塩基配列にもとづいたプライマ一 (配列番号 1 05および 1 06に塩基配列を示した。 ） を用いて実施例 2に記載 の方法で健常人と I g A腎症患者の白血球について RT— PC Rによる遺伝子の 発現量を調べたところ、 I g A腎症の患者白血球で健常人と比較して 4. 6倍の 発現量の上昇が見られた。
GT I NP 332 A— 2 1の c DNA部分をプローブにして、 I g A腎症患者 白血球の c DNAラィブラリ一のプラークハイプリダイゼーションにより c DN Aクローン PHGT I NP 332A— 2 1— 28— 1を取得した。
該クローンの c DNAの塩基配列を決定したところ 1 28アミノ酸からなる 0 RFが存在することがわかった。 配列番号 6に PHGT I NP 332 A- 2 1 28- 1の c DNAの塩基配列を、 配列番号 39に OR Fのコードする蛋白質の アミノ酸配列を示した。
該 OR Fのアミノ酸配列はリン酸化チロシンと結合する機能を持つ、 フォス ファチジルイノシ ト一ル 3， 4， 5— 3 リン酸 5—フォスファターゼ等の S H 2 ドメインと相同性を持つことがわかった。
(6) I NM 0 6 3 - 7
完全長の c DN Aクローンを取得するために、 NB— 1の c DNAライブラリ 一からプラークハイブリダィゼーシヨンにより 3つの c DNAクローン （I NM 0 6 3 - 7 p h 5 - l , I NM0 6 3 - 7 p h 4 — l、 I NM0 6 3— 7 p h 9 - 1 ) を取得した。
これら取得された c DNAクローンの塩基配列を組み合わせることにより、 配 列番号 7に示した 4 3 4 3 b pからなる I NM 0 6 3— 7の c DNAの塩基配列 を決定した。
ディファレンシャル ' ディスプレイにより得られた断片の塩基配列 （配列番号 8 ) は配列番号 7の 2 8 0 9〜 2 9 6 4番目に相当する相補鎖の塩基配列と一致 した。 このことから、 アンカープライマーは mRNAの 3 ' 末端の p o 1 y A 配列ではなく、 配列番号 7の 2 9 6 5〜 2 9 7 4番目に存在する Tが連続する配 列の相補鎖にアニーリングしたものと考えられた。
4 3 4 3 b pからなる I NM0 6 3— 7の c DNAの塩基配列には、 3 4 3ァ ミノ酸からなる ORF (配列番号 7の 1 〜 1 0 2 9番目に相当する。 ァミノ酸配 列を配列番号 4 0に示した。 ） が見出された。
該 ORFのアミノ酸配列をアミノ酸配列のデータベースと比較したところ、 iron-regulatory protein 2(1 R P 2)のスプライシングバリアントであることがわか つた。
I NM 0 6 3— 7の塩基配列には、 本来はィントロンと考えられる 2 8 0 8 b pの塩基配列 （配列番号 7の 1 0 2 4〜 3 8 3 2番目に相当） が存在しているこ とから、 I NM0 6 3— 7は異常なスプラィシングの結果生じた c DNAである と推定された。
ディファレンシャル ' ディスプレイにより得られた I g A腎症患者で発現 · 量が上昇していた断片の塩基配列は、上記ィン トロン由来の配列中にあることか ら、 I g A腎症患者ではこのような異常なスプライシングを起こした m R N Aが 上昇していることがわかった。 この異常なスプラィシングを起こした m R N Aか ら翻訳される蛋白質は、 本来の I N P 0 6 3— 7遺伝子がコードする蛋白質 （9 6 3アミノ酸） とは 3 4 2番目以降のアミノ酸配列が異なっており、 本来の機能 を発揮していない可能性が高い。 実施例 4 本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体の作製
( 1 ) 抗原の調製
各蛋白質のアミノ酸配列を解析し、 親水性の高い部分、 N末端および C末端の アミノ酸配列の中からぺプチド抗原として適当と考えられる部分を選択して、 化 合物 1から 8 (配列番号 1 1 4から 1 2 1 ) を合成した。 化合物の理化学的性質 は次の方法により測定した。
質量分析は、 日本電子 JMS- HX110A を用い F A B— M S法により行った。 アミ ノ酸分析は、 コーェン （Cohen, S. A. ) らの方法 [Analyt ical Biochemistry, 222, 19 (1994) ] により行った。 加水分解は塩酸蒸気中 1 1 0 °Cで 2 0時間行い、 加水分解物のァミノ酸組成はゥオーターズ · アキュ · タグ （Waters AccQ-Tag) アミノ酸分析計 （Waters社製） を用い分析した。
( i ) 配列番号 1 1 4に記載のアミノ酸配列を有するぺプチド （化合物 1 ) の 合成
配列番号 3 7、 3 8の蛋白質に対する抗体を作製するために、 該蛋白質の C末 端 1 4アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するぺプチドを下記の方法で合 成した。
N。一 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル一 L—イソロイシン （以下、 F m 0 c — I 1 eと略す） 2 5 m o 1が結合した担体樹脂 （Wang樹脂、 ノノ 5
ビオケム社製） 52. l mgを自動合成機 （ACT社製） の反応容器に入れ、 0· 5 m 1の DMFを加えて 3分間攪拌した後溶液を排出し、 続いて以下の操作を行 つた。
(a) N， N—ジメチルホルムアミ ド （以下、 DMFと略す） にピペリジンを 2 5 %添加した溶液 （以下、 2 5 %ピペリジン一 DMF溶液と略す） 1 m 1 を力 Π えて混合物を 2分間攪拌し、 該溶液を排出した。 再度 2 5%ピぺリジン一 DMF 溶液 1 m 1 を加えて混合物を 1 0分間攪拌し、 該溶液を排出した。
