WO1998021226A1

WO1998021226A1 - H-phosphonate oligonucleotide derivative and process for producing the derivative

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Publication number: WO1998021226A1
Application number: PCT/JP1997/004128
Authority: WO
Inventors: Mitsuo Sekine; Takeshi Wada
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 1998-05-22
Anticipated expiration: 1999-05-13
Also published as: AU4964897A

Description

H-ホスホネ一卜オリゴヌクレオチド誘導体、及び該誘導体の製造方法技術分野

本発明は、新規な H-ホスホネ一卜ォリゴヌクレオチド誘導体、及び該誘導体の製造方法に関する。詳しくは、ホスホジエステラーゼ耐性で、かつ細胞への取り込み効率の高い H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体に関する。背景技術

近年、遺伝子発現を阻害するアンチセンス DNAとして数多くの DNA類似体が合成されている。中でも、ホスホロチォエート型 DNAとメチルホスホネート型 DNAについて広く研究されている。例えば、ホスホロチォェ一ト型 DNAに関しては、ヒト免疫不全ウィルス (HIV) の発現制御 (C.Cazenave et al, Nucleic Acids Res.，15， 10507(1987), W. J. Stec et al, J. Am.Chem. ,106,6077(1984)、 S.Agrawal et al,Pro c.Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7079(1988), T.Vickers et al, Nucleic Acids Res. ,19, 3359(1991)) 、単純へルぺスウィルス（HSV) の発現制御（W.Gao et al,J.Biol. Chem., 2643, 11521(1989)) 、ゥシパピ口一マウィルス（BPV) の発現の制御（L.M .Cowsert et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37, 171 ( 1993 ) ) 、 c-m yc oncogeneの発現制御 (E.L.Wickstrom et al, In Vitro Cell Develop. Biol. ,2 5,297(1989)) 、 BCL-2 oncogeneの発現制御 (J. C. Reed et al,Proc.Natl.Acad. S ci.USA,87， 3660(1990)) 、 I CAM- 1タンパク質の発現制御 (J.A.M.Maier et al,Sc ience., 249, 1570(1990)) や IL- 1？タンパク質の発現制御 (J.Manson et al,Lymp hokine Res. ,9,35(1990)) などが報告されている。また、メチルホスホネート型 MAに関しては、単純へルぺスウィルス（HSV) の発現制御（C.C.Smith et al,Pr oc. Natl. Acad. Sci.USA,83,2785( 1985), M.Koziolkiewicz et al,Chem. Scripta,26 ,251(1986)) 、水疱性口内炎ウィルス (VSV) の発現制御 (C.H.Agris et al，Bio chemistry, 25, 6268(1986)) 、 SV40の発現制御 (P.S.Miller et al,Biochimie,67 ,769(1985)) 、 N-ras oncogeneの発現制御 (D.M.Tidd,Anti-Cancer Drug Design ,3,117(1988)) 、 JGlobinの発現制御 (K. R. Blake, Biochemistry,24,6132( 1985) ) やクロラムフエニコールァセチルトランスフェラ一ゼの発現制御（C.J.Marcus -Sekura, Nucleic Acid Res. ,15,5749(1987)) などが報告されている。

しかしながら、ホスホロチォェ一ト型 DNAには、その二重鎖の安定性が低く、標的とする m A以外のタンパク質とも結合し、非選択的な阻害を惹起するという問題点があった。また、メチルホスホネート型 DNAは、標的 mMAに高い特異性を有しているが、親和性が低いために有効な生物活性を示すためには高濃度で使用しなければならず、さらに、水に対する溶解度が低いため高濃度で細胞に投与できないという問題点があった。

このような問題点を改良すべくいくつかの提案がなされている。例えば、ヒド口キシメチル基を導入することにより、水溶性などを高めたヒドロキシメチルホスホネ一ト型 DNAが提案されている（Bioorganic Chem.22， 128(1994)、 Tetrahedron LeH 8845(1995))。

なお、構造上、二重鎖の安定性が高く、高い水溶性を有し、さらに RNaseの基質になりにくいと考えられる H-ホスホネ一卜オリゴヌクレオチド誘導体としては、その有用性にも関わらず本発明者らの知る限りにおいては、わずかに 2量体のものが報告されているのみである (J. Org. Chem., 49., 139(1984)) 、 Tetrahedron Let t., 29, 2911 (1989), Tetrahedron Lett. ,30,4713( 1989)_s Tetrahedron Lett., l,4 145 (1980) ) 。また、固相担体に結合した状態の H-ホスホネートオリゴヌクレオチドについての報告例もあるが（W090/1202(PCT/US90/01865)) 、固相担体から切り出すと該ヌクレオチドは直ちに加水分解されてしまう。即ち、長鎖の H-ホスホネ一卜オリゴヌクレオチドについては、これまでに合成し、単離された報告例は皆無である。発明の開示

本発明は、新規な H-ホスホネ一卜オリゴヌクレオチド誘導体、及び該誘導体の合成方法を提供することを課題とする。

H -ホスホネートオリゴヌクレオチドは塩基性条件下において極めて不安定である。このため通常の DNA合成における塩基部位のァシル型保護基の除去および固相担体からのオリゴマーの切り出しを行う場合には、用いられるアンモニァ水処理の過程で完全に分解されてしまう。この場合でも、 H-ホスホネートオリゴヌクレォチドの 3'および 5'水酸基に保護基が導入されてレ、れば無水塩基性条件下におレ、ても比較的安定である。しかし、保護基を除去してしまうと、 H-ホスホネート DN Aの 3'末端に存在する遊離の水酸基が 2' -デォキシリボースを介して 5'側に隣接する H-ホスホネ一トジエステルを分子内求核攻撃し、これにより H-ホスホネ一ト DN Aがヌクレオシド 3'， 5' -環状ホスホネートを形成しながら逐次 3，側から分解されてしまう。 H-ホスホネ一ト DNAの 5'末端に存在する遊離の水酸基も同様の反応機構により 2' -デォキシリボ一スを介して 3'側に隣接する H-ホスホネ一トジエステルを分子内求核攻撃し、これにより H-ホスホネート DNAがヌクレオシド 3，，5，- 環状ホスホネートを形成しながら逐次 5'側から分解されてしまう（図 1 A ) 。

