WO1999058716A1

WO1999058716A1 - Procede servant a quantifier une sequence specifique de genes et reactif de quantification

Info

Publication number: WO1999058716A1
Application number: PCT/JP1999/002374
Authority: WO
Inventors: Haruma Kawaguchi; Keiji Fujimoto; Mamoru Hatakeyama; Kyoko Nakamura; Masanori Fukui
Original assignee: Kyowa Medex Co Ltd
Current assignee: Minaris Medical Co Ltd
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2000-11-08
Also published as: AU3628999A

Description

明細

特細云子配列の定量法及び定量試薬技術分野

本発明は、遺醒び遺伝子の突然変異等を早期に診断するための簡便な検出又は定法及びそれらに用いる検出又は ¾fi用試薬に関し、特に特異的反応を抑制した検出又は ^法及びそれらに用いる検出又は定量用試薬に関する。背景技術

遺伝子型及び遺伝子の突然変異等を検出又は定量する方法として P C R (Polymerase Chain Reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法力知られている。し力、し、 PCR法は高感度ではあるが、コストが高く、遺伝子のコンタミネ一シヨンを起こしやすくしかも手法が煩雑である等の理由により広く普及していない。

特異的な親和性を利用した物質の精法に関しては、例えば担体に結合した DN Aプローブを用いて、該プローブ DN Aに特異的に吸着する蛋白質を精製する方法（特開平 3 - 6 1493号公報）が知られている。また、非特異的吸着を示さな、、担体を用、て該担体に結合した DNAプロ一ブを用、て該プロ一ブに特異的に結合する DN A又は RN Aを濃縮又は精製する方法 [ジャーナル ·ォブ · コロイド《アンド ·ィンタ一フェース ·サイエンス (j. Colloid and Interface Sci. ) , 17 7, 245 ( 1996 ) ] が知られている。

ノ、ィブリダイゼ一ション法を用いた 1塩基ミスマツチの排除が可能な特^！伝子断片の検出又は定量方法は本願出願人が既に出願（特開平 10- 1 79 1 79 号）しているが、さらなる感度向上が望まれている。

発明の開示

本発明の目的は、非特異的反応が少ない、特^!伝子配列を有する一本鎖 DN A断片をハイプリダイゼーション法を用いて検出又は定量する方法及びそれらに用いる検出又は定量試薬を提供することである。該方法は、癌等の各種疾患に関与して生じる点突然変異等の検出又は定量に有用である。

本発明によれぱ、試料中の検出又は定量すベき特定遺伝子配列を有する一本鎖

D N A断片の特^ t伝子配列と相捕的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプロ一ブと担体とがスぺ一サ一を介し又は介さず結合している担体結合 D N Aプローブと試料中の D N A断片とをハイブリダィズし、該担体結合 D N Aプローブとハイプリダイズした試料中の D N A断片を検出又は定量することからなる特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定》¾ "法において、担体が表面にェポキシ基を有する高分子であり、該担体と第 1の D N Aプロ一ブを結合させた後、該担体のエポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合 D N Aプローブを用いることを特徴とする特^ t伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定法（以下、第一の方法というときもある）が提供される。また試料中の検出又は定量すべき特^ t伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特¾¾伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと担体とがスぺーサ一を介し又は介さず結合している担体結合 D N Aプローブ及び試料中の検出又は ¾fiすべき特^ t伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特¾¾伝子配列以外の部分配列と相補的な配列を有する第 2の一本鎖 D N Aプローブを共に試料中の D N A断片にハイブリダイズし、該担体結合 D N A及び該第 2の一本鎖 D N Aプロ一ブにハイブリダイズした試料中の D N A断片を検出又は^することからなる特^!伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定 *¾·法において、担体が表面にエポキシ基を有する高分子であり、該担体と第 1の D N Aプローブを結合させた後、該担体のエポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合 D N Aプローブを用いることを特徴とする特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定法（以下第二の方法というときもある）が提供される。

さらに試料中の検出又は^すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特^ 1伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと担体とがスぺーサ一を介し又は介さず結合している担体結合 D N Aプローブと試料中の D N A断片とをハイプリダイズし、次いで一本鎖 D N A断片を切断する酵素を作用させた後、該担体結合 D N Aプローブとハイブリダィズしている試料中の D N A断片を検出又は定量することからなる特^ t伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定量方法において、担体が表面にエポキシ基を有する高分子であり、該担体と第 1の一本鎖 D N Aプローブを結合させた後、該担体のエポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合 D N Aプローブを用いることを特徴とする特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定量方法 (以下、第三の方法ということもある）力提供される。

また本発明によれば、試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特¾¾伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプロープとエポキシ基を有する担体をスぺーサーを介し又は介さず結合させた後、該担体のエポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合 D N Aプローブが提供される。

また本発明によれば、該担体結合 D N Aプロ一ブ及び試料中の検出又は定量すベき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D NA断片の特¾¾伝子配列以外の部分配列と相補的な配列を有する第 2の一本鎖 D N Aプロ一ブと標識化合物が結合している標識結合 D N Aプローブからなる試び標識化合物の検出又は定量試薬からなる特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は用試薬キットが提供される。

さらに本発明によれば、試料中の検出又は定量すべき特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特¾¾伝子配列と相捕的な配列を有する第 1の一本鎖 D N A プローブと標識化合物が結合している標識結合 D N Aプローブとエポキシ基を有する担体をスぺーサ一を介し又は介さず結合させた後、該担体のエポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合標識 D N Aプローブが提供される。

また本発明によれば、該担体結合標識 D N Aプローブを含有する試薬、一本鎖 D N Aを切断する酵素を含有する試び標識化合物の検出又は定量試薬からなる特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定量用試薬キットが提供

C? し。

本発明の第一から第三の方法においては、試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特^!伝子配列と相捕的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブとエポキシ基を有する担体をスぺ一サ一を介し又は介さず結合させた後、該担体のエポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合 D N Aプローブを用いる。

