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WO1999054731A1 - Procede d'amplification de la formation de complexes ligands-recepteurs et ses utilisations - Google Patents

Procede d'amplification de la formation de complexes ligands-recepteurs et ses utilisations Download PDF

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WO1999054731A1
WO1999054731A1 PCT/FR1999/000915 FR9900915W WO9954731A1 WO 1999054731 A1 WO1999054731 A1 WO 1999054731A1 FR 9900915 W FR9900915 W FR 9900915W WO 9954731 A1 WO9954731 A1 WO 9954731A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ligand
receptor
electromagnetic signal
sample
biological activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1999/000915
Other languages
English (en)
Inventor
Jacques Benveniste
Didier Guillonnet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Digibio SA
Original Assignee
Digibio SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Digibio SA filed Critical Digibio SA
Priority to EP99914611A priority Critical patent/EP1073900A1/fr
Priority to AU33362/99A priority patent/AU3336299A/en
Publication of WO1999054731A1 publication Critical patent/WO1999054731A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass
    • G01N37/005—Measurement methods not based on established scientific theories
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying the formation of complexes between the two elements of a ligand / receptor pair, to a method and to an apparatus for detecting the presence, in a sample (hereinafter "sample”).
  • analytical " of a substance corresponding to one of the two elements of a ligand / receptor pair, implementing this amplification method, to the applications of this detection method, as well as to a detection method of the presence, in an electromagnetic signal, of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of a substance corresponding to one of the two elements of a ligand / receptor pair, also implementing said amplification method.
  • affinity properties of antibodies towards antigens are the basis of a large number of immunological detection methods which have in common the use of the formation of antigen-antibody complexes - the substance sought could be either the antigen or the antibody - and detect, or even quantify, the complexes thus formed.
  • immunological detection methods which are very frequently used include immunoprecipitation, agglutination reactions, equilibrium dialysis, fluorescence quenching, fluorescence polarization, immunoelectrophoresis. , counter-immunoelectrophoresis or electrosyneresis, radioimmunoassays (RIA), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) or immunofluorescence.
  • all of the immunological detection methods proposed to date include a step which consists in incubating a determined volume - which is generally at least 500 ⁇ l - of the sample to be analyzed with a specific reagent, for each substance sought.
  • a step which consists in incubating a determined volume - which is generally at least 500 ⁇ l - of the sample to be analyzed with a specific reagent, for each substance sought.
  • the problem therefore arises of providing a method which makes it possible to detect the presence of a substance in a sample with both very high sensitivity and high specificity, while offering the possibility of performing as many analyzes that are necessary from micro-samples, to overcome, moreover, the constraints of conservation, shipping and transport of samples presented by the methods currently used for the detection of a substance, and which can, in addition , be implemented easily and quickly without requiring heavy and expensive equipment.
  • the present invention therefore has for its object a method for amplifying the formation of complexes between the two elements of a ligand / receptor pair by reaction of these two elements, which method is characterized in that it comprises:
  • the term “ligand / receptor couple” means any couple formed by two substances capable of recognizing each other specifically, of binding and reacting together by forming complexes.
  • it may be an antigen / antibody or hapten / antibody pair in which the ligand (the antigen or the hapten) may be a biological compound (protein, enzyme, hormone, toxin, tumor marker, etc.). .), a chemical compound (active drug ingredient for example), or a cellular or particulate antigen (cell, bacteria, virus, fungus, ...)
  • the receptor can be a soluble antibody or a membrane receptor. It can also be a couple formed by an enzyme and its specific substrate.
  • the term “electromagnetic signal characteristic of the biological activity” of an element means the electromagnetic signal picked up from a biologically active element such as a substance, a cell or a microorganism, etc. , or a material containing this element such as a purified preparation, a biological sample, an organ or a living being, as has been described in International Application WO 94/17406 in the name of J. BENVENISTE.
  • the term “electromagnetic signal characteristic of the biological activity” of an element also means the signals derived from a signal as defined above by digitization and / or signal processing.
  • the term “characteristic" is used in the sense that the electromagnetic signal picked up contains information characterizing the fact that the material from which this signal is picked up exhibits the biological activity in question.
  • a material containing a plurality of biologically active elements presents the biological activity of each of the elements which it contains.
  • the reaction between the ligand and the receptor is carried out using two reagents containing the ligand and the receptor respectively, and one is applied to one and / or the other of these reagents, an electromagnetic signal to be tested and suspected of comprising the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of this ligand and / or of this receptor.
  • the term “reagent” denotes any preparation whose composition is known, which contains the ligand or receptor in an amount also known and which is present either in a dry form such that a lyophilisate to be reconstituted in a solvent, either in a liquid form such as a solution or a suspension, the ligand or the receptor being able to be fixed on a solid phase (particles or beads of latex, glass or polystyrene, ...
  • the application, to one and / or the other of the reagents, of the electromagnetic signal to be tested is carried out by exposure of a solution or of a suspension containing one and / or the other of these reagents, to this electromagnetic signal.
  • the application, to one or the other of the reagents, of the electromagnetic signal to be tested is carried out by dilution of a solution or of a suspension comprising one and / or the other of these reagents , in a solvent having been previously exposed to this electromagnetic signal.
  • the application, to one and / or the other of the reagents, of the electromagnetic signal to be tested is carried out by dissolution or suspension of this or these reagents in a solvent having been previously exposed to this electromagnetic signal.
  • This arrangement is of particular interest when the reagents which it is desired to use are in a dehydrated form such as a lyophilisate, since it is then possible to apply the electromagnetic signal to be tested to them simply by dissolving them or by suspending as appropriate, in a volume of a solvent having been previously exposed to this electromagnetic signal.
  • the electromagnetic signal to be tested is an electromagnetic signal picked up from a sample to be analyzed and suspected of containing this ligand and / or this receptor, this sample being able as well to come from a biological sample (blood, urine, milk, ...) than a non-biological sample (water, food product, pharmaceutical product, cosmetic product, ).
  • the electromagnetic signal to be tested can also be an electromagnetic signal radiated by a source of electromagnetic radiation, in particular a source suspected of emitting harmful radiation for living beings of the high-voltage line, transformer, electric motor, microwave oven type. waves, particle accelerator, X-ray source, ... Similarly, the 7
  • electromagnetic signal to be tested can come from the acquisition of a mechanical signal like vibrations, an electrostatic signal or other.
  • the reaction between the ligand and the receptor is carried out by bringing into contact a sample to be analyzed and suspected of containing the ligand and / or the receptor, with a reagent containing either the receptor or the ligand (depending on the substance suspected to be present in the analytical sample with which it is desired to react this reagent), and the characteristic electromagnetic signal is applied to this sample and / or to this reagent of the biological activity of said ligand and / or of said receptor.
  • the application, to the sample to be analyzed, of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of the ligand and / or of the receptor is carried out by exposure of this sample to this or these electromagnetic signals, or by diluting this sample in a solvent having been previously exposed to the said electromagnetic signal (s).
  • the application, to the reagent intended to react with the sample to be analyzed, of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of the ligand and / or of the receptor is carried out by exposure of a solution or suspension containing this reagent to this or these electromagnetic signals, or by dilution of such a solution or suspension in a solvent having been previously exposed to this or these electromagnetic signals, or also by dissolution or suspension of this reagent in a solvent having been previously exposed to said electromagnetic signal (s).
  • the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of the ligand and / or the receptor is applied to the sample to be analyzed and to the reagent intended to react with it, by exposure of a solution or a suspension containing this sample and this reagent to this or these electro- 8
  • this second embodiment there is applied to the sample to be analyzed and / or to the reagent intended to react with it, both the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of the ligand and the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of the receptor.
  • both the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of the ligand and the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of the receptor are applied simultaneously to these elements.
  • the solvent having been exposed beforehand to the electromagnetic signal (s) is advantageously water or physiological solute.
  • the reagents capable of being used in the amplification process in accordance with the invention and containing the ligand on the one hand, and the receptor on the other hand may also be ready-to-use reagents commercially available. as reagents specially designed and prepared for the implementation of this process.
  • these reagents can be in different forms (dry, liquid, etc.), they can also be coupled to a marker such as a radioactive isotope, an enzyme, a fluorescent substance, a colored particle, biotin or an organometallic compound capable of detecting and / or measuring the ligand-receptor complexes resulting from the reaction between the ligand and the receptor.
  • the amplification method advantageously further comprises a step of acquiring the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of one and / or the other of the elements of the ligand / receptor pair.
  • ligand / receptor can come either from a sample to be analyzed and suspected of containing this or these elements, or from a source of electromagnetic radiation or from the acquisition of a mechanical (vibration), electrostatic or other signal, or even from reagents containing the ligand or the receptor in solution or in suspension in a solvent, according to the embodiments of the amplification process in accordance with the invention.
  • the amplification method in accordance with the invention also comprises a step of recording and restoring information representative of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of one and / or the other elements of the ligand / receptor couple.
  • the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of an analytical sample once recorded, can be kept indefinitely and used as many times as necessary.
  • the electromagnetic signals characteristic of the biological activity of the ligand and of the biological activity of the receptor, picked up from reagents can be recorded once and for all and be used to carry out a plurality of reactions involving this ligand. and this receiver.
  • the amplification method advantageously further comprises a step of detecting the complexes resulting from the reaction between the ligand and the receptor and, optionally, of measuring these complexes.
  • This step can, advantageously, be completed by the comparison of the results obtained with those observed for a reaction serving as a "control", that is to say a reaction carried out with the same ligand / receptor pair and under the same reaction conditions, but without application of an electromagnetic signal to the elements of this couple, whether it is before, simultaneously or after they are brought into contact.
  • the detection and / or measurement of ligand-receptor complexes can be carried out by all the methods conventionally used to reveal and quantify the formation of such complexes.
  • the ligand is an antigen or a hapten
  • the receptor is an antibody or a membrane receptor directed specifically against this ligand.
  • the reaction between this ligand and this receptor is a reaction revealed by agglutination, because of its simplicity and of its speed of execution.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence of a substance corresponding to one of the two elements of a ligand / receptor pair in an analytical sample, characterized in that it comprises the implementation work of an amplification process as defined above.
  • this detection method comprises:
  • obtaining an amplification of the formation of ligand-receptor complexes between the two reagents compared to a "control" reaction reflects the presence, in the electromagnetic signal, of the biological activity of the 'sample to be analyzed, of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of the sought substance and, consequently, translates the presence, in this sample, of the sought substance.
