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WO1998033900A1 - Method and apparatus for predicting protein function site, method for improving protein function, and function-improved protein - Google Patents

Method and apparatus for predicting protein function site, method for improving protein function, and function-improved protein Download PDF

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WO1998033900A1
WO1998033900A1 PCT/JP1998/000430 JP9800430W WO9833900A1 WO 1998033900 A1 WO1998033900 A1 WO 1998033900A1 JP 9800430 W JP9800430 W JP 9800430W WO 9833900 A1 WO9833900 A1 WO 9833900A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
length
protein
value
acid residue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1998/000430
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hirofumi Doi
Hideaki Hiraki
Akio Kanai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority claimed from JP1924997A external-priority patent/JP3801714B2/ja
Priority claimed from JP33210097A external-priority patent/JP3880173B2/ja
Priority claimed from JP01869998A external-priority patent/JP3792039B2/ja
Application filed by Japan Science and Technology Corp filed Critical Japan Science and Technology Corp
Priority to DE69836971T priority Critical patent/DE69836971T2/de
Priority to EP98901095A priority patent/EP1013759B1/en
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting a functional site of a protein, an apparatus for performing the function prediction, a method for improving the function of a protein, and a function-improving protein. More specifically, the present invention relates to the prediction of the functional site of a protein of unknown function obtained by genomic analysis and cDNA analysis, and the novel function and the functional site of a protein whose function is already known. The present invention relates to prediction of a modified site for prediction and improvement of the function of the protein, and a protein having a function improved based on the prediction. Background art
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a new method for predicting a functional site of a protein of unknown function obtained from genome analysis or cDNA analysis. It is an object.
  • Another object of the present invention is to provide an apparatus for performing the function prediction. are doing.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting a new functional site of a protein of unknown or known function and mutating the functional site to produce a modified protein.
  • Still another object of the present invention is to provide a protein whose function has been modified by the above method. Disclosure of the invention
  • the first invention provided by this application is a method for predicting a functional site of any protein of a species a from a predicted total protein of the species a for which genomic data or cDNA analysis data is known.
  • oligopeptides of length n those with an appearance frequency of 1 were less than those with an appearance frequency of 2, and those of oligopeptides of length (n + 1) with an appearance frequency of 1 were less than those with an appearance frequency of 2. Also many;
  • Aj (n + 1 ⁇ j ⁇ L—n) is the j-th amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence (length L) of the protein whose functional site is to be predicted.
  • Aj indicates the i-th residue of this oligopeptide
  • this is a method for predicting a functional site of a protein, wherein the degree of responsibility of each amino acid residue for the function of the protein is predicted using the magnitude of the Zj value as an index.
  • the second invention is a method for predicting a functional site of any protein of the species a from the predicted total protein of the species a for which genomic data or cDNA analysis data is known,
  • the jth amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence (length L) is Aj, and the jth amino acid residue Aj (n ⁇ j ⁇ L—n + 1) in the partial sequence of the amino acid sequence of this protein ) Including any length n (1 ⁇ n ⁇ M, where M is the length M of the first oligonucleotide that meets the following criteria; all oligopeptides of length M have an appearance frequency of 1) Aj oligopeptide;
  • This is a method for predicting a functional site of a protein, wherein the degree of responsibility of each amino acid residue for the function of the protein is predicted using the magnitude of the Wj value as an index.
  • a third invention is an apparatus for automatically performing the method of the first invention, and at least the following apparatuses (a) to (h):
  • oligopeptides of length n those with an appearance frequency of 1 are less than those with an appearance frequency of 2, and those of length (n + 1) with an appearance frequency of 1 are less than those with an appearance frequency of 2. Many;
  • a storage device comprising a CPU for calculating
  • the amino acid sequence (length L) from the N-terminus of the amino acid sequence (length L) of the protein whose functional site is to be predicted is defined as Aj (n + 1 ⁇ " ⁇ ! _- ⁇ ), and the amino acid sequence of this protein is Aj oligopeptide of length (n + 1) containing the jth amino acid residue Aj in the partial sequence;
  • Aj indicates the i-th residue of this oligopeptide
  • a calculation Z storage device comprising a CPU for obtaining a ratio Yji of the appearance frequency of Aj oligopeptide and Xi oligopeptide, and a storage device for storing Yji.
  • a calculation / storage device comprising a CPU for determining
  • a calculation / storage device comprising a CPU for determining, and a storage device for storing ⁇
  • a fourth invention is an apparatus for automatically performing the method of the second invention, and at least the following apparatuses (a) to (i):
  • the amino acid sequence (length) of the jth amino acid residue from the N-terminus is Aj
  • the amino acid residue at the jth amino acid in the partial sequence of the amino acid sequence of this protein Any length n (1 ⁇ n ⁇ M, including Aj (n ⁇ j ⁇ Ln + 1), where M is the length M of the first oligopeptide that meets the following criteria; All having an appearance frequency of 1) Aj oligopeptides;
  • a computational storage device consisting of a CPU for determining the frequency of occurrence of
  • a calculation Z storage device comprising a CPU for obtaining a ratio Yji of the appearance frequency of Aj oligopeptide and Xi oligopeptide, and a storage device for storing Yji;
  • a storage device comprising a CPU for obtaining the following, and a storage device for storing YG, n):
  • a functional storage device for protein comprising: a calculation storage device comprising a storage device for storing a value.
  • a fifth invention is a method for improving the function of Protein A whose function is known from all proteins of the species a whose genome data or cDNA analysis data is known,
  • Protein A and related proteins were extracted from the existing protein database and aligned.
  • oligopeptides of length n those with an appearance frequency of 1 are less than those with an appearance frequency of 2, and those with an appearance frequency of 1 in oligopeptides of length (n + 1) are more than those with an appearance frequency of 2. Also many;
  • Aj indicates the i-th residue of this oligopeptide
  • Zj is used as the representative value of the function of the j-th amino acid residue in the amino acid sequence (length L) of protein A,
  • Steps (3) to (6) are sequentially repeated to obtain each Zj value for all amino acid residues at the position (n + 1 ⁇ j ⁇ L-n) of the amino acid sequence (length L).
  • amino acid sequence (length L) of protein A For the amino acid sequence (length L) of protein A, one or more amino acid residues to be mutated are selected based on the data of the alignment performed in step (1), and those amino acid residues are separated. Steps (3) to (6) are sequentially repeated for the mutated amino acid residues in various mutated amino acid sequences mutated to the amino acid residues of
  • a method for improving the function of a protein characterized in that:
  • a sixth invention is a method for improving the function of protein B of species b in which genomic data or cDNA analysis data is unknown,
  • Protein A closest to protein B is extracted and aligned from all proteins of species a for which genomic data or cDNA analysis data is known, and protein B is closely related to protein B. Is extracted from the existing protein database and aligned.
  • oligopeptides of length n one with an appearance frequency of less than one with an appearance frequency of two
  • those with an appearance frequency of 1 are higher than those with an appearance frequency of 2;
  • Aj indicates the i-th residue of this oligopeptide
  • Zj is used as the representative value of the function of the j-th amino acid residue in the amino acid sequence (length L) of protein A,
  • Steps (3) to (6) are sequentially repeated to obtain the 3 ⁇ 4 value of each amino acid residue at the position (n + 1 ⁇ j ⁇ L—n) of the amino acid sequence (length L),
  • one or more amino acid residues to be mutated are selected based on the data of the alignment performed in step (1), and those amino acid residues are selected.
  • Steps (3) to (6) are sequentially repeated for the mutated amino acid residue in various mutated amino acid sequences mutated to another amino acid residue, and the Zj value of the mutated amino acid residue is determined, (9) Select the mutation position and mutant amino acid residue where the Zj value of the mutant amino acid residue obtained in step (8) is larger or smaller than the 3 ⁇ 4 value of the original amino acid residue obtained in step (7).
  • a method for improving the function of a protein characterized in that:
  • the seventh invention is a method for improving the function of protein A, whose function is known, from all proteins of species a whose genomic data or cDNA analysis data is known, comprising the steps of: Proteins are extracted from existing protein databases and aligned,
  • the jth amino acid residue from the N-terminal of the amino acid sequence (length L) is Aj, and the jth amino acid residue Aj (n ⁇ j ⁇ L—n + 1) in the partial sequence of the amino acid sequence of this protein ) Including any length n (1 ⁇ n ⁇ M, where M is the length M of the first oligonucleotide that meets the following criteria; all oligopeptides of length M have an appearance frequency of 1) Aj oligopeptide;
  • Wj h (Z0, D, ZG, 2), ..., ⁇ , ⁇ ), D (j, 1), D (j, 2), ..., D (j, M))
  • Steps (3) to (10) are sequentially repeated to obtain the Wj value of each amino acid residue at the position (n + 1 ⁇ j ⁇ L-1n) of the amino acid sequence (length L),
  • one or more amino acid residues to be mutated are selected based on the data of the alignment performed in step (1), and those amino acids are selected.
  • Steps (3) to (10) are sequentially repeated for the mutated amino acid residue in various mutated amino acid sequences in which the acid residue is mutated to another amino acid residue, and the Wj value of the mutated amino acid residue is determined.
  • a method for improving the function of a protein characterized in that:
  • the amino acid sequence of the Pfu DNA synthase was artificially modified so as not to stop the elongation of the synthesized DNA chain in the course of catalyzing the synthesis of a DNA chain complementary to the single-stranded DNA.
  • a heat-resistant DNA synthase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present application provides a DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a recombinant vector containing the DNA sequence.
  • a recombinant vector is Escherichia coli HMS174 (DE3) / pDP320 (FERM P-
  • Recombinant plasmid P DP320 to 16,052)'s also provided.
  • thermostable DNA synthase characterized by culturing cells transformed with an expression vector containing the above DNA sequence, and isolating and purifying the target enzyme produced in the medium. And a method for producing the same.
  • the ninth invention is characterized in that the amino acid sequence of the Rfu DNA synthase is artificially modified such that the synthesized DNA strand extends longer when catalyzing the synthesis of a DNA strand complementary to the single-stranded DNA. It is a thermostable DNA synthase, specifically, a DNA synthase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or a DNA synthase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • this application provides, in connection with the ninth invention, a DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or 5, and a recombinant vector containing these DNA sequences.
  • vectors include the recombinant plasmid pDP5b17 (a vector having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) carried by Escherichia coli HMS174 (DE3) / pDP5b17 (FERM BP-6189), and Escherichia coli HMS174 ( Also provided is a recombinant plasmid pD P5C4 (a vector having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) carried by DE3) / pD P5C4 (FERM BP-6190).
  • the present invention provides a method for producing a DNA synthetase, which comprises culturing cells transformed with an expression vector containing the above DNA sequence, and isolating and purifying the target enzyme produced in the medium.
  • the protein functional site prediction method of the first invention is based on the following idea.
  • proteins are composed of sequences of 20 types of amino acid residues, but the arrangement is not random. Therefore, in any given species, the frequency of occurrence of a specific oligopeptide, which is a partial sequence of the amino acid sequence, in all the proteins encoded in the genome is not uniform.
  • the functional site of the protein is composed of oligopeptides that appear at a low frequency.
  • the longer the length of the oligopeptide the more rarely appearing oligopeptides. That is, the oligopeptide having the length (n + 1) shown in step (3) in the method of the first invention is the shortest oligopeptide that appears frequently at a low frequency, and is included in this oligopeptide.
  • the function value Zj value calculated for the amino acid residue Aj at an arbitrary position becomes the appearance index of the amino acid residue Aj at that position (that is, its function representative value).
  • the step (3) The ratio of the frequencies of appearance of Aj oligopeptide and Xi oligopeptide shown, Yji, assesses the extent to which amino acid residue Aj contributes to the frequency of appearance of Aj oligopeptide, and thus the position of any position in the protein.
  • the Z (j, n) value differs depending on the type of amino acid residue Aj.
  • step (7) of the method of the present invention the distribution of ZG, n) values in all proteins of a certain species a is determined for each of 20 types of amino acids, and the average value and standard deviation for each amino acid obtained from these distributions are obtained.
  • the D (j, n) value obtained by standardizing the Z (j, n) value based on the value is the function representative value corrected for the bias due to the type of amino acid residue.
  • the protein functional site prediction devices of the third invention and the fourth invention are devices for automatically performing the methods of the first invention and the second invention, respectively, and the protein improvement methods of the fifth invention and the sixth invention, respectively. Is a method for preparing a mutant protein by substituting an amino acid residue at a functional site predicted by the method of the first invention with another amino acid residue.
  • the protein improvement method of the seventh invention is a method of preparing a mutant protein by substituting the amino acid residue at the functional site predicted by the method of the second invention with another amino acid residue.
  • the present invention provides a novel thermostable DNA synthetase (the eighth and ninth inventions) as such an improved protein.
  • DNA polymerase is a general term for enzymes that catalyze the synthesis of DNA strands complementary to single-stranded DNA, and is essential for DNA sequencing and DNA amplification in vitro. Especially in PCR (Polymerase chain reaction), in order to automate a series of reaction cycles, ⁇ thermostable DNA synthase '' is It is essential.
  • Taq, Pfu, KOD, and the like are known as such heat-resistant DNA synthases, and are used depending on their characteristics.
  • Pfu DNA synthase is known as an enzyme with very little misreading (high fidelity) during DNA chain synthesis.
  • this Pfu DNA synthase was unsuitable for amplifying high-molecular-weight DNA such as genomic DNA, because the synthesis amount was small and the elongation activity on the synthetic chain was insufficient.
  • this application provides a new Pfu DNA synthase prepared by the method of the fifth invention.
  • FIG. 1 shows the frequency of occurrence of each of the length 3 lygopeptide, the length 4 oligopeptide, and the length 5 oligopeptide in the method of the first invention, and the number of occurrences of each length is determined. It is a frequency distribution of an oligopeptide.
  • FIG. 2 is an example of an amino acid sequence of length 20, an Aj-old rigopeptide of length 4 containing the fifth amino acid residue Met of this sequence, and an Xi oligopeptide.
  • FIG. 3 shows the frequency of appearance of each of the oligopeptides having a length of 2, an oligopeptide having a length of 3, an oligopeptide having a length of 4, and an oligopeptide having a length of 5 in the method of the second invention.
  • FIG. 4 is an example of a flowchart for carrying out step (1) of the second invention method.
  • FIG. 5 is a flowchart for carrying out steps (2 ′) to (3) of the second invention method. This is an example.
  • FIG. 6 is an example of a flowchart for carrying out steps (4) to (5) of the second invention method.
  • Figure 7 shows the frequency distribution of ZG.3) values for each type of amino acid in the method of the second invention. is there.
  • the solid line shows the distribution for isoleucine (lle), the broken line shows the distribution for alanine (Ala), and the dashed line shows the distribution for methionine (Met).
  • FIG. 8 is an example of a flowchart for carrying out step (7) of the second invention method.
  • FIG. 9 is an example of a flowchart for carrying out step (8) of the second invention method.
  • FIG. 10 is an example of a flowchart for carrying out step (9) of the second invention method.
  • FIG. 11 is a configuration diagram illustrating an apparatus of the third invention.
  • FIG. 12 is a configuration diagram illustrating the device of the third invention.
  • FIG. 13 shows the results of electrophoresis showing the primer-elongation activity of conventional Pfu DNA synthase and KOD DNA synthase.
  • FIG. 14 is a distribution diagram in which the values of the peni-log Yj calculated by the method of the first invention are plotted for the entire amino acid sequence encoding the template DNA synthase encoded by MJ0885.
  • FIG. 17 is an alignment diagram of the amino acid sequence of motif C of each of ⁇ -type DNA synthases Pfu, K0D, and MJ.
  • Figure 19 shows all amino acids encoding ⁇ -type DNA synthase encoded by MJ0885.
  • FIG. 21 shows the partial sequence of the amino acid sequence of ⁇ -type DNA synthase encoded by MJ0885 (exo I (exol), exo ⁇ (exoll), motif ACmotif A), motif B (motif B) and motif C
  • FIG. 23 shows the results of electrophoresis showing the primer extension activity of the conventional Pfu DNA synthase (wild type) and the modified Pfu DNA synthase I of the present invention.
  • FIG. 24 shows the results of electrophoresis showing the conventional Pfu DNA synthase (wild type) and the modified Pfu DNA synthase ⁇ and ⁇ primer extension activities of the present invention.
  • the protein functional site prediction method of the first invention is a method for predicting a functional site of any protein of the species a from the predicted total protein of the species a for which genomic data or cDNA analysis data is known. Therefore, the following steps (1) to (6) are required.
  • the frequency of appearance of each amino acid residue and And the frequency of appearance of each oligopeptide whose length is increased in order by combining the amino acid residues is determined to determine the length n of the oligopeptide.
  • the length n is determined as the minimum number satisfying the following criteria.
  • Fig. 1 shows the entire genome encoded by this microorganism.
  • the frequency of occurrence of oligopeptides of length 3, oligopeptides of length 4, and oligopeptides of length 5 in the protein was calculated, and the frequency distribution of oligopeptides that appeared a certain number of times for each length was calculated. is there.