また本発明の第三の方法においては、試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特¾¾伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D Aプローブと標識化合物が結合している標識結合 D N Aプローブとェポキシ基を有する担体をスぺーサを介し又は介さず結合させた後、該担体のェポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合標識 D N Aプロ —ブを用いるのが好ましい。

担体の形状は特に制限はなく、例えばプレート状の担体や粒子状の担体があげられ、粒子状の担体が単位体積あたり D N Aプロ一プを多く結合できるので好ましい。粒子状の担体の粒径としては、 0. 0 1〜： L 0 0 / mが好ましく、 0. 0 5〜 2 0 /z mが特に好ましい。

担体は、表面にエポキシ基を有する合成高分子であり、該高分子を形成するモノマーとしては、例えば、グリシジル（メタ）ァクリレート等のエポキシ基含有

(メタ）アクリル酸エステルがあげられる。この合成高分子ィ匕合物はプレート又は粒子の少なくとも表面の層を形成すればよく、内部は例えばポリスチレン、ポリビニル等の疎水性高分子であってもよい。プレート又は粒子の表面は特に、ェポキシ基を多く含むように調製されることが好ましい。このような粒子としては、例えばポリスチレン ·ポリグリシジルメタクリレートのコア .シェノレ構造を持つ粒子があげられる。

該高分子化合物は、公知の方法で合成できる。特に粒子を製造する場合は、例えば懸濁重合法、乳化重合 ^が用いられる。懸濁重合法により合成する場合、反応には分散安定剤として、例えばポリアクリルアミド及びその限定加水分解物、ポリアクリル酸、ヒドロキシプロピルセルロース、ェチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルアルコ一ル、ポリ酢酸ビニル等の水溶性高分子を用いることができる。重合開始剤としては、ァゾビスイソプチロニトリル、 2， 2 ' —ァゾビス（2—アミノブロノくン）ジヒドロクロライド等のァゾ系開始剤、過酸化べンゾィル等の過酸化物等を用いることができる。乳化重合における重合開始剤としても、通常の乳化重合で使用されるものであれば特に限定されない。乳化重合法における重合法は、バッチ式、セミバッチ式、連続式等の各方式が用いられる。乳化重合法としては、粒子表面をクリ―ンな面とし吸着物質を持ち込まない様にするため、水、モノマー、重合開始剤からなる、ソ一プフリ一乳化重合法を用いることが好ましく、特に 2段階ソープフリ一重合法が好ましい。

S H化合物としては、炭素数 1〜 6、好ましくは炭素数 1〜 3の S H基を有する炭化水素があげられる。極性基としては、例えばヒドロキシ、カルボキシ等があげられる。極性基は、該 S H化合物に:!〜 3個存在することができる。極性基を有する S H化合物は、例えば 2—メルカプトエタノール、 2—メルカプト酢酸、 3—メルカプトプロピオン酸、 3—メルカプト一 1， 2—プロパンジオール、 3 一メルカプト— 1—プロパノール等があげられる。これら極 ' 基をもつ S H化合物は、担体のエポキシ基を開環する目的で、直接使用することができるが、水、緩衝液等の水性媒体中に溶解させて用いることもできる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等があげられる。

スぺーサーとは、担体と試料中の検出又は定量すべき特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特定遺伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D N A プローブを結合するものである。該スぺ一サ一としては、例えば一本鎖 DN A鎖及び一本鎖 R N A鎖等をあげることができる。一本鎖 D A鎖及び一本鎖 R N A 鎖をスぺ一サ一に用いる場合の該鎖の塩基配列はいかなるものでもよいが、塩基にアミノ基をもつ、アデニン（A) 、グァニン（G) 、シトシン（C) を末端に有するものが好ましい。これらの一本鎖 DN A鎖及び一本鎖 RN A鎖の長さとしては、 5〜4 Ome r力好ましく、 1 0〜 20 m e rがより好ましい。

試料中の検出又は定量すベき特定遺伝子配列を有する一本鎖 DNA断片の特定遺伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 DN Aプローブの DN A断片の長さとしては、 1 0〜50塩基、より好ましくは 1 0〜3 0塩基、特に好ましくは 15〜2 5塩基である。

検出又は定量すべき特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特^ t伝子配列としては、各種の形質に関与する遺、疾患に関与する遺伝子等に由来する DN A断片があげられる。例えば各種の形質に関与する遺伝子としては、 PS 1 (プリセリニン 1) 遺伝子、 PS 2 (プリセリニン 2) 遺伝子、 APP (ベータ一アミロイドブレカーサ一蛋白質）遺伝子、リポプロテイン遺伝子、 HLA (ヒト白血球抗原）遺伝子、 C型肝炎ウィルス遺伝子、 B型肝炎ウィルス遺伝子、 h MS H 2遺伝子等があげられる。また、疾患に関与する遺伝子としては K_ r a s遺伝子、 p 53遺伝子等があげられる。 K一 r a s遺伝子の変異については、ジャパニーズ ·ジャーナル ·ォブ ·キヤンサ一 ·リサーチ（jpn. j. Cancer Res . ), 84， 96 1 (1993)、同 85, 147 (1 99 4)、同 85, 1240 ( 1 994) 、同 85， 1005 (1994) 、同 86， 1 1 50 (19 95) 、同 86， 7 3 7 (1995)、同 87， 466 (1 99 6)、同 87， 1 056 ( 1 996) 、同 8 7， 79 3 ( 1 996 ) 等に記載されている。また、 p 53遺伝子の変異については、ジャパニーズ'ジャーナル'ォブ ·キャンサー · リサーチ (Jpn. J. Cancer Res. ) , 85， 1 087 (1 9 9 4) 、同 85， 12 4 7 (19 94) 、同 86， 1 143 (1995) 、同 86， 57 (1 995) 、同 86， 1 7 4 (1995)、同 86， 730 (199 5)、同 87, 930 (1 996 ) 等に記載されている。 hMSH 2遺伝子については、ジャパニーズ'ジャ一ナノレ ·ォブ ·キヤンサー · リサ一チ（Jpn. J. Cancer Res. ) , 8 7， 2 7 9 ( 1 996 ) 等に記載されている。

