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WO1999060118A1 - SOUS-UNITE ε2 DU RECEPTEUR GABA¿A? - Google Patents

SOUS-UNITE ε2 DU RECEPTEUR GABA¿A? Download PDF

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Publication number
WO1999060118A1
WO1999060118A1 PCT/FR1999/001138 FR9901138W WO9960118A1 WO 1999060118 A1 WO1999060118 A1 WO 1999060118A1 FR 9901138 W FR9901138 W FR 9901138W WO 9960118 A1 WO9960118 A1 WO 9960118A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
gaba
subunit
receptor
sequence
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/001138
Other languages
English (en)
Inventor
Maurice Garret
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority to AU36115/99A priority Critical patent/AU3611599A/en
Publication of WO1999060118A1 publication Critical patent/WO1999060118A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates in particular to a nucleotide sequence which comprises at least one sequence having at least 80% identity with the gene coding for the ⁇ 2 subunit of the GABA A receptor, the peptide corresponding to the ⁇ 2 subunit, a method of screening of active substances on the central nervous system, and a pharmaceutical composition comprising said substances.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • GTP binding protein a second messengers (GTP binding protein) to cation channels (potassium or calcium);
  • GABA A GABA type A receptors
  • the family of GABA type A receptors belongs to the superfamily of receptor channels with opening dependent on the binding of a ligand and today includes 6 subfamilies ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ of which 3 have several subtypes ⁇ 1-6, ⁇ 1-3 and ⁇ l-3 (01sen and Tobin, 1990; Sieghart, 1995; Davies et al., 1997; Garret et al., 1997; Hedblom et al, 1997; Whiting et al., 1997). All of the GABA ionotropic receptor subunits have peptide sequence identities of 70 to 80% within a subfamily and 30 to 40% between subfamilies.
  • GABA A receptors The binding of GABA to GABA A receptors causes Cl " ions to pass through the postsynaptic membrane, which ultimately inhibits neuronal activity. These receptor channels are oligomeric glycoproteins forming a pentamer which delimits the channel Ion central distribution.
  • the distribution of mRNAs of the different GABA A receptors has been shown to vary very significantly from one region to another of the nervous system. This differential distribution correlates with the heterogeneity of pharmacology and the distinct physiological role of families. and GABA A subtypes. So the dozen GABA A receptor subunits can lead by combination to a multitude of functional receptors each having a very specific localization and a more specific affinity for certain ligands.
  • GABA A receptors represent specific binding sites for many substances commonly used for the treatment of nervous system disorders and physiology. Benzodiazepines are particularly effective in modulating the activity of various GABA A receptor subtypes. Consequently, it is possible to identify new molecules which act specifically on a subunit of the receptor and which can serve in particular to regulate symptoms linked to the central nervous system, such as anxiety, disturbances of alertness, of memory. , and sleep. More particularly, the characterization of new subunits, expressed in the brain at the level of the sub-thalamic nucleus (NST), would be a new opportunity for the treatment of Parkinson's disease.
  • NST sub-thalamic nucleus
  • the tonic activity (muscle tension and motor activity) of the subthalamic nucleus is involved in the onset of tremors and akinesia in Parkinson's disease.
  • High frequency stimulation of NST or local application of GABA dramatically improves these symptoms.
  • GABA A receptors Numerous pharmacological results of GABA A receptors have been obtained from whole brain membranes or regions of the brain. These results only reflect the general properties of the GABA A receptors and do not allow the heterogeneity of these receptors to be measured. Experiments have shown that certain products tested have different affinities for GABA A receptors from different regions of the brain.
  • these products may have different effects on the GABA-induced currents recorded on different neuronal populations.
  • some allosteric sites are therefore not necessarily present on all GABA A receptors.
  • these receptors exist in multiple forms which have different regional and cellular distributions.
  • GABA A subunit corresponds to a new class called ⁇ . It is expressed in the conductive tissue of the heart (Garret et al., 1997). It has also been shown by Northern blot experiments that the gene coding for this ⁇ subunit is expressed in the subthalamic nucleus (NST) and to a lesser extent in the amygdala (Davies et al. , 1997 ; Whiting et al., 1997). This sub-unit ⁇ , which will subsequently be called ⁇ l, was the subject of a patent application WO 96/06862. However, in situ hybridization experiments with a probe hybridizing to this ⁇ l gene show an absence of labeling in the NST (Whiting et al., 1997; Garret et al., Unpublished results).
  • the rat NST cDNA was amplified by PCR with oligonucleotides derived from the sequence of the human ⁇ 1 subunit.
  • the subunit ⁇ l mentioned above, was not detected in the NST.
  • the subunit, expressed in the NST represents a new and distinct subunit ⁇ , called ⁇ 2, which is in particular the object of the present invention.
