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WO1998038213A1 - Inhibiteur de la transmission de signaux intracellulaires - Google Patents

Inhibiteur de la transmission de signaux intracellulaires Download PDF

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WO1998038213A1
WO1998038213A1 PCT/JP1998/000836 JP9800836W WO9838213A1 WO 1998038213 A1 WO1998038213 A1 WO 1998038213A1 JP 9800836 W JP9800836 W JP 9800836W WO 9838213 A1 WO9838213 A1 WO 9838213A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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dna
gly
protein
arg
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1998/000836
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hideaki Yoshida
Toshiaki Ohtsuka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Cytosignal Research Inc
Original Assignee
Institute of Cytosignal Research Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Cytosignal Research Inc filed Critical Institute of Cytosignal Research Inc
Priority to AU61184/98A priority Critical patent/AU6118498A/en
Publication of WO1998038213A1 publication Critical patent/WO1998038213A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a protein having an activity of suppressing the activation of IL-8 promoter in response to a specific extracellular stimulus, a DNA encoding the protein, a vector containing the DNA, a host holding the vector, The present invention relates to an antibody against the protein, and a pharmaceutical composition containing the protein as an active ingredient.
  • Interleukin-8 (hereinafter referred to as “IL-8”) is a type of site-active protein that is a proteinaceous chemical that is responsible for signal transmission between cells. IL-8 is known as a site force-in with effects such as neutrophil migration, lymphocyte migration, neutrophil activation, and angiogenesis (Matsushima, K. et. Al. J. Exp. Med.167, 1883-93 (1988), Larsen, G.et.al.Science 243,1464-6 (1989), Daniels, RHet.al.Immunol.75, 157-63 (1992), Koch, AE et. al. Science 258, 1798-804 (1992), Harada, A. et al. Mol. Med. Today 2, 482-489 (1996)).
  • IL-8 in addition to these normal functions in living organisms, inflammation (Watanabe, K. et al Infection & Immunity 60, 1268 (1992)) and reperfusion tissue damage in myocardial infarction (reperfusion injury) (Sekido, N. et al. Nature 365, 654-657 (1993)).
  • IL : 8 Since the relationship between IL : 8 and various diseases has been elucidated in this way, pharmaceuticals targeting IL-8 are also being developed.
  • a drug discovery example based on the anti-inflammatory activity of anti-IL-8 antibody (Sekid 0, N. et. Al. Nature 365, 654-657 (1993)) is described (Nikkei Bio Yearbook 97, 321, 1996). ).
  • an object of the present invention is to provide a factor having an anti-inflammatory effect that does not have such a problem, particularly a factor having an activity of suppressing activation of an IL-8 promoter.
  • IL-8 As a finding related to IL-8, expression of IL-8 is observed in many inflammations (Watanabe, K., et al. Infection & Immunity 60, 1268 (1992), Matsushima, K. et al. Chem Immunol 51, 236-265 (1992)) and that inflammation is suppressed when IL-8 function is inhibited by IL-8 antibody (Harada, A. et al. Int. Immunol. 5 681-). 690 (1993) and Sekido, N. et al. Nature 365 654-657 (1993)). Therefore, it is considered that the expression of IL-8 is closely related to inflammation.
  • dexamethasone which is known as an anti-inflammatory steroid, has an inhibitory effect on the activation of the IL-8 promoter overnight (Mukaida N. et al. J. Immunol. 146 1212- 1215 (1991), Mukaida, NJ Biol. Chem. 269 13289 (1994)).
  • the gene becomes a promising candidate for a gene that encodes a protein that has an inhibitory effect on the activation of IL-8 promoter, and as a result, anti-inflammatory Protein with action ⁇ ⁇ ⁇ It is considered to be a strong candidate for a gene encoding quality.
  • the present inventors attempted to isolate a gene whose expression is induced by dexamethasone treatment.
  • screening by the subtraction method and the differential hybridization method using a cDNA library extracted from cells treated with dexamethasone and a cDNA library extracted from cells not treated with dexamethasone We succeeded in isolating a gene whose expression was induced in the treated cells.
  • the present inventors examined whether the isolated gene suppressed the activation of the IL-8 promoter. As a result, it was found that the isolated gene actually suppressed the activation of the IL-8 promoter by IL-1 stimulation.
  • the present inventors determined the nucleotide sequence of the isolated gene and performed a homology search on a DNA database basis, and found that the gene was a novel gene that had not been isolated before. Was found to be a gene.
  • the present invention relates to a factor that suppresses activation of the IL-8 promoter, and more specifically,
  • the protein according to SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in the protein, which has an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added, and responds to a specific extracellular stimulus A protein having an activity of suppressing the activation of the IL-8 promoter,
  • the protein of SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence in the protein having one or several amino acids substituted, deleted, or added, and responded to a specific extracellular stimulus A protein having an activity of suppressing the activation of the IL-8 promoter, (4) a protein encoded by a DNA that hybridizes to the DNA of SEQ ID NO: 4, which has an activity of suppressing activation of an IL-8 promoter in response to a specific extracellular stimulus ,
  • the present invention relates to a protein having an activity of suppressing activation of an IL-8 promoter in response to a specific extracellular stimulus.
  • IL-1 Crin. Immunol. 2718-28 (1995)
  • IL-8 Clin. Immunol. 2780-85 (1995)
  • TNF Molecular Medicine 33 1010-1020 ( 1996)
  • IL-8 production is induced by stimulation of IL-1 and TNF (Mukaida, N. et al. Icrobiol. Immunol., 36773 (1977). 992)).
  • IL-8 gene is induced through an intracellular signal transduction process based on the binding of IL-1 and TNF to cell membrane receptors.
  • the protein of the present invention has a property that its expression is induced by treatment with dexamethasone, an anti-inflammatory agent, and a property that it inhibits the activity of IL-8 promoter by inhibiting the above-mentioned intracellular signal transmission process. Have. From these facts, it is considered that the protein of the present invention has an anti-inflammatory effect.
  • the protein of the present invention may be of natural origin or a recombinant protein produced using genetic engineering techniques.
  • a natural protein can be prepared, for example, using an affinity column to which the antibody of the present invention described later is bound.
  • the recombinant protein can be prepared, for example, using the transformant of the present invention described below.
  • the protein of the present invention also includes a variant in which an amino acid has been substituted, deleted, or added to a native form (for example, the protein described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3).
  • a variant may occur naturally, but those skilled in the art, for example, synthesize a double-stranded DNA using the single-stranded DNA of the target gene as type III and the mutant oligonucleotide as a primer, Various methods based on the principle of eliminating DNA derived from normal type II genes and selecting plasmids derived from mutant DNA strands using genetic techniques (Lesley, SA and Bohnsack, RN, Promega Notes Magazine, 46, 6-10 (1994), Kunkel, T. et al.
  • amino acid sequence of the amino acid sequence of the protein described in SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, or added.
  • SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3
  • amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, or added has been substituted, deleted, or added.
  • IL-8 promoter in response to extracellular stimuli in mice
  • a protein having an activity of suppressing the formation of an enzyme is included in the scope of the present invention. _
  • a protein encoded by a DNA that hybridizes with the DNA consisting of the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4), and the activity of the IL-8 promoter in response to a specific extracellular stimulus Proteins having the activity of inhibiting the formation of proteins are also included in the scope of the present invention.
  • the protein obtained by the hybridization technique preferably has a homology of 60% or more, more preferably 80% or more, with the protein of the present invention described in SEQ ID NO: 1 or 3 in the amino acid sequence. More preferably, the homology is more preferably 90% or more.
  • the activity of suppressing the activation of the IL-8 promoter in response to a specific extracellular stimulus can be measured, for example, by detecting a reporter gene as a marker.
  • reporter genes include, but are not limited to, white luciferase (de Wet, JR et al. Mol. Cell. Biol. 7, 725-737 (1987)), and mushroom luciferase (Sherf, BA et al. Prome ga Note 57, 2-9 (1996)), CAT (chloramphenico-l-acetyltransferase) (Gorman, CM et al. Mol. Cell. Biol.
  • ⁇ -galactosidase Jain, V. et al. Anal.Biochem. 199, 119-124 (1991)
  • glucuronidase Gallagher, SR GUS Protocol: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Acasemic Press 47-59 (1992)
  • Azore force phosphatase Cullen, B. et al. Methods in Enzymology 216, 362-368 (19 92)
  • site power-in include — for example, IL-1, TNF, etc., but are not particularly limited as long as they cause activation of IL-8.
  • the present invention also relates to a DNA encoding the protein of the present invention.
  • the form of the MA encoding the protein of the present invention is not particularly limited.
  • chemically synthesized DNA is also included in the DNA of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be prepared, for example, by the following method. If it is a cDNA, first, a cDNA library is prepared to obtain the cDNA. A cDNA library is obtained by ligating a cDNA synthesized based on mRNA purified from cells producing the protein of the present invention to an appropriate vector having a microbial replicon, and then introducing it into a suitable host. It is made. As a method for synthesizing cDNA from the purified mRNA, a method using an oligo dT primer or a random primer, a method using a synthetic primer having a specific base sequence, and the like are usually used.
  • a vector used for library production for example, a plasmid vector, a phage vector, a cosmid vector, a phagemid vector, a YAC vector, and the like are mainly used.
  • a host for example, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis and the like are mainly used.
  • a method for selecting clones having cDNA of the present invention for example, using those labeled with the Origonukureo tides comprising the nucleotide sequence of the DNA of the present invention 3 2 P, an enzyme such as a probe
  • an enzyme such as a probe
  • RT-PCR Yamamoto, ES and Wang, AM, PCR Technology (Erlich, HA ed.) Stockton Press, 89-97 (1989), etc.
  • cDNA can be prepared by expression screening using Escherichia coli or the like as a host.
  • genomic DNA the cells are lysed using the appropriate cells of the target organism as a material, and the proteins bound to genomic MA are removed using a protein denaturant and protease.
  • DNA In the case of chemically synthesized DNA, it is produced by nucleic acid chemical synthesis according to a conventional method such as the phosphite triester method (Hunka piller, M. et al. Nature, 3, 10. 105-111 (1984)). can do.
  • the codon for the desired amino acid is known per se and may be selected arbitrarily. For example, it can be determined according to a conventional method in consideration of the codon usage of the host to be used (Grantham, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, p43-p74 (1981)).
  • the nucleotide sequence of the DNA of the present invention thus cloned can be analyzed by a dideoxy method using a radiolabel or a fluorescent label, the Maxam-Gilbert method, or the like.
  • the present invention also relates to a vector into which the DNA of the present invention has been inserted.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it can be propagated and replicated in a host cell (for example, Escherichia coli, yeast, animal cells, etc.) and has an appropriate selection marker gene.
  • E. coli for example, r p Bluescipt II "(STRATAGENE Co., Ltd.),” p CR T “II” (Invitrogen), and the like.
  • yeast for example, “pSR403j (Sikorski RS and Hieter, P., Genetics, 122, 19-27 (1989))”, etc.
  • pCDM8 Seed, B., Nature, 329, 840-842 (1987)
  • pSV2-neo Southern and Berg, J. Mol. App 1. Genet., 1, 327-341, (1982)
  • an expression vector is particularly useful. There are no particular restrictions on the expression vector as long as it is generally one to which a promoter 'and a control sequence compatible with the host cell are added.
  • pKC30 Shimatake, H, and Rosenberg, M., Nature, 292, 128-132, (1981)
  • pTrc 99A Align, E. et al., Gene, 69, 30 1-315, (1988)
  • pCAGGS Niwa et al., Gene, 108, 193-200, (1991)
  • pcDL-SR 293 Takebe et al. Mo 1. Cell. Biol., 8, 466-472, (1988)
  • pAdexlw a transfer vector for adenovirus production (Kanegae et al., Experimental Medicine, 12, 316). -322, (1994)).
  • the insect cells include a transfer vector for recombinant virus production, pAc373 (Luckow et al., Bio / Technology, 6, 47-55, (1988)).
  • Insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed by a conventional method (Molecular Cloning. A Laboratory logistic (Maniatis, T., et al (eds), Cold Spring Habor Laboratory Press, New York)) or a laboratory manual genetic engineering (Muramatsu edition). , Maruzen))).
  • the present invention also relates to a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cells into which the vector of the present invention is introduced include prokaryotes (eg, Escherichia coli) and eukaryotes
  • Cells eg, yeast, mammals, insects
  • suitable Escherichia coli strains include "X-Blue”, “SURE”, “DH5" (all available from RIKEN Genebank).
  • prokaryotic eg, Escherichia coli
  • eukaryotic eg, yeast, mammal, insect cells and the like can be used as host cells.
  • animal cells examples include “C0S-1 cell” (RIKEN Cell Development Bank, RCB0143), human embryonic kidney line (293) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Baby-Hamus Yuichi kidney cell (BHK, ATCC) CCL10), Chinese hamster ovary cells (CH0-Kl, RIKEN Cell Development Bank, RCB0285), Monkey kidney cells (CV 1, ATCC CCL70).
  • yeast examples include baker's yeast (Saccharomyces cerevisae) and ethanol-assimilating yeast (Pichia pastoris).
  • insect cells include silkworm cultured cells.
  • the introduction of the vector into the host cell can be carried out using a calcium phosphate method or an electroporation method, which is common to those skilled in the art.
  • a host cell into which the above-described vector has been introduced that is, a transformant is cultured, and the recombinant protein expressed in the transformant is recovered. It is possible to manufacture.
  • the transformant can be cultured according to a conventional method, and the protein of the present invention is produced intracellularly or extracellularly by the culture.
  • the medium used for the culture can be appropriately selected from those commonly used depending on the host cell used.
  • the “RPMI-1640” medium or the Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium ( A medium such as DMEM) to which serum components such as fetal bovine serum (FBS) are added as necessary can be used.
  • the recombinant protein expressed in the cultured transformant can be separated and purified by various known separation procedures utilizing the physical and chemical properties of the protein. Separation and purification methods include, for example, treatment with ordinary protein precipitants, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), various types of liquid chromatography such as adsorption chromatography, high-performance chromatography (HPLC), and dialysis. And combinations thereof.
  • the present invention also relates to an antibody that reacts with the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a monoclonal antibody as well as a polyclonal antibody. Also included are humanized antibodies and all antibody classes.
  • the antibody of the present invention can be prepared by a conventional method known to those skilled in the art (New Cell Engineering Experimental Protocol, edited by Cancer Inhibition Research Division, Institute of Medical Science, The University of Tokyo, 202-217 (1993), etc.). It is.
  • the antigen include the whole protein of the present invention (for example, the protein of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3) produced using recombinant DNA technology.
  • an appropriate partial peptide thereof for example, the peptides described in SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 30) can be used.
  • Antisera can be obtained from these animals with increased antibody titers, or cells can be collected to obtain polyclonal antibodies.
  • an animal having an increased antibody titer against the antigen is used as a source of antibody-producing cells.
  • spleen cells prepared from immunized mouse spleen and mouse-derived myeloma By screening a hybridoma obtained by fusing cells, a monoclonal antibody specific to the protein of the present invention can be obtained. Furthermore, it is also possible to clone an antibody gene or a part thereof from a cell expressing the antibody of the present invention, and to express this by genetic engineering to obtain an antibody or a part thereof. It is also possible to obtain humanized antibodies.
  • the antibody of the present invention can be used as an excellent means for detecting, quantifying, and further purifying the protein of the present invention.
  • the quantitative method includes the Radioimnoassay (MA) method (Kitakawa et al., Radioimnoassay (New Chemistry Laboratory 12), 79-88, Tokyo Kagaku Doujin (1992)) (EIA) method (Ishikawa et al., Enzymimnoadisei (New Chemistry Laboratory Course 12), 88-99, Tokyo Kagaku Dojin (1992)) and the like.
  • MA Radioimnoassay
  • EIA Errawa et al., Enzymimnoadisei (New Chemistry Laboratory Course 12), 88-99, Tokyo Kagaku Dojin (1992)
  • a purification method is, for example, an affinity chromatography method in which the antibody of the present invention is bound to an insoluble support (Nishimichi et al., Affinity Chromatography Using Immobilized Antibodies (New Biochemistry). Chemistry Experiment Course 1), 403-406, Tokyo Kagaku Dojin (1990)).
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the protein of the present invention as an active ingredient.
  • the protein of the present invention has an activity of suppressing activation of the IL-8 promoter.
  • the protein of the present invention also has a property induced by dexamethasone which is an anti-inflammatory agent. Therefore, the protein of the present invention is useful as an agent for treating various diseases associated with the expression of IL-8, particularly as an anti-inflammatory agent.
  • Diseases to which the protein of the present invention can be applied include, for example, rheumatoid arthritis, gouty arthritis, psoriasis, contact dermatitis, sepsis, idiopathic pulmonary fibrosis, adult respiratory distress syndrome, inflammatory bowel disease , Immune vasculitis, glomerulonephritis, urinary tract infection, myocardial infarction, respiratory tract infection, bronchial asthma, perinatal infection, transplant organ rejection and the like.
  • the protein of the present invention can be directly administered, or can be used after being formulated by a known pharmaceutical production method.
  • FIG. 1 is an electrophoresis image of Northern blot hybridization detecting expression of rat "GISP” mRNA by treatment with the anti-inflammatory drug dexamethasone (Dex).
  • FIG. 2 is an electrophoresis image of rat “GISP” mRNA expression in rat and human tissues detected by Northern blot hybridization.
  • FIG. 3 shows a comparison of amino acid sequences between human and rat “GISP”.
  • the upper row is the amino acid sequence of rat “GISP”, and the lower row is the amino acid sequence of human “GISP”.
  • Figure 4 shows the effect of the expression of the “GISP” gene on the light CINC Promoter activity (A) and the elongation factor 1-1 activity (B) by the reporter gene method. It is a figure showing a detection result.
  • Figure 5 shows the effect of the "GISP” gene on the human IL-8 promoter activity (A) and the elongation factor 1-1-hyperpromotor activity (B) detected by the repo-Ichiichii gene method. It is a figure showing a result.
  • Genetic manipulation techniques that are not specifically described include “Molecular Cloning. A Laboratory Ma Thigh 1” (Maniatis, T., et al (eds), Cold Spring Habor Laboratory Press, New York) and laboratory manual genetic engineering (Muramatsu And Maruzen Co., Ltd.). General reagents used in genetic engineering experiments, such as restriction enzymes, were purchased and used from Boehringer Mannheim, Takara Shuzo.
  • Anti-inflammatory steroid-treated or untreated NRK52E cells (cultured cells derived from rat kidney) (Dainippon Pharmaceutical) and poly (A) + RNA were prepared.
  • Steroid treatment cells are lipopolysaccharide Sa steward Lai de (LPS) 10 zg / ml RPMI1640 containing medium (LIFE TECHNO LOGIES, Inc., Inc.) was cultured overnight NRK52E cells, about 2.5Xl0 8 cells anti-inflammatory (hereinafter abbreviated as Dex) scan Teroi de of which is one type dexamethasone (final concentration 1x10 one 6 M, dissolved in ethanol) were further cultured for 5 hours with the addition of the.
  • Dex lipopolysaccharide Sa steward Lai de
  • Dex anti-inflammatory
  • the integration of the cDNA into the phage vector was performed using a ZAP-cDNA synthesis kit (ZAP-cDNA SYNTHESIS KIT) (manufactured by STRATAGENE, Toyobo). The process is described below. The operation was performed according to the instruction manual of the ZAP-cDNA synthesis kit. That is, a first-strand cDNA synthesis reaction using reverse transcriptase (M-MuLV Reverse Transcriptase) was performed using 5 ⁇ g each of Dex (+) mRNA and Dex ( ⁇ ) mMA as templates. Subsequently, a second strand synthesis reaction using E. coli RNase H and E. coli DNA polymerase was performed.
  • ZAP-cDNA SYNTHESIS KIT manufactured by STRATAGENE, Toyobo.
  • coli PLK-F (STRATAGENE, Toyobo), and about 50,000 pieces of 20-cm 15 cm plates
  • SM buffer NaCl 5.8 g, M gS0 4 - 7H 2 02.0g, lM Tris -HCl (pH7.5) 50ml, and allowed to stand overnight by adding 3 ⁇ 4 gelatin (gelatin) _50ml / l physician 1 0 ml.