  • the concentrations of the ligand and of the receptor reacted are advantageously chosen so as to be sufficient to lead to the production of ligand-receptor complexes detectable in the absence of the application of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of said sample, but lower than the concentrations likely to lead to saturation of the reaction between this ligand and this receptor.
  • this detection method it comprises:
  • obtaining ligand-receptor complexes reflects the presence of the substance sought in the analytical sample.
  • This second preferred embodiment is of particular interest for detecting the presence of substances in samples, which are known to be not detectable or only very difficult by the other available detection methods, because these substances are generally present at very low concentrations, even in trace amounts.
  • the method for detecting the presence of a substance in an analytical sample in accordance with the invention has many advantages.
  • This method can be used to detect any substance capable of specifically binding to and reacting with another substance, it being understood that the term "substance” as it is used here, denotes a biological compound as well, a chemical compound, a cell than a microorganism of the bacteria, virus or fungus type, knowing in particular that for any hapten, protein or protein complex, it is possible to find on the market or to have the corresponding antibodies produced.
  • this process finds, in particular, application in biological diagnosis, whether in human or veterinary medicine, or for bacteriological quality control in industries such as the pharmaceutical industry, the cosmetic industry, the productions and food industries.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence, in an electromagnetic signal to be tested, of a signal 14
  • the electromagnetic characteristic of the biological activity of a substance corresponding to one of the two elements of a ligand / receptor pair which method is characterized in that it comprises the implementation of an amplification method such as defined above.
  • the electromagnetic signal to be tested is the electromagnetic signal radiated by a source of electromagnetic radiation.
  • the invention also relates to an apparatus for detecting the presence of a substance corresponding to one of the two elements of a ligand / receptor pair in an analytical sample, which apparatus is characterized in that it puts implementing a method according to the invention and in that it comprises: a) means for receiving the analytical sample and a reagent containing either the receptor or the ligand, enabling them to be brought into contact under proper conditions to allow their reaction; b) an electromagnetic signal source characteristic of the activity of the ligand and / or of the receptor; c) means for applying the signal delivered by said source of electromagnetic signal to the sample and / or the reagent; and d) means for detecting and / or measuring the ligand-receptor complexes formed during the reaction between the sample and the reagent.
  • the invention further relates to an apparatus for detecting the presence of a substance corresponding to one of the two elements of a ligand / receptor pair in an analytical sample, which apparatus is characterized in that it implements a method according to the invention and in that it comprises: a) means for receiving two reagents containing the ligand and the receptor respectively, allowing them to be brought into contact under conditions suitable for allowing their reaction; b) means for acquiring an electromagnetic signal from the analytical sample; 15
  • the detection means comprise optical detection means.
  • these devices include an enclosure provided with electrical and magnetic shielding surrounding said receiving means.
  • the invention also comprises other provisions which will emerge from the additional description which follows, which relates to exemplary embodiments of signal acquisition, recording and application devices capable of be used according to the invention as well as to examples of experiments which have made it possible to validate the amplification process which is the subject of the present invention, and which refers to the appended drawings in which: - Figure 1 represents a diagram of a first embodiment of a signal acquisition device capable of being used according to the present invention;
  • FIG. 2 shows a diagram of a second embodiment of a signal acquisition device capable of being used according to the present invention
  • FIG. 3 shows a diagram of a first embodiment of a signal recording device capable of being used according to the present invention
  • FIG. 4 shows a diagram of a second embodiment of a signal recording device capable of being used according to the present invention
  • FIG. 5 shows a diagram of an exemplary embodiment of a signal application device capable of being used in accordance with the invention
  • FIG. 6 shows a black and white image of 320 pixels x 240 pixels of the agglutinates formed during an agglutination reaction between the antigen 16
  • FIG. 7 shows a black and white image of 320 pixels x 240 pixels of agglutinates formed during an agglutination reaction between the polysaccharide antigen of Escherichia coli Kl and an antibody directed against this antigen, after application of the signal electromagnetic characteristic of the biological activity of Escherichia coli;
  • - Figure 8 shows a black and white image of 320 pixels x 240 pixels of the agglutinates formed during an agglutination reaction between the polysaccharide antigen of Escherichia coli Kl and an antibody directed against this antigen, after simultaneous application of the electromagnetic signals characteristic of the biological activity of Streptococcus and the biological activity of an antibody directed against Escherichia coli;
  • - Figure 9 shows a black and white image of 320 pixels x 240 pixels of agglutinates also formed during an agglutination reaction between the polysaccharide antigen of Escherichia coli Kl and an antibody directed against this antigen, after simultaneous application electromagnetic signals characteristic of the biological activity of Escherichia coli and the biological activity of its specific antibody;
  • FIG. 10 shows a diagram of an exemplary embodiment of a device for detecting and / or measuring ligand-receptor complexes capable of being used according to the present invention.
  • each image of Figures 6 to 9 corresponds to an area of approximately 2 mm x 1.5 mm of the support on which the agglutination reactions were carried out. 17
  • Figure 1 there is shown schematically a first embodiment of a device for acquiring the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of a substance 1 arranged in a container 3, for example a test tube.
  • a sensor 5 typically a coil of the "telephone sensor” type marketed with a view to being applied to a telephone earpiece and connected to a tape recorder, is applied against the container 3.
  • the container 3 can also be formed by a biological wall, in particular the skin of a living being. In such a case, the acquisition of the electromagnetic signal is carried out in a non-invasive manner.
  • the signal collected by the coil 5 is advantageously amplified by an amplifier 7 and is available at an output terminal 9. Without this being in any way limiting in the example illustrated, a first end of the coil 5 is connected to the input of the amplifier-preamplifier 7, the opposite end being connected to a ground 11.
  • the coil 5 is a commercial telephone sensor having a length of 6 mm, an internal diameter of 6 mm containing a metal core, an external diameter of 16 mm and an impedance of 300 ⁇ .
  • FIG. 2 there is shown schematically the preferred embodiment of a device for acquiring the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of a substance 1 contained in a container 3, in which the device preferably comprises , in an enclosure 13 provided with an electric and magnetic shielding, a transducer 15 for irradiating said substance 1 supplied by a generator 17.
  • the transducer 15 comprises, for example, a coil, advantageously supplemented by waveguides, for example, an air gap (not shown) placed in contact with the outer walls of the container 3.
  • the generator 17 generates a low frequency sinusoidal signal, low frequency square signals, pink noise or, advantageously, white noise.
  • the spectrum of the excitation signal supplying the coil 15 corresponds substantially to the spectrum of audible frequencies (20 Hz - 20,000 Hz).
  • the generator 17 can be an analog signal generator of known type or, for example, a read-only memory (ROM, PROM, EPROM, EEPROM in English terminology) containing the digital signal of the desired noise and which is connected to a digital converter - analog, or the line output of a sound card from a multimedia microcomputer.
  • ROM read-only memory
  • PROM PROM
  • EPROM Erasable programmable read-only memory
  • EEPROM electrically erasable programmable read-only memory
  • the acquisition sensor 5 can comprise a coil similar to the coil 5 of the device of FIG. 1 or, advantageously, a coil of small diameter connected by an electromagnetic waveguide to the wall of the container 3.
  • the signal received by the sensor 5 is available at an output terminal 9 of an amplifier-preamplifier 7.
  • the signal available on terminal 9 can be directly applied to the substance or substances to be irradiated, in particular to the ligand, to the receptor or to the ligand / receptor pair (in particular using the device illustrated in FIG. 5 and described below) .
  • the signal can be recorded in analog by a signal recorder 19 ( Figure 3), in particular on magnetic tape 21 adapted to the frequencies of the signal received. For acoustic frequencies, it is possible in particular to use a tape recorder.
  • the output terminal 9 of the signal acquisition device of Figures 1 or 2 is connected to the microphone input or to the line input of such a tape recorder. During reading, the signal is collected at an output terminal 9 ′, in particular at the line output or at the speaker output of the tape recorder 19.
  • digital recording is carried out after analog-digital conversion of the signal.
  • a microcomputer 23 illustrated in Figure 4 provided with a signal acquisition card 25. It is for example a PC type computer, running under the operating system 19
  • the acquisition card 25 comprises an analog converter 39 preferably having a resolution greater than 10 bits, for example equal to 12 bits, as well as a sampling frequency twice the maximum frequency than the we want to be able to digitize for signal processing. In the acoustic frequencies, the sampling frequency is advantageously substantially equal to 44 kHz.
  • a sound card for a microcomputer is advantageously used, for example the Soundblaster 16 card or the Soundblaster 32 card sold by the CREATIVE LABS Company.
  • the computer 23 provided with the reproduction acquisition card 25, in particular with a Soundblaster card 32 can advantageously replace the signal generator 17 of FIG. 2.
  • the output 9 of the signal acquisition devices of Figures 1 is connected to the input 9 of the analog-digital converter 39 of the card 25 of the computer 23; the signal is acquired for a period of time, for example, between 1 and 60 s and the digital file is recorded in a mass memory 33, for example in the form of a sound file in .WAV format.
  • This file may possibly undergo digital processing, such as for example digital amplification for signal level calibration, filtering for the elimination of unwanted frequencies, or be transformed into its spectrum by a discrete FOURIER transform, preferably by l 'fast FOURIER transform algorithm (FTT in English terminology).
  • the sound reproduction time can be increased by repeating a fragment or the entire original sound file several times in a file.
  • the file possibly processed is transformed by a digital-analog converter 41 of the card 25 (or of a separate card), which delivers on the output 9 'the analog electromagnetic signal characteristic of the biological activity to be applied, according to the amplification process in accordance with 20
  • the invention for example to an aliquot 43 of a first reagent and to an aliquot 45 of a second reagent, as illustrated in FIG. 5.
  • the application of the signal to these aliquots is carried out prior to their mixing.
  • the support on which these aliquots are deposited for example, a blade 47 provided with a capillary 49 in the form of a serpentine, is arranged in an electromagnetic field radiated by a transducer 51, typically a coil of which a first end 9, 9 'is connected to the output 9 of an acquisition device of Figures 1 or 2 or to the output 9 'of a recording device of Figures 3 or 4.
  • the end of the coil opposite to the connection terminal 9, 9 ' is, for example, connected to ground 11.
  • the transducer 51 advantageously comprises a coil, of horizontal axis allowing the introduction of the blade 47.
  • the coil has, for example, a length of 120 mm, an internal diameter of 25 mm, an outside diameter of 28 mm, has 631 turns of a wire with a diameter of 0.5 mm and a resistance of 4.7 ⁇ .