  • the present invention relates to a nucleotide sequence comprising at least one sequence having at least 75% identity with the gene which codes for the ⁇ 2 subunit of the GABA A receptor.
  • said nucleotide sequence has the following sequence SEQ ID No. 1 or a sequence having at least 85% identity with this sequence:
  • nucleotide sequence is intended to mean a sequence of single-stranded or double-stranded DNA, coding or non-coding, sense or antisense, or a sequence of sense or antisense RNA. Said sequence comprises all the possible variations coding for the ⁇ 2 subunit of the GABA A receptor in order to take account of the degeneration of the genetic code.
  • Another aspect of the present invention relates to a peptide characterized in that it comprises at least one peptide sequence having at least 65% of identity with the ⁇ 2 subunit of the GABA A receptor
  • said peptide has the following sequence SEQ ID No. 2 or a sequence having at least 80% identity with this sequence:
  • the different receptors formed from any combination between the subunits ⁇ 2, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ , as well as any multimeric protein formed from any combination between the subunits ⁇ 2, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ are also part of the invention.
  • the present invention also relates to a vector for expression of said peptide, characterized in that it comprises a nucleotide sequence as mentioned above.
  • the coding nucleotide sequence can be fused to a promoter effective in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • This expression vector may also comprise one or more selection markers and optionally one or more genes coding for the ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ subunits of the GABA A receptor.
  • a further aspect of the invention relates to a cell transformed by this vector, particularly a transformed cell which expresses on its surface a multimeric protein formed from any combination ⁇ 2, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ .
  • any combination is meant the set of possible dependent and independent associations comprising at least ⁇ 2 and another subunit.
  • said transformed cell expresses on its surface a GABA A receptor having the ⁇ 2 subunit.
  • a cell can be co- transfected with several vectors, each expressing one or more GABA A receptor subunits .
  • An embodiment of the present invention consists in a method of manufacturing said peptide characterized in that said peptide is made to express by a transformed cell as defined above.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for screening for molecules capable of possessing a pharmacological activity consisting in testing the affinity and / or the action of molecules on said peptide and / or on the complete GABA A receptor further having ⁇ 2 .
  • the present invention relates to an antibody against said peptide, an agonist or an antagonist of said peptide and / or of the complete GABA A receptor further having ⁇ 2.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising said peptide, an agonist, an antagonist, or a vector, as mentioned above, and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • This composition is useful for the manufacture of a medicament, in particular for the manufacture of a medicament intended for the inhibition of one or more GABA A receptors having the ⁇ 2 subunit or for the activation of one or more GABA A receptors having the ⁇ 2 subunit, preferably for the treatment of disorders of the central nervous system, in particular anxiety, nervousness, anxiety, behavioral disorders, alertness, memory, and sleep.
  • this composition is useful for the manufacture of a medicament for the treatment of the symptoms of tremors and akinesia, in particular for the treatment of Parkinson's disease.
  • the gene coding for the ⁇ 2 subunit was identified and amplified by PCR from the cDNA present in the rat subthalamic nucleus.
  • the amplified 320 bp sequence has 80% identity with the ⁇ l subunit previously characterized in the conductive tissue of the heart, Garret et al. , (1997), incorporated into the description by reference. This percentage of identity is observed between the subunits of the same family, for example the six sub- ⁇ units have 80% identity between them.
  • the percentage of identity in the area of transmembrane regions is 100%. Therefore, the subunit characterized in rat NST is identified as the product of a new gene and is identical ⁇ 2 in humans.
  • a new subunit, ⁇ 2 was demonstrated from RNA extracted from the subthalamic nucleus, during the experiments of the present invention.
  • the molecular and electrophysiological characterization of a new GABA receptor associated with this ⁇ 2 subunit should lead to the discovery of a new pharmacology.
  • the ⁇ 2 subunit can be used in conjunction with the other ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ subunits (multiple combinations) in order to precisely define the functions of the NST and to identify substances with specific action. high.
  • a specific pharmacology of a receptor expressed in a region of the brain makes it possible to envisage developing new therapeutic weapons directed against a dysfunction of this structure or against the dysfunction of a circuit in which this structure is involved.
  • the in situ hybridization experiments show a marking mainly in the locus coeruleus, the rape nuclei and the hypothalamus (arcuate, dorsomedian, dorsomedian pars compacta and lateral nucleus). Other markings are observed at the level of the Purkinje cells of the cerebellum, of the substantia nigra, the median tonsil, the subfornical organ, the preoptic nucleus and the lateral septum.
  • Figure 1 Identification of the ⁇ 2 subunit.
  • Figure 2 Partial comparison between the ⁇ 2 and ⁇ l genes.
  • Figure 3 Partial comparison between the peptides ⁇ 2 and ⁇ l.