  • the first n in this step (1) is 3.
  • Aj (n + 1 ⁇ j ⁇ Ln) is the jth amino acid residue from the N-terminal of the amino acid sequence (length L) of the protein whose functional site is to be predicted, and j is the partial sequence of the amino acid sequence of this protein.
  • Such Aj oligopeptide and Xi oligopeptide can be exemplified, for example, as shown in FIG.
  • the upper ⁇ 1 ⁇ in Fig. 2 is thought to encode the ⁇ -type DNA synthase of Methanococcus jannaschii (Bult et. Al., Science 273, 1058-1073, 1996).
  • the partial sequence from the N-terminus (amino terminal) to the twentieth amino acid residue is represented by single letter code, and the middle ⁇ 2 ⁇ is the fifth amino acid residue Met ( 4 shows an example of an Aj oligopeptide of length 4 containing M) and an example of an Xi oligopeptide containing a fifth amino acid residue M below ⁇ 3 ⁇ to ⁇ 6 ⁇ .
  • the ratio of the appearance frequency of Aj oligopeptide to Xi oligopeptide Yji is determined.
  • the average value of Yji is calculated as follows.
  • a monotonically decreasing function value or a monotonically increasing function value Zj of Yj is obtained as follows.
  • the value of Zj is set as a function representative value of the j-th amino acid residue in the amino acid sequence (length L).
  • each amino acid residue for the function of the protein is predicted using the value of 3 ⁇ 4 as an index. That is, the frequency of occurrence of each amino acid residue is expressed as a function value Zj of Yj.If Zj is a monotonically decreasing function value, the higher the Zj value, the lower the frequency of occurrence of that amino acid residue. Therefore, it is considered to have a great responsibility for the function development. When Zj is a monotonically increasing function, amino acid residues with smaller 3 ⁇ 4 values are considered to have greater responsibility for function.
  • the ⁇ value of each amino acid residue can be determined at a glance by displaying, for example, an amino acid sequence on the X axis and a Zj value on the Y axis as a distribution map.
  • the protein functional site prediction method of the second invention is a method of predicting a functional site of any protein of the species a from the predicted total protein of the species a for which genomic data or cDNA analysis data is already known. Therefore, the following steps (1) to (9) are required.
  • the frequency of appearance of each amino acid residue and the frequency of appearance of each oligopeptide whose length is increased in order by combining each amino acid residue are determined.
  • Figure 3 shows Methanococcus jannaschii
  • FIG. 4 is an example of a flowchart for carrying out this step (1).
  • Aj is the jth amino acid residue from the N-terminus of the amino acid sequence (length L), and includes the jth amino acid residue Aj (n ⁇ j ⁇ L—n + 1) in the partial sequence of the amino acid sequence of this protein.
  • Aj oligonucleotides of length n (1 ⁇ n ⁇ M, where M is the length M of the first lipopeptide that first meets the following criteria; all oligopeptides of length M have an appearance frequency of 1) ;
  • Such Aj oligopeptide and Xi oligopeptide can be exemplified, for example, as shown in FIG. 2, as in the method of the first invention.
  • FIG. 5 is an example of a flowchart for performing the above steps (2 ′) to (3).
  • the average value of Yji (YG, n) is calculated as follows.
  • the logarithmic value Z i, n) of Y (j, n) is obtained as follows.
  • FIG. 6 is an example of a flowchart for performing the above steps (4) to (5).
  • steps (2) to (6) are sequentially repeated for all proteins of species a to obtain the distribution of Z (j, n) values for each type of amino acid residue, and for each amino acid Aa based on this distribution.
  • a function g that calculates the average value Ad (Aa) and the standard deviation value Sd (Aa) of the Z (j, n) values and standardizes the difference in distribution depending on the type of amino acid residue;
  • FIG. 8 is an example of a flowchart for carrying out step (7).
  • FIG. 9 is an example of a flowchart for carrying out step (8).
  • the representative value of the function of the j-th amino acid residue of length L) is used, and the degree of responsibility of each amino acid residue for the function of the protein is predicted using the magnitude of the Wj value as an index.
  • FIG. 10 is an example of a flowchart for carrying out step (9).
  • the Wj value of each amino acid residue can be confirmed at a glance by displaying the amino acid sequence on the X-axis as a distribution map in which the Wj value is plotted on the Y-axis, for example. This is a preferred embodiment for carrying out the invention.
  • the protein functional site prediction device is a device for automatically performing the functional site prediction method of the first invention, and for example, as shown in FIG. At least the following devices (a) to (g) for processing steps (1) to (6) of the method are provided.
  • a device comprising a CPU for calculating the frequency of appearance of each oligopeptide determined in step (1), and a storage device for storing the calculation results.
  • a device comprising a CPU for calculating the length n of the oligopeptide determined in step (1), and a storage device for storing n.
  • a device comprising a CPU for calculating the appearance frequency of each of the Aj oligopeptide and Xi oligopeptide determined in step (2) in all proteins, and a storage device for storing the calculation results.
  • a device comprising a CPU for calculating the Yji value obtained in step (3) and a storage device for storing the Yji value.
  • a device comprising a CPU for calculating the Yj value obtained in step (4) and a storage device for storing the Yj value.
  • a device comprising a CPU for calculating the Zj value obtained in step (5) and a storage device for storing the Zj value.
  • the device of the present invention may be provided with a keyboard ( ⁇ ), a control device (j), etc. as exemplified in FIG. Good.
  • the protein functional site prediction device according to the fourth invention is a device for automatically performing the functional site prediction method according to the second invention, and for example, as shown in FIG. At least the following devices (a) to (i) for processing steps (1) to (9) of the inventive method are provided.
  • An apparatus comprising a CPU for calculating the frequency of appearance of each oligopeptide determined in step (1), and a storage device for storing the calculation results.
  • a device that consists of a CPU that calculates the frequency of appearance for all proteins, and a storage device that stores the calculation results.
  • a device comprising a CPU for calculating the Yji obtained in step (3) and a storage device for storing the Yji value.
  • a device comprising a CPU for calculating the Y (j, n) value obtained in step (4) and a storage device for storing the Y (j, n) value.
  • Step (5) An apparatus comprising a CPU for calculating the ZG, n) value obtained in (6) and a storage device for storing the ZG, n) value.
  • a device comprising: a CPU for calculating the g value obtained in step (7); and a computing device for storing the g value.
  • a device comprising a CPU for calculating the DG, n) value obtained in step (8), and a storage device for storing the DG, n) value.
  • a device comprising a CPU for calculating the Wj value obtained in step (9), and a storage device for storing the Wj value.
  • the following devices j) to (l) can be provided in an appropriate combination.
  • a device that displays the Wj value of each amino acid residue as a distribution map on the stereostructure database or three-dimensional model stored in the device (k).
  • the device of the present invention may be provided with a keyboard (m), a control device (n), and the like as exemplified in FIG. Good.
  • a keyboard m
  • a control device n
  • the protein function improving method according to the fifth invention will be described.
  • This method is a method for improving the function of Protein A, whose function is known, from the expected total protein of Species a whose genome data or cDNA analysis data is known, and comprises the following steps (1). ) To (10) as constituent requirements.
  • step 1 :
  • Protein A and related proteins are extracted from the existing protein database and aligned.
  • Steps (1) to (6) in the method of the first invention are performed on the amino acid sequence of all the proteins of the species a.
  • one or more amino acid residues to be mutated were selected based on the data of the alignment performed in step (1), and various amino acid residues were mutated to another amino acid residue.
  • Steps (3) to (6) are sequentially repeated for the mutated amino acid residue in the mutated amino acid sequence to determine the Zj value of the mutated amino acid residue.
  • a modified gene of protein A encoding the amino acid sequence selected in step (9) is prepared according to a known method, and this gene is expressed in an appropriate host-vector system to prepare improved protein A.
  • the method for improving protein function of the sixth invention is a method for improving the function of protein B of species b whose genomic data or cDNA analysis data is unknown, and comprises the following steps ( 1 ) to (10). It is a configuration requirement.
  • Steps (2) to (8) of the method of the third invention are performed on the amino acid sequence of the whole protein of the species a.
  • a modified gene of protein B that realizes the position selected in step (9) and its amino acid residue is prepared according to a known method, and this gene is expressed in a suitable host-vector system to prepare an improved protein B. I do.
  • the function improvement methods according to the fifth and sixth inventions of the present invention incorporate unknown function sites of proteins by incorporating the function site prediction method of the first invention. It is newly found and characterized by mutating this site.
  • the protein function improving method of the fifth invention can be carried out in the same manner as the fifth invention by using the function prediction method of the second invention.
  • the heat-resistant DNA synthases of the eighth and ninth inventions are prepared by preparing a thermostable Pfu DNA synthase derived from Pyrococcus furiosus by a known mutant gene preparation method (Strategies, vol. 9, p3-4). , 1996) (hereinafter, the thermostable DNA synthase of the present invention may be referred to as "modified Pfu DNA synthase").
  • the preparation of this enzyme can be performed as follows. That is, since the gene sequence of the Pfu DNA synthase has a known base sequence (Nucleic Acids Research, vol.
  • a synthetic oligonucleotide complementary to both ends of the gene is synthesized and used as a primer.
  • a gene for Pfu DNA synthase is prepared by a PCR method using the genomic DNA of the above bacterium as type III. This gene DNA fragment is cloned into a vector and mutated by the method described in the above-mentioned literature.
  • the mutation in the gene caused the base to be replaced such that a part of the amino acid sequence of Pfu DNA synthase was replaced with the amino acid sequence of KOD DNA synthase.
  • the amino acid sequences of PfuDNA synthase and KODDNA synthase are approximately 80 ⁇ 1 ⁇ 2 homologous and cause the same synthesis termination at the time of PCR (Fig. 13), the growth rate of KODDNA synthase is similar to that of PfuDNA synthesis. It is about 6 times that of the enzyme.
  • the amino acid residue of Pfu DNA synthase substituted with the amino acid residue of KOD DNA synthase, it is possible to improve the termination of the elongation of the elongation chain or to elongate the elongation of the synthetic DNA chain at a high elongation speed. This is because a possible enzyme may be obtained.
  • the gene thus mutated was expressed in Escherichia coli, and the expression product was recovered and purified to obtain the modified PfuDNA synthase of the present invention.
  • the heat-resistant DNA synthase (modified Pfu DNA synthase I) of the eighth invention is specifically an enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • This amino acid sequence is From the amino acid sequence of a known Pfu DNA synthase, an amino acid residue whose function can be changed by the method for predicting a functional site according to the present invention is specified, and the amino acid residue is substituted as shown in Table 1, which is a novel sequence. .
  • DNA synthesis such as PCR is performed using this novel enzyme, as shown in the examples below, the synthesis stop caused by using the conventional DNA synthase is almost completely eliminated.
  • the type I DNA strand that is efficiently amplified by the conventional enzyme is similarly efficiently amplified.
  • the heat-resistant DNA synthase (modified Pfu DNA synthases I and m) of the ninth invention is specifically an enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 6 and 7, and similarly, the amino acid of Pfu DNA synthase. From the sequence, an amino acid residue whose function can be changed by the method for predicting a functional site of the present invention is specified, and as shown in Table 2, the amino acid residue is replaced with a novel sequence. Then, when DNA synthesis such as PCR is performed using this novel enzyme, it is possible to obtain a large amount of a high-molecular synthetic product as shown in the following Examples.
  • the DNA sequences encoding these modified Pfu DNA synthases include the enzymes described above. Mutant genes of the Pfu DNA synthase gene obtained in the element preparation process can be exemplified. These mutant genes have been cloned into recombinant plasmids p320, pDP5b17 and pDP5C4, for example, with respect to the DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 6 or 7, respectively.
  • the plasmid was introduced into E. coli HMS174 (DE3) and deposited with the National Institute of Bioscience and Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (deposit numbers FERMP_16052, FERMBP-6189, and FERM BP-6190, respectively).
  • DNA sequence of the present invention can be appropriately designed as a DNA sequence in which, for example, base codons corresponding to the amino acid residues of SEQ ID NOs: 1, 6, and 7 are joined.
  • thermostable DNA synthase of the present invention can be obtained by expressing it in a microorganism such as Escherichia coli.
  • a microorganism such as Escherichia coli.
  • the above-described DNA sequence is inserted into an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a cDNA cloning site, a terminator, etc. which can be replicated in a microorganism, and the expression vector is prepared. After transforming a host cell with this expression vector and culturing the resulting transformant, the enzyme encoded by the DNA sequence can be mass-produced in the microorganism.
  • Example 2
  • Figure 1 is an alignment diagram of the amino acid sequence of each motif C of Pfu, K0D, and MJ. In the region from 531 to 544, there is no difference between Pfu and MJ.
  • Lliethanococcus jannaschii (Bult et a, Science 273, 1058-1073, 1996), predicted by the gene MJ0885 of this microorganism, which is thought to encode a prototype DNA synthase.
  • Z (j, 1) -l in the method of the second invention.
  • FIG. 19 is a plot of these results as a distribution map for the 100 residues from the N-terminus.
  • the positions of the amino acid residues in the three-dimensional structure are displayed in dark on a three-dimensional structure model created by a known method based on the enolase of S. cerevisiae. It can be seen that residues at distant positions on the amino acid sequence are close together in the three-dimensional structure.
  • Example 2 the improved PfuDNA synthase I was prepared by applying the amino acid residue mutation for the function improvement expected for DNA synthase MJ to PfuDNA synthase.
  • a PCR primer is synthesized according to the base sequence of the Pfu DNA synthase gene (Nucleic Acids Research, vol.21, P259-265, 1993), and the genomic DNA of Pyrococcus furiosus (P. furiosus) is converted to type III.
  • the target gene was amplified and cloned into an expression vector for E. coli. Details are as follows.
  • P. furiosus DSM3638 was cultured by the method described in the above literature.
  • the medium described was prepared, sterilized at a high temperature and pressure, and then infused with a nitrogen gas, inoculated, and cultured at 95 ° C for 15 hours. Approximately 0.5 mg of cells were obtained from 200 ml of culture by centrifugation. The collected cells were suspended in buffer A (10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM Nacl), 1 ml of 10% SDS was added, and after stirring, 0.5 mg of proteinase K was added. The reaction was performed at 55 ° C for 60 minutes. The reaction solution was sequentially extracted with phenol, phenol, and then extracted with chloroform.
  • the ethanol was added to insolubilize the DNA, and recovered.
  • the obtained DNA was dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM EDTA), 0.5 mg of RNase A was added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 60 minutes.
  • primer DNAs represented by SEQ ID NOS: 2 and 3 were synthesized based on known sequence data. That is, the start codon ATG of the target gene and the restriction enzyme Ncol rooster (5'-CCATGG-3 ') were introduced into the fore-primer sequence, and the reverse primer was downstream of the stop codon. It was designed to be connected at an appropriate position. PCR was performed using 2 ⁇ g of P. furiosus DNA and 10 pmol of each primer, using LATaq (Takara Shuzo) and the attached buffer under a 50 I reaction system.
  • a gene for a modified Pfu DNA synthase was prepared on expression vector pDPWT100 to construct expression vector pDP320.
  • the amino acid sequence of the modified Pfu DNA synthase was confirmed by determining the nucleotide sequence of the modified gene.
  • the prepared modified PfuDNA synthase I gene was expressed in Escherichia coli and purified as follows.
  • modified genes ⁇ and m were created as follows.
  • the expression vector pDPWT100 incorporating the cloned PfuDNA synthase gene was compared with an oligonucleotide containing the expected mutation (SEQ ID NOs: 8 and 9) and a mutation introduction kit of Promega using a known method ( According to Strategies, vol 9, p3-4, 1996), a gene for the modified PfuDNA synthase ⁇ was created on the expression vector pDPWT100 to construct the expression vector pDP5b17.
  • the amino acid sequence of the modified PfuDNA synthetase (SEQ ID NO: 6) was confirmed by determining the nucleotide sequence of the modified gene.
  • a modified PfuDNA synthase ⁇ ⁇ ⁇ gene was prepared by the same method as described above except that the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 10 and 11 were used, and an expression vector pDP5C was constructed. By determining the nucleotide sequence of this modified gene, The amino acid sequence of type PfuDNA synthase ⁇ (SEQ ID NO: 7) was confirmed.
  • the modified Pfu DNA synthase ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ genes thus prepared were expressed in E. coli and purified as follows.
  • the expression vector pDP5b17 and the expression vector pDP5C4 were introduced into E. coli HMS174 (DE3) strain, respectively, and cultured for 14 hours in LB medium containing 0.1 mM IPTG to induce the expression of the enzyme in E. coli. did. After collecting the cells by centrifugation, the modified Pfu DNA synthase was sonicated with a buffer containing 150 mM Tris / HCI (pH 7.5), 2 mM EDTA, 0.24 mM APMSF and 0.2% Tween20. And m were extracted.
  • the crude extract was subjected to a heat treatment of 80 ° (:, 15 minutes) to inactivate the DNA synthase derived from Escherichia coli and to partially purify the modified Pfu DNA synthases ⁇ and ⁇ .
