[go: up one dir, main page]

WO1998029732A1 - Verfahren und vorrichtung zur bewegungserfassung an mikroskopischen objekten - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur bewegungserfassung an mikroskopischen objekten Download PDF

Info

Publication number
WO1998029732A1
WO1998029732A1 PCT/EP1997/007218 EP9707218W WO9829732A1 WO 1998029732 A1 WO1998029732 A1 WO 1998029732A1 EP 9707218 W EP9707218 W EP 9707218W WO 9829732 A1 WO9829732 A1 WO 9829732A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
detector means
detector
partial area
micro
imaged
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP1997/007218
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Günter FUHR
Thomas Schnelle
Henning Glasser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evotec Biosystems GmbH
Original Assignee
Evotec Biosystems GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19723873A external-priority patent/DE19723873B4/de
Application filed by Evotec Biosystems GmbH filed Critical Evotec Biosystems GmbH
Publication of WO1998029732A1 publication Critical patent/WO1998029732A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01P—MEASURING LINEAR OR ANGULAR SPEED, ACCELERATION, DECELERATION, OR SHOCK; INDICATING PRESENCE, ABSENCE, OR DIRECTION, OF MOVEMENT
    • G01P3/00—Measuring linear or angular speed; Measuring differences of linear or angular speeds
    • G01P3/64—Devices characterised by the determination of the time taken to traverse a fixed distance
    • G01P3/80—Devices characterised by the determination of the time taken to traverse a fixed distance using auto-correlation or cross-correlation detection means
    • G01P3/806—Devices characterised by the determination of the time taken to traverse a fixed distance using auto-correlation or cross-correlation detection means in devices of the type to be classified in G01P3/68
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1484—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry microstructural devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1027—Determining speed or velocity of a particle
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for automatic motion detection on microscopic particles, in particular for measuring the speed of rotations or at least partially periodic transverse movements of such particles, such as e.g. for measuring rotational and oscillatory movements of biological cells or biological cell components in aqueous suspensions.
  • characteristic object movements are used which are induced by electrical rotating and alternating fields (overview in U. Zimmermann et al. "Electro-manipulation of cells "CRC Press Inc., 1996).
  • the object movement can be, for example, a rotation or an oscillation on a straight or curved movement path.
  • Passive electrical properties of the moving objects can be concluded from the movement properties (e.g. speed, deflection from an equilibrium position).
  • Characteristic oscillation speeds of the objects range from 100 revolutions (or oscillations) per second up to 1 revolutions (or oscillation) per minute, typically below 1 revolution or oscillation per second.
  • the object rotation is proportional to the imaginary part of the Clausius-Mosotti factor, while the oscillatory movement in an inhomogeneous alternating field to the real part of it Factor corresponds (see TB John's "Electromechanics of Particles", Cambridge University Press, Cambridge, 1995).
  • Automatic rotation measurements are e.g. B. from DE-OS 33 25 843 or DD-WP 281 223 (1986) known. In this measurement, alternating electrical fields are applied to induce different directions of rotation. The switch-on times are varied until the object stops. This method is disadvantageous because of the expenditure of tax and time and because of the necessity that the object standstill had to be determined by visual observation.
  • the object of the invention is to provide an improved method for motion detection on microscopic objects, with which, in particular, a rapid and automatable motion measurement is made possible even on individual particles and which has an extended area of application.
  • the method is intended to detect any periodic movements, in particular both rotational and oscillating movements.
  • the object of the invention is also to provide a device for implementing the method.
  • the invention is based on the idea of capturing an image of the moving object to be examined with at least one detector means, recording a detector signal of the detector means over several object rotations or oscillations and subjecting it to a Fourier and / or correlation analysis. Part of the object is preferably image captured.
  • the Fourier and correlation analysis is carried out according to conventional algorithms known per se and is therefore not described in detail here.
  • the analysis provides the frequency of object rotation or oscillation and integer multiples thereof.
  • the actual particle movement can be inferred from the amplitude and frequency of the analysis signals.
  • the direction of movement (the rotation or translation) can be acquired from the phase shift of the correlation signals.
  • the use of several detector means is not absolutely necessary. Rather, it is also possible to detect the object movement with a single detector.
  • a device comprises imaging means for generating an enlarged object image, at least one detector means which is set up to detect a partial area of the object image, and signal processing and computing means.
  • the imaging means are preferably integrated into the beam path of a microscope or are formed by a display means coupled to a microscope.
  • the movement detection according to the invention has the advantage that a relatively small number of serial measured values are recorded, stored and processed. Pattern or image recognition is not necessary, so that the information density to be processed is greatly reduced. Due to the small amount of data, the Fourier and correlation analyzes can be carried out quickly and with high accuracy. The object movement can be recorded in real time. The present observation limits can be overcome with the invention. Thus, according to the invention, the detection of previously unresolvable particle movements with frequencies below 2 vibrations per second can be recorded.
  • the motion detection according to the invention can be easily automated. It is easy to observe individual objects or a large number of objects simultaneously.
  • a preferred use of the invention is the determination of passive electrical properties of biological objects which are arranged in a field cage by means of negative dielectrophoresis and are set in motion in a floating state by applying rotating electrical or periodically changing alternating fields.
  • a particular advantage of the invention is that it enables the movement of microscopically enlarged particles to be detected, which, in contrast to the movement of macroscopic workpieces, for example, can react much more sensitively to environmental disturbances (thermal movement, solvent flows) than a clamped workpiece.
  • the application of Fourier analysis or correlation techniques to micro objects is realized for the first time.
  • FIG. 1 a block diagram of an embodiment of a measuring arrangement according to the invention
  • Fig. 5 Curve representation of the signal curves in the detection of the rotation of a pollen grain according to the invention
  • the invention is described below using the example of rotation measurement on synthetic or biological objects that are manipulated with a microelectrode arrangement and observed with a light microscope.
  • the invention can be used in the same way for the detection of periodic translation movements on straight or curved particle paths or of periodic pivoting movements (rotation with reversal of direction).
  • the implementation of the invention is not tied to the combination with microelectrode arrangements and microscope observations, but is generally applicable to the motion detection of any objects.
  • a device contains an electrode arrangement 12 for forming a microfield cage in which a microscopic object 11 (size approximately 500 ⁇ m or less) is set in a periodic movement (rotation or transverse oscillation).
  • the imaging means comprise a light microscope 13 with an electronic image acquisition (video camera 14), possibly a simultaneously operated video recorder 15, a video signal TD iQ
  • FIGS. 3, 4, 5 and 7 show detector signals obtained according to the invention and their processing.
  • the curves show a the time dependence of the detector signal (voltage or current profile of a photoelement signal), b the Fourier transform (amplitude depending on the time) of the detector signal according to a and c the autocorrelation function (relative units depending on the time) the detector signal according to a.
  • FIG. 3 illustrates the measurement on a well-contrasted object (artificial dielectric body).
  • the actual rotation speed was 2 U / s.
  • the detector signal a is subject to periodic fluctuations which correspond to the object rotation.
  • the Fourier transform b provides a maximum amplitude at the rotation frequency and less contributions at the higher harmonics (4 or 6 Hz).
  • the autocorrelation function c which also shows a convolution of the detector signal a, including a predetermined delay time, has corresponding maxima at multiples of the period.
  • FIGS. 4 and 5 show corresponding measurements on a lymphocyte (diameter 15 ⁇ m) or a pollen grain from Corylus Avellana.
  • the detector means comprises several photo elements, each of which records a different partial area of the observed object, the period can also be recorded d Hi
  • a particular advantage of the invention resides in the ability to combine the motion detection with other autocorrelation measurements.
  • a preferred use of the invention is in combination with optical autocorrelation measurements, in particular with fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FCS measuring arrangements with a confocal pinhole WO 94/16313
  • FCS with a laser-induced two-photon FCS EP-A 0 762 114, US-A-5 034 613
  • a near-field microscopic arrangement with which substance-specific parameters of one or more molecules are determined by means of correlation spectroscopy (WO 96/13744).
  • the invention can also be used with advantage in any other confocal measuring arrangement.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

Die periodische Bewegung eines mikroskopisch kleinen Objekts wird erfasst, indem eine vergrösserte Abbildung des Objekts erzeugt und mit einem Detektormittel ein Teilbereich des Objekts erfasst wird. Das Detektormittel stellt ein Detektorsignal bereit, dessen Zeitabhängigkeit charakteristisch für die Zeitabhängigkeit der Objektbewegung ist. Das Detektorsignal wird digitalisiert und einer Fourier- und/oder Korrelations-Analyse unterzogen.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Bewegungserfassung an mikroskopischen Objekten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatischen Bewegungserfassung an mikroskopisch kleinen Teilchen, insbesondere zur Messung der Geschwindigkeit von Rotationen oder zumindest teilweise periodischen transversalen Bewegungen derartiger Teilchen, wie z.B. zur Messung von Rotations- und Oszillationsbewegungen biologischer Zellen oder biologischer Zellbestandteile in wässrigen Suspensionen.
Zur Charakterisierung von Mikroobjekten (wie z.B. Latexpartikel, lebende Zellen usw.), die in Flüssigkeit suspendiert sind, werden charakteristische Objektbewegungen verwendet, die über elektrische Rotations- und Wechselfelder induziert werden (Übersicht in U. Zimmermann et al . "Electro-manipulation of Cells" CRC Press Inc., 1996). Die Objektbewegung kann beispielsweise eine Rotation oder eine Oszillation auf einer geradlinigen oder gekrümmten Bewegungsbahn sein. Aus den Bewegungseigenschaften (z.B. Geschwindigkeit, Auslenkung aus einer Gleichgewichtslage) kann auf passive elektrische Eigenschaften der bewegten Objekte geschlossen werden. Charakteristische Oszillationsgeschwindigkeiten der Objekte liegen im Bereich von 100 Umdrehungen (oder Schwingungen) pro Sekunde bis zu 1 Umdrehung (oder Schwingung) pro Minute, typischerweise unterhalb von 1 Umdrehung oder Schwingung pro Sekunde.
Die Objektrotation verhält sich proportional zum Imaginärteil des Clausius-Mosotti-Faktors, während die oszillatorische Bewegung in einem inhomogenen Wechselfeld dem Realteil dieses Faktors entspricht (s. T.B. Johns "Elektromechanics of Particles", Cambridge University Press, Cambridge, 1995).
Die Erfassung passiver elektrischer Eigenschaften biologischer Objekte hat sich in der Biologie und Medizin als hochauflösendes Untersuchungsverfahren erwiesen, das mit Impedanz- messungen vergleichbar ist. Nachteilig ist jedoch, daß die Rotation oder transversale Bewegung eines Objektes bislang entweder durch visuelle Beobachtung oder durch aufwendige technische Verfahren bestimmt werden muß. Ferner ist es bislang unmöglich, sowohl den Imaginär- als auch den Realteil des Clausius-Mosotti-Faktors an einzelnen Mikroobjekten automatisch zu erfassen. Dies wäre jedoch insbesondere bei kompliziert aufgebauten Objekten von Bedeutung, da die Real- und Imaginär-Teile mit der Kramers-Kronig-Beziehung ineinander überführbar sind, so daß eine Kontrolle der Meßwerte bzw. der verwendeten Modelle möglich wäre. Ein weiterer Nachteil ist, das mit der direkten (visuellen) Beobachtung nur relativ langsame Bewegungen genügend genau meßbar sind (langsamer als 1 Umdrehung pro Sekunde) .
Automatische Rotationsmessungen sind z. B. aus DE-OS 33 25 843 oder DD-WP 281 223 (1986) bekannt. Bei dieser Messung werden elektrische Wechselfelder zur Induzierung unterschiedlicher Drehrichtungen appliziert. Die Anschaltzeiten werden so lange variiert, bis das Objekt still steht. Diese Methode ist wegen des Steuer- und Zeitaufwandes und wegen der Notwendigkeit nachteilig, daß der Objektstillstand durch visuelle Beobachtung bestimmt werden mußte.
Es ist ferner allgemein bekannt, die Bewegung komplex strukturierter Objekte mit Bildverarbeitungssystemen zu erfassen. Mikroskopische Objektbilder werden in zeitlicher Folge aufgenommen, gespeichert und über eine Raum-Transformation einer Vielzahl von Bildpunkten zur Bewegungskonstruktion bearbeitet. Dies ist nachteilig, da eine hohe Informationsdichte zu verarbeiten ist, was die Rechnerverarbeitung lang- wierig und aufwendig gestaltet. Zusätzliche Probleme treten bei Veränderungen der Objektstruktur während der Messung auf, falls sich z.B. die Fokusebene verlagert oder falls die Objekte einen schwachen Kontrast besitzen.
Von J. Gimsa et al . ("Electro-rotation of Particles by Dynamic Light Scattering - A new dielectric spectroscopy technique", Colloids and Surfaces A: Band 98, S. 423 ff., 1995) wird eine automatische Bewegungsmessung unter Verwendung der dynamischen LichtStreuung beschrieben. Dieses Verfahren ist jedoch in seiner Anwendbarkeit beschränkt, da es nicht an einzelnen Objekten einsetzbar ist, sondern lediglich Mittelwerte über eine Vielzahl von Partikeln liefert, die sich in einem Meßstrahl befinden. In der Regel handelt es sich dabei mindestens um 100 Partikel.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Bewegungserfassung an mikroskopisch kleinen Objekten anzugeben, mit dem insbesondere eine schnelle und automatisierbare Bewegungsmessung selbst an einzelnen Teilchen ermöglicht wird und das einen erweiterten Anwendungsbereich besitzt. Mit dem Verfahren sollen beliebige periodische Bewegungen, insbesondere sowohl Rotations- als auch Oszillationsbewegungen erfaßt werden. Aufgabe der Erfindung ist es ferner, eine Vorrichtung zur Implementierung des Verfahrens anzugeben.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren und eine Vorrichtung mit den Merkmalen entsprechen den Patent- Sprüchen 1 bzw. 12 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Die Erfindung beruht auf der Idee, mit mindestens einem Detektormittel eine Abbildung des zu untersuchenden, bewegten Objekts zu erfassen, ein Detektorsignal des Detektormittels über mehrere Objektdrehungen oder -Oszillationen aufzunehmen und einer Fourier- und/oder Korrelations-Analyse zu unterziehen. Mit dem Detektormittel wird vorzugsweise ein Teil des Objekt- bildes erfaßt. Die Fourier- und Korrelations-Analyse erfolgt nach an sich bekannten, herkömmlichen Algorithmen und wird daher hier im einzelnen nicht beschrieben. Die Analyse liefert die Frequenz der Objektrotation oder -Oszillation und ganzzahlige Vielfache von dieser. Aus der Amplitude und Frequenz der Analysensignale kann auf die tatsächliche Partikelbewegung rückgeschlossen werden.
Werden zwei oder mehrere Detektormittel zur Teilbilderfassung verwendet, so kann aus der Phasenverschiebung der Korrelations- signale die Bewegungsrichtung (der Rotation oder Translation) erfaßt werden. Der Einsatz mehrerer Detektormittel ist jedoch nicht zwingend erforderlich. Vielmehr ist es auch möglich, die Objektbewegung mit einem einzelnen Detektormittel zu erfassen.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt Abbildungsmittel zur Erzeugung eines vergrößerten Objektbildes, mindestens ein Detektormittel, das dazu eingerichtet ist, einen Teilbereich des Objektbildes zu erfassen, und Signalbearbeitungs- und Rechenmittel. Die Abbildungsmittel sind vorzugsweise in den Strahlengang eines Mikroskops integriert oder werden durch ein mit einem Mikroskop gekoppeltes Anzeigemittel gebildet.
Die erfindungsgemäße Bewegungserfassung besitzt den Vorteil, daß eine relativ geringe Anzahl serieller Meßwerte erfaßt, gespeichert und verarbeitet wird. Eine Muster- oder Bilderkennung ist nicht erforderlich, so daß die zu verarbeitende Informationsdichte stark reduziert ist. Aufgrund der geringen Datenmengen lassen sich die Fourier- und Korrelations-Analysen schnell und mit hoher Genauigkeit ausführen. Die Objekt - bewegung kann in Echtzeit erfaßt werden. Mit der Erfindung können die bisherigen Beobachtungsgrenzen überwunden werden. So ist erfindungsgemäß die Erfassung von bisher nicht auflösbaren Partikelbewegungen mit Frequenzen unterhalb von 2 Schwingungen pro Sekunde erfaßbar. Die erfindungsgemäße Bewegungserfassung ist leicht automatisierbar. Es lassen sich ohne weiteres einzelne Objekte oder simultan eine Vielzahl von Objekten beobachten.
Eine bevorzugte Verwendung der Erfindung ist die Ermittlung passiver elektrischer Eigenschaften biologischer Objekte, die in einem Feldkäfig mittels negativer Dielektrophorese angeordnet und durch Anlegen rotierender elektrischer oder sich periodisch ändernder Wechselfelder in einem schwebenden Zustand in die jeweilige Bewegung versetzt werden.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die Erfassung der Bewegung mikroskopisch vergrößerter Partikel ermöglicht wird, die im Unterschied etwa zur Erfassung der Bewegung makroskopischer Werkstücke wesentlich empfindlicher auf Umgebungsstörungen (thermische Bewegung, Lösungsmittel- Strömungen) reagieren können als ein eingespanntes Werkstück. Mit der Erfindung wird erstmalig die Anwendung von Fourier- Analyse- oder Korrelations-Techniken an Mikroobjekten realisiert .
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im folgenden in Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1: eine Blockdarstellung einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Meßanordnung;
Fig. 2: Beispiele mikroskopischer Abbildungen von biologischen Zellen;
Fig. 3: Kurvendarstellungen der Signalverläufe bei der erfindungsgemäßen Erfassung der Rotation eines synthetischen Objekts; Fig. 4: Kurvendarstellungen der Signalverläufe bei der erfindungsgemäßen Erfassung der Rotation eines Lymphozyten;
Fig. 5: Kurvendarstellung der Signalverläufe bei der erfindungsgemäßen Erfassung der Rotation eines Pollenkornes ;
Fig. 6: eine Kurvendarstellung zur Illustration von Vorteilen der erfindungsgemäßen Bewegungserfassung; und
Fig. 7: weitere Kurvendarstellungen der Signalverläufe bei der erfindungsgemäßen Erfassung der Rotation eines synthetischen Objekts.
Im folgenden wird die Erfindung am Beispiel der Rotations- messung an synthetischen oder biologischen Objekten, die mit einer Mikroelektrodenanordnung manipuliert und mit einem Lichtmikroskop beobachtet werden, beispielhaft beschrieben. Die Erfindung ist jedoch in gleicher Weise bei der Erfassung von periodischen Translationsbewegungen auf geraden oder gekrümmten Teilchenbahnen oder von periodischen Schwenkbewegungen (Drehung mit Richtungsumkehr) einsetzbar. Außerdem ist die Realisierung der Erfindung nicht an die Kombination mit Mikroelektrodenanordnungen und Mikroskopbeobachtungen gebunden, sondern allgemein bei der Bewegungserfassung beliebiger Objekte anwendbar.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung enthält entsprechend der schematischen Übersicht gemäß Fig. 1 eine Elektrodenanordnung 12 zur Bildung eines Mikrofeldkäfigs, in dem ein mikroskopisch kleines Objekt 11 (Größe ungefähr 500 μm oder geringer) in eine periodische Bewegung (Rotation oder transversale Oszillation) versetzt wird. Die Abbildungsmittel umfassen beim dargestellten Beispiel ein Lichtmikroskop 13 mit einer elektronischen Bilderfassung (Videokamera 14) , gegebenenfalls einem simultan betriebenen Videorecorder 15, einem Videosignal- TD iQ
CD CD
F CD
P- F-
0 CQ
D. d
P- CD ra rt
Ω CD tr F
CD tTJ t CD
CD
Hl CD d
CD Ω
PT tr et et
P- d
< d
P- CQ rt ra
PJ= F et P-
CQ Ω
PJ= tr d rt fr d
CD d
F CQ d d $,
CQ : tr
Di F
CD CD
CQ d fr o tr fr
CD
CD F
PT et ? tQ 0 rt
CQ l rt rt
PJ P- rt 0 rt d
Hi
P- CD d P- fr d
CD CD rt
Figure imgf000009_0001
CO
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
P-
3
^i
PJ
Φ
Φ
P- d
Φ
F
^ d
0
F
Φ ra
N
Φ d tsi
3 φ
CD tQ d d P1
CQ o
<
0
F
CQ
Φ ra φ tr
Φ d ra φ
F- d
Figure imgf000012_0001
In den Figuren 3, 4, 5 und 7 sind erfindungsgemäß gewonnene Detektorsignale und ihre Bearbeitung dargestellt. Dabei zeigen jeweils die Kurvenverläufe a die Zeitabhängigkeit des Detektorsignals (Spannungs- oder Stromverlauf eines Photoelement- Signals) , b die Fourier-Transformierte (Amplitude in Abhängigkeit von der Zeit) des Detektorsignals gemäß a und c die Autokorrelationsfunktion (relative Einheiten in Abhängigkeit von der Zeit des Detektorsignals gemäß a.
Fig. 3 illustriert die Messung an einem gut kontrastierten Objekt (künstlicher dielektrischer Körper) . Die tatsächliche Rotationsgeschwindigkeit lag bei 2 U/s. Das Detektorsignal a unterliegt periodischen Schwankungen, die der Objektrotation entsprechen. Die Fourier-Transformierte b liefert eine maximale Amplitude bei der Rotationsfrequenz und geringere Beiträge bei den höheren Harmonischen (4 bzw. 6 Hz) . Die Autokorrelationsfunktion c, die eine Faltung des Detektorsignals a mit sieht selbst unter Einbeziehung einer vorbestimmten Verzöge- rungsszeit darstellt, besitzt entsprechende Maxima bei den Vielfachen der Periodendauer. Die Signalanalysen b bzw. c liefern Werte für die Periodendauer von T = 0.502 s bzw. T = 0.501 s. Die Abweichung liegt somit unterhalb von 2% in Bezug auf den erwarteten Wert 0.5 s . Diese hohe Genauigkeit der Bewegungserfassung stellt einen entscheidenden Vorteil dar.
Die Figuren 4 und 5 zeigen entsprechende Messungen an einem Lymphozyten (Durchmesser 15 μm) bzw. einem Pollenkorn von Corylus Avellana.
Es ist erfindungsgemäß möglich, ausschließlich die Fourier- Analyse oder ausschließlich die Autokorrelations-Analyse durchzuführen. Zur Erhöhung der Meßgenauigkeit wird jedoch eine Kombination von beiden analytischen Verfahren bevorzugt.
Falls das Detektormittel mehrere Photoelemente umfaßt, die jeweils einen anderen Teilbereich des beobachteten Objekts aufnehmen, kann zusätzlich zur Erfassung der Periodendauer d Hi
Φ Φ tr F
3 d tr Φ
JD
F
• F- φ
03
F-
Pi
3
F- φ fr φ
F tr
0
Hl
F φ iD d φ d
N fr φ
CQ
2
0 d
P- rt
0
F
CD
^-^ σi o
X
N
—
Φ d rt
Figure imgf000014_0001
Ein besonderer Vorteil der Erfindung beruht in der Kombinierbarkeit der Bewegungserfassung mit anderen Autokorrelationsmessungen. So besteht eine bevorzugte Verwendung der Erfindung in der Kombination mit optischen Autokorrelationsmessungen, insbesondere mit der Fluoreszenz - Korrelations-Spektroskopie (FCS) . Hierzu zählen beispielsweise FCS-Meßanordnungen mit einer confokal angeordneten Lochblende (WO 94/16313) , mit einer laserinduzierten Zwei-Photonen-FCS (EP-A 0 762 114, US-A-5 034 613) oder mit einer nahfeld- mikroskopischen Anordnung, mit der Stoffspezifische Parameter eines oder mehrerer Moleküle mittels Korrelationsspektroskopie ermittelt werden (WO 96/13744) .
Die Erfindung kann jedoch mit Vorteil auch bei beliebigen anderen confokalen Meßanordnungen angewendet werden.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Bewegungserfassung eines Mikroobjekts (11), das sich zumindest zeitweilig periodisch in einem Mikrofeld- käfig einer Mikroelektrodenanordnung (12) bewegt, wobei mit einem Mikroskop eine vergrößerte Abbildung des Objekts auf mindestens ein Detektormittel (18) derart erfolgt, daß das Detektormittel einen Teilbereich des Objekts erfaßt, und wobei ein Detektorsignal des Detektormittels über den Zeitraum einer Mehrzahl von Bewegungsperioden des Objekts aufgenommen und einer Fourier-Analyse und/oder einer Korrelationsanalyse unterzogen wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zur Objektabbildung das zu beobachtende Objekt mit einem optischen System auf das Detektormittel abgebildet wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Abbildung derart erfolgt, daß das Detektormittel einen Teilbereich des Objekts erfaßt .
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem der Teilbereich weniger als 50% der abgebildeten Objektoberfläche umfaßt.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Objektabbildung unter Verwendung eines Mikroskops, eines Videosystems und eines Anzeigemonitors erfolgt, wobei das Detektormittel mindestens ein Photoelement umfaßt, das auf der Bildschirmfläche des Monitors in einem Teilbereich des abgebildeten Objekts angebracht wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem mindestens zwei Photoelemente mit Abstand im Bereich des abgebildeten Objekts vorgesehen sind und die Phasenverschiebung zwischen den Korrelationssignalen erfaßt wird, die aus den Detektorsignalen der Photoelemente ermittelt sind.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem zur Objektabbildung ein Teilbereich des Objekts auf ein Detektormittel abgebildet wird, das im Strahlengang eines Mikroskops vorgesehen ist.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die beobachteten Objekte suspendierte Mikropartikel in elektrischen Hochfrequenz-Feldkäfigen sind.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem simultan zur Bewegungserfassung eine korrelationsspektros- kopische Messung erfolgt.
10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem zur Objektabbildung das Objekt im Mikrofeldkäfig mit Anregungslicht bestrahlt wird und das Detektormittel zur Erfassung der Eigenfluoreszenz des Objekts eingerichtet ist.
11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Objekt durch eine biologische Zelle oder Zellbestandteile oder durch einen dielektrischen Körper gebildet wird.
12. Vorrichtung zur Bewegungserfassung eines Mikroobjekts (11) in einem Mikrofeldkäfig einer Mikroelektrodenanordnung (12) , mit einem Mikroskop (13) zur Erzeugung einer Objekt- abbildung, Detektormitteln (18) zur Erfassung eines Teilbereichs des Objekts und Signalbearbeitungs- und Rechenmitteln zur Bearbeitung der Signale der Detektormittel mit einer Fourier-Analyse und/oder einer Korrelationsanalyse.
13. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, bei der als Abbildungsmittel ein Lichtmikroskop, ein Videosystem und ein Monitor vorgesehen sind, auf dessen Bildschirmfläche das Detektormittel angebracht ist, das aus mindestens einem Photoelement besteht.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, bei dem als Abbildungsmittel ein Lichtmikroskop vorgesehen ist, in dessen Strahlengang das Detektormittel angebracht ist .
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 13 oder 14, bei dem das Detektormittel dazu eingerichtet ist, einen Teilbereich des Objektes zu erfassen und ein Detektorsignal bereitzustellen, dessen Zeitabhängigkeit charakteristisch für die Zeitabhängigkeit der Objektbewegung ist.
16. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, die eine Mikroelektrodenanordnung enthält, die zur Manipulierung mikroskopischer kleiner Objekte unter Wirkung von Hochfrequenzfeldern und zur optisch-mikroskopischen Beobachtung eingerichtet ist.
17. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, die eine Meßanordnung zur Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie enthält.
PCT/EP1997/007218 1997-01-01 1997-12-19 Verfahren und vorrichtung zur bewegungserfassung an mikroskopischen objekten Ceased WO1998029732A1 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19700004.5 1997-01-01
DE19700004 1997-01-01
DE19723873.4 1997-06-06
DE19723873A DE19723873B4 (de) 1997-06-06 1997-06-06 Verfahren und Vorrichtung zur Bewegungserfassung eines sich zumindest zeitweilig periodisch bewegenden Objekts

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998029732A1 true WO1998029732A1 (de) 1998-07-09

Family

ID=26032931

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1997/007218 Ceased WO1998029732A1 (de) 1997-01-01 1997-12-19 Verfahren und vorrichtung zur bewegungserfassung an mikroskopischen objekten

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO1998029732A1 (de)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000045147A3 (de) * 1999-01-26 2000-11-30 Evotec Biosystems Ag Verfahren und vorrichtung zur detektion mikroskopisch kleiner objekte
WO2001069241A3 (en) * 2000-03-15 2002-04-18 Aviva Biosciences Corp Apparatus and method for high throughput electrorotation analysis
US6448794B1 (en) 2000-03-15 2002-09-10 Aviva Biosciences Corporation Apparatus and method for high throughput electrorotation analysis
DE19723873B4 (de) * 1997-06-06 2004-02-05 Evotec Oai Ag Verfahren und Vorrichtung zur Bewegungserfassung eines sich zumindest zeitweilig periodisch bewegenden Objekts
WO2016139925A1 (en) * 2015-03-04 2016-09-09 Sony Corporation Image processing apparatus, image processing method and image processing system
US10586333B2 (en) 2015-03-04 2020-03-10 Sony Corporation Image processing apparatus, image processing method and image processing system

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3942022A (en) * 1974-10-25 1976-03-02 Itek Corporation Rapid response correlation type image motion sensor
US5229849A (en) * 1984-09-17 1993-07-20 University Of Delaware Laser doppler spectrometer for the statistical study of the behavior of microscopic organisms
WO1993016383A1 (en) * 1992-02-08 1993-08-19 Genera Technologies Limited Methods of analysis
WO1994008244A1 (en) * 1992-09-30 1994-04-14 Forskningscenter Risø Method and apparatus for determining the rate of angular rotation of a rotating object

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3942022A (en) * 1974-10-25 1976-03-02 Itek Corporation Rapid response correlation type image motion sensor
US5229849A (en) * 1984-09-17 1993-07-20 University Of Delaware Laser doppler spectrometer for the statistical study of the behavior of microscopic organisms
WO1993016383A1 (en) * 1992-02-08 1993-08-19 Genera Technologies Limited Methods of analysis
WO1994008244A1 (en) * 1992-09-30 1994-04-14 Forskningscenter Risø Method and apparatus for determining the rate of angular rotation of a rotating object

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19723873B4 (de) * 1997-06-06 2004-02-05 Evotec Oai Ag Verfahren und Vorrichtung zur Bewegungserfassung eines sich zumindest zeitweilig periodisch bewegenden Objekts
WO2000045147A3 (de) * 1999-01-26 2000-11-30 Evotec Biosystems Ag Verfahren und vorrichtung zur detektion mikroskopisch kleiner objekte
US6801311B1 (en) 1999-01-26 2004-10-05 Evotec Technologies Gmbh Process and device for the detection of microscopically small objects
WO2001069241A3 (en) * 2000-03-15 2002-04-18 Aviva Biosciences Corp Apparatus and method for high throughput electrorotation analysis
US6448794B1 (en) 2000-03-15 2002-09-10 Aviva Biosciences Corporation Apparatus and method for high throughput electrorotation analysis
US6630835B2 (en) 2000-03-15 2003-10-07 Aviva Biosciences Corporation Apparatus and method for high throughput electrorotation analysis
WO2016139925A1 (en) * 2015-03-04 2016-09-09 Sony Corporation Image processing apparatus, image processing method and image processing system
US10586333B2 (en) 2015-03-04 2020-03-10 Sony Corporation Image processing apparatus, image processing method and image processing system

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60202374T2 (de) Methode und Vorrichtung zur Aufnahme dreidimensionaler Abbildungen von schwebend gehaltenen Mikroobjekten unter Verwendung hochauflösender Mikroskopie
DE69115876T2 (de) Bildgebender Durchflusszytometer
DE2261695C2 (de) Vorrichtung zur Schnellanalyse und zum Sortieren kleiner Teilchen
EP3042177B1 (de) In-vitro-verfahren zum markierungsfreien bestimmen eines zelltyps einer zelle
AT515577B1 (de) Gemeinsamer Strahlungspfad zum Ermitteln von Partikel-information durch Direktbildauswertung und durch Differenzbildanalyse
DE68917064T2 (de) Vorrichtung zur Teilchenanalyse und Verfahren zur Bestimmung des Kernverschiebungsindex.
EP3608828A1 (de) Verfahren zur bereitstellung eines auswertungsmittels für wenigstens ein optisches anwendungssystem einer mikroskopischen anwendungstechnologie
DE2823490A1 (de) Verfahren zur analyse von organismus- zellen
DE102017107348B4 (de) Verfahren zur zytometrischen Analyse von Zellproben
DE2551026C3 (de) Verfahren zur Analysieren von Teilchen
EP1155303B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur detektion mikroskopisch kleiner objekte
EP1797567A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur rastersondenmikroskopie
DE102010007730B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Einstellen eines geeigneten Auswerteparameters für ein Fluoreszenzmikroskop
EP3244197B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur einstellung des laserfokus eines anregungslasers in blut durchflossenen gefässen für optische messungen zur bestimmung des geschlechtes von vogeleiern
WO1998029732A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur bewegungserfassung an mikroskopischen objekten
DE69634619T2 (de) Verfahren zur Teilchenanalyse bei der Durchflusszytometrie
DE60003973T2 (de) Rasterabtastmikroskop
EP3430565B1 (de) Verfahren zur untersuchung verteilter objekte unter segmentierung eines übersichtbildes
DE69221669T2 (de) Gerät zur Messung von Zellen im Urin
DE69214471T2 (de) Vorrichtung und Verfahren zum Messen einer Probe
DE19859460C2 (de) Verfahren und Vorrichtung zur elektro-optischen Einzelpartikelspektroskopie
DE19723873B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Bewegungserfassung eines sich zumindest zeitweilig periodisch bewegenden Objekts
EP3574303B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur untersuchung von zellen
DE102020127071B3 (de) Verfahren und Mikroskop mit einer Einrichtung zum Erfassen von Verlagerungen einer Probe gegenüber einem Objektiv
EP1697722B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur aufnahme mikroskopischer bilder

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase