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WO1998029739A1 - Microsystemes pour analyses biologiques, leur utilisation pour la detection d'analytes et leur procede de realisation - Google Patents

Microsystemes pour analyses biologiques, leur utilisation pour la detection d'analytes et leur procede de realisation Download PDF

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WO1998029739A1
WO1998029739A1 PCT/FR1997/002439 FR9702439W WO9829739A1 WO 1998029739 A1 WO1998029739 A1 WO 1998029739A1 FR 9702439 W FR9702439 W FR 9702439W WO 9829739 A1 WO9829739 A1 WO 9829739A1
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WO
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electrode
electrodes
mobile
analyte
fixed electrode
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR1997/002439
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English (en)
Inventor
Jean-Frédéric Clerc
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
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Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Publication date
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Priority to US09/331,578 priority patent/US6133046A/en
Priority to EP97953962A priority patent/EP0950185A1/fr
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode

Definitions

  • the present invention relates to microsystems for biological analyzes, usable in particular in the health sector, the food industry and the environment.
  • microtechnologies in the biological field, thus making it possible, through integration and parallelization, to achieve high performance, speeds and sensitivities.
  • microtechnologies lead to new solutions, both technical (miniaturization, integration) and economic (mass production), likely to boost the development of biosensors.
  • EP-A-244 326 also describe a method for detecting and / or identifying a biological substance in a liquid sample using electrical measurements.
  • the sample is brought into contact with a reagent-carrying plate comprising a ligand specific for the biological substance to be detected, this plate possibly being made of a semiconductor material such as silicon, and being coated with a silica insulating layer, then we measure the C and / or R components of the electrical impedance of the system to detect the presence of the biological substance in the sample.
  • the present invention specifically relates to a biological analysis microsystem, based on the same principle, that is to say on the recognition reaction of the biological substance or analyte to be detected with a specific ligand, which makes it possible to on the one hand, to detect this recognition reaction by several types of combined measurements such as impedance and rheological measurements of viscosity and surface forces, and on the other hand, to carry out these measurements in the vicinity or within the active layer analyte-ligand.
  • the device for detecting or assaying an analyte comprises: - a cell comprising at least one fixed electrode and at least one mobile electrode opposite the fixed electrode, the mobile electrode being able to be moved so as to approach and / or move away from the fixed electrode, the space between the electrodes forming a sample receiving cavity and the wall of at least one of the electrodes facing the receiving cavity being capable of fixing a specific ligand for the analyte to be detected, means for moving the mobile electrode, means for separately connecting the electrodes to an external electrical circuit, and means for measuring the impedance or the electric capacitance between the electrodes .
  • the mobile electrode and the fixed electrode are both capable of fixing a specific ligand of the analyte to be detected, the ligands of the two electrodes being able to be identical or different.
  • the electrodes and preferably both are covered with ligand.
  • the means for moving the mobile electrode can be constituted by means for polarizing the fixed electrode and the mobile electrode.
  • Fc . ⁇ SV 2 / e 2 , where ⁇ is the dielectric constant of the medium between the electrodes, V is the applied voltage, e is the average distance between the electrodes and S is the surface of the electrodes.
  • This capacitive force thus makes it possible to ensure the displacement of the mobile electrode, provided of course that it is free to move in the device.
  • the means for moving the mobile electrode are magnetic means.
  • the means for moving the mobile electrode can also be constituted by excitation means using an inductive effect.
  • the mobile electrode can be associated with turns supplied with electric current and subjected to the action of a magnetic field so as to generate a force in the desired direction of movement of the mobile electrode.
  • the cell comprises a tank on a wall of which the fixed electrode is arranged, the mobile electrode is arranged opposite the fixed electrode on a mobile element mounted on the ( the) wall (s) of the tank by means of at least one flexible beam, so that the mobile electrode can approach or move away from the fixed electrode by deformation of the flexible beam, and of the contacts electric are arranged on the wall (s) of the tank, on said flexible beam and on the movable element to connect separately the fixed electrode and the mobile electrode to an external electrical circuit allowing to polarize the electrodes and to measure the capacitance between the fixed electrode and the mobile electrode.
  • the means for moving the mobile electrode can be constituted by means for polarizing the fixed electrode and the mobile electrode.
  • a second pair of electrodes formed respectively on a wall of the tank and on the mobile element so as to be opposite one of the another, and means of polarization of the pair of electrodes so as to 'cause movement of the movable member supporting the movable electrode.
  • magnetic means for moving the mobile electrode can comprise a permanent magnet placed on the mobile element of the mobile electrode, and means for applying a magnetic field to this magnet.
  • the device is advantageously produced from a silicon substrate with a buried silica layer.
  • the bottom and the wall (s) of the tank are formed of silicon, the wall (s) are separated from the bottom by a layer of insulating silica, the mobile element and the flexible beams. are also formed of silicon, and the electrodes are formed of silicon made conductive by implantation of ions.
  • the device of the invention can be used for the detection or the assay of analytes of various types. By way of example of such analytes, in particular in the medical field, mention may be made of antigens, haptens, antibodies, peptides, nucleic acid fragments (DNA or RNA), enzymes and enzyme substrates .
  • At least one of the electrodes of the device is covered with a ligand specific for the analyte to be detected, for example by direct or indirect grafting of this ligand on the electrode (s).
  • a ligand specific for the analyte to be detected for example by direct or indirect grafting of this ligand on the electrode (s).
  • the specific ligands covering the electrode (s) are those which have at least one site for recognition of the analyte and which are capable of binding to the latter.
  • the ligand-analyte pair can thus belong to the antigen-antibody, hapten-antibody, hormone receptor, DNA- C DNA, RNA-RNA C , enzyme-substrate, or any other association of biological molecules or not, capable of forming between they are complex.
  • the use of a detection device comprising a mobile electrode has many advantages.
  • the operation of grafting the ligand onto the electrode (s) can be carried out while avoiding the formation agglomerates, which makes it possible to obtain a homogeneous layer of ligand, as dense as possible.
  • the fluidics are facilitated by allowing the fluid to be agitated at the electrodes, which leads to an increased probability of recognition between the analyte and the attached ligand, prevents the formation of agglomerates and makes it possible to obtain a homogeneous and dense active layer on the electrode (s).
  • the fact of having a mobile electrode also makes it possible to detect the presence of analyte by using other measurements, for example a measurement of the viscosity of the sensitive layer by studying the damping of the movement. of the mobile electrode in this layer, after a series of alternating movements of this electrode.
  • the presence of analyte can also be detected by measuring the surface mechanical forces at vicinity of the sensitive layer, as will be seen below.