  • the dialysate was dialyzed against a buffer of 50 mM Tris / HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.2% Tween20 7 mM 2-mercaptoethanol and 10% glycerol, which was specific for the modified Pfu DNA synthase ⁇ and m at this stage. DNA synthesis activity was detected.
  • the present invention it is possible to predict the functional site of a protein of unknown function obtained from genomic analysis or cDNA analysis. It is also possible to predict a new functional site for a protein with a known function.
  • the heat-resistant DNA synthase provided by the present invention can efficiently synthesize and amplify the entire length thereof when amplifying high-molecular DNA by PCR or the like. This makes it possible to perform synthesis and amplification of DNA strands in a test tube, determination of base sequence, etc. easily and with high accuracy.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Lys Arg Tyr Ala Va I lie Asp Glu Glu G I y Lys Va I lie Thr Ar G I y
  • Glu Tyr Lys Ala lie G I y Pro His Va I Ala Va I Ala Lys Lys Leu Ala
  • Lys Va I Tyr A I a Asp Glu lie A I a Lys A I a Trp Glu Ser G I y Glu Asn 290 295 300
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)

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Description

明綑書 蛋白質機能部位の予測方法と予測装置、並びに
蛋白質の機能改良方法と機能改良蛋白質 技術分野
この発明は、蛋白質の機能部位を予測する方法と、この機能予測を行なう ための装置、ならびに蛋白質の機能改良方法と機能改良蛋白質に関するもの である。さらに詳しくは、この発明は、ゲノム解析や cDNA解析により得られた機 能未知の蛋白質の機能部位の予測や、機能が既知である蛋白質であってもそ の蛋白質のもつ新規の機能と機能部位の予測およびの機能向上のための改 変部位の予測と、この予測に基づいて機能を改良した蛋白質に関するものであ る。 背景技術
病原微生物を含む種々の生物のゲノム解析や cDNA解析の進展にともない、 機能未知の新規遺伝子やそれによってコードされる蛋白質の数が急速に増加 している。たとえば、 これまでにマイコプラズマ■ジェニタリウム [Mycoplasma genitalium] (Fraser et al., Science 270, 397-403, 1995)、へモフィラス■ィンフ ゾレエンザ工 [Heamophilus influenzae] (Fleischmann et. al., Science 269, 496— 512, 1995)、メタノコッカス-ャナシィ [Methonococcus jannashcii](Bult et. al., Science 273, 1058-1073, 1996)などの微生物の全ゲノムの核酸配列が解析さ れ、遺伝子から予測される新規の蛋白質が数多く発見されている。またヒトゃマ ウスでは cDNA解析がゲノム解析と同時に進行しており新規の蛋白質が多く発 見されている。
このような状況において、機能未知の蛋白質の機能または機能部位を予測 することが重要な課題となってきている。また、新規の蛋白質のみならず、機能 が既知の蛋白質についても、新規の機能あるいは機能部位が発見されれれぱ、 その蛋白質の産業上あるいは医療上の利用価値が判断可能となる。また、こ のような機能予測は、機能をさらに向上させた改変型蛋白質の作成をも可能と する。
従来より、ゲノム解析や cD NA解析によって明らかにされた遺伝子がコードす る蛋白質が新規であるか機能既知であるかは、 Swiss- Prot 等の蛋白質データ ベースを用いたホモロジ一検索によって行なわれてきた。また機能部位を予測す るには、同じ機能をもった種々の生物由来の蛋白質を蛋白質データべ一スから 抽出してァライメントを行い、両者に共通して保存されている領域を機能部位と して予測していた。
しかしながら、ゲノム解析や cD NA解析から得られた蛋白質が全く新規の蛋 白質であった場合、ァライメント法は使えないという問題があった。また蛋白質デ ータベース中の既知の蛋白質とホモロジ—があったとしても、近縁生物種の蛋 白質とのホモロジ一であった場合、保存領域がその蛋白質のアミノ酸配列のほ とんどを占め、機能部位の予測が行えないという問題があった。さらに、機能が 既知あるいは未知に関わらず、蛋白質の改変に関しては、ァライメントによって 機能部位の予測が行えたとしても、保存領域を変異させると一般的に機能が 低下することが予想され、保存領域外のアミノ酸を変異させることにより機能向 上を計らなければならない。すなわち、改変したい蛋白質において新規の機能 部位を見い出す必要がリ、新規の機能部位の発見やどのアミノ酸を変異させれ ばよいかは従来のァライメント法では予測できないという問題があった。
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ゲノム解析 や c D NA解析から得られた機能未知の蛋白質について、その機能部位を予測 するための新しい方法を提供することを目的としている。
また、この発明は、この機能予測を行なうための装置を提供することを目的と している。
さらにこの発明は、機能未知または既知の蛋白質について、その新たな機能 部位を予測し、その機能部位を変異させることによって改変型の蛋白質を作成 する方法を提供することを目的としている。
さらにまた、この発明は、上記の方法で機能を改変させた蛋白質を提供する ことを目的としてもいる。 発明の開示
この出願によって提供される第 1の発明は、ゲノムデータまたは cDNA解析デ ータが既知である生物種 aの予想される全蛋白質から、その生物種 aの任意の 蛋白質の機能部位を予測する方法であって、
(1) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度 および各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出 現頻度を求め、最初に以下の基準に合致するオリゴペプチドの長さ n;
長さ nのオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のものよりも少 なく、長さ（ n + 1 )のオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2の ものよりも多い；
を確定し、
(2) 機能部位予測対象の蛋白質のアミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目ァ ミノ酸残基を Aj(n+1≤j≤L— n)とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列 で j番目のアミノ酸残基 Ajを含む長さ（n+1 )の Ajオリゴペプチド；
aj1 aj2....Aji ..... ajnaj(n + 1 )( 1≤ i≤ n + 1； Aj = Ajiで
Ajはこのオリゴペプチドの i番目の残基を示す）
の出現頻度と、長さ（n+1 )の Xiオリゴペプチド；
aj1aj2..... Xi ..... ajnaj(n + 1 )(Xi は任意のアミノ酸残基を示す）の出現頻度と を生物種 aの全蛋白質中で求め、 (3) Ajオリゴぺプチドと Xiォリゴペプチドの出現頻度の比 Yj iを求め、
(4) Yjiの平均値 Yj;
Yj=∑YjiZn+1 (1≤i≤n + 1 )
を求め、
(5) Yjの関数値 Zj;
¾=f(Yj) (関数 fは単調減少関数または単調増加関数）
を求め、この Zjの値をアミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機能代表 fitとし、
(6) 以下、上記ステップ (2) から（5) を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の n +1≤j≤L_nの位置にある全アミノ酸残基 Ajについて各々の Zj値を求める、 ことによって、蛋白質の機能に対する各アミノ酸残基の責任の程度を Zj値の大 きさを指標として予測すること特徴とする蛋白質の機能部位予測方法である。
第 2の発明は、ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 a の予想される全蛋白質から、その生物種 aの任意の蛋白質の機能部位を予測 する方法であって、
(1) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度 および各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出 現頻度を求め、
(2) 生物種 aの任意の蛋白質について、
(2') アミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ酸残基を Ajとし、この蛋白質 のアミノ酸配列の部分配列で j番目のアミノ酸残基 Aj(n≤j≤L— n+1 )を含む 任意の長さ n(1≤n≤M、ただし Mは最初に以下の基準に合致するオリゴぺプ チドの長さ M;長さ Mのオリゴペプチドはすべて、出現頻度 1である）の Ajオリゴぺ プチド；
aj1aj2....aji....ajn( 1≤i≤n+ 1； Aj = aj ίで Ajはこのオリゴペプチドの i番目 の残基を示す） の出現頻度と、
Ajオリゴペプチドに対応する長さ nの Xiオリゴペプチド；
aj1aj2....Xi....ajn(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求め、
(3) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求め、
(4) Yjiの平均値 Y(j,n);
YO,n)=∑ YjiZn( 1≤i≤n)
を求め、
(5) Y(j,n)の関数値 ZG,n);
ZG,n) = -log(YO,n))
を求め、
(6) 以下、上記ステップ (2')から (5)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の j番 目（n≤j≤L— n + 1 )の位置にあるアミノ酸残基 Ajについて各々の Z(j,n) 値を 求め、
(7) 生物種 aの全蛋白質について上記ステップ (2)から（6)を順次繰り返し、ァミノ 酸残基の種類毎の ZG,n)値の分布を求め、この分布に基づいて各アミノ酸 Aaに 対する Z(j,n)値の平均値 Av(Aa)と標準偏差値 Sd ( Aa)を求め、アミノ酸残基 の種類による分布の違いを標準化する関数 g;
Figure imgf000007_0001
Aj) =に (j,n)— Av(Aa)}ノ Sd(Aa) (ただし Aj=Aa) を求め、
(8) アミノ酸配列（長さ L)の j番目（n≤j≤L— n+1 )の位置にある全アミノ酸残 基 Ajについてステップ (7)で得られた関数 gの値 DG.n);
Figure imgf000007_0002
を求め、
(9) アミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機能代表値を Z(j,n)値と D (j,n)値の関数値 Wj; Wj = h(ZG,D, ZG.2) , Z(j,M), D(j,1), DC, 2) , D(j,M)) とする、
ことによって、蛋白質の機能に対する各アミノ酸残基の責任の程度を Wj値の大 きさを指標として予測すること特徴とする蛋白質の機能部位予測方法である。
第 3の発明は、上記第 1発明の方法を自動的に行なう装置であって、少なく とも以下の（a)から（h)の装置、
(a) ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 aの予想される全 蛋白質のアミノ酸配列データ、および既存の蛋白質データベースを記憶する外 部記憶装置、
(b) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度 および各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出 現頻度を計算する CPUと、その計算結果を記憶する記憶装置とからなる計算 Z記憶装置、
(c) 装置（b)に出現頻度が記憶された各オリゴペプチドの中から、最初に以下の 基準に合致するオリゴペプチドの長さ n;
長さ nのオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のものよりも少 なく、長さ（n+ 1 )のオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2の ものよりも多い；
を計算する CPUと、 nを記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、
(d) 機能部位予測対象の蛋白質のアミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目ァ ミノ酸残基を Aj(n + 1≤」≤ !_ー门）とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列 で j番目のアミノ酸残基 Ajを含む長さ（n+1 )の Ajオリゴペプチド；
aj1 aj2..... Aji..ajnaj(n + 1 )( 1≤ i≤ n + 1； Aj = Ajiで
Ajはこのオリゴペプチドの i番目の残基を示す）
の出現頻度と、長さ（n+1 )の Xiオリゴペプチド；
aj1aj2..... Xi ....ajnaj(n+1 ) ( Xiは任意のアミノ酸残基を示す）の出現頻度と をこの生物種の全蛋白質中で求める CPUと、その計算結果を記憶する記憶装 置とからなる計算 記憶装置、
(e) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求める CPUと、 Yji を記憶する記憶装置とからなる計算 Z記憶装置、
(f) Yjiの平均値 Yj;
Yj=∑YjiZn + 1 (1≤i≤n+1)
を求める CPUと、 Yjを記憶する記憶装置とからなる計算/記憶装置、
(g) Yjの関数値 ¾;
¾=f(Yj) (関数 fは単調減少関数または単調増加関数）
を求める CPUと、 ¾を記憶する記憶装置とからなる計算/記憶装置、
を備えていることを特徴とする蛋白質の機能部位予測装置である。
第 4の発明は、上記第 2発明の方法を自動的に行なう装置であって、少なく とも以下の (a)から (i)の装置、
(a) ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 aの予想される全 蛋白質のアミノ酸配列データ、および既存の蛋白質データベースを記憶する外 部記憶装置、
(b) この生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現 頻度および各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチド の出現頻度を計算する CPUと、その計算結果を記憶する記憶装置とからなる 計算 記憶装置、
(c) この生物種 aの任意の蛋白質について、アミノ酸配列（長さし）の N末端から j 番目アミノ酸残基を Ajとし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列で j番目のァ ミノ酸残基 Aj(n≤j≤L-n + 1 )を含む任意の長さ n(1≤n≤M、ただし Mは最 初に以下の基準に合致するオリゴペプチドの長さ M;長さ Mのオリゴペプチドは すべて、出現頻度 1である）の Ajオリゴペプチド；
aj1aj2....aji....ajn( 1≤i≤n+ 1； Aj = aj iで Ajはこのオリゴペプチドの i番目 の残基を示す）
の出現頻度と、
Ajオリゴペプチドに対応する長さ nの Xiオリゴペプチド；
aj1aj2....Xi....ajn(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求める CPUと、その計算結果を記憶 する記憶装置とからなる計算 記憶装置、
(d) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求める CPUと、 Yji を記憶する記憶装置とからなる計算 Z記憶装置、
(e) Yjiの平均値 Y(j,n);
YG,n)=∑ Yji/n(1≤i≤n)
を求める CPUと、 YG,n)を記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、
(f) Y(j,n)の関数値 ZG，n);
Figure imgf000010_0001
を求める CPUと、 Z(j,n)を記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、 (g) 生物種 aの全蛋白質のアミン酸配列について、各アミノ酸残基の Z(j,n) を 求め、アミノ酸残基の種類毎の Z(j,n)値の分布を求め、この分布に基づいて各 アミノ酸 Aaに対する Z(j,n)値の平均値 Av(Aa)と標準偏差値 Sd(Aa)を求め、 アミノ酸残基の種類による分布の違いを標準化する関数 g;
g=(ZG,n), Aj) = {ZG,n)-Av(Aa)}/Sd(Aa) (ただし Aj=Aa) を求める CPUと、 gを記憶する計算装置とからなる計算 記憶装置、
(h) アミノ酸配列（長さ L)の j番目（n≤j≤L— n+1 )の位置にある全アミノ酸残 基 Ajについて、装置 (g)に記憶された関数 gの値 D(j,n);
Figure imgf000010_0002
を求める CPUと、 DG,n)値を記憶する記憶装置とからなる計算ノ記憶装置、 (i) アミノ酸配列について、各アミノ酸残基の Z(j，n)値 gと DCj.n)値の任意の関数 値 Wj; Wj = h(ZG,D, ZG,2) , .·., Z(j，M), D(j,1), DQ, 2) , D(j，M)) を求める計算装置と、 Wj値を記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、 を備えていることを特徴とする蛋白質の機能部位予測装置である。
第 5の発明は、ゲノムデータまたは cDN A解析データが既知である生物種 a の全蛋白質から、機能が既知である蛋白質 Aの機能を改良する方法であって、