  • the electrical signal applied to this coil 51 will have an amplitude of 2 effective volts.
  • the amplification process in accordance with the invention was validated by testing the effects, on an agglutination reaction between the polysaccharide antigen of Escherichia coli Kl and an antibody directed against this antigen:
  • the acquisition of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of Streptococcus was carried out by placing in the center of the enclosure 13 a tube containing 1 ml of an aqueous suspension of previously formulated Streptococcus bacteria (6.10 ⁇ bacteria / ml).
  • a transducer consisting of a coil measuring 120 mm long and 25 mm internal diameter, having 631 turns and a resistance of 4.7 ⁇ , is placed in an oven heated to 37 ° C, and connected to the converter output 9 ' digital-analog 41 of a Soundblaster card of a computer 23 reproducing the recording files constituted by the electromagnetic signals which it is desired to apply, the time necessary to bring this transducer to the temperature of 37 ° C;
  • the desired electromagnetic signal (s) are applied to the two drops of reagents thus deposited by placing the slide in the center of the transducer for approximately 2 min and by restoring a sound file using the computer 23 of FIG. 4;
  • this reading is performed by analysis using a software of analysis and image processing implemented on a PC-type computer 23 'running the WINDOWS ® operating system 95
  • MICROSOFT MICROSOFT
  • the computer determines an agglutination index (I) calculated according to the formula:
  • This agglutination index is higher the greater the size of the agglutinates formed during the agglutination reaction. Amplification is considered positive when, during an experiment, the application of the electromagnetic signals characteristic of the biological activity of Escherichia coli and / or the biological activity of its specific antibody leads to obtaining agglutination index at least 40% greater than the maximum agglutination index obtained, under the same conditions, and for example on 3 experiments, after application of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of Streptococcus.
  • Table 1 below presents the agglutination indexes (I) obtained in a first series of tests aimed at comparing the effects of the application of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of Escherichia coli with those observed after application, under the same reaction conditions, of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of Streptococcus, and this, for 24
  • FIGS. 6 and 7 show, by way of example, images of the agglutinates formed on the one hand, after application of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of Streptococcus (FIG. 6) and, on the other hand, after application of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of Escherichia coli ( Figure 7). These images correspond respectively to the agglutination indexes of 32 and 117 which are reported in the 5th row of results in Table 1.
  • Table 2 below presents the agglutination index (I) obtained in a second series of experiments in which the effects of the simultaneous application of the electromagnetic signal characteristic of biological activity d 'Escherichia coli and the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of the antibody directed against Escherichia coli, were compared with those of the simultaneous application, under the same reaction conditions, of the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of Streptococcus and the electromagnetic signal characteristic of the activity 25
  • Antibody signal Anti-E antibody signal. anti-E coli. coli
  • Figures 8 and 9 show, also by way of example, images of the agglutinates which correspond respectively to the agglutination indexes of 71 and 247 reported in the second row of results in Table 2. All these results clearly show the aptitude presented by the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of an element of a ligand / receptor pair, to amplify the formation of the complexes formed by the reaction between this ligand and this receptor, in a very specific way, since the electromagnetic signal characteristic of the biological activity of a biologically active element, but foreign to this reaction does not produce an amplification effect.
  • Table 3 presents the agglutination indexes (I) obtained in three series of tests.
  • the size of the agglutinates formed during the reaction between the polysaccharide antigen of Escherichia coli Kl and its specific antico ⁇ s is substantially higher in the case where the electromagnetic signal applied during this reaction has been captured from a sample of applesauce contaminated with Escherichia coli bacteria.

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Abstract

L'invention se rapporte à un procédé d'amplification de la formation de complexes entre les deux éléments d'un couple ligand/récepteur ainsi qu'à ses utilisations pour détecter la présence, d'une part, d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur dans un échantillon et, d'autre part, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur dans un signal électromagnétique. Ce procédé d'amplification comprend: la mise en contact des deux éléments du couple ligand/récepteur dans des conditions propres à permettre leur réaction; et préalablement, simultanément ou postérieurement à cette mise en contact, l'application à l'un et/ou l'autre de ces éléments du signal électromagnétique caractérisique de l'activité biologique de l'un et/ou l'autre desdits éléments. Applications: diagnostic biologique en médecine humaine et vétérinaire, contrôle bactériologique dans l'industrie pharmaceutique, l'industrie cosmétique, les productions et industries alimentaire, etc.

Description

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PROCEDE D'AMPLIFICATION DE LA FORMATION DE COMPLEXES LIGANDS-RECEPTEURS ET SES UTILISATIONS
La présente Invention se rapporte à un procédé d'amplification de la formation de complexes entre les deux éléments d'un couple ligand/récepteur, à un procédé et à un appareil de détection de la présence, dans un échantillon (ci-après "échantillon analytique"), d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur, mettant en oeuvre ce procédé d'amplification, aux applications de ce procédé de détection, ainsi qu'à un procédé de détection de la présence, dans un signal électromagnétique, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur, mettant également en oeuvre ledit procédé d'amplification.
Pour détecter la présence d'une substance dans un échantillon analytique, on a proposé de très nombreuses méthodes fondées sur la capacité de cette substance à se lier spécifiquement à une autre substance et à réagir avec elle.
En particulier, les propriétés d'affinité que présentent les anticorps vis-à-vis des antigènes sont à la base d'un grand nombre de méthodes immunologiques de détection qui ont en commun d'utiliser la formation de complexes antigènes- anticorps - la substance recherchée pouvant être soit l'antigène, soit l'anticorps - et de détecter, voire de quantifier, les complexes ainsi formés.
A titre d'exemples de méthodes immunologiques de détection qui sont très fréquemment utilisées, on peut citer l'immunoprécipitation, les réactions d'agglutination, la dialyse à l'équilibre, l'extinction de fluorescence, la polarisation de fluorescence, l'immunoélectrophorèse, la contre-immunoélectrophorèse ou électrosynérèse, les dosages radio-immmunologiques (RIA), les dosages immuno- enzymatiques (ELISA) ou encore l'immunofluorescence.
Ces méthodes immunologiques de détection, si elles présentent incontestablement de grandes qualités, ne donnent toutefois pas totalement satisfaction. 2
En premier lieu, leur sensibilité (qui est définie par la concentration minimale de substance recherchée que ces méthodes détectent) est, dans la plupart des cas, insuffisante. Ainsi, BERZOFSKY et BERKOWER (Antigen-Antibody Interaction, In : WE Paul, Fundamental Immunology, RAVEN PRESS, New- York, 1984, 595) ont montré que, pour ce qui concerne par exemple la détection des anticorps, à l'exception des tests de neutralisation des phages avec lesquels il est possible de détecter la présence d'une seule molécule d'anticorps mais dont l'usage est extrêmement limité, très peu de méthodes ont une sensibilité inférieure à 10 ng d'anticorps par ml d'échantillon. II est donc souhaitable de développer de nouvelles techniques qui permettent d'abaisser le seuil de détection d'une substance recherchée.
Par ailleurs, toutes les méthodes de détection immunologiques proposées à ce jour comprennent une étape qui consiste à incuber un volume déterminé - qui est généralement au minimum de 500 μl - du prélèvement à analyser avec un réactif spécifique et ce, pour chaque substance recherchée. De ce fait, elles présentent l'inconvénient de nécessiter, dès que l'analyse d'un prélèvement porte sur plusieurs substances - comme cela est très souvent le cas des analyses médicales à visée diagnostique -, un prélèvement d'un volume relativement important, ce qui n'est pas toujours bien supporté par les patients, notamment dans le cas de prélèvements sanguins.
De plus, le fait que ces méthodes de détection nécessite, pour leur mise en oeuvre, de disposer du prélèvement à analyser ou, à tout le moins, d'un échantillon de celui-ci, n'est pas sans présenter un certain nombre de contraintes. En effet : - d'une part, il est fréquent que des prélèvements ayant donné lieu à des analyses doivent être conservés de manière à ce que la fiabilité de ces analyses puisse être contrôlée ultérieurement ou que des analyses complémentaires puissent être réalisées. Ainsi, par exemple, les centres de transfusion sanguine, les services de médecine légale et les centres de prélèvements tissulaires conservent des échantillons de tous les prélèvements biologiques qu'ils sont amenés à effectuer. Cette 3
conservation, qui est réalisée par congélation desdits échantillons, outre d'avoir un coût non négligeable, nécessite des équipements et des locaux adaptés.
- d'autre part, il est également fréquent que des prélèvements ne puissent pas être analysés sur le lieu où ils ont été réalisés et qu'il soit nécessaire de les acheminer jusqu'au laboratoire chargé d'en effectuer l'analyse. Or, l'acheminement de prélèvements biologiques, outre qu'il n'est jamais très aisé à mettre en oeuvre en raison de la faible durée de conservation des substances biologiques en l'absence de congélation, pose un certain nombre de difficultés lorsque ces prélèvements sont potentiellement contaminants. De plus, la durée d'un tel acheminement diffère d'autant l'obtention des résultats de l'analyse.
Le problème se pose, par conséquent, de fournir une méthode qui permette de détecter la présence d'une substance dans un échantillon avec, à la fois, une très grande sensibilité et une haute spécificité, tout en offrant la possibilité d'effectuer autant d'analyses que nécessaires à partir de microprélèvements, de s'affranchir, de plus, des contraintes de conservation, d'expédition et de transport des prélèvements que présentent les méthodes actuellement utilisées pour la détection d'une substance, et qui puisse, en outre, être mise en oeuvre aisément et rapidement sans nécessiter un équipement lourd et onéreux.
Or, dans le cadre de leurs travaux sur la transmission d'une activité biologique sous la forme d'un signal électromagnétique, les Inventeurs ont constaté que l'application, à l'un et/ou l'autre des éléments d'un couple ligand/récepteur tel qu'un couple antigène/anticorps, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'un et/ou l'autre de ces éléments a, de façon tout à fait surprenante, pour effet d'amplifier la formation de complexes entre les deux éléments de ce couple lorsque ces derniers sont mis à réagir ensemble et ce, de manière très spécifique, et ont eu l'idée de mettre à profit cet effet pour détecter d'une part, la présence d'une substance dans un échantillon analytique et, d'autre part, la présence du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'une substance dans un rayonnement électromagnétique. 4
La présente Invention a, donc, pour objet un procédé d'amplification de la formation de complexes entre les deux éléments d'un couple ligand/récepteur par réaction de ces deux éléments, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact des deux éléments du couple ligand/récepteur dans des conditions propres à permettre leur réaction, et
- préalablement, simultanément ou postérieurement à cette mise en contact, l'application à l'un et/ou l'autre de ces éléments du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'un et/ou l'autre desdits éléments.