  • the invention also relates to a method for detecting or assaying an analyte in a liquid sample which comprises the following steps: a) introducing said sample into a cell comprising at least one fixed electrode and at least one mobile electrode located opposite the fixed electrode, said movable electrode being movable so as to approach or move away from the fixed electrode, at least one of said electrodes being coated with a specific ligand for the analyte to be detected and the sample being introduced between the electrodes with the movable electrode in a position remote from the fixed electrode; b) move the movable electrode at least once to bring it closer to the fixed electrode or to make it oscillate between a close position and a position distant from the fixed electrode; and c) measuring, during this displacement or after this (s) displacement (s), a parameter representative of the formation or not, between the electrodes, of a sensitive layer obtained by reaction of the ligand with the analyte to be detected.
  • step b) the mobile electrode is moved at once or in several times to bring it closer to the fixed electrode, and then after each movement is measured in the step c), the electrical impedance between the electrodes, the measured value being compared with a reference value determined in the absence of analyte.
  • step c) it is also possible to carry out several impedance measurements at different distances between the electrodes in order to have a record of the phenomena of variation of impedance due to the presence of the layer active formed by the ligand-analyte complex. It is thus possible to obtain separately the impedance of the intermediate layer and the impedance of the active layer.
  • the mobile electrode is moved several times to make it oscillate between a close position and a distant position, then after these displacements, the capacitance between the electrodes as a function of time is measured in step c).
  • step b the mobile electrode is moved only once to bring it closer to the fixed electrode, and measure in step c) during this displacement the capacity between the electrodes and the force applied to bring the mobile electrode closer.
  • step c the capacity between the electrodes and the force applied to bring the mobile electrode closer.
  • This measurement mode is more particularly intended for the determination of analytes having two recognition sites for the same specific ligand or for two different ligands or the mobile electrode and the fixed electrode of a mixture of two ligands.
  • the mobile electrode and the fixed electrode are covered with different ligands or the mobile electrode and the fixed electrode with a mixture of two ligands.
  • FIG. 1 is a perspective view of a detection device according to the invention.
  • FIG. 2 is a view in vertical section of the device of the invention along the line XX 'of FIG. 1.
  • FIGS 3 to 5 illustrate the main stages of preparation of the device of Figure 1.
  • FIG. 6 schematically illustrates the device of FIG. 1 during the step of coating the electrodes and bringing it into contact with the sample, the electrodes being in a distant position.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating the viscosity of the liquid between the electrodes as a function of the distance between the electrodes, in the absence of analyte (curve 1) and in the presence of analyte (curve 1)
  • Figure 9 illustrates the device of Figure
  • FIG. 10 is a diagram illustrating the contact force between the electrodes as a function of the interelectrode distance, in the absence of analyte (curve
  • Figure 1 there is shown in perspective a microsystem for biological analysis according to one invention.
  • This microsystem comprises a measuring cell 1 of parallelepiped shape comprising on one of its side walls 2 a fixed electrode 3.
  • a mobile electrode 5 is located opposite the fixed electrode 3 on a mobile element 7 mounted on the side walls opposite 9 and 11 of the cell, by means of flexible thin beams 13 and 15 which form a flexible mechanical connection between the movable element 7 and the walls 9 and 11.
  • the fixed electrode 3 and the mobile electrode 5 are electrically isolated from each other by a layer electrical insulation 17 disposed on the side walls 2, 9, 11 and 22 of the cell above the bottom 19 thereof.
  • the interior of the cell constitutes a cavity for receiving the liquid sample to be analyzed.
  • Electrical contacts 21 and 23 respectively connect the fixed electrode 3 and the movable electrode 5 to an external circuit.
  • This external circuit makes it possible in particular to apply appropriate voltages to the fixed electrode and to the mobile electrode, to control the movement of the mobile element 7 and of the associated electrode 5, to control the distance between the electrodes and carry out various measurements such as a measurement of the capacitance between the electrodes, possibly as a function of time and during the displacement of the mobile electrode.
  • a permanent magnet 8 shown in phantom in the figures 1 and 2 and a field is created around the device
  • the miscrosystem of the invention can be produced by micro-machining methods such as those used in microelectronics.
  • micro-machining methods such as those used in microelectronics.
  • devices of very small dimensions for example 3 mm ⁇ 3 mm on a side with an interelectrode space which can range from 0.1 ⁇ m in the close position to 10 ⁇ m in the remote position.
  • FIGs 3 to 5 there is shown schematically, the realization of a microsystem of this type starting from a SOI type substrate (Silicon on Insulator "(silicon on insulator).
  • the first step of forming the electrodes 3 and 5 is shown in the SOI substrate which comprises an intermediate layer of silica 17 with a thickness of approximately 4000 ⁇ , between its lower part 19. made of silicon and its upper part 20 also made of silicon, about 5 ⁇ m thick.
  • the silicon is modified locally in the upper part 20 by implantation of ions, for example of boron, through a mask defining the zones to be implanted which correspond to the electrodes. Sufficient energy is used for the implantation to make the silicon conductive on these areas up to the intermediate layer of silica 17.
  • External electrical contacts 21 and 23 are produced by conventional techniques, such as those usually used in microelectronics, for example by metallic deposit or followed by etching.
  • the side walls 2, 9 are then produced,
  • holes 8 are also made in the element 7, also by photolithography, which will be useful later to release the movable element 7 from the bottom 19.
  • FIG ' 5 there is shown the process step in which the movable element is released 7. This can be done by dissolving the layer of Si0 2 covering the bottom 19, by means of hydrofluoric acid introduced by the openings previously made between the movable element 7 and the side walls 2 and 22, as well as through the holes 8. This gives an elimination of the layer 17 except on the walls 2, 22, 9 and 11 of the device.
  • 2 can be used for analyzes, in particular biological analyzes, after fixation on one or both electrodes of a specific ligand L of the analyte A to be detected.
  • the ligand L can be fixed by conventional techniques, for example by adsorption on the electrode after having oxidized it very superficially, or by forming a covalent bond between the electrode and the ligand using a bifunctional coupling reagent capable of reacting both with the electrode and with the ligand.
  • a bifunctional coupling reagent capable of reacting both with the electrode and with the ligand. The use of such reagents is well known.
  • silane derivatives comprising an alkoxysilane group and an NH 2 group separated from one 'other by a hydrocarbon chain. Techniques of this type are described in references 1, 3 and 4 cited above.
  • This attachment may also be effected by the techniques described in r OA-94/22889 (reference 6).
  • This fixing is preferably carried out before use, with the electrodes 3 and 5 in the remote position.
  • the electrodes 3 and 5 are shown diagrammatically as well as part of the bottom 19 and of the movable element 7 of the device of FIG. 1.
  • the electrodes are in the distant position at a distance distant from e , for example 2 ⁇ m, and they are covered with specific ligand L.
  • the reagents and the ligand are introduced into the tank of the device; thereby also securing a ligand on the bottom 19 and on the movable member 7, as can be seen in this figure.
  • the sample to be analyzed is introduced into the device, the electrodes always being in the remote position.
