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WO1998037219A1 - Process for producing malonic acid derivatives - Google Patents

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WO1998037219A1
WO1998037219A1 PCT/JP1998/000711 JP9800711W WO9837219A1 WO 1998037219 A1 WO1998037219 A1 WO 1998037219A1 JP 9800711 W JP9800711 W JP 9800711W WO 9837219 A1 WO9837219 A1 WO 9837219A1
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WO
WIPO (PCT)
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cyanoacetate
formula
microorganism
nitrilase activity
represented
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP1998/000711
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eiji Ozaki
Kanehiko Enomoto
Takakazu Endo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Chemical Corp
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co Ltd
Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP3650897A external-priority patent/JP3718572B2/ja
Priority claimed from JP3651097A external-priority patent/JPH10229891A/ja
Application filed by Mitsubishi Rayon Co Ltd, Nitto Chemical Industry Co Ltd filed Critical Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority to EP98904405A priority Critical patent/EP1008655B1/en
Priority to US09/367,716 priority patent/US6238896B1/en
Priority to DE69834562T priority patent/DE69834562T2/de
Publication of WO1998037219A1 publication Critical patent/WO1998037219A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843—Corynebacterium

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a malonic acid monoester useful as a synthetic intermediate for various chemical products, medicines, agricultural chemicals, and the like.
  • malonic acid monoester As a method for producing malonic acid monoester, a method is generally used in which malonic acid diester is hydrolyzed. However, with this method, it is difficult to isolate the product malonic acid monoester from unreacted malonic acid diester and by-product malonic acid after completion of the reaction. Purified malonic acid monoester cannot be obtained.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing malonic acid monoester which is useful as a synthetic intermediate for various chemical products, medicines, agricultural chemicals and the like, and has excellent productivity.
  • the present inventors have found that when a culture, a microbial cell, or a processed microbial cell of a microorganism having a nitrilase activity is allowed to act on cyanoacetate, malonic acid monoester is selectively generated, and the ester bond is hydrolyzed.
  • the present inventors have found that high-purity malonic acid monoester can be produced without side reactions such as decomposition, and the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following inventions.
  • R represents an alkenyl group, an aryl group, an aralkyl group, or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • the following formula ( ⁇ ) is characterized in that it is hydrolyzed by treating with a treated product.
  • the alkyl group having 1 to 20 carbon atoms represented by R is an alkyl group having 3 to 20 carbon atoms, and the microorganism having a nitrilase activity belongs to the genus Rhodococcus The method according to the above (1), which is a microorganism.
  • Rhodococcus rhodochrous A microorganism having nitrilase activity is Rhodococcus rhodochrous. (Rhodococcus rhodochrous) The method according to the above (1), which is ATCC 33025.
  • Equation (8)
  • R ′ represents an alkenyl group, an aryl group, an aralkyl group, or an alkyl group having 3 to 20 carbon atoms.
  • the alkyl group represented by R may have a linear or branched structure.
  • the alkyl group has 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, and more preferably 2 to 6 carbon atoms.
  • the alkyl group represented by R ′ may have any of a linear or branched structure.
  • the alkyl group has 3 to 20 carbon atoms, preferably 3 to 10 carbon atoms, and more preferably 3 to 6 carbon atoms.
  • the alkenyl group represented by R may have a linear or branched structure.
  • the alkenyl group has 2 to 20 carbon atoms, preferably 2 to 6 carbon atoms.
  • concrete Examples include butyl, aryl, crotyl (2-butenyl), isopropyl (1-methylvinyl) and the like.
  • the alkenyl group represented by R ′ may have a linear or branched structure.
  • the alkenyl group has 3 to 20 carbon atoms, preferably 3 to 6 carbon atoms. Specific examples include aryl, crotyl (2-butul), and isopropyl (1-methylvinyl).
  • Examples of the aralkyl group represented by R or R ′ include benzyl, 1-naphthylmethyl, 2-naphthylmethyl, phenethyl (2-phenylethyl), 1-phenylethyl, phenylpropyl, phenylbutyl, phenylpentyl, phenylhexyl, methylbenzyl , Methylphenethyl, dimethylbenzyl, dimethylphenyl, trimethylbenzyl, ethylbenzyl, getylbenzyl and the like.
  • Representative compounds among the cyanoacetates represented by the formula (I) include, for example, methyl cyanoacetate, ethyl ethyl cyanoacetate, ⁇ -propyl cyanoacetate, isopropyl cyanoacetate, n-butyl cyanoacetate Tert-butyl cyanoacetate, 2-ethylhexyl cyanoacetate, aryl aryl cyanoacetate, benzyl cyanoacetate and the like.
  • Representative compounds among the cyanoacetates represented by the above formula () include, for example, n-propyl cyanoacetate, isopropyl cyanoacetate, n-butyl cyanoacetate, tert-butyl cyanoacetate, and cyanoacetic acid 2 -Ethylhexyl, aryl cyanoacetate, benzyl cyanoacetate, and the like.
  • the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the genus Corynebacterium, Gordona or Rhodococcus and has a nitrilase activity. Specifically, Corynebacterium nitrilophilus ) ATCC 21419, Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535), Rhodococcus rhodochrous ATCC 33025 and the like.