  • a phage solution of two plates (containing about 107 recombinant phages) was stored as two sub-libraries, and a mixture of equal amounts of 10 sub-libraries was stored as an entire library. .
  • the entire library was designated as "NRK-52E cell Dex (+) phage library 1" and "NRK-52E cell Dex (-) phage library”.
  • Escherichia coli cultured to "0D 6O . 5.0" in 5 ml of XLlBlue MRF'j (STRATAGENE, Toyobo) ("Helper phage ExAssistj (l.Ox10 10 pfu / ml) (STRATAGENE, Toyobo) lml, and NRK-52E cells
  • XLlBlue MRF'j STRATAGENE, Toyobo
  • Helper phage ExAssistj l.Ox10 10 pfu / ml) (STRATAGENE, Toyobo) lml, and NRK-52E cells
  • Dex (+) phage library (7.0xl0 9 pfu / ml) 700 ⁇ 1 were mixed and incubated for 15 minutes at 37 ° C. then tetracycline ( Was added to 251111, and incubated at 37 ° C (2.5 hours).
  • M08Helper phage j (STRATAGENE, Toyobo) (7.5 ⁇ 10 1 ° pfu / ml) 140 ⁇ 1
  • the cells were cultured for 8 hours at 37 ° C to produce single-stranded phage, and the supernatant was recovered by centrifugation at 12,000 g for 10 minutes (4 ° C).
  • One-quarter volume of a solution containing 3.5 M ammonium acetate and 20% PEG was added and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to precipitate single-stranded phage particles.
  • the single-stranded phage particles were collected as a precipitate by the centrifugation procedure described in step 1.
  • the resulting precipitate was suspended in 10 ml of TE buffer, then extracted with phenol (TE saturated), and phenol: chloroform (1: 1). Extraction and chloroform extraction were performed once each, and 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 5.2) and 2 volumes of ethanol were added. After keeping the temperature at-20 ° C, centrifugation at 12,000 g was performed for 10 minutes at 4 ° C to recover the DNA.
  • the recovered DNA was rinsed with 70% ethanol, lightly dried, and then TE buffer 300 Dissolved in # 1 About 300 mg of DM was finally obtained.
  • the enzyme is digested with restriction enzymes and the phenol is extracted in the presence of magnesium ions (Nucleic Acid Res. 18.4833-4842 (1990). )). Specifically, 100 ⁇ g of the above marauder was digested with restriction enzymes Bgll I (10u 1) 10/1 and PvuI I (10u / ⁇ l) 10 // 1. To the reaction mixture (300/1), add 10% SDS 3 il (final concentration 0.1%) and 0.5 M EDTA 7.5 ⁇ 1 (final concentration 12.5 mM), mix, and then mix phenol (Tris-HC1 buffer (PH7.5) (Saturated).
  • the upper layer (aqueous layer) was recovered.
  • the buffer layer was re-extracted by adding 300-1 Buffer-1 to the lower layer (phenol layer), and the upper layer solution after centrifugation was combined with the previous upper layer (aqueous layer) to proceed to the next step.
  • Add a lOOmM MgCl 2 solution in 300/1 TE buffer mix vigorously, and centrifuge at 16,000 g for 10 minutes.
  • the step of removing the aqueous layer was performed twice to remove double-stranded DNA.
  • the single-stranded DNA was transferred to the aqueous layer by centrifugation at 16,000 g for 10 minutes, and the aqueous layer was recovered.
  • 100 zl of 50 mM EDTA was added again, and the aqueous layer was recovered by the same operation and combined with the previous aqueous layer.
  • 1/10 volume of sodium acetate was added, and 2.5 times volume of ethanol was further added, and DNA was recovered by an ethanol precipitation method. Finally, about 30 ⁇ g of single-stranded DNA was obtained.
  • a solution containing NRK-52E cell Dex (-) phage library add an equal volume of a solution (203 ⁇ 4 PEG 2M NaCl dissolved in SM buffer), incubate on ice for 1 hour, and run at 3,000 rpm The phage particles were collected by centrifugation for 20 minutes. The precipitate of the phage particles is suspended in 7.5 ml of LB medium, an equal amount of “DE (DIETHYLAMINOETHL CELUL0SE) 52” (manufactured by Whatman) (suspended in LB medium) is added, mixed, and then mixed at 15,000 rpm for 5 minutes.
  • DE DIETHYLAMINOETHL CELUL0SE
  • Unnecessary substances other than the phage particles were adsorbed and removed on DE52 by performing the centrifugation operation of and collecting the centrifuged supernatant. After adding proteinase K (final concentration 200 zg / ml) and 10% SDS (final concentration 0.1%) to the collected supernatant and incubating at room temperature for 5 minutes, 3M potassium acetate (final concentration 0.5M) was added. The mixture was heated at 88 ° C for 20 minutes. After standing on ice for 10 minutes, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, an equal volume of isopropanol was added to the supernatant, and DNA was precipitated at -20 ° C and collected by centrifugation. The obtained phage DNA was dissolved in a TE (pH 8.0) buffer.
  • RNase-free DNasel (8 ⁇ 1) was added for the purpose of removing type I DNA and incubated at 37 ° C for 15 minutes.
  • add 240 ⁇ 1 of RNase-free sterile water and 2001 of lithium chloride solution (attached to MEGAscript T ), leave at -20 ° C for 30 minutes, and centrifuge at 15,000 rpm for 15 minutes.
  • the RNA was recovered as a precipitate, rinsed with 70% ethanol, dissolved in 100 ⁇ 1 TE (pH 8.0) buffer, and the yield was measured, yielding about 500 ⁇ g of biotinylated RNA. .
  • VECTRE-AVIDIN VECTOR LABORATORIES, manufactured by Funakoshi
  • "Potinated copy RNA” and “hybridized product of biotinylated copy MA and single-stranded circular DNA” were removed.
  • add 250m of “VECTREX-AVID ⁇ _ ⁇ ” (equilibrated in advance with lOOmM Tris-HCl (pH 7.5) and OmM NaCl buffer) per 25mg of the biotinylated copy RNA for 2 hours at room temperature.
  • the composition of the reaction mixture was lxTaq DNA Polymerase-zebuffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCK 1.5 mM MgCL, 0.001% gelatin), and 0.2 mM each.
  • the final concentrations were dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), and primer DNA (synthetic DNA (SEQ ID NO: 5)).
  • dNTPs dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  • primer DNA synthetic DNA
  • Escherichia coli transformants were transformed into L medium (trypton 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g, pH 7.5) containing 2 ml of ampicillin (50 ⁇ g / ml). 1L) overnight, and the plasmid DNA was purified using a plasmid automatic separation device (Clavo, PI-100). An equivalent amount of an alkaline solution (3M NaCl, 1N NaOH) 'was added to the TE buffer in which those DNAs were dissolved, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Then, an equivalent amount (2 / 1) Two spots were created, and two identical fills were created.
  • L medium trypton 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g, pH 7.5
  • ampicillin 50 ⁇ g / ml
  • 1L plasmid automatic separation device
  • First strand cDNA synthesis reaction was performed using reverse transcriptase “Super Script TM II” (manufactured by GIBCO BRL) with 5 ⁇ g each of Dex (+) mRNA and Dex ( ⁇ ) mRNA as a template. Subsequently, a second strand synthesis reaction using E. coli RNase H and E. coli DNA polymerase (STMTAGE NE, Toyobo) was performed. Thus obtained et the two cDNA it it to hexa nucleotides, Klenow fragment, Non - 32 P] probe was 32 P labeled with multi-prime DNA labeling system (manufactured by full Alma shear Biotech) using dCTP like Produced.
  • the composition of the pre hybrida I See Chillon solution (final concentration), 5xSSPE (20xSSPE: 3.6M NaCl, 0.2 M sodium phosphate (pH7.7), 0.02M Na 2 EDTA ), 5x Denhardt's solution (100x Denhardt's solution: 2% (W / V) BSA (bovine serum albumin), 2% (W / V) Ficoll 400, 2% (W / V) polyvinylpyrrolidone (PVP)), 0.5% SDS and heat-denatured 20 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA.
  • 5xSSPE 20xSSPE: 3.6M NaCl, 0.2 M sodium phosphate (pH7.7), 0.02M Na 2 EDTA
  • 5x Denhardt's solution 100x Denhardt's solution: 2% (W / V) BSA (bovine serum albumin), 2% (W / V) Ficoll 400, 2% (W / V) polyviny
  • hybridization was performed in a solution obtained by adding a 32 P-labeled probe to a new prehybridization solution, and further kept at 65 ° C. for 18 hours.
  • Filtration is performed using a 2xSSPE solution containing 0.1% SDS at 65 ° C for 30 minutes. Washing was performed once with an O.lxSSPE solution containing 0.1% SDS at 65 ° C for 30 minutes. After washing, the filter was affixed to filter paper (Whatman 3MM), exposed to an imaging plate (manufactured by Fuji Film Co., Ltd.), and analyzed using a “Bio Image Analyzer Bas 2000” (manufactured by Fuji Film Co., Ltd.).
  • MRNA (poly (A) + RNA) was prepared from N52E cells subjected to various steroid treatment conditions according to the method described in (1) of [Example 1]. Subsequently, Northern plot analysis was performed according to a conventional method. That is, poly (A) + RNA of each sample was electrophoresed on a 0.8% agarose gel containing formaldehyde. After the electrophoresis, the RNA was transferred from the gel to a nylon filter (Biodyne A, manufactured by Nippon Pol Co., Ltd.) using capillary action. The DNA was immobilized on the membrane by UV treatment of the filter. On the other hand, a probe used for hybridization was prepared as follows.
  • Escherichia coli clones of plasmid DNA (hereinafter referred to as “pBlue-r # 5”) containing the rat “GISP” gene are cultured and the nucleic acid separation / purification chip “QIAGEN-tip 500” (QIAGENinc. Funakoshi Co., Ltd.) was used to prepare plasmid DNA. 10 ⁇ g of this plasmid DNA is treated with restriction enzymes XhoI and EcoRI, electrophoresed on a 0.8% low-melting-point agarose gel, and a DNA fragment inserted into a vector of about 0.3 kb is cut out.
  • PrepA- gene was purified by Matrix j (manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories Ichizu Co.) thus prepared DNA (approximately 30 ng) and the hexa nucleotides, click Renou fragment, [shed - 3 2 P]. multi-prime using dCTP like the 3 2 P-labeled probe was prepared by labeling method.
  • the hybridization between Phil Yuichi and the above probe is Northern Plot High. This was performed according to the standard method of bridging.
  • the filter was placed in a plastic bag, filled with a prehybridization solution for Northern plot, and incubated at 65 ° C for 4 hours with shaking.
  • the composition of the prehybridization solution was ⁇ 50% (W / V) formamide, 5xSSPE, 5x Denhardt's solution, 2% (W / V) Ficoll 400, 2% (W / V) polyvinylpyrrolidone (PVP)), 0.5% SDS and heat denatured 20 g / ml salmon sperm DNA.
  • Lanes 2, 4, and 6 show the mRNA of cells treated with dexamethasone
  • lanes 1, 3, and 5 show the mRNA of cells not treated with dexamethasone
  • Lanes 1, 3, and 5 show the lysis of dexamethasone.
  • the cells treated with dexamethasone in lanes 2, 4, and 6 and the same time (lanes 1 and 2: 2 hours, lanes 3 and 4: 6 hours, Lanes 5 and 6: 24 hours).
  • the sequencing reaction was performed using “Taq DyeDeoxy TM Termination Cycle Sequncing Kit” (manufactured by Applied Biosystems) according to the protocol. After completion of the reaction, the reaction product purified by a spin column (Bio-Spin 30 manufactured by Bio-Rad) was analyzed by a DNA sequencer (ABI 373A DNA Sequencing System). Using the homology search system “GeneBright” (manufactured by Hitachi Software) for the obtained DNA base sequence, a homology search was performed for GeneBank Release 97, which is a DNA database. It turned out to be a gene.
  • a synthetic MA primer (“synthetic DNA (SEQ ID NO: 6)” and “synthetic DNA (SEQ ID NO: 7)”) that binds to the DNA portion of the phage vector and the primer of “pBlue-r # 5” DNA primers (“synthetic DNA (SEQ ID NOs: 8-11)”) that bind to the cDNA are prepared, and the phage DNA contained in each sub-library is subjected to PCR to perform PCR, and “pBlue-r # 5” It was examined whether there was a supply library in which a longer PCR product was amplified than in the case of ⁇ .
  • the reaction composition of PCR is the same as in the above (3-3), except that the temperature conditions are “94 ° (for 1 minute)”, “60 ° C for 1 minute”, “72 ° C for 2 minutes”. As a result, bands of several sizes were observed. Furthermore, in order to detect those having the insert cDNA sequence of pBlue-r # 5j in the PCR reaction products, The PCR reaction product was electrophoresed on a 0.8% agarose gel and transcribed to Nylon Fil Yuichi according to a conventional method. The screening probe was as described in (5) of [Example 1] above. pBlue-r # 5 "to about 0.3 kb cDNA fragments was a 3 2 P-labeled by use of a.
  • the phage was adsorbed from the plate to a nylon filter “GeneScreen TM Plus Hybridization Transfer Membrane j” (manufactured by Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) to prepare screening filters for screening. For 5 minutes, and then neutralized by treatment with 1 M Tris-HCl (pH 7.5) for 5 minutes, followed by UV treatment to immobilize the DNA. It was the use of a fragment of about 0.3kb cMA of "pBlue- r # 5" 3 2 P-labeled by. Positive plaques were picked from the results of the plaque hybridization and transferred to 1 ml of SM buffer.
  • plaques were again formed on the plate, and the steps of making a filter and hybridization with a probe were repeated to isolate a single clone.
  • the obtained phage clone was converted from a ZAP phage vector into a plasmid (pBluescript SK-) by the method described in (3-1)-(A) of (3) in [Example 1], and the inserts thereof were inserted.
  • the DNA base sequence of the cDNA was determined.
  • the plasmid of a clone having an insert cMA of less than 1.2 kb was named “pBlue-r # 5 1.2”.
  • the DNA base sequence of the insert cDNA of “ ⁇ 1 ue-r # 5 1.2” was determined, it contained the entire sequence of the insert cDNA of “pBlue-r # 5”. It turned out to be.
  • Example 2 Confirmation of expression of “GISP” gene in rat and human tissues
  • mRNAs from various tissues were transcribed.
  • Northern plot analysis was carried out using Yuichi Nichiru (CL0NTECH, Toyobo). After purification of the DNA fragment of about 1.2kb obtained by cutting the "pBlue-r # 5 1.2" DNA restriction enzymes EcoRI and Xhol as probes, using 3 2 those P-labeled. Other experimental conditions are as shown in [Example 1] (5).
  • Figure 2 shows the results. In the rat, a band of about 2 kb was detected in the various cells examined, but high expression was observed particularly in the heart, skeletal muscle, and kidney.
  • FIG. 2 A in the figure indicates poly (A) + RNA in each tissue of the rat (heart, brain, spleen, lung, liver, skeletal muscle, kidney, testis) B shows poly (A) + RNA detected in human tissues (in order from lane 1 to 8, heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, and kidney).
  • C is poly poly (A) + RNA detected in human tissues (in order from lane 1 to 8, spleen, thymus, prostate, testis, ovary, small intestine, large intestine, and peripheral blood leukocytes). This figure shows the detection of poly (A) + RNA from human fetal tissues (brain, lung, liver, kidney, in order from lanes 1 to 4).
  • Example 1 After purification excised cDNA moiety from containing the gene of the rat "pBlue- r # 5 1.2", used as a probe to 3 2 P-labeled by the multi-prime labeling method, in Example 1 (7 Hybridization was carried out as indicated in section). About 6Xl0 5 or phage plaques showing a positive signal were screened recombinant Ekarada phage were peak Dzukuappu. Then, for each of them, the process of making a filter and hybridization with a probe was repeated to isolate 28 single phage clones.
  • This gene had a region encoding a new protein consisting of 467 amino acid residues according to MOlbp's 0RF (open reading frame).
  • ESTs short cDNA fragments of unknown function
  • the gene for the renal tubular interstitial nephritis antigen tubu lointerstitical nepharitis antigen mRNA (LOCUS name: Ozono 270)
  • LCUS name Ozono 270
  • the protein encoded by this gene and the human “GISP” gene have about 47% similarity at the amino acid level. This similarity is estimated to be due to the coding of the rat “GISP” gene and the human “GISP” gene.
  • the similarity between the proteins (89% for rat (upper) and human (lower), see Fig. 3) is clearly lower, and “0CU24270” is called the homologue of the gene in this specification ( ⁇ sagi version). Rather than the family or super family.
  • the gene was transformed into “pBlue-h # 5-22” DNA, Using NAj (SEQ ID NO: 12) and “synthetic DNA” (SEQ ID NO: 13) as primers, PCR was performed using “LA taq” (Takara Shuzo) to perform the protein coding region of the hidden “GISP” gene, about 1400 bp Was prepared.
  • the reaction mixture was composed of lxLAtaq buffer (Takara Shuzo), dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, TTP) at a concentration of 0.2 mM (all final concentrations), primer DNA (1 M) and type I
  • the total reaction volume is 50/1, and the reaction is kept at 94 ° C for 5 minutes, followed by 20 cycles of 98 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 2 minutes. Furthermore, the test was performed under the conditions of three steps of keeping the temperature at 72 ° C for 10 minutes. After the PCR was completed, digestion was performed with restriction enzymes EcoRI and Notl, and the PCR product was further purified using DNA purification reagent “prepA-gene Matrix”.
  • the plasmid “pBlue-r # 5 1.2” containing the rat “GISP” gene has five or more ends of the human “GISP” mRNA. It turned out that the part corresponding to the side was missing. Therefore, we applied PCR to clone the 5 'end of the rat “GISP” gene.
  • the 5 'primer “synthetic DM (SEQ ID NO: 14)” refers to the human gene (cDNA) sequence
  • the 3' primer “synthetic DNA (SEQ ID NO: 15)” refers to the rat gene (SEQ ID NO: 15).
  • the cDNA corresponding to the sequence was designed and used.
  • PCR using “LA Taq” was performed using cDNA synthesized from NRK52E Dex (+) mRNA as type I DNA as type I.
  • the composition of the reaction solution was the same as in [Example 4], and the reaction conditions were "96 ° C for 20 seconds” and "68 ° C for 1 minute”. Was performed in 25 cycles.
  • Approximately 700 bp amplified by PCR was run on a 0.8% low melting point agarose gel, the target DNA fragment was excised, and purified using the DNA preparation reagent prepA-gene Matrix.
  • the purified DNA fragment was purified from the “PCR ligation independent cloning (LIC) method” (Nucleic Acid Res.
  • the gene fusion method using PCR was used to ligate the 5 and end portions of the rat “GISP” gene of PDirect700j to “pBlue-r # 5 1.2” described in (7) of [Example 1]. et al, Nucleic Acid Res. 17 723-733 (1989)). First, two types of DNA fragments containing the 5 'end and the 3' end were prepared by PCR.
  • the 5 'end uses pD irect700 DNA as a type II, "synthetic DNA (SEQ ID NO: 14)” and “synthetic DNA (SEQ ID NO: 16)", and the 3' end uses "pBlue-r
  • the first step PCR was performed using “Synthetic DNA (SEQ ID NO: 17)” and “Synthetic DNA (SEQ ID NO: 18)” with # 5 1.2 DNA as type II.
  • the first-stage PCR product has a primer sequence that has an overlapping portion (30-40 bp) to ligate DNA fragments. The obtained two DNA fragments were purified and further subjected to the second-stage PCR.
  • the second step PCR consists of a two-step reaction.
  • the first step mix the two PCR products in equal volumes (40 ⁇ g each) and add 30 minutes at 96 ° C without adding the primers. For 5 seconds, the reaction was performed for 2 seconds and at 72 ° C for 2 minutes.
  • primers (“Synthetic DNA (SEQ ID NO: 14)” and “Synthetic DNA (SEQ ID NO: 18)” (0.2 ⁇ M each) to the reaction solution, and add “96 °
  • the reaction was performed for 25 cycles of “20 seconds at C”, “4 minutes at 65 ° C.”, and 6 minutes at 72 ° C. As a result, an expected DNA fragment of about 1.8 kb was obtained.