  • the sample contains the analyte A, which forms with the ligand L an LA complex or active layer with a thickness less than 1000 ⁇ on the walls of the electrodes and of the device, as shown in FIG. 6.
  • the presence or absence of this complex is then checked, for example by bringing the mobile electrode 5 closer to the fixed electrode 3 so as to have a close distance d r between the electrodes, which is for example 2000 ⁇ , ie 0.2 ⁇ m , and then performing or during this reconciliation the measurement of a significant parameter.
  • FIG. 7 shows the device in this position where the inter-electrode distance d r corresponds to a close position. It is thus noted that the active layer (LA complex) occupies practically the entire space between the electrodes 3 and 5.
  • the presence of this layer is detected by measuring the impedance between the electrodes 3 and
  • an appropriate voltage is applied to the electrodes 3 and 5 and the intensity of the current flowing in the cell is measured.
  • the presence of the analyte in the sample is detected by determining the viscosity of the sensitive layer between the electrodes.
  • This damping depends on friction and therefore on the viscosity of the layer of molecules between the electrodes, in particular its thickness.
  • FIG. 8 shows the evolution of the viscosity ⁇ of the liquid as a function of the distance d between the electrodes.
  • Curve 1 of this figure represents this evolution in the absence of analyte.
  • Curve 2 represents this evolution in the presence of analyte.
  • the viscosity does not vary significantly when the interelectrode distance remains greater than the thickness of the layers of the ligand alone or of the layers of the ligand-analyte complex.
  • This increase in viscosity can be detected after having made the mobile electrode oscillate between a close position and a distant position, by measuring the capacitive variation between the electrodes during the damping of the movement of the mobile electrode.
  • the close position must correspond to an interelectrode distance less than d_.
  • the presence of the analyte is detected by measuring the contact forces between the electrodes.
  • This third embodiment is more particularly used when the analyte has two recognition sites for a specific ligand or for two different specific ligands.
  • FIG. 9 This case is illustrated in FIG. 9 where we see the fixed 3 and mobile 5 electrodes in the close position covered respectively with ligands L and
  • L '(L' L or L ' ⁇ L), and I' analyte A or A 'which has two identical (A) or different (A') recognition sites.
  • the analyte A or A ' is bound both to the ligand of electrode 3 and to the ligand of electrode 5, which corresponds to a bonding phenomenon between the electrodes.
  • FIG. 10 shows the evolution of the contact force f between the electrodes as a function of the interelectrode distance d.
  • Curve 3 illustrates this development in the absence of analyte and curve 4 illustrates this development in the presence of analyte. So, we notice that the contact force increases rapidly when the interelectrode distance reaches the thickness of the sensitive layer, either di without analyte, or d2> d j with analyte. This therefore also makes it possible to determine the presence of analyte.
  • This contact force can be determined by measuring the capacity between the electrodes and the voltage required to bring the movable electrode closer.
  • the value of the capacity makes it possible to determine the inter-electrode distance and the force applied depends on the thickness of the sensitive layer.
  • a device of this type was used to detect the presence of known DNA sequences in an aqueous solute by using the complementary DNA sequence as ligand, and by carrying out the binding of the ligand by grafting onto a polymer itself. - same electrodeposited on the fixed and mobile electrodes.

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Abstract

L'invention concerne un microsystème pour analyse biologique, destiné à la détection d'analytes, par exemple d'antigènes, dans un échantillon. Le microsystème comprend une cellule (1) munie d'une électrode fixe (3) et d'une électrode mobile (5) selon l'axe XX'. La ou les électrode(s) sont recouvertes ou capables de fixer un ligand spécifique de l'analyte à détecter, par exemple un anticorps. Aprés introduction d'un échantillon dans la cellule avec les électrodes en position éloignée, par exemple à une distance de 2 mu m, on peut rapprocher l'électrode mobile ou la faire osciller entre une position éloignée (2 mu m) et une position rapprochée (0,1 mu m) et mesurer un paramètre (impédance, viscosité, force de contact entre électrodes) représentatif de la formation d'une couche analyte-ligand sur la (les) électrode(s).

Description

MICROSYSTEMES POUR ANALYSES BIOLOGIQUES, LEUR
UTILISATION POUR LA DETECTION D'ANALYTES ET LEUR
PROCEDE DE REALISATION
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention a pour objet des microsystèmes pour analyses biologiques, utilisables notamment dans le secteur de la santé, de l'industrie agro-alimentaire et de l'environnement.
Elle s'applique plus particulièrement à la réalisation de microsystèmes d'analyses biologiques destinés au diagnostic in vitro, notamment en analyse des maladies infectieuses (détection du HIV, des mycobactéries etc.).
Dans ces domaines où il s'agit de faire des économies de santé, on recherche actuellement des microsystèmes d'analyse à usage unique, qui soient simples d'emploi, utilisent de très faibles volumes d'échantillon et reposent sur le principe d'une détection directe ne nécessitant ni réactif de détection (marqueur ou autre) , ni amplification du signal de détection.
Etat de la technique antérieure ,
Depuis environ quatre ans, de nouveaux formats de tests (multiaffinité, intégration de fonctions telles que l'amplification génique, séparation par électrophorese) ont fait leur apparition et leurs applications industrielles semblent importantes, bien qu'aujourd'hui elles soient principalement localisées dans le séquençage du génome humain.
Ces nouveaux tests doivent surtout leur succès à l'introduction des microtechnologies dans le domaine biologique, permettant ainsi, par l'intégration et la parallélisation, d'atteindre des performances, des vitesses et des sensibilités élevées. Par ailleurs, les microtechnologies conduisent à des solutions nouvelles tant techniques (miniaturisation, intégration) qu'économiques (production en masse), de nature à relancer le développement des biocapteurs.
Ainsi, on a réalisé récemment des support de tests pour la détection immunochimique directe, constitués de couches minces de semiconducteur et de silice avec des anticorps liés de façon covalente à ces couches, qui permettent de détecter la présence d'un antigène capable de réagir avec ces anticorps par mesure de la capacité de l'ensemble (voir référence
1 : Battaillard et al, dans Analytical Chemistry, 60, 1988, pages 2374-2379). Un autre microsystème du même type a été décrit par Schyberg et al, dans la référence
2 : Sensors and Actuators, B26-27, 1995, pages 457-460.