(b) 担体樹脂に l m lの DMFを加え 1分間攪拌し、 該溶液を排出した。 こ の操作を 6回繰り返した後、 0. 5m lの DMFで樹脂と反応容器を洗浄した。 こう して、 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル （以下、 Fmo cと略 す） 基を除去した H- I 1 eの結合した担体樹脂を得た。
( c ) 得られた担体樹脂に対して、 5 00 1の DMF、 Να— 9—フルォレ ニルメチルォキシカルボ二ルー L—ァスパラギン酸一 一 t—ブチルエステル
〔以下、 Fmo c— A s p (0 t B u) —OHと略す〕 と N—ヒ ドロキシベンゾ トリァゾール （以下、 HOB t と略す） . 1水和物をそれぞれ 0. 5 Mの濃度で 含む N—メチルピロリ ドン （以下、 NMPと略す） 溶液 2 5 0 1および N， N，一ジイソプロピルカルポジイ ミ ド （以下、 D I PCと略す） を 0. 5Mの濃 度で含む NMP溶液 1 2 5 /ノ 1 を加えて 1 0分間攪拌し、 1分間静置した。 1 0 分攪拌、 1分静置のサイクルを 4回繰り返した後、 該溶液を排出した。
(d) 担体樹脂に l m lの DMFを加え 1分間攪拌し、 該溶液を排出した。 こ の操作を 2回繰り返した。
(e) 担体樹脂に対して、 3 7 5 1の DMF、 Fmo c— A s p (O t B u) —OHと HOB t · 1水和物をそれぞれ 0. 5Mの濃度で含む NMP溶液 2 50 し 2— (1 H—ベンゾトリアゾール一 1—ィル） 一 1 , 1， 3， 3—テ トラメチルゥロニゥム ' へキサフルォロホスフェート （以下、 HBTUと略す） を 0. 5Mの濃度で含む DMF溶液 2 50 μ 1およびジイソプロピルェチルアミ- ン （以下、 D I EAと略す） を 2Mの濃度で含む DMF溶液 1 2 5 a 1 を加えて 1 0分間攪拌し、 1分間静置した。 1 0分間攪拌、 1分間静置のサイクルを 3回 繰り返した後、 該溶液を排出した。
( f ) 担体樹脂に 1 m 1の DMFを加え 1分間攪拌し、 該溶液を排出した。 こ の操作を 2回繰り返した後、 0. 5 m 1の D M Fで樹脂と反応容器を洗浄した。 該操作により、 Fmo c—A s p (O t B u) — I 1 eの結合した担体樹脂を 得た。
上記 （ f ) 行程終了後、 （a) (b) の Fmo c基除去工程を行った。 Fmo c基除去後、 （c ) の工程で Fmo c—A s p (O t B u) —OHのかわりに N "一 9一フルォレニルメチルォキシカルボニルー 0— t—ブチルー Lースレオニ ン 〔以下、 Fmo c— T h r ( t B u) OHと略す〕 を用いて縮合反応を行つ た。 縮合反応後、 （d) の洗浄工程を経、 （ e ) の工程で再度 Fm 0 c— A s p (O t B u) — OHのかわりに Fmo c— T h r ( t B u ) —OHを用いて縮合 反応を行い、 （ f ) の洗浄工程を行うことによ り、 Fmo c— Th r ( t B u) 一 A s p (O t B u) — I 1 eを担体上に合成した。
以下、 工程 （ c ) ( e ) において、 N。一 9一フルォレニルメチルォキシカル ボニル一 Ng— 2， 2， 5， 7， 8—ペンタメチルクロマン _6 スルホ二ルー L—アルギニン 〔以下、 Fmo c—A r g (Pmc) — OHと略す〕 、 Fmo c -Th r ( t B u ) -OH, N。一 9一フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー L—フエ二ルァラニン （以下、 Fmo c— P h e OHと略す） 、 Fmo c— P h e— OH、 Fmo c— T h r ( t B u) — OH、 Na— 9 フルォレニルメチ ルォキシカルボニル一 L—グリシン （以下、 Fmo c— G 1 y— OHと略す） 、 Fmo c—A s p (O t B u) 一 OH、 N"— 9—フルォレニルメチルォキシカ ルポ二ル—し一グルタ ミ ン酸一 7— t—プチルエステル 〔以下、 Fmo c— G 1 u (0 t -B u ) —OHと略す〕 、 Fmo c—A r g (Pmc) —〇H、 N。一 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー N E— t一ブチルォキシカルボニル — L一リジン 〔以下、 Fmo c—L y s (B o c ) — OHと略す〕 、 F m o c— T h r ( t B u ) -OH, N。一 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル一 L —ロイシン （以下、 Fm 0 c— L e u— OHと略す） 、 Fmo c— Th r ( t B u ) 一 0 H、 N。 一 9一フルォレニルメチルォキシカルボニル一 L一プロ.リ ン
(以下、 Fm 0 c— P r 0— OHと略す） 、 Νπ— 9一フルォレニルメチルォキ シカルボ二ルー S— トリチル一 L—システィン 〔以下、 Fmo c—C y s (T r t ) —OHと略す〕 を順次用いて、 （a) 〜 （ Π 工程を繰り返した後、 （a)
(b) の Fmo c基除去工程を行った。