例えば、これら文献記載の塩基配列を含む特定遺伝子配列と相捕的な D Ν Α断片がプローブ DN A配列として好適に用いられる。

このように、第 1の一本鎖 D N Aプローブの配列はこれら公知の配列に基づ、て設計すればよい。本発明で特に好適に適応できる検出又は定量すべき遺伝子配列としては、既知配列の内点突然変異を起こしていること力知られている配列である。この場合、変異を起こしている塩基と相補的な塩基配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプロ一ブ中の位置としては、該 DNAプロ一プの両端の 3塩基以上内側が好ましく、該 DN Aプローブの中央から 2塩基以内が特に好ましい。

試料中の検出又は定量すべき特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特定遺伝子配列と相捕的な配列を有する第 1の一本鎖 DN Aプローブは、 DN Aのィ匕学合成反応をシリ力等の担体を用いた固相法により自動化した DN A合成機等を用いて合成できる。反応基質には、塩基のアミノ基及びリボースの 5， —OHを保護基で保護し、リボースの 3' —OHにジイソプロピルホスホアミダイトを結合させたヌクレオチド誘導体を用いる。塩基のアミ'ノ基の保護基としては、ベンゾィノレ基又はイソブチル基等が、リボースの 5' —OHの保護基としては、ジメトキシトリチル基等があげられる。塩基配列に従って、アミノ基及び 5' -OH 基を保護されたアデニン、チミジン（T) 、シトシン、グァニンのいずれかのヌクレオチドを 3， —OHを介して支離に固定したカラムを出発材料とし、酸によるトリチル基の除去（5' —OHの形成）後、 3' 末端にホスホアミダイト基を持つ上述のヌクレオチド誘導体をテトラゾールなど適当な縮合剤のもとに付加する。さらに両者の結合をヨウ素と水で安定なリン酸トリエステル結合に変換する。この脱トリチルイ匕と縮合反応のサイクルを繰り返し、最後にアンモニア処理により脱保護基及び支持体からの切断を行う。以上の操作で目的の第 1の一本鎖 DN Aプローブを合成できる。また、スぺーサ一が一本鎖 DN Aの場合は更にその配列を連続して合成すればよい。これにより、 DN Aのスぺーサーを持つ第 1 の一本鎖 D N Aプロ一ブが合成できる。

試料中の検出又は定量すベき特¾¾伝子配列を有する一本鎖 DNA断片の特定遺伝子配列と相捕的な配列を有する第 1の一本鎖 DN Aプローブと DN Aを吸着しにくい物質からなる担体とがスぺ一サ一を介し又は介さず結合している担体結合 DN Aプローブの調製法について説明する。スぺーサ一の種類及び担体の種類により、担体、スぺ一サ一及び第 1の一本鎖 DN Aプローブの各結合方法を決定できる。一般的には第 1の一本鎖 DNAプローブ又はスぺーサ一末端の塩基がもっァミノ基と担体のエポキシ基を結合させることにより行う。

スぺ一サ一がー本鎖 DN Aである場合、該 DN Aプローブと担体の結合は、例えば以下のように行う。前述の DN A合成法に従い、 DN Aのスぺ一サ一を持つ第 1の一本鎖 DN Aプローブ及び該プローブと相補的配列を有し、スぺーサ一配列は有しな、一本鎖 DNAを合成する。次、で両者をノ、イブリダイズさせ二本鎖にし、検出又は定量すべき遺伝子配列の塩基が有するアミノ基を保護し、遊離のスぺ—サ—部分の塩基が有するァミノ基と担体のエポキシ基を結合させる。担体に結合させた後、第 1の一本鎖 D Aプローブと相補的配列を有しスぺーサー配列を有しなゝ一本鎖 DNAを解離し、目的の担体結合 D N Aプロ一ブを調製することができる。

ハイブリダィズは、必要に応じてホルムアミド、塩、蛋白質、安定剤、緩衝剤等を含む水溶液で行う。以下この溶液をハイブリダィゼーシヨン溶液という。ホルムアミド濃度は 0〜6 0%、好ましくは 10〜50%、より好ましくは 20〜 30%である。塩としては塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム等の無機塩、クェン酸ナトリゥム、シユウ酸ナトリゥム等の有機酸塩があげられ、塩濃度としては 0〜 2. 0M、好ましくは 0. 15〜1. 0Mである。蛋白質としては血清アルブミン等があげられる。安定剤としてはフイコール等があげられる。緩衝剤としては、リン酸緩衝剤等があげられ、濃度としては 1〜10 OmM力好ましい。前述の相捕的な 2種の D N Aのハイプリダイゼ一シヨンは、ハイプリダイゼーション溶液中にそれぞれ合成した一本鎖 D N Aを等モル濃度となるように添加し、 60〜 9 0 °Cで 1〜 6 0分間加温した後、 0〜40でまで1〜24時間かけて徐々に冷却することにより行うことができる。こうして、一本鎖ポリヌクレオチドのスぺ一サーを持つ部分二本鎖 D N Aが調製される。

担体との結合は、エポキシ基を有する担体粒子を 1〜： 1 00 mMのリン酸緩衝液で洗浄し、粒子を平衡化した後、洗浄に用いた緩衝液と同じ溶液中で担体と上述の方法で作成した一本鎖 D N Aのスぺ一サーを持つ部分二本鎖 D N Aを混合し、 5〜50時間、 20〜50°Cに保温することにより行う。未反応の DNAを 1〜 3 Mの塩化ナトリウム等の塩類を含む水溶液で洗浄することにより取り除く。この担体結合二本鎖 D N Aをハイブリダイゼ一ション用溶液中で 7 0〜 90 °C の条件で洗浄することにより、担体結合一本鎖 DN Aを調製できる。洗浄はハイブリダィゼーシヨン溶液を用い、 70〜90°Cで、数千〜の遠心分離で数回行う。

次いで、極性基を有する S H化合物、好ましくは水性媒体で 1〜 3 M、より好ましくは 1. 5〜2. 5 Mとなるように溶解した極性基を有する SH化合物中に担体を加え、 10〜60°C、好ましくは室温で、 1 5〜50時間保温し、担体上に存在する未反応のエポキシ基を開環させる。