  • FIG. 1A shows the analysis of the PCR product obtained after amplification of the cDNA of rat NST with the primers MIU and M3D. No fragment is visible at the expected size (310 bp) after staining with ethidium bromide. Two bands are visible at the markers 194 and 118 bp indicating non-specific amplification. After cutting the agarose band corresponding to 310 bp, a second amplification makes it possible to obtain a DNA fragment corresponding to ⁇ 2 (FIG. 1B).
  • the brain is obtained from male Wistar rats 20 to 28 days old.
  • a block of tissue containing the NST is cut into coronal slices of 300-400 ⁇ M, the NST is identified using an atlas, Paxinos G. and Watson C, (1986).
  • RNA is extracted by the method of Chomezynski and Sacchi (1987).
  • the cDNA is synthesized in 20 ⁇ l from 5 ⁇ g of total RNA and 1 ⁇ g of primers at random (haxanucleotides) with 200 U of reverse transcriptase (Superscript; BRL).
  • Examples 2 Amplification by PCR.
  • the PCR is carried out in a volume of 50 ⁇ l containing 1 unit of Taq polymerase (Applig Amsterdam, Illkirch, France) in the buffer supplied by the manufacturer, 1 ⁇ M of each primer, 0.2 mM of each deoxynucleotide, and 1 ⁇ l of cDNA.
  • the primers used are MIU (sense): ATGGTCATGACGATTTTCTTCAAT (SEQ ID 3) and M3D (antisense): TGTCTGGTT GTAGATCAGGAAGTTGAGC (SEQ ID 4).
  • PCR is carried out first with 5 cycles: denaturation for 30 s at 95 ° C, hybridization 30 s at 45 ° C and polymerization 30 s at 72 ° C followed by 30 cycles (30 s at 95 ° C, 30 s at 50 ° C and 30 s at 72 ° C) then 1 cycle (30 s at 95 ° C , 30 s at 50 ° C and 10 min at 72 ° C).
  • the amplification product is purified by centrifugation on a Sephadex S-400 column (Pharmacia), and sequenced by PCR with the primer M3D and a kit "dRhodamme terminator cycle sequencing" (PE Applied Biosystem) according to the manufacturer's instructions.
  • the PCR product is subcloned into a plasmid (pT7 Blue, Novagen).
  • RNA splicing regulâtes the expression of a novel GABA A receptor subunit conferring atypical functional properties. J. Neurosci. 17, 5027: 5037

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Abstract

La présente invention concerne notamment une séquence nucléotidique qui comprend au moins une séquence ayant au moins 75 % d'identité avec le gène codant pour la sous-unité epsilon 2 du récepteur GABAA, le peptide correspondant à la sous-unité epsilon 2 une méthode de criblage de substances actives sur le système nerveux central, et une composition pharmaceutique comprenant lesdites substances.

Description

SOUS-UNITE ε2 DU RECEPTEUR GABAA
La présente invention concerne notamment une séquence nucléotidique qui comprend au moins une séquence ayant au moins 80% d'identité avec le gène codant pour la sous-unité ε2 du récepteur GABAA, le peptide correspondant à la sous-unité ε2, une méthode de criblage de substances actives sur le système nerveux central, et une composition pharmaceutique comprenant lesdites substances.
Le GABA (acide gamma-aminobutyrique), principal neuromédiateur inhibiteur du système nerveux central, agit en se fixant soit sur les récepteurs ionotropiques de type A et C, soit sur les récepteurs de type B, qui sont des récepteurs métabotropiques associés via le système des second messagers (GTP binding protein) à des canaux cationiques (potassique ou calcique); (Bowery, 1993).
La famille des récepteurs du GABA de type A (GABAA), appartient à la super-famille des canaux-récepteurs à ouverture dépendante de la fixation d'un ligand et comprend à ce jour, 6 sous-familles α, β, γ, δ, π et ε dont 3 comportent plusieurs sous-types α 1-6, β 1-3 et γl-3 (01sen et Tobin, 1990 ; Sieghart, 1995 ; Davies et al., 1997 ; Garret et al., 1997 ; Hedblom et al, 1997 ; Whiting et al. , 1997). Toutes les sous-unités des récepteurs ionotropiques de GABA présentent des identités de séquences peptidiques de 70 à 80% à l'intérieur d'une sous-famille et de 30 à 40% entre les sous- familles.