  • the resulting fragment was purified and then subcloned by the PCR Direct Cloning system using the LIC method. Plasmid DNA was extracted from several clones and analyzed, and the desired plasmid was analyzed. DNA CpDirect r # 5-1.8kj was obtained. After preparing plasmid DNA according to a conventional method, the DNA base sequence was determined. It was confirmed that there was no change from the respective sequences before ligation. However, of the determined base sequence, the 24 bases from the 5 'end are sequences of a primer derived from a human sequence.
  • Example 1 Therefore, a primer was used that is directed 5 'upstream from the portion determined as the rat cDNA sequence, and a primer that is directed from the vector side toward the 5' end of the insert cDNA was used [Example 1].
  • NM52E cell Dex (+) sublibrary shown in (2) above as type III, three-step PCR was performed. The phage solution 5 ⁇ 1 was heat-treated at 98 ° C for 10 minutes, and then subjected to PCR using LAtaq (Takara Shuzo).
  • the composition of the reaction mixture was IX LA taq buffer (Takara Shuzo Co., Ltd.) and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, TTP) at a concentration of 0.2 mM (all final concentrations), primer-DNA (1 zM) and ⁇ .
  • dNTPs dATP, dCTP, dGTP, TTP
  • primer-DNA 1 zM
  • An expression vector for the rat “GISP” gene was constructed by the same steps as in [Example 4].
  • the DNA fragment to be inserted into the vector was prepared using LADirect and the sequences shown in “Synthetic DNA (SEQ ID NO: 12)” and “Synthetic DNA (SEQ ID NO: 19)” using “pDirect r # 5-1.8kj”.
  • This primer about 1400 bp of the protein coding region of the PCI trophy “GISP” gene was amplified. Reaction conditions and the like are as shown in [Example 4].
  • the PCR reaction product was purified by digestion with the restriction enzymes Ecoill and Notl. After ligating to pEF-18S DNA digested with EcoRI and Notl using T4 DNA ligase, E.
  • coli K-12 strain was used. It was transfected into a competent cell of a certain XL Blue to obtain an ampicillin-resistant D21. Plasmid was recovered from cultured cells of several colonies, and plasmid DNA into which rat "GISP" gene DNA had been inserted was obtained as expected from restriction enzyme digestion proteins. The resulting plasmid DNA “pEF-r # 5” was sequenced with the rat “GISP” gene to confirm that the nucleotide sequence was correct.
  • lung-derived cells “MRC-5 SV1 TGI cells” (Riken Cell Bank) were cultured with “RITC 80-7 medium” supplemented with 10% FCS.
  • rat cells “NRK-52E cells” (Flow Laboratories Inc. Tokyo, Japan), a cell line derived from renal epithelium, were cultured with "DMEM medium” supplemented with 10% FCS.
  • Dexamethasone was dissolved in 100% ethanol, diluted with the medium, and added. In the control group, the solvent was added at the same concentration as the solvent in the dexamethasone-treated group.
  • GISP transcriptional repressive activity
  • the method is as follows: On the first day of the experiment, seed the “O-5 SV1 TG1 cell” or “NRK-52E cell” on a 6-wel 1 plate (manufactured by Corning) at 3 to 5 x 10 5 / well, and on the second day of the experiment. Using the DEAE-dextran method in the eyes: The plasmid DNA was cotransfected into cells. In addition, the amount of DNA used was 0.75 ⁇ g + in the case of ⁇ MRC-5 SV1 TGI cells, '' per 100 ⁇ l of ⁇ GISP '' expression vector ( ⁇ pEF-h # 5 '' or ⁇ pEF-r # 5 '').
  • “PRL-EF” was 0.05 / g.
  • dexamethasone final concentration 1 M
  • IL-15 final concentration 100 U / ml
  • Cell extracts were prepared using "Passive LysisBuffer” (Promega).
  • Dua Luciferase Repoter Assay Systemj manufactured by Promega
  • the activity of the hydrogen and P. luciferase in this cell extract was measured using a Lumat model LB953j (Berthold, Germany).
  • Figures 4 and 5 As a control for “pEF-h # 5” and “pEF-r # 5”, the “pEF-18S” vector into which “# 5 cDNA” was not inserted was used.
  • Figure 4A shows the vector with the human luciferase gene ligated downstream of the rat IL-8 (CINC) promoter
  • Figure 5A shows the vector with the human luciferase gene downstream of the human IL-8 promoter.
  • FIG. 4B and FIG. 5B was detected in cells into which the vector linked to the MYC luciferase gene downstream of the EF motor was introduced.
  • GISP is not a significant factor due to the elongation factor—1 ⁇ -promo It did not suppress the expression of C. luciferase (FIGS. 4B and 5B). Therefore, the specificity of the inhibitory effect of GI SPj on human IL-8 and rat CINC promoter was demonstrated.
  • Peptide 5-4 (SEQ ID NO: 28) HSRAMGRGKRQATSRC
  • Veptide 5-5 (SEQ ID NO: 29) VSQGRPEQYRRHGTHSVKI
  • Peptide 5-6 (SEQ ID NO: 30) ETFVLGVWGRVGMED GHH
  • peptides having a cysteine residue added to the N-terminus were used.
  • TBS Tris-HC1, 0.5 M NaCl (pH 7.5)”
  • TTBS 0.1% Tween 20
  • the plate was treated at room temperature for 60 minutes with a blocking agent composed of TTBS containing 2% of a blocking reagent, Smileite (manufactured by Sumitomo Metal Industries, Ltd.).
  • a stamp lot analysis was performed using each antiserum containing an antibody against each peptide diluted 1000-fold with a TTBS solution containing 2% smileite as the primary antibody.
  • the plate was treated with a TTBS solution containing an anti-GISP peptide antibody and 2% smileite at room temperature for 60 minutes, and then washed twice with TTBS for 5 minutes.
  • alkaline phosphatase-labeled anti-Egret IgG (manufactured by Nippon Bio-Rad Laboratories) was diluted 1000-fold with a TTBS solution containing 2% Smartlight, treated as a secondary antibody at room temperature for 60 minutes, and treated with TTBS for 5 minutes. Two washes were performed for 2 minutes.
  • a protein having an activity of suppressing activation of an IL-8 promoter in response to a specific extracellular stimulus a DNA encoding the protein, a vector containing the DNA, and a transformation retaining the vector A body, an antibody that reacts with the protein, and a pharmaceutical composition containing the protein as an active ingredient are provided.
  • the protein of the present invention has an activity of suppressing the activation of the IL-8 promoter, it is used as a drug for treating a disease associated with IL-8 expression, for example, an anti-inflammatory drug, an anti-bronchial asthma drug It is expected to be used for antiallergic drugs, antirheumatic drugs, etc.
  • the protein of the present invention has no risk of producing neutralizing antibodies and the like in the human body when it is of the human type.
  • both human and rat types are proinflammatory proteins other than IL-8, which are activated and expressed by the same pathway as that of IL-8 promoter overnight, such as TNF-H (Shakhov, AN et.al. J. Exp.Med. 171, 35-47 (1990)) and IL-6 (Kishimoto, T. et.al. Proc. Nat. Acad. Sci. US 90, 10193-7 (1993))
  • TNF-H Shakhov, AN et.al. J. Exp.Med. 171, 35-47 (1990)
  • IL-6 Kerat, T. et.al. Proc. Nat. Acad. Sci. US 90, 10193-7 (1993)
  • NOS nitric oxide synthase
  • Gly Arg lie Tyr Pro Val Leu Gly Thr Tyr Trp Asp Asn Cys Asn Arg
  • Val Ala Ser Asp Arg Val Ser lie His Ser Leu Gly His Met Thr Pro
  • Asn Asp Lys Glu lie Met Lys Glu Leu Met Glu Asn Gly Pro Val Gin
  • Sequence type nucleic acid
  • Val Ser lie His Ser Leu Gly His Met Thr Pro lie Leu Ser Pro Gin
  • Sequence type nucleic acid
  • GGT GGC AGA TAC TGC CM GAG CAG GAC ATG TGC TGC CGC GGC CGT GCT 240 Gly Gly Arg Tyr Cys Gin Glu Gin Asp Met Cys Cys Arg Gly Arg Ala
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • CTCGCTCGCC CAATGTGGCG ATGTCCACTG GGGCTATGC 39 SEQ ID NO: 15
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthesis MA Array.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic MA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
  • Val Ser Gin Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Arg Arg His Gly Thr His Ser Val Lys 1 5 10 15 lie SEQ ID NO: 30'- Sequence length: 19

Landscapes

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Description

明細書
- . 細胞内シグナル伝達抑制因子 技術分野
本発明は、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモー夕一の活性化を抑制する 活性を有するタンパク質、 該タンパク質をコードする DNA、 該 DNAを含むベクター 、 該ベクタ一を保持する宿主、 該タンパク質に対する抗体、 および該タンパク質 を有効成分とする医薬組成物に関する。 背景技術
インターロイキン 8 (以下、 「IL-8」 と称する） は、 細胞間の情報伝達を担う夕 ンパク性の化学物質であるサイ ト力インの一種である。 IL-8は、 好中球遊走、 リ ンパ球遊走、 好中球活性化、 血管新生などの作用を持つサイ ト力インとして知ら れている（Matsushima, K. et. al. J. Exp. Med.167, 1883-93 (1988)、 Larsen， G .et.al. Science 243,1464-6 (1989)、 Daniels,R.H.et.al. Immunol.75, 157-63 ( 1992)、 Koch, A.E. et. al. Science 258,1798-804 (1992)、 Harada, A. et al. Mol. Med. Today 2, 482-489 (1996))。
一方、 IL- 8については、 これら生体における正常な機能の他に、 炎症 （Watana be, K. et al Infection & Immunity 60, 1268 (1992)や心筋梗塞症などにおける 再濯流性組織障害 (reperfusion injury) (Sekido, N. et al. Nature 365, 65 4-657(1993)) などの種々の疾患に関与していることが示唆されている。
特に、 炎症と IL- 8の関係については、 多くの報告例があり、 種々の炎症性疾患 、 例えば、 慢性関節リウマチ、 痛風性関節炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 敗血症、 突 発性肺線維症、 成人呼吸窮迫症候群、 炎症性腸疾患、 免疫性血管炎、 糸球体腎炎 、 尿路感染症、 心筋梗塞、 気道感染症、 気管支喘息、 周産期感染、 移植臓器拒絶 症などにおいて、 IL-8が産生されていることが調べられている （Matsushima, K. et al.Chem Immunol 51, 236-265(1992)、 松島綱治 免疫薬理 12， 15-21, 1994 、 Harada, A. et al. Mo 1. Med. Today 2, 482-489 (1996)) 。
このように IL:8と種々疾患との関係が明らかとなってきたことから、 IL-8を標 的とした医薬品の開発も行われている。 例えば、 抗 IL- 8抗体の抗炎症活性（Sekid 0, N. et. al. Nature 365,654-657 (1993))に基づく医薬品閧発例が記載されて いる（日経バイオ年鑑 97， 321頁， 1996)。
しかし、 このような医薬品開発には抗体に対する中和抗体の産生による薬効の 消失ゃァレルギー誘発抗体の産生などの問題点がある。 発明の開示
そこで本発明は、 かかる問題点を有しない抗炎症作用を有する因子、 特に IL-8 プロモーターの活性化を抑制する活性を有する因子を提供することを課題とする
IL- 8に関連する知見として、 多くの炎症において IL- 8の発現が見られること （ Watanabe, K. , et al. Infection & Immunity 60， 1268 (1992), Matsushima, K . et al. Chem Immunol. 51, 236-265 (1992)) や、 また IL-8の機能を IL- 8抗体に より阻害した場合に炎症が抑制されること （Harada, A. et al. Int. Immunol.5 681-690 (1993)、 Sekido, N. et al. Nature 365 654-657 (1993)) が報告され ている。 従って、 IL- 8の発現は炎症と深く関わっていると考えられる。
ところで抗炎症ステロイ ドとして知られているデキサメタゾンには、 IL- 8プロ モ一夕一の活性化の抑制作用があることが報告されている （Mukaida N. et al. J. Immunol. 146 1212-1215(1991)、 Mukaida, N. J.Biol. Chem. 269 13289(199 4)) 。
従って、 デキサメタゾンによる刺激に応じて発現する遺伝子を単離することが できれば、 該遺伝子は IL- 8プロモー夕一の活性化の抑制作用を有するタンパク質 をコードする遺伝子の有力な候補となり、 ひいては抗炎症作用を有するタンパク ό 質をコードする遺伝子の有力な候補になると考えられる。
そこで、 本発明者らは、 デキサメタゾン処理により発現が誘導される遺伝子の 単離を試みた。 の結果、 デキサメタゾン処理した細胞から抽出した cDNAライブ ラリーとデキサメタゾン処理をしていない細胞から抽出した cDNAライブラリーと を用いてサブトラクション法およびディファレンシャルハイブリダイゼーシヨン 法によるスクリーニングを行うことにより、 デキサメタ Vン処理した細胞で発現 が誘導される遺伝子を単離することに成功した。
さらに本発明者らは、 単離した遺伝子が IL-8プロモーターの活性化を抑制する か否かの検討を行った。 この結果、 単離した遺伝子が実際に IL-1 ?刺激による IL -8プロモーターの活性化を抑制することを見出した。
本発明者らは、 単離した遺伝子の塩基配列を決定して、 DNAデ一夕一ベースに対 してホモロジ一検索を行ったところ、 該遺伝子がこれまでに単離されていない新 規な遺伝子であることを見出した。
即ち、 本発明は、 IL- 8プロモーターの活性化を抑制する因子に関し、 より具体 的には、
( 1 ) 配列番号： 1に記載のタンパク質、 または該タンパク質中のアミノ酸配 列において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 若しくは付加したアミノ酸 配列を有し、 特定の細胞外刺激に応答した IL-8プロモーターの活性化を抑制する 活性を有するタンパク質、
( 2 ) 配列番号： 2に記載の DNAとハイブリダィズする DNAがコードするタンパ ク質であって、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモーターの活性化を抑制す る活性を有するタンパク質、
( 3 ) 配列番号： 3に記載のタンパク質、 または該タンパク質中のアミノ酸配 列において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 若しくは付加したアミノ酸 配列を有し、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモータ一の活性化を抑制する 活性を有するタンパク質、 (4) 配列番号： 4に記載の DNAとハイブリダィズする DNAがコード:するタンパ ク質であって、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモーターの活性化を抑制す る活性を有するダンパク質、
(5) 特定の細胞外刺激がインターロイキン による刺激である、 （1) か ら （4) のいずれかに記載のタンパク質、
(6) (1) または （3) に記載のタンパク質をコードする DNA、
( 7 ) 配列番号： 2に記載の DNAおよび/または配列番号： 4に記載の DNAとハ イブリダィズし、 特定の細胞外刺激に応答した IL-8プロモーターの活性化を抑制 する活性を有するタンパク質をコ一ドする DNA、
(8) 特定の細胞外刺激がインタ一ロイキン による刺激である、 （7) に 記載の DNA、
(9) (6) から （8) のいずれかに記載の DNAを含むベクタ一、
(10) (9) に記載のベクタ一を保持する宿主、
(11) (1) から （5) のいずれかに記載のタンパク質に反応する抗体、
(12) (1) から （5) のいずれかに記載のタンパク質を有効成分とする医 薬組成物、
(13) 抗炎症剤である、 （12) に記載の医薬組成物、
に関する。
本発明は、 特定の細胞外刺激に応答して IL- 8プロモーターの活性化を抑制する 活性を有するタンパク質に関する。
炎症を含む種々の疾患で、 IL- 1 (Clin. Immunol. 2718-28 (1995)) や、 IL - 8 (Clin. Immunol. 2780-85 (1995)) 、 TNF (Molecular Medicine 33 1010-1020 (1996)) の産生がみられることや、 IL- 1や TNFの刺激により IL- 8の産生が誘導され ることが報告されている (Mukaida, N. et al. icrobiol. Immunol., 36773(1 992)) 。 また、 この IL- 8遺伝子の発現は、 IL-1や TNFの細胞膜受容体への結合に基 づく細胞内シグナル伝達過程を通して誘発されることが示唆されている。 一方、 本発明のタンパク質は、 抗炎症剤であるデキサメタゾン処理により発現が誘導さ れるという特性を有し、 さらに上記細胞内シグナル云達過程を阻害して IL-8プロ モーターの活性 を抑制するという特性を有する。 これらの事実から本発明の夕 ンパク質は、 抗炎症作用を有すると考えられる。
本発明のタンパク質としては、 天然由来であるか、 遺伝子工学技術を用いて調 製する組み換えタンパク質であるかを問わない。 天然のタンパク質は、 例えば、 後述する本発明の抗体を結合したァフィ二ティーカラムを用いて調製することが できる。 また、 組み換えタンパク質は、 例えば、 後述する本発明の形質転換体を 用いて調製することが可能である。
また、 本発明のタンパク質には、 天然型 （例えば、 配列番号： 1または配列番 号： 3に記載のタンパク質） に対してアミノ酸の置換、 欠失、 付加などがされて いる改変体も含まれる。 このような改変体は天然に生ずることもあるが、 当業者 であれば、 例えば、 対象遺伝子の一本鎖 DNAを銪型、 変異オリゴヌクレオチドをプ ライマーとして二本鎖 DNAを合成し、 大腸菌遺伝学の手法を 用い錶型である正常 遺伝子由来の DNAを排除し、 変異 DNA鎖由来のプラスミ ドを選択してくることを基 本原理とした種々の方法 （Lesley, S.A. and Bohnsack, R. N. , Promega Notes M agazine, 46, 6-10 ( 1994)、 Kunkel, T丄ら Methods Enzymol . , 154, 367-382 ( 1987)、 Sayers, J ら Bioteches, 13， 592-596 ( 1992) ) により調製すること が可能である。 また、 PCRの組み合わせで、 突然変異プライマー由来の増幅 DNAを 得る力法 (Cormack, B.， Current Protocals in Molecular Biology (Ausubel , F.M. et al eds. ) 8.5.1-8. 5.9. ( 1987)、 Erlich, H丄, (ed. ) PCR Techno log y, Stocken Press, New York ( 1989 ) ) などの周知技術を用いて調製することが 可能である。
このように配列番号： 1 (または配列番号： 3 ) に記載のタンパク質のアミノ酸 配列中のァミノ酸において 1もしくは数個のアミノ酸が置換、 欠失もしくは付加さ れたァミノ酸配列を有し、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモーターの活性 化を抑制する活性を有するタンパク質も本発明の範囲に含まれる。 _
また、 当業者にとっては、 周知技術であるハイプリダイゼーシヨン技術 （Samb rook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis,T. (ed. ) , Molecular Cloning 2nd e d. Cold Spring Habor Laboratory Press, NewYork (1989)) を用いて、 配列番号 ： 2 (または配列番号： 4) に記載の DNA配列 （またはその一部） を基に、 これと 相同性の高い DNAを単離して、 該 DNAから本発明のタンパク質の機能的同等物を得 ることも常套手段である。 このように配列番号： 2 (または配列番号： 4) に記 載の DNA配列からなる DNAとハイブリダイズする DNAがコードするタンパク質であつ て、 特定の細胞外刺激に応答した IL-8プロモーターの活性化を抑制する活性を有 するタンパク質も本発明の範囲に含まれる。 ハイプリダイズ技術により得られた タンパク質は、 配列番号： 1または 3に記載の本発明のタンパク質とアミノ酸配 列において、 60%以上の相同性を有することが好ましく、 80%以上の相同性を有 することがさらに好ましく、 90%以上の相同性を有することがさらに好ましい。 なお、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモーターの活性化を抑制する活性 は、 例えば、 レポーター遺伝子をマーカ一として検出し測定することが可能であ る。 即ち、 IL-8プロモーター領域の下流にレポ一夕一遺伝子を有するベクタ一を 宿主細胞に導入し、 該細胞に特定の細胞外刺激を与えて、 レポーター遺伝子産物 の活性を検出することにより、 測定することができる。 レポーター遺伝子として は、 例えば、 ホ夕ルルシフェラーゼ （de Wet, J. R. et al.Mol. Cell. Biol. 7 , 725-737 (1987)) 、 ゥミシィタケルシフェラ一ゼ （Sherf， B.A. et al. Prome ga Note 57, 2-9 (1996))、 CAT (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ —ゼ) (Gorman, C. M. et al. Mol. Cell. Biol. 2, 1044-1051 (1982))、 β- ガラクトシダ一ゼ (Jain, V. et al. Anal. Biochem. 199， 119-124 (1991))、 グルクロニダーゼ (Gallagher, S. R. GUS Protocol: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Acasemic Press 47-59 (1992)) 、 ァゾレ力リフ ォスファターゼ （Cullen, B. et al. Methods in Enzymology 216, 362-368 (19 92)) などを用いることができる。 また、 本発明において 「特定の細胞外刺激」 と は、 細胞、 特に細胞の細胞膜受容体へのサイ トカインによる刺激を指す。 サイ ト 力インとしては、 —例えば、 IL- 1、 TNFなどが挙げられるが、 IL-8の活性化を引き起 こすものであれば特に制限はない。
また、 本発明は、 上記本発明のタンパク質をコードする DNAに関する。 本発明の タンパク質をコードする MAとしては、 その形態に特に制限はない。 例えば、 本 発明のタンパク質の産生能を有する細胞より分離される mRNAより調製できる cDNA ゃゲノム DNAの他、 化学合成 DNAも本発明の DNAに含まれる。
本発明の DNAは、 例えば、 以下の方法により調製することが可能である。 cDNAで あれば、 まず、 cDNAを取得するために cDNAライブラリ一の作製が行われる。 cDNA ライブラリーは、 本発明のタンパク質を産生している細胞から精製した mRNAをも とに合成した cDNAを、 微生物由来のレブリコンを持つ適当なベクターに連結した 後、 適合する宿主に導入することにより作製される。 精製した mRNAから cDNAを合 成する方法としては、 オリゴ dTプライマーやランダムプライマーを使用する方法 、 特定塩基配列を持つ合成プライマーを使用する方法などが通常用いられる。 ラ イブラリー作製に用いられるベクターとしては、 例えば、 プラスミ ドベクタ一、 ファージぺク夕一、 コスミ ドベクター、 ファージミ ドベクタ一、 YACベクタ一等が 主として使用される。 宿主としては、 例えば、 大腸菌、 酵母、 枯草菌等が主とし てに使用される。 作製した cDNAライブラリ一から、 本発明の cDNAを持つクローン を選択する方法としては、 例えば、 本発明の DNAの塩基配列を含むオリゴヌクレオ チドを3 2 Pや酵素等で標識したものをプローブとして用いてスクリーニングする方 法の他に、 本発明の DNAに特異的な配列からなるプライマ一を用いた PCR (Polyme rase Chain Reaction) によって得られた DNA断片をプローブとして用いる方法が 挙げられる。 また、 RT-PCR (Kawasaki , E. S. and Wang, A.M. , PCR Technology ( Erlich, H.A. ed. ) Stockton Press, 89-97 ( 1989)等 ） を用いることによって、 宿主に導入する cDNAライブラリ一のスクリーニングの工程を経ずに直接に本発明 の cDNAを調製することもできる。 本発明のタンパク質に反応する抗体が利用でき る場合には、 大腸菌などを宿主とした発現ク ό一二ングにより cDNAを調製するこ とも可能である。'
また、 ゲノム DNAであれば、 対象とする生物の適当な細胞を材料として、 細胞を 溶解し、 ゲノム MA に結合しているタンパク質をタンパク質変成剤、 タンパク質 分解酵素を用いて除去する工程を経て DNAを精製する方法 （村松編、 ラボマ二ユア ル遺伝子工学、 増補版、 丸善、 61-62、 ( 1990) ) により調製することが可能であ る。
また、 化学合成 DNAであれば、 例えば、 ホスフアイ ト · トリエステル法 （Hunka piller, M.ら Nature, 3， 10. 105-111 ( 1984) ) 等の常法に従い、 核酸の化学合 成により製造することができる。 なお、 所望アミノ酸に対するコドンはそれ自体 公知であり、 その選択も任意でよく、 例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考 慮して常法に従い決定できる （Grantham, R. ら、 Nucleic Acids Res. , 9 ， p43 -p74 ( 1981 ) ) 。
このようにしてクロ一ニングされた本発明の DNAの塩基配列は、 放射標識あるい は蛍光標識を用いるジデォキシ法、 マキサム一ギルバート法等により解析するこ とができる。
また、 本発明は、 本発明の DNAが挿入されたべクタ一に関する。 本発明のベクタ 一としては、 宿主細胞 （例えば、 大腸菌、 酵母、 動物細胞など） において増殖、 複製することができ、 適当な選択マーカ一遺伝子を有するものであれば特に制限 はない。 大腸菌用としては、 例えば、 rpBluescipt I I」 （STRATAGENE社） 、 「p CRT" I I」 （Invitrogen社） 等が挙げられる。 また、 酵母用としては、 例えば、 「 pSR403j ( Sikorski R. S. and Hieter, P. , Genetics, 122， 19-27 ( 1989 ) ) 等が 挙げられる。 さらに、 動物細胞用としては、 例えば、 「pCDM8」 （Seed, B.， Nat ure, 329, 840-842 ( 1987) ) 、 「pSV2- neo」 ( Southern and Berg, J. Mol . App 1. Genet. , 1， 327-341 , ( 1982 ) ) 等が挙げられる。 本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場.合には、 特 に、 発現べクタ一が有用である。 発現べクタ一どしては、 一般に宿主細胞に適合 するプロモーター'および制御配列等が付加されたものであれば特に制限はないが
、 例えば、 大腸菌用として、 「pKC30」 ( Shimatake, H, and Rosenberg, M.， N ature, 292, 128-132， （1981 ) )、 「pTrc 99A」 （Amann, E. ら、 Gene, 69, 30 1-315, ( 1988) ) 、 動物細胞用のプラスミ ドベクタ一として、 「pCAGGS」 （Niwa らヽ Gene, 108, 193-200, ( 1991 ) ) あるいは 「pcDL- SRひ 293」 （Takebeら、 Mo 1. Cell. Biol . , 8, 466-472, ( 1988) ) 等が、 ウィルス系べクタ一としてはアデ ノウィルス作製用トランスファ一ベクタ一 「pAdexlw」 （鐘ケ江ら、 実験医学 、 12， 316-322, ( 1994) ) などが挙げられる。 昆虫細胞としては、 組換えウィルス 作製用トランスファ一ベクタ一 「pAc373」 （Luckow ら、 Bio/Technology， 6， 47 -55, ( 1988)) 等が挙げられる。
ベクタ一への本発明の DNAの挿入は常法 （Molecular Cloning. A Laboratory anual (Maniatis, T.， et al ( eds) , Cold Spring Habor Laboratory Press, Ne w York) やラボマニュアル遺伝子工学 （村松編、 丸善 （株） ） ） により行うこと が可能である。
また、 本発明は、 本発明のベクタ一が導入された宿主細胞に関する。 本発明の ベクターが導入される宿主細胞としては、 原核生物 （例えば大腸菌） 、 真核生物
(例えば酵母、 哺乳動物、 昆虫） 細胞等を用いることができ、 特に制限はない。 例えば、 好適な大腸菌株として、 「X - Blue」、 「SURE」、 「DH5」 （いずれも理 研ジーンバンク等から入手可能） 等が挙げられる。 本発明のタンパク質を生産す る目的においては、 宿主細胞として、 原核生物 （例えば大腸菌）、 真核生物 （例 えば酵母、 哺乳動物、 昆虫） 細胞等を用いることができる。 動物細胞の例として は、 「C0S- 1細胞」 （理研細胞開発銀行、 RCB0143) 、 ヒト胎児腎株 （293) (大日 本製薬 （株） ）、 ベービ一ハムス夕一腎細胞 （BHK，ATCC CCL10) 、 チャイニーズ ハムスター卵巣細胞 （CH0 - Kl、 理研細胞開発銀行、 RCB0285) 、 サル腎細胞 （CV 1 ,ATCC CCL70) 等が挙げられる。 酵母の例としては、 パン酵母 ( Saccharomyces cerevisae) やエタノール資化性酵母 (Pichia pastoris) 等が挙げられる。 昆虫 細胞の例としては'、 蚕培養細胞等を挙げることができる。
宿主細胞へのベクターの導入は、 当業者には常法であるリン酸カルシウム法や エレクトロポレーシヨン法を用いて行うことができる。
本発明のタンパク質を組み換えタンパク質として製造するためには、 上記のベ クタ一が導入された宿主細胞、 即ち、 形質転換体を培養し、 該形質転換体内で発 現した組み換えタンパク質を回収することにより製造することが可能である。 形質転換体は、 常法に従い培養することができ、 該培養により細胞内または細 胞外に本発明のタンパク質が生産される。 該培養に用いられる培地としては、 採 用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、 例えば上記 COS細 胞であれば 「RPMI- 1640」 培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地 （DMEM) 等 の培地に必要に応じ牛胎児血清 （FBS) 等の血清成分を添加したものを使用できる 。 培養した形質転換体内で発現した組み換えタンパク質は、 タンパク質の物理的 性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により分離 ·精製するこ とができる。 分離 ·精製法としては、 例えば、 通常のタンパク沈殿剤による処理 、 限外ろ過、 分子ふるいクロマトグラフィー （ゲルろ過） 、 吸着クロマトグラフ ィ一、 高速クロマトグラフィー （HPLC) 等の各種液体クロマトグラフィー、 透析 法、 これらの組み合わせ等が挙げられる。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質に反応する抗体に関する。 本発明の抗体 の形態には、 特に制限はなく、 ポリクロ一ナル抗体の他、 モノクローナル抗体も 含まれる。 また、 ヒト化抗体やすべての抗体のクラスが含まれる。
本発明の抗体は、 当業者には既知である常法 （新細胞工学実験プロトコ一ル、 東京大学医科学研究所抑癌研究部編、 202-217 ( 1993) 等） により調製することが 可能である。 抗原としては、 例えば、 組換え DNA技術を用いて製造した本発明の夕 ンパク質 （例えば、 配列番号： 1または配列番号： 3に記載のタンパク質） の全体 、 もしくはそれらの適当な部分ペプチド （例えば、 配列番号： 25〜配列番号： 30 に記載のペプチド） を利用することができる。 これちをゥサギ、 マウス、 ラット 、 ャギ、 ヒッジ、 '二ヮトリ、 ハムス夕一、 ゥマ、 モルモットなど一般に抗体の調 製用に利用される哺乳動物、 鳥類などにアジュバンドなどとともに投与し、 抗体 価が上昇したこれらの動物より抗血清を得たり、 また細胞を回収してポリクロー ナル抗体を得たりすることができる。 また、 モノクローナル抗体についても、 該 抗原に対する抗体価が高くなった動物を抗体産生細胞のソースとして用いること により、 即ち、 例えば、 免疫を行ったマウス脾臓から調製した脾細胞とマウス由 来の骨髄腫細胞を融合して得られたハイプリ ドーマをスクリーニングすることな どにより、 本発明の夕ンパク質に特異的なモノクローナル抗体を得ることができ る。 さらには、 本発明の抗体を発現している細胞から抗体遺伝子、 またはその一 部をクロ一ニングし、 これを遺伝子工学的に発現させて抗体やその一部を得るこ とも可能であり、 またヒト化抗体を得ることも可能である。 本発明の抗体は、 本 発明のタンパク質の優れた検出、 定量、 さらには精製のための優れた手段として 利用することができる。
本発明の抗体が利用される検出法としては、 常法、 例えばウエスタンプロット 法 (Towbin, H. ら、 Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 76, 4350-4354 ( 1979 ) ) 等 が、 また、 定量法としては、 ラジオィムノアヅセィ （MA) 法 （北川ら、 ラジオィ ムノアッセィ （新生化学実験講座 1 2 ) 、 79-88、 東京化学同人 （1992) ) ゃェン ザィムィムノアッセィ （EIA) 法 （石川ら、 ェンザィムィムノアヅセィ （新生化学 実験講座 1 2 ) 、 88-99、 東京化学同人 （1992) ) 等が挙げられる。
また、 精製法としての利用は、 例えば、 本発明の抗体を不溶性の支持体に結合 させたァフィ二ティ一クロマトグラフィー法 （西道ら、 固定化抗体を用いたァフ ィニティ一クロマトグラフィー （新生化学実験講座 1 ) 、 403-406、 東京化学同人 ( 1990) ) などが挙げられる。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質を有効成分とする医薬組成物に関する。 本発明のタンパク質は、 前述したように、 IL-8プロモーターの活性化.を抑制する 活性を有する。 また、 本発明のタンパク質は、 抗炎症剤であるデキサメタゾンに より誘導される特'性をも有する。 従って、 本発明のタンパク質は、 IL- 8の発現が 関連する種々の疾患を治療するための薬剤、 特に抗炎症剤として有用である。 本 発明のタンパク質を適用することが可能な疾患としては、 例えば、 慢性関節リウ マチ、 痛風性関節炎、 乾癬、 接触性皮膚炎、 敗血症、 突発性肺線維症、 成人呼吸 窮迫症候群、 炎症性腸疾患、 免疫性血管炎、 糸球体腎炎、 尿路感染症、 心筋梗塞 、 気道感染症、 気管支喘息、 周産期感染、 移植臓器拒絶症などが挙げられる。 本発明のタンパク質を上記疾患の治療に用いる場合には、 該タンパク質を直接 投与することもできるが、 公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることも できる。 例えば、 薬理学上許容される担体若しくは媒体と適宜組み合わせて用い ることもできる。 本発明のタンパク質を有効成分とする医薬組成物の投与方法お よび投与量は、 当業者であれば、 患者の症状、 年齢、 体重などに応じて適宜選択 することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 抗炎症剤デキサメタゾン （Dex) 処理によるラヅト 「GISP」 mRNAの発現 をノ一 ザンブロットハイプリダイゼーシヨンにより検出した電気泳動像である。 図 2は、 ラットおよびヒ卜の各組織におけるラット 「GISP」 mRNAの発現をノーザ ンブロットハイプリダイゼーシヨンにより検出した電気泳動像である。
図 3は、 ヒトおよびラット 「GISP」 のアミノ酸配列の比較を示す図である。 上 段がラット 「GISP」 のアミノ酸配列であり、 下段がヒト 「GISP」 アミノ酸配列で ある。
図 4は、 ラヅ ト CINCプロモー夕一活性 （A) とェロンゲーシヨンファクタ一- 1ひ プロモ 一夕一活性 （B) に与える 「GISP」 遺伝子の発現の影響をレポーター遺伝 子法に より検出した結果を示す図である。 図 5は、 ヒト IL-8プロモーター活性 （A) とェロンゲ一シヨンファクタ一- 1ひプ ロモ一 ター活性 （B) に与える 「GISP」 遺伝子の発琅の影響をレポ一夕一遺伝子 法により検出し 結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
[実施例 1] ラッ卜 「GISP」 (Glucocorticoid - Inducible Suppressor Protein) 遺伝子の取得
特に記述のない汎用する遺伝子操作技術は、 「Molecular Cloning. A Laborat ory Ma腿 1」 (Maniatis, T. , et al (eds) , Cold Spring Habor Laboratory Pr ess,NewYork) やラボマニュアル遺伝子工学 （村松編、 丸善 （株） ） などに準じて 実施した。 また、 制限酵素などの遺伝子工学的実験に使用する一般試薬類は、 ベ 一リンガーマンハイム （株） 、 宝酒造 （株） 等から購入して使用した。
( 1 ) NRK52E細胞からの mRNA (poly(A)+ RNA) の調製
抗炎症ステロイ ド処理、 若しくは未処理の NRK52E細胞 （ラット腎臓由来培養細 胞） （大日本製薬社製） それそれから poly(A)+RNAの調製した。 ステロイ ド処理細 胞は、 リポポリサヅカライ ド （LPS) 10 zg/ml を含む RPMI1640培地 (LIFE TECHNO LOGIES, Inc. 社）で NRK52E細胞を一晩培養した後、 約 2.5xl08個の細胞に抗炎症ス テロイ ドの一種であるデキサメサゾン （以下 Dexと略する） （最終濃度 1x10一6 M、 エタノールに溶解） を添加してさらに 5時間培養した。 他方、 ステロイ ド未処理細 胞は同様に LPSを含む RPMI1640培地で細胞を一晩培養した後、 溶媒であるエタノー ルを添加して 5時間培養した。 その後、 それそれの NRK52E細胞を遠心分離操作によ り回収した。 各細胞から 「Acid Guanidium Thiocyanate Phenol Chloroform (A GPC) 法」 （Chomczynski , P. , and Sacchi, N.， ( 1987) Anal . Biochem. , 162, 156-159) に基づいた ISOGEN試薬 （二ツボンジーン社製） を用いて、 ステロイ ド処 理細胞から約 5.0mg、 また、 ステロイ ド未処理細胞より約 6. Omgの RNAを抽出した。 そのうち各 l . Omgの MAを材料として Ol igotex- dT30 (宝酒造社製） を用いて、 ステ ロイ ド処理細胞由'来 mRNA (以下 「Dex( + )mRNA」 と略す） 約 12〃g、 また、 ステロイ ド未処理細胞由来 mRNA (以下 「Dex(- )mRNA」 と略す） 約 10〃gを poly(A)+ RNAとし て精製した。
(2) cDNAライブラリーの作製
cDNAの合成からファ一ジベクタ一への組み込みは、 ZAP-cDNA合成キット （ZAP- cDNA SYNTHESIS KIT) (STRATAGENE社製、 東洋紡） を用いて実施した。 工程を以 下に記す。 操作は ZAP- cDNA合成キヅ卜の説明書に準じて行った。 即ち、 Dex( + )mR NA及び Dex( -)mMA各 5〃gをテンプレートとして、 逆転写酵素 （M- MuLV Reverse T ranscriptase) によるファーストストランドの cDNA合成反応を行った。 続いて、 E. coli RNase Hと E. col i DNAポリメラ一ゼを用いたセカンドストランド合成反応 を行なった。 さらに、 T4 DNAポリメラ一ゼによる末端平滑化反応をした後、 EcoR Iアダプタ一を付加した。 アダプターの末端を T4ポリヌクレオチドキナーゼ （T4 Polynucleotide Kinase) でリン酸化して、 さらに、 制限酵素 Xho Iで切断した後 、 Sephacryl S- 400カラムで低分子量の DNAを除去し、 最終的に Dex( + )mRNA及び De x( -) mRNAそれそれについて約 0.6〃gの二本鎖 cDNAを得た。 そのうちの lOOngの cDN Aをべクタ一であるえ ZAPI I (Eco RI/Xho I消化、 CIAP処理したもの） のアームに T4 DNAリガ一ゼで連結した。 次に、 「； DNAインビトロ 'パッケージング .キッ ト ·ギガパック I I ·ゴ一ルド」 ( in vitro Packaginng kit Gigapak I I Gold)
(STRATAGENE社製、 東洋紡） でインビトロパッケージングを行い、 cDNAライブラ リ一を作成した。 調製した両パッケージングエキストラクト 500〃1から約 lxlO6の 組換え体ファージが得られた。 こうして得られた各パッケージングエキストラク ト （約 100万個の組み換え体ファージを含む） を宿主大腸菌 PLK-F， （STRATAGENE社 製、 東洋紡） に感染させ、 約 5万個ずつ 15cmのプレート 20枚にプレーティングし、 プレート上にプラークを形成した後、 各プレートに SMバッファー （NaCl 5.8g, M gS04 - 7H202.0g,lM Tris -HCl(pH7.5) 50ml, ¾ゼラチン (gelatin)_50ml/lい 1 0mlを加えて一晩放置した。 プレート 2枚分 （約 107個の組換えファージを含む） のファージ液を二つのサブライブラリ一として、 また、 その計 10種のサブライブ ラリーを等量づっ混合したものを全ライブラリーとして保存した。 それそれの全 ライブラリーを 「NRK- 52E細胞 Dex( + )ファージライブラリ一」 、 及び 「NRK-52E細 胞 Dex(- )ファ一ジライブラリー」 とした。
(3) 差し引きライブラリーの作製
ステロイ ド処理細胞由来の遺伝子 cDNAライプラリー （NRK-52E細胞 Dex( + )ファー ジライブラリー） からステロイ ド未処理細胞においても存在する遺伝子を除去し て、 ステロイ ドで誘導される遺伝子を濃縮させた 「差し引きライプラリー」 の作 製を、 A.Swaroopらの方法 (Nucleic Acid Res., 19, 8, 1954, (1991)) などを参 考として実施した。
(3-1) NRK- 52E細胞 Dex( + )ファージライブラリーからの一本鎖環状 MA( Single -Stranded circular DNA)の調製
A) ファージベクタ一からプラスミ ド （pBluescript SK-) ライブラリ一への変 換
「0D6O。=5.0」 まで培養した大腸菌 「XLlBlue MRF' j (STRATAGENE社製、 東洋紡 ) 5mlに ("Helper phage ExAssistj (l.Ox 1010pfu/ml) (STRATAGENE社製、 東洋紡 ) lml、 および NRK-52E細胞 Dex( + )ファージライブラリー（7.0xl09pfu/ml)700〃 1を混合して、 37°Cにて 15分間インキュベーションした。 次にテトラサイクリン（
Figure imgf000017_0001
を含む1^培地を251111に加ぇた後、 37°(で2.5時間ィンキュベ一シヨン を行った。 70°Cで 15分間熱処理を行って、 4,000g、 15分間の遠心分離操作により その上清を回収した。 次に、 その回収した上清 100^1を大腸菌株 （XL0LR ) (ST MTAGENE社、 東洋紡） (OD6。。=1.0)20mlに加えて、 37°Cで 15分間インキュべ一ショ ンした後、 テトラサイクリン（12.5〃 g/ml)を含む LB培地 30mlに加えて 37°C、 45分 間培養した。 さらに、 テトラサイクリン （12.5〃 /1111)とァンピシリン（50 / /1111 ) を含む LB培地 1Lに添加してそのまま 37°Cで一晩培養を行った。
B) プラスミ ド DNA (pBluescript SK-) から一本鎖 DM (Single-Stranded匪) の調製 '
上記培養液 10mlを 2 X YT培地 100mlに添加して 37°Cで 2時間培養した後、 「M08H elper phage j (STRATAGENE社、 東洋紡） （7.5 x 101 °pfu/ml )140〃1を加えて 37°C で 8時間の培養を行い、 一本鎖ファージを作製させた。 12，000g、 10分間 （4°C) の 遠心分離操作によりその上清を回収した。 次に、 上清に 4分の 1容量の 3.5M酢酸ァ ンモニゥムと 20%PEGを含む溶液を加えて室温にて 15分間放置して一本鎖ファージ の粒子を沈殿させた。 12, 000g、 15分間 （4°C) の遠心分離操作により一本鎖ファ ージの粒子を沈殿として回収した。 得られた沈殿を TEバッファ一 10mlに懸濁した 後、 フエノール（TE 飽和）抽出、 フヱノール ： クロロフオルム （1 ： 1) 抽出、 クロ ロフオルム抽出を各 1回行った。 10分の 1容量の 3M酢酸ナトリゥム（pH5.2)と 2倍容 量のエタノールを加えて- 20°Cで保温後、 12，000gの遠心分離操作を 4°Cで 10分間行 い DNAを回収した。 次いで、 回収した DNAを 70%エタノールでリンスして、 軽く乾 燥後 TEバッファー 300〃1に溶解した。 最終的に約 300〃gの DMを得た。
C) 二本鎖 DNA (double-stranded DNA) の除去
上記の DNA中に残存する二本鎖 DNAは、 後のサブトラクション工程におけるバッ クグランドとなるため、 制限酵素消化とマグネシウムイオン存在下条件でのフエ ノール抽出法 (Nucleic Acid Res. 18.4833-4842 ( 1990 )) により除去した。 具体 的には、 上記匪 100〃gを制限酵素 Bgll l ( 10u 1 )10 / 1 および PvuI I ( 10u/〃l )10// 1を用いて消化した。 反応液 （300 / 1) に 10%SDS 3 i l (最終濃度 0.1 % )と 0.5M EDTA 7.5〃1(最終濃度 12.5mM)を加えて混合した後、 フエノール（Tris- HC1 バッファー (PH7.5 )飽和したもの）にて抽出した。 遠心分離操作後、 上層 （水溶液 層） を回収した。 下層 （フヱノール層） に ΤΕバッファ一 300〃1を加えて再抽出操 作を行い、 遠心分離後の上層液を前回の上層 （水溶液層） に合わせて、 次の工程 に進めた。 それらに 10分の 1容量の 1M MgCl 2を加えた後、 等容量のフヱノールを添 加して激しく攪拌を行った。 16，000gで 10分間の遠心操作を行い、 二本鎖 DNAが含 まれる水溶液層を除去した。 残ったフエノール層には、 一本鎖 DNAが含まれるが、 さらに 300 / 1の TEバッファ一に溶かした lOOmM MgCl 2溶液を加えて、 激しく攪拌し た後、 16，000gで 10分間の遠心操作および水溶液層の除去の工程を 2回実施して、 二本鎖 DNAを除去した。 次に、 100〃1の 50mM EDTAを加えて攪拌した後、 16, 000gで 10分間の遠心操作することにより一本鎖 DNAを水溶液層に移行させて、 その水溶液 層を回収した。 残ったフヱ一ノール層には、 再び 100 z lの 50mM EDTAを加えて、 同 様な操作により水溶液層を回収して前回の水溶液層と合わせた。 1/10量の酢酸ナ トリゥムを加えてさらに 2.5倍量のエタノールを加えてエタノール沈殿法により DNAを回収した。 最終的に約 30〃gの一本鎖 DNAを得た。
(3-2) ピオチン化 copy Aの調製
A) Dex(- )ファ一ジライブラリーからの Dex( - )ファージ DNAの調製
NRK-52E細胞 Dex(- )ファージライブラリーを含む液に、 等量の （20¾PEG 2M NaC 1を SMバッファーで溶かした） 溶液を添加して、 氷中で 1時間インキュベーション した後、 3，000rpmで 20分間の遠心操作を行いファージ粒子を回収した。 ファージ 粒子の沈殿を LB培地 7.5mlに懸濁して等量の 「DE(DIETHYLAMINOETHL CELUL0SE)52 」 （Whatman社製） （LB培地に懸濁したもの） を加えて混合し、 15，000rpmで 5分間 の遠心操作を行いその遠心上清を回収することにより、 ファージ粒子以外の不要 物を DE52に吸着除去した。 回収した上清にプロティナ一ゼ K (最終濃度 200 zg/ml ) および 10% SDS (最終濃度 0. 1%) を加えて室温で 5分間インキュベーションした 後に、 3M酢酸カリウム （最終濃度 0.5M) を添加して 88°Cで 20分間加温した。 氷中 で 10分間放置してから 15 , OOOrpmで 10分間の遠心操作を行い、 その遠心上清液に等 量のイソプロパノールを加え- 20°Cで DNAを沈殿させて遠心操作により回収した。 得られたファージ DNAは TE ( pH8.0 )バッファーに溶解した。
B) copy MAの合成
上記ファージ DNAを銪型としてべクタ一に揷入されたィンサート cMA部分に対応 するピオチン化された cRNAを調製した。 以下に詳細を示す。
く铸型 DNAの調製 >
ファージ DNA 50 zgを制限酵素 Xholで切断処理した後、 プロティナーゼ K (最終 濃度 100 g/ml) と SDS (最終濃度 0.55 を添加して 37°Cで 30分間処理した。 フエ ノール/クロロフオルム （1 : 1) 混合液を加えて抽出操作を行ってからエタノー ル沈殿法で DNAを回収した。
く RNAの合成反応〉
「 EGAscriptTM」 （Ambion、 フナコシ社製） を用いてそのプロトコールに従つ て、 160〃 1の反応液 （添付の IxTranscription Buffer, 最終濃度 7.5mMの ATP、 CT P、 GTPヽ 3.25mMの UTP、 0.5mMの Biotin-2卜 UTP) に上記錶型 DNA (Xhol消化したも の） 8〃gと酵素混合物 （20U/〃1パクテリオファージ T3 Aポリメラ一ゼ、 46U/ j 胎盤性リボヌクレアーゼ阻害剤（Placental Ribonuc lease Inhibitor)) 16〃 1を添加して 37°Cで 6時間の反応を行った。 次に、 銪型 DNAを除去する目的で 8〃 1の RNase-free DNaselを添加して 37°Cで 15分間インキュベーションを行った。 さらに 、 RNase- freeの滅菌水を 240〃1と塩化リチウム溶液 （MEGAscriptT"に添付のもの） 200 1を加えて- 20°Cにて 30分間放置してから 15，000rpm、 15分間の遠心操作を行 い RNAを沈殿物として回収した。 70%エタノールでリンスした後、 100〃1 TE (pH 8.0) バッファーに溶解して収量を測定したところ、 約 500〃gのピオチン化 RNAを 得た。
(3-3) 差し引きハイブリダィゼ一シヨン
(3-1) で得られた NRK- 52E細胞 Dex( + )ファージライブラリーからの一本鎖環状 DNA 2 /gと、 上記 （3-2) ピオチン化 copy RNA 50〃gをエタノール沈殿した後、 R Naseフリ一滅菌水 20〃1で懸濁した。 5xハイプリダイゼ一シヨンバッファ一 （2.0 M NaCls 250mM HEPES(pH7.6)、 lOmM EDTA) 20 /1 とホルムアミ ド 20〃 1で加えて 、 70°C、 2分間保温した後、 52°C、 45時間のハイブリダィゼ一シヨンを行なった。 次に、 「VECTRE - AVIDIN」 （VECTOR LABORATORIES、 フナコシ社製） を用い、 「ビ ォチン化 copy RNA」 および 「ピオチン化 copy MAと一本鎖環状 DNAのハイプリッ ド形成物」 を除去した 。 具体的には、 ピオチン化 copy RNA25〃g当たり 250m の 「 VECTREX- AVID ΙΝ_Τ (あらかじめ lOOmM Tr is- HCl (pH7. 5) 、 OmM NaClのバッファ 一で平衡化したもの） を加えて室温で 2時間保温した後、 3，000rpm 30秒間の遠心 分離操作を行い上清を回収した。 上清は新しい同様な VECTREX- AVIDINの処理を繰 り返して、 集めた上清をエタノール沈殿を行ってハイブリダィゼーシヨンを免れ た一本鎖環状 DNAを回収した。 こうして得られた一本鎖環状 DNAは、 ベクタ一であ るプラスミ ド (pBluescriptSK-) に相補的な合成 DNA (BLU- T3、 「合成 DNA (配列 番号： 5) 」 ） をプライマ一として Taq DNAポリメラ一ゼを用いた反応により二本 鎖環状 DNAに変換した。 反応液組成 （いずれも最 終濃度） は、 lxTaq DNAポリメラ —ゼバッファ一 （10mM Tris- HCl (pH 8.3 )、 50mM KCK 1 .5mM MgCL , 0. 001%ゼラ チン） 、 各 0.2mMの濃度 （いずれも最終濃度） の dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 、 プライマ一 DNA (合成 DNA (配列番号： 5 )：最終濃度 および一本鎖環状 DNAと して合計 100〃1容量で行った。 反応装置として 「DNA Thermal Cycler Model PJ2 000」 （宝酒造、 PERKIN ELMER CETUS) を用いて、 温度条件は 「95°C、 1分間」 、 「55°C、 30分間」 、 「72°C、 30分間」 を 1サイクルで反応した。 「0. 1 SDSと 12. 5mM EDTA pH8.0j (いずれも最終濃度） として反応を停止した後、 フエノールー /クロロフオルム処理を行った後、 エタノール沈殿により DNAを回収した。 20〃1 の TEバッファーに懸濁して、 大腸菌株 「XL1— Blue MRF，」 を形質転換した。 結果 として合計約 1000個の形質転換体が得られた。 これらを用いて次の工程に進めた
(4) デェファレンシャルハイブリダィゼ一シヨン法によるステロイ ドで発現 が誘導される遺伝子の選択
A) 各プラスミ ド DNAをスポッ 卜したメンブランの作成
大腸菌形質転換体を、 それそれ 2mlのアンピシリン （50〃g/ml ) を含む L培地 （ トリプトン（trypton) 10g、 酵母抽出物（yeast extract ) 5g、 NaCl 10g(pH 7. 5 )/ 1L) で一晩培養して、 プラスミ ド自動分離装置 （クラボー、 PI- 100) でプラスミ ド DNAを精製した。 それらの DNAが溶解した TEバッファーに当量のアルカリ溶液 （ 3M NaCl,lN NaOH)'を加えて室温で 5分間放置した後、 ナイロンメンブランのバイ オダイン A (日本ポール社製） に等量 （2 /1) づっスポットして、 同一のフィル夕 —を 2枚ずつ作成した。
B) ディファレンシャルハイブリダィゼ一シヨンによるスクリーニング
Dex( + )mRNA及び Dex(-)mRNA各 5〃gをテンプレートとして、 逆転写酵素 「スーパ 一スクリプト TMII」 （GIBCO BRL社製） を用いて、 ファーストストランドの cDNA合 成反応を行った。 続いて、 E.coli RNase Hと E.coli DNAポリメラーゼ （STMTAGE NE社、 東洋紡） を用いたセカンドストランド合成反応を行なった。 こうして得ら れた 2種類の cDNAをそれそれへキサヌクレオチド、 クレノウ断片、 [ひ-32 P]dCTP等 を用いるマルチプライム DNA標識システム （フアルマシアバイオテク社製） で32 P 標識してプローブを作製した。 各 cDNAの l g当たり約 lxl09cpmの比活性のプロ一 ブが作成できた。 Dex( + )mRNAから合成されたものを 「プローブ A」 、 また Dex (- )m RNAからのものを 「プローブ B」 とした。 次に、 （4)- Aで示した 2枚 （duplicate) のフィル夕一について、 これら 2種類のプローブに対して別々にハイプリダイゼ一 シヨンを行った。 フィル夕一とプローブのハイブリダィゼーシヨンは、 以下の条 件下で行った。 プラスチヅクバヅグにフィルタ一を入れて、 プレハイブリダィゼ —シヨン溶液で満たし振盪しながら 65°Cで 4時間保温した。 プレハイブリダィゼー シヨン溶液の組成 （最終濃度） は、 5xSSPE(20xSSPE:3.6M NaCl、 0.2 Mリン酸ナト リウム（pH7.7)、 0.02M Na2EDTA)、 5xデンハルト溶液 （100xデンハルト溶液： 2% (W/V)BSA (牛血清アルブミン) 、 2% (W/V) Ficoll 400、 2% (W/V) ポリビニル ピロリ ドン （PVP) ) 、 0.5% SDSおよび熱変性した 20〃g/mlのサケ精子 DNAである 。 続いて、 新しいプレハイブリダィゼ一シヨン溶液に32 P標識プローブを加えた溶 液中で、 更に、 65°Cで 18時間保温してハイブリダィゼ一シヨンを行った。 フィル 夕一の洗浄は、 0.1%SDSを含む 2xSSPE溶液を用いて 65°C、 30分間の洗浄し、 続い て 0.1%SDSを含む O. lxSSPE溶液で 65°Cで 30分間 1回の洗浄を行った。 洗浄後、 フィ ルターを濾紙 （ワットマン 3MM) に貼り付けてイメージングプレート （富士フィル ム社製） を感光きせて、 「バイオイメージアナライザー Bas 2000」 （富士フィル ム社製） で解析した。 ペアとなる 2枚のフィル夕一のハイブリダィゼ一シヨンシグ ナルの強度を比較して、 「プローブ A」 により強いシグナルを示すクローンを 57ク ローンピックアップした。 以降の実施例は、 このうちの 1クローン （このクローン を 「r#5(rat#5 )」 と命名した） がコードする遺伝子である 「GISP」 （Glucocortic o id— Inducible Suppressor Protein)につ ヽての解析を示す。
(5) ノーザンブロッ トハイブリダィゼ一シヨン法による mRNAの検出
各種のステロイ ド処理条件を施した N 52E細胞から、 それそれ [実施例 1] の （ 1) に記した方法に従って、 mRNA (poly(A)+RNA) を調製した。 引き続き、 常法に 従ってノーザンプロット解析を行った。 つまり、 各サンプルの poly(A)+RNAをホル ムアルデヒドを含む 0.8%のァガロースゲルで電気泳動を行った。 泳動終了後、 毛 細管現象を利用して RNAをゲルからナイロンフィルター （バイオダイン A 、 日本ポ —ル社製） にトランスファ一した。 フィルターを UV処理することにより DNAを膜上 に固定した。 他方、 ハイブリダィゼ一シヨンに用いるプローブを以下のように作 製した。 つまり、 ラット 「GISP」 遺伝子を含むプラスミ ド DNA (以下、 「pBlue-r #5」 と称する） の大腸菌クローンを培養して、 核酸分離 ·精製用チップ 「QIAGEN -tip 500」 （QIAGENinc.フナコシ社製） を用いてプラスミ ド DNA を調製した。 本 プラスミ ド DNA10〃gを制限酵素 Xho Iと EcoRIで処理して、 0.8%の低融点ァガロー スゲルで泳動し、 約 0.3kbからなるベクターに挿入された DNA 断片を切り出して 、 DNA 製用試薬 「prepA- gene Matrix j (日本バイオラッドラボラトリ一ズ社製 ) により精製した。 こうして調製した DNA (約 30ng) を、 へキサヌクレオチド、 ク レノウ断片、 [ひ-3 2 P] dCTP等を用いるマルチプライムラべリング法により3 2 P 標識したプローブを作製した。
フィル夕一と上記プローブのハイブリダイゼ一シヨンはノーザンプロットハイ ブリダイゼ一シヨンの常法に従って行った。 プラスチックバッグにフィルターを 入れて、 ノーザンプロット用プレハイプリダイゼーシヨン溶液で満たして、 振盪 しながら 65°Cで 4時間保温した。 プレハイブリダィゼーシヨン溶液の組成は、 「5 0% (W/V) ホルムアミ ド、 5xSSPE、 5xデンハルト溶液 、 2% (W/V) Ficol l 400 、 2% (W/V) ポリビニルピロリ ドン （PVP) ) 、 0.5 % SDSおよび熱変性した 20 g/mlのサケ精子 DNA」 である。 続いて、 新しいプレハイブリダィゼ一シヨン溶液 に3 2 P標識プローブを加えた溶液中で、 更に、 42°Cで 18時間保温してハイブリダィ ゼ一シヨンを行った。 その後、 フィル夕一を 0. 1 %SDSを含む 2xSSPE溶液において 65°Cで 30分間という条件下で 3回、 引き続き 0. 1 % SDSを含む O. lxSSPE溶液で 42°Cで 30分間洗浄した。 軽く風乾した後、 オートラジオグラフィーを行った。 この結果 を、 図 1に示す。 デキサメタゾン処理により、 ラッ ト 「GISP」 の発現が誘導され ることが判明した。 なお、 レーン 2、 4、 6はデキサメタゾン処理の細胞の mRNA、 レーン 1、 3、 5はデキサメタゾン未処理の細胞の mRNAを泳動したものであるが、 レ —ン 1、 3、 5はデキサメタゾンの溶解に用いた溶媒であるエタノールだけを加えた 対照で、 レーン 2、 4、 6のデキサメタゾン処理をした細胞とそれそれ同じ時間 （レ ーン 1と 2 : 2時間、 レーン 3と 4 : 6時間、 レーン 5と 6 : 24時間） の培養を行った。
(6) DNA塩基配列の決定
ステロイ ドの刺激により誘導されることが確認された 「pBlue-r#5」 のインサー ト cDNAの DNA塩基配列を決定した。 シ一ケンシング反応は、 「Taq DyeDeoxyTM Te rmination Cycle Sequncing Kit」 （アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて 、 そのプロトコールに従って行った。 反応終了後、 スピンカラム （バイオラッド 社製 Bio- Spin 30) で精製した反応産物を DNAシーケンサー （AB I 373A DNA Sequ encing System) で解析した。 得られた DNA塩基配列について、 ホモロジ一検索シ ステム 「GeneBright」 （日立ソフトウェア社製） を用いて DNAデーターベースであ る GeneBank リリース 97に対してホモロジ一検索を行ったところ、 新規の配列を 有する遺伝子であることが判明した。 (7) ラット NRK細胞由来 cDNAライブラリーからのラット 「GISP」 遺伝子の取得 図 1に示した様にノーザンブロット解析結果において、 本遺伝子はサブトラク シヨンライブラリ'一から取得されたものよりかなり長い mRNAであることが示唆さ れ、 「pBlue-r#5」 のィンサ一ト cDNAは本来の遺伝子の一部分であることが判明し た。 そこで、 より完全な遺伝子を取得する目的でラット NM細胞由来 cDNAライブラ リーからの再スクリーニングを実施した。 [実施例 1] の （2) に示した NRK- 52E細 胞 Dex( + )サブライブラリー 10種について、 「pBlue- r#5」 のインサート cDNAより長 い DNA断片を有するクローンが含まれているかを PCRにて検討した。 具体的には、 ファージベクタ一 DNA部分に結合する合成 MAプライマー （ 「合成 DNA (配列番号： 6) 」 および 「合成 DNA (配列番号： 7) 」 ） と 「pBlue- r#5」 のィンサ一ト cDNAに 結合する DNAプライマー （ 「合成 DNA (配列番号： 8〜11) 」 ） を作製して、 各サブ ライブラリ一に含まれるファージ DNAを铸型として PCRを行い、 「pBlue-r#5」 を錡 型とした場合より長い PCR産物が増幅されるサプライブラリーがないかを調べた。
PCRの反応組成は、 前記 （3-3) と同様であるが、 ただし温度条件 は 「94° (、 1分 間」 、 「60°C、 1分間」 、 「72°C、 2分間」 30サイクルで反応した 。 この結果、 幾 つかの大きさのバンドが観察されたため、 さらに、 PCR反応産物のうち実際に 「p Blue-r#5j のインサート cDNA配列を持つものを検出する目的で 、 サザンプロット 解析を行った。 常法に従って PCR反応産物を 0.8%のァガロースゲルで電気泳動、 ナイロンフィル夕一への転写をした。 スクリーニングのプローブとしては上記 [ 実施例 1] の （5) に示した 「pBlue-r#5」 の約 0.3kb cDNAの断片を3 2 P標識して使 用した。 フィルターとプローブのハイブリダィゼ一シヨンは 、 [実施例 1] の （ 4) と同様な条件下で行った。 ハイブリダィゼ一シヨン後、 フィルターを 0.1%SD Sを含む 2xSSPE溶液、 65°Cで 30分間という条件下で 4回洗浄した。 軽く風乾した後 、 ォ一トラジオグラフィーを行った。 この結果、 サブライブラリ一の 3つにおいて 、 より長い DNA断片を有するクローンが存在することが確認された。 そこで、 それ らのサブライブラリーを宿主大腸菌 XL1- Blueに感染させ、 約 5万個づっ 15cm径のプ レートにプレーティングしてプラークを形成させた。 そのプレートからナイロン フィルター 「GeneScreen TM Plus Hybridization Transfer Membrane j (第 1化学 薬品社製） にファ'ージを吸着させ、 スクリーニング用フィル夕一を調製した。 そ れらフィル夕一は、 0.5M NaOHで 5分間処理することによりアルカリ変性し、 さら に 1M Tris-HCl(pH 7.5 )で 5分間処理することにより中和後、 UV処理を行い DNAを固 定化した。 スクリーニングのプローブとしては、 前記の 「pBlue- r#5」 の約 0.3kb cMAの断片を3 2 P標識して使用した。 プラークハイプリダイゼ一シヨンの結果か ら、 陽性プラークをピックアップして、 1mlの SMバッファーに移した。 さらに、 そ れそれもう一度プレート上にプラークを形成させて、 フィル夕一の作成とプロ一 ブによるハイブリダィゼ一シヨンの工程を繰り返して、 単一なクローンとして分 離した。 得られたファージクローンは、 [実施例 1] の （3) の （3-1) - Aに示した 方法によりえ ZAPファージベクタ一からプラスミ ド （pBluescript SK-) へ変換し て、 それらのインサート cDNAの DNA塩基配列を決定した。 この中で 1.2kb弱のイン サ一ト cMAを持つクローンのプラスミ ドを 「pBlue-r#5 1.2」 と名付けた。 「ρΒ1 ue-r#5 1.2」 のインサート cDNAの DNA塩基配列を決定したところ、 「pBlue-r#5」 のインサート cDNAの全配列を含んでおり、 さら に 5'上流に 900bp弱長い DNA断片で あることが判明した。
[実施例 2] ラットおよびヒ卜の各組織における 「GISP」 遺伝子の発現の確認 ラットゃヒトのどのような組織で 「GISP」 遺伝子が発現しているか調べるため に、 各種組織由来の mRNAが転写してあるノーザンプロッ トフィル夕一 （CL0NTECH 社製、 東洋紡） を使用してノーザンプロット解析を行った。 プローブとしては 「 pBlue-r#5 1.2」 DNAを制限酵素 EcoRIと Xholで切断して得られる約 1.2kbの DNA断片 を精製した後、 3 2P標識したものを用いた。 その他の実験条件は [実施例 1] (5) に示したとおりである。 その結果を図 2に示す。 ラッ トでは調べた各種の細胞に おいて約 2kbのバンドが検出されたが、 特に心臓、 骨格筋、 腎臓において高発現し ていることが観察された。 ヒトでは脳と末梢血白血球にシグナルがみられなかつ たが、 その他のほとんどの組織にラットよりやや大きな （約 2.4kb) ハイプリダイ ゼ一シヨンのバンドが検出できた （図 2 ) 。 なお、 図中の Aはラットの各組織 （ レーン 1から 8まで ΐ頃に、 心臓、 脳、 脾臓、 肺、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 精巣） のポ リ poly(A)+RNAを検出したものであり、 Bはヒト各組織 （レーン 1から 8 まで順に 、 心臓、 脳、 胎盤、 肺、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 脬臓） のポリ poly(A)+RNAを検出し たものであり、 Cはヒト各組織 （レーン 1から 8まで順に、 脾臓、 胸腺、 前立腺、 精巣、 卵巣、 小腸、 大腸、 末梢血白血球） のポリ poly(A)+RNAを検出したものであ り、 Dはヒト胎児各組織 （レーン 1から 4まで順に、 脳、 肺、 肝臓、 腎臓） のポリ poly(A)+RNAを検出したものである。
[実施例 3] ヒト 「GISP」 遺伝子の取得
前記 [実施例 2] の結果から、 ヒト腎臓などにおいてラット 「GISP」 遺伝子の類 似遺伝子 （ホモログ） が発現していることが確認出来た。 そこで、 ヒト腎臓の cD NAライブラリーを作製し、 ヒト 「GISP」 遺伝子のクローニングを実施した。
(1) ヒト腎臓の cDNAライブラリ一を作製
ヒト腎臓の mMA (poly(A)+RNA) (CL0NTECH社製、 東洋紡） 5〃gを出発材料とし て、 ZAP-cDNA合成キット （ZAP- cDNA Synthesis Kit) ( STRATAGENE社製、 東洋紡 ) を用いて作製を行った。 [実施例 1] の （2) の項と同様な工程により、 約 1x10 6個の組換え体ファージから成るライブラリーを作製した。
(2) ヒト 「GISP」 遺伝子のクローニング
上記のラットの遺伝子を含む 「pBlue- r#5 1.2」 から cDNA部分を切り出して精製 後、 マルチプライムラべリング法で3 2 P標識してプローブとして用いて、 [実施例 1] の （7) の項に示した様にハイブリダィゼ一シヨンを行った。 約 6xl05個の組換 え体ファージをスクリーニングして陽性のシグナルを示すファージプラークをピ ヅクアップした。 そして、 それそれについて再度フィル夕一の作成とプローブに よるハイブリダィゼ一シヨンの工程を繰り返して、 単一なファージクローンを 28 個分離した。 このうち 12ファージクローンについて、 [実施例 1] の （3) の （3- 1) -Aに示した方法により人 ZAPファージぺク夕一からプラスミ ド （pBluescriptS K-) へ変換した。 プラスミ ド DNAを調製してそれらめ制限酵素切断パターンや部分 的 DNA塩基配列の 析結果から、 ラット遺伝子に対応するヒト遺伝子を含むクロー ンとして 「pBlue-h#5-22」 （ 「h#5」 は 「human#5」 を意味する） を選び出し、 そ の全 DNA塩基配列とそれがコードするァミノ酸配列を決定した。 決定したアミノ酸 配列および塩基配列をそれそれ配列番号： 1および配列番号： 2に示す。 この遺伝 子は MOlbpの 0RF(open reading frame ) により 467アミノ酸残基から構成される新 規タンパク質をコードする領域を持っていた。 データベース上に現在公開されて いる EST (機能不明の短い cDNA断片） の中に、 本遺伝子の一部分と DNA塩基配列が 一致するものがあるが、 これら以外でこの遺伝子とホモ口ジ一が比較的高いもの として GeneBankのデータベースにゥサギの尿細管間質性腎炎抗原の遺伝子 （tubu lointerstiticalnepharitis antigen mRNA ( LOCUS名： 0園 270) ) (Nelson, T.R. , J. Biol . Chem. 270(27) , 16265-16270( 1995 )) が見出される。 この遺伝子 がコードするタンパク質とヒト 「GISP」 遺伝子はアミノ酸レベルで約 47%の類似 性がみられるが、 この類似度はラッ ト 「GISP」 遺伝子とヒト 「GISP」 遺伝子がコ —ドすると推定されるタンパク質間の類似度 （ラッ ト（上段）とヒト（下段）では 89 %、 図 3参照） と比較して明らかに低く、 「0CU24270」 は本明細書の遺伝子のホ モログ （ゥサギ版） というよりはそのフアミリーあるいはスーパ一フアミリーで あると推察される。
[実施例 4] ヒ卜 「GISP」 遺伝子の発現ベクターの作製
ヒト 「GISP」 遺伝子の発現べクタ一の構築法について以下に示す。 発現べクタ —としてはェロンゲ一シヨンファクターのプロモ一夕一を有する 「pEF-18S」 (0 hashi，H.， Proc. Natl . Acad. Sci . USA 91 158-162 ( 1994) ) を用いた。 「pEF-l 8S」 DNAを制限酵素 EcoRIと Notlで消化を行った後、 DNA精製用試薬 「prepA-gene Matrix」 （日本バイオ ·ラッ ドラボラトリーズ社製） により精製した。 一方、 こ れに揷入するために遺伝子は、 「pBlue- h#5-22」 DNAを鍊型とし、 図 2の 「合成 D NAj (配列番号： 12) と 「合成 DNA」 （配列番号： 13) をプライマ一として、 「L A taq」 （宝酒造社製） による PCRを行ってヒド 「GISP」 遺伝子のタンパク質コ一 ド領域約 1400bpを'調製した。 反応液の組成は、 lxLAtaqバッファ一 （宝酒造社製） と各 0.2mMの濃度 (いずれも最終濃度) の dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, TTP) にプライ マ一 DNA ( 1〃M) 及び铸型となる DNAを加えて合計 50 / 1の容量で、 また、 反応は 「 94°C、 5分間」 保温後、 「98°C、 10秒間」 、 「68°C、 2分間」 の 20サイクル、 さら に 「72°C、 10分間」 保温の 3工程の条件で行った。 PCR終了後、 制限酵素 EcoRIと N otlで消化を行った後、 さらに、 DNA精製用試薬 「prepA-gene Matrix」 により PCR 産物を精製した。 この両者を T4 MAリガーゼを使用する 「DNA Ligation Kit」 （ 宝酒造社製） により連結した後、 大腸菌 K- 12 株である X - Blueのコンビテント 細胞へ導入してアンビシリン耐性のコロニーを得た。 いくつかのコロニーの培養 菌体からプラスミ ドを回収して制限酵素切断パターンから、 予定どおりにヒト 「 GISPj 遺伝子 DNAが挿入されたプラスミ ド DNA 「pEF- h#5」 を取得した。 得られたプ ラスミ ド DNAについて、 ベクターに挿入されたヒト 「GISP」 遺伝子部分の全塩基配 列に誤りのないことを DNA塩基配列を解析して確認した。
[実施例 5] ラット 「GISP」 遺伝子の発現ベクターの作製
( 1) ラット 「GISP」 遺伝子の 5'端側部分のクローニング
前記 [実施例 4] に示したヒト 「GISP」 遺伝子の解析の結果、 ラット 「GISP」 遺 伝子を含むプラスミ ド 「pBlue-r#5 1.2」 には、 ヒト 「GISP」 mRNAの 5，端側に対応 する部分が不足していることが判明した。 そこで PCRを応用してラヅト 「GISP」 遺 伝子の 5'端側部分のクロ一ニングを実施した。 5'側プライマー 「合成 DM (配列番 号： 14) 」 はヒ卜の遺伝子 （cDNA) 配列を参考として、 また、 3，側プライマー 「 合成 DNA (配列番号： 15) 」 はラッ卜の遺伝子 （cDNA) 配列に対応するものをデザ インして使用した。 鍊型 DNAとして NRK52E Dex( + )mRNAから合成した cDNAを錡型と して用いて、 「LA Taq」 （宝酒造社製） による PCRを実施した。 反応液の組成は 、 [実施例 4] と同様で、 また、 反応条件は 「96°C、 20秒間」 、 「68°C、 1分間」 の 25サイクルで行った。 PCRで増幅された約 700bpを 0.8%の低融点ァガロースゲル で泳動し、 目的の DNA断片を切り出して、 DNA 製用試薬 prepA-gene Matrixによ り精製した。 精製'した DNA断片は、 ""l igation independent cloning (LIC) 法」 (Nucleic Acid Res. 18 :6069-6074 ( 1990 )など） の改法である 「PCR Direct c loning systemj (CLONTECH社製、 東洋紡） により 「pDIRECTベクター」 (CL0NTE CH社製、 東洋紡） にサブクローニングを行った。 得られたプラスミ ド DNAを 「pDi rect700j とした。
(2) ラッ ト 「GISP」 遺伝子の 5'端側部分と 3'端側部分の連結