次に検出又は定量すべき特^!伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の調法について説明する。検出又は定量に用いる生体検査試料は各種臓器、組織、血液等から公知の D N A抽出方法により調製できる。単離した D N Aは特定の制限酵素で切断し検出又は定量すべき特定遺伝子配列を含む 1 0〜20 Ome r、好ましくは 20〜：！ O Ome rの長さを有する一本鎖 DNA断片に調製する。例えば、細胞から抽出した DNAを制限酵素 Dd e 1と H i η ί Iを用いて処理すると K _ r a sのコドン 1 2を含む 7 0塩基長の D N A断片が調製できる。本発明においては、検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有するように D N Aを断片化するだけでよい。

標識ィ匕合物を標識する対象 D N Aとしては、検出又は ¾fi ^法に応じて、試料中の D N A断片、試料中の検出又は ¾fiすべき特^ »伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特^!伝子配列以外の部分配列と相補的な配列を有する第 2の一本鎖 D N Aプロ一ブ中の一本鎖 D N A断片、試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特^ 1伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと D N Aを吸着しにくい物質からなる担体とがスぺ一サ一を介し又は介さず結合している担体結合 D N Aプローブ中の一本鎖 D N A断片のいずれかがあげられる。

試料中の検出又は定量すべき特^ t伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特定遺伝子配列以外の部分配列と相補的な配列を有する第 2の一本鎖 D N Aプローブに標識ィ匕合物を標識したものを以下の説明では単に標識結合 D N Aプローブという。また、試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特^ t伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと D N Aを吸着しにくい物質からなる担体とがスぺーサーを介し又は介さず結合している担体結合 D N Aプロ一ブの一本鎖 D N A断片に標識ィ匕合物を標識したものを以下の説明では単に担体結合標識 D N Aプローブという。

D N Aを標識する標識ィ匕合物としては、直接又は間接的に検出又は定量できるものであればいずれの標識ィ匕合物でも用いることができる。例えば熱に安定な抗原、ピオチンがあげられ、共有結合により結合される。また、標識結合 D N Aプローブ及び担体結合標識 D N Aプローブの標識化合物としては、放射性同位元素、発色試薬、蛍光試薬、発光試薬等熱に安定な標識化合物があげられ、特に、ピオチンが好ましい。

D N Aとピオチンの結合方法について述べる。 D N Aの 3，末端のピオチン化は、ピオチン結合デォキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて、例えば 3，末端標識法、バイオーブリッジ（B i o— B r i d g e)法、ニックトランスレーション法等により酵素的に結合させることができる。ビォチン結合デォキシリボヌクレオシド三リン酸としては、例えば B i o— 11— dUTP、 B i o— 16— dUTP、 B i o— 11一 dCTPがあげられ、ェンゾ（En z o)社等から市販品として入手できる。 DNAが合成DNAの場合は、シァノエチルホスホアミダイト法による自動合成機で、 5' 末端ピオチン標識 DNAを合成することもできる。ピオチン化 DN Aは、セフアデックス G— 50を用いたスピンカラムのゲルろ過等で精製できる。

標識化合物の検出又は定量試薬は、標識化合物を検出又は定量できるものであればいかなる試薬でも用いうる。標識ィ匕合物がピオチンである場合は、検出又は定量試薬としては、標識酵素結合ァビジン及び該標識酵素活性検出又は定量試薬からなる。標識酵素としては、例えばパーォキシダ一ゼ、アルカリホスファタ一ゼ等があげられる。

標識酵素がパーォキシダーゼの場合の酵素活性検出又は定量試薬としては、例えば過酸化水素と 3， 3' ージァミノべンジジン、 o—ジァニシジン、 4—メトキシ一 1—ナフトール、 2， 2，一アジノービス（3 _ェチルベンゾチアゾリン） — 6—スルホン酸（ABTS)、 10—N—メチルカルバモイル— 3， 7—ジメチルァミノ一 10H—フエノチアジン（MCDP)、 10— N—カルボキシメチルカルバモイルー 3， 7—ジメチルァミノ一 10H—フエノチアジン（CCAP)、 N— （カルボキシメチルァミノカルボニル）一4， 4，一ビス（ジメチルァミノ）ジフエ二ルァミンナトリウム（DA— 64)、 4， 4，一ビス（ジメチルアミノ）ジフエニルァミンもしくはビス [3—ビス（4—クロ口フエニル）メチルー 4—ジメチル一ァミノフエ二ル] ァミン（BCMA)等の発色試薬からなる試薬又は過酸化水素とホモバニリン酸、 P—ヒドロキシフエニル酢酸もしくはジァセチルフルォレスシン誘導体（ジァセチルフルォレスシン、ジァセチルジクロロフルォレスシン等）等の蛍光試薬からなる試薬又は過酸ィ匕水素とルミノール、イソルミノール、ピロガロールもしくはビス（2， 4， 6—トリクロ口フエニル）ォキザレ一ト等の発光試薬からなる試薬があげられる。例えば発色試薬として M C D Pを用いた場合は、 6 2 0 n mで比色して検出できる。

また、 4—メトキシ— 1一ナフトール等の 1一ナフトール誘導体の発色試薬、ユウ口ピウム等のランタニド蛍光試薬、ァクリジニゥム等の発光試薬からなる検出又は定量試薬があげられる。

標識酵素がアル力リホスファタ一ゼの場合の検出又は定量試薬としては、パラニトロフエ二ルリン酸塩等のリン酸エステル、ァダマンチルォキセタン誘導体の発光試薬からなる検出又は定量試薬があげられる。

特に、アルカリホスファターゼの検出又は定量試薬としては、 N A D P、 I N T一バイオレツト、 N A D H、エタノール、ダイァフオラ一ゼ及びアルコールデヒドロゲナ一ゼからなる検出又は定量試薬が好ましい。

これら酵素活性検出又は定量試薬には、必要に応じて、緩衝液、他の基質、他の酵素、界面活性剤、酵素の安定化剤等が添加されていてもよい。該酵素活性検出又は定量試薬は、必要に応じて二つ以上の試薬からなるキットとして調製されていてもよい。