La fixation de GABA sur les récepteurs GABAA provoque le passage d'ions Cl" à travers la membrane post-synaptique, ce qui in fine inhibe l'activité neuronale. Ces canaux-récepteurs sont des glycoprotéines oligomériques formant un pentamère qui délimite le canal ionique central. Il a été démontré que la distribution des ARNm des différents récepteurs GABAA varie très significativement d'une région à l'autre du système nerveux. Cette distribution différentielle corrèle avec l'hétérogénéité de la pharmacologie et le rôle physiologique distinct des familles et des sous-types de GABAA . Ainsi, la quizaine de sous-unités des récepteurs GABAA peut conduire par combinaison à une multitude de récepteurs fonctionnels ayant chacun une localisation bien particulière et une affinité plus spécifique pour certains ligands.
Les récepteurs GABAA représentent des sites de liaison spécifique pour de nombreuses substances couramment utilisées pour le traitement des troubles du système nerveux et du phy schisme. Les benzodiazépines sont particulièrement efficaces pour moduler l'activité de divers sous-types du récepteur GABAA . En conséquence, il est possible d'identifier de nouvelles molécules agissant spécifiquement sur une sous-unité du récepteur et pouvant servir notamment de régulateur des symptômes liés au système nerveux central, tels que l'anxiété, les troubles de la vigilance, de la mémoire, et du sommeil. Plus particulièrement, la caractérisation de nouvelles sous-unités, exprimées dans le cerveau au niveau du noyau sous-thalamique (NST), serait une nouvelle opportunité pour le traitement de la maladie de Parkinson. En effet, l'activité tonique (tension musculaire et activité motrice) du noyau sous- thalamique est impliquée dans l'apparition des tremblements et de l'akinésie dans la maladie de Parkinson. La stimulation à haute fréquence du NST ou l'application locale de GABA améliore spectaculairement ces symptômes. Ainsi, la caractérisation d'un nouveau type de récepteur exprimé dans cette structure permet d'envisager le développement de nouvelles thérapeutiques. De nombreux résultats de pharmacologie des récepteurs GABAA ont été obtenus à partir de membranes de cerveau entier ou de régions du cerveau. Ces résultats reflètent seulement les propriétés générales des récepteurs GABAA et ne permettent pas de mesurer l'hétérogénéité de ces récepteurs. Des expériences ont montrées que certains produits testés possèdent des affinités différentes pour les récepteurs GABAA issus de régions distinctes du cerveau. En outre, ces produits peuvent avoir des effets différents sur les courants induits par le GABA enregistrés sur différentes populations neuronales. Ainsi, certains sites allostériques ne sont donc pas nécessairement présents sur tous les récepteurs GABAA. Ainsi, ces récepteurs existent sous de multiples formes qui présentes des distributions régionales et cellulaires différentes.
Une sous-unité du récepteur GABAA , récemment clonée, correspond à une nouvelle classe appelée ε. Elle est exprimée dans le tissu conducteur du cœur (Garret et al. , 1997). Il a également été montré par des expériences de Northern blot que le gène codant pour cette sous-unité ε est exprimé dans le noyau sous-thalamique (NST) et à un moindre niveau dans l'amygdale (Davies et al. , 1997 ; Whiting et al., 1997). Cette sous-unité ε, que l'on nommera par la suite εl, a fait l'objet d'une demande de brevet WO 96/06862. Mais des expériences d'hybridation in situ avec une sonde s'hybridant à ce gène εl montrent une absence de marquage dans le NST (Whiting et al. , 1997 ; Garret et al., résultats non publiés).
Pour comprendre cette contradiction entre les résultats obtenus par northern blot et par hybridation in situ, l'ADNc de NST de rat a été amplifié par PCR avec des oligonucléotides dérivés de la séquence de la sous-unité εl humaine. Or, de manière surprenante, la sous-unité εl, ci-dessus mentionnée, n'a pas été détectée dans le NST. En réalité, la sous-unité, exprimée dans le NST, représente une nouvelle et distincte sous-unité ε, appelée ε2, qui est notamment l'objet de la présente invention.
Ainsi, aucun document de l'art antérieur ne suggère, ni ne divulgue la présente invention telle que définie ci-dessous.