PDirect700j のラッ ト 「GISP」 遺伝子の 5，端側部分を [実施例 1] の （7) に 記述した 「pBlue- r#5 1.2」 に連結するために、 PCRを利用した遺伝子融合法 （Va l lete, F . et al Nucleic Acid Res. 17 723-733( 1989 )) を実施した。 まず、 5 '端側部分と 3'端側部分を含む 2種類の DNA断片を PCRで調製した。 5'端側部分は pD irect700 DNAを鍊型に 「合成 DNA (配列番号： 14) 」 と 「合成 DNA (配列番号： 16 ) 」 を用いて、 また、 3'端側部分は 「pBlue- r#5 1.2」 DNAを銪型に 「合成 DNA ( 配列番号： 17) 」 と 「合成 DNA (配列番号： 18) 」 を用い、 それそれ第 1段階の PC Rを行った。 第 1段階の PCR産物には、 DNA断片を連結するためにオーバーラップす る部分 （30-40bp) ができるようなプライマ一配列となっている。 得られた 2つの DNA断片を精製して、 さらに第 2段階 PCRを実施した。 第 2段階 PCRは 2ステップの反 応から成るが、 1ステップ目では、 2つの PCR産物を等量 （各 40〃g) 混合してブラ イマ一を添加せずに、 「96°Cで 30秒間」 、 「72°Cで 2分間」 の 5サイクルの反応を 行った。 2ステップ目として、 その反応液にプライマー （ 「合成 DNA (配列番号： 14) 」 と 「合成 DNA (配列番号： 18) 」 ） （各 0.2〃M) を添加して、 さらに、 「9 6°Cで 20秒間」 、 「65°Cで 4分間」 の 25サイクル、 及び 72°Cで 6分間の反応を行つ た。 その結果、 期待される約 1.8kbの DNA断片を得た。 得られた断片は精製後、 LI C法を利用した 「PCR Direct cloning systemj によりサブクローニングを行った 。 幾つかのクロ一ンよりプラスミ ド DNAを抽出して解析して、 目的のプラスミ ド DNA CpDirect r#5-1 .8kj を得た。 常法に従いプラスミ ド DNAを調製後、 DNA塩基 配列を決定した。 連結前のそれそれの配列と変化がないことが確認できた。 しか し、 決定された塩 ¾配列の内、 5'末端から 24塩基はヒト配列由来プライマ一の配 列である。 そこで、 ラヅ トの cDNA配列として確定している部分から 5'上流側に向 かうプライマーと、 ベクター側からインサート cDNAの 5'末端側方向に向かうブラ イマ一を用いて、 [実施例 1 ] の（2 )に示した NM52E細胞 Dex( + )サブライブラリ ーを錶型として 3段階の PCRを実施した。 ファージ液 5〃1を 98°C、 10分間熱処理し た後、 LAtaq (宝酒造社製） による PCRを行った。 反応液の組成は、 IX LA taqバッ ファー （宝酒造社製） と各 0.2mMの濃度 （いずれも最終濃度） の dNTPs ( dATP , d CTP , dGTP, TTP ) にプライマ一 DNA ( 1 zM) 及び錡型となる DNAを加えて合計 50 ju 1の容量で、 また、 反応は （96°C、 30秒間） （58°C、 30秒間） （72°C、 2分間） の 25サイクル、 さらに （72°C、 10分間） 保温の 3工程の条件で行った。 計 3回の PCR に、 cDNAの上流側 （ベクタ一配列にハイプリダイズする） の 5'プライマーとして 合成 DNA (配列番号： 6 ) を、 また 3'プライマーとして 3種類のプライマ一 （合成 D NA (配列番号： 22、 23、 24) を順次使用して、 目的と思われる大きさの PCR産物を 得ることができた。 PCR 産物をゲルから切りだして精製後、 DNA塩基配列を決定 した。 最終的に決定されたラッ ト cDNAの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号
： 3および配列番号： 4に示した。
( 3) ラッ ト 「GISP」 遺伝子の発現ベクターの作製
[実施例 4] と同様な工程によりラッ ト 「GISP」 遺伝子の発現ベクターを構築し た。 ベクターに挿入するための DNA断片は 「pDirect r#5-1.8kj を使用して、 LA taqおよび 「合成 DNA (配列番号： 12) 」 と 「合成 DNA (配列番号： 19) 」 に示す配 列のプライマ一を用いて、 PCI こてラッ ト 「GI SP」 遺伝子のタンパク質コード領域 約 1400bpを増幅した。 反応条件等は [実施例 4] に示したとおりである。 PCR反応 産物は、 制限酵素 Ecoillと Notlで消化処理後、 精製した。 制限酵素 EcoRIと Notlで 消化した 「pEF- 18S DNA」 に T4 DNAリガ一ゼを用いて連結した後、 大腸菌 K- 12株で ある XL卜 B lueのコンビテント細胞へ導入してアン.ピシリン耐性のコ D二一を得た 。 いくつかのコロニーの培養菌体からプラスミ ドを回収して制限酵素切断パ夕一 ン等から予定どお'りにラット 「GISP」 遺伝子 DNAが挿入されたプラスミ ド DNAを取 得した。 得られたプラスミ ド DNA 「pEF-r#5」 についてラット 「GISP」 遺伝子部分 のシークェンスを行い、 塩基配列に間違いのないことを確認した。
[実施例 6 ]ヒト IL-8及びラッ ト CINC (ラット IL- 8) プロモータ一活性に対する 「GISP」 遺伝子の効果
( 1) 細胞培養
ヒト細胞としては、 肺由来の細胞である 「MRC- 5 SV1 TGI細胞」 （Riken Cel l Bank) を 「RITC 80- 7培地」 に 10% FCSを添加して培養した。 ラット細胞としては 、 腎上皮由来の細胞株である 「NRK-52E細胞」 （Flow Laboratories Inc. Tokyo, Japan) を 「DMEM培地」 に 10% FCSを添加して培養した。 デキサメタゾンは 100%ェ 夕ノールに溶解し、 培地で希釈して加えた。 なお、 対照実験群には溶媒であるェ 夕ノ一ルをデキサメ夕ゾン処理群のェ夕ノ一ルと同じ濃度になるように添加した
(2) ルシフェラーゼ発現ベクターの作製
1) 「pGL3- hIL8- 185」 の作製
PCRブライマ一として、 「5， -ATGTCTCGAGAATTCAGTAACCCAGGCATTATTTTATC-3' (配 列番号： 20) 」 および 「5' - TTGTCCTAGAAGCTTGTGTGCTCTGCTGTC-3' (配列番号： 21 ) 」 を合成し、 ヒト 「VA- 13細胞」 （Riken Cell Bank) のゲノム DNAを錶型として PCRを行ない、 ヒト IL- 8 (好中球走化性サイ トカイン） のプロモーター領域 （- 1 481から +44 bp) (K. Matsushima et. al . : J. Immunol . , 143, 1366-1371 , 1989 ) を含む DNAを調製した。 これを制限酵素 Dra Iと Hind I I Iで切断して、 -185から +44 bpの IL- 8プロモーター領域 DNA断片を回収精製した。 一方、 プラスミ ド 「pGL 3 - Promoter Vectorj (Promega社製） を Sma Iと Hind I I Iで切断して SV40初期プロ モータ一を取り除いたものを調製した。 これに、 上記の- 185から +44bp断片を挿入 して、 ヒト IL-8プロモー夕一を持つホ夕ルルシフェラーゼ発現ベクター 「pGL3- h IL8- 185」 を調製した。
2) 「pGL3- CINC'- 164」 の作製
「pGL2 - Basic Vector j (Promega社製） の Kpn Iと Hind I I I切断部位の間にラッ ト CINC (ラット IL-8) プロモーター領域 （-164から +7 bp) をクローン化したブラ スミ ドを調製した （T. Ohtsuka et. al. : J. Biol. Chem. , 271, 1651-1659, 19 96) 。 このプラスミ ドを制限酵素 Sma Iと Hind I IIで切断して、 -164から +7 bpの CINCプロモー夕一領域 DNA断片を回収精製した。 一方、 プラスミ ド 「pGL3- Promot er Vectorj (Promega社製） を Sma Iと Hind 111で切断して SV40初期プロモーター を取り除いたものを調製した。 これに、 上記の- 164から +7bp断片を挿入して、 ラ ット CINCプロモータ一を持つホ夕ルルシフェラーゼ発現べクタ一 「pGL3- CINC-16 4」 を調製した。
3) 「pRL- EF」 の作製
厂 pEF- 18S」 ベクタ一を Hind I I Iと EcoR Iで切断して、 ェロンゲ一シヨンファク 夕一一 1ひプロモーター領域を含む約 1.2kbpの DNA断片を回収精製した。 一方、 プ ラスミ ド 「pRL- null Vectorj (Promega社製） を Hind I IIと EcoR Iで切断したプ ラスミ ドを用意した。 これに、 上記のェロンゲーシヨンファクタ一- 1ひプロモー 夕一領域 DNA断片を挿入して、 ェロンゲーシヨンファクタ一- 1ひプロモー夕一を持 っゥミシィタケルシフェラ一ゼ発現べクタ一 「pRL- EF」 を調製した。
(3) レポ一夕一遺伝子法による 「GISP」 の評価
「GISP」 の持つ転写抑制活性について解析するため、 レポーター遺伝子法によ るアツセィを行った。 すなわち、 「GISP」 発現ベクター （ 「pEF- h#5」 ， 「pEF - r# 5」 ） と共に、 ホ夕ルルシフェラ一ゼ発現プラスミ ド （ 「pGL3- hIL8-185」 または 「pGL3- CINC- 164」 ） 、 およびゥミシィタケルシフェラ一ゼ発現プラスミ ド （ 「p RL- EF」 ） 、 計 3種類のプラスミ ド DNAを培養細胞にコトランスフエク卜して、 プロ モーター活性の変化を調べた。 方法は、 実験第 1日目に 「應- 5 SV1 TG1細胞」 または 「NRK-52E細胞」 を 6- wel 1プレート (Corning社製) に 3〜5xl05個/ wellで蒔き、 実験第 2日目に DEAE-デキス トラン法を用いて： 上記プラスミ ド DNAを細胞にコトランスフエクトした。 なお、 用いた DNA量は、 「MRC- 5 SV1 TGI細胞」 の場合、 1ゥエル当たり 「GISP」 発現べク ター ( 「pEF- h#5」 または 「pEF- r#5」 ) 0.75^g + 「pGL3- hIL8- 185」 0.25 g + 厂 pRL-EFj 0.025〃gで、 「NRK-52E細胞」 の場合は、 1ゥエル当たり 「GISP 」 発現べ クタ一 （ 「pEF- h#5」 または 「pEF- r#5」 ) l . O^g + 「pGL3- CINC-164」 0.5 /g M+
「pRL- EF」 0.05 /gであった。 実験第 3日目にデキサメタゾン （終濃度 1 M) を添 加し、 37°Cで 2時間培養後、 更に IL- 1 5 (終濃度 100 U/ml) を添加し、 5時間後に 細胞溶解剤 「Passive LysisBuffer」 （Promega社製） を用いて細胞抽出液を調製 した。 そして、 「Duaト Luciferase Repoter Assay Systemj (Promega社製) を 用いて、 この細胞抽出液中のホ夕ルおよびゥミシィタケルシフェラ一ゼ活性を 「 Lumat model LB953j ( Berthold, Germany) にて測定した （図 4， 図 5) 。 「pEF-h #5」 および 「pEF- r#5」 の対照としては、 「#5cDNA」 を挿入していない 「pEF-18S 」 ベクターを用いた。 なお、 図 4Aはラット IL-8 (CINC) プロモ一夕一の下流にホ 夕ルルシフェラ一ゼ遺伝子が連結したベクタ一、 図 5Aはヒト IL- 8プロモー夕一の 下流にホ夕ルルシフェラーゼ遺伝子が連結したベクタ一、 図 4Bおよび図 5Bは EFプ 口モーターの下流にゥミシィタケルシフェラーゼ遺伝子が連結したベクターが導 入された細胞で検出した。
この結果、 「#5cDNA」 を挿入していない 「pEF- 18S」 ベクターを導入した細胞で は、 IL-1 ?を添加すると、 ヒト IL- 8およびラヅ ト CINCプロモー夕一が活性化され 、 強いホタルルシフェラ一ゼ活性が誘導されるが、 これにデキサメタゾン処理を 加えることで抑制が認められた （図 4A、 5A) 。 「GISP」 発現べクタ一 （ 「pEF-h# 5」 または 「pEF-r#5」 ) を導入しておくと、 デキサメタゾン処理と同程度かそれ 以上のホ夕ルルシフェラーゼ発現抑制が認められた （図 4A、 5A) 。 しかしながら 、 「GISP」 は、 ェロンゲーシヨンファクタ—— 1 αプロモ一夕一活性によるゥミシ ィタケルシフェラ一ゼの発現を抑制しなかった （図 4B、 5B) 。 したがって、 「GI SPj の持つヒト IL- 8およびラット CINCプロモータ一抑制作用の特異性が示された
[実施例 7]
配列番号： 3に示されるラヅト 「GISP」 のアミノ酸配列のうち、 6力所の領域 （表 1に示す） を選び、 この配列を含むペプチドを合成した。 免疫は、 キャリアタン パク質としてゥシチログロブリン （thyroglobulin) を結合させた抗原液と油性ァ ジュバンド （ （株） 免疫生物研究所製） のェマルジヨンを作成して、 100〃gずつ 8回にわたってゥサギ 3把に接種した。 表 1 合成ペプチド抗原に含まれるラット 「GISP」 のアミノ酸配列 ぺプチド 5-1 (配列番号： 25) MTPILSPQNLLSCD
ベプチド 5- 2 (配列番号： 26) CRGGRLDGAWWFLRRRGVVSD
ぺプチド 5- 3 (配列番号： 27) SGREQNDEASPTPRC
ぺプチド 5-4 (配列番号： 28) HSRAMGRGKRQATSRC
ベプチド 5- 5 (配列番号： 29) VSQGRPEQYRRHGTHSVKI
ぺプチド 5 - 6 (配列番号： 30) ETFVLGVWGRVGMED GHH
なお、 「ペプチド 5- 5」 および 「ペプチド 5-6」 については、 N末端にシスティン 残基を付加したぺプチドを用いた。
ゥサギの試験採血をして酵素免疫測定法を用いて抗体値を調べたところ、 いず れの血清においても合成べプチドに対する抗体値の上昇が確認されたので、 これ らを抗血清とした。 得られた抗血清の評価を行うために、 以下のような試験を行 つた。 配列番号： 3に示されるラット 「GISP」 のアミノ酸配列をコードする遺伝子 を導入し、 発現ざせた C0S1細胞 （理研細胞開発銀行、 RCB0143) から調製した蛋白 質画分を SDS-ポリアクリルアミ ド電気泳動 (SDS-PAGE) にかけ、 次いで、 PVDF膜
(フルォロトランス、 日本ジエネテイクス社製） に BioRadセミ ドライブロッティ ング装置 （日本バイオラッドラボラトリーズ社製） にて転写した。 転写後の膜を
「20mM Tris- HC1、 0.5M NaCl(pH7.5 )」 （以下、 「TBS」 と称する） で 5分 間洗浄 し、 0. 1% Tween 20入り TBS (以下、 「TTBS」 と称する） で 5分間 2回洗浄後、 プロ ッキング試薬であるスマイライ ト （住友金属工業社製） を 2%含む TTBSから成るブ 口ッキング剤で室温で 60分間処理した。 各べプチドに対する抗体を含む各抗血清 を 2%スマイライ トを含む TTBS溶液で 1000倍希釈したものを一次抗体として、 ゥェ スタンプロット解析を行った。 即ち、 抗 GISPペプチド抗体、 2%スマイライ トを含 む TTBS溶液で室温 60分間処理後、 TTBSで 5分間 2回洗浄した。 次にアルカリフォス ファターゼ標識抗ゥサギ IgG (日本バイオラッ ドラボラトリーズ社製） を 2%スマ ィライ トを含む TTBS溶液で 1000倍希釈したものを 2次抗体として、 室温で 60分間処 理後、 TTBSで 5分間 2回の洗浄を行った。 さらに、 TBSで 5分間 2回の洗浄を行った後 、 アルカリフォスファターゼ発色キット （AP発色キッ ト） （日本バイオラッ ドラ ボラトリーズ社製） により発色させた。 その結果、 「ペプチド 5-3」 および 「ぺプ チド 5- 5」 の抗血清において 「GISP」 タンパク質が認識、 検出されることが確認で きた。 産業上の利用可能性
本発明により、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモーターの活性化を抑制 する活性を有するタンパク質、 該タンパク質をコードする DNA、 該 DNAを含むべク 夕一、 該ベクターを保持する形質転換体、 該タンパク質に反応する抗体、 および 該タンパク質を有効成分とする医薬組成物が提供された。 本発明のタンパク質は、 IL-8プロモーターの活性化を抑制する活性を有するた め、 IL-8の発現と関連性を有する疾患の治療のための薬剤、 例えば、 抗炎症薬、 抗気管支喘息薬、 抗アレルギー薬、 抗リウマチ薬などへの利用が期待される。 また、 本発明のタンパク質は、 ヒト型のものはヒト体内において中和抗体など が産生されるおそれはない。 また、 ヒト型およびラット型はいずれも IL-8プロモ 一夕一の活性化と同様の経路により活性化され発現する IL- 8以外の炎症誘発性蛋 白質、 例えば、 TNF-ひ（Shakhov，A.N. et. al. J. Exp. Med. 171,35-47 (1990))や IL-6(Kishimoto, T. et. al. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 90,10193-7 (1993))、 一 酸化窒素合成酵素（NOS) ( Xie.Q.W. et.al. J.Biol.Chem. 269,4705-8 (1994))の 産生を抑えることなども考えられ、 広範な抗炎症効果が期待できる。
配列表 ―
( 1 ) 出願人氏名 ：株式会社 サイ トシグナル研究所
( 2 ) 発明の名称'：細胞内シグナル伝達抑制因子
( 3 ) 整理番号： S 1— 9 0 1 P C T
( 4 ) 出願番号：
( 5 ) 出願曰 ：
( 6 ) 優先権のもととなった出願をした国名および出願番号： 日本国、 特願平 9 — 6 2 0 0 8号
( 7 ) 優先日 ：平成 9年 2月 2 8日
( 8 ) 配列の数： 3 0 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 467
配列の型 ： アミノ酸
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： タンパク質
酉己 列
Met Trp Arg Cys Pro Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10
Pro Leu Ala Gly His Leu Ala Leu Gly Ala Gin Gin Gly Arg Gly Arg
15 20 25
Arg Glu Leu Ala Pro Gly Leu His Leu Arg Gly lie Arg Asp Ala Gly
30 35 40
Gly Arg Tyr Cys Gin Glu Gin Asp Leu Cys Cys Arg Gly Arg Ala Asp
45 50 55 60
Asp Cys Ala Leu Pro Tyr Leu Gly Ala l ie Cys Tyr Cys Asp Leu Phe 65 70 75
Cys Asn Arg Thr Val Ser Asp Cys Cys Pro Asp Phe Trp Asp Phe Cys
80 85 90
Leu Gly Val Pro Pro Pro Phe Pro Pro lie Gin Gly Cys Met His Gly
95 100 105
Gly Arg l ie Tyr Pro Val Leu Gly Thr Tyr Trp Asp Asn Cys Asn Arg
110 115 120
Cys Thr Cys Gin Glu Asn Arg Gin Trp Gin Cys Asp Gin Glu Pro Cys 125 130 135 140
Leu Val Asp Pro Asp Met l ie Lys Ala lie Asn Gin Gly Asn Tyr Gly
145 150 155
Trp Gin Ala Gly Asn His Ser Ala Phe Trp Gly Met Thr Leu Asp Glu
160 165 170
Gly l ie Arg Tyr Arg Leu Gly Thr l ie Arg Pro Ser Ser Ser Val Met
175 180 185
Asn Met His Glu lie Tyr Thr Val Leu Asn Pro Gly Glu Val Leu Pro
190 195 200
Thr Ala Phe Glu Ala Ser Glu Lys Trp Pro Asn Leu l ie His Glu Pro 205 210 215 220
Leu Asp Gin Gly Asn Cys Ala Gly Ser Trp Ala Phe Ser Thr Ala Ala
225 230 235
Val Ala Ser Asp Arg Val Ser l ie His Ser Leu Gly His Met Thr Pro
240 245 250
Val Leu Ser Pro Gin Asn Leu Leu Ser Cys Asp Thr His Gin Gin Gin
255 260 Z65
Gly Cys Arg Gly Gly Arg Leu Asp Gly Ala Trp Trp Phe Leu Arg Arg 270 275 280
Arg Gly Val Val Ser Asp His Cys Tyr Pro Phe Ser Gly Arg Glu Arg 285 ' 290 295 300
Asp Glu Ala Gly Pro Ala Pro Pro Cys Met Met His Ser Arg Ala Met
305 310 315
Gly Arg Gly Lys Arg Gin Ala Thr Ala His Cys Pro Asn Ser Tyr Val
320 325 330
Asn Asn Asn Asp lie Tyr Gin Val Thr Pro Val Tyr Arg Leu Gly Ser
335 340 345
Asn Asp Lys Glu l ie Met Lys Glu Leu Met Glu Asn Gly Pro Val Gin
350 355 360
Ala Leu Met Glu Val His Glu Asp Phe Phe Leu Tyr Lys Gly Gly lie 365 370 375 380
Tyr Ser His Thr Pro Val Ser Leu Gly Arg Pro Glu Arg Tyr Arg Arg
385 390 395
His Gly Thr His Ser Val Lys l ie Thr Gly Trp Gly Glu Glu Thr Leu
400 405 410
Pro Asp Gly Arg Thr Leu Lys Tyr Trp Thr Ala Ala Asn Ser Trp Gly
415 420 425
Pro Ala Trp Gly Glu Arg Gly His Phe Arg l ie Val Arg Gly Val Asn
430 435 440
Glu Cys Asp l ie Glu Ser Phe Val Leu Gly Val Trp Gly Arg Val Gly 445 450 455 460
Met Glu Asp Met Gly His His
465 配列番号 ： 2 .
配列の長さ ： 2187 ―
配列の型 ： 核酸—
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： cDNA to mRNA
配列の特徴
特徴を表す記号 ： CDS
存在位置 ： 77 . . 1477
特徴を決定した方法 ： E
配 列
CGCAGAGCCA GGAGGCGGAG GCGCGCGGGC CAGCCTGGGC CCCAGCCCAC ACCTTCACCA 60 GGGCCCAGGA GCCACC ATG TGG CGA TGT CCA CTG GGG CTA CTG CTG TTG CTG 112
Met Trp Arg Cys Pro Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10
CCG CTG GCT GGC CAC TTG GCT CTG GGT GCC CAG CAG GGT CGT GGG CGC 160 Pro Leu Ala Gly His Leu Ala Leu Gly Ala Gin Gin Gly Arg Gly Arg
15 20 25
CGG GAG CTA GCA CCG GGT CTG CAC CTG CGG GGC ATC CGG GAC GCG GGA 208 Arg Glu Leu Ala Pro Gly Leu His Leu Arg Gly He Arg Asp Ala Gly
30 35 40
GGC CGG TAC TGC CAG GAG CAG GAC CTG TGC TGC CGC GGC CGT GCC GAC 256 Gly Arg Tyr Cys Gin Glu Gin Asp Leu Cys Cys Arg Gly Arg Ala Asp
45 50 55 60
GAC TGT GCC CTG CCC TAC CTG GGC GCC ATC TGT TAC TGT GAC CTC TTC 304 Asp Cys Ala Leu Pro Tyr Leu Gly Ala l ie Cys Tyr Cys Asp Leu Phe 65 70 75
TGC AAC CGC ACG GTC TCC GAC TGC TGC CCT GAC TTC TGG GAC TTC TGC 352 Cys Asn Arg Thr Val Ser Asp Cys Cys Pro Asp Phe Trp Asp Phe Cys
80 85 90
CTC GGC GTG CCA CCC CCT TTT CCC CCG ATC CAA GGA TGT ATG CAT GGA 400 Leu Gly Val Pro Pro Pro Phe Pro Pro l ie Gin Gly Cys Met His Gly
95 100 105
GGT CGT ATC TAT CCA GTC TTG GGA ACG TAC TGG GAC AAC TGT AAC CGT 448 Gly Arg lie Tyr Pro Val Leu Gly Thr Tyr Trp Asp Asn Cys Asn Arg
110 115 120
TGC ACC TGC CAG GAG AAC AGG CAG TGG CAG TGT GAC CAA GAA CCA TGC 496 Cys Thr Cys Gin Glu Asn Arg Gin Trp Gin Cys Asp Gin Glu Pro Cys
125 130 135 140
CTG GTG GAT CCA GAC ATG ATC AAA GCC ATC AAC CAG GGC AAC TAT GGC 544 Leu Val Asp Pro Asp Met l ie Lys Ala lie Asn Gin Gly Asn Tyr Gly
145 150 155
TGG CAG GCT GGG AAC CAC AGC GCC TTC TGG GGC ATG ACC CTG GAT GAG 592 Trp Gin Ala Gly Asn His Ser Ala Phe Trp Gly Met Thr Leu Asp Glu
160 165 170
GGC ATT CGC TAC CGC CTG GGC ACC ATC CGC CCA TCT TCC TCG GTC ATG 640 Gly lie Arg Tyr Arg Leu Gly Thr lie Arg Pro Ser Ser Ser Val Met
175 180 185
AAC ATG CAT GAA ATT TAT ACA GTG CTG AAC CCA GGG GAG GTG CTT CCC 688 Asn Met His Glu lie Tyr Thr Val Leu Asn Pro Gly Glu Val Leu Pro
190 195 200
ACA GCC TTC GAG GCC TCT GAG AAG TGG CCC AAC CTG ATT CAT GAG CCT 736 Thr Ala Phe Glu Ala Ser Glu Lys Trp Pro Asn Leu l ie His Glu Pro
205 210 215 220
CTT GAC CM GGC "AAC TGT GCA GGC TCC TGG GCC TTC TCC ACA GCA GCT 784
Leu Asp Gin Gly Asn Cys Ala Gly Ser Trp Ala Phe Ser Thr Ala Ala
225 230 235
GTG GCA TCC GAT CGT GTC TCA ATC CAT TCT CTG GGA CAC ATG ACG CCT 832 Val Ala Ser Asp Arg Val Ser l ie His Ser Leu Gly His Met Thr Pro
240 245 250
GTC CTG TCG CCC CAG AAC CTG CTG TCT TGT GAC ACC CAC CAG CAG CAG 880 Val Leu Ser Pro Gin Asn Leu Leu Ser Cys Asp Thr His Gin Gin Gin
255 260 265
GGC TGC CGC GGT GGG CGT CTC GAT GGT GCC TGG TGG TTC CTG CGT CGC 928 Gly Cys Arg Gly Gly Arg Leu Asp Gly Ala Trp Trp Phe Leu Arg Arg
270 275 280
CGA GGG GTG GTG TCT GAC CAC TGC TAC CCC TTC TCG GGC CGT GAA CGA 976 Arg Gly Val Val Ser Asp His Cys Tyr Pro Phe Ser Gly Arg Glu Arg
285 290 295 300
GAC GAG GCT GGC CCT GCG CCC CCC TGT ATG ATG CAC AGC CGA GCC ATG 1024 Asp Glu Ala Gly Pro Ala Pro Pro Cys Met Met His Ser Arg Ala Met
305 310 315
GGT CGG GGC AAG CGC CAG GCC ACT GCC CAC TGC CCC AAC AGC TAT GTT 1072 Gly Arg Gly Lys Arg Gin Ala Thr Ala His Cys Pro Asn Ser Tyr Val
320 325 330
AAT AAC AAT GAC ATC TAC CAG GTC ACT CCT GTC TAC CGC CTC GGC TCC 1120 Asn Asn Asn Asp l ie Tyr Gin Val Thr Pro Val Tyr Arg Leu Gly Ser
335 340 345 AAC GAC AAG GAG ATC ATG AAG GAG CTG ATG GAG AAT GGC CCT GTC CAA 1168 Asn Asp Lys Glu He Met Lys Glu Leu Met Glu Asn Gly Pro Val Gin
350 355 360
GCC CTC ATG GAG GTG CAT GAG GAC TTC TTC CTA TAC AAG GGA GGC ATC 1216 Ala Leu Met Glu Val His Glu Asp Phe Phe Leu Tyr Lys Gly Gly l ie
365 370 375 380
TAC AGC CAC ACG CCA GTG AGC CTT GGG AGG CCA GAG AGA TAC CGC CGG 1264 Tyr Ser His Thr Pro Val Ser Leu Gly Arg Pro Glu Arg Tyr Arg Arg
385 390 395
CAT GGG ACC CAC TCA GTC AAG ATC ACA GGA TGG GGA GAG GAG ACG CTG 1312 His Gly Thr His Ser Val Lys l ie Thr Gly Trp Gly Glu Glu Thr Leu
400 405 410
CCA GAT GGA AGG ACG CTC AAA TAC TGG ACT GCG GCC AAC TCC TGG GGC 1360 Pro Asp Gly Arg Thr Leu Lys Tyr Trp Thr Ala Ala Asn Ser Trp Gly
415 420 425
CCA GCC TGG GGC GAG AGG GGC CAC TTC CGC ATC GTG CGC GGC GTC AAT 1408 Pro Ala Trp Gly Glu Arg Gly His Phe Arg l ie Val Arg Gly Val Asn
430 435 440
GAG TGC GAC ATC GAG AGC TTC GTG CTG GGC GTC TGG GGC CGC GTG GGC 1456 Glu Cys Asp l ie Glu Ser Phe Val Leu Gly Val Trp Gly Arg Val Gly
445 450 455 460
ATG GAG GAC ATG GGT CAT CAC TGAGGCTGCG GGCACCACGC GGGGTCCGGC 1507 Met Glu Asp Met Gly His His
465
CTGGGATCCA GGCTAAGGGC CGGCGGAAGA GGCCCCAATG GGGCGGTGAC CCCAGCCTCG 1567 CCCGACAGAG CCCGGGGCGC AGGCGGGCGC CAGGGCGCTA ATCCCGGCGC GGGTTCCGCT 1627 /。d ει〇 ト
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303 3謹00V3_ 〇 〇 sEEE iSM IJV 寸
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65 70 75 80
Ser Asp Cys Cys Pro Asp Phe Trp Asp Phe Cys Leu Gly l ie Pro Pro
"85 90 95
Pro Phe Pro Pro Val Gin Gly Cys Met His Ala Gly Arg He Tyr Pro
100 105 110 l ie Phe Gly Thr Tyr Trp Glu Asn Cys Asn Arg Cys Thr Cys His Glu
115 120 125
Lys Gly Gin Trp Glu Cys Asp Gin Glu Pro Cys Leu Val Asp Pro Ala
130 135 140
Met l ie Lys Ala l ie Asn Arg Gly Asn Tyr Gly Trp Gin Ala Gly Asn 145 150 155 160
His Ser Ala Phe Trp Gly Met Thr Leu Asp Glu Gly l ie Arg Tyr Arg
165 170 175
Leu Gly Thr l ie Arg Pro Ser Ser Ser Val Met Asn Met Asn Glu He
180 185 190
Tyr Thr Val Leu Gly Gin Gly Glu Val Leu Pro Thr Ala Phe Glu Ala
195 200 205
Ser Glu Lys Trp Pro Asn Leu l ie His Glu Pro Leu Asp Gin Gly Asn
210 215 220
Cys Ala Gly Ser Trp Ala Phe Ser Thr Ala Ala Val Ala Ser Asp Arg 225 230 235 240
Val Ser l ie His Ser Leu Gly His Met Thr Pro lie Leu Ser Pro Gin
245 250 255
Asn Leu Leu Ser Cys Asp Thr His His Gin Lys Gly Cys Arg Gly Gly
260 265 270
Arg Leu Asp Gly Ala Trp Trp Phe Leu Arg Arg Arg Gly Val Val Ser 275 280 285
Asp Asn Cys Tyr Pro Phe Ser Gly Arg Glu Gin Asn Asp Glu Ala Ser
290 ' 295 300
Pro Thr Pro Arg Cys Met Met His Ser Arg Ala Met Gly Arg Gly Lys 305 310 315 320
Arg Gin Ala Thr Ser Arg Cys Pro Asn Ser Gin Val Asp Ser Asn Asp
325 330 335
He Tyr Gin Val Thr Pro Val Tyr Arg Leu Ala Ser Asp Glu Lys Glu
340 345 350 l ie Met Lys Glu Leu Met Glu Asn Gly Pro Val Gin Ala Leu Met Glu
355 360 365
Val His Glu Asp Phe Phe Leu Tyr Gin Arg Gly l ie Tyr Ser His Thr
370 375 380
Pro Val Ser Gin Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Arg Arg His Gly Thr His 385 390 395 400
Ser Val Lys l ie Thr Gly Trp Gly Glu Glu Thr Leu Pro Asp Gly Arg
405 410 415
Thr lie Lys Tyr Trp Thr Ala Ala Asn Ser Trp Gly Pro Trp Trp Gly
420 425 430
Glu Arg Gly His Phe Arg l ie Val Arg Gly l ie Asn Glu Cys Asp lie
435 440 445
Glu Thr Phe Val Leu Gly Val Trp Gly Arg Val Gly Met Glu Asp Met
450 455 460
Gly His His 配列番号 ： 4
配列の長さ ： 1930 ―
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 二本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： cDNA to mRNA
配列の特徴
特徴を表す記号 ： CDS
存在位置 ： 67 . . 1467
特徴を決定した方法 ： E
酉己 列
CGAGCTTGGA GGCGGAGGCG CGCAGGGCAG CCTGGGTCCA GCCCACACCC 50 CTCACCAGCA GGCACC ATG TGG GGA TGT CCG CTA GGG CTG CTA TTG 96
Met Trp Gly Cys Pro Leu Gly Leu Leu Leu
1 5 10
CTG CTG CTG GCT GGC CAG GCT GCC CTG GAG GCC CGG CGG AGT CGT TGG 144 Leu Leu Leu Ala Gly Gin Ala Ala Leu Glu Ala Arg Arg Ser Arg Trp
15 20 25
CGC AGG GAG CTG GCG CCA GGG CTG CAC CTG CGG GGC ATC CGG GAC GCC 192 Arg Arg Glu Leu Ala Pro Gly Leu His Leu Arg Gly l ie Arg Asp Ala
30 35 40
GGT GGC AGA TAC TGC CM GAG CAG GAC ATG TGC TGC CGC GGC CGT GCT 240 Gly Gly Arg Tyr Cys Gin Glu Gin Asp Met Cys Cys Arg Gly Arg Ala
45 50 55
GAC GAG TGT GCT TTG CCC TAC CTG GGA GCC ACC TGT TAC TGT GAC CTC 288 Asp Glu Cys Ala Leu Pro Tyr Leu Gly Ala Thr Cys Tyr Cys Asp Leu 60 65 70
TTC TGC AAC CGC ACC GTC TCT GAC TGC TGC CCT GAC TTT TGG GAC TTC 336 Phe Cys Asn Arg "Thr Val Ser Asp Cys Cys Pro Asp Phe Trp Asp Phe
75 80 85 90
TGC CTC GGG ATT CCA CCC CCC TTC CCT CCT GTC CAA GGT TGC ATG CAT 384 Cys Leu Gly l ie Pro Pro Pro Phe Pro Pro Val Gin Gly Cys Met His
95 100 105
GCG GGC CGG ATC TAC CCA ATC TTC GGA ACC TAT TGG GAA AAC TGC AAT 432 Ala Gly Arg l ie Tyr Pro He Phe Gly Thr Tyr Trp Glu Asn Cys Asn
110 115 120
CGG TGC ACC TGC CAT GAG AAA GGG CAG TGG GAA TGT GAC CAG GAG CCA 480 Arg Cys Thr Cys His Glu Lys Gly Gin Trp Glu Cys Asp Gin Glu Pro
125 130 135
TGT CTA GTG GAC CCA GCC ATG ATT AAA GCC ATC AAC CGG GGC AAC TAC 528 Cys Leu Val Asp Pro Ala Met He Lys Ala l ie Asn Arg Gly Asn Tyr
140 145 150
GGG TGG CAG GCT GGG AAC CAC AGT GCC TTC TGG GGC ATG ACC CTG GAT 576 Gly Trp Gin Ala Gly Asn His Ser Ala Phe Trp Gly Met Thr Leu Asp
155 160 165 170
GAG GGC ATT CGA TAC CGG CTG GGC ACA ATC CGC CCA TCT TCC TCT GTC 624 Glu Gly l ie Arg Tyr Arg Leu Gly Thr He Arg Pro Ser Ser Ser Val
175 180 185
ATG AAT ATG AAT GAA ATT TAT ACA GTG CTG GGA CAA GGA GAA GTG CTA 672 Met Asn Met Asn Glu lie Tyr Thr Val Leu Gly Gin Gly Glu Val Leu
190 195 200
CCC ACT GCC TTT GAG GCT TCC GAG AAG TGG CCC AAC CTG ATC CAT GAG 720 nsi SJV J QJd J¾ Ι¾Λ U]9 J 9Π dsy usy s dsy ΐ¾ ^ΐθ Οίΐ SID 003 DV1 010 100 33V 319 9V0 OVX OIV 3V9 IW 031 IVO 1X9 3V0
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J8S usy OJJ S (Q Say J8S J¾ ¾IV u[9 Sjy Say ¾iv 990Ϊ I3V XW DD3 001 393 131 IDV 330 DVD D03 SW DOS 093 D3D 91V 000
OTC 90C 00S
Say J9S sin ^3W s^o Say OJJ jq OJJ ass BIV dsy usy u^g
800 ΐ 093 ODV OVO 3XV OIV 331 V03 133 I3V 333 09V 039 9V9 DV9 OW OVD
2 062 98Z
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Z 993 913 3X1 991 931 139 199 IV9 313 193 999 X99 V93 391 330 9W
92 09Z 992
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9£800/86df/I3d €IZ8£/86 OAV 335 340 345
GCC TCC GAT GAG AAG GAG ATC ATG AAG GAG CTA ATG GAA AAT GGC CCC 1152 Ala Ser Asp Glu "Lys Glu He Met Lys Glu Leu Met Glu Asn Gly Pro
350 355 360
GTT CAA GCG CTT ATG GAA GTA CAC GAA GAC TTC TTC TTG TAC CAG CGA 1200 Val Gin Ala Leu Met Glu Val His Glu Asp Phe Phe Leu Tyr Gin Arg
365 370 375
GGC ATC TAC AGC CAC ACA CCT GTA AGC CAG GGG AGG CCA GAG CAG TAC 1248 Gly l ie Tyr Ser His Thr Pro Val Ser Gin Gly Arg Pro Glu Gin Tyr
380 385 390
CGC CGA CAC GGG ACT CAC TCT GTC AAG ATC ACA GGG TGG GGA GAA GAG 1296 Arg Arg His Gly Thr His Ser Val Lys lie Thr Gly Trp Gly Glu Glu
395 400 405 410
ACA CTG CCA GAC GGA AGG ACG ATC AAG TAC TGG ACT GCT GCC AAC TCG 1344 Thr Leu Pro Asp Gly Arg Thr l ie Lys Tyr Trp Thr Ala Ala Asn Ser
415 420 425
TGG GGC CCA TGG TGG GGT GAG AGG GGC CAC TTC CGA ATC GTG CGT GGC 1392 Trp Gly Pro Trp Trp Gly Glu Arg Gly His Phe Arg He Val Arg Gly
430 435 440
ATC AAC GAG TGT GAC ATC GAG ACC TTC GTG CTG GGC GTC TGG GGC CGC 1440 l ie Asn Glu Cys Asp l ie Glu Thr Phe Val Leu Gly Val Trp Gly Arg
445 450 455
GTA GGA ATG GAG GAC ATG GGG CAC CAC TGAGTCTCGG CCACTAAGCT 1487 Val Gly Met Glu Asp Met Gly His His
460 465
AGGTGGGATC CACAGCCACG GAAGAGGCCT TGGGGGCCAC GCCGATGAGG CCTTGGGACC 1547 AGGTGCTAAT CCCCTCAGAC TCAGATCCAC ACAAACGCAG AACCCCACCT GGGAGCTAAT 1607
GTCCCTCAGG GAGCAACAGT GAGGCTGGAG GGAACCCTCA GACATCACAG CCGGAACTGG 1667
AAAGGGCCCG GCTTGGAAAC TGCAGGGAGT AAAATTCCCA GGCCCCTGGT CAGCCAGCCC 1727
AAGACCATGG GAGCTAAGAC ACCCCAACCT CTTTATCCTC CTACCCAACC TCATTCTTAT 1787
TTTTTCATTC TCTTTGGTGG ATTCTGCCCA TCCCCCTGGC CTCCGTTCTG GCTGGACCTT 1847
TCCATCCTCA ACACTGCTTT CTTACTCTTT AAAAATATTT ATTTTTCTTT TCATTAAAAT 1907
AAAACCAAAG TATTGATAAT TGC 1930 配列番号： 5
配列の長さ ： 29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAAGGGA ACAAAAGCT 29 配列番号： 6
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCTAGAACTA GTGGATCCCC C Zl 配列番号： 7
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸 '
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCCCCCCCTC GAGTTTTTTT T 21
配列番号： 8
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGCCGCGGAA TTATCAATAC TTTGGTT 27
配列番号： 9
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GAGTAAGAAA GCAGTGTTGA GGAT 24 配列番号： 10 ——
配列の長さ ： 21 '
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 MA
配列
CAGAACGGAG GCCAGGGGGA T 21 配列番号： 11
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ACTGCAGGGA GTAAAATTCC CAG 23 配列番号： 12
配列の長さ ： 33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 ATGAATTCCA CCATGTGGCG ATGTCCACTG GGG 33 配列番号： 13 " - 配列の長さ ： 33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGCGGCCGC TTATCAGTGA TGACCCATGT CCT 33 配列番号： 14
配列の長さ ： 39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 MA
配列
CTCGCTCGCC CAATGTGGCG ATGTCCACTG GGGCTATGC 39 配列番号： 15
配列の長さ ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 MA 配列 .
CTGGTTCGGC CCAGATGGAC ACTCGGTCAG ATGCG 35 配列番号： 16
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GATGGACACT CGGTCAGATG CG 22 配列番号： 17
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 MA
配列
CAGCTGTCGC ATCTGACCGA GTG 23 配列番号： 18
配列の長さ ： 34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTGGTTCGGC CCAGCAATTA TCAATACTTT GGTT 34 配列番号： 19
配列の長さ ： 33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGCGGCCGC TTATCAGTGG TGCCCCATGT CCT 33 配列番号： 20
配列の長さ ： 38
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGTCTCGAG AATTCAGTAA CCCAGGCATT ATTTTATC 38 配列番号： 21
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 MA ——
配列
TTGTCCTAGA AGCTTGTGTG CTCTGCTGTC 30 配列番号： 22
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 MA
配列
AACAGTTATC AGACACCACC CCTCG 25 配列番号： 23
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GTCATGCCCC AGAAGGCACT G 23 配列番号： 24
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 MA
配列
TCCCGAGGCA GAAGTCCCAA AAGT 24 配列番号： 25
配列の長さ ： 14
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Met Thr Pro l ie Leu Ser Pro Gin Asn Leu Leu Ser Cys Asp
1 5 10 配列番号： 26
配列の長さ ： 21
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Cys Arg Gly Gly Arg Leu Asp Gly Ala Trp Trp Phe Leu Arg Arg Arg Gly Val 1 5 10 15
Val Ser Asp
20 配列番号： 27
配列の長さ ： 15 '
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Ser Gly Arg Glu Gin Asn Asp Glu Ala Ser Pro Thr Pro Arg Cys
1 5 10 15 配列番号： 28
配列の長さ ： 16
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
His Ser Arg Ala Met Gly Arg Gly Lys Arg Gin Ala Thr Ser Arg Cys
1 5 10 15 配列番号： 29
配列の長さ ： 19
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Val Ser Gin Gly Arg Pro Glu Gin Tyr Arg Arg His Gly Thr His Ser Val Lys 1 5 10 15 lie 配列番号： 30 '- 配列の長さ ： 19
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Glu Thr Phe Val Leu Gly Val Trp Gly Arg Val Gly Met Glu Asp Met Gly His 1 5 10 15
His

Claims

請求の範囲 . ―
I . 配列番号： 1に記載のタンパク質、 または該タンパク質中のアミノ酸配列 において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 若しくは付加したアミノ酸配 列を有し、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモーターの活性化を抑制する活 性を有するタンパク質。
2 . 配列番号： 2に記載の DNAとハイブリダィズする DNAがコードするタンパク 質であって、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモーターの活性化を抑制する 活性を有するタンパク質。
3 . 配列番号： 3に記載のタンパク質、 または該タンパク質中のアミノ酸配列 において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、 欠失、 若しくは付加したアミノ酸配 列を有し、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモー夕一の活性化を抑制する活 性を有するタンパク質。
4 . 配列番号： 4に記載の DNAとハイブリダィズする DNAがコードするタンパク ' 質であって、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモ一夕一の活性化を抑制する 活性を有するタンパク質。
5 . 特定の細胞外刺激がインターロイキン- 1/3による刺激である、 請求項 1か ら 4のいずれかに記載のタンパク質。
6 . 請求項 1または 3に記載の夕ンパク質をコ一ドする DNA。
7 . 配列番号： 2に記載の DNAおよび/または配列番号： 4に記載の DNAとハイ ブリダィズし、 特定の細胞外刺激に応答した IL- 8プロモ一夕一の活性化を抑制す る活性を有するタンパク質をコードする DNA。
8 . 特定の細胞外刺激がインターロイキン- 1 /5による刺激である、 請求項 7に 記載の DM。
9 . 請求項 6から 8のいずれかに記載の DNAを含むベクター。
1 0 . 請求項 9に記載のベクターを保持する宿主。
I I . 請求項 1から 5のいずれかに記載のタンパク質に反応する抗体。
1 2 . 請求項 1から 5のいずれかに記載のタンパク質を有効成分上する医薬組 成物。
1 3 . 抗炎症—剤である、 請求項 1 2に記載の医薬組成物。
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