  • the microorganism to be used is not particularly limited as long as it has a nitrilase activity.
  • microorganisms described above for example, genus Pseudomonas, genus Brevibacterium, Nocardia, Arthrobacter, Bacillus, Escherichia, Micrococcus, Streptomyces, Aeromonas, Mycoprana Genus, genus Cellulomonas, genus Erwinia, genus Candida
  • a microorganism may be used a microorganism having two Bok Lira Ichize activity.
  • microorganisms are, respectively, the American Type Culture Collection (ATCC) from 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, and Tokyo, Japan. Institute for Molecular and Cellular Biology, Center for Cell and Functional Polymers, IAM Culture Collection, Center for Cellular and Molecular Research, Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo (IA), It can be obtained from the Institute for Fermentation, Osaka (IFO), etc., 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Japan.
  • the microorganism can be cultured in a liquid medium or a solid medium.
  • a medium appropriately mixed with components such as a microbial power, a carbon source, a nitrogen source, vitamins, and minerals that can normally be used is used. It is also possible to add a small amount of a nitrile compound or a lactam compound to the medium in order to improve the hydrolytic ability of the microorganism.
  • the nitrile compound has 1 to 12 carbon atoms and the straight chain is a branched aliphatic nitrile or aromatic nitrile, for example, propionitrile, isopalleronitrile, hexanenitrile, acrylyl.
  • the cultivation is performed at a temperature at which the microorganism can grow, and is preferably at a temperature suitable for culturing the strain to be used. Aeration and agitation may be performed to promote the growth of microorganisms.
  • the treated cells include cells treated with acetone, toluene, etc., crushed cells, cell-free extracts obtained by crushing cells, crude enzymes or purified enzymes separated from cells, and the like.
  • Fungus The reaction is carried out by entrapping and fixing the treated cells or cells in a crosslinked acrylamide gel or the like, or by physically and / or physically immobilizing them on a solid carrier such as ion exchange resin or diatomaceous earth. It is also possible to recover and reuse after collection.
  • the malonic acid monoester can be preferably produced by the following method.
  • the substrate, cyanoacetic ester is added to the reaction medium and dissolved or suspended.
  • a culture of a microorganism serving as a catalyst is added.
  • the hydrolysis reaction is performed while controlling the reaction temperature and, if necessary, the pH of the reaction solution.
  • the reaction medium for example, ion-exchanged water, a buffer, or the like is used.
  • the reaction temperature is usually from O to 70 ° C, and preferably from 10 to 35 ° C, but may be performed at a temperature at which the activity of bacteria and other nitrilase increases.
  • the pH of the reaction solution depends on the optimum pH of the microbial enzyme to be used, but it is generally preferable to carry out the reaction within a range of ⁇ ⁇ 6 to 9, since side reactions due to chemical hydrolysis can be suppressed.
  • the concentration of the cells or processed cells in the reaction solution is usually 0.01 to 5% by weight as a dry weight.
  • the concentration of the substrate in the reaction solution is not particularly limited as long as it is between 0.01 and 70% by weight, but is preferably in the range of 0.1 to 15% by weight.
  • malonic acid monoester can be accumulated at a high concentration by continuously adding cyanoacetic acid ester.
  • the substrate concentration in the reaction solution is preferably maintained at 0.01 to 10% by weight, more preferably Q.i to 5% by weight. Is added.
  • unreacted cyanoacetate can be recovered by removing the microbial cells used as a catalyst by centrifugation, filtration, etc., and extracting them with a solvent such as hexane or ethyl acetate. It is. After the extraction residue is adjusted to pH 1 to 2 with an acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid, and extracted with a solvent such as hexane or ethyl acetate, a malonic acid monoester as a product can be obtained.
  • Example 1 Gordona terae MA-1 (FERM BP-4535) was inoculated into 3 ml of a sterilized LB medium (1% polybuton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. 1 ml of the obtained cell culture was inoculated into 100 ml of the following sterilized medium A, and cultured at 3ITC for 48 hours.
  • a sterilized LB medium 1% polybuton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl
  • HPLC high performance liquid chromatography-(HPLC, column: TSKgel 0DS-120A (manufactured by Tosoichi Co., Ltd.), 4.6 band LD.
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 6 except that benzyl cyanoacetate was used as the substrate. After completion of the enzyme reaction, 10% of benzyl cyanoacetate was not reacted. Unreacted benzyl cyanoacetate was extracted and removed with ethyl acetate. After the extraction, 2N hydrochloric acid was added to the aqueous layer to adjust the pH to 2.0, and then monobenzyl malonate as a reaction product was extracted with ethyl acetate. The organic layer is dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate, and the solvent is Was distilled off to obtain 0.89 g of monobenzyl malonate (yield: 80.3%).
  • Ethyl cyanoacetate was added to the cell suspension obtained in the same manner as in Example 1 so as to have a concentration of 5 to 50% by weight, and reacted at 25 ° C for 20 hours. After completion of the reaction, the reaction yield was measured by liquid chromatography. Table 1 shows the results.