Les documents référencés 3 : FR-A-2 598 227 et 4 : EP-A-244 326 décrivent aussi un procédé de détection et/ou d'identification d'une substance biologique dans un échantillon liquide à l'aide de mesures électriques. Selon ce procédé, on met en contact l'échantillon avec une plaque porte-réactif comportant un ligand spécifique de la substance biologique à détecter, cette plaque pouvant être réalisée en un matériau semi-conducteur tel que le silicium, et étant revêtue d'une couche isolante de silice, puis on mesure les composantes C et/ou R de l'impédance électrique du système pour détecter la présence de la substance biologique dans l'échantillon. Tous ces systèmes font appel à la réaction de reconnaissance entre la substance biologique à détecter et un ligand spécifique de cette substance pour réaliser une détection directe de cette dernière sans avoir à utiliser d'autres réactifs ou moyens de détection (marqueurs, réactions d'amplification du signal etc) . En effet, cette réaction de reconnaissance se traduit par la formation d'une couche active qui présente des caractéristiques électriques, par exemple une capacité et une impédance, différentes de celles du système en l'absence de ladite couche.
Cependant, les systèmes connus actuellement ne permettent pas d'employer d'autres modes de mesure que l'impédance électrique et ils ne conviennent pas pour effectuer des mesures au voisinage ou au sein de la couche active.
La présente invention a précisément pour objet un microsystème d'analyse biologique, basé sur le même principe, c'est-à-dire sur la réaction de reconnaissance de la substance biologique ou analyte à détecter avec un ligand spécifique, qui permet, d'une part, de détecter cette réaction de reconnaissance par plusieurs types de mesures combinées telles qu'impédance et mesures rhéologiques de viscosité et des forces de surface, et d'autre part, d'effectuer ces mesures au voisinage ou au sein de la couche active analyte-ligand. Exposé de l'invention
Selon l'invention le dispositif de détection ou de dosage d'un analyte comprend : - une cellule comportant au moins une électrode fixe et au moins une électrode mobile en regard de l'électrode fixe, l'électrode mobile pouvant être déplacée de façon à se rapprocher et/ou s'éloigner de l'électrode fixe, l'espace entre les électrodes formant une cavité de réception de l'échantillon et la paroi d'au moins une des électrodes en regard de la cavité de réception étant capable de fixer un ligand spécifique de l' analyte à détecter, des moyens de déplacement de l'électrode mobile, des moyens pour relier séparément les électrodes à un circuit électrique extérieur, et des moyens de mesure de l'impédance ou de la capacité électrique entre les électrodes. De préférence, selon l'invention, l'électrode mobile et l'électrode fixe sont toutes deux capables de fixer un ligand spécifique de l' analyte à détecter, les ligands des deux électrodes pouvant être identiques ou différents . Généralement, l'une au moins des électrodes et, de préférence, les deux sont recouvertes de ligand.
Dans le dispositif de l'invention, les moyens de déplacement de l'électrode mobile peuvent être constitués par des moyens de polarisation de l'électrode fixe et de l'électrode mobile.
En effet, en appliquant sur ces électrode une tension appropriée, on peut créer une force capacitive Fc perpendiculaire à la surface des électrodes, régie par l'équation :
Fc = . εSV2/e2, où ε est la constante diélectrique du milieu entre les électrodes, V est la tension appliquée, e est la distance moyenne entre les électrode et S est la surface des électrodes.
Cette force capacitive permet ainsi d'assurer le déplacement de l'électrode mobile, à condition bien entendu que celle-ci soit libre de se déplacer dans le dispositif .
Selon une variante de réalisation, les moyens de déplacement de l'électrode mobile sont des moyens magnétiques . Selon l'invention, les moyens de déplacement de l'électrode mobile peuvent être aussi constitués par des moyens d'excitation utilisant un effet inductif.
Dans ce cas, on peut associer l'électrode mobile à des spires alimentées en courant électrique et les soumettre à l'action d'un champ magnétique de façon à engendrer une force selon la direction voulue de déplacement de l'électrode mobile.
Selon un mode" particulier de réalisation de l'invention, la cellule comprend une cuve sur une paroi de laquelle est disposée l'électrode fixe, l'électrode mobile est disposée en face de l'électrode fixe sur un élément mobile monté sur la (les) paroi (s) de la cuve par l'intermédiaire d'au moins une poutre flexible, de sorte que l'électrode mobile puisse se rapprocher ou s'éloigner de l'électrode fixe par déformation de la poutre flexible, et des contacts électriques sont disposés sur la (les) paroi (s) de la cuve, sur ladite poutre flexible et sur l'élément mobile pour relier séparément l'électrode fixe et l'électrode mobile à un circuit électrique extérieur permettant de polariser les électrodes et de mesurer la capacité entre l'électrode fixe et l'électrode mobile. Dans ce cas les moyens de déplacement de l'électrode mobile peuvent être constitués par des moyens de polarisation de l'électrode fixe et de l'électrode mobile. Toutefois, il peut être avantageux d'utiliser comme moyen de déplacement de l'électrode mobile un second couple d'électrodes formées respectivement sur une paroi de la cuve et sur l'élément mobile de façon à être en regard l'une de l'autre, et des moyens de polarisation de ce couple d'électrodes de façon à' provoquer le mouvement de l'élément mobile supportant l'électrode mobile.
Dans ce mode particulier de réalisation de l'invention, on peut aussi utiliser des moyens magnétiques de déplacement de l'électrode mobile. Dans ce cas, ces moyens magnétiques peuvent comprendre un aimant permanent placé sur l'élément mobile de l'électrode mobile, et des moyens pour appliquer un champ magnétique à cet aimant.
Selon ce mode- particulier de réalisation de l'invention, le dispositif est avantageusement réalisé à partir d'un substrat de silicium à couche de silice enterrée. Dans ce cas, le fond et la (les) paroi (s) de la cuve sont formés de silicium, la (les) paroi (s) sont séparées du fond par une couche de silice isolante, l'élément mobile et les poutres flexibles sont également formés de silicium, et les électrodes sont formées de silicium rendu conducteur par implantation d' ions . Le dispositif de l'invention est utilisable pour la détection ou le dosage d' analytes de divers types. A titre d'exemple de tels analytes, notamment dans le domaine médical, on peut citer les antigènes, les haptènes, les anticorps, les peptides, les fragments d'acide nucléique (ADN ou ARN) , les enzymes et les substrats d'enzymes.
Pour cette détection, conformément à l'invention, l'une au moins des électrodes du dispositif est recouverte d'un ligand spécifique de l' analyte à détecter, par exemple par greffage direct ou indirect de ce ligand sur la (les) électrodes. Lorsque la (les) électrode (s) ainsi recouverte (s) sont en contact avec un échantillon contenant l' analyte correspondant, il se forme un complexe analyte-ligand, ou couche active, sur la (les) électrode (s) , et on détecte directement la présence de ce complexe par diverses mesures, par exemple des mesures électriques d'impédance ou des mesures de la viscosité ou des forces de contact relatives à la couche sensible.
Les ligands spécifiques recouvrant la ou les électrodes sont ceux qui présentent au moins un site de reconnaissance de l' analyte et qui sont susceptibles de se lier à ce dernier. Le couple ligand-analyte peut ainsi appartenir aux couples antigène-anticorps, haptène-anticorps, hormone-récepteur, ADN-ADNC, ARN-ARNC, enzyme-substrat, ou tout autre association de molécules biologiques ou non, capables de former entre elles des complexes. Selon l'invention, l'utilisation d'un dispositif de détection comprenant une électrode mobile présente de nombreux avantages. En effet, ceci permet d'effectuer les mesures au voisinage ou au sein de la couche active, dans une position rapprochée des électrodes, ce qui conduit à une meilleure sensibilité, la distance interélectrode pouvant être très faible, par exemple de l'ordre de 0,1 à 0,5 μm .
Dans ces conditions, la perte de signal due à la présence d'une quantité plus importante de liquide entre les électrodes est évitée. On améliore ainsi la précision.
En revanche, lorsque les électrodes se trouvent en position éloignée, par exemple à une distance de l'ordre de 1 à 10 μm, on peut réaliser l'opération de greffage du ligand sur la (les) électrode (s) en évitant la formation d'agglomérats, ce qui permet d'obtenir une couche de ligand homogène, la plus dense possible.
De même, si l'on réalise la mise en contact de l'échantillon avec les électrodes dans une position éloignée, on facilite la fluidique en permettant l'agitation du fluide au niveau des électrodes, ce qui conduit à une probabilité accrue de reconnaissance entre l' analyte et le ligand fixé, évite la formation d'agglomérats et permet l'obtention d'une couche active homogène et dense sur la (les) électrode (s) . Enfin, le fait d'avoir une électrode mobile permet de plus de détecter la présence d' analyte en ayant recours à d'autres mesures, par exemple une mesure de la viscosité de la couche sensible par l'étude de l'amortissement du mouvement de l'électrode mobile dans cette couche, après une série de mouvements alternatifs de cette électrode.
On peut encore détecter la présence d' analyte par une mesure des forces mécaniques de surface au voisinage de la couche sensible, comme on le verra plus loin .
Aussi, l'invention a également pour objet un procédé de détection ou de dosage d'un analyte dans un échantillon liquide qui comprend les étapes suivantes : a) introduire ledit échantillon dans une cellule comprenant au moins une électrode fixe et au moins une électrode mobile située en regard de l'électrode fixe, ladite électrode mobile pouvant être déplacée de façon à se rapprocher ou s'éloigner de l'électrode fixe, l'une au moins desdites électrodes étant revêtue d'un ligand spécifique de l' analyte à détecter et l'échantillon étant introduit entre les électrodes avec l'électrode mobile dans une position éloignée de l'électrode fixe ; b) déplacer au moins une fois l'électrode mobile pour la rapprocher de l'électrode fixe ou pour la faire osciller entre une position rapprochée et une position éloignée de l'électrode fixe ; et c) mesurer, lors de ce déplacement ou après ce (s) déplacement (s) , un paramètre représentatif de la formation ou non, entre les électrodes, d'une couche sensible obtenue par réaction du ligand avec 1' analyte à détecter. Selon un premier mode de réalisation de ce procédé, dans l'étape b) , on déplace en une seule fois ou en plusieurs fois l'électrode mobile pour la rapprocher de l'électrode fixe, et on mesure ensuite après chaque déplacement, dans l'étape c) , l'impédance électrique entre les électrodes, la valeur mesurée étant comparée à une valeur de référence déterminée en l'absence d' analyte. Dans ce premier mode de réalisation du procédé de l'invention, on peut aussi effectuer plusieurs mesures d'impédance à des distances différentes entre les électrodes afin de disposer d'un relevé des phénomènes de variation d' impédance dus à la présence de la couche active formée par le complexe ligand- analyte. On peut ainsi obtenir séparément l'impédance de la couche intermédiaire et l'impédance de la couche active . Selon un second mode de réalisation du procédé de l'invention spécialement adapté à la mesure de la viscosité de la couche sensible, dans l'étape b) , on déplace plusieurs fois l'électrode mobile pour la faire osciller entre une position rapprochée et une position éloignée, puis après ces déplacements, on mesure dans l'étape c) , la capacité entre les électrodes en fonction du temps.
Ceci conduit à mesurer l'amortissement du mouvement de l'électrode mobile et l'écart d'amplitude dû aux frottements de l'électrode mobile avec la couche active qui dépend de la viscosité et de l'épaisseur de cette couche. Ainsi, on peut calculer le coefficient de qualité Q lié directement à la perte d'énergie due au frottement donc à la viscosité. Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, plus spécialement adapté à la mesure des forces mécaniques de surface, dans l'étape b) , on déplace une seule fois l'électrode mobile pour la rapprocher de l'électrode fixe, et on mesure dans l'étape c) lors de ce déplacement la capacité entre les électrodes et la force appliquée pour rapprocher l'électrode mobile. Ceci correspond à une mesure de la force de collage entre les électrodes qui se traduit par une non-linéarité de la réponse électromécanique du système en raison de l'établissement de liaisons chimiques entre les deux couches sensibles lors de leur mise en contact .
Ce mode de mesure est plus particulièrement destiné à la détermination d' analytes présentant deux sites de reconnaissance pour un même ligand spécifique ou pour deux ligands différents ou l'électrode mobile et l'électrode fixe d'un mélange de deux ligands.
Dans ce dernier cas, on recouvre l'électrode mobile et l'électrode fixe de ligands différents ou l'électrode mobile et l'électrode fixe d'un mélange de deux ligands.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit, donnée bien entendu à titre illustratif et non limitatif.
Brève description des dessins
La figure 1 est une vue en perspective d'un dispositif de détection conforme à l'invention. La figure 2 est une vue en coupe verticale du dispositif de l'invention suivant la ligne X-X' de la figure 1.
Les figures 3 à 5 illustrent les étapes principales de préparation du dispositif de la figure 1.
La figure 6 illustre de façon schématique le dispositif de la figure 1 lors de l'étape de revêtement des électrodes et de mise en contact avec l'échantillon, les électrodes étant dans une position éloignée .
La figure 7 illustre le dispositif de la figure 1 avec les électrodes dans une position rapprochée. La figure 8 est un diagramme illustrant la viscosité du liquide entre les électrodes en fonction de la distance entre les électrodes, en l'absence d' analyte (courbe 1) et en présence d' analyte (courbe
2) . La figure 9 illustre le dispositif de la figure
1 et la formation d'une couche active avec un analyte comportant deux sites de reconnaissance.
La figure 10 est un diagramme illustrant la force de contact entre les électrodes en fonction de la distance interélectrode, en l'absence d' analyte (courbe
3) et en présence d' analyte (courbe 4).
Exposé détaillé des modes de réalisation
Sur la figure 1, on a représenté en perspective un microsystème pour analyse biologique conforme à 1' invention.
Ce microsystème comprend une cellule de mesure 1 de forme paralléllipipédique comportant sur l'une des ses parois latérales 2 une électrode fixe 3. Une électrode mobile 5 est située en face de l'électrode fixe 3 sur un élément mobile 7 monté sur les parois latérales opposées 9 et 11 de la cellule, par l'intermédiaire des poutres minces flexibles 13 et 15 qui forment une liaison mécanique souple entre l'élément mobile 7 et les parois 9 et 11.
L'électrode fixe 3 et l'électrode mobile 5 sont isolées électriquement l'une de l'autre par une couche d'isolant électrique 17 disposée sur les parois latérales 2, 9, 11 et 22 de la cellule au-dessus du fond 19 de celle-ci.
L' intérieur de la cellule constitue une cavité de réception de l'échantillon liquide à analyser.
Des contacts électriques 21 et 23 relient respectivement l'électrode fixe 3 et l'électrode mobile 5 à un circuit extérieur.
Ce circuit extérieur permet en particulier d'appliquer des tensions appropriées à l'électrode fixe et à l'électrode mobile, de commander le déplacement de l'élément mobile 7 et de l'électrode 5 associée, de contrôler la distance entre les électrodes et d'effectuer diverses mesures telles qu'une mesure de la capacité entre les électrodes, éventuellement en fonction du temps et pendant le déplacement de l'électrode mobile.
Sur la figure 2, on a représenté en coupe verticale selon la ligne XX' de la figure 1, le microsystème de l'invention.
Sur cette figure où les éléments portent les mêmes références, on voit l'élément mobile 7 muni de l'électrode mobile 5 en position rapprochée de l'électrode fixe 3. Sur les figures 1 et 2, il est prévu de déplacer l'élément mobile 7 et l'électrode 5 qui lui est associée en appliquant des tensions appropriées aux électrodes 3 et 5. Dans le cas où on veut réaliser ce déplacement par des moyens magnétiques on modifie le dispositif des figures 1 et 2 de la façon représentée en trait mixte.
On dispose sur l'élément mobile 7 un aimant permanent 8 (représenté en trait mixte sur les figures 1 et 2) et on crée autour du dispositif un champ
magnétique B , par exemple au moyen d'un électroaimant 10 (représenté en trait mixte sur la figure 2) . De cette façon, on peut déplacer l'aimant 8 et l'élément mobile 7 qui lui est associé, par l'action du
champ magnétique B .
Le miscrosystème de l'invention peut être réalisé par des procédés de micro-usinage tels que ceux employés en microélectronique. Ainsi, on peut réaliser des dispositifs de dimensions très faibles, par exemple de 3 mm x 3 mm de côté avec un espace interélectrode pouvant aller de 0,1 μm en position rapprochée à 10 μm en position éloignée.
Sur les figures 3 à 5, on a représenté de façon schématique, la réalisation d'un microsystème de ce type en partant d'un substrat de type SOI (Silicon on Insulator » (silicium sur isolant).
Sur la figure 3, on a représenté la première étape de formation des électrodes 3 et 5 dans le substrat SOI qui comprend une couche intermédiaire de silice 17 d'une épaisseur d'environ 4000 Â, entre sa partie inférieure 19. en silicium et sa partie supérieure 20 également en silicium, d'environ 5 μm d'épaisseur. Pour définir les électrodes 3 et 5, on modifie le silicium localement dans la partie supérieure 20 par implantation d'ions par exemple de bore, à travers un masque définissant les zones à implanter qui correspondent aux électrodes. On utilise pour l'implantation une énergie suffisante pour rendre conducteur le silicium sur ces zones jusqu'à la couche intermédiaire de silice 17. On réalise les contacts électriques extérieurs 21 et 23 par des techniques classiques, telles que celles utilisées habituellement en microélectronique, par exemple par dépôt métallique or suivi de gravure. On réalise ensuite les parois latérales 2, 9,
11, 22, les poutres flexibles 13 et 15 et l'élément mobile 7 du dispositif par photolithogravure comme représenté sur la figure 4.
Ceci peut être effectué par gravure ionique réactive (gravure sèche) du silicium, par exemple au moyen de SF6, jusqu'à la couche de silice 17 suivant le motif voulu, en utilisant par exemple un masque de résine, selon des techniques classiques. On obtient ainsi la paroi latérale 22, l'élément mobile 7 comportant l'électrode 5 et la paroi latérale 2 munie de l'électrode fixe 3, ainsi que les parois latérales 9 et 11 et les poutre flexibles minces 13 et 15, non visibles sur la figure 4.
De préférence, on réalise de plus dans l'élément 7, également par photolithogravure, des trous 8 qui seront utiles .ultérieurement pour libérer l'élément mobile 7 du fond 19.
Sur la figure' 5, on a représenté l'étape du procédé dans laquelle on libère l'élément mobile 7. Ceci peut être effectué par dissolution de la couche de Si02 recouvrant le fond 19, au moyen d'acide fluorhydrique introduit par les ouvertures ménagées précédemment entre l'élément mobile 7 et les parois latérales 2 et 22, ainsi que par les trous 8. On obtient ainsi une élimination de la couche 17 sauf sur les parois 2, 22, 9 et 11 du dispositif.
On précise que les techniques utilisables pour réaliser les différentes étapes de fabrication du microsystème sont celles de la microélectronique. On peut en particulier réaliser l'étape de libération de l'élément mobile (figure 5) par le procédé décrit dans la référence 5 : 6 EP-A-605 300. L'utilisation des microtechnologies permet notamment :
- d'améliorer la sensibilité du dispositif (contrôle précis des géométries, des paramètres optiques ou électriques) , - d'améliorer la spécificité de la détection en utilisant plusieurs dispositifs du même type sur une seule plaquette de silicium (redondance, détection multiple) ,
- d'améliorer la fiabilité de la détection en s' affranchissant des problèmes de pollutions localisées ou de réactions non spécifiques, et d'obtenir une réduction du coût de fabrication ( miniaturisation des éléments sensibles, utilisation des techniques collectives d'hybridation et de packaging développées pour les microsystèmes) .
Ainsi, ces dispositifs fabriqués par des procédés de microtechnologies offriront-ils aux utilisateurs finaux, - notamment aux laboratoires d'analyse décentralisés, l'avantage d'une haute praticabilité.
Le microsystème représenté sur les figures 1 et
2 peut être utilisé pour des analyses, en particulier des analyses biologiques, après fixation sur une ou les deux électrodes d'un ligand spécifique L de l' analyte A à détecter.
La fixation du ligand L peut être effectuée par des techniques classiques, par exemple par adsorption sur l'électrode après l'avoir oxydée très superficiellement, ou par formation d'une liaison covalente entre l'électrode et le ligand en utilisant un réactif de couplage bifonctionnel capable de réagir à la fois avec l'électrode et avec le ligand. L'utilisation de tels réactifs est bien connue.