得られた樹脂をメタノール、 ブチルエーテルで順次洗浄し、 減圧下 1 2時間乾 燥して、 側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。 これに、 トリフルォロ酢 酸 （以下、 TFAと略す） 8 2. 5%、 チオア二ソール 5%、 水 5%、 ェチ ルメチルスルフイ ド 3%、 1， 2—エタンジチオール 2. 5%およびチォフエ ノール 2 %からなる混合溶液 l m 1 を加えて室温で 8時間放置し、 側鎖保護基 を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。 樹脂を濾別後、 得られた溶 液にエーテル約 1 0m l を加え、 生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーショ ンにより回収し、 粗ペプチドとして 4 9. Omgを取得した。 この粗生成物を 2 M 酢酸水溶液に溶解後、 逆相カラム （資生堂製、 CAPCELL PAK C18 30匪 I.D. X 250mm) を用いた H P L Cで精製した。 0. 1 % TFA水溶液に、 TFA 0. 1 %を含む 90 % ァセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、 220 nmで検出し、 化合物 1を含む画分を得た。 この画分を凍結乾燥して、 化 合物 1を 1 8. Omg得た。
質量分析 〔FABMS〕 ； m/z = 1 797. 4 (M+H + )
ァミ ノ酸分析； A s x 2. 1 (2) ， G l x l . l ( 1 ) , G 1 y 1. 0 (1) , A r g 1. 8 ( 2) ， T h r 2. 0 (2) ， P r o 0. 9 ( 1) ， C y s 1. 3 ( 1 ) , L y s 1. 0 ( 1 ) , l i e 1. 0 (1) ， L e u 1. 0 ( 1 ) , P h e 1. 9 (2) (ii) 配列番号 1 1 5に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物 2) の 合成
配列番号 3 7、 38の蛋白質に対する抗体を作製するために、 該蛋白質の 73 〜8 7番目の 1 5アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを下記 の方法で合成した。
Fmo c— NH、 2 5 mo 1が結合した担体樹脂 （Rink Amide BHA樹脂、 ノバビオケム社製） 4 5. 5mgを出発物質として、 （ 1 ) - ( i ) と同様にし て、 mo c— G l u (O t B u) — OH、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c - A r g (Pmc) —OH、 Fmo c— G l u (O t B u) _OH、 Fmo c— A r g (Pmc ) 一 OH、 Fmo c -L y s (B o c ) —OH、 Na— 9—フル ォレニルメチルォキシカルボニル一 O— t—ブチル一Lーセリン 〔以下、 Fmo c - S e r ( t B u) —〇Hと略す〕 、 Fmo c— L y s (B o c) — OH、 N «— 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー N y— ト リチルー Lーァスパラ ギン 〔以下、 Fmo c— A s n (T r t ) —〇Hと略す〕 、 Fmo c—P h e— OH、 Fmo c -L y s (B o c) — OH、 Fmo c— G l u (O t B u) —0 H、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c— P h e— OH、 Fmo c— S e r ( t B u) 、 Fmo c— C y s (T r t) 一 0 Hを順次縮合した後に、 F m o c基除 去、 洗浄、 乾燥を経て、 側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。 （ 1) - ( i ) と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、 粗べ プチド、 6 7. l mgを取得し、 逆相カラムを用いた HP LCで精製し、 化合物 2を 30. 8mg得た。
質量分析 〔FABMS〕 ； m/z = 2 0 1 3. 1 (M+H + )
ァミノ酸分析； A s x 1. 0 ( 1 ) , S e r 1. 8 (2 ) ， G 1 x 3. 2 (3) ， A r g 1. 9 (2) ， C y s 1. 3 ( 1 ) ， L y s 3. 0 (3) ， L e u 1. 9 (2) , P h e 2. 0 (2) (iii) 配列番号 1 1 6に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物 3) の合成
配列番号 37、 38の蛋白質に対する抗体を作製するために、 該蛋白質の 1 0 4〜 1 1 6番目の 14アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するぺプチドを 下記の方法で合成した。
Fmo c— NH、 25 ^ m o Iが結合した担体樹脂 （Rink Amide BHA樹脂、 ノバビオケム社製） 4 5. 5mgを出発物質として、 （ 1 ) - ( i ) と同様にし て、 Fm 0 c— G 1 y— OH、 N。一 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル — L—バリ ン （以下、 Fm 0 c— V a 1一 OHと略す） 、 Fm o c— L y s (B o c ) -OH, N。一 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー N'nd— t一 ブチルォキシカルボニル一 L一 トリプトファン 〔以下、 Fmo c—T r p (B o c ) —OHと略す〕 、 Fmo c— L y s (B o c) — OH、 Fmo c— G i u