(1) 蛋白質 Aと近縁の蛋白質を既存の蛋白質データベースから抽出してァライ ンメントを行い、
(2) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度 および各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出 現頻度を求め、最初に以下の基準に合致するオリゴペプチドの長さ n;
長さ nのオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のものよりも少 なく、長さ（n+1 )のオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2の ものよりも多い；
を確定し、
(3) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ酸残基を Aj (n+1 ≤』≤しー とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列で j番目のアミノ酸残基 Ajを含む長さ（n + 1 )の Ajオリゴペプチド；
aj1 aj2....Aji....ajnaj(n+1 )( 1≤ i≤ n + 1； Aj = Ajiで
Ajはこのオリゴペプチドの i番目の残基を示す）
の出現頻度と、長さ（n+1)の Xiオリゴペプチド；
aj1aj2....Xi....ajnaj(n+1)(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求め、
(4) Ajオリゴぺプチドと Xiオリゴぺプチドの出現頻度の比 Yj iを求め、
(5) Yjiの平均値 Yj;
Yj=∑Yji/n+1 (1≤i≤n+1)
を求め、 (6) Yjの関数値 Zj ;
Zj = f(Yj ) (関数 fは単調減少関数または単調増加関数）
を求め、この Zjの値を蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基 の機能代表値とし、
(7) ステップ (3)から (6)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の（n + 1≤j≤L- nの位置にある全アミノ酸残基について各々の Zj値を求め、
(8) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)について、ステップ (1 )で行なったァラインメ ントのデータをもとに変異させるアミノ酸残基を 1種以上選択し、それらのァミノ 酸残基が別のアミノ酸残基に変異した種々の変異型アミノ酸配列における変異 アミノ酸残基についてステップ (3)から (6)を順次繰り返し、変異アミノ酸残基の Zj 値を求め、
(9) ステップ (8)で求めた変異アミノ酸残基の Zj値が、ステップ (7)で求めた元のァ ミノ酸残基の Zj値より大きいか小さい変異型アミノ酸配列を選択し、
( 1 0) このアミノ酸配列をコードする蛋白質 Aの改変型遺伝子を作成し、この遺 伝子の発現産物として改良型蛋白質を作成する、
ことを特徴とする蛋白質の機能改良方法である。
第 6の発明は、ゲノムデータまたは c D NA解析データが未知である生物種 b の蛋白質 Bの機能を改良する方法であって、
(1 ) ゲノムデータまたは c D NA解析データが既知である生物種 aの全蛋白質か ら、蛋白質 Bと最も近縁の蛋白質 Aを抽出してアラインメントを行ない、また蛋白 質 Bと近縁の蛋白質を既存の蛋白質データベースから抽出してアラインメントを 行い、
(2) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度 および各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出 現頻度を求め、最初に以下の基準に合致するオリゴペプチドの長さ n ;
長さ nのオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のものよりも少 な《長さ（ n + 1 )のオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2の ものよりも多い；
を確定し、
(3) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ酸残基を Aj(n+1 ≤』≤!_ー とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列で j番目のアミノ酸残基
Ajを含む長さ（n+1 )の Ajオリゴペプチド；
aj1aj2....Aji....ajnaj(n+1)( 1≤ i≤ n + 1； Aj = Ajiで
Ajはこのオリゴペプチドの i番目の残基を示す）
の出現頻度と、長さ（n+1 )の Xiオリゴペプチド；
aj1aj2....Xi....ajnaj(n+1)(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求め、
(4) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求め、
(5) Yjiの平均値 Yj;
Yj=∑YjiZn+1 (1≤i≤n + 1)
を求め、
(6) Yjの関数値 Zj;
¾=f(Yj) (関数 fは単調減少関数または単調増加関数）
を求め、この Zjの値を蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基 の機能代表値とし、
(7) ステップ (3)から（6)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の（n+1≤j≤L— nの位置にある全アミノ酸残基について各々の ¾値を求め、
(8) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)について、ステップ（1)で行なったァラインメ ン卜のデータをもとに変異させるアミノ酸残基を 1種以上選択し、それらのァミノ 酸残基が別のアミノ酸残基に変異した種々の変異型アミノ酸配列における変異 アミノ酸残基についてステップ (3)から (6)を順次繰り返し、変異アミノ酸残墓の Zj 値を求め、 (9) ステップ (8)で求めた変異アミノ酸残基の Zj値が、ステップ (7)で求めた元のァ ミノ酸残基の ¾値より大きいか小さい変異位置と変異アミノ酸残基を選択し、
(10)この位置でこの変異アミノ酸残基を実現する蛋白質 Bの改変型遺伝子を 作成し、この遺伝子の発現産物として改良型蛋白質を作成する、
ことを特徴とする蛋白質の機能改良方法である。
第 7の発明は、ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 a の全蛋白質から、機能が既知である蛋白質 Aの機能を改良する方法であって、 (1) 蛋白質 Aと近縁の蛋白質を既存の蛋白質データベースから抽出してァライ ンメントを行い、
(2) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度 および各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出 現頻度を求め、
(3) 蛋白質 Aについて、
(3') アミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ酸残基を Ajとし、この蛋白質 のアミノ酸配列の部分配列で j番目のアミノ酸残基 Aj(n≤j≤L— n+1 )を含む 任意の長さ n(1≤n≤M、ただし Mは最初に以下の基準に合致するオリゴぺプ チドの長さ M;長さ Mのオリゴペプチドはすべて、出現頻度 1である）の Ajオリゴぺ プチド；
aj1aj2....aji....ajn( 1≤i≤n+ 1； Aj = aj ίで Ajはこのオリゴペプチドの i番目 の残基を示す）
の出現頻度と、
Ajオリゴペプチドに対応する長さ nの Xiオリゴペプチド；
aj1aj2....Xi....ajn(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求め、
(4) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求め、
(5) Yjiの平均値 YG，n); Y(j,n)=∑ YjiZn(1≤i≤n)
を求め、
(6) Y(j,n)の関数値 Z(j，n);
ZG,n) = -log(YG,n))
を求め、
(7) 以下、上記ステップ (3')から (6)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の j番 目（n≤j≤L—n + 1 )の位置にあるアミノ酸残基 Ajについて各々の Z(j,n)値を求 め、
(8) 生物種 aの全蛋白質について上記ステップ (2)から（7)を順次繰り返し、ァミノ 酸残基の種類毎の Z(j,n)値の分布を求め、この分布に基づいて各アミノ酸 Aaに 対する Z(j，n)値の平均値 Av(Aa)と標準偏差値 Sd ( Aa )を求め、アミノ酸残基 の種類による分布の違いを標準化する関数 g;
g=(Z(j,n), Aj) =に (j,n)— Av(Aa) }ノ Sd(Aa) (ただし Aj = Aa) を求め、
(9) アミノ酸配列（長さ の j番目（n≤j≤L— n+1)の位置にある全アミノ酸残 基 Ajについてステップ (8)で得られた関数 gの値 DG,n);
DG,n) = g(ZG,n), Aj)
を求め、
(10) アミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機能代表値を Z(j,n)値と D G,n)値の関数値 Wj;
Wj = h(Z0,D, ZG,2) , ..., ΖΟ,Μ), D(j,1), D(j,2), ..., D(j,M))
とし、
(11) ステップ (3)から（10)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の（n + 1≤j≤L 一 nの位置にある全アミノ酸残基について各々の Wj値を求め、
(12) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)について、ステップ (1)で行なったァラインメ ントのデータをもとに変異させるアミノ酸残基を 1種以上選択し、それらのァミノ 酸残基が別のアミノ酸残基に変異した種々の変異型アミノ酸配列における変異 アミノ酸残基についてステップ (3)から（10)を順次繰り返し、変異アミノ酸残基の Wj値を求め、
(13) ステップ（12)で求めた変異アミノ酸残基の Wj値力、ステップ（10)で求めた元 のアミノ酸残基の Wj値より大きいか小さい変異型アミノ酸配列を選択し、
(14)このアミノ酸配列をコードする蛋白質 Aの改変型遺伝子を作成し、この遺伝 子の発現産物として改良型蛋白質を作成する、
ことを特徴とする蛋白質の機能改良方法である。
第 8の発明は、 1本鎖 DNAに相補的な DNA鎖の合成を触媒するに際して合 成 DNA鎖の伸長を途中で停止させることのないよう PfuDNA合成酵素のァミノ 酸配列を人為的に改変したことを特徴とする耐熱性 DNA合成酵素であり、具 体的には、配列番号 1のアミノ酸配列からなる耐熱性 DNA合成酵素である。
またこの第 8発明に関連して、この出願は、配列番号 1のアミノ酸配列をコー ドする DNA酉己列と、この DNA配列を含む組換え体べクタ一を提供する。このよう な組換え体べクタ一としては、 大腸菌 HMS174(DE3)/pDP320 (FERM P-
16052)が保有する組換え体プラスミド PDP320も提供する。
さらにまた、この発明は、上記の DNA配列を含む発現ベクターにより形質転 換した細胞を培養し、培地中に産生された目的酵素を単離，精製することを特 徴とする耐熱性 DNA合成酵素の製造方法を提供する。
第 9の発明は、 1本鎖 DNAに相補的な DNA鎖の合成を触媒するに際して合 成 DNA鎖がより長く伸長するように RfuDNA合成酵素のアミノ酸配列を人為的 に改変したことを特徴とする耐熱性 DNA合成酵素であり、具体的には、配列番 号 6のアミノ酸配列からなる DNA合成酵素または配列番号 7のアミノ酸配列か らなる DNA合成酵素である。
またこの出願は、この第 9発明に関連して、配列番号 6またはフのアミノ酸配 列をコードする DN A配列と、これらの DNA配列を含む組換え体ベクターを提供 する。このようなベクターとしては、大腸菌 HMS174(DE3)/pDP5b17 (FERM BP- 6189)が保有する組換え体プラスミド pDP5b17(配列番号 1のアミノ酸配列 をコードする DNA配列を保有するベクター）、および大腸菌 HMS174(DE3)/pD P5C4(FERM BP- 6190)が保有する組換え体プラスミド pD P5C4 (配列番号 1の アミノ酸配列をコードする DNA配列を保有するベクター）をも提供する。
さらにまた、上記 DNA配列を含む発現ベクターにより形質転換した細胞を培 養し、培地中に産生された目的酵素を単離 ·精製することを特徴とする DNA合 成酵素の製造方法を提供する。 第 1発明の蛋白質機能部位予測方法は、以下のとおりの考えに立脚してな されたものである。すなわち、蛋白質は 20種類のアミノ酸残基の配列によって 構成されているが、その並びはランダムではない。従って、任意の生物種におい て、アミノ酸配列の部分配列である特定のオリゴペプチドがゲノムでコードされる 全蛋白質中に出現する頻度は均一ではな 種々の蛋白質に高頻度で出現す るオリゴペプチドや、まれにしか出現しないオリゴペプチドが存在する。このうち 種々の蛋白質に共通して高頻度に出現するオリゴペプチドは、個々の蛋白質の 独自性、すなわち機能を決める能力がな 一方、低頻度で出現するオリゴぺプ チドが個々の蛋白質の独自性や機能を決定していると考えることができる。
つまり、蛋白質の機能部位は低頻度で出現するオリゴペプチドで構成されて いると考えられる。また、才リゴペプチドの長さが長くなるほどまれに出現するオリ ゴペプチドが多くなる。すなわち、第 1発明の方法におけるステップ (3)において示 されている長さ（n+ 1 )のオリゴペプチドは、多くのものが低頻度で出現する最短 のオリゴペプチドであり、このオリゴペプチドに含まれる任意の位置のアミノ酸残 基 Ajについて算出された関数値 Zj値が、その位置にあるアミノ酸残基 Ajの出現 指数（すなわち、その機能代表値）となる。
また、第 2発明の蛋白質機能部位予測方法においては、ステップ (3)において 示されている Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yj iによって、ァ ミノ酸残基 Ajが Ajオリゴペプチドの出現頻度に寄与している程度が評価され、 従って蛋白質の任意の位置のアミノ酸残基 Ajについて算出された関数値 Z(j,n) 値力、その位置にあるアミノ酸残基 Ajの出現指数（すなわち、その機能代表値 となる）。
また、この Z(j,n)値はアミノ酸残基 Ajの種類によって異なっている。この発明 の方法におけるステップ (7)において、ある生物種 aの全蛋白質における ZG,n)値 の分布を 20種類のアミノ酸毎に求め、これらの分布より求めたアミノ酸毎の平 均値と標準偏差値に基づいて Z(j,n)値を標準化した D(j,n)値が、アミノ酸残基の 種類によるバイアスを補正した機能代表値となる。
さらにまた、オリゴペプチドの長さが長くなるほど、まれに出現するオリゴぺプ チドが多くなる。従って、一般に長さ nによっても ZG,n)値や D(j,n)値は異なるため、 様々な長さ nで求めた ZCi.n)値と D(j,n)値の関数値 Wj値が機能代表値となる。 第 3発明および第 4発明の蛋白質機能部位予測装置は、各々、上記第 1発 明および第 2発明の方法を自動的に行うための装置であり、第 5発明および第 6発明の蛋白質改良方法は、上記第 1発明の方法によって予測した機能部位 のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換して変異蛋白質を作成する方法であ る。また、第 7発明の蛋白質改良方法は、上記第 2発明の方法によって予測し た機能部位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換して変異蛋白質を作成す る方法である。この発明では、このような改良蛋白質として新規の耐熱性 D NA 合成酵素（第 8発明および第 9発明）を提供する。
D NA合成酵素（D NA polymerase )は 1本鎖 D N Aに相補的な D N A鎖の合 成を触媒する酵素の総称である、 D NAの塩基配列決定や試験管内での D NA 増幅などには必須の酵素であるが、特に PCR(Polymerase chain reaction)にお いては、その一連の反応サイクルを自動化する上で「耐熱性 D NA合成酵素」は 不可欠である。
このような耐熱性 D NA合成酵素としては Taq、 Pfu、 KOD 等が知られており、 それぞれの特性に応じて使い分けられている。特に、 Pfu D NA合成酵素は D NA 鎖合成時における読み違いが極めて少ない（忠実性が高い）酵素として知られ ている。しかしながら、この Pfu D NA合成酵素は、合成量が少なく、また合成鎖 に対する伸長活性が不十分であるために、ゲノム D NA等の高分子 D NAを増幅 するには不適当であった。そこでこの出願は、第 5発明の方法によって作成した 新しい Pfu D NA合成酵素を提供する。 図面の簡単な説明
第 1図は、第 1発明の方法において、長さ 3の才リゴペプチド、長さ 4のオリゴ ペプチド、長さ 5のオリゴペプチドの各々の出現頻度を求め、それぞれの長さに ついてある回数出現するオリゴペプチドの頻度分布である。
第 2図は、長さ 20のアミノ酸配列、この配列の 5番目のアミノ酸残基 Met を 含む長さ 4の Aj才リゴペプチド、および Xiオリゴペプチドの例である。
第 3図は、第 2発明の方法において、長さ 2のオリゴペプチド、長さ 3のオリゴ ペプチド、長さ 4のオリゴペプチド、長さ 5のオリゴペプチドの各々の出現頻度を 求め、それぞれの長さについてある回数出現するオリゴペプチドの頻度分布で める。
第 4図は、第 2発明方法のステップ (1 )を実施するためのフローチヤ一卜の例で 第 5図は、第 2発明方法のステップ (2')〜（3)を実施するためのフローチャート の例である。
第 6図は、第 2発明方法のステップ (4)〜（5)を実施するためのフローチャート の例である。
第 7図は、第 2発明方法におけるアミノ酸の種類毎の ZG.3)値の頻度分布で ある。実線はイソロイシン（lle)、破線はァラニン (Ala)、一点鎖線はメチォニン（Met) における分布を示している。
第 8図は、第 2発明方法のステップ (7)を実施するためのフローチャートの例であ る。
第 9図は、第 2発明方法のステップ (8)を実施するためのフローチャートの例であ る。
第 10図は、第 2発明方法のステップ (9)を実施するためのフローチャートの例で 第 11図は、第 3発明の装置を例示した構成図である。
第 12図は、第 3発明の装置を例示した構成図である。
第 13図は、従来の Pfu DNA合成酵素と KOD DNA合成酵素のプライマ一伸長 活性を示す電気泳動の結果である。
第 14図は、 MJ0885 でコードされるひ型 DNA合成酵素をコードする全アミノ酸 配列について、第 1発明の方法により算出した ¾ニ- log Yjの値をプロットした分布 図である。
第 15図は、第 14図に分布図を示したアミノ酸配列の部分配列（モチーフ Aおよ びモチーフ C)について、 Zj=- logYjの値をプロットした分布図である。