  • Rhodococcus rhodochrous ATCC 33025 was inoculated into 3 ml of a sterilized LB medium (1% polybuton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. 1 ml of the obtained cell culture was inoculated into 100 ml of the following sterilized medium A, and cultured at 30 ° C. for 48 hours.
  • Medium A pH 7.2
  • the reaction solution was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC, column: TSKgel ODS-120A (manufactured by Tosoh Corporation), 4.6% ID X 25 cm, mobile phase: 5% acetonitrile, 95% water, 0.1% phosphoric acid Analysis was performed at a flow rate of 0.5 ml / min and detection at UV 220 nm. As a result, all the substrates were converted to mono ⁇ -propyl malonate. After completion of the reaction, the cells were removed by centrifugation, 2N hydrochloric acid was added, the pH was adjusted to 2.0, and the reaction product mono-n-propyl malonate was extracted with ethyl acetate. The organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate, and the solvent was evaporated to obtain 1.06 g of mono ⁇ -propyl malonate (yield: 89.9%).
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 23 except that benzyl cyanoacetate was used as the substrate. After completion of the enzyme reaction, 10% of benzyl cyanoacetate was not reacted. Unreacted benzyl cyanoacetate was extracted and removed with ethyl acetate. After the extraction, 2N hydrochloric acid was added to the aqueous layer to adjust the pH to 2.0, and then the reaction product, monobenzyl malonate, was extracted with ethyl acetate. The organic layer was dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off to obtain 0.88 g of monobenzyl malonate (yield: 80.2%).
  • n-propyl cyanoacetate was added to a concentration of 5 to 50% by weight, and reacted at 25 ° C. for 20 hours. After completion of the reaction, the reaction yield was measured by liquid chromatography. Table 2 shows the results.
  • malonic acid monoesters useful as synthetic intermediates for various chemical products, pharmaceuticals, agricultural chemicals, and the like can be produced with high productivity.

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Description

明 細 書 マロン酸誘導体の製造法 技術分野
本発明は、 種々の化成品、 医薬、 農薬等の合成中間体として有用なマロン酸モ ノエステルの製造方法に関する。 背景技術
マロン酸モノエステルの製造方法としてはマロン酸ジエステルをィヒ学的に加水 分解する方法が一般的である。 し力 しな力 ら、 この方法では、 反応終了後、 生成 物であるマロン酸モノエステルを、 未反応のマロン酸ジエステル及び副生成物で あるマロン酸から単離するのが困難であり、 高純度のマロン酸モノエステルを得 ることができない。
高純度のマロン酸モノエステルを得る方法として、 Meldrum ' s酸を原料とする 方法が知られている （例えば、 Matoba Katsuhide et al. , Chem. Pharm. Bull. , 31 (8) , 2955 (1983) 、 又は Rigo B. et al. , Tetrahedron Lett. , 30 (23) , 3073 (1989)参照） 。 しかしながら、 この方法は、 高価な Meldrum ' s 酸を使用するため 実用的な方法とは言い難く、 工業的生産には適していない。