DESCRIPTION
Ainsi, la présente invention concerne une séquence nucléotidique comprenant au moins une séquence ayant au moins 75% d'identité avec le gène qui code pour la sous-unité ε2 du récepteur GABAA. De préférence, ladite séquence nucléotidique la séquence SEQ ID n° l suivante ou une séquence ayant au moins 85 % d'identité avec cette séquence:
5'CTCCACACAGGTGGTCGTGCCAGGCACCGCTGAGATGTTGCCTAA AGTTCTCCTGATGCTCCTCAACATGTTCCTGGCCCTCCAGTGGAGGG TTGGACCTCACATTAAACTGGAGAATAAACCCCCTGCCCAAGATAAG GAGTCTTTGGCCCTCAGCCTCAGCCTGTGCCACAACCTCTGATTCCG CCTGAATCTCCTGCTGGAGATGATGTAGTCTTCGACTCTCAGCCCCA GCCCCAGTCGGAATCCCCTGGCCATGATGATGTCTTTAGCTCCCAGC CCCAGCCTCTGCCCCAGTCCCAGCTGGAACCTCAGCCTAGTGGAAAG AAGCTTCCAGCAAGAGAAACAGAACTCACTGCTGATCATACAACTG AACGCCCACGTGGAAAACTGACAAGAGCTTCTCAAATCCTTAACACC ATCCTGAGCAACTACGACCATAAACTGCGCCCTAGCATTGGAGAGA AGCCTACCGTGGTCACTGTTAAAGTCTTTGTCAACAGCCTCGGACCT ATTTCCATCCTAGACATGGAATATTCCATTGACATCATCTTCTACCAG ACCTGGTATGATGAGCGTCTTCGTTACAATGACACCTTTGAGACACT TATTCTACATGGCAACGTGGTGAGCCAGTTGTGGATCCCGGATACTT TTTTTAGGAATTCTAAGAGGACCCAAGAGTATGATATCACCATACCC AACCAGATGGCTCTCATCCATAAGGATGGAAAAGTGTTGTACACAGT TAGGATGACCATTGATGCAÂGATGCTCACTCCACATGCTCAATTTTC CAATGGATTCTCACTCTTGCCCTCTGTCTTTCTCTAGCTTTTCCTATGA TGAGCATGAGATGATATACAAGTGGGAGAATTTCAAACTCAAAATC GATGCGAAGAACACTTGGAAGCTATTGGAGTTTGATTTTACAGGAGT GAACAACAAAACTGAAATCATCTCCACCCCAGTTGGTGACTTCATGG TCATGACATTCTTCTTCAATGTAAGCAGGAGGTTTGGCTTCATTGTCT TTC AAAACT ATATCCCTTC ATCTGTT ACC AC AATGCTTTCCTGGGTGT CCTTCTGGATCAAGATAGAAGCTGCTGCTGCCAGGGCCTCTGTAGGG GTCAGTTCTGTGCTCACCATGGCCACACTGGGTACCTTTTCTCGTAAG AATTTCCCTCGTGTCTCCTATCTCACAGCTTTGGACTTCTATATTGCA ATTTGTTTCGTCTTGTGCTTCTGTACTCTACTAGAGTTCACTGTGCTC AACTTCCTGACCTACAATAATATTGAACGAC AGGCTTCTCC AAAGTT CTACCAATTTCCAACCAATAGCCGTGCTAATGCACGTACTCGTGCTC GTGCCCGCACTCGTGCTCGTGCTCGTGCCCGTGCTCGTCAGCAGCAG GAAGTGTTTGTGTGTGAGATTGTTACCTATGAGGAAAATGCTGAAGA GGGTTACCAGTGGTCTCCAAGATCAAGAAGACCTCAGTGTCCCTGGA GGCGATGTGGCCGAAGCTATGTGTGCTTCAGGGTTCTCAGGAAGTAT TTCTGCATGGTTCCTGGTTGTGAGGGCAACAACTGGCAGCGGGGCCG CATCTGCATCCACGTTTATCGCCTGGATAACTACTCGCGGGTGCTTTT CCCCATTACATTCTTCTTCTTTAATGTGGTCTACTGGGTGATTTGCCTT AACCTGTAG-3'
On entend par séquence nucléotidique, une séquence d'ADN simple brin ou double brin, codante ou non codante, sens ou anti-sens, ou une séquence d'ARN sens ou anti-sens. Ladite séquence comprend toutes les variations possibles codant pour la sous-unité ε2 du récepteur GABAA afin de tenir compte de la dégénérescence du code génétique.
Un autre aspect de la présente invention concerne un peptide caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence peptidique ayant au moins 65% d'identité avec la sous-unité ε2 du récepteur GABAA De préférence, ledit peptide possède la séquence SEQ ID n° 2 suivante ou une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec cette séquence:
MLPKVLLMLLNMFLALQWRVGPHIKLENKPPAQDKVVFGPQPQPVPQP LIPPESPAGDDNVFDSQPQPQSESPGHDDVFSSQPQPLPQSQLEPQPSGK LPARETELTADHTTERPRGKLTRASQILΝTILSΝYDHKLRPSIGEKPTV VTVKVFVΝSLGPISILDMEYSIDUFYQTWYDERLRYΝDTFETLILHGΝVV SQLWIPDTFFRΝSKRTQEYDITIPΝQMALIHKDGKVLYTVRMTIDARCSL HMLΝFPMDSHSCPLSFSSFSYDEHEMIYKWEΝFKLKIDAKΝTWKLLEFD FTGVΝΝKTEIISTPVGDFMVMTFFFΝNSRRFGFIVFQΝYIPSS VTTMLS W VSFWIKIEAAAARASVGVSSVLTMATLGTFSRKΝFPRVSYLTALDFYIAI CFVLCFCTLLEFTVLΝFLTYΝΝIERQASPKFYQFPTΝSRAΝARTRARART RARARARARQQQEVFVCEIVTYEEΝAEEGYQWSPRSRRPQCPWRRCGR SYVCFRVLRKYFCMVPGCEGΝΝWQRGRICIHVYRLDΝYSRVLFPITFFF FΝVVYWVICLΝL
Les différents récepteurs, formés à partir de toute combinaison entre les sous- unité ε2, α, β, γ, δ et π, ainsi que toute protéine multimérique formée à partir de toute combinaison entre les sous-unité ε2, α, β, γ, δ et π font aussi parti de l'invention.