Au sens de la présente Invention, on entend par "couple ligand/récepteur", tout couple formé par deux substances capables de se reconnaître spécifiquement, de se lier et de réagir ensemble en formant des complexes. Ainsi, il peut s'agir d'un couple antigène/anticorps ou haptène/anticorps dans lequel le ligand (l'antigène ou l'haptène) peut être un composé biologique (protéine, enzyme, hormone, toxine, marqueur tumoral, ...), un composé chimique (principe actif médicamenteux par exemple), ou un antigène cellulaire ou particulaire (cellule, bactérie, virus, champignon, ...), le récepteur pouvant être un anticorps soluble ou un récepteur membranaire. Il peut également s'agir d'un couple formé par une enzyme et son substrat spécifique.
Par ailleurs, on entend par "signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique" d'un élément, le signal électromagnétique capté à partir d'un élément biologiquement actif tel qu'une substance, une cellule ou un micro-organisme, ..., ou d'une matière contenant cet élément tel qu'une préparation purifiée, un prélèvement biologique, un organe ou un être vivant, ainsi que cela a été décrit dans la Demande Internationale WO 94/17406 au nom de J. BENVENISTE. On entend également par "signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique" d'un élément, les signaux dérivés d'un signal tel que défini ci-dessus par numérisation et/ou traitement de signal. Par ailleurs, dans cette expression, on emploie le terme "caractéristique" dans le sens où le signal électromagnétique capté contient une information caractérisant le fait que la matière à partir de laquelle est capté ce signal présente l'activité biologique en question. Le signal électromagnétique capté à partir 5
d'un matériel contenant une pluralité d'éléments biologiquement actifs présente l'activité biologique de chacun des éléments qu'il contient.
Selon un premier mode de mise en oeuvre préféré du procédé d'amplification conforme à l'Invention, la réaction entre le ligand et le récepteur est réalisée en utilisant deux réactifs contenant respectivement le ligand et le récepteur, et on applique, à l'un et/ou l'autre de ces réactifs, un signal électromagnétique à tester et suspecté comprendre le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de ce ligand et/ou de ce récepteur.
Dans ce qui précède et dans ce qui suit, on désigne sous le terme de "réactif, toute préparation dont la composition est connue, qui contient le ligand ou le récepteur en une quantité également connue et se présente soit sous une forme sèche telle qu'un lyophilisât à reconstituer dans un solvant, soit sous une forme liquide telle qu'une solution ou une suspension, le ligand ou le récepteur pouvant être fixé sur une phase solide (particules ou billes de latex, de verre ou de polystyrène, ...). Selon une première disposition avantageuse de ce premier mode de mise en oeuvre, l'application, à l'un et/ou l'autre des réactifs, du signal électromagnétique à tester est réalisée par exposition d'une solution ou d'une suspension contenant l'un et/ou l'autre de ces réactifs, à ce signal électromagnétique.
En variante, l'application, à l'un et ou l'autre des réactifs, du signal électromagnétique à tester est réalisée par dilution d'une solution ou d'une suspension comprenant l'un et/ou l'autre de ces réactifs, dans un solvant ayant été préalablement exposé à ce signal électromagnétique.
Ainsi, par exemple, lorsque les réactifs que l'on souhaite utiliser sont en solution ou en suspension dans une phase liquide, il est possible de leur appliquer le signal électromagnétique à tester :
* soit préalablement à leur utilisation :
• en exposant l'un et/ou l'autre de ces réactifs ou des aliquotes de l'un et/ou l'autre de ces réactifs à ce signal électromagnétique, ou
• en diluant l'un et/ou l'autre desdits réactifs ou leurs aliquotes dans un volume d'un solvant ayant été préalablement exposé au dit signal électromagnétique, 6
* soit lors de la mise en oeuvre du procédé d'amplification conforme à l'Invention :
• en exposant à ce signal électromagnétique un aliquote de chacun de ces réactifs, après dépôt de ces aliquotes sur un support (lame par exemple) mais préalablement à leur mise en contact, ou
• en mélangeant un aliquote du premier réactif avec un aliquote du deuxième réactif sur un support ou dans un tube, et en exposant ce mélange au signal électromagnétique, ou encore
• en mélangeant un aliquote du premier réactif avec un aliquote du deuxième réactif sur un support ou dans un tube et en diluant ce mélange dans un volume d'un solvant ayant été préalablement exposé audit signal électromagnétique.
Selon une autre disposition avantageuse de ce premier mode de mise en oeuvre, l'application, à l'un et/ou l'autre des réactifs, du signal électromagnétique à tester est réalisée par dissolution ou mise en suspension de ce ou ces réactifs dans un solvant ayant été préalablement exposé à ce signal électromagnétique. Cette disposition présente un intérêt tout particulier lorsque les réactifs que l'on souhaite utiliser, se trouvent sous une forme déshydratée telle qu'un lyophilisât, puisqu'il est alors possible de leur appliquer le signal électromagnétique à tester simplement en les dissolvant ou en les mettant en suspension selon le cas, dans un volume d'un solvant ayant été préalablement exposé à ce signal électromagnétique.
Avantageusement, le signal électromagnétique à tester est un signal électromagnétique capté à partir d'un échantillon à analyser et suspecté contenir ce ligand et/ou ce récepteur, cet échantillon pouvant être aussi bien issu d'un prélèvement biologique (sang, urine, lait, ...) que d'un prélèvement non biologique (eau, produit alimentaire, produit pharmaceutique, produit cosmétique, ...).
En variante, le signal électromagnétique à tester peut également être un signal électromagnétique rayonné par une source de rayonnement électromagnétique, notamment une source suspectée émettre un rayonnement nocif pour les être vivants du type ligne haute-tension, transformateur, moteur électrique, four à micro-ondes, accélérateur de particules, source de rayons X, ... De même, le 7
signal électromagnétique à tester peut provenir de l'acquisition d'un signal mécanique comme des vibrations, d'un signal électrostatique ou autre.
Selon un deuxième mode de mise en oeuvre préféré du procédé d'amplification conforme à l'Invention, la réaction entre le ligand et le récepteur est réalisée en mettant en contact un échantillon à analyser et suspecté contenir le ligand et/ou le récepteur, avec un réactif contenant soit le récepteur, soit le ligand (selon la substance suspectée être présente dans l'échantillon analytique avec laquelle on souhaite faire réagir ce réactif), et on applique, à cet échantillon et/ou à ce réactif, le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique dudit ligand et/ou dudit récepteur.
Selon une première disposition avantageuse de ce deuxième mode de mise en oeuvre, l'application, à l'échantillon à analyser, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et/ou du récepteur est réalisée par exposition de cet échantillon à ce ou ces signaux électromagnétiques, ou par dilution de cet échantillon dans un solvant ayant été préalablement exposé au(x)dit(s) signal(aux) électromagnétique(s).
Selon une autre disposition avantageuse de ce deuxième mode de mise en oeuvre, l'application, au réactif destiné à réagir avec l'échantillon à analyser, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et/ou du récepteur est réalisée par exposition d'une solution ou d'une suspension contenant ce réactif à ce ou ces signaux électromagnétiques, ou par dilution d'une telle solution ou suspension dans un solvant ayant été préalablement exposé à ce ou ces signaux électromagnétiques, ou encore par dissolution ou mise en suspension de ce réactif dans un solvant ayant été préalablement exposé au(x)dit(s) signal(aux) électromagnétique(s).
En variante, on applique, à l'échantillon à analyser et au réactif destiné à réagir avec lui, le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et/ou du récepteur, par exposition d'une solution ou d'une suspension contenant cet échantillon et ce réactif à ce ou ces signaux électro- 8
magnétiques, ou par dilution d'une telle solution ou suspension dans un solvant ayant été préalablement exposé au(x)dit(s) signal(aux) électromagnétique(s).
Selon une disposition particulièrement préférée de ce deuxième mode de mise en oeuvre, on applique, à l'échantillon à analyser et/ou au réactif destiné à réagir avec lui, à la fois le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du récepteur. En effet, les Inventeurs ont constaté que, s'il suffit d'appliquer, aux éléments du couple ligand/récepteur, le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'un seul de ces éléments pour obtenir une amplification des complexes formés par leur réaction, cette amplification est plus élevée lorsqu'on applique à ces éléments simultanément les signaux électromagnétiques caractéristiques de l'activité biologique de chacun d'eux.
Quel que soit le mode de mise de oeuvre du procédé d'amplification conforme à l'Invention, le solvant ayant été préalablement exposé au(x) signal(aux) électromagnétique(s) est avantageusement de l'eau ou du soluté physiologique.
Les réactifs susceptibles d'être utilisés dans le procédé d'amplification conforme à l'Invention et contenant le ligand d'une part, et le récepteur d'autre part, peuvent être aussi bien des réactifs prêts à l'emploi disponibles dans le commerce que des réactifs spécialement conçus et préparés pour la mise en oeuvre de ce procédé. Outre le fait que, comme mentionné ci-avant, ces réactifs peuvent se présenter sous différentes formes (sèche, liquide, ...), ils peuvent, par ailleurs, être couplés à un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme, une substance fluorescente, une particule colorée, la biotine ou un composé organométallique, propre à permettre la détection et ou la mesure des complexes ligands-récepteurs résultant de la réaction entre le ligand et le récepteur.
Le procédé d'amplification comprend avantageusement, de plus, une étape d'acquisition du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'un et/ou l'autre des éléments du couple ligand/récepteur.
Comme précédemment indiqué, le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'un et/ou l'autre des éléments du couple 9
ligand/récepteur peut provenir soit d'un échantillon à analyser et suspecté contenir ce ou ces éléments, soit d'une source de rayonnement électromagnétique ou de l'acquisition d'un signal mécanique (vibrations), électrostatique ou autre, soit encore de réactifs contenant le ligand ou le récepteur en solution ou en suspension dans un solvant, selon les modes de mises en oeuvre du procédé d'amplification conforme à l'Invention.