また、 高純度のマロン酸モノエステルを得る方法として、 マロン酸ジエステル にエステル結合を加水分解する能力を有する酵素又は微生物を作用させる方法が 公知である （特開平 8- 173174号公報） 。 しかしな力 ら、 原料としてマロン酸ジェ ステルを用いることはコス卜的に不利である。
した力つて、 生産性に優れた高純度のマロン酸モノエステルの製造方法の開発 が望まれていた。 発明の開示
本発明の課題は、 種々の化成品、 医薬、 農薬等の合成中間体として有用なマロ ン酸モノエステルの生産性に優れた製造方法を提供することにある。 本発明者らは、 シァノ酢酸エステルに、 二トリラーゼ活性を有する微生物の培 養物、 菌体又は菌体処理物を作用させると、 マロン酸モノエステルが選択的に生 成され、 エステル結合の加水分解等の副反応もなく、 高純度のマロン酸モノエス テルを製造することができることを見出し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 以下の発明を包含する。
( 1 ) 次式 （ I ) ：
NCCH2 COOR (I)
(式中、 Rは、 アルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基又は炭素数 1~20のァ ルキル基を示す。 ）
で表されるシァノ酢酸エステルを、 コリネバクテリゥム（Corynebacterium) 属、 ゴルドナ（Gordona) 属又は口ドコッカス（Rhodococcus) 属に属し、 二トリラ一ゼ 活性を有する微生物の培養物、 菌体又は菌体処理物で処理して加水分解すること を特徴とする、 次式 （Π) ：
H00CCH2 COOR (Π)
(式中、 Rは、 前記のとおりである。 ）
で表されるマロン酸モノエステルの製造方法。
(2) 加水分解反応中、 反応液のシァノ酢酸エステルの濃度を 0.01〜10重量％の 範囲に維持しながら該エステルを連続添加する前記 （1 ) に記載の方法。
(3) 式 （ I ) において Rで示される炭素数 1〜20のアルキル基が炭素数 3〜 20のアルキル基であり、 二ト リラ一ゼ活性を有する微生物が口ドコッカス (Rhodococcus) 属に属する微生物である前記 （ 1 ) に記載の方法。
(4) 加水分解反応中、 反応液のシァノ酢酸エステルの濃度を 0.01〜10重量％の 範囲に維持しながら該エステルを連続添加する前記 （3) に記載の方法。
(5) 二トリラーゼ活性を有する微生物がコリネパクテリゥム ニトリロフィ ラス（Corynebacterium nitrilophilus) ATCC 21419である前記 （1) に記載の方 法。
(6) 二トリラ一ゼ活性を有する微生物がゴルドナ テラエ（Gordona terrae) MA-1 (FER BP- 4535) である前記 ( 1 ) に記載の方法。
( 7 ) 二ト リラ一ゼ活性を有する微生物がロ ドコッカス ロ ドクロウス (Rhodococcus rhodochrous) ATCC 33025である前記 ( 1 ) に記載の方法。
(8) 式 （Γ ) ：
NCCH2 COOR* ( I ' )
(式中、 R' は、 アルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基又は炭素数 3〜20の アルキル基を示す。 ）
で表されるシァノ酢酸エステルを、 二トリラーゼ活性を有する微生物の培養物、 菌体又は菌体処理物で処理して加水分解することを特徴とする、 式 （ΙΓ ) ： H00CCH2 COOR' (Π' )
(式中、 R' は、 前記のとおりである。 ）
で表されるマロン酸モノエステルの製造方法。
(9) 加水分解反応中、 反応液のシァノ酢酸エステルの濃度を 0.01~10重量％の 範囲に維持しながら該エステルを連続添加する前記 （8) に記載の方法。
以下、 本発明を詳細に説明する。
前記式 （I ) 又は （Π) において、 Rで表されるアルキル基は、 直鎖又は分岐 状のいずれの構造でもよい。 このアルキル基の炭素数は 1〜20であり、 好ましく は 1〜10であり、 より好ましくは 2〜6である。 具体的には、 メチル、 ェチル、 η-プロピル、 イソプロピル、 π-ブチル、 sec-ブチル、 tert- ブチル、 イソブチ ル、 n-ペンチル、 イソペンチル、 へキシル、 ヘプチル、 ォクチル、 2-ェチルへキ シル、 デシル、 ドデシル、 テ卜ラデシル、 へキサデシル、 ォクタデシル、 エイコ シルなどが例示される。
前記式 （Γ ) 又は （Π' ) において、 R' で表されるアルキル基は、 直鎖又 は分岐状のいずれの構造でもよい。 このアルキル基の炭素数は 3〜20であり、 好 ましくは 3〜10であり、 より好ましくは 3〜6である。 具体的には、 π-プロピ ル、 イソプロピル、 Π-ブチル、 sec-ブチル、 tert-ブチル、 イソブチル、 n-ペン チル、 イソペンチル、 へキシル、 ヘプチル、 ォクチル、 2-ェチルへキシル、 デシ ル、 ドデシル、 テトラデシル、 へキサデシル、 ォクタデシル、 エイコシルなどが 例示される。
Rで表されるアルケニル基は、 直鎖又は分岐状のいずれの構造でもよい。 この アルケニル基の炭素数は 2〜20であり、 好ましくは炭素数 2〜6である。 具体的 には、 ビュル、 ァリル、 クロチル （2—ブテニル） 、 イソプロぺニル （ 1ーメチ ルビニル） などが例示される。
R ' で表されるアルケニル基は、 直鎖又は分岐状のいずれの構造でもよい。 こ のアルケニル基の炭素数は 3〜20であり、 好ましくは炭素数 3〜 6である。 具体 的には、 ァリル、 クロチル （2—ブテュル） 、 イソプロぺニル （ 1ーメチルビ二 ル） などが例示される。