一本鎖 D N Aを切断する酵素としては、例えば S 1ヌクレア一ゼ、マングビーンヌクレア一ゼ等のヌクレア一ゼ;^あげられる。

検出又は定量すべき特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特¾¾伝子配列と相捕的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと D N Aを吸着しにくい担体がスぺ一サ一を介し又は介さず結合している担体結合 D N Aプローブ及び試料中の検出又は定量すべき特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特^!伝子配列以外の部分配列と相補的な配列を有する第 2の一本鎖 D N Aプローブと標識化合物が結合している標識結合 D N Aプローブからなる試び検出又は定量すべき特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特¾¾ 配列と相捕的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと標識ィ匕合物が結合している標識結合 D N Aプローブと D N Aを吸着しにくい担体がスぺーサを介し又は介さず結合して、、る担体結合標識 D N Aプローブからなる試薬には必要に応じて、例えば前述のハイブリダィゼ一シヨン溶液等が添カ卩されていることが好ましい。

次に本発明の第一の方法について述べる。ハイブリダィズは、前述のハイプリダイゼーシヨン溶液を用いて厳格な条件下で行う。例えば、本発明の担体結合 D N Aプローブと D N A断片を含む試料を該ハイブリダイゼーション溶液に添加し、 7 0〜 9 0 °C、好ましくは 8 0〜 8 5 °Cで 1〜 2 0分間、好ましくは 5〜 1 5分間加熱した後、 0 . 5〜 2 4時間、好ましくは 1〜 6時間かけて徐々に 2 0〜 5 0 °C、好ましくは 2 0〜3 0 °Cまで冷却することにより行う。また、ハイブリダィズは本発明の担体結合 D N Aプローブと D N A断片を含む試料を該ハイブリダィゼーション溶液に添加し、室温で 0. 5〜 2 4時間、好ましくは 1〜 6時間かけて行うこともできる。その後、完全相補鎖二本鎖とミスマッチニ本鎖の融解温度の中間温度、通常 4 5〜 6 5 °C、好ましくは 5 0〜 6 0 °Cで、前述の洗浄液で洗浄することが好ましい。

次いで担体に粒子を用いる場合は遠心分離操作等により、担体にプレートを用いる場合は洗浄操作によりハイブリダィズしていない試料中の D N A断片を除去する。担体結合 D N Aプローブにハイブリダィズした D N A断片の検出又は定量は、ハイブリダィズした状態又は担体プローブから単離した後、 D N Aを検出又は定量する方法で行うことができる。

このハイブリダイズした D N A断片の検出又は定量は、標識化合物を用いて行うこと力 <好ましい。

まず、試料 D N A全てを標識して行う場合の検出又は定量方法を述べる。前述の方法に従って試料中の D N A断片を全て標識ィ匕する。次いで、本発明の担体結合 D N Aプローブと該標識 D N Aをハイプリダイズする。ハイブリダイゼ一ションの条件は前述の厳格なハイブリダィゼ一シヨン条件と同様である。ハイブリダィズした D N A断片の検出又は定量は、ハイブリダィズしていない D N A断片を除去した後、担体結合 D N Aプロ一ブにハイブリダイズした標識 D N A試料の標識を検出又は定量することにより行う。

また、本発明を標識 D N Aプロ一ブを用、る第二の方法に適用する場合について述べる。試料 D N Aヽ本発明の担体結合 D N Aプローブ及び標識結合 D N Aプ口―ブを上記ハイブリダイゼ一ション条件下でハイブリダイズする。ハイブリダィゼーシヨンの条件は前述の厳格なハイブリダィゼ—シヨン条件と同様である。次いで、担体に粒子を用いる場合は遠心分離操作等により、担体にプレートを用いる場合は洗浄操作により、本発明の担体結合 D N Aプロ一ブにハイブリダイズしていない試料 D N A断片及び標識結合 D N Aプローブを除去する。ハイブリダィズした D N A断片の検出又は定量は、担体結合 D N Aプロ一ブにハイブリダイズした試料 D N A断片に更にハイブリダイズした標識結合 D N Aプロ一ブの標識を検出又は定量することにより行う。

さらに、本発明を担体結合 D N A標識プローブを用いる第三の方法に適用する場合について述べる。試料 D N A断片と本発明の担体結合標識 D N Aプローブをハイブリダィズさせる。ハイブリダィゼーシヨンの条件は特に限定されず、完全に相補的な D N A断片がハイブリダイズすれば、 1塩基ミスマッチをもつ D N A 断片がハイブリダィズする条件でもよい。次いで、 S 1ヌクレアーゼ等一本鎖 D N Aを切断する酵素を作用させ二本鎖 D N Aを形成していな Lゝ本発明の標識結合 D N Aプロ一ブを切断する。完全に相捕的でない D N A断片がプローブ D N Aにハイブリダイズし、部分的に 1本鎖となったプローブ D N Aは本酵素反応により切断される。完全にハイプリダイズした D N Aの断片の検出又は定量は、担体結合標識 D N Aプロ一ブの標識を検出又は定量することにより行う。この担体結合 D N A標識プローブを用いる場合は、 D N Aプローブと担体を結合するスぺーサ一は使用しないか又は D N A鎖以外のものを用いること力好ましい。本方法では、ミスマッチを伴って結合している試料 D N A断片が生じているとしてもこれを排除でき、プローブ DN Aに完全に相捕的な配列を有する試料 DN Aのみを検出できる点で特に好ましい。

本発明のゝずれの方法でも、あらかじめ既知量の試料 D N Aを用いて検量線を作成することにより、試料中の検出又は定量すべき D A濃度を検出又は定量することができる。

次に、標識ィ匕合物の検出又は定 fi ^法について述べる。標識化合物としてピオチンを用いた場合、ピオチンは例えば標識酵素結合ァビジンをピオチンに結合させた後、ピオチンに結合した標識酵素結合ァビジンの酵素活性を検出又は定量することにより検出又は定量できる。