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression dudit peptide caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique telle que mentionnée ci-dessus. La séquence nucléotidique codante peut être fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules procaryotes ou eucaryotes. Ce vecteur d'expression peut comporter en outre un ou des marqueurs de sélection et éventuellement un ou plusieurs gènes codant pour les sous-unités α, β, γ, δ et π du récepteur GABAA. Un aspect supplémentaire de l'invention vise une cellule transformée par ce vecteur, particulièrement une cellule transformée qui exprime à sa surface un protéine multimérique formée à partir de toute combinaison ε2, α, β, γ, δ , π. On entend par toute combinaison, l'ensemble des possibles associations dépendantes et indépendantes comportant au minimum ε2 et une autre sous-unité. De préférence, ladite cellule transformée exprime à sa surface un récepteur GABAA ayant la sous-unité ε2. Une cellule peut être co- transfectée par plusieurs vecteurs, chacun exprimant une ou plusieurs sous- unités du récepteur GABAA.
Un mode de réalisation de la présente invention consiste en un procédé de fabrication dudit peptide caractérisé en ce qu'on fait exprimer ledit peptide par une cellule transformée telle que définie ci-dessus.
Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder une activité pharmacologique consistant à tester l'affinité et/ou l'action de molécules sur ledit peptide et/ou sur le récepteur GABAA complet ayant en outre ε2. De surcroît, on peut tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur une cellule telle que définie ci- dessus.
La présente invention vise un anticorps contre ledit peptide, un agoniste ou un antagoniste dudit peptide et/ou du récepteur GABAA complet ayant en outre ε2. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant ledit peptide, un agoniste, un antagoniste, ou un vecteur, tels qu'ils sont mentionnés ci-dessus, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Cette composition est utile pour la fabrication d'un médicament, en particulier pour la fabrication d'un médicament destiné à l'inhibition d'un ou plusieurs récepteurs GABAA ayant la sous-unité ε2 ou à l'activation d'un ou plusieurs récepteurs GABAA ayant la sous-unité ε2, de préférence pour le traitement des troubles du système nerveux central, notamment de l'anxiété, de la nervosité, de l'angoisse, des troubles du comportement, de la vigilance, de la mémoire, et du sommeil. En outre, cette composition est utile pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des symptômes de tremblements et de l'akinésie, en particulier pour le traitement de la maladie de Parkinson.
Le gène codant pour la sous-unité ε2 a été identifié et amplifié par PCR à partir de l'ADNc présent dans le noyau sous-thalamique de rat. La séquence amplifiée de 320 pb, possède 80% d' identité avec la sous-unité εl précédemment caractérisée dans le tissu conducteur du cœur, Garret et al. , (1997), incorporée dans la description par référence. Ce pourcentage d'identité est observé entre les sous-unité d'une même famille, par exemple les six sous- unités α ont 80% d'identité entre elles. De plus, lorsqu'on compare la même sous-unité entre deux espèce différente (par ex : le rat et l'homme), le pourcentage d'identité dans le domaine des régions transmembranaire est de 100% . Par conséquent, la sous-unité caractérisée dans le NST de rat est identifiée comme le produit d'un nouveau gène et est identique ε2 chez l'homme.
L'ensemble des données bibliographiques infra montre que plusieurs sous- types de récepteurs GABAA sont présents dans le SNC. Les propriétés pharmacologiques de chaque sous-type de récepteur dépend de la composition en sous-unités. Par exemple, seule la co-expression des sous-unités α et β et d'une sous-unité γ permet de trouver une réponse à l'ensemble des molécules de la famille des benzodiazépines.
Une nouvelle sous-unité, ε2, a été mise en évidence à partir d'ARN extrait du noyau sous-thalamique, lors des expériences de la présente invention. La caractérisation moléculaire et électrophysiologique d'un nouveau récepteur GABA associé à cette sous-unité ε2 doit conduire à la mise en évidence une nouvelle pharmacologie. De même on peut utiliser la sous-unité ε2 conjointement avec les autres sous-unités α, β, γ, δ et π (multiples combinaisons) afin de définir précisément les fonctions du NST et d'identifier des substances ayant une spécificité d'action élevée. Une pharmacologie spécifique d'un récepteur exprimé dans une région du cerveau permet d'envisager de développer de nouvelles armes thérapeutiques dirigés contre un dysfonctionnement de cette structure ou contre le dysfonctionnement d'un circuit dans laquelle cette structure est impliquée.
Les expériences d'hybridation in situ montrent un marquage principalement dans le locus coeruleus, les noyaux du raphe et l'hypothalamus (noyau arqué, dorsomédian, dorsomédian pars compacta et latéral). D'autres marquages sont observés au niveau des cellules de Purkinje du cervelet, de la substance noire, l'amygdale médiane, l'organe subfornical, le noyau préoptique et le septum latéral.
Ceci suggère une influence de cette sous-unité sur les systèmes noradrénergiques, sérotoninergiques et dopaminergiques qui sont propres respectivement au locus coeruleus, aux noyaux du raphe et à la substance noire. La sous-unité ε2 paraît donc avoir un rôle sur les comportements dans lesquels ces structures sont impliquées.
Pour la suite de la description et des exemples, on se référera aux légendes des figures présentées ci-dessous.
Figure 1 : Identification de la sous-unité ε2.
Electrophorèse sur gel d'agarose 1,5% des produits PCR, avec les amorces MIU et M3D, réalisé sur : A, le cDNA de NST et B, le fragment d'ADN extrait du gel montré en A. Le fragment à la taille attendue de 310 pb est indiqué par une flèche. (M) : marqueur de taille, fragment phiX174-HaeIII.
Figure 2 : Comparaison partielle entre les gènes ε2 et εl.
Séquence nucléotidique du fragment PCR obtenu a partir de cDNA de NST de rat (ε2), comparaison avec la séquence correspondante de la sous-unité de récepteur GABAA εl humaine. L'identité de la séquence est indiqué à droite de la figure, les amorces MIU et M3D utilisées pour la PCR sont indiquées. Les positions conservées entre les deux séquences sont indiquées par un point.
L'alignement entres les séquences complètes de ε2 (rat) et εl (humain) montre un pourcentage d'identité de 71,2 pour la séquence nucléotidique.
Figure 3 : Comparaison partielle entre les peptides ε2 et εl.
Séquence peptidique déduite de la séquence du fragment PCR obtenu a partir de cDNA de NST de rat (ε2), comparaison avec la séquence correspondante de la sous-unité de récepteur GABAA εl humaine. L' identité de la séquence est indiqué à droite de la figure, les régions correspondants aux amorces MIU et M3D utilisées pour la PCR sont indiquées. Les positions conservées entre les deux séquences sont indiquées par un point. La figure 1A montre l'analyse du produit PCR obtenu après amplification de l'ADNc de NST de rat avec les amorces MIU et M3D. Aucun fragment n'est visible à la taille attendue (310pb) après coloration au bromure d'ethidium. Deux bandes sont visibles au niveau des marqueurs 194 et 118 pb indiquant une amplification non spécifique. Après découpe de la bande d'agarose correspondant à 310 pb, une deuxième amplification permet d'obtenir un fragment d'ADN correspondant à ε2 (figure 1B).
Le séquençage du produit PCR montre que le fragment amplifié est homogène, indiquant l'amplification d'une séquence unique. La séquence nucléotidique du produit PCR obtenu correspondant à ε2 (figure 2) est homologue à la séquence εl à 80% .
L'alignement entres les séquences complètes de ε2 (rat) et ε l(humain) montre un pourcentage d'identité de 63,9 pour la séquence peptidique.
Exemples 1 : Préparation du tissu.
Le cerveau est obtenu à partir de rats mâles Wistar de 20 à 28 jours. Un bloc de tissu contenant le NST est découpé en tranches coronales de 300-400 μM, le NST est repéré à l'aide d'un atlas, Paxinos G. et Watson C , (1986).
Après dissection du NST, L'ARN total est extrait par la méthode de Chomezynski et Sacchi (1987). L'ADNc est synthétisé dans 20 μl à partir de 5 μg d'ARN total et 1 μg d'amorces au hasard (haxanucléotides) avec 200 U de reverse transcriptase (Superscript ; BRL).
Exemples 2 : Amplification par PCR.