(O t B u) -OH, Fmo c— P h e— OH、 Fmo c - G l u ( 0 t B u ) 一 OH、 Fmo c— G l y— OH、 Fmo c - S e r ( t B u) 一 OH、 Fmo c -T r p (B o c) 一 OH、 N a— 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル — N'm— ト リチルー L—ヒスチジン 〔 Fmo c— H i s (T r t ) -OH) 、 Fmo c— G l u (O t B u) 一 OH、 N。一 9—フルォレニルメチルォキシカ ルポニル一 Lーァラニン （以下、 Fmo c— A 1 a— OHと略す） 、 Fmo c— C y s (T r t ) 一 OHを順次縮合した後に、 Fmo c基除去、 洗浄、 乾燥を経 て、 側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。 これに 2—メチルインドール を 5 m gZm 1の濃度で含む T F A (90%) 、 チオア二ソ一ル （5%) 、 1， 2—エタンジチオール （ 5 % ) からなる混合溶液 1 m 1を加えて室温で 2時間放 置し側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行った。 その後は （ 1) -
( i ) と同様にして粗ペプチド、 50. 6mgを取得し、 逆相カラムを用いた H PLCで精製し、 化合物 3を 6. 6mg得た。 質量分析 〔FABMS〕 ； m/ z = 1 792. 5 (M+H+)
ァミノ酸分析； S e r 1. 0 ( 1 ) ， G 1 x 3. 0 (3) ， G l y 2. 2 (2) ， H i s 0. 8 ( 1 ) ， A 1 a 0. 8 ( 1 ) ， C y s 1. 1 ( 1 ) ， V a 1 1. 1 ( 1 ) ， L y s 2. 1 (2) ， P h e 1. 1 ( l ) ， T r pは 分析せず
(iv) 配列番号 1 1 7に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物 4) の 合成
配列番号 34の蛋白質に対する抗体を作製するために、 該蛋白質の C末端 1 5 アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するぺプチドを下記の方法で合成した
Fmo c—P h e、 2 5 mo 1が結合した担体樹脂 （Wang樹脂、 ノバビオケ ム社製） 4 9. Omgを出発物質として、 （ 1 ) - ( i ) と同様にして、 Fmo c— L y s (B o c ) — OH、 Fmo c— G l y— OH、 Fmo c— P h e— 0 H、 Fmo c— H i s ( T r t ) OH、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c— I l e—OH、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c— S e r ( t B u) _OH、 Fmo c— V a l— OH、 Fmo c— A r g (Pmc) — OH、 F m o c— L y s (B o c ) -OH, Fmo c— A s p (O t B u) — OH、 Fm o c - I 1 e -OH, Fmo c—G l u (O t B u) OH、 Fmo c - C y s (T r t) - 〇Hを順次縮合した後に、 Fmo c基除去、 洗浄、 乾燥を経て、 側鎖保護べプチ ドの結合した担体樹脂を得た。 （ 1 ) - ( 1 ) と同様にして側鎖保護基の切断な らびに樹脂からの切り出しを行い、 粗ペプチド、 4 1. 2mgを取得し、 逆相力 ラムを用いた HPLCで精製し、 化合物 4を 1 4. 6mg得た。
質量分析 〔FABMS〕 ； m/z = 1 90 5. 8 (M+H + )
ァミノ酸分析； A s x 1. 0 ( 1 ) ， S e r 0. 9 ( 1 ) ， G 1 1. 0 (1) ， G l y 1. 1 ( 1 ) ， H i s 1. 1 ( 1 ) , A r g 0. 9 ( 1 ) ， C y s 1. 3 (1) ， V a l 1. 0 ( 1 ) ， L y s 2. 1 (2) ， l i e 1. 8 (2) ， L e u 1. 9 (2 ) ， P h e 2. 2 (2)
(v) 配列番号 1 1 8に記載のァミノ酸配列を有するぺプチド （化合物 5 ) の 合成
配列番号 3 5の蛋白質に対する抗体を作製するために、 該蛋白質の C末端 1 4 ァミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するぺプチドを下記の方法で合成した;
Fmo c— S e r ( t B u) 、 2 5 m o iが結合した担体樹脂 （Wang樹脂、 ノバビオケム社製） 4 2. 4 mgを出発物質として、 （ 1 ) — ( i ) と同様にし て、 Fmo c— S e r ( t B u) — OH、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c— S e r ( t B u) — OH、 Fmo c— G l u (0 t B u) -OH, Fmo c— G i y—〇H、 Fmo c— T h r ( t B u) 一 OH、 F mo c—L y s (B o c) — OH、 Fmo c— A r g (Pmc) — OH、 Fmo c - L y s (B o c) 一〇H、 N。一 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル —L—メチォニン （以下、 Fmo c -Me t— OHと略す） 、 Fmo c— L e u 一 OH、 Fmo c— A r g (Pmc) — OH、 Fmo c— C y s (T r t) — 0 Hを順次縮合した後に、 Fmo c基除去、 洗浄、 乾燥を経て、 側鎖保護ペプチド の結合した担体樹脂を得た。 （ 1 ) - ) と同様にして側鎖保護基の切断なら びに樹脂からの切り出しを行い、 粗ペプチド、 48. 4 mgを取得し、 逆相カラ ムを用いた H P LCで精製し、 化合物 5を 1 9. Omg得た。