R又は R ' で表されるァリール基としてば、 フエニル、 1一ナフチル、 2—ナ フチル等の芳香族炭化水素基；フリル、 チェニル、 ピロリル、 ォキサゾリル、 ィ ソォキサゾリル、 チアゾリル、 イソチアゾリル、 イミダゾリル、 ピラゾリル、 ピ リジル、 ピリミジニル、 ピリダジニル、 ビラジニル、 キノリル、 イソキノリル等 の芳香族複素環基などが例示される。
R又は R ' で表されるァラルキル基としては、 ベンジル、 1一ナフチルメチ ル、 2—ナフチルメチル、 フエネチル （2—フエニルェチル） 、 1—フエニルェ チル、 フヱニルプロピル、 フヱニルブチル、 フヱニルペンチル、 フヱニルへキシ ル、 メチルベンジル、 メチルフエネチル、 ジメチルベンジル、 ジメチルフヱネチ ル、 卜リメチルベンジル、 ェチルベンジル、 ジェチルベンジルなどが例示され る。
前記式 （ I ) で表されるシァノ酢酸エステルの中で、 代表的な化合物として は、 例えば、 シァノ酢酸メチル、 シァノ酢酸ェチル、 シァノ酢酸 π-プロピル、 シ ァノ酢酸イソプロピル、 シァノ酢酸 n-ブチル、 シァノ酢酸 tert-ブチル、 シァノ 酢酸 2-ェチルへキシル、 シァノ酢酸ァリル、 シァノ酢酸べンジル等が挙げられ る。
前記式 （ ) で表されるシァノ酢酸エステルの中で、 代表的な化合物として は、 例えば、 シァノ酢酸 n-プロピル、 シァノ酢酸イソプロピル、 シァノ酢酸 n-ブ チル、 シァノ酢酸 tert-ブチル、 シァノ酢酸 2-ェチルへキシル、 シァノ酢酸ァリ ル、 シァノ酢酸べンジル等が挙げられる。
本発明に使用される微生物は、 コリネバクテリウム属、 ゴルドナ属又はロドコ ッカス属に属し、 二卜リラ一ゼ活性を有していれば、 特に制限されない。 具体的 には、 コリネバクテリゥム ニトリロフィラス（Corynebacterium nitrilophilus ) ATCC 21419、 ゴルドナ テラエ（Gordona terrae) MA- 1 (FERM BP- 4535)、 ロド コッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous) ATCC 33025等が例示され る。
これらの微生物の中で、 ゴルドナ テラエ MA- Uま、 前記受託番号にて日本国 茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術 研 9¾尸斤 (National Institute or Bioscience and Human -Technolo y Agency of Industrial Science and Technology)に寄託されている。 また、 コリネバクテ リウム 二卜リロフィラス及びロドコッカス ロドクロウスは、 12301 Par klawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U. S. A.のアメリカン タイプ カルチヤ一 コレクション（American Type Culture Collection) (ATCC) などから入手可能で ある。
また、 基質として、 前記式 （ I ) において Rがアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基又は炭素数 3〜20のアルキル基であるシァノ酢酸エステル、 即 ち、 前記式 （ Γ ) で表されるシァノ酢酸エステルを使用する場合には、 使 用する微生物は、 二トリラーゼ活性を有していれば、 特に制限されず、 前述 した微生物の他、 例えば、 シユードモナス（Pseudomonas) 属、 ブレビパクテ リウム（Brevibacterium)属、 ノカルディア（Nocardia)属、 アースロバクタ一 (Arthrobacter)属、 バチルス（Bacillus)属、 ェシヱリキア（Escherichia) 属、 ミクロコッカス（Micrococcus) 属、 ストレプトマイセス（Streptomyces)属、 ァエロモナス（Aeromonas) 属、 マイコプラナ（Mycoplana) 属、 セルロモナス (Cellulomonas)属、 エルビニァ（Erwinia) 属、 キャンディダ（Candida) 属等に属 する微生物であって、 二卜リラ一ゼ活性を有する微生物を使用してもよい。
より具体的には、 シユードモナス シンキサンタ（Pseudomonas synxanta) IAM 12356 、 ブレビバクテリウム ァセチリカム（Brevibacterium acetylicum) IA 1790, ノカルディア ァステロイデス（Nocardia asteroides) IFO 3384、 ァ —スロバクタ一 ォキシダンス（Arthrobacter oxydans) IFO 12138、 バチルス サブチリス (Bacillus subtilis) ATCC 21697、 ェシエリキア コリ (Escherichia coli) IFO 3301、 ミクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus) ATCC 383 、 ストレプトマイセス グリセウス（Streptomyces griseus) IFO 3355 、 ァエロ モナス パンクタタ（Aeromonas punctata) IFO 13288、 マイコプラナ ジモル ファ（Mycoplana dimorpha) ATCC 4297、 セルロモナス フイ ミ（Cellulomonas fimi) I AM 12107 、 エルビニァ ヘルビコラ（Erwinia herbicola) IFO 12686、 キャンディダ ギリヤーモンディ一（Candida guilliermondii) IFO 0566 などが 例示される。 