第 16図は、 MJ0885でコードされるな型 DNA合成酵素のアミノ酸配列から算出 した Zj=- logYjの値の頻度分布図である。
第 17図は、 α型 DNA合成酵素 Pfu、 K0D、 MJ の各々のモチーフ Cのアミノ酸 配列のァライメント図である。
第 18図は、メタノコッカス-ャナシィ（Methanococcus ja議 schii)のゲノムデ一 タをもとに、 α型 DNA合成酵素 Pfu、 KODおよび MJの各々のモチーフ Cにおける Zj=-log Yjの値をプロットした分布図である。 530〜550は Pfuにおけるアミノ酸残 基の位置である。
第 19図は、 MJ0885でコードされる α型 DNA合成酵素をコードする全ァミノ 酸配列の N末から 100残基について、第 2発明の方法により算出した Wj = Z(j, 3) 一 ZG，1)値（実線）、 Wj = Z(J,4)— Z(j,3)値（破線）、 Wj二 Z(j,5)— Z(j,3)値（一点鎖 線）をプロットした分布図である。
第 20図は、 MJ0885 でコードされる 型 DNA合成酵素のアミノ酸配列の部 分配列（ェクソ I (exol)、ェクソ Π (exoll),モチーフ A(motif A)、モチーフ B(motif B)およびモチーフ C(motif C)を含む領域）について、 Wj = Z(j,5)— Z(j,3)の値をプ ロットした分布図である。
第 21図は、 MJ0885 でコードされる α型 DNA合成酵素のアミノ酸配列の部 分配列（ェクソ I (exol)、ェクソ Π (exoll)、モチーフ ACmotif A)、モチーフ B(motif B)およびモチーフ C(motif C)を含む領域）について、 Wj = D(j,3)値（濃色）と Wj = D(j,5)値（淡色）をプロットした分布図である。
第 22図は、 MJ0232 でコードされるエノラ一ゼのアミノ酸配列について、 Wj = D(j，3)値が 2以上または 2以下になっているアミノ酸残基の立体構造における位 置を、立体構造モデル上に濃色で示した分布図である。
第 23図は、従来の PfuDNA合成酵素（野性型）とこの発明の改変型 PfuDN A合成酵素 Iのプライマー伸長活性を示す電気泳動の結果である。
第 24図は、従来の PfuDNA合成酵素（野性型）とこの発明の改変型 PfuDN A合成酵素 Πおよび ΠΙプライマー伸長活性を示す電気泳動の結果である。 発明を実施するための最良の形態
第 1発明の蛋白質機能部位予測方法は、ゲノムデータまたは cDNA解析デ ータが既知である生物種 aの予想される全蛋白質から、その生物種 aの任意の 蛋白質の機能部位を予測する方法であって、 以下のステップ（1)から（6)を構成 要件としている。
ステップ（1):
生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度お よび各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出現 頻度を求め、オリゴペプチドの長さ nを確定する。
このとき、長さ nは以下の基準を満たす最小の数として決定される。
「長さ nのオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のものよりも少 な 、長さ（n+ 1 )のオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のも のよりも多くなる」
たとえば、第 1図は、 メタノコッカス■ャナシィ [Methanococcus jannaschii] (Bult et. al., Science 273, 1058-1073, 1996)のゲノムデ一タをもとに、この微生 物のゲノムがコードする全蛋白質中での長さ 3のオリゴペプチド、長さ 4のオリゴ ペプチド、長さ 5のオリゴペプチドの出現頻度を求め、それぞれの長さについてあ る回数出現するオリゴペプチドの頻度分布をとつたものである。この第 1図に示 した 3種類のオリゴぺプチドの場合、このステップ（1 )における最初の nは 3とな る。
ステップ (2):
機能部位予測対象の蛋白質のアミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミ ノ酸残基を Aj(n+1≤j≤L— n)とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列で j 番目のアミノ酸残基 Ajを含む長さ（n+1 )の Ajオリゴペプチド；
aj1 aj2....Aji....ajnaj(n+1)( 1≤ i≤ n + 1； Aj = Aj iで Ajはこのオリゴペプチド の i番目の残基を示す）
の出現頻度と、長さ（n+1 )の Xiオリゴペプチド；
aj1aj2....Xi....ajnaj(n + 1)(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求める。
このような Ajオリゴペプチドと Xiオリゴぺプチドは、例えば第 2図のように例示 することができる。 この第 2図の上段 { 1 } は、 メタノコッカス 'ャナシィ [Methanococcus jannaschii] ( Bult et. al., Science 273, 1058 - 1073, 1996)の、 α型 DNA合成酵素をコードしていると考えられる遺伝子 MJ0885 によって予想 されるアミノ酸配列について、 N末（ァミノ端末）から 20 番目のアミノ酸残基まで の部分配列をシングルレター 'コードで表記したもので、中段 {2}は、 5番目のァ ミノ酸残基 Met(M)を含む長さ 4の Ajオリゴペプチドの例を示し、さらにその下 {3} 〜{6}に 5番目のアミノ酸残基 Mを含む Xiオリゴペプチドの例を示している。
ステップ (3):
Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yj iを求める。
ステップ (4):
Yjiの平均値 Yjを以下のとおりに求める。
Yj=∑YjiZn+1 (1≤i≤n+1)
ステップ（5):
Yjの単調減少関数値または単調増加関数値 Zjを以下のとおりに求める。
Zj=f(Yj)
そしてこの Zjの値を、アミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機能代 表値とする。
ステップ (6):
以下、上記ステップ (2)から (5)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の n+1 ≤j≤L一 nの位置にある全アミノ酸残基について各々の Zj値を求めことによって、 蛋白質の機能に対する各アミノ酸残基の責任の程度を ¾値の大きさを指標とし て予測する。すなわち、各々のアミノ酸残基の出現頻度は Yjの関数値 Zjとして 表されるため、 Zjが単調減少関数値の場合には、この Zj値が大きいほどそのァ ミノ酸残基の出現頻度が小さく、従って、機能発現に対して大きな責任を有する と考えられる。また、 Zjが単調増加関数の場合には、 ¾値が小さいアミノ酸残基 ほど機能に対する責任が大きいと考えられる。
なお、各アミノ酸残基の ¾値は、例えば、 X軸にアミノ酸配列を、 Y軸に Zj値を プロットしたような分布図として表示することによって、一目で機能部位を確認す ることができ、この発明を実施する形態としては好ましい。 第 2発明の蛋白質機能部位予測方法は、ゲノムデータまたは cDNA解析デ 一夕が既知である生物種 aの予想される全蛋白質から、その生物種 aの任意の 蛋白質の機能部位を予測する方法であって、 以下のステップ (1)から (9)を構成 要件としている。
ステップ（1):
生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度お よび各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出現 頻度を求める。
たとえば、 第 3図は、 メタノコッカス-ャナシィ [Methanococcus jannaschii]
(Bult et. al., Science 273, 1058-1073, 1996)のゲノムデータをもと（こ、この微生 物のゲノムがコードする全蛋白質中での長さ 3の才リゴペプチド、長さ 4のオリゴ ペプチド、長さ 5のオリゴペプチドの頻度を求め、それぞれの長さについてある回 数出現するオリゴぺプチドの頻度分布をとつたものである。
第 4図は、このステップ（1) を実施するためのフローチャートの例である。
ステップ (2):
生物種 aの任意の蛋白質について、
ステップ (2')：
アミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ酸残基を Ajとし、この蛋白質の アミノ酸配列の部分配列で j番目のアミノ酸残基 Aj(n≤j≤L— n+ 1 )を含む任 意の長さ n(1≤n≤M、ただし Mは最初に以下の基準に合致する才リゴペプチド の長さ M;長さ Mのオリゴペプチドはすべて、出現頻度 1である）の Ajオリゴぺプ チド；
aj1aj2....aji....ajn( 1≤ i≤ n + 1； Aj = aj iで Ajはこのオリゴペプチドの i番目 の残基を示す）
の出現頻度と、 Ajオリゴぺプチドに対応する長さ nの Xiオリゴペプチド； aj1aj2....Xi....ajn(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求める。
このような Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドは、第 1発明方法と同様に、例 えば第 2図のように例示することができる。
ステップ (3):
Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求める。
第 5図は、以上のステップ (2')〜（3)を実施するためのフローチャートの例であ る。
ステップ (4):
Yjiの平均値 YG,n)を以下のとおりに求める。
YG,n)=∑ Yji/n(1≤i≤n)
ステップ (5):
Y(j，n)の対数値 Z i,n)を以下のとおりに求める。
ZG,n) = - log(Y(j,n))
第 6図は、以上のステップ (4)〜（5)を実施するためのフローチャートの例であ る。
ステップ (6):
以下、上記ステップ (2)から（5)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の n≤j ≤L—n+1の位置にある全アミノ酸残基について各々の ZG,n)値を求める。
ステップ（7):
生物種 aの全蛋白質について上記ステップ (2)から (6)を順次繰り返し、ァミノ 酸残基の種類毎の Z(j,n)値の分布を求め、この分布に基づいて各アミノ酸 Aaに 対する Z(j,n)値の平均値 Ad(Aa)と標準偏差値 Sd ( Aa)を求め、アミノ酸残基 の種類による分布の違いを標準化する関数 g;
g=(Z(j,n), Aj)= Z(j,n)— Ad(Aa)}ノ Sd(Aa) (ただし Aj=Aa) を求める。 ljえ (ま、第フ図（ま、メタノコッカス -ャナシィ [Methanococcus jannaschii] ( Bult et. aし Science 273, 1058— 1073, 1996)のゲノム力《コードする全蛋白質における Z(j,n)値の分布を 3種類のアミノ酸：イソロイシン（lle)、ァラニン (Ala)、メチォニン (Met)について示している。この分布から例えば、アミノ酸イソロイシン（lie)におけ る ZG,n)値の平均値 Ad(lle)=3.16、標準偏差値 Sd(lle)=0.17などが求められ、 Aj = lleの場合の関数 gが以下のとおり求められる。
g=(Z(j,n), Aj) = (ZG,n)_3.16)Z0.17
第 8図は、このステップ (7)を実施するためのフローチャートの例である。
ステップ (8):
アミノ酸配列（長さ L)の n≤j≤L— n + 1の位置にある全アミノ酸残基 Ajにつ いてステップ (7)で得られた関数 gの値；
Figure imgf000026_0001
を求める。
第 9図は、ステップ (8)を実施するためのフローチヤ一卜の例である。
ステップ（9):
Ζα,η) 値と D(j,n) 値の関数値 Wjを以下のとおりに求める。
Wj = Wj = h(Z0,1), ZG,2) , ZG,M), D(j,1), DO, 2) , D(j,M)) そしてこの Wjの値を、アミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機能代 表値とし、蛋白質の機能に対する各アミノ酸残基の責任の程度を Wj値の大き さを指標として予測する。
第 10図は、ステップ (9) を実施するためのフローチヤ一卜の例である。
なお、各アミノ酸残基の Wj値は、例えば、 X軸にアミノ酸配列を、 Y軸に Wj値 をプロットしたような分布図として表示することによって、一目で機能部位を確認 することができ、この発明を実施する形態としては好ましい。
また、機能部位予測対象の蛋白質の立体構造が既知である場合、または 公知の方法（例えば、ホモロジ一モデリング法： Peitsch, Proceedings of the fifth international cinference on intelligent systems for molecular biology 1997, 5, 234- 236)等によって立体構造モデルが作成できる場合には、立体構 造上で分布を表示することによって、新規の機能部位の候補となるアミノ酸残 基の空間的な配置を確認することができ、この発明を実施する形態として好ま しい。 第 3発明に係る蛋白質機能部位予測装置は、上記第 1発明の機能部位予 測方法を自動的に行うための装置であって、例えば第 11図に構成例を示した ように、第 1発明方法のステップ（1)から (6)を処理するための、少なくとも以下の (a)から (g)の装置を備えている。
外部記憶装置（a):
ステップ（1)において利用する蛋白質のアミノ酸配列デ一タまたは既存の蛋白 質データベースを記憶する装置。
計算 記憶装置（b):
ステップ (1)において求める各オリゴペプチドの出現頻度を計算する CPUと、 その計算結果を記憶する記憶装置とからなる装置。
計算 記憶装置 (c):
ステップ（1)において求めるオリゴペプチドの長さ nを計算する CPUと、 nを記 憶する記憶装置とからなる装置。
計算 記憶装置（d):
ステップ (2)において求める Ajオリゴペプチドおよび Xiオリゴペプチドの各々の 出現頻度を全蛋白質中で計算する CPUと、その計算結果を記憶する記憶装 置とからなる装置。
計算 記憶装置 (e):
ステップ (3)で求める Yji値を計算する CPUと、 Yji値を記憶する記憶装置とか らなる装置。 計算 記憶装置 (f) :
ステップ (4)で求める Yj値を計算する CP Uと、 Yj値を記憶する記憶装置とから なる装置。
計算 記憶装置（g) :
ステップ (5)で求める Zj値を計算する CP Uと、 Zj値を記憶する記憶装置とから なる装置。
また、この機能部位予測装置は、
ディスプレー装置（h) :
計算ノ記憶装置 (g)で得た各アミノ酸残基の Zj値を分布図として表示する装 置
を備えることを好ましい態様としている。
さらに、これらの装置（a) ~ (h)以外にも、この発明の装置は、第 1 1図にも例 示したようなキーボード (ί)および制御装置 (j)等を備えるようにしてもよい。 第 4発明に係る蛋白質機能部位予測装置は、上記第 2発明の機能部位予 測方法を自動的に行うための装置であって、例えば第 1 2図に構成例を示した ように、第 2発明方法のステップ（1 )から（9)を処理するための、少なくとも以下の (a)から (i)の装置を備えている。
外部記憶装置（a) :
ステップ (1 )において利用する蛋白質のアミノ酸配列データまたは既存の蛋白 質データベースを記憶する装置。
計算 Z記憶装置（b) :
ステップ (1 )において求める各オリゴペプチドの出現頻度を計算する CP Uと、 その計算結果を記憶する記憶装置とからなる装置。
計算ノ記憶装置（c) :
ステップ (2')において求める Ajオリゴペプチドおよび Xiオリゴペプチドの各々の 出現頻度を全蛋白質中で計算する CPUと、その計算結果を記憶する記憶装 置とからなる装置。
計算 記憶装置 (d):
ステップ (3)において求める Yjiを計算する CPUと、 Yji値を記憶する記憶装置 とからなる装置。
計算 Z記憶装置 (e):
ステップ (4)において求める Y(j,n)値を計算する CPUと、 Y(j,n)値を記憶する記 憶装置とからなる装置。
計算 記憶装置 (f):
ステップ (5)(6)において求める ZG,n)値を計算する CPUと、 ZG,n)値を記憶する 記憶装置とからなる装置。
計算 記憶装置 (g):
ステップ (7)において求める g値を計算する CPUと、 g値を記憶する計算装置 とからなる装置。
計算ノ記憶装置（h):
ステップ (8)において求める DG,n)値を計算する CPUと、 DG,n)値を記憶する記 憶装置とからなる装置。
計算 記憶装置（i):
ステップ (9)において求める Wj値を計算する CPUと、 Wj値を記憶する記憶装 置とからなる装置。
さらに、この第 4発明の機能部位予測装置においては、以下の j)〜（l)の装 置を適宜に組み合わせて備えるようにすることもできる。
ディスプレー装置 (j):
装置（i)で得られた各アミノ酸残基の Wj値を分布図として表示する装置。 計算 記憶装置 (k):
既存の蛋白質立体構造データベースを記憶し、または公知の方法に従って アミノ酸配列から立体構造モデルを作成し記憶する装置。
ディスプレー装置（I) ：
アミノ酸配列について、各アミノ酸残基の Wj値を装置（k)に記憶されている立 体構造データベースまたは立体構造モデル上に分布図として表示する装置。
なお、これらの装置（a)〜（l)以外にも、この発明の装置は、第 1 2図にも例示し たようなキーボード (m)および制御装置（n)等を備えるようにしてもよい。 次に、第 5発明に係る蛋白質機能改良方法について説明する。この方法は、 ゲノムデータまたは c D NA解析データが既知である生物種 aの予想される全蛋 白質から、機能が既知である蛋白質 Aの機能を改良する方法であって、以下の ステップ （1 )から（1 0)を構成要件とするものである。
ステップ (1 ) :
蛋白質 Aと近縁の蛋白質を既存の蛋白質データベースから抽出してァライン メントを行う。
ステップ (2)〜（7)：
生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、上記第 1発明の方法における ステップ（1 ) ~ (6)を行なう。
ステップ (8) :
蛋白質 Aのアミノ酸配列について、ステップ ( 1 )で行なったアラインメントのデー タをもとに変異させるアミノ酸残基を 1種以上選択し、それらのアミノ酸残基が別 のアミノ酸残基に変異した種々の変異型アミノ酸配列における変異アミノ酸残 基についてステップ (3)から（6)を順次繰り返し、変異アミノ酸残基の Zj値を求め る。
ステップ (9) :
ステップ (8)で求めた変異アミノ酸残基の Zj値が、ステップ (7)で求めた元のァ ミノ酸残基の ¾値より大きいか小さい変異型アミノ酸配列を選択する。 ステップ（10):
ステップ (9)で選択したアミノ酸配列をコードする蛋白質 Aの改変型遺伝子を 公知の方法に従って作成し、この遺伝子を適当な宿主一ベクター系で発現させ て改良型蛋白質 Aを作成する。 第 6発明の蛋白質機能改良方法は、ゲノムデータまたは cDNA解析データ が未知である生物種 bの蛋白質 Bの機能を改良する方法であって、以下のス亍 ップ (1)~(10)を構成要件としている。
ステップ 0)·.
ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 aの予想される全 蛋白質から、蛋白質 Bと最も近縁の蛋白質 Aを抽出してアラインメントを行ない、 また蛋白質 Bと近縁の蛋白質を既存の蛋白質データベースから抽出してァライ ンメン卜を行なう。
ステップ (2)〜（8)：
生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、上記の第 3発明の方法のス亍 ップ (2)から (8)を行う。
ステップ (9):
ステップ (8)で求めた変異アミノ酸残基の Zj値が、ステップ (7)で求めた元のァ ミノ酸残基の Zj値より大きいか小さい変異位置と変異アミノ酸残基を選択する。 ステップ（10):
ステップ (9)で選択した位置とそのアミノ酸残基を実現する蛋白質 Bの改変型 遺伝子を公知の方法に従って作成し、この遺伝子を適当な宿主—ベクタ一系で 発現させて改良型蛋白質 Bを作成する。 以上のとおりの、この発明の第 5および第 6発明である機能改良方法は、第 1発明の機能部位予測方法を組み込むことにより、蛋白質の未知機能部位を 新たに見出し、この部位を変異させることを特徴とするものである。
また、第フ発明の蛋白質機能改良方法も、第 2発明の機能予測方法を利用 することによって、第 5発明と同様にして実施することができる。 第 8発明および第 9発明の耐熱性 DNA合成酵素は、具体的には、ピロコッカ スフリオサス（Pyrococcus furiosus)由来の耐熱性 PfuDNA合成酵素を公知の 変異遺伝子作成法（Strategies, vol.9, p3- 4, 1996)によって遺伝子工学的に改 変した酵素である（以下、この発明の耐熱性 DNA合成酵素を「改変型 PfuDNA 合成酵素」と記載することがある）。この酵素の作成は以下のとおりに行なうこと ができる。すなわち、 PfuDNA合成酵素の遺伝子は塩基配列が公知（Nucleic Acids Research, vol.21, p259— 265, 1993)であるため、その両端 Iニキ目補的な才リ ゴヌクレオチドを合成し、これをプライマ一として、上記細菌のゲノム DNAを錶型 とする PCR法により PfuDNA合成酵素の遺伝子を調製する。この遺伝子 DNA 断片をべクタ一にクローニングし、上記文献に記載の方法により変異させる。特 にこの発明では、遺伝子の変異は、 PfuDNA合成酵素のアミノ酸配列の一部が KODDNA合成酵素のアミノ酸配列に置き変わるように塩基を置換させた。 PfuD NA合成酵素と KODDNA合成酵素は、アミノ酸配列が約 80<½相同であり、 PC Rの際に同様の合成停止を生じさせるが（第 13図）、 KODDNA合成酵素の伸 長速度は PfuDNA合成酵素の約 6倍である。そこで、 PfuDNA合成酵素のアミ ノ酸残基を KODDNA合成酵素のアミノ酸残基に置換することによって、伸長鎖 の合成停止が改善され、または伸長速度が速 従って合成 DNA鎖をより長く 伸長させることのできる酵素が得られる可能性があるからである。そして、このよ うにして変異させた遺伝子を大腸菌で発現させ、その発現産物を回収し、精製 することによってこの発明の改変型 PfuDNA合成酵素を得た。
第 8発明の耐熱性 DNA合成酵素（改変型 PfuDNA合成酵素 I )は、具体的 には、配列番号 1アミノ酸配列を有する酵素である。このアミノ酸配列は、従来 公知の PfuDNA合成酵素のアミノ酸配列から、この発明に機能部位予測方法 によってその機能を変化させうるアミノ酸残基を特定し、表 1に示すとおりにアミ ノ酸残基を置換した新規な配列である。そして、この新規酵素を用いて PCR等 の DNA合成を行なった場合には、下記の実施例に示すように、従来の DNA合 成酵素を用いた場合に生じる合成停止がほぼ完全に解消される。もちろん、従 来酵素によって効率良く増幅される錶型 DNA鎖は同様に効率良く増幅される。
また、第 9発明の耐熱性 DNA合成酵素（改変型 PfuDNA合成酵素 Πおよび m)は、具体的には、配列番号 6および 7のアミノ酸配列を有する酵素であり、同 じく PfuDNA合成酵素のアミノ酸配列から、この発明の機能部位予測方法によ つてその機能を変化させうるアミノ酸残基を特定し、表 2に示すとおりにアミノ酸 残基を置換した新規な配列である。そして、この新規酵素を用いて PCR等の D NA合成を行なった場合には、下記の実施例に示すように、大量かつ高分子の 合成産物を得ることが可能となる。
表 1
改変型 DNA 野生型 改変型
合成酵素 位 アミノ酸 => アミノ酸
2 I le Val
533 Phe Ty r
538 し eu I le
I 540 I le Ser
545 し eu Phe
546 Ty r Phe
2 I le Val
710 Pro Arg
Π 712 Ser Arg
713 Asn Asp
717 し eu Pro
m 2 I le Va I
717 し eu Pro
.れらの改変型 PfuDNA合成酵素をコードする DNA配列としては、上記の酵 素作成過程で得られた PfuDNA合成酵素遺伝子の変異遺伝子を例示すること ができる。これらの変異遺伝子は、例えば配列番号 1、 6または 7のアミノ酸配 列をコードする DNA配列については、それぞれ組換え体プラスミド p320、 pDP 5b17および pDP5C4にクロ一ニングされており、これらの組換え体プラスミドは大 腸菌 HMS174(DE3)に導入され、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄 託されている（各々、寄託番号 FERMP_16052、 FERMBP-6189 および FERM BP - 6190)。
また、この発明の DNA配列は、例えば配列番号 1、 6または 7の各アミノ酸残 基に対応する塩基コドンをつなぎ合わせた DNA配列として適宜にデザインする こともできる。
この発明の耐熱性 DNA合成酵素は、大腸菌などの微生物で発現させて得 ることができる。例えば、微生物中で複製可能なオリジン、プロモータ一、リボソ ーム結合部位、 cDNAクローニング部位、ターミネータ一等を有する発現べクタ 一に、上記 DNA配列を挿入結合して発現べクタ一を作成し、この発現べクタ一 で宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、 DN A配列にコードされている酵素を微生物内で大量生産することができる。 実施例
以下、実施例を示してこの発明のさらに詳細かつ具体的に説明するが、この 発明は以下の例によって限定されるものではない。 実施例 1
タノコッカス-ャナンィ [Methanococcus jannaschii] ( Bult et.al., Science 273, 1058- 1073, 1996)のゲノムデータをもとに、 or型 DN A合成酵素をコードして いると考えられるこの微生物の遺伝子 MJ0885によって予想される DNA合成酵 素のアミノ酸配列（N末から C末）の各アミノ酸残基について、第 1発明の方法で ¾二 logYjを算出した（fニ- log)。第 14図は、この結果を分布図としてプロットした ものである。
さらに、 α型 DNA合成酵素の機能部位として知られているモチーフ部分のう ち、モチーフ A(motif A)およびモチーフ C(motif C)を抜粋し、それぞれのァミノ 酸残基の Zj値を第 15図にプロットした。この第 15図と次の第 16図から、機能 に責任のあるアミノ酸残基の Zj=-logYjの値は他のアミノ酸残基のそれに比較し て大きいことが分かる。
第 16図は、 MJ0885 でコードされる α型 DNA合成酵素のアミノ酸配列につい ての、 Zj=-logYj の値の頻度分布図である。この図から、この分布図において ¾ =-logYjの値が 4.8以上のアミノ酸残基が、蛋白質の機能に責任のあるアミノ酸 残基である可能性が高いことが確認された。 実施例 2
ピロコッカス.フリオサス [Pyrococcus furiosus]由来の α型 DNA合成酵素 Pfu ( DDBJ ァクセッション番号 D12983 )の性質を、 ピロコッカス.エスピー [Pyrococcus sp.]由来の α型 D N A合成酵素 KOD(DDBJ ァクセッション番号 D29671 )のアミノ酸配列およびメタノコッカス -ャナシィ [Methanococcus jannaschii](Bult et al., Science 273, 1058 - 1073,1996)のゲノムデータおよび MJ0885 でコードされる α型 DNA合成酵素（MJ)のアミノ酸配列をもとに、実施 例 1の第 15図に基づいて改良した。
第 1フ図は Pfu、 K0D、 MJの各々のモチーフ Cのアミノ酸配列のァライメント図 であり、 531 から 544までの領域では Pfuと MJには差はない。
第 18図は、 Pfu、 K0Dおよび MJ のモチーフ Cのアミノ酸配列について、メタノ コッカス■ャナシィ [Methanococcus jannaschiijのケノム丁一タをもとに、この発 明の方法で機能部位を予測した結果である。 この結果から、 lle540Ser、 Leu545Phe、 Tyr546Phe、 lle568Thrの変異力《あると、これらのアミノ酸残基の Zi =-logYjの値が大きくなることがわかる。さらに Asp541 や Ala547でも Zj=_logYj の値が大きくなつている。すなち、 これらの変異をメタノコッカス 'ャナシィ [Methanococcus jannaschii]の 型 D N A合成酵素 M J Iこっし、て亍ぅと、全蛋白 質の中でこの配列はより特殊となり、何らかの機能が向上することが期待され る。 実施例 3
メタノコッカス-ャナン Lliethanococcus jannaschii] ( Bult et aに， Science 273, 1058-1073, 1996)のゲノムデータをもとに、 ひ型 DNA合成酵素をコードして いると考えられるこの微生物の遺伝子 MJ0885によって予想される DNA合成酵 素のアミノ酸配列（N末から C末）の各アミノ酸残基について、第 2発明の方法で Z(j,1)=- l。gYG,1)、 Z(j，3)=— logY(j,3)、 Z(j,4)=- logY(j,4)、 Z(j,5)=- logYG,5)を算出 し、 Wj = Z(j,3)— Z(j,1)を算出した（h = Z(j,3)— ZG，1))。同様に、 Wj = Z(j,4)— Z Cj，3)(h = Z(j,4)— ZG,3))、 \^ = 2(],5) ヱ(],3)( =2 ,5)—ヱ( 3))を算出した。
第 19図は、 N末から 100残基についてこれらの結果を分布図としてプロット したものでである。 h = Z(j,5)— Z(j,3)の場合、他の二つの場合と比べて大き〈分 布が異なる領域が N末から 35残基目から 60残基目にかけての領域等に存在 している。この分布から Wj = Z(j, 5)— Z(j, 3)が小さくなることによってアミノ酸配列 が特徴づけられることが分かる。
さらに、 α型 DN A合成酵素の機能部位として知られているモチーフ部分のう ち、ェクソ I (exol)、ェクソ n(exoll)、モチーフ A(motif A), モチーフ B(motif B)お よびモチーフ C(motif C)を含む領域を抜粋し、それぞれのアミノ酸残基の Wj値 を第 20図にプロットした。この第 20図に示したように、 Wj値が小さくなることによ つて特徴づけられる部分と機能部位が対応していることが分かる。 実施例 4 第 21図は、 or型 DNA合成酵素の機能部位として知られているモチーフ部分 のうち、ェクソ I (exol)、ェクソ Π (exoll)、モチーフ A(motif A),モチーフ B(motif B)およびモチーフ C(motif C)を含む領域を抜粋し、それぞれのアミノ酸残基の W j = D(j,3)値と Wj = D(j,5)値をプロットしたものである（h = D(j,3)と h = D(j,5))。 Wj =DG,n)が 2以上または 2以下になっているアミノ酸残基がモチーフ部分以外に も存在しており、これらのアミノ酸残基が新たな機能部位の候補となる。 実施例 5
第 22図は、メタノコッカス-ャナシィ [Methanococcus ja固 schii]のエノラ一ゼ であると予想される MJ0232 のアミノ酸配列について、 Wj = D(J,3)値が 2以上ま たは 2以下になっているアミノ酸残基の立体構造における位置を、出芽酵母菌 のエノラーゼを基に公知の方法で作成した立体構造モデル上に濃色で表示し たものである。アミノ酸配列上では離れた位置にある残基が立体構造では近く にあることが分かる。 実施例 6
実施例 2において、 DNA合成酵素 M Jについて予想された機能改良のため のアミノ酸残基の変異を、 PfuDNA合成酵素に適用して、改良型 PfuDNA合成 酵素 Iを作成した。
(1)改変型 PfuDNA合成酵素遺伝子の作成
PfuDNA合成酵素遺伝子のクロ一ニング：
PfuDNA合成酵素遺伝子の塩基酉己列（Nucleic Acids Research, vol.21 , P259-265, 1993)に従って PCRプライマ一を合成し、ピロコッカスフリオサス （P. furiosus)のゲノム DNAを錶型とする PCRによって目的遺伝子を増幅し、これを 大腸菌用の発現ベクターにクローニングした。詳細は以下のとおりである。
P.furiosus DSM3638 を上記文献に記載された方法で培養した。先ず、文献 記載の培地を調製し、高温加圧滅菌ののち、蜜素ガスを吹き込み、植菌して 95°Cで 15時間静置培養した。 200mlの培養掖から遠心分離により約 0.5mgの 菌体を得た。集菌体を緩衝液 A(10 mMトリス一 HCL, pH8.0, 1 mMEDTA, 100 mM Nacl)に懸濁し、 10% SDSを 1 ml 加え、撹拌の後、プロティナ一ゼ Kを 0.5mg加えて 55°Cで 60分反応させた。反応液を順次フエノール抽出、フエノー ル クロ口ホルム抽出、クロ口ホルム抽出し、エタノールを加えて DNAを不溶化 し、回収した。得られた DNAを 1 mlの TEバッファ一（10 mMトリスー HCI, pH8.0, 1 mMEDTA)に溶解し、 0.5mgの RNase Aを加えて 37°Cで 60分反応させたの ち、再度フヱノール抽出、フ: I：ノール クロロホルム抽出、クロ口ホルム抽出し、 エタノール沈殿で DNAを回収して TEバッファ一に溶解させ、約 0.3mgの DNAを 得た。
次いで、 目的の DNA合成酵素遺伝子を PCR増幅するために、既知の配列 データをもとに配列番号 2および 3に示す 2種のプライマー DNAを合成した。すな わち、フォア一ドプライマ一配列中には目的遺伝子の開始コドン ATGおよび制限 酵素 Ncol酉己列（5'-CCATGG- 3')を導入し、リバ一スプライマ一は終止コドンの下 流の適当な位置に結合するように設計した。 PCRは、 P.furiosusDNA2 u g とプ ライマー各 10pmol を用し、、 LATaq (宝酒造）と添付のバッファ一条件で、 50 I の反応系で行った。サイクル条件は、酵素を加える前に 93°CZ3分を行い、 94°CZ0.5分、 55°CZ0.5 分、 72°CZ1.0分を 30サイクルした。増幅した DNA断 片を精製し、 Ncol で処理した後、同じく Ncol で切断後に平滑末端化し、さらに Ncol 処理した発現べクタ一 pET15— bの T7プロモータ一下流に組み込んだ。こ の発現ベクターを PDPWT100とし、挿入遣伝子の塩基配列を確認した。
PfuDNA合成酵素遺伝子の改変：
クローン化した PfuDNA合成酵素遺伝子を組み込んだ発現べクタ一 pDPWT 100 に対して、期待する変異を含んだオリゴヌクレオチド（配列番号 4および 5)と プロメガ社の突然変異導入キットを用い、公知の方法（Strategies, vol.9, P3- 4, 1996)に従って改変型 PfuDNA合成酵素の遺伝子を、発現べクタ一 pDPWT 100上で作成し、発現べクタ一 pDP320を構築した。なお、この改変型遺伝子の 塩基配列を決定することにより、改変型 PfuDNA合成酵素のアミノ酸配列（配 列番号 1 )を確認した。
(2)改変型 PfuDNA合成酵素の大腸菌での発現と精製
作成した改変型 PfuDNA合成酵素 I の遺伝子を次のとおりに大腸菌で発 現させ、精製した。
改変型 PfuDNA合成酵素遺伝子をもつ発現べクタ一PDP320 を大腸菌 HM S173(DE3)株に導入し、終濃度 0.1 mMの I PTGを含んだ LB培地で 14時間培 養し、酵素を大腸菌体内に発現誘導した。遠心して菌体を集めた後、 150 mM Tris/HCI(pH7.5)、 2 mM EDTA、 0.24 mM APMSFおよび 0.2%の Tween20を 含む緩衝液で超音波処理を行いながら、改変型 PfuDNA合成酵素を抽出した。 この粗抽出液を 80°C、 15 分の熱処理を行うことで大腸菌由来の DNA合成酵 素を失活させると共に、この発明の DNA合成酵素の部分精製を行なった。部 分精製画分は 50 mM Tris/HCI(pH7.5)、 1 mMEDTA、 0.2% Tween20、 7 mM 2- mercaptoethanolおよび 10% glycerolの緩衝液に対し透析した。この段階で改 変型 PfuDNA合成酵素 Iに特異的な DNA合成活性を検出した。 実施例 7
実施例 6で部分精製した改変型 PfuDNA合成酵素 Iを用い、錶型 DNAに 相補的な DNA鎖のプライマー伸長反応を試験した。
20 m Tris/HCI(pH8.0)、 2 mM MgCI2 50 μ g/ml BS A、 0.1 % Triton X— 100、
1 mM の各 cold dNTPs(0.1 mM for dCTP) [ a -32P]dCTP の 10 Ci と
M13(- 21)のプライマ一をァニールさせた 0.63 gの pBLUESCRIPT プラスミドを 含む反応液 20 1 に、上記の部分精製酵素画分 1 gを入れ、 75°Cで 1分およ び 3分間反応させた。伸長した DNA鎖を 8M urea を含んだポリアクリルアミドゲ ル電気泳動で分離した後、イメージアナライザ一によりそのパターンを解析した。 また、対照として、従来の野性型 PfuDNA合成酵素を用いて、 同様の DNA合 成を行なった。
結果は第 23図に示したとおりである。従来の野性型 PfuDNA合成酵素を用 いた場合には、合成停止による不完全は DNA鎖の存在を示すバンドが少なくと も 10個観察されたが、この発明の改変型 PfuDNA合成酵素 Iによる DNA合 成では、これらのバンドは消失した。一方、 1000ベース近傍の良く伸長した DNA 鎖の蓄積には差は見られなかった。 実施例 8
PfuDNA合成酵素 Πおよび mを作成した。
(1)改変型 PfuDNA合成酵素遺伝子の作成
実施例 6(1)と同様にして PfuDNA合成酵素遺伝子をクローニングしたのち、 改変型遺伝子 Πおよび mを以下のとおりに作成した。
改変型 PfuDNA合成酵素 Π遺伝子の作成：
クローン化した PfuDNA合成酵素遺伝子を組み込んだ発現べクタ一pDPWT 100 に対して、期待する変異を含んだオリゴヌクレオチド（配列番号 8および 9)と プロメガ社の突然変異導入キットを用い、公知の方法 （Strategies, vol 9, p3- 4,1996)に従って改変型 PfuDNA合成酵素 Πの遺伝子を、発現べクタ一 pDPW T100上で作成し、発現ベクター pDP5b17を構築した。なお、この改変型遺伝子 の塩基配列を決定することにより、改変型 PfuDNA合成酵素 Πのアミノ酸配列 (配列番号 6)を確認した。
改変型 PfuDNA合成酵素 ΠΙ遺伝子の作成：
配列番号 10および 11のオリゴヌクレオチドを用いたことを除き、上記と同一 の方法により、改変型 PfuDNA合成酵素 ΠΙの遺伝子を作成し、発現ベクター p DP5C を構築した。この改変型遺伝子の塩基配列を決定することにより、改変 型 PfuDNA合成酵素 ΙΠのアミノ酸配列（配列番号 7)を確認した。
(2)改変型 PfuDNA合成酵素 Πおよび ΠΙの大腸菌での発現と精製
作成した改変型 PfuDNA合成酵素 Πおよび ΙΠの遺伝子を次のとおりに大腸 菌で発現させ、精製した。
発現べクタ一 pDP5b17および発現べクタ一 pDP5C4をそれぞれ大腸菌 HMS 174(DE3)株に導入し、終濃度 0.1 mMの I PTGを含んだ LB培地で 14時間培 養し、酵素を大腸菌体内に発現誘導した。遠心して菌体を集めた後、 150 mM Tris/HCI(pH7.5)、 2 mM EDTA、 0.24 mM APMSFおよび 0.2%の Tween20を 含む緩衝液で超音波処理を行いながら、改変型 PfuDNA合成酵素 Πおよび m を抽出した。この粗抽出液を 80° (：、 15分の熱処理を行うことで大腸菌由来の D NA合成酵素を失活させると共に、改変型 PfuDNA合成酵素 Πおよび ΙΠの部 分精製を行なった。部分精製画分は 50 mM Tris/HCI(pH7.5)、 1 mM EDTA、 0.2% Tween20 7mM 2- mercaptoethanolおよび 10% glycerolの緩衝液に対し 透析した。この段階で改変型 PfuDNA合成酵素 Πおよび mに特異的な DNA合 成活性を検出した。
実施例 9
実施例 8でそれぞれ部分精製した改変型 PfuDNA合成酵素 Πおよび Ktを用 い、錶型 DNAに相補的な DNA鎖のプライマー伸長反応を試験した。