質量分析 〔FABMS〕 ； m/z = 1 708. 9 (M + H + )
ァミノ酸分析； S e r 2. 8 (3) , G l x 1. 1 ( 1 ) , G l y 1. 1 (1) ， A r g 2. 1 (2) ， T h r 1. 0 ( 1 ) ， C y s 1. 3 ( 1) ， Me t 0. 4 ( 1 ) ， L y s 2 · 1 (2) ， L e u 3. 0 (3)
(vi) 配列番号 1 1 9に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物 6) の 合成 配列番号 4 0の蛋白質に対する抗体を作製するために、 該蛋白質の C末端 1 3 アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するぺプチドを下記の方法で合成した
Fm o c— S e r ( t B u ) 、 2 5 / m o 1が結合した担体樹脂 （Wang樹脂、 ノバビオケム社製） 4 2. 4 m gを出発物質として、 （ 1 ) - ( と同様にし て、 Fmo c— V a i — OH、 Fmo c— L y s (B o c ) — OH、 Fm o c— T h r ( t B u) 一 OH、 Fmo c— l i e— OH、 Fmo c—G l y— OH、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c— V a l — OH、 Fmo c— V a l — OH、 Fmo c— A s p ( 0 t B u ) 一 OH、 Fmo c— I 1 e— OH、 Fmo c— S e r ( t B u ) — OH、 Fmo c— T h r ( t B u) 一〇H、 Fm o c— C y s
(T r t ) 一 OHを順次縮合した後に、 Fm o c基除去、 洗浄、 乾燥を経て、 側 鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。 これに TFA (9 0%) 、 チオア二 ソール （5%) 、 1， 2—エタンジチオール （5 %) からなる混合溶液 l m l を 加えて室温で 2時間放置し、 側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行 つた。 その後は （ 1 ) - ( i ) と同様にして粗ペプチド 3 2. 8 m gを取得し、 逆相カラムを用いた HP L.Cで精製し、 化合物 6を 1 1. Omg得た。
質量分析 〔FABMS〕 ； m/ z = 1 4 3 4. 7 (M+H + )
ァミノ酸分析； A s x 1. 1 ( 1 ) ， S e r 1. 9 ( 2 ) , G l y 1. 1
( 1 ) , T h r 2. 0 (2) ， C y s 1. 2 ( 1 ) ， V a l 2. 1 ( 3) ， L y s 1. 1 ( 1) ， l i e 2. 3 (2) ， L e u 1. 1 ( 1 )
(vii) 配列番号 1 2 0に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物 7) の合成
配列番号 3 9の蛋白質に対する抗体を作製するために、 該蛋白質の 6 5〜 7 9 番目の 1 5アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するぺプチドを下記の方法 で合成した。
Fmo c— NH、 2 5 /ノ m o 1が結合した担体樹脂 （Rink Amide MBHA樹脂、 - 5
ノバビオケム社製） 4 5. 5m gを出発物質として、 （ 1 ) - ( i ) と同様にし て、 Fmo c - L y s (B o c) — OH、 Fmo c A r g (Pmc) —OH、 Fm o c— P h e— OH、 N °— 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー 0 一 t一ブチル一 Lーチロシン 〔以下、 Fmo c—T y r ( t B u) —OHと略 す〕 、 Fmo c - A r g (Pmc) — OH、 Fmo c - L y s (B o c) 一 OHヽ Fmo c— H i s (T r t ) — OH、 Fmo c— V a 卜 OH、 Fmo c— G i y -OH, Fmo c— P r o— OH、 N。一 9一フルォレニルメチルォキシカル ボニルー L—ァラニン （以下、 Fmo c— A 1 a— OHと略す） 、 Fmo c— T h r ( t B u) 一〇H、 Fmo c— G l u ( 0 t B u ) 一 OH、 Fmo c— A l a -OH, Fmo c— S e r ( t B u .) 、 Fmo c— C y s (T r t ) — OHを 順次縮合した後に、 Fmo c基除去、 洗浄、 乾燥を経て、 側鎖保護ペプチドの結 合した担体樹脂を得た。 （ 1 ) - ( i ) と同様にして側鎖保護基の切断ならびに 樹脂からの切り出しを行い、 粗ペプチド 42. 4 mgを取得し、 逆相カラムを用 いた H P LCで精製し、 化合物 7を 1 2. l mg得た。
質量分析 〔FABMS〕 ； m/z = 1 84 9. 7 (M+H + )