La PCR est réalisée dans un volume de 50 μl contenant 1 unité de Taq polymérase (Appligène, Illkirch, France) dans le tampon fourni par le fabricant, 1 μM de chaque amorce, 0.2 mM de chaque deoxynucleotide, et 1 μl de cDNA. Les amorces utilisées sont MIU (sens) : ATGGTCATGACGATTTTCTTCAAT (SEQ ID 3) et M3D (antisens) : TGTCTGGTT GTAGATCAGGAAGTTGAGC (SEQ ID 4). La PCR est réalisée d'abord avec 5 cycles : dénaturation pendant 30 s à 95 °C, hybridation 30 s à 45° C et polymérisation 30 s à 72° C suivit par 30 cycles (30 s à 95 °C, 30 s à 50°C et 30 s à 72°C) puis 1 cycle (30 s à 95°C, 30 s à 50°C et 10 min. à 72°C).
Une fraction de 8 μl du produit d'amplification est analysée sur gel d'agarose 1.5 % en parallèle avec un marqueur de taille PhiX174-HaeIII (Gibco). Une bande d'agarose correspondant à 310 pb est découpée, congelée et décongelée rapidement. Une fraction de milieu ainsi obtenu est utilisée pour une deuxième amplification dans les conditions décrites ci-dessus, excepté que les 5 cycles avec la température d'hybridation à 45°C sont omis.
Exemples 3 : Séquençage.
Le produit d'amplification est purifié par centrifugation sur une colonne de séphadex S-400 (Pharmacia), et séquence par PCR avec l'amorce M3D et un kit "dRhodamme terminator cycle sequencing" (PE Applied Biosystem) selon les instructions du fabricant. Le produit PCR est sous-cloné dans une plasmide (pT7 Blue, Novagen).
Références
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Claims

Revendications
1. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence ayant au moins 75% d'identité avec le gène codant pour la sous-unité ε2 du récepteur GABAA.
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comporte au minimum la séquence SEQ ID n° l.
3. Peptide caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence peptidique ayant au moins 65% d'identité avec la sous-unité ε2 du récepteur GABAA.
4. Peptide selon la revendication 3 ayant au minimum la séquence SEQ ID n° 2.
5. Protéine multimérique formée à partir d'une combinaison entre le peptide selon la revendication 3 et les sous-unités appartenant aux familles α, β, γ, δ et π.
6. Vecteur d'expression d'un peptide selon l'une des revendications 3 et 4 caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 2 fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules procaryotes et/ou eucaryotes et éventuellement un ou des marqueurs de sélection.
7. Vecteur d'expression selon la revendication 6 exprimant en outre un ou plusieurs gènes codant pour les sous-unités α, β, γ, δ et π du récepteur GABAA.
8. Vecteur d'expression d'une protéine selon la revendication 5.
9. Cellule transformée par un vecteur selon l'une des revendications 6 à 8.
10. Cellule co-transfectée avec un vecteur selon la revendication 6 et un vecteur exprimant un ou plusieurs gènes codant pour les sous-unités α, β, γ, δ et π du récepteur GABAA.
11. Cellule transformée selon l'une des revendications 9 à 10 caractérisée en ce qu'elle exprime à sa surface le récepteur GABAA ayant la sous-unité ε2.
12. Procédé de fabrication d'un peptide caractérisé en ce qu'on fait exprimer ledit peptide par une cellule selon l'une revendications 9 à 1 1.
13. Procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder une activité pharmacologique consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur un peptide et/ou une protéine selon l'une des revendications 3 à 5.
14. Procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder une activité phaπnacologique consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur une cellule selon l'une des revendications 9 à 11.
15. Anticorps contre un peptide' selon l'une des revendications 3 à 4 et/ou une protéine selon la revendication 5.
16. Agoniste d'un peptide selon l'une des revendications 3 à 4 et/ou d'une protéine selon la revendication 5.
17. Antagoniste d'un peptide selon l'une des revendications 3 à 4 et/ou d'une protéine selon la revendication 5.
18. Composition pharmaceutique comprenant un peptide selon l'une des revendications 3 à 4 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
19. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur selon l'une des revendications 6 à 8, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
20. Composition pharmaceutique comprenant un antagoniste selon la revendication 17 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
21. Composition pharmaceutique comprenant un agoniste selon la revendication 16 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 18 à 21 pour la fabrication d'un médicament.
23. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 18 à 20 pour la fabrication d'un médicament destiné à l'inhibition d'un ou plusieurs récepteurs GABAA ayant la sous-unité ε2.
24. Utilisation d'une composition selon la revendication 21 pour la fabrication d'un médicament destiné à l'activation d'un récepteur ou plusieurs récepteur GABAA ayant la sous-unité ε2.
25. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 18 à 21 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des troubles du système nerveux central.
26. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 18 à 21 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'anxiété, de la nervosité, de l'angoisse, des troubles du comportement, de la vigilance, de la mémoire, et du sommeil.
27. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 18 à 21 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des symptômes de tremblements et de l'akinésie, en particulier pour le traitement de la maladie de Parkinson.
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