ピオチンと標識酵素結合アビジンの結合は、例えば界面活性剤、塩類、緩衝液等を含む溶液中で、室温で 0. 5〜 2時間放置することにより行い、ピオチンに結合していない標識酵素結合ァビジンは遠心分離又は洗浄により除去する。ァビジンに結合している酵素の活性は、前述の酵素活性検出又は定量試薬を用いて常法により行うことができる。

ピオチン結合標識酵素がアル力リホスファタ一ゼの場合は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びダイァフオラ一ゼを用いた增感系 [ (Ann. Biol, clin )， 4 7 , 52 7 ( 1989 ) ] を用いる方法が好ましい。検出又は定量は、アルカリホスファターゼにより生成した NADとエタノールにアルコ一ノレデヒドロゲナーゼを作用し NAD Hを生成させ、生成した NADHと I NT—バイオレツト等のダイァフオラ一ゼの基質にダイァフオラ一ゼを作用し生成する色素例えば、フォルマザンを 492 nmで比色することにより行うことができる。

次に、本発明の効果の一例を試験例で説明する。

試験例 1

200 m 1の撹拌装置を持つ四つ口フラスコ中に、スチレン 1. 2 g、グリシジルメタクリレート 1. 0 g、ジビニルベンゼン 0. 04 gを秤取り、水 1 1 0 m 1に分散させ 7 0°Cの恒温層にセットし、窒素ガス置換した。回転数 200 r pmでこの溶液を撹拌しながら、重合開始剤である 2， 2' ーァゾビス（2—ァミノブロノ、。ン）ジヒドロクロライドを 0. 0 6 g添加し重合を開始した。 2時間後、グリシジルメタクリレート 0. 3 gを添加しさらに 2 2時間反応させた。この反応液を遠心分離（3 0， 0 0 0 g、 1 0分間）し沈澱を蒸留水で 3回洗浄し精製し、担体粒子を得た。本法により作成された粒子を以下 S G粒子と略記する。作成した粒子は単分散で粒径は約 0. 2 μ mであつた。

次いで S G粒子表面に残つているェポキシ基を開環するため該粒子を 2 Mメルカプトェタノールを含む 0. 1 Mリン酸緩衝液（ p H 8. 0 ) 中で室温にて、 2 4時間反応させた。反応終了後、蒸留水で 3回遠心分離洗浄した後さらに、 2 晚透析処理し未反応のメルカプトェタノールを完全に除去しメルカプトエタノールで処理した担体粒子を製造した。

比較として、 2 Mメルカプトエタノールを 1 OmMトリス緩衝液「トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン、（p H 8. 0) 」にかえる以外は上述と同様にして、トリス処理担体粒子を製造した。

上述で製造した各担体とアビジン標識ペルォキシダ一ゼ（ベ一リンガ一ハイム社製）を、 2 5%ホルムアミド、 0. 7 5 M塩ィ匕ナトリウム、 0. 0 7 5 Mクェン酸ナトリウム、 1 %牛血清アルブミン、 1 %ポリビニルピロリドン、 1 %フィコ一ルからなるハイブリダィゼーション溶液に添加し、 2 5 °Cで 3 0分間保温した。その後 5 5°Cで 1時間処理し、該温度条件で遠心分離により該担体を該ハイブリダイゼーション溶液で洗浄した。

担体を回収し 1 Z 5 0の界面活'醜（非ィォン性界面活性剤を含む中性洗浄液、協和メデックス社製） 1M塩ィ匕ナトリウム、 1 OmMリン酸緩衝液（pH 8. 0) からなる溶液 1 0 μ 1に分散させ、 1 0 0〃M MCDP (協和メデックス製）及び 1 M過酸化水素を添加し、 3 7°Cで 3 0分間反応し、反応前後の吸光度の変化を 6 2 O nmで測定した。なお、アビジン標識ペルォキシダ一ゼ濃度は、ベ

―リンガ一ハイム社製の市販品濃度を 1倍として表した。結果を第 1表に示す。

第 1 表

TR I S ：トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン

ME ： 2—メルカプトエタノール

第 1表に示すように、メルカプトエタノールで担体を処理することにより、担体への標識酵素の非特異的吸着が抑制される。

試験例 2

試験例 1で使用した担体（メルカプトエタノ一ル処理担体またはトリス処理担体）と参考例 2で作成した標識 DNAを、それぞれ 2 5%ホルムアミド、 0. 7 5 M塩ィ匕ナトリウム、 0. 0 7 5 Mクェン酸ナトリウム、 1 %牛血清アルブミン、 1 %ポリビニルピロリドン、 1 %フィコールからなるハイプリダイゼーション溶液に添加し、 2 5°Cで 3 0分間反応させた。その後 5 5°Cで 1時間処理し、該温度条件で遠心分離により該担体を該ハイプリダイゼ一ション溶液で洗浄した。次いで、標識 DNA及び 1 0 0 U/m 1のアビジン結合パ一ォキシダ一ゼを 5 0 μ 1添カロし室温で 6 0分間静置した。その後、同組成の溶液で遠心分離し 3回洗净しこ

担体を回収し 1,5 0の界面活性剤（非イオン性界面活性剤を含む中性洗浄液、協和メデックス社製） 1M塩ィ匕ナトリウム、 1 OmMリン酸緩衝液（ρΗ 8. 0) からなる溶液 1 0 0 β \に分散させ、 1 0 0 /Μ MCDP (協和メデックス製）及び 1〃Μ過酸ィ匕水素を添加し、 3 7°Cで 3 0分間反応し、反応前後の吸光度の変化を 6 2 0 nmで測定した。

結果を第 2表に示す。第 2 表

TR I S ：トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン

ME ： 2—メルカプトエタノール

第 2表に示すように、メルカプトエタノールで担体を処理することにより、担体への標識 D N Aプロ一ブの非特異的吸着が抑制される。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。

発明を実施するための最良の形態

実施例 1 (担体結合 DN Aプローブの合成）

(1) 一本鎖 DN Aの合成

下記の K— r a s突然変異配列を有する D N A鎖、

5' — GTTGGAGCTCGTGGCGTAGG— 3' ( 2 0 m e r ；配列番号 1、変異点は 10番目の C)

及び配列番号 1の相捕的配列に連続した Gを 1 0塩基持つ D N A、

5' -GGGGGGGGGGCCTACGCCACGAGCTCCAAC- 3'

(3 Ome r ；配列番号 2 )

を DN A合成機で合成した。

( 2 ) 担体の合成

200 m 1の撹拌装置を持つ四つ口フラスコ中に、スチレン 1. 2 g、グリシジルメタクリレート 1. 0 g、ジビニルベンゼン 0. 04 gを秤取り、水 1 1 0 m 1に分散させ 7 0°Cの恒温層にセットし、窒素ガス置換した。回転数 200 r pmでこの溶液を撹拌しながら、重合開始剤である 2， —ァゾビス（2—ァミノプロパン）ジヒドロクロライドを 0. 06 g添加し重合を開始した。 2時間後、グリシジルメタクリレート 0. 3 gを添加しさらに 22時間反応させた。この反応液を遠心分離（30， 000 g、 1 0分間）し沈澱を蒸留水で 3回洗浄し精製し、担体粒子を得た。本法により作成された粒子を以下 SG粒子と略記する。作成した粒子は単分散で粒径は約 0. 2 μ mであった。

(3) DN Aの担体への固定

上記（2) で作成した SG粒子を、 1 OmMリン酸緩衝液（pH8. 0 ) で遠心分離により洗浄し粒子を平衡化した。上記 (1) で作成した 2本鎖 DNAを 8 // gと 30 m gの平衡化した S G粒子を 400 1のリン酸緩衝液中で 3 7 °C、 24時間反応させ固定ィ匕した。 2. 5 M塩ィ匕ナトリウム水溶液で遠心分離により 3回洗浄し、非結合 DN Aを除いた。

(4) 担体結合 DN Aプローブの作成

上記 (3) で得られた SG粒子 2 m gに固定化された 2本鎖 DN Aを、 2 5% ホルムアミド、 0. 75 M塩ィ匕ナトリウム、 0. 075 Mクェン酸ナトリウム、 1%牛血清アルブミン、 1 %ポリビニルピロリドン、 1%フイコールからなるハイブリダイゼーション溶液 400 m l中に添加し、 80 °Cで 5分間処理しこの温度条件下で 5回洗浄することで、配列番号 2の塩基配列の 5，末端と S。担体が結合したプローブを得た。

(5) 未反応エポキシ基の開環処理

次いで S G粒子表面に残つているエポキシ基を開環するため該 D N A結合粒子を 2 Mメルカプトエタノールを含む 0. 1Mリン酸緩衝液（pH 8. 0) 中で室温下 24時間反応させた。反応終了後、蒸留水で 3回遠心分離洗浄した後さらに、 2晚透析処理し未反応のメルカプトェタノールを完全に除去し、メルカブトエタノ一ルで処理した担体結合 D N Aプロ一ブを製造した。

比較例 1

実施例 1の（1)〜（4) に示す工程で配列番号 2の塩基配列の 5' 末端と S G担体が結合したプローブを得た。次いで SG粒子表面に残っているエポキシ基を開環するため該 DN A結合粒子を 1 OmMトリス緩衝液 (pH 8. 0) 中で室温下 24時間反応させた。反応終了後、蒸留水で 3回遠心分離洗浄し、トリスァミノメタンで処理した担体結合 D N Aプロ一ブを製造した。

実施例 2

下記の組成の、 K— r a s突然変異検出キットを作成した。

第 1試薬：

実施例 1と同様に作成した作成した SG粒子結合 DN Aプローブ（配列番号 2 の DN Aを有する） 2 Omg/m 1と参考例 1で作成したピオチン標識 DN Aプローブ（配列番号 3の DN Aを有する） 6 / /1111を含む1 OmMリン酸緩衝液（pH8. 0) 。

第 2試薬：

100 U/m 1のァビジン結合パ一ォキシダ一ゼを含む 10 mMリン酸緩衝液 (pH8. 0)。

第 3試薬：

MCDP試薬（協和メデックス社製）。

比較例 2

下記の組成の、 K一 r a s突然変異検出キットを作成した。

第 1試薬：

比較例 1で作成した S G粒子結合 DN Aプローブ（配列番号 2の DN Aを有する） 2 Omg/m 1と参考例 1で作成したピオチン標識 DN Aプローブ（配列番号 3の DN Aを有する） 6 g/mlを含む 10 mMリン酸緩衝液（p H 8. 0)_c 第 2試薬：

100 U/m 1のアビジン結合パ一ォキシダ一ゼを含む 10 mMリン酸緩衝液 (pH8. 0)。

第 3試薬：

MCDP試薬（協和メデックス社製）。

実施例 3 2m lマイクロチューブに、実施例 2又は比較例 2で調製した第 1試薬 120 μ 1と参考例 2で調製した試料 120 ^ 1をそれぞれ添加し、 55 °Cで 1時間処理した。 2. 5 M塩ィ匕ナトリウム溶液 400〃 1で 2回遠心分離により洗浄した _c 洗浄後、実施例 2又は比較例 2で作成した第 2試薬 20 μ 1をそれぞれ遠心管に添加し室温で 1時間静置した。 400〃 1の、蒸留水で 1/50倍希釈した界面活性剤（非イオン性界面活性剤を含む中性洗浄液、協和メデックス社製）、 1M 塩化ナトリウム、 1 OmMリン酸緩衝液 (pH7. 0) からなる溶液で 3回洗浄した後、担体を含む画分に実施例 2または比較例 2で調製した第 3試薬 500 μ 1を添加し、 3 7°Cで 3 0分間反応し、 620 nmの吸舰を測定した。

結果を第 3表に示す。

第 3 表

TR I S ：トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン

ME ： 2—メルカプトエタノール

第 3表に示す通り、 1塩基ミスマツチ配列（配列番号 5の試料）を検出することなく、完全に相補的な配列（配列番号 4の試料）のみを検出することができるので、遺伝子診断において変異配列を含む試料を！ ^できる。これは、メルカプトエタノールで処理した担体は、トリスで処理した担体に比配列番号 3または配列番号 5の D N A試料との非特異的反応が抑制されているためである。