20 mM Tris/HCI(pH8.0)% 2 mM MgCI2, 50 μ g/mlBSA, 0.1% Triton X— 100、 1 mM の各 cold dNTPs(0.1 mM for dCTP)、 [ —32 P]dCTP の 10A< Ci と M13(- 21)のプライマ一をァニールさせた 0.63 Aigの pBLUESCRIPT プラスミドを 含む反応液 20AH に、上記の部分精製酵素画分 1 を入れ、 75°Cで 1分およ び 3分間反応させた。伸長した DNA鎖を 8M urea を含んだポリアクリルアミドゲ ル電気泳動で分離した後、イメージアナライザ一によりそのパターンを解析した。 また対照として、従来の野性型 PfuDNA合成酵素を用いて同様の DNA合成を 行なった。
結果は第 24図に示したとおりである。従来の野性型 PfuDNA合成酵素を用 いた場合には、約 1000 ベースに大きな合成停止領域が存在し、このことによる 不完全な DNA鎖の存在を示すバンドが観察された。一方、この発明の改変型 PfuDNA合成酵素 Πおよび mによる DNA合成では、約 1000 ベースのバンドも 含めて合成量が増大し、しかもより高分子の（すなわち、より伸長した） PCR産 物の存在を示すバンドも観察された。
以上の結果から、この発明の DNA合成酵素は、 PCR法による DNA合成に おいて、合成 DNA鎖のより長い伸長が可能であることが確認された。 産業上の利用可能性
この発明によって、ゲノム解析や cDNA解析から得られた機能未知の蛋白 質について、その機能部位を予測するが可能となる。また、機能既知の蛋白質 についても、その新たな機能部位を予測することも可能となる。
また、この発明によて提供される耐熱性 DNA合成酵素は、高分子 DNAを P CR等によって増幅する場合、その全長を効率よく合成、増幅することができる。 これによつて、 DNA鎖の試験管内での合成や増幅、塩基配列の決定等を簡便 かつ高精度で行なうことが可能となる
配列表
配列番号： 1
配列の長さ： 775
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
配列
Met Va I Leu Asp Va I Asp Ty r I I e 「hr Glu G I u G I y Lys Pro Va I l ie
1 5 10 15
Ar g Leu Phe Lys Lys Glu Asn G I y Lys Phe Lys I I e Glu Hi s Asp Ar g
20 25 30
Th r Phe Ar g Pro Ty r I I e Tyr Ala Leu Leu A g Asp Asp Ser Lys I I e
35 40 45
Glu Glu Va I Lys Lys l ie Thr G I y Glu Ar g His G I y Lys l ie Va I Ar 50 55 60
l ie Va I Asp Va I Glu Lys Va I Glu Lys Lys Phe Leu G I y Lys Pro l ie 65 70 75 80
Thr Va I T r p Lys Leu Tyr Leu Glu Hi s Pro Gin Asp Va I Pro Thr I I e
85 90 95
Arg Glu Lys Va I Arg Glu Hi s Pro A I a Va I Va I Asp l ie Phe Glu Tyr
100 105 110
Asp I I e Pro Phe A I a Lys Ar Tyr Leu I I e Asp Lys G I y Leu I I e Pro
115 120 125
Met Glu G I y Glu Glu Glu Leu Lys l ie Leu A I a Phe Asp l ie Glu Thr 130 135 140
Leu Tyr Hi s Glu G I y Glu Glu Phe G I y Lys G I y Pro l ie l ie Met l ie 145 150 155 160 6i一6 OAV
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405 410 415
His Asn Va I Ser Pro Asp Thr Leu Asn Leu Glu G I y Cys Lys Asn Tyr
420 425 430
Asp l ie A I a Pro Gin Va I G I y Hi s Lys Phe Cys Lys Asp l ie Pro G I y
435 440 445
Phe l ie Pro Ser Leu Leu G I y His Leu Leu Glu Glu Arg Gin Lys l ie
450 455 460
し ys Thr し ys Met Lys Glu Thr Gin Asp Pro I I e Glu Lys I I e Leu し eu 465 470 475 480 Asp Tyr Arg Gin Lys Ala l ie Lys Leu Leu A I a Asn Ser Phe Tyr G I y
485 490 495
Tyr Tyr G I y Tyr A I a Lys A I a Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu
500 505 510
Ser Va I Thr Ala Trp G I y Ar Lys Tyr l ie Glu Leu Va I Trp Lys Glu
515 520 525
Leu Glu Glu し ys Tyr G I y Phe Lys Va I I I e Tyr Ser Asp Thr Asp G I y
530 535 540
Phe Phe Ala Thr l ie Pro G I y G I y Glu Ser Glu Glu l ie Lys Lys Lys 545 550 555 560 A I a Leu Glu Phe Va I Lys Tyr I I e Asn Ser Lys Leu Pro G I y Leu Leu
565 570 575 〇
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配列番号： 2
配列の長さ： 35
配列の型：核酸
鎖の数 ·. 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 D NA)
配列
GTGGGGAGCA CCATGGTTTT AGATGTGGAT TACAT 35 配列番号：3
配列の長さ： 35
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 D NA)
配列
GCATGCAGAT AGACCATTTC TAACGAAGGC GTTTG 35 配列番号： 4
配列の長さ： 66
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 D NA)
配列
CTCGAAGAAA AGTATGGATT TAAAGTCATC TACAGTGACA CTGATGGTTT CTTTGCAACT ATCCCA 66 配列番号： 5 配列の長さ： 66
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA)
配列
TGGGATAGTT GCAAAGAAAC CATCAGTGTC ACTGTAGATG ACTTTAAATC CATACTTTTC TTCGAG 66 配列番号：6
配列の長さ： 775
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
配列
Met Va I Leu Asp Va I Asp Ty r l ie Thr G I u G I u G I y Lys Pro Va I l ie 1 5 10 15
Arg Leu Phe Lys Lys G I u Asn G I y Lys Phe Lys I I e G I u Hi s Asp Ar
20 25 30
Thr Phe Arg Pro Ty r I I e Ty r A I a Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys I I e
35 40 45 G I u Glu Va I Lys Lys l ie Thr G I y G I u Arg Hi s G I y Lys l ie Va I Arg 50 55 60
l ie Va I Asp Va I Glu Lys Va I Glu Lys Lys Phe Leu G I y Lys Pro l ie 65 70 75 80
Thr Va I Tr p Lys Leu Ty r Leu Glu Hi s Pro Gin Asp Va I Pro Thr I I e
85 90 95
Arg Glu Lys Va I Arg Glu His Pro Ala Va I Va I Asp l ie Phe Glu Tyr -)Λ丄 丄 e|v δΛ e | y dsy n | 5
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Leu Tyr A I a Thr l ie Pro G I y G I y G I u Ser G I u Glu l ie Lys Lys Lys 545 550 555 560
A I a Leu Glu Phe Va I Lys Tyr I I e Asn Ser Lys Leu Pro G I y Leu Leu
565 570 575
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Leu Glu l ie Va I Arg Arg Asp Trp Ser Glu l ie Ala Lys Glu Thr Gin
610 615 620
A I a Arg Va I Leu Glu Thr l ie Leu Lys Hi s G I y Asp Va i Glu Glu A I a 625 630 635 640
Va I Arg I I e Va I Lys Glu Va I I I e Gin Lys Leu A I a Asn Tyr Glu I I e
645 650 655
Pro Pro Glu Lys Leu A I a l ie Tyr Glu Gin l ie Thr Arg Pro Leu His
660 665 670
Glu Tyr Lys Ala l ie G I y Pro Hi s Va I Ala Va I Ala Lys Lys Leu Ala
675 680 685
Ala Lys G I y Va I Lys I I e Lys Pro G I y Met Va I I I e G I y Tyr I I e Va I
690 695 700
Leu Arg G I y Asp G I y Arg l ie Arg Asp Arg A I a l ie Pro Ala Glu Glu 705 710 715 720
Tyr Asp Pro Lys Lys Hi s Lys Tyr Asp A I a Glu Tyr Tyr l ie Glu Asn 725 730 735
Gin Va I Leu Pro A I a Va I Leu Arg l ie Leu G I u G I y Phe G I y Tyr Arg
740 745 750
Lys G I u Asp Leu Arg Tyr Gin Lys Thr Arg Gin Va I G I y Leu Thr Ser
755 760 765
Tr p Leu Asn I I e し ys Lys Ser
770 775
配列番号：7
配列の長さ： 775
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
配列
Met Va I Leu Asp Va I Asp Tyr l ie Thr G I u Glu G I y Lys Pro Va I I I e 1 5 10 15 Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn G I y Lys Phe Lys I I e Glu His Asp Ar
20 25 30
Thr Phe Ar Pro \ r I I e Tyr Ala Leu Leu Ar Asp Asp Ser Lys I I e
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Glu Glu Va I Lys Lys l ie Thr G I y Glu Ar Hi s G I y Lys l ie Va I Arg 50 55 60
I I e Va I Asp Va I Glu Lys Va I Glu Lys Lys Phe Leu G I y Lys P o I I e 65 70 75 80
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Met G I u G I y Glu Glu G I u Leu Lys l ie Leu Ala Phe Asp l ie Glu Thr 130 135 140
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Ser Tyr A I a Asp Glu Asn Glu Ala Lys Va I l ie Thr Tr p Lys Asn l ie
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Va I Glu Va I Va I Ser Ser Glu Arg Glu Met l ie Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg l ie l ie Arg Glu Lys Asp Pro Asp l ie l ie Va I Thr
195 200 205
Tyr Asn G I y Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu A I a Lys Arg A I a Glu 210 215 220
Lys Leu G I y I I e Lys Leu Thr I I e G I y Arg Asp G I y Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240
Met Gin Arg l ie G I y Asp Met Thr Ala Va I Glu Va I Lys G I y Arg l ie
245 250 255
Hi s Phe Asp Leu Tyr Hi s Va I l ie Thr Arg Thr l ie Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Va I Tyr Glu Ala l ie Phe G I y Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Va I Tyr A I a Asp Glu l ie A I a Lys A I a Tr p Glu Ser G I y Glu Asn 290 295 300
Leu Glu Arg Va I A I a Lys Tyr Ser Met Glu Asp A I a Lys A I a Thr Tyr 305 310 315 320 929 029 919
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755 760 765
T r p Leu Asn I I e Lys Lys Ser
770 775
配列番号： 8
配列の長さ： 49
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA)
配列
AGAGGCGATG GTCGAATTCG CGATAGGGCA ATTCCAGCTG AGGAATACG 49 配列番号： 9
配列の長さ： 49
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類.他の核酸（合成 DNA)
配列
CGTATTCCTC AGGTGGAATT GCCCTATCGC GAATTCGACC ATCGCCTCT 49 配列番号： 10
配列の長さ： 40
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 D NA)
配列
CCAATTAGCA ATAGGGCAAT TCCAGCTGAG GAATACGATC 40 配列番号： 1 1
配列の長さ： 40
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 D NA)
配列
GATCGTATTC CTCAGCTGGA ATTGCCCTAT TGCTAATTGG 40

Claims

請求の範囲
1. ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 aの予想される 全蛋白質から、その生物種 aの任意の蛋白質の機能部位を予測する方法であつ て、
(1) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度およ び各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出現頻度 を求め、最初に以下の基準に合致する才リゴペプチドの長さ n;
長さ nのオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のものよりも少な 長さ（n+ 1 )のオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のもの よりも多い；
を確定し、
(2) 機能部位予測対象の蛋白質のアミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ 酸残基を Aj(n+ 1≤j≤L-n)とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列で j番 目のアミノ酸残基 Ajを含む長さ（n+1 )の Ajオリゴペプチド；
a j1 a j2....Aji ..... a jn aj(n+1)( 1≤ i≤ n + 1； Aj=Ajiで
Ajはこのオリゴペプチドの i番目の残基を示す）
の出現頻度と、長さ（n+1)の Xiオリゴペプチド；
aj1 aj2..... Xi ..... ajn aj(n+1)(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）の出現頻度と を生物種 aの全蛋白質中で求め、
(3) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求め、
(4) Yjiの平均値 Yj;
Yj=∑Yji/n+1 (1≤i≤n+1)
を求め、
(5) Yjの関数値 ¾;
¾=f(Yj) (関数 fは単調減少関数または単調増加関数） を求め、この ¾の値をアミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機能代表値 とし、
(6) 以下、上記ステップ (2)から（5)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の n+1 ≤j≤L_nの位置にある全アミノ酸残基 Ajについて各々の Zj値を求める、 ことによって、蛋白質の機能に対する各アミノ酸残基の責任の程度を ¾値の大きさ を指標として予測すること特徴とする蛋白質の機能部位予測方法。
2. アミノ酸配列（長さ L)について、各アミノ酸残基の ¾値（n + 1≤j≤L— r>) を分布図として表示する請求項 1の方法。
3. ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 aの予想される 全蛋白質から、その生物種 aの任意の蛋白質の機能部位を予測する方法であつ て、
(1) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度およ び各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出現頻度 を求め、
(2) 生物種 aの任意の蛋白質について、
(2') アミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ酸残基を Ajとし、この蛋白質の アミノ酸配列の部分配列で j番目のアミノ酸残基 Aj(n≤j≤L- n+1)を含む任意 の長さ n(1≤n≤M、ただし Mは最初に以下の基準に合致するオリゴペプチドの長 さ M;長さ Mのオリゴぺプチドはすべて、出現頻度 1である）の Ajオリゴペプチド； aj1 aj2....aji....ajn( 1≤ i≤ n + 1； Aj = aj ίで Ajはこのオリゴペプチドの i番目 の残基を示す）
の出現頻度と、
Ajオリゴペプチドに対応する長さ nの Xiオリゴペプチド；
aj! aj2....Xi....ajn(Xiは任意のアミノ酸残基を示す） の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求め、
(3) Ajオリゴペプチドと Χίオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求め、
(4) Yjiの平均値 YG,n);
Y0,n)=∑ Yji/n( 1≤i≤n)
を求め、
(5) Y(j,n)の関数値 ZG,n);
Figure imgf000060_0001
を求め、
(6) 以下、上記ステップ (2')から (5)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さし）の j番目 (n≤j≤L— n+1 )の位置にあるアミノ酸残基 Ajについて各々の Z(j,n)値を求め、
(7) 生物種 aの全蛋白質について上記ステップ (2)から (6)を順次繰り返し、アミノ酸 残基の種類毎の Z(j,n)値の分布を求め、この分布に基づいて各アミノ酸 Aaに対す る Z(j,n)値の平均値 Av(Aa)と標準偏差値 Sd(Aa)を求め、アミノ酸残基の種類に よる分布の違いを標準化する関数 g;