これらの微生物は、 それぞれ 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U. S. A.のアメリカン タイプ カルチャー コ レ ク シ ョ ン (American Type Culture Collection) (ATCC) 、 日本国東京都文京区弥生 1一 1 一 1の東京大学分子細胞生物学研究所、 細胞 ·機能高分子総合センタ一、 I AM カルチヤ一コレクション（IAM Culture Collection, Center for Cellular and Molecular Research, Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo) (IA )、 日本国大阪府大阪市淀川区十三本町 2丁目 1 7番 8 5号の財団法人発酵研究所（Institute for Fermentation, Osaka) (IFO)などか ら入手可能である。
微生物の培養は、 液体培地でも固体培地でも行うことができる。 培地として は、 微生物力 S通常資化しうる炭素源、 窒素源、 ビタミン、 ミネラルなどの成分を 適宜配合したものが用いられる。 微生物の加水分解能を向上させるため、 培地に 二トリル化合物又はラクタム化合物を少量添加することも可能である。 二卜リル 化合物は炭素数 1 ~12の直鎖文は分岐状の脂肪族二卜リル又は芳香族二卜リルで あり、 例えばプロピオ二トリル、 イソパレロニトリル、 へキサン二トリル、 ァク リロ二トリル、 アジポニトリル、 ベンゾニトリル、 2—ピリジンカルボ二トリル などが挙げられる。 また、 ラクタム化合物としては、 例えば丫ーブチロラクタ ム、 δ—バレロラクタム、 ε—力プロラクタムなどが挙げられる。 培養は、 微生 物が生育可能である温度、 ΡΗで行われるが、 使用する菌株の最適培養条件で行う の力 s好ましい。 微生物の生育を促進させるため、 通気攪拌を行ってもよい。 本発明においては、 前記のような二卜リラーゼ活性を有する微生物を培地中で 培養して得られる培養物をそのままか、 又は該培養物から遠心分離などの集菌操 作によって得られる菌体、 若しくは菌体処理物を用いることができる。 菌体処理 物としては、 アセトン、 トルエン等で処理した菌体、 菌体の破砕物、 菌体を破砕 した無細胞抽出物、 菌体から分離した粗酵素又は精製酵素など力 s挙げられる。 菌 体又は菌体処理物は、 架橋したアクリルアミドゲルなどに包括固定したり、 ィォ ン交換樹脂、 珪藻土などの固体担体に物理的、 ィヒ学的に固定化して用いることに より、 反応を行った後に回収再利用することも可能である。
本発明において、 マロン酸モノエステルは、 好ましくは、 以下の方法で製造す ることができる。 反応媒体に基質であるシァノ酢酸エステルを添加して溶解又は 懸濁する。 また、 基質を反応媒体に添加する前に又は添加した後に触媒となる微 生物の培養物等を加える。 そして、 反応温度、 必要により反応液の pHを制御しな がら加水分解反応を行う。 反応媒体としては、 例えば、 イオン交換水、 緩衝液等 が用いられる。 反応温度は通常 O ~70°C、 好ましくは 10〜35°Cであるが、 菌体等 の二卜リラ一ゼ活性力 ί高くなる温度で行えばよい。 反応液の pHは用いる微生物酵 素の至適 pHに依存するが、 一般的には ρΗ6 ~ 9の範囲内で反応を行うと化学的加 水分解反応による副反応を抑えることができるので好ましい。 反応液中の菌体 又は菌体処理物の濃度は、 乾燥重量として通常 0. 01~ 5重量％相当量である。 ま た、 反応液の基質濃度は 0. 01〜70重量％の間であれば特に制限はないが、 0. 1 か ら 15重量％の範囲内力好ましい。
更に、 加水分解反応中、 シァノ酢酸エステルを連続添加することによりマロン 酸モノエステルを高濃度に蓄積させることができる。 その際、 基質による酵素の 失活を最小限に抑えるため、 反応液の基質濃度を好ましくは 0. 01~10重量％、 更 に好ましくは Q. i〜5重量％の範囲に維持しながら基質を添加する。
反応終了後、 触媒として使用した微生物の菌体を遠心分離、 濾過などの操作に より除去してから、 へキサン、 酢酸ェチルなどの溶剤で抽出することにより未反 応のシァノ酢酸エステルを回収可能である。 抽出残液を硫酸、 塩酸などの酸で pH 1〜2とした後に、 へキサン、 酢酸ェチルなどの溶剤で抽出することにより、 生 成物であるマロン酸モノエステルを得ることができる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明する力 本発明の範囲はこれらの実 施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〗 ゴルドナ テラエ MA- 1 (FERM BP-4535)を滅菌した L B培地 （ 1 %ポリぺブト ン、 0.5%酵母エキス、 0.5% NaCl ) 3mlに植菌し、 30°Cで 24時間振盪培養し た。 得られた菌体培養液 lmlを滅菌した下記培地 A 100mlに植菌し、 3ITCで 48時 間培養した。
培地 A (pH 7.2)
グリセロール 1.0 %
イソバレロ二トリル 0.2 %
酵母エキス 0.02 %
Figure imgf000010_0001
N aC 1 0.1 %
MgS04-7H2 0 0.02 %
F e S 04· 7 H2 0 10 ppra
C o C 12-4 H2 0 10 ppm
Figure imgf000010_0002
MnC 12- 4 H2 0 7 ppm