そこで、本発明者らは、合成過程における H-ホスホネートオリゴヌクレオチドの塩基性条件下における分解を抑制し、高収率で H-ホスホネートオリゴヌクレオチドを合成する方法について、鋭意研究を行った。この結果、本発明者等は、固相法でォリゴマーを合成する際に、ォリゴマーの 3'末端および 5'末端に適当な鎖長のアルキレン基をもつアルコキシホスホン酸の導入を行うと、オリゴマーの 3，および 5'水酸基とそれにより分子内求核攻撃を受けていた H-ホスホネートジエステルとの分子間距離が離れるため、該水酸基の H-ホスホネ一トジエステルへの攻撃が不可能となり、無水塩基性条件下で反応を行った場合でも、 H-ホスホネートオリゴヌクレオチドの分解が顕著に抑制され（図 1 B ) 、これにより H-ホスホネ一卜オリゴヌクレオチドが効率よく合成されることを見いだした。

本発明の H-ホスホネ一トォリゴヌクレオチド誘導体は、下記一般式（I )で表されるものである。

[式中、 Bは互いに異なっていてもよい、チミン、シトシン、ゥラシル等のピリミジン塩基、アデニン、グァニン等のプリン塩基または 5-メチルシトシン、 5-フルォロウラシル、 5—ヒドロキシメチルシトシン等のそれらの誘導体を表す。 R1は水素原子、メチル基、ェチル基、プロピル基、ブチル基等のアルキル基、ビニル基、ァリル基等のアルケニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、プロピルォキシ基、ブチルォキシ基、メトキシェトキシ基等のアルコキシ基、ァリルォキシ基等のアルケニルォキシ基、またはメチルカルボニル基、ェチルカルボ二ル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等のァシル基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基を表す。 R²は炭素数 1〜； 10、好ましくは、炭素数 6〜8等の分岐していてもよいアルキレン基を表す。また、これらアルキレン基は 1以上の酸素原子を介していてもよい。例えば、

- ( O C H ₂ C H ₂ O -

(式中 Xは、 1〜5の数を表す）等が挙げられる。 Xは酸素原子、硫黄原子、セレン原子、好ましくは酸素原子等のへテロ原子を表す。 nは 1以上、好ましくは、 10〜 30、特に好ましくは、 12~15の数を表す。 ] 本発明の H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体は、例えば、以下の工程からなる方法によって合成することができる。

<反応工程 1 >

この工程は、アルキレン基を導入した固相にモノマーを結合させる工程である (図 5参照）。一般式（II)

R³ - 0 - R² - 0— R⁴ (II)

[式中、 R³は、トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメ卜キシトリチル基、ピキシル基等の保護基を表し、 Γは式

-COCONH-R⁵

(式中、 R⁵はァミノプロピル CPG、長鎖アルキルアミノ CPG、アミノメチルポリスチレン等の担体を表す。）を表し、 R²は前記と同義を表す。 ] で表される化合物の保護基 R³を、通常、約1%のトリフルォロ酢酸/ 11₂(；1₂、約2.5%のトリクロロ酢酸 /CH2CI2, 約 3¾のジクロ口酢酸/ CH₂C1₂などによって除去後、下記一般式（III)

[式中、、Β、および Xは前記と同義を表し、 R⁶は一般式（II)中の R³と同様の保護基を表し、

+

X¹

はトリェチルアンモニゥム、 1，8-ジァザビシクロ [5.4.0] ゥンデ力- 7-ェニゥム、トリプチルアンモニゥム等のアンモニゥム塩、リチウム、ナトリウム、力リウム等の金属塩などのカチォニック塩を表す。 ] で表される塩基モノマー単位と、該モノマー単位に対して、通常、 1〜5当量の脱水縮合剤の存在下、ビリジン、あるいはァセトニトリル—ピリジン（l : l、v/v)中、室温で 1〜10分程度反応させる。上記一般式（I I )で表される化合物および一般式（I I I )で表される塩基モノマ一単位は、後述の実施例に示すような方法によって得ることができる（図 2、図 7参昭) 。

かくして一般式（IV)

[式中、 Β、Χ、、ίί²、Ι1⁴および R⁶は前記と同義を表す. ] で表される化合物を得ることができる。

く反応工程 2 >

この工程は、反応工程 1において得た固相に結合したモノマーに、さらにモノマ一を結合させてヌクレオチド鎖を伸長させる工程である（図 5参照）。

反応工程 1で得られる一般式（IV)で表される化合物の保護基 R⁶を通常、約のトリフルォロ酢酸/ CH₂C1₂などの条件下に除去し、前記一般式（I I I )で表される塩基モノマー単位を反応工程 1の方法と同様にして反応させる。この操作を繰り返し行うことによって式

[式中、 Β，Χ, ，ί1², ，Γ，Ι1⁶および nは前記と同義を表す] で表されるオリゴマーを得ることができる。

<反応工程 3 >

この工程は、反応工程 2で合成したオリゴマーの 5'末端に、縮合剤の存在下、アルキレン基を導入する工程である（図 5参照）。

反応工程 2で得たォリゴマーと一般式（V