De manière particulièrement avantageuse, le procédé d'amplification conforme à l'Invention comprend, également, une étape d'enregistrement et de restitution d'une information représentative du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'un et/ou l'autre des éléments du couple ligand/récepteur. Ainsi, le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'un échantillon analytique, une fois enregistré, peut être conservé indéfiniment et utilisé autant de fois que nécessaire. De manière similaire, les signaux électromagnétiques caractéristiques de l'activité biologique du ligand et de l'activité biologique du récepteur captés à partir de réactifs, peuvent être enregistrés une fois pour toutes et être utilisés pour effectuer une pluralité de réactions mettant en jeu ce ligand et ce récepteur.
Le procédé d'amplification comprend avantageusement, en outre, une étape de détection des complexes résultant de la réaction entre le ligand et le récepteur et, éventuellement, de mesure de ces complexes. Cette étape peut, avantageusement, être complétée par la comparaison des résultats obtenus avec ceux observés pour une réaction servant de "témoin", c'est-à-dire une réaction conduite avec le même couple ligand/récepteur et dans les mêmes conditions réactionnelles, mais sans application d'un signal électromagnétique aux éléments de ce couple, que ce soit préalablement, simultanément ou postérieurement à leur mise en contact.
La détection et/ou la mesure des complexes ligands-récepteurs sont susceptibles d'être effectuées par toutes les méthodes classiquement utilisées pour révéler et quantifier la formation de tels complexes. Ainsi, dans le cas de complexes antigènes-anticorps, il est possible d'utiliser aussi bien une révélation par agglutination, par immunoprécipitation, par extinction de fluorescence, par 10
polarisation de fluorescence qu'un test radio-immunologique, immuno-enzymatique ou encore un test d'immuno-fluorescence.
Selon un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré du procédé d'amplification conforme à l'Invention, le ligand est un antigène ou un haptène, tandis que le récepteur est un anticorps ou un récepteur membranaire dirigé spécifiquement contre ce ligand.
De manière particulièrement avantageuse, la réaction entre ce ligand et ce récepteur est une réaction révélée par agglutination, du fait de sa simplicité et de sa rapidité d'exécution. La présente Invention a, également, pour objet un procédé de détection de la présence d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur dans un échantillon analytique, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification tel que défini ci-avant.
Selon un premier mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de ce procédé de détection, celui-ci comprend :
- la mise en contact de deux réactifs contenant respectivement le ligand et le récepteur, dans des conditions propres à permettre leur réaction,
- préalablement, simultanément ou postérieurement à cette mise en contact, l'application, à l'un et/ou l'autre de ces réactifs, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'échantillon analytique, et
- la détection et/ou la mesure des complexes ligands-récepteurs formés au cours de la réaction entre les deux réactifs.
Ainsi, l'obtention d'une amplification de la formation de complexes ligands-récepteurs entre les deux réactifs par rapport à une réaction "témoin" (telle que précédemment définie) traduit la présence, dans le signal électromagnétique de l'activité biologique de l'échantillon à analyser, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de la substance recherchée et, par voie de conséquence, traduit la présence, dans cet échantillon, de la substance recherchée.
Dans le cas où une telle amplification est obtenue et où l'échantillon analytique est susceptible de contenir non pas un seul des deux éléments du couple 11
ligand/récepteur, mais ces deux éléments, la présence, dans cet échantillon, de la substance recherchée peut être confirmée par la comparaison des résultats obtenus avec :
- soit ceux observés pour une réaction conduite dans les mêmes conditions réactionnelles mais avec une application à la fois du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'échantillon à analyser et du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand,
- soit ceux observés pour une réaction conduite dans les mêmes conditions réactionnelles mais avec une application à la fois du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'échantillon à analyser et du signal caractéristique de l'activité biologique du récepteur.
Ainsi, si l'application simultanée du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'échantillon analytique et du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand se traduit par une amplification de la formation des complexes ligands-récepteurs par rapport à l'application du seul signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique dudit échantillon analytique, alors cela signifie que cet échantillon ne contient pas de ligand et donc ne contient que le récepteur. L'absence d'augmentation de la formation des complexes ligands-récepteurs signant, elle, la présence du ligand dans l'échantillon analytique.
De manière similaire, si l'application simultanée du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'échantillon analytique et du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du récepteur se traduit par une amplification de la formation des complexes ligands-récepteurs par rapport à l'application du seul signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique dudit échantillon analytique, alors il peut en être déduit que cet échantillon ne contient pas de récepteur et donc ne contient que le ligand. L'absence d'augmentation de la formation des complexes ligands-récepteurs signant, elle, la présence du récepteur dans l'échantillon. 12
Afin d'éviter d'obtenir des résultats faussement négatifs, c'est-à-dire des résultats qui ne permettraient pas de révéler un effet d'amplification de l'application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité de l'échantillon analytique et ce, bien que ce dernier contienne en réalité la substance recherchée, les concentrations du ligand et du récepteur mis à réagir sont avantageusement choisies de manière à être suffisantes pour conduire à l'obtention de complexes ligands-récepteurs détectables en l'absence de l'application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique dudit échantillon, mais inférieures aux concentrations susceptibles d'aboutir à une saturation de la réaction entre ce ligand et ce récepteur. Selon un deuxième mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé de détection, celui-ci comprend :
- la mise en contact de l'échantillon analytique avec un réactif contenant soit le récepteur, si la substance recherchée dans l'échantillon est le ligand, soit le ligand, si la substance recherchée dans l'échantillon est le récepteur, dans des conditions propres à permettre leur réaction,
- préalablement, simultanément ou postérieurement à cette mise en contact, l'application, à cet échantillon et/ou ce réactif, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et/ou du récepteur, et
- la détection et/ou la mesure des complexes ligands-récepteurs éventuellement formés, auquel cas, l'obtention de complexes ligands-récepteurs traduit la présence de la substance recherchée dans l'échantillon analytique.
Ce deuxième mode de mise en oeuvre préféré présente un intérêt tout particulier pour détecter la présence de substances dans des échantillons, dont on sait qu'elles ne sont pas détectables ou que très difficilement par les autres méthodes de détection disponibles, en raison de ce que ces substances sont généralement présentes à des concentrations très faibles, voire à l'état de traces.
Le procédé de détection de la présence d'une substance dans un échantillon analytique conforme à l'Invention présente de nombreux avantages.
En effet, d'une part, il permet de détecter la présence d'une substance recherchée avec une très grande sensibilité et une haute spécificité. De ce fait, dans le 13
cas, par exemple, d'une analyse bactériologique, il permet de supprimer la nécessité d'isoler les différents germes, de les cultiver, de procéder à un antibiogramme et d'identifier ces germes par leurs caractères biochimiques, morphologiques et immunologiques, et autorise l'obtention de résultats beaucoup plus rapidement que les méthodes de détection immunologiques actuellement utilisées en bactériologie.
D'autre part, dans la mesure où il suffit de disposer d'un échantillon de la taille d'une goutte pour être en mesure d'acquérir et d'enregistrer le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de cet échantillon et où, ce signal, une fois enregistré peut être restitué à la demande, ce procédé offre la possibilité de réaliser autant d'analyses que l'on souhaite à partir d'un microprélèvement.
Enfin, l'enregistrement d'un signal électromagnétique pouvant être conservé indéfiniment, par exemple sous la forme d'un fichier informatique susceptible d'être conservé sur une simple disquette ou un CD-Rom, et d'être transmis d'un lieu à un autre par tout moyen de transmission de données numériques, ce procédé permet, de plus, de supprimer toutes les contraintes de conservation, d'expédition et de transport des prélèvement que présentent les méthodes actuellement utilisées pour la détection d'une substance.
Ce procédé est susceptible d'être utilisé pour détecter toute substance capable de se lier spécifiquement avec une autre substance et de réagir avec elle, étant entendu que le terme "substance" tel qu'il est utilisé ici, désigne aussi bien un composé biologique, un composé chimique, une cellule qu'un micro-organisme du type bactérie, virus ou champignon, sachant notamment que pour tout haptène, protéine ou complexe protéinique, il est possible de trouver sur le marché ou de faire fabriquer les anticorps correspondants. A ce titre, ce procédé trouve, notamment, application dans le diagnostic biologique, que ce soit en médecine humaine ou vétérinaire, ou pour le contrôle de qualité bactériologique dans les industries telles que l'industrie pharmaceutique, l'industrie cosmétique, les productions et industries alimentaires.
La présente Invention a, encore, pour objet un procédé de détection de la présence, dans un signal électromagnétique à tester, d'un signal 14
électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification tel que défini ci-avant. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé de détection, le signal électromagnétique à tester est le signal électromagnétique rayonné par une source de rayonnement électromagnétique.
L'Invention a, aussi, pour objet un appareil de détection de la présence d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur dans un échantillon analytique, lequel appareil est caractérisé en ce qu'il met en œuvre un procédé selon l'Invention et en ce qu'il comporte : a) des moyens de réception de l'échantillon analytique et d'un réactif contenant soit le récepteur, soit le ligand, permettant leur mise en contact dans des conditions propres à permettre leur réaction ; b) une source de signal électromagnétique caractéristique de l'activité du ligand et/ou du récepteur ; c) des moyens d'application du signal délivré par ladite source de signal électromagnétique à l'échantillon et/ou le réactif ; et d) des moyens de détection et/ou de mesure des complexes ligands-récepteurs formés au cours de la réaction entre l'échantillon et le réactif.
L'Invention a, en outre, pour objet un appareil de détection de la présence d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur dans un échantillon analytique, lequel appareil est caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un procédé selon l'Invention et en ce qu'il comporte : a) des moyens de réception de deux réactifs contenant respectivement le ligand et le récepteur, permettant leur mise en contact dans les conditions propres à permettre leur réaction ; b) des moyens d'acquisition d'un signal électromagnétique de l'échantillon analytique ; 15
c) des moyens d'application du signal délivré par lesdits moyens d'acquisition de signal électromagnétique à l'un et/ou l'autre des réactifs ; et d) des moyens de détection et/ou de mesure des complexes ligands-récepteurs formés en cours de la réaction entre les deux réactifs. Selon un mode de réalisation avantageux de ces appareils, les moyens de détection comportent des moyens de détection optique.
De manière préférée, ces appareils comportent une enceinte munie d'un blindage électrique et magnétique entourant lesdits moyens de réception.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des exemples de réalisation de dispositifs d'acquisition, d'enregistrement et d'application de signal susceptibles d'être utilisés selon l'Invention ainsi qu'à des exemples d'expérimentations ayant permis de valider le procédé d'amplification objet de la présente Invention, et qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels : - la Figure 1 représente un schéma d'un premier exemple de réalisation d'un dispositif d'acquisition de signal susceptible d'être utilisé selon la présente Invention ;
- la Figure 2 représente un schéma d'un deuxième exemple de réalisation d'un dispositif d'acquisition de signal susceptible d'être utilisé selon la présente Invention ;
- la Figure 3 représente un schéma d'un premier exemple de réalisation d'un dispositif d'enregistrement de signal susceptible d'être utilisé selon la présente Invention ;
- la Figure 4 représente un schéma d'un deuxième exemple de réalisation d'un dispositif d'enregistrement de signal susceptible d'être utilisé selon la présente Invention ;
- la Figure 5 représente un schéma d'un exemple de réalisation d'un dispositif d'application de signal susceptible d'être utilisé conformément à l'Invention ;
- la Figure 6 montre une image noir et blanc de 320 pixels x 240 pixels des agglutinats formés au cours d'une réaction d'agglutination entre l'antigène 16
polysaccharidique d'Escherichia coli Kl et un anticorps dirigé contre cet antigène, après application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de Streptococcus ;
- la Figure 7 montre une image noir et blanc de 320 pixels x 240 pixels des agglutinats formés au cours d'une réaction d'agglutination entre l'antigène polysaccharidique d'Escherichia coli Kl et un anticorps dirigé contre cet antigène, après application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'Escherichia coli ;
- la Figure 8 montre une image noir et blanc de 320 pixels x 240 pixels des agglutinats formés au cours d'une réaction d'agglutination entre l'antigène polysaccharidique d'Escherichia coli Kl et un anticorps dirigé contre cet antigène, après application simultanée des signaux électromagnétiques caractéristiques de l'activité biologique de Streptococcus et de l'activité biologique d'un anticorps dirigé contre Escherichia coli ; - la Figure 9 montre une image noir et blanc de 320 pixels x 240 pixels des agglutinats formés également au cours d'une réaction d'agglutination entre l'antigène polysaccharidique d'Escherichia coli Kl et un anticorps dirigé contre cet antigène, après application simultanée des signaux électromagnétiques caractéristiques de l'activité biologique d'Escherichia coli et de l'activité biologique de son anticorps spécifique ; et
- la Figure 10 représente un schéma d'un exemple de réalisation d'un dispositif de détection et/ou de mesure des complexes ligands-récepteurs susceptible d'être utilisé selon la présente Invention.
Sur les Figures 1 à 5 et 10, on a utilisé les mêmes références pour désigner les mêmes éléments.
Par ailleurs, chaque image des Figures 6 à 9 correspond à une surface d'environ 2 mm x 1,5 mm du support sur lequel ont été réalisées les réactions d'agglutination. 17
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustrations de l'objet de l'Invention et n'en constituent en aucune manière une limitation.
On se réfère tout d'abord aux Figures 1 à 5. Sur la Figure 1, on a représenté schématiquement un premier exemple de réalisation d'un dispositif d'acquisition du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'une substance 1 disposée dans un contenant 3, par exemple un tube à essai. Un capteur 5, typiquement une bobine de type "capteur téléphonique" commercialisé en vue d'être appliqué sur un écouteur téléphonique et relié à un magnétophone, est appliqué contre le contenant 3. Le contenant 3 peut également être constitué par une paroi biologique, notamment la peau d'un être vivant. Dans un tel cas, l'acquisition du signal électromagnétique s'effectue de manière non invasive.
Le signal recueilli par la bobine 5 est, avantageusement, amplifié par un amplificateur 7 et est disponible à une borne de sortie 9. Sans que cela présente un quelconque caractère limitatif de l'exemple illustré, une première extrémité de la bobine 5 est connectée à l'entrée de l'amplificateur-préamplificateur 7, l'extrémité opposée étant connectée à une masse 11. Dans un exemple de réalisation, la bobine 5 est un capteur téléphonique du commerce présentant une longueur de 6 mm, un diamètre interne de 6 mm contenant un noyau métallique, un diamètre externe de 16 mm et une impédance de 300 Ω.
Sur la Figure 2, on a représenté schématiquement l'exemple préféré de réalisation d'un dispositif d'acquisition du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'une substance 1 contenue dans un contenant 3, dans lequel le dispositif comprend, de préférence, dans une enceinte 13 munie d'un blindage électrique et magnétique, un transducteur 15 d'irradiation de ladite substance 1 alimenté par un générateur 17. Le transducteur 15 comporte, par exemple, une bobine, avantageusement complétée par des guides d'ondes, par exemple, un entrefer (non représenté) placé au contact des parois extérieures du contenant 3. 18
Le générateur 17 génère un signal sinusoïdal basse fréquence, des signaux carrés basse fréquence, du bruit rose ou, avantageusement, du bruit blanc. Le spectre du signal d'excitation alimentant la bobine 15 correspond sensiblement au spectre des fréquences audibles (20 Hz - 20 000 Hz). Le générateur 17 peut être un générateur de signal analogique de type connu ou, par exemple, une mémoire morte (ROM, PROM, EPROM, EEPROM en terminologie anglo-saxonne) contenant le signal numérique du bruit désiré et qui est reliée à un convertisseur numérique- analogique, ou la sortie ligne d'une carte sons d'un micro-ordinateur multimédia. Toutefois, la mise en oeuvre de fréquences supérieures ne sort pas du cadre de la présente Invention.
Le capteur d'acquisition 5 peut comporter une bobine analogue à la bobine 5 du dispositif de la Figure 1 ou, avantageusement, une bobine de petit diamètre relié par un guide d'ondes électromagnétiques à la paroi du contenant 3. Avantageusement, le signal capté par le capteur 5 est disponible à une borne de sortie 9 d'un amplificateur-préamplificateur 7.
Le signal disponible sur la borne 9 peut être directement appliqué à la ou aux substances à irradier, notamment au ligand, au récepteur ou au couple ligand/récepteur (notamment à l'aide du dispositif illustré sur la Figure 5 et décrit ci- après). L'enregistrement du signal peut être effectué en analogique par un enregistreur de signal 19 (Figure 3), notamment sur bande magnétique 21 adapté aux fréquences du signal capté. Pour les fréquences acoustiques, on peut notamment utiliser un magnétophone. La borne de sortie 9 du dispositif d'acquisition de signal des Figures 1 ou 2 est reliée à l'entrée microphone ou à l'entrée ligne d'un tel magnétophone. Lors de la lecture, le signal est recueilli à une borne de sortie 9', notamment à la sortie ligne ou à la sortie haut-parleur du magnétophone 19.
Avantageusement, on effectue un enregistrement numérique après conversion analogique-numérique du signal. On utilise, par exemple, un microordinateur 23 illustré sur la Figure 4, muni d'une carte d'acquisition de signal 25. Il s'agit par exemple d'un ordinateur de type PC, tournant sous le système d'exploitation 19
WINDOWS® 95 de la Société MICROSOFT et comportant, outre la carte d'acquisition 25, un microprocesseur 27, un interface d'entrée/sortie 29, un contrôleur 31 d'une mémoire de masse 33 et une interface vidéo 35 reliée par un ou plusieurs bus 37. La carte d'acquisition 25 comporte un convertisseur analogique 39 ayant, de préférence, une résolution supérieure à 10 bits, par exemple égale à 12 bits, ainsi qu'une fréquence d'échantillonnage double de la fréquence maximale que l'on veut pouvoir numériser pour le traitement de signaux. Dans les fréquences acoustiques, la fréquence d'échantillonnage est avantageusement sensiblement égale à 44 kHz. Pour le traitement de ces types de signaux, on utilise avantageusement une carte son pour micro-ordinateur, par exemple la carte Soundblaster 16 ou la carte Soundblaster 32 vendues par la Société CREATIVE LABS. L'ordinateur 23 muni de la carte d'acquisition de restitution 25, notamment d'une carte Soundblaster 32 peut avantageusement remplacer le générateur de signal 17 de la Figure 2.
On connecte la sortie 9 des dispositifs d'acquisition de signal des Figures 1 à l'entrée 9 du convertisseur analogique-numérique 39 de la carte 25 de l'ordinateur 23 ; on procède à une acquisition du signal pendant une durée par exemple comprise entre 1 et 60 s et on enregistre le fichier numérique dans une mémoire de masse 33, par exemple sous la forme d'un fichier son au format .WAV. Ce fichier peut éventuellement subir un traitement numérique, comme par exemple une amplification numérique pour calibrage du niveau de signal, un filtrage pour l'élimination de fréquences non désirées, ou être transformé en son spectre par une transformée de FOURIER discrète, de préférence par l'algorithme de transformée de FOURIER rapide (FTT en terminologie anglo-saxonne).
Le temps de reproduction sonore peut être augmenté en répétant dans un fichier plusieurs fois un fragment ou la totalité du fichier son original.
Sur commande, le fichier éventuellement traité est transformé par un convertisseur numérique-analogique 41 de la carte 25 (ou d'une carte séparée), qui délivre sur la sortie 9' le signal électromagnétique analogique caractéristique de l'activité biologique à appliquer, selon le procédé d'amplification conforme à 20
l'Invention, par exemple à un aliquote 43 d'un premier réactif et à un aliquote 45 d'un deuxième réactif, comme illustré sur la Figure 5.
Avantageusement, l'application du signal à ces aliquotes est réalisée préalablement à leur mélange. Le support sur lequel sont déposés ces aliquotes, par exemple, une lame 47 munie d'un capillaire 49 en forme de serpentin, est disposé dans un champ électromagnétique rayonné par un transducteur 51 , typiquement une bobine dont une première extrémité 9, 9' est reliée à la sortie 9 d'un dispositif d'acquisition des Figures 1 ou 2 ou à la sortie 9' d'un dispositif d'enregistrement des Figures 3 ou 4. L'extrémité de la bobine opposée à la borne de connexion 9, 9' est, par exemple, connectée à la masse 11.
Sans que cela représente un quelconque caractère limitatif, le transducteur 51 comporte avantageusement une bobine, d'axe horizontal permettant l'introduction de la lame 47. La bobine a, par exemple, une longueur de 120 mm, un diamètre interne de 25 mm, un diamètre extérieur de 28 mm, présente 631 tours d'un fil de diamètre 0,5mm et une résistance de 4,7 Ω.
Avantageusement, le signal électrique appliqué sur cette bobine 51 aura une amplitude de 2 volts efficaces.
EXEMPLE 1 : AMPLIFICATION DE LA FORMATION D'AGGLUTINATS ENTRE L'ANTIGENE POLYSACCHARIDIQUE WESCHEMCHIA COLI Kl ET UN ANTICORPS DIRIGE CONTRE CET ANTIGENE
Le procédé d'amplification conforme à l'Invention a été validé en testant les effets, sur une réaction d'agglutination entre l'antigène polysaccharidique d'Escherichia coli Kl et un anticorps dirigé contre cet antigène :
- de l'application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'une substance antigénique étrangère à cette réaction telle que
Streptococcus,
- de l'application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'Escherichia coli, 21
- de l'application simultanée du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de Streptococcus et du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'un anticorps dirigé contre Escherichia coli, et enfin - de l'application simultanée du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique à! Escherichia coli et du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'un anticorps dirigé contre cet antigène.
1) Réalisation des tests : a) Acquisition des signaux électromagnétiques :
L'acquisition des signaux électromagnétiques caractéristiques des activités biologiques de Streptococcus, d'Escherichia coli et de son anticorps spécifique a été réalisée au moyen du matériel d'enregistrement de la Figure 2.
L'acquisition du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de Streptococcus a été effectuée en plaçant au centre de l'enceinte 13 un tube contenant 1 ml d'une suspension aqueuse de bactéries Streptococcus préalablement formulées (6.10δ bactéries/ml).
L'acquisition des signaux électromagnétiques caractéristiques de l'activité biologique d'Escherichia coli et de son anticorps spécifique a été réalisée en opérant de la même manière, mais en utilisant respectivement :
- un tube contenant 1 ml d'une suspension aqueuse de bactéries Escherichia coli préalablement formulées (6.106 bactéries/ml) ; et
- un tube contenant 1 ml d'une suspension de particules d'un latex sensibilisé par un anticorps monoclonal de souris spécifique d'Escherichia coli Kl, provenant d'une trousse PASTOREX® MENINGITIS (Référence 61709 - SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR), b) Préparation des réactifs de la réaction d'agglutination :
Les tests ont été réalisés en utilisant comme réactifs :
- d'une part, une solution d'antigène polysaccharidique d'Escherichia coli Kl préparée par dissolution d'un extrait antigénique provenant 22
d'une trousse PASTOREX® MENINGITIS (Référence 61709 - SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR) dans 1 ml d'eau distillée et stérile, puis dilution au 1/7, 1/7,5 ou 1/8 dans du sérum physiologique ; et
- d'autre part, le latex sensibilisé par un anticorps monoclonal de souris spécifique de l'anticorps d'Escherichia coli Kl présent dans cette même trousse, après dilution au 1/3 dans du sérum physiologique. c) Application des signaux électromagnétiques à la réaction d'agglutination : Pour chacun des tests, on a utilisé le protocole suivant :
- on place dans une étuve chauffée à 37°C un transducteur constitué par une bobine mesurant 120 mm de long et 25 mm de diamètre interne, présentant 631 tours et une résistance de 4,7 Ω, et reliée à la sortie 9' du convertisseur numérique-analogique 41 d'une carte Soundblaster d'un ordinateur 23 restituant les fichiers d'enregistrement constitué par les signaux électromagnétiques que l'on souhaite appliquer, le temps nécessaire pour amener ce transducteur à la température de 37°C ;
- on dépose sur une lame munie d'un capillaire en forme de serpentin (de type de celles fournies dans les kits PASTOREX MENINGITIS), à faible distance de l'ouverture de ce dernier, une goutte (soit 40 à 50 μl) de la solution antigénique telle que décrite au point b) ci-avant, ainsi qu'une goutte (correspondant également à un volume de 40 à 50 μl) du latex sensibilisé par l'anticorps, en prenant garde à ce que ces gouttes ne se mélangent pas ;
- on applique, aux deux gouttes de réactifs ainsi déposées, le ou les signaux électromagnétiques désirés en plaçant la lame au centre du transducteur pendant environ 2 mn et en restituant un fichier son à l'aide de l'ordinateur 23 de la Figure 4 ;
- on mélange les deux gouttes de réactifs pendant environ 10 secondes et on laisse pendant environ 13 minutes dans l' étuve le mélange réactionnel migrer dans le capillaire et la réaction d'agglutination se produire ;
- on sort alors la lame de l' étuve et on procède à une lecture de cette agglutination. 23
Comme visible sur la Figure 10, cette lecture est réalisée par analyse, au moyen d'un logiciel d'analyse et de traitement d'images implémenté sur un ordinateur de type PC 23' tournant sous le système d'exploitation WINDOWS® 95
(MICROSOFT), d'une image acquise à l'aide d'une caméra vidéo 53 positionnée sur un microscope optique 55 et connectée audit ordinateur par une carte d'acquisition vidéo 57. La caméra 53 travaille en niveaux de gris. Un premier traitement augmentant le contraste, le seuil étant réglé de manière à ce que les agglutinats apparaissent en noir, tandis que les zones dépourvues de particules de latex ou d'agglutinats apparaissent en blanc. A partir de l'analyse de la répartition spatiale bidimensionnelle des zones sombres de l'image, l'ordinateur détermine un index d'agglutination (I) calculé selon la formule :
Surface occupée par les agglutinats de taille supérieure à 60 pixels 1 = Surface occupée par les agglutinats de taille égale ou inférieure à 60 pixels
Cet index d'agglutination est d'autant plus élevé que la taille des agglutinats formés au cours de la réaction d'agglutination est plus importante. L'amplification est considérée comme positive lorsque, lors d'une expérience, l'application des signaux électromagnétiques caractéristiques de l'activité biologique d'Escherichia coli et/ou de l'activité biologique de son anticorps spécifique conduit à l'obtention d'index d'agglutination au moins supérieurs de 40% à l'index d'agglutination maximal obtenu, dans les mêmes conditions, et sur par exemple 3 expériences, après application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de Streptococcus.
2) Résultats :
Le Tableau 1 ci-après présente les index d'agglutination (I) obtenus dans une première série de tests visant à comparer les effets de l'application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'Escherichia coli à ceux observés après application, dans les mêmes conditions réactionnelles, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de Streptococcus, et ce, pour 24
3 dilutions différentes (1/7, 1/7,5 et 1/8) de la solution d'antigène polysaccharidique d'Escherichia coli Kl utilisée comme réactif dans les réactions d'agglutination.
TABLEAU 1
Index d'agglutination (I)
Dilution de la solution d'antigène E. coli Kl Signal Streptococcus Signal E. coli
11 173
1/7 6 52 16 154
58 141
1/7,5 32 117 12 107
10 113
1/8 6 37
8 21
Figure imgf000026_0001
Par ailleurs, les Figures 6 et 7 montrent, à titre d'exemples, des images des agglutinats formés d'une part, après application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de Streptococcus (Figure 6) et, d'autre part, après application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'Escherichia coli (Figure 7). Ces images correspondent respectivement aux index d'agglutination de 32 et de 117 qui sont rapportés à la 5ème ligne de résultats du Tableau 1.
Le Tableau 2 ci-dessous présente, quant à lui, les index d'agglutination (I) obtenus dans une deuxième série d'expérimentations dans le cadre de laquelle les effets de l'application simultanée du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'Escherichia coli et du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'anticorps dirigé contre Escherichia coli, ont été comparés à ceux de l'application simultanée, dans les mêmes conditions réactionnelles, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de Streptococcus et du signal électromagnétique caractéristique de l'activité 25
biologique de l'anticoφs dirigé contre Escherichia coli et ce, pour 2 dilutions différentes (1/7 et 1/7,5) de la solution d'antigène polysaccharidique d'Escherichia coli Kl utilisée comme réactif.
TABLEAU 2
Index d'agglutination (I)
Dilution de la solution d'antigène Signal Streptococcus Signal E. coli
E. coli Kl + +
Signal anticorps Signal anticorps anti-E. coli anti-E. coli
1/7 18 94 71 247
1/7,5 48 212
Figure imgf000027_0001
93 1141
Les Figures 8 et 9 montrent, également à titre d'exemples, des images des agglutinats qui correspondant respectivement aux index d'agglutination de 71 et de 247 rapportés à la 2ème ligne de résultats du Tableau 2. Tous ces résultats mettent clairement en évidence l'aptitude que présente le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'un élément d'un couple ligand/récepteur, à amplifier la formation des complexes formés par la réaction entre ce ligand et ce récepteur et ce, de manière très spécifique, puisque le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'un élément biologiquement actif, mais étranger à cette réaction ne produit, lui, pas d'effet d'amplification.
Ils montrent également que cette amplification est d'autant plus prononcée que l'on applique, aux deux éléments du couple ligand/récepteur, à la fois le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de ce ligand et le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de ce récepteur. 26
EXEMPLE 2 : DETECTION DE LA PRESENCE D'ESCHERICHIA COLI DANS UN ECHANTILLON
L'intérêt de l'utilisation du procédé d'amplification conforme à l'Invention pour la détection d'une substance présente dans un échantillon analytique a été vérifiée en effectuant une série de tests visant à comparer les effets de l'application, sur une réaction d'agglutination entre l'antigène polysaccharidique d'Escherichia coli Kl et un anticoφs monoclonal de souris spécifique de cet antigène identique à celle mise en œuvre dans l'exemple 1 ci-avant, du signal électromagnétique capté à partir d'un échantillon d'un produit alimentaire, en l'espèce une compote de pommes, préalablement contaminé par des bactéries Escherichia coli, avec ceux obtenus lors de l'application, dans les mêmes conditions réactionnelles, du signal électromagnétique capté à partir d'un échantillon témoin, c'est-à-dire non contaminé, du même produit alimentaire. 1) Réalisation des tests : L'acquisition des signaux électromagnétiques des échantillons de compote de pommes (échantillons témoins et échantillons contaminés) a été réalisée au moyen du matériel d'enregistrement de la Figure 2, en plaçant au centre de l'enceinte 13 :
- dans le cas des échantillons témoins, un tube contenant 1 ml de compote préalablement diluée au 1/2 avec du sérum physiologique, et
- dans le cas des échantillons contaminés, un tube contenant 1 ml de compote préalablement diluée au 1/2 avec du sérum physiologique et contaminée, par addition de bactéries Escherichia coli préalablement formulées, à raison de 3.106 bactéries par ml de compote diluée. Les tests ont été réalisés en utilisant comme réactifs :
- d'une part, une suspension contenant des bactéries Escherichia coli préalablement formulées dans du sérum physiologique, à raison de 107bactéries/ml, et 27
- d'autre part, le latex sensibilisé par un anticoφs monoclonal de souris spécifique de l'anticoφs d'Escherichia coli Kl présent dans cette même trousse, après dilution au 1/3 dans du sérum physiologique, et en suivant un protocole opératoire identique à celui décrit au paragraphe c) de l'exemple 1 ci-avant.
2 Résultats :
Le Tableau 3 ci-après présente les index d'agglutination (I) obtenus dans trois séries de tests.
TABLEAU 3
Index d'agglutination (I)
Tests
Echantillons témoins Echantillons contaminés
10 42
Série 1 25 93 27 104
14 30
Série 2 17 153 46 40
Série 3 19 54
34 314
Figure imgf000029_0001
Comme visible sur le Tableau 3, la taille des agglutinats formés au cours de la réaction entre l'antigène polysaccharidique d'Escherichia coli Kl et son anticoφs spécifique est substantiellement plus élevée dans le cas où le signal électromagnétique appliqué au cours de cette réaction a été capté à partir d'un échantillon de compote de pommes contaminé par des bactéries Escherichia coli.
Ces résultats montrent que le procédé d'amplification conforme à l'Invention peut avantageusement être utilisé pour détecter la présence, dans un échantillon analytique, d'une susbtance biologiquement active telle qu'une bactérie, même lorsque cet échantillon présente une composition complexe, c'est-à-dire qu'il 28
renferme, comme dans le cas des échantillons de compote de pommes, de nombreuses autres susbstances biologiquement actives.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement aux formes de réalisation qui viennent d'être décrites de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente Invention.

Claims

29REVENDICATIONS
1. Procédé d'amplification d'une réaction entre les deux éléments d'un couple ligand/récepteur, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact des deux éléments du couple ligand/récepteur dans des conditions propres à permettre leur réaction, et
- préalablement, simultanément ou postérieurement à cette mise en contact, l'application à l'un et/ou l'autre de ces éléments du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'un et/ou l'autre desdits éléments.
2. Procédé d'amplification selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction entre le ligand et le récepteur est réalisée en mettant en contact deux réactifs contenant respectivement le ligand et le récepteur, et on applique, à l'un et/ou l'autre de ces réactifs, un signal électromagnétique à tester et suspecté comprendre le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de ce ligand et ou de ce récepteur.
3. Procédé d'amplification selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'application, à l'un et/ou l'autre des réactifs, du signal électromagnétique à tester est réalisée par exposition d'une solution ou d'une suspension contenant l'un ou l'autre de ces réactifs à ce signal électromagnétique.
4. Procédé d'amplification selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'application, à l'un et/ou l'autre des réactifs, du signal électromagnétique à tester est réalisée par dilution d'une solution ou d'une suspension comprenant l'un et/ou l'autre de ces réactifs, dans un solvant ayant été préalablement exposé à ce signal électromagnétique.
5. Procédé d'amplification selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'application, à l'un et/ou l'autre des réactifs, du signal électromagnétique à tester est réalisée par dissolution ou mise en suspension de ce ou ces réactifs dans un solvant ayant été préalablement exposé à ce signal électromagnétique.
6. Procédé d'amplification selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisé en ce que le solvant ayant été préalablement exposé au 30
signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'échantillon à analyser est de l'eau ou du soluté physiologique.
7. Procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que le signal électromagnétique à tester est le signal électromagnétique capté à partir d'un échantillon à analyser et suspecté contenir le ligand et/ou le récepteur.
8. Procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que le signal électromagnétique à tester est le signal électromagnétique rayonné par une source de rayonnement électromagnétique.
9. Procédé d'amplification selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction entre le ligand et le récepteur est réalisée en mettant en contact un échantillon à analyser et suspecté contenir le ligand et ou le récepteur, avec un réactif contenant soit le récepteur, soit le ligand, et on applique, à cet échantillon et/ou à ce réactif, le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique dudit ligand et/ou dudit récepteur.
10. Procédé d'amplification selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'application, à l'échantillon à analyser, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et ou du récepteur est réalisé par exposition de cet échantillon à ce ou ces signaux électromagnétiques, ou par dilution de cet échantillon dans un solvant ayant été préalablement exposé au(x)dit(s) signal(aux) électromagnétiques.
11. Procédé d'amplification selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que l'application, au réactif destiné à réagir avec l'échantillon à analyser, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et/ou du récepteur est réalisée par exposition d'une solution ou d'une suspension contenant ce réactif à ce ou ces signaux électromagnétiques, ou par dilution d'une telle solution ou suspension dans un solvant ayant été préalablement exposé à ce ou ces signaux électromagnétiques, ou encore par dissolution ou mise en suspension de ce réactif dans un solvant ayant été préalablement exposé au(x)dit(s) signal(aux) électromagnétiques. 31
12. Procédé d'amplification selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on applique, à l'échantillon à analyser et au réactif destiné à réagir avec lui, le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et/ou du récepteur, par exposition d'une solution ou d'une suspension contenant cet échantillon et ce réactif à ce ou ces signaux électromagnétiques, ou par dilution d'une telle solution ou suspension dans un solvant ayant été préalablement exposé au(x)dit(s) signal(aux) électromagnétique(s).
13. Procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'on applique, à l'échantillon à analyser et/ou au réactif destiné à réagir avec lui, à la fois le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et le signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du récepteur.
14. Procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que le solvant ayant été préalablement exposé au(x) signal(aux) électromagnétique(s) est avantageusement de l'eau ou du soluté physiologique.
15. Procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'acquisition du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'un et/ou l'autre des éléments du couple ligand/récepteur.
16. Procédé d'amplification selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'enregistrement et de restitution d'une information représentative du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'un et/ou l'autre des éléments du couple ligand/récepteur.
17. Procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection et, éventuellement, de mesure des complexes résultant de la réaction entre le ligand et le récepteur.
18. Procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le ligand est un antigène ou un haptène, 32
tandis que le récepteur est un anticoφs ou un récepteur membranaire dirigé spécifiquement contre ce ligand.
19. Procédé d'amplification selon la revendication 18, caractérisé en ce que la réaction entre l'antigène et l'anticoφs ou l'haptène et l'anticoφs est révélée par agglutination.
20. Procédé de détection de la présence d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur dans un échantillon analytique, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 9 à 19.
21. Procédé de détection selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de deux réactifs contenant respectivement le ligand et le récepteur, dans des conditions propres à permettre leur réaction,
- préalablement, simultanément ou postérieurement à cette mise en contact, l'application, à l'un et ou l'autre de ces réactifs, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique de l'échantillon analytique, et
- la détection et/ou la mesure des complexes ligands-récepteurs formés au cours de la réaction entre les deux réactifs.
22. Procédé de détection selon la revendication 21, caractérisé en ce que les concentrations du ligand et du récepteur sont choisies de manière à être suffisantes pour conduire à l'obtention de complexes ligands-récepteurs détectables en l'absence de l'application du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique dudit échantillon, mais inférieures aux concentrations susceptibles d'aboutir à une saturation de la réaction entre ce ligand et ce récepteur.
23. Procédé de détection selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de l'échantillon analytique avec un réactif contenant soit le récepteur, si la substance recherchée dans l'échantillon est le ligand, soit le ligand, si la substance recherchée dans l'échantillon est le récepteur, dans des conditions propres à permettre leur réaction, 33
- préalablement, simultanément ou postérieurement à cette mise en contact, l'application, à cet échantillon et/ou ce réactif, du signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique du ligand et ou du récepteur, et
- la détection et/ou la mesure des complexes ligands-récepteurs éventuellement formés.
24. Appareil de détection de la présence d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur dans un échantillon analytique, caractérisé en ce qu'il met en œuvre un procédé selon la revendication 20 et en ce qu'il comporte : a) des moyens (47) de réception de l'échantillon analytique et d'un réactif contenant soit le récepteur, soit le ligand, permettant leur mise en contact dans des conditions propres à permettre leur réaction ; b) une source (5, 9, 9', 19) de signal électromagnétique caractéristique de l'activité du ligand et/ou du récepteur ; c) des moyens (51) d'application du signal délivré par ladite source
(5, 9, 9', 19) de signal électromagnétique à l'échantillon et/ou le réactif ; et d) des moyens (53, 55, 57) de détection et/ou de mesure des complexes ligands-récepteurs formés au cours de la réaction entre l'échantillon et le réactif.
25. Appareil de détection de la présence d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur dans un échantillon analytique, caractérisé en ce qu'il met en œuvre un procédé selon la revendication 20 et en ce qu'il comporte : a) des moyens (47) de réception de deux réactifs contenant respectivement le ligand et le récepteur, permettant leur mise en contact dans les conditions propres à permettre leur réaction ; b) des moyens d'acquisition d'un signal électromagnétique de l'échantillon analytique ; 34
c) des moyens (51) d'application du signal délivré par lesdits moyens d'acquisition (5, 9, 9', 19) de signal électromagnétique à l'un et ou l'autre des réactifs ; et d) des moyens (53, 55, 57) de détection et ou de mesure des complexes ligands-récepteurs formés en cours de la réaction entre les deux réactifs.
26. Appareil selon la revendication 24 ou la revendication 25, caractérisé en ce que les moyens de détection comportent des moyens de détection optique.
27. Appareil selon l'une quelconque des revendications 24 à 26 caractérisé en ce qu'il comporte une enceinte (13) munie d'un blindage électrique et magnétique entourant lesdits moyens de réception (47).
28. Application d'un procédé de détection de la présence d'une substance dans un échantillon analytique selon l'une quelconque des revendications 20 à 23 au diagnostic biologique en médecine humaine ou vétérinaire.
29. Application d'un procédé de détection de la présence d'une substance dans un échantillon analytique selon l'une quelconque des revendications 20 à 23 au contrôle bactériologique dans l'industrie pharmaceutique, l'industrie cosmétique, les productions et industries alimentaires.
30. Procédé de détection de la présence, dans un signal électromagnétique à tester, d'un signal électromagnétique caractéristique de l'activité biologique d'une substance correspondant à l'un des deux éléments d'un couple ligand/récepteur, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et 15 à 19.
31. Procédé de détection selon la revendication 30, caractérisé en ce que le signal électromagnétique est le signal électromagnétique rayonné par une source de rayonnement électromagnétique.
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