A titre d'exemple de réactif convenant pour le couplage de ligands constitués par des anticorps, des protéines et des peptides, sur le silicium, on peut citer les dérivés de silane comportant un groupe alkoxysilane et un groupe NH2 séparés l'un de l'autre par une chaîne hydrocarbonée. Des techniques de ce type sont décrites dans les références 1, 3 et 4 citées précédemment.
Cette fixation peut aussi être effectuée par les techniques décrites rdans O-A-94/22889 (référence 6) .
Cette fixation est effectuée de préférence avant l'utilisation, avec les électrodes 3 et 5 en position éloignée.
Sur la figure 6, on a représenté schématiquement les électrodes 3 et 5 ainsi qu'une partie du fond 19 et de l'élément mobile 7 du dispositif de la figure 1. Les électrodes sont en position éloignée à -une distance éloignée de, par exemple de 2μm, et elles sont recouvertes de ligand spécifique L.
Pour réaliser cette fixation, on introduit dans la cuve du dispositif les réactifs et le ligand ; on obtient également de ce fait une fixation du ligand sur le fond 19 et sur l'élément mobile 7, comme on peut le voir sur cette figure.
Après fixation du ligand, on introduit dans le dispositif l'échantillon à analyser, les électrodes étant toujours en position éloignée. Lorsque l'échantillon contient l' analyte A, celui-ci vient former avec le ligand L un complexe LA ou couche active d'une épaisseur inférieure à 1000 Â sur les parois des électrodes et du dispositif, comme représenté sur la figure 6.
On contrôle alors la présence ou non de ce complexe, par exemple en rapprochant l'électrode mobile 5 de l'électrode fixe 3 pour avoir une distance rapprochée dr entre les électrodes, qui est par exemple de 2000 Â, soit 0,2 μm, et en effectuant ensuite ou lors de ce rapprochement la mesure d'un paramètre significatif .
La figure 7 représente le dispositif dans cette position où la distance interélectrode dr correspond à une position rapprochée. On remarque ainsi que la couche active (complexe L-A) occupe pratiquement tout l'espace entre les électrodes 3 et 5.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, on détecte la présence de cette couche par une mesure de l'impédance entre les électrodes 3 et
5 en position rapprochée."
Pour cette mesure, on applique aux électrodes 3 et 5 une tension appropriée et on mesure l'intensité du courant circulant dans la cellule. En comparant cette mesure avec une mesure effectuée dans les mêmes conditions en l'absence d' analyte, on peut vérifier si l'épaisseur de la couche sensible a augmenté et en déduire la présence ou non d' analyte.
Selon un second mode de réalisation de l'invention, on détecte la présence de l' analyte dans l'échantillon en déterminant la viscosité de la couche sensible entre les électrodes. Dans ce but, on soumet l'élément mobile à une série de mouvements alternatifs d' éloignement et de rapprochement de l'électrode fixe, par application de tensions appropriées aux électrodes, puis on cesse d'appliquer cette tension d' actionnement de l'élément mobile et on applique une tension de mesure pour déterminer les variation de la capacité entre les électrodes en fonction du temps ; cette capacité dépend de la distance interélectrode et sa variation en fonction du temps traduit l'amortissement du mouvement oscillatoire de l'électrode mobile.
Cet amortissement dépend des frottements et donc de la viscosité de la couche de molécules entre les électrodes, notamment de son épaisseur.
Sur la figure 8, on a représenté l'évolution de la viscosité η du liquide en fonction de la distance d entre les électrodes.
La courbe 1 de cette figure représente cette évolution en l'absence d' analyte.
La courbe 2 représente cette évolution en présence d' analyte.
Dans les deux cas_, on constate que la viscosité ne varie pas significativement lorsque la distance interélectrode reste -supérieure à l'épaisseur des couches du ligand seul ou des couches du complexe ligand-analyte .
En revanche, lorsque l'électrode pénètre dans ces couches , la viscosité augmente. En l'absence d' analyte, l'épaisseur des couches étant plus faible, on obtient cette augmentation lorsque la distance interélectrode a l'épaisseur d]_ .
En présence d' analyte, cette augmentation de la viscosité se produit plus tôt lorsque la distance interélectrode a l'épaisseur d2> ι car la couche sensible est plus épaisse qu'en l'absence d' analyte.
Cette augmentation de viscosité peut être détectée après avoir fait osciller l'électrode mobile entre une position rapprochée et une position éloignée, en mesurant la variation capacitive entre les électrodes lors de l'amortissement du mouvement de l'électrode mobile. Bien entendu la position rapprochée doit correspondre à une distance interélectrode inférieure à d_ .
Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, on détecte la présence de l' analyte par mesure des forces de contact entre les électrodes.
Ce troisième mode de réalisation est plus particulièrement utilisé lorsque l' analyte comporte deux sites de reconnaissance pour un ligand spécifique ou pour deux ligands spécifiques différents.
Ce cas est illustré sur la figure 9 où l'on voit les électrodes fixe 3 et mobile 5 en position rapprochée recouvertes respectivement des ligands L et
L' (L' = L ou L'≠ L) , et I' analyte A ou A' qui comporte deux sites de reconnaissance identiques (A) ou différents (A') . L' analyte A ou A' est lié à la fois au ligand de l'électrode 3 et au ligand de l'électrode 5, ce qui correspond à un phénomène de collage entre les électrodes .
Sur la figure 10, on a représenté l'évolution de la force de contact f entre les électrodes en fonction de la distance interélectrode d. La courbe 3 illustre cette évolution en l'absence d' analyte et la courbe 4 illustre cette évolution en présence d' analyte. Ainsi, on remarque que la force de contact augmente rapidement lorsque la distance interélectrode atteint l'épaisseur de la couche sensible, soit di sans analyte, soit d2 > dj avec analyte. Ceci permet donc également de déterminer la présence d' analyte.
Cette force de contact peut être déterminée par mesure de la capacité entre les électrodes et de la tension nécessaire au rapprochement de l'électrode mobile. La valeur de la capacité permet de déterminer la distance interélectrode et la force appliquée dépend de l'épaisseur de la couche sensible.
A titre d'exemple, on a utilisé un dispositif de ce type pour détecter la présence de séquences connues ADN dans un soluté aqueux en utilisant comme ligand la séquence complémentaire d'ADN, et en réalisant la fixation du ligand par greffage sur un polymère lui-même électrodéposé sur les électrodes fixe et mobile.
Références citées
- (1) Battaillard .et al, Analytical Chemistry,
60, 1988, pages 2374-2379.
- (2) Schyber et al, Sensors and Actuators,
B26-27, 1995, pages 457-460. - (3) FR-A-2 598 227
- (4) EP-A-244 326
- (5) EP-A-605 300
- (6) WO-A-94/22889

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de détection ou de dosage d'un analyte dans un échantillon comprenant : - une cellule (1) comportant au moins une électrode fixe (3) et au moins une électrode mobile (5) en regard de l'électrode fixe, l'électrode mobile pouvant être déplacée de façon à se rapprocher et/ou s'éloigner de l'électrode fixe (3), l'espace entre les électrodes formant une cavité de réception de l'échantillon et la paroi d'au moins une des électrodes en regard de la cavité de réception étant capable de fixer un ligand spécifique de l' analyte à détecter,
- des moyens rde déplacement de l'électrode mobile,
- des moyens (21, 23) pour relier séparément les électrodes à un circuit électrique extérieur, et
- des moyens de mesure de l'impédance ou de la capacité électrique entre les électrodes.
2. Dispositif se.lon la revendication 1 dans lequel l'une au moins des électrodes est recouverte d'un ligand spécifique '- (L) de l' analyte (A) à détecter.
3. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel les deux électrodes sont recouvertes d'un ligand
(L, L' ) spécifique de l'analyte à détecter.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les moyens de déplacement de l'électrode mobile sont constitués par des moyens de polarisation de l'électrode fixe et de l'électrode mobile.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la cellule comprend une cuve sur une paroi (2) de laquelle est disposée l'électrode fixe (3), l'électrode mobile (5) est disposée en face de l'électrode fixe sur un élément mobile (7) monté sur la (les) paroi (s) (9, 11) de la cuve par l'intermédiaire d'au moins une poutre flexible (13, 15), de sorte que l'électrode mobile (5) puisse se rapprocher ou s'éloigner de l'électrode fixe (3) par déformation de la poutre flexible, et des contacts électriques (21, 23) sont disposés sur la (les) paroi (s) (2,9) de la cuve, sur ladite poutre flexible (13) et sur l'élément mobile (7) pour relier séparément l'électrode fixe (3) et l'électrode mobile
(5) à un circuit électrique extérieur permettant de polariser les électrodes et de mesurer la capacité entre l'électrode fixe et l'électrode mobile.
6. Dispositif selon la revendication 5 dans lequel les moyens de déplacement de l'électrode mobile sont constitués par des moyens de polarisation de l'électrode fixe et de l'électrode mobile.
7. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel les moyens de déplacement de l'électrode mobile comprennent un second couple d'électrodes formées respectivement sur une paroi de la cuve et sur l'élément mobile de façon à être en regard l'une de l'autre, le dispositif comprenant de plus des moyens de polarisation de ce couple d'électrodes de façon à provoquer le mouvement de l'élément mobile supportant l'électrode mobile.
8. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel les moyens de déplacement de l'électrode mobile sont des moyens magnétiques.
9. Dispositif selon la revendication 8, dans lequel les moyens magnétiques comprennent un aimant permanent (8) placé sur l'élément mobile (7) et des moyens (10) pour appliquer un champ magnétique à cet aimant .
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, dans lequel le fond (19) et la
(les) paroi (s) (2, 9, 11, 22) de la cuve sont formés de silicium, la (les) paroi (s) sont séparées du fond par une couche (17) de silice isolante, l'élément mobile (7) et les poutres flexibles ( 13, 15) sont également formés de silicium, et les électrodes (3, 5) sont formées de silicium rendu conducteur par implantation d' ions .
11. Procédé de détection ou de dosage d'un analyte dans un échantillon liquide (conducteur de l'électricité), comprenant les étapes suivantes : a) introduire ledit échantillon dans une cellule comprenant au moins une électrode fixe et au moins une électrode mobile située en regard de l'électrode fixe, ladite électrode mobile pouvant être déplacée de façon à se rapprocher ou s'éloigner de l'électrode fixe, l'une au moins desdites électrodes étant revêtue d'un ligand spécifique de l' analyte à détecter et l'échantillon étant introduit entre les électrodes avec l'électrode mobile dans une position éloignée de l'électrode fixe ; b) déplacer au moins une fois l'électrode mobile pour la rapprocher de l'électrode fixe ou pour la faire osciller entre une position rapprochée et une position éloignée de l'électrode fixe ; et c) mesurer, lors de ce déplacement ou après ce (s) déplacement (s) , un paramètre représentatif de la formation ou non, entre les électrodes, d'une couche sensible obtenue par réaction du ligand avec l' analyte à détecter.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'électrode fixe et l'électrode mobile sont toutes deux recouvertes de ligand.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, dans lequel, dans l'étape b) , on déplace en une seule fois ou en plusieurs fois l'électrode mobile pour la rapprocher de l'électrode fixe, et on mesure ensuite après chaque déplacement, dans l'étape c) , l'impédance électrique entre les électrodes, la valeur mesurée étant comparée à une valeur de référence déterminée en l'absence d' analyte.
14. Procédé selon la revendication 11 ou 12, dans lequel, dans l'étape b) , on déplace plusieurs fois l'électrode mobile pour la faire osciller entre une position rapprochée et une position éloignée, puis après ces déplacements, on mesure dans l'étape c) , la capacité entre les électrodes en fonction du temps.
15. Procédé selon la revendication 11 ou 12, dans lequel, dans l'étape b) , on déplace une seule fois l'électrode mobile pour la rapprocher de l'électrode fixe, et on mesure - dans l'étape c) lors de ce déplacement la capacité entre les électrodes et la force appliquée pour rapprocher l'électrode mobile.
16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel l' analyte présente deux sites de reconnaissance respectivement vis-à-vis d'un premier ligand recouvrant l'électrode fixe et vis-à-vis d'un deuxième ligand recouvrant l'électrode mobile.
17. Procédé selon la revendication 15, dans lequel l' analyte présente deux sits de reconnaissance respectivement vis-à-vis de deux ligands mélangés et recouvrant à la fois l'électrode fixe et l'électrode mobile .
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, dans lequel la distance maximale entre les électrodes est de 1 à 10 μm et la distance minimale entre les électrodes est de 0,1 à 0,5 μm.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 18, dans lequel le couple analyte- ligand (s) est choisi parmi les couples antigène- anticorps, haptène-anticorps, hormone-récepteur ADNC-ADN, ARNC-ARN, et enzyme-substrat.
20. Procédé de fabrication d'un dispositif de détection selon la revendication 10, comprenant les étapes suivantes :
1) formation sur un substrat de silicium comportant une couche de silice enterrée, de zones conductrices de l'électricité correspondant aux électrodes du dispositif, par implantation d'ions à travers un masque,
2) gravure du substrat jusqu'à la couche de silice enterrée pour définir dans celui-ci la (les) paroi (s) de la cuve," l'élément mobile et la (les) poutre (s) flexible (s), 3) élimination de la couche de silice enterrée sauf sur les parties qui correspondent aux parois de la cuve, et
4) formation de contacts électriques sur la (les) paroi (s) de la cuve et la poutre flexible permettant de relier séparément les électrodes à un circuit extérieur.
21. Procédé selon la revendication 20, comprenant en outre une étape de fixation d'un ligand spécifique sur la (les) électrodes du dispositif.
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