培養終了後、 培養液を遠心分離し、 得られた菌体の全量をイオン交換水で洗浄 した後、 50mMリン酸緩衝液 （pH7.0) 100mlに懸濁した。 この菌体懸濁液の濁度 は、 OD630 = 5.5 であった。 この菌体懸濁液に基質としてシァノ酢酸ェチル 1.00 gを添加し、 30°Cで 1時間反応させた。 反応液を高速液体クロマトグラフィ - (HPLC、 カラム： TSKgel 0DS-120A (東ソ一株式会社製） 、 4.6匪 LD. X 25 cm, 移動相： 5 %ァセ卜二トリル， 95%水， 0.1%リン酸、 流速： 0.5ml /min、 検出： UV 220nm) で分析したところ、 全ての基質がマロン酸モノェチル に変換されていた。 反応終了後、 遠心分離により菌体を除き、 2 N塩酸を添加 し、 pHを 2.0に調整し、 反応生成物であるマロン酸モノェチルを酢酸ェチルで抽 出した。 有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、 溶媒を蒸発留去して、 1.05 gのマロン酸モノェチルを得た （収率 89.9%) 。
〔実施例 2]
微生物としてコリネバクテリゥム 二卜リロフィラス ATCC 21419 を用いた 以外は全て実施例 1と同様にして 1.07gのマロン酸モノェチルを得た （収率 91.6 % ) 。
〔実施例 3]
基質としてシァノ酢酸メチルを用いた以外は全て実施例 1と同様にして 0.97 g のマロン酸モノメチルを得た （収率 81.4%) 。
〔実施例 4]
基質としてシァノ酢酸 n-プロピルを用いた以外は全て実施例 1と同様にして 1· 05 gのマロン酸モノ n-プロピルを得た （収率 91.3%) 。
〔実施例 5〗
基質としてシァノ酢酸ィソプロピルを用いた以外は全て実施例 1と同様にして 1.02 gのマロン酸モノイソプロピルを得た （収率 88.7%) 。
〔実施例 6]
基質としてシァノ酢酸 n-ブチルを用いた以外は全て実施例 1と同様にして 1.06 gのマロン酸モノ n-ブチルを得た （収率 93.4%) 。 なお、 HP LC分析の移動相 として、 40%ァセ卜二卜リル， 60%水， 0.1 %リン酸を用いた。
〔実施例 7]
基質としてシァノ酢酸 tert-ブチルを用いた以外は全て実施例 6と同様にして 1.05 gのマロン酸モノ tert-ブチルを得た （収率 92.5%) 。
〔実施例 8】
基質としてシァノ酢酸ァリルを用いた以外は全て実施例 6と同様にして 1.02 g のマロン酸モノアリルを得た （収率 87.2%) 。
〔実施例 9]
基質としてシァノ酢酸 2-ェチルへキシルを用いた以外は全て実施例 6と同様に して 1.01 gのマロン酸モノ 2-ェチルへキシルを得た （収率 91.8%) 。
〔実施例 10]
基質としてシァノ酢酸ベンジルを用いた以外は全て実施例 6と同様にして反応 を行った。 酵素反応終了後、 10%のシァノ酢酸ベンジルが未反応であった。 未反 応のシァノ酢酸ベンジルを酢酸ェチルで抽出除去した。 その抽出後、 水層に 2N 塩酸を添加して pHを 2.0に調整し、 次いで反応生成物であるマロン酸モノべンジ ルを酢酸ェチルで抽出した。 有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、 溶媒 を蒸発留去し、 0. 89 gのマロン酸モノベンジルを得た （収率 80. 3% ) 。
〔実施例 11〜19]
実施例 1と同様にして得られた菌体懸濁液に、 シァノ酢酸ェチルを 5〜50重量 %濃度となるように添加し、 25°Cで 20時間反応させた。 反応終了後の反応収率を 液体クロマ卜グラフィ一で測定した。 結果を表 1に示す。
表 1
Figure imgf000012_0001
〔実施例 20]
実施例 1と同様にして得られた菌体懸溺液 100mlに、 シァノ酢酸ェチルを 5 g 添加し、 25°Cで反応させた。 以後、 反応液中の基質濃度が 5重量％を超えないよ うに、 基質濃度を測定しながら合計 30 gのシァノ酢酸ェチルを分割して添加し た。 30時間後、 反応収率は 100%であった。
〔実施例 21]
ロドコッカス ロドクロウス ATCC 33025 を滅菌した L B培地 （ 1 %ポリぺブ トン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% NaCl ) 3 mlに植菌し、 30°Cで 24時間振盪培養 した。 得られた菌体培養液 l mlを滅菌した下記培地 A 100mlに植菌し、 30°Cで 48 時間培養した。 培地 A (pH 7.2)
グリセ口一ル 1.0 %
イソバレロ二トリル 0.2 %
酵母エキス 0.02 %
KH2 P04 0.2 %
N aC 1 0.1 %
Figure imgf000013_0001
F e S Ο 4 · 7 H2 0 10 ppm
CoC "·4Η2 0 10 ppm
C a C 12 · 2 H 2 0 1 pm
Figure imgf000013_0002
培養終了後、 培養液を遠心分離し、 得られた菌体の全量をイオン交換水で洗浄 した後、 50mMリン酸緩衝液 （pH7.0) 100mlに懸濁した。 この菌体懸濁液の濁度 は、 O D630 =5.6 であった。 この菌体懸濁液に基質としてシァノ酢酸 n-プロ ピル l.OOgを添加し、 30°Cで 1時間反応させた。 反応液を高速液体クロマトグ ラフィ一 （HPLC、 カラム： TSKgel ODS-120A (東ソ一株式会社製） 、 4.6讓 I.D. X 25 cm, 移動相： 5%ァセトニ卜リル， 95%水， 0.1%リン酸、 流速： 0.5ml/min 、 検出： UV 220nm) で分析したところ、 全ての基質がマロン酸モノ η-プロピルに変換されていた。 反応終了後、 遠心分離により菌体を除き、 2 N塩 酸を添加し、 PHを 2.0に調整し、 反応生成物であるマロン酸モノ n-プロピルを酢 酸ェチルで抽出した。 有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、 溶媒を蒸発 留去して、 1.06 gのマロン酸モノ π-プロピルを得た （収率 89.9%) 。
〔実施例 22]
基質としてシァノ酢酸イソプロピルを用いた以外は全て実施例 21と同様にして 1.01 gのマロン酸モノイソプロピルを得た （収率 88.6%) 。
〔実施例 23]
基質としてシァノ酢酸 n-ブチルを用いた以外は全て実施例 21と同様にして 1.05 gのマロン酸モノ n-ブチルを得た （収率 93· 3%) 。 なお、 HP LC分析の移動相 として、 40%ァセ卜二トリル， 60%水， 0.1 %リン酸を用いた。 〔実施例 24]
基質としてシァノ酢酸 tert -ブチルを用レヽた以外は全て実施例 23と同様にして 1. 04 gのマロン酸モノ tert-ブチルを得た （収率 92. 4% ) 。
〔実施例 25]
基質としてシァノ酢酸ァリルを用いた以外は全て実施例 23と同様にして 1. 04 g のマロン酸モノアリルを得た （収率 87. 1% ) 。
〔実施例 26]
基質としてシァノ酢酸 2-ェチルへキシルを用いた以外は全て実施例 23と同様に して l . OO gのマロン酸モノ 2-へチルへキシルを得た （収率 91. 7% ) 。
〔実施例 27]
基質としてシァノ酢酸ベンジルを用いた以外は全て実施例 23と同様にして反応 を行った。 酵素反応終了後、 10%のシァノ酢酸ベンジルが未反応であった。 未反 応のシァノ酢酸ベンジルを酢酸ェチルで抽出除去した。 その抽出後、 水層に 2 N 塩酸を添加して pHを 2. 0に調整し、 次いで反応生成物であるマロン酸モノべンジ ルを酢酸ェチルで抽出した。 有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、 溶媒 を蒸発留去し、 0. 88 gのマロン酸モノベンジルを得た （収率 80. 2% ) 。
[実施例 28〜36]
実施例 21と同様にして得られた菌体懸濁液に、 シァノ酢酸 n-プロピルを 5 ~50 重量％濃度となるように添加し、 25°Cで 20時間反応させた。 反応終了後の反応収 率を液体クロマトグラフィ一で測定した。 結果を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000015_0001
〔実施例 37]
実施例 21と同様にして得られた菌体懸濁液 100mlに、 シァノ酢酸 n-プロピルを 5 g添加し、 25°Cで反応させた。 以後、 反応液中の基質濃度が 5重量％を超えな いように、 基質濃度を測定しながら合計 20 gのシァノ酢酸 n-プロピルを分割して 添加した。 30時間後、 反応収率は 100%であった。 産業上の利用の可能性
本発明により、 種々の化成品、 医薬、 農薬等の合成中間体として有用な、 マロ ン酸モノエステルを生産性よく製造することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 次式 （ I ) ：
NCCH2 COOR (I)
(式中、 Rは、 アルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基又は炭素数 1~20のァ ルキル基を示す。 ）
で表されるシァノ酢酸エステルを、 コリネパクテリゥム（Corynebacterium) 属、 ゴルドナ（Gordona) 属又は口ドコッカス（Rhodococcus) 属に属し、 二トリラ一ゼ 活性を有する微生物の培養物、 菌体又は菌体処理物で処理して加水分解すること を特徴とする、 次式 （Π) ：
H00CCH2 COOR (Π)
(式中、 Rは、 前記のとおりである。 ）
で表されるマロン酸モノエステルの製造方法。
2. 加水分解反応中、 反応液のシァノ酢酸エステルの濃度を 0.01〜10重量％の範 囲に維持しながら該エステルを連続添加する請求の範囲第 1項記載の方法。
3. 式 （ I ) において Rで示される炭素数 1〜20のアルキル基が炭素数 3〜 20のアルキル基であり、 二トリラーゼ活性を有する微生物が口ドコッカス (Rhodococcus) 属に属する微生物である請求の範囲第 1項記載の方法。
4. 加水分解反応中、 反応液のシァノ酢酸エステルの濃度を 0.01〜10重量％の範 囲に維持しながら該エステルを連続添加する請求の範囲第 3項記載の方法。
5. 二卜リラ一ゼ活性を有する微生物がコリネパクテリゥム ニトリロフィラス (Corynebacterium nitrilophilus) ATCC 21419である請求の範囲第 1項記載の方 法。
6. 二トリラーゼ活性を有する微生物がゴルドナ テラエ（Gordona terrae) MA- 1 (FER BP-4535) である請求の範囲第 1項記載の方法。
7. 二ト リラ一ゼ活性を有する微生物がロ ドコッカス ロ ドクロウス (Rhodococcus rhodochrous) ATCC 33025である請求の範囲第 1項記載の方法。
8. 式 （Γ ) ：
NCCH2 COOR' ( I ' ) (式中、 R' は、 アルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基又は炭素数 3〜20の アルキル基を示す。 ）
で表されるシァノ酢酸エステルを、 二トリラ一ゼ活性を有する微生物の培養物、 菌体又は菌体処理物で処理して加水分解することを特徴とする、 式 （Π' ) ： HOOCCHz COO R' (Ε' )
(式中、 R' は、 前記のとおりである。 ）
で表されるマロン酸モノエステルの製造方法。
9. 加水分解反応中、 反応液のシァノ酢酸エステルの濃度を 0.01〜10重量％の範 囲に維持しながら該エステルを連続添加する請求の範囲第 8項記載の方法。
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