ァミノ酸分析； S e r 0. 9 ( 1 ) ， G 1 x 1. 0 ( 1 ) ， G 1 y 1. 0 ( 1) ， H i s 0. 7 ( 1 ) ， A r 2. 0 (2) ， T h r 0. 9 ( 1 ) , A l a 1. 9 (2) ， P r o 1. 0 ( 1 ) ， C y s 1. 4 ( 1 ) ， T y r 1. 7 (1) ， V a 1 0. 7 ( 1 ) ， L y s 2. 1 (2) , P h e 1. 1 (1 )
(viii) 配列番号 1 2 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド （化合物 8) の合成
配列番号 36の蛋白質に対する抗体を作製するために、 該蛋白質の C末端 1 5 アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するぺプチドを下記の方法で合成した。
H— P r o、 2 5/ mo 1力 ?結合した担体樹脂 （クロ口トリチル樹脂、 ノバビ オケム社製） 6 1. Omgを出発物質として、 ジクロロメタン 1 m 1で樹脂を洗 浄した後に （ 1 ) - ( i ) の工程 （c) から合成を始める以外は （ 1 ) - ( i ) と 同様にして、 Fmo c— T y r ( t B u) — OH、 Fmo c— A s n (T r t ) 一 OH、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c—V a l —OH、 Fmo c— A s n
(T r t ) -OH, Fmo c— G l y— OH、 Fmo c— L e u— OH、 Fmo c— L e u—〇 H、 N。一 9一フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー N E— ト リチルー L一グルタミン 〔以下、 Fmo c— G i n (T r t ) — OHと略す〕 、 Fmo c L y s (B o c) — OH、 Fmo c— G l u (O t B u) —OH、 F mo c— T h r ( B u ) 一 OH、 Fm o c— I 1 e— OH、 Fmo c— L y s
(B o c) -OH, Fmo c— C y s (T r t ) _ 0 Hを順次縮合した後に、 F mo c基除去、 洗浄、 乾燥を経て、 側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た c I一 6 と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、
( 1 ) - ( i ) と同様に粗べプチド 53. 1 m gを取得し、 逆相カラムを用いた HP L Cで精製し、 化合物 8を 2 3. 4mg得た。
質量分析 〔FABMS〕 ； m/ z = 1 833. 6 (M+H+)
ァミノ酸分析； A s x 2. 1 (2 ) ， G 1 X 2. 1 (2) ， G l y 1. 1
( 1 ) ， Th r 0. 9 ( 1 ) ， P r o 1. 0 ( 1 ) , C y s 1. 4 ( 1 ) ， Ty r 1. 0 ( 1 ) ， V a 1 0. 9 ( 1 ) ， L y s 1. 9 (2) ， l i e 1. 0 (1) ， L e u 2. 9 (3)
(2) 免疫原の調製
免疫原性を高める目的で、 上記 （ 1 ) で得られた化合物 1〜8と KLH (カル ビオケム社製） とのコンジュゲートを、 以下の方法で作製し、 免疫原として用い た。
即ち、 KLHを P B Sに溶解して 1 OmgZm 1 に調整し、 1/10 容量の 2 5 mg/m 1 MB S (ナカライテスク社製） を滴下して 3 0分間撹拌反応させた c 予め PB Sで平衡化しておいたセフアデックス G— 2 5カラムを用レ 未反応 の MB Sを除いた。
得られた 2. 5：!1 の1^し11ー ：6を、 化合物 1〜 8各々 1 mgを溶解した 0. 1 Mりん酸ナトリウムバッファー （ P H 7. 0 ) に添加、 混合し、 室温で 3時間、 攪拌反応させた。
反応後、 該反応液を P B S中で透析した。
(3) 動物の免疫とポリクローナル抗体の作製
上記 （2 ) で調製した各化合物の KLHコンジユゲート 1 00 gをアルミ二 ゥムゲル 2 m gおよび百日咳ワクチン （千葉県血清研究所製） 1 X 1 09細胞と ともに 5週令雌ラッ ト （SD) に投与し、 2週間後より 1 00 gのコンジュゲ —トを 1週間に 1回、 計 4回投与した。 眼底静脈叢より採血し、 その血清抗体価 を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、 十分な抗体価を示したラッ トから全採血に より血清を採取した。
(4) 酵素免疫測定法
アツセィ用の抗原には上記 （ 1 ) で得られた各化合物をサイログロブリン （以 下、 THYと略す。 ） とコンジュゲー ト したものを用いた。 作製方法は上記 (2) に記した通りである力 \ 架橋剤には MB Sの代わりに SMC C (シグマ社 製） を用いた。 96穴の E I A用プレート （グライナ一社製） に、 上述のように 調製したコンジュゲートを 1 0 g/m 1、 50 / 1 /穴で分注し、 4度でー晚 放置して吸着させた。 洗浄後、 1 %B SA— PB Sを 1 Z穴で加え、 室 温 1時間反応させて残っている活性基をブロックした。 1 % B S A— P B Sを捨 て、 被免疫ラッ ト抗血清を 5 0 17穴で分注し 2時間反応させた。 PB Sに Tweenを 0.05%添加した溶液 （以下 0.05%T w e e n— PB Sと略す） で洗浄後、 ペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗ラッ トイムノグロプリン （ダコ社製） を 5 0 1 /穴で加えて室温、 1時間反応させ、 0.05°/oT w e e η -Ρ B Sで洗浄後 A B T S基質液 〔2. 2—アジノビス （ 3—ェチルベンゾチアゾ一ルー 6—スルホン 酸） アンモニゥム〕 を用いて発色させ OD4 1 5 nmの吸光度をプレートリーダ 一 (E-m a ；和光純薬） で測定した。
結果を第 1〜8図に示した。 いずれの抗血清も免疫原として用いた化合物に特 異的な反応性を示した。 産業上の利用可能性
本発明により得られる DNA、 蛋白質および抗体を用いることにより I g A腎 症の診断、 治療が可能である。 配列表フリーテキス ト
配列番号 4 5—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 46一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 47—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 48一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 49一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 50—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 51一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 52一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 53—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 54一人工配列の説明 合成 DNA
配列 ¾·可 5 5—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 5 6—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 5 7—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 5 8—人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 59一人工配列の説明 合成 DNA 85
配歹 L番号 6 0一人工配列の説明：合成 DNA 配歹 L番号 6 1一人工配列の説明：合成 DNA 配歹 i.番号 62一人工配列の説明： 合成 DNA 配歹 i番号 63一人工配列の説明：合成 DNA 配歹 i.番号 64一人工配列の説明 ·合成 DNA 配歹 ί番号 6 5一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 ί番号 66一人工配列の説明 合成 DN A 配歹 1番可り Ί一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1.番号 6 8一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1.番号 6 9一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1.番号 70一人工配列の説明 合成 DNA 配歹番号 7 1一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 i'番号 72一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1.番号 73一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1番号 74一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1. 1番号 75一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1. 1番号 76一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1 1番号 7 7一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 i 1番号 78一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1 1番号 79一人工配列の説明 合成 DNA 配歹 1 1番号 80一人工配列の説明 合成 DNA 西曰？し 11 j田^ 7 O 丄 一ノ入ー了し西曰 Fし"¾ yリlのレノ n ¾i日^ HJ 八 Π¾τ Pi "NT Δ 配歹 1 1番号 82一人工配列の説明 ：合成 DNA 配歹 1 1番号 83一人工配列の説明 ：合成 DNA 配歹 1 1番号 84一人工配列の説明 ：合成 DNA 配歹 1 1番号 8 5一人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 86一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 8 7一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 88一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 89一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 90一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 9 1一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 92一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 93一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 94一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 95一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 96一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 97一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 98一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 99一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 0 0—人工配列の説明 合成 DN A 配列番号 1 0 1一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 02一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 03—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 04一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 0 5—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 0 6—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 0 7—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 08一人工配列の説明 合成 DNA 配列 ¾ " 1 09一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 1 0—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 1 1一人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 1 1 2 人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 1 1 3 人工配列の説明：合成 D N A 配列番号 1 1 4 人工配列の説明：合成べプチド 配列番号 1 1 5 ァミデーシヨ ン、 クルタ ミ ン酸アミ ド 配列番号 1 1 6 ァミデーシヨ ン、 ク"リシンアミ ド 配列番号 1 1 7 人工配列の説明：合成べプチド 配列番号 1 1 8 人工配列の説明：合成べプチド 配列番号 1 1 9 人工配列の説明：合成べプチド 配列番号 1 2 0 -ァミデーシヨ ン、 リシノアミ ド 配列番号 1 2 1 人工配列の説明：合成べプチド

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 1〜 3 3および配列番号 4 1〜 4 3で表される塩基配列から選 ばれる塩基配列を有する I g A腎症関連 DNAまたは該 DNAとストリンジェン トな条件下でハイプリダイズする DNA。
2. 配列番号 1〜 3 3で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続し た 5〜 6 0残基と同じ配列を有する DNAまたは該 DNAと相補的な配列を有す る DNA。
3. DNAカ?、 配列番号 4 5〜 1 0 6で表される塩基配列から選ばれる塩基 配列を有する D N Aである、 請求項 2記載の D N A。
4. 請求項 1、 2または 3記載の DNAを用いる、 I gA腎症関連遺伝子の mRNAを検出する方法。
5. 請求項 1、 2または 3記載の DNAを含む、 I gA腎症診断薬。
6. 請求項 2または 3記載の DNAを用いる、 I g A腎症関連遺伝子の転写 または I g A腎症関連遺伝子の mRNAの翻訳を抑制する方法。
7. 請求項 2または 3記載の DNAを含む、 I gA腎症治療薬。
8. ディ ファレンシャル ' ディスプレイ法を用い、 I g A腎症患者白血球よ り I g A腎症関連 DN Aを取得する方法。
9. 配列番号 3 4〜 4 0で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列 を有する蛋白質、 または該蛋白質の有するアミノ酸配列とは 1若しくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、 かつ I gA腎症に 関連する活性を有する蛋白質。
10. 請求項 9記載の蛋白質をコードする DNA。
11. 請求項 1 0記載の DN Aをベクターに組み込んで得られる組換え体 DN A。
12. 請求項 1 1記載の組換え体 DN Aを宿主細胞に導入して得られる形質転 換体。
13. 請求項 1 2記載の形質転換体を培地に培養し、 培養液中に請求項 9記載 の蛋白質を生成蓄積させ、 該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする蛋 白質の製造方法。
14. 請求項 9記載の蛋白質を認識する抗体。
15. 請求項 1 4記載の抗体を用いる、 請求項 9記載の蛋白質の免疫学的検出 方法
16. 請求項 1 4記載の抗体を含有する、 I g A腎症の診断薬。
17. 請求項 1 4記載の抗体を含有する、 I g A腎症の治療薬。
18. 請求項 1、 2または 3に記載の D N Aおよび診断に許容される担体から なる組成物。
19. 請求項 1または 3に記載の D N Aおよび薬理学的に許容される担体から なる組成物。
20. 請求項 1 4に記載の抗体および診断に許容される担体からなる組成物。
21. 請求項 1 4に記載の抗体および薬理学的に許容される担体からなる組成 物。
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