g=(Z(i，n), Aj)= ZG,n)— Av(Aa)} Sd(Aa) (ただし Aj = Aa)
を求め、
(8) アミノ酸配列（長さ L)の j番目（n≤j≤L— n+1 )の位置にある全アミノ酸残基 Ajについてステップ (7)で得られた関数 gの値 DG,n);
DG,n) = g(ZG,n), Aj)
を求め、
(9) アミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機能代表値を Z(j,n)値と D(j,n) 値の関数値 Wj;
Wj = h(Za,1), Z(j，2) , Z(j,M), D(j,1), DG,2) , D(j,M))
とする、
ことによって、蛋白質の機能に対する各アミノ酸残基の責任の程度を Wj値の大き さを指標として予測すること特徴とする蛋白質の機能部位予測方法。
4. 各アミノ酸残基の Wj値を 2次元的な分布図として表示する請求項 3の方 法。
5. 各アミノ酸残基の Wj値を、蛋白質の立体構造モデル上に分布図として表 示する請求項 3の方法。
6. 請求項 1記載の方法を自動的に行なう装置であって、少なくとも以下の（a) から (g)の装置、
(a) ゲノムデータまたは cDN A解析データが既知である生物種 aの予想される全 蛋白質のアミノ酸配列データ、および既存の蛋白質データベースを記憶する外部 記憶装置、
(b) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度およ び各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出現頻度 を計算する CPUと、その計算結果を記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装 置、
(c) 装置 (b)に出現頻度が記憶された各オリゴペプチドの中から、最初に以下の基 準に合致するオリゴペプチドの長さ n;
長さ πのオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のものよりも少な く、長さ（n+ 1 )のオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のもの よりも多い；
を計算する CPUと、 nを記憶する記憶装置とからなる計算 Z記憶装置、
(d) 機能部位予測対象の蛋白質のアミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ 酸残基を Aj(n+1≤j≤L_r>)とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列で j番 目のアミノ酸残基 Ajを含む長さ（n+1)の Ajオリゴペプチド；
a j1 a j2..... Aji..a jn a j(n + 1 ) ( 1≤ i≤ n + 1 ; Aj = Aj i"C
Ajはこのオリゴペプチドの i番目の残基を示す） の出現頻度と、長さ（n+1 )の Xiオリゴペプチド；
aj1 aj2..... Xi ....a jn a j(n + 1 )(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）の出現頻度と をこの生物種の全蛋白質中で求める CPUと、その計算結果を記憶する記憶装置 とからなる計算 記憶装置、
(e) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求める CPUと、 Yji を記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、
(f) Yjiの平均値 Yj;
Yj=∑Yji/n+1 (1≤i≤n+1)
を求める CPUと、 Yjを記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、
(g) Yjの関数値 Zj;
=f(Yj) (関数 fは単調減少関数または単調増加関数）
を求める CPUと、 Zjを記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、
を備えていることを特徴とする蛋白質の機能部位予測装置。 7. アミノ酸配列（長さ L)について、各アミノ酸残基の Zj値（n+1≤j≤L— n) を分布図として表示するディスプレー装置を備えた請求項 6の装置。
8. 請求項 3記載の方法を自動的に行なう装置であって、少なくとも以下の (a) から (i)の装置、
(a) ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 aの予想される全 蛋白質のアミノ酸配列データ、および既存の蛋白質データベースを記憶する外部 記憶装置、
(b) この生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度 および各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出現 頻度を計算する CPUと、その計算結果を記憶する記憶装置とからなる計算 記 憶装置、 (c) この生物種 aの任意の蛋白質について、アミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番 目アミノ酸残基を とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列で j番目のアミノ酸 残基 Aj(n≤j≤L— n+1 )を含む任意の長さ n(1≤n≤M、ただし Mは最初に以 下の基準に合致するオリゴペプチドの長さ M;長さ Mのオリゴペプチドはすべて、 出現頻度 1である）の Ajオリゴペプチド；
aj1 aj2....aji....ajn( 1≤i≤n+ 1； Aj = aj iで Ajはこのオリゴペプチドの i番目 の残基を示す）
の出現頻度と、
Ajオリゴペプチドに対応する長さ nの Xiオリゴペプチド；
aj1 aj2....Xi....ajn(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求める CPUと、その計算結果を記憶する 記憶装置とからなる計算 記憶装置、
(d) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求める CPUと、 Yji を記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、
(e) Yjiの平均値 Y(j,n);
Y(j,n)=∑ YjiZn(1≤i≤n)
を求める CPUと、 Y(j,n)を記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、
(f) Y(j，n)の関数値 ZG,n);
Z(j,n) = - log(Y(j，n))
を求める CPUと、 ZG,n)を記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、
(g) 生物種 aの全蛋白質のアミン酸配列について、各アミノ酸残基の ZG,n) を求 め、アミノ酸残基の種類毎の Z(j,n)値の分布を求め、この分布に基づいて各ァミノ 酸 Aaに対する Z(j,n)値の平均値 Av(Aa)と標準偏差値 Sd( Aa)を求め、アミノ酸 残基の種類による分布の違いを標準化する関数 g;
Figure imgf000063_0001
Aj) =に (j,n)— Av(Aa)}ZSd(Aa) (ただし Aj=Aa)
を求める CPUと、 gを記憶する計算装置とからなる計算 記憶装置、 (h) アミノ酸配列（長さ L)の j番目（n≤j≤L—n + 1 )の位置にある全アミノ酸残基 Ajについて、装置 (g)に記憶された関数 gの値 D(j,n);
DO.n) =g(ZG,n), Aj)
を求める CPUと、 D(j,n)値を記憶する記憶装置とからなる計算ノ記憶装置、
(i) アミノ酸配列について、各アミノ酸残基の Z(j,n)値 gと D(j,n)値の任意の関数値 Wj;
Wj = h(ZG,1), ZG.2) , ..., ΖΟ,Μ), D(j,1)， DG.2) , ..., D(j,M))
を求める計算装置と、 Wj値を記憶する記憶装置とからなる計算 記憶装置、を備 えていることを特徴とする蛋白質の機能部位予測装置。
9. アミノ酸配列について、各アミノ酸残基の Wj値を 2次元的な分布図として 表示するディスプレー装置を備えている請求項 8の装置。
10. 既存の蛋白質立体構造データベースを記憶し、または公知の方法に従つ てアミノ酸配列から立体構造モデルを作成し記憶する計算 記憶装置と、アミノ酸 配列について、各アミノ酸残基の Wj値を上記計算 記憶装置に記憶されている立 体構造データベースまたは立体構造モデル上に分布図として表示するディスプレ 一装置を備えた請求項 8の装置。
11. ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 aの全蛋白質 から、機能が既知である蛋白質 Aの機能を改良する方法であって、
(1) 蛋白質 Aと近縁の蛋白質を既存の蛋白質データベースから抽出してァラインメ ントを行い、
(2) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度およ び各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出現頻度 を求め、最初に以下の基準に合致するオリゴペプチドの長さ n; 長さ nのオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のものよリも少な 長さ（n+1)のオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のもの よりも多い；
を確定し、
(3) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ酸残基を Aj(n+1≤ 】≤!_ー。）とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列で j番目のアミノ酸残基 Ajを 含む長さ（n+1 )の Ajオリゴペプチド；
a j1 a j2....Aji....a jn a j(n+1)( 1≤ Ί≤ n + 1； Aj = Ajiで
Ajはこのオリゴペプチドの i番目の残基を示す）
の出現頻度と、長さ（n+1)の Xiオリゴペプチド；
aj1 aj2....Xi....ajn aj(n+1)(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求め、
(4) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求め、
(5) Yjiの平均値 Yj;
Yj=∑Yji/n+1 (1≤i≤n+1)
を求め、
(6) Yjの関数値 Zj;
¾=f(Yj) (関数 fは単調減少関数または単調増加関数）
を求め、この Zjの値を蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機 能代表値とし、
(7) ステップ (3)から (6)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の（n+1≤j≤L— n の位置にある全アミノ酸残基について各々の Zj値を求め、
(8) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)について、ステップ (1)で行なったァラインメン 卜のデータをもとに変異させるアミノ酸残基を 1種以上選択し、それらのアミノ酸残 基が別のアミノ酸残基に変異した種々の変異型アミノ酸配列における変異アミノ酸 残基についてステップ (3)から (6)を順次繰り返し、変異アミノ酸残基の Zj値を求 め、
(9) ステップ (8)で求めた変異アミノ酸残基の Zj値が、ステップ (7)で求めた元のアミ ノ酸残基の ¾値より大きいか小さい変異型アミノ酸配列を選択し、
(10) このアミノ酸配列をコードする蛋白質 Aの改変型遺伝子を作成し、この遺伝 子の発現産物として改良型蛋白質を作成する、
ことを特徴とする蛋白質の機能改良方法。
12. ゲノムデータまたは cDNA解析データが未知である生物種 bの蛋白質 B の機能を改良する方法であって、
(1) ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 aの全蛋白質から、 蛋白質 Bと最も近縁の蛋白質 Aを抽出してアラインメントを行ない、また蛋白質 Bと 近縁の蛋白質を既存の蛋白質データベースから抽出してアラインメントを行い、 (2) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度およ び各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出現頻度 を求め、最初に以下の基準に合致するオリゴペプチドの長さ n;
長さ nのオリゴぺプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のものよりも少な 長さ（n+1 )のオリゴペプチドのうち、出現頻度 1のものが出現頻度 2のもの よりも多い；
を確定し、
(3) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ酸残基を Aj(n+1≤ j≤L— n)とし、この蛋白質のアミノ酸配列の部分配列で j番目のアミノ酸残基 Ajを 含む長さ（n+1)の Ajオリゴペプチド；
a j1 a j2....Aji....a jn a j(n + 1)( 1≤ i≤ n + 1 ; Aj = Aji"
Ajはこのオリゴペプチドの i番目の残基を示す）
の出現頻度と、長さ（n+1)の Xiオリゴペプチド；
aj1 aj2....Xi....ajn aj(n+1)(Xiは任意のアミノ酸残基を示す） の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求め、
(4) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求め、
(5) Yjiの平均値 Yj;
Yj=∑ YjiZn+ 1 ( 1≤ί≤η+ 1 )
を求め、
(6) Yjの関数値 Zj;
¾=f(Yj) (関数 fは単調減少関数または単調増加関数）
を求め、この Zjの値を蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機 能代表値とし、
(7) ステップ (3)から (6)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の（n+1≤j≤L— n の位置にある全アミノ酸残基について各々の ¾値を求め、
(8) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)について、ステップ (1)で行なったァラインメン 卜のデータをもとに変異させるアミノ酸残基を 1種以上選択し、それらのアミノ酸残 基が別のアミノ酸残基に変異した種々の変異型アミノ酸配列における変異アミノ酸 残基についてステップ (3)から（6)を順次繰り返し、変異アミノ酸残基の Zj値を求 め、
(9) ステップ (8)で求めた変異アミノ酸残基の Zj値が、ステップ (7)で求めた元のアミ ノ酸残基の ¾値より大きいか小さい変異位置と変異アミノ酸残基を選択し、
(10) この位置でこの変異アミノ酸残基を実現する蛋白質 Bの改変型遺伝子を作 成し、この遺伝子の発現産物として改良型蛋白質を作成する、
ことを特徴とする蛋白質の機能改良方法。
13. ゲノムデータまたは cDNA解析データが既知である生物種 aの全蛋白質 から、機能が既知である蛋白質 Aの機能を改良する方法であって、
(1) 蛋白質 Aと近縁の蛋白質を既存の蛋白質データベースから抽出してァラインメ ントを行い、 (2) 生物種 aの全蛋白質のアミノ酸配列について、各アミノ酸残基の出現頻度およ び各アミノ酸残基を組み合わせて順に長さを長くした各オリゴペプチドの出現頻度 を求め、
(3) 蛋白質 Aについて、
(3') アミノ酸配列（長さ L)の N末端から j番目アミノ酸残基を Ajとし、この蛋白質の ァミノ酸配列の部分配列で』番目のァミノ酸残基^ ( 0≤_|≤1_—。+1)を含む任意 の長さ n(1≤n≤M、ただし Mは最初に以下の基準に合致するオリゴペプチドの長 さ M;長さ Mのオリゴペプチドはすべて、出現頻度 1である）の Aj才リゴペプチド； aj1 aj2....aji....ajn( 1≤i≤n+ 1； Aj = ajiで Ajはこのオリゴペプチドの i番目 の残基を示す）
の出現頻度と、
Ajオリゴペプチドに対応する長さ nの Xiオリゴペプチド；
aj1 aj2....Xi....ajn(Xiは任意のアミノ酸残基を示す）
の出現頻度とを生物種 aの全蛋白質中で求め、
(4) Ajオリゴペプチドと Xiオリゴペプチドの出現頻度の比 Yjiを求め、
(5) Yjiの平均値 YG,n);
YG,n)=∑ YjiZn(1≤ί≤η)
を求め、
(6) YG,n)の関数値 Z(j,n);
ZG,n) = -log(YG,n))
を求め、
(7) 以下、上記ステップ (3')から (6)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の j番目 (n≤j≤L— n+1 )の位置にあるアミノ酸残基 Ajについて各々の Z(j,n)値を求め、
(8) 生物種 aの全蛋白質について上記ステップ (2)から (6)を順次繰り返し、アミノ酸 残基の種類毎の Z(j,n)値の分布を求め、この分布に基づいて各アミノ酸 Aaに対す る Z(j,n)値の平均値 Av(Aa)と標準偏差値 Sd(Aa)を求め、アミノ酸残基の種類に よる分布の違いを標準化する関数 g;
g=(ZG,n), Aj) = {ZG,n)-Av(Aa)}/'Sd(Aa) (ただし Aj=Aa)
を求め、
(9) アミノ酸配列（長さ L)の j番目（n≤j≤L— n+1)の位置にある全アミノ酸残基 Ajについてステップ (7)で得られた関数 gの値 D(j，n);
D(j,n) = g(Z(j,n), Aj)
を求め、
(10) アミノ酸配列（長さ L)の j番目のアミノ酸残基の機能代表値を Z(j,n)値と D (j，n)値の関数値 Wj;
Wj = h(Za,D, ZG.2), ..., ΖΟ,Μ), D(j,D, D(j,2)， ·..， D(j，M))
とし、
(11) ステップ (3)から（10)を順次繰り返し、アミノ酸配列（長さ L)の（n+1≤j≤L— nの位置にある全アミノ酸残基について各々の Wj値を求め、
(12) 蛋白質 Aのアミノ酸配列（長さ L)について、ステップ（1)で行なったァラインメ ントのデータをもとに変異させるアミノ酸残基を 1種以上選択し、それらのアミノ酸 残基が別のアミノ酸残基に変異した種々の変異型アミノ酸配列における変異アミノ 酸残基についてステップ (3)から（10)を順次繰り返し、変異アミノ酸残基の Wj値を 求め、
(13) ステップ（12)で求めた変異アミノ酸残基の Wj値が、ステップ (10)で求めた元 のアミノ酸残基の Wj値より大きいか小さい変異型アミノ酸配列を選択し、
(14) このアミノ酸配列をコードする蛋白質 Aの改変型遺伝子を作成し、この遺伝 子の発現産物として改良型蛋白質を作成する、
ことを特徴とする蛋白質の機能改良方法。 14. 1本鎖 DNAに相補的な DNA鎖の合成を触媒するに際して合成 DNA鎖 の伸長を途中で停止させることのないように Pfu DNA合成酵素のアミノ酸配列を 人為的に改変したことを特徴とする耐熱性 DNA合成酵素。
15. 配列番号 1のアミノ酸配列からなる請求項 14の耐熱性 DNA合成酵素。
16. 1本鎖 DNAに相補的な DNA鎖の合成を触媒するに際して合成 DNA鎖 がより長く伸長するように RfuDNA合成酵素のアミノ酸配列を人為的に改変したこ とを特徴とする耐熱性 DNA合成酵素。
17. 配列番号 6のアミノ酸配列からなる請求項 16の DNA合成酵素 <
18. 配列番号 7のアミノ酸配列からなる請求項 16の DNA合成酵素 (
19. 配列番号 1のアミノ酸配列をコードする DNA配列。
20. 配列番号 6のアミノ酸配列をコードする DNA配列。
21. 配列番号 7のアミノ酸配列をコードする DNA配列。
22. 請求項 19の DNA配列を含む組換え体ベクター。
23. 大腸菌 HMS 174(DE 3)/p DP 320(FERM P-16052)が保有する組換え 体プラスミド p DP 320である請求項 22の組換え体ベクター。
24. 請求項 20の DNA配列を含む組換え体べクタ一。
25. 大腸菌 HMS 174(DE 3)/p DP 5b17(FERM BP- 6189)が保有する組換え 体プラスミド pDP 5b17である請求項 24の組換え体べクタ一。
26. 請求項 23の DNA配列を含む組換え体べクタ一。
27. 大腸菌 HMS 174(DE 3)/p DP 5C4(FIRM BP- 6190)が保有する組換え 体プラスミド pDP 5C4である請求項 26の組換え体べクタ一。
28. 請求項 19の DNA配列を含む発現ベクターにより形質転換した細胞を培 養し、培地中に産生された目的酵素を単離'精製することを特徴とする耐熱性 DN0 A合成酵素の製造方法。
29. 請求項 20または 21の DNA配列を含む発現ベクターにより形質転換した 細胞を培養し、培地中に産生された目的酵素を単離 ·精製することを特徴とする D NA合成酵素の製造方法。
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