参考例 1 (標識 D N Aプロ一ブ法の試薬）

(1) ピオチン標識 DN Aプローブの作成

下記の検出又は定量する領域以外の K一 r a s配列に相補的な 16塩基配列に連続した Gを 4塩基を持つ DNA、

5' — C ACAAGTTTATACTC AGGGG— 3' ( 20 m e r ；配列番号 3)

を DN A合成機で合成した。

次いで、該合成 DNA 15 / gとピオチン化 dUTP [ェンゾ（E n z o)社製] ) 15 gを同社の 3' 末端標識キットを用いて該標準反応緩衝液中でターミナルトランスフェラ一ゼ存在下で反応させ、 3，一末端にピオチンを結合させた。未反応のピオチン化 dUTPをセフアデックス G— 50を用いスピンカラム法で除去し目的のビォチン結合 D N Aプロ一ブを得た。 .

参考例 2 (標識結合 D N Aプロ—ブ法）

下記の K— r a s突然変異配列を持つ DNA、

G— 3 ' (7 Ome r ；配列番号 4、変異点は 29番目の C)、

K- r a s配列をもつ DNA、

G - 3， (7 Ome r ：配列番号 5 )、

を DN A合成機で合成した。次いで上記配列番号の合成 DN A各 2 g含む 12 0 β 1のハイプリダイゼーション溶液（実施例 1と同一の組成）を調製し検出すべき DN Α配列の試料とした。

実施例 4 (担体結合標識 D N Aプロ一ブの合成）

実施例 1と同様な方法で配列番号 2の塩基配列の 5 ' 末端と S G担体が結合した担体結合 DN Aプローブを作成した。次いで、該担体結合 DNAプローブ（D NAとして 15 g) とピオチン化 dUTP [ェンゾ（E n z o)社製] ) 15 gを同社の 3' 末端標識キットを用いて該標準反応緩衝液中でターミナルトランスフェラーゼ存在下で反応させ、 3' —末端にピオチンを結合させた。未反応のピオチン化 d U T Pを遠心分離により洗浄し、担体結合標識 D N Aプローブを製造した。

産業上の利用可能性

本発明により、非特異的反応が抑えられるので検出又は定量すべき遺伝子配列のみを正確でしかも簡便に検出又は定量することができる。またこれにより突然変異遺伝子の簡便な手法による高感度定量が可能となる。

Claims

請求の範囲

1. 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特伝子配列と相捕的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと担体とがスぺ一サーを介し又は介さず結合している担体結合 D N Aプローブと試料中の D N A断片とをハイブリダィズし、該担体結合 D N Aプローブとハイブリダィズした試料中の D N A断片を検出又は定量することからなる特^ t伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定量方法において、担体が表面にエポキシ基を有する高分子であり、該担体と第 1の一本鎖 D N Aプローブを結合させた後、該担体のエポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合 D N Aプロ一ブを用いることを特徴とする特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定量方法。

2. 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特伝子配列と相捕的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと担体とがスぺーサ一を介し又は介さず結合している担体結合 D N Aプローブ及び試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特定遺伝子配列以外の部分配列と相補的な配列を有する第 2の一本鎖 D N Aプロ一ブを共に試料中の D N A断片にハイプリダイズし、該担体結合 D N A及び該第 2の一本鎖 D N Aプロ一ブにハイブリダイズした試料中の D N A断片を検出又は定量することからなる特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定 * ^法において、担体が表面にエポキシ基を有する高分子であり、該担体と第 1の一本鎖 D N Aプローブを結合させた後、該担体のエポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合 D N Aプローブを用いることを特徴とする特^ t伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定量方法。

3. 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと担体とがスぺーサ一を介し又は介さず結合している担体結合 D N Aプローブと試料中の D N A断片とをハイブリダィズし、次いで一本鎖 D N A断片を切断する酵素を作用させた後、該担体結合 D N Aプローブとハイブリダィズしている試料中の D N A断片を検出又は定量することからなる特^ 1伝子配列を有する一本鎖 D N A 断片の検出又は定 *¾·法において、担体が表面にエポキシ基を有する高分子であり、該担体と第 1の一本鎖 D N Aプローブを結合させた後、該担体のエポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合 D N Aプロ一ブを用 L、ることを特徴とする特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定 *^ 法。

4. エポキシ基を有する担体が、スチレン—グリシジルメタクリレートのコアシェル構造を持つ粒子である請求項 1力、ら 3 t、ずれかに記載の特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定量方法。

5. 試料中の検出又は定量すベき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブとェポキシ基を有する担体をスぺーサを介し又は介さず結合させた後、該担体のェポキシ基を極性基を有する S H化合物で処理して得られる担体結合 D N Aプローブ。

6. 試料中の検出又は定量すべき特定遺伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特^！:伝子配列と相補的な配列を有する第 1の一本鎖 D N Aプローブと標識ィ匕合物が結合している標識結合 D N Aプローブとエポキシ基を有する担体をスぺ —サを介し又は介さず結合させた後、該担体のエポキシ基を極を有する S H 化合物で処理して得られる担体結合標識 D N Aプローブ。

7. ェポキシ基を有する担体が、スチレン一グリシジルメタクリレートのコアシェル構造を持つ粒子である請求項 5又は 6記載の担体結合 D N Aプローブ c

8. 請求項 5記載の担体結合 D N Aプロ一ブ及び試料中の検出又は定量すべき特¾¾伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の特¾¾伝子配列以外の部分配列と相補的な配列を有する第 2の一本鎖 D N Aプロ一ブと標識化合物が結合している標識結合 D N Aプローブからなる試び標識化合物の検出又は定量試薬からなる特^ t伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定量用試薬キット。

9. 請求項 6記載の担体結合 D N Aプローブを含有する試薬、一本鎖 D N

Aを切断する酵素を含有する試び標識化合物の検出又は定量試薬からなる特伝子配列を有する一本鎖 D N A断片の検出又は定量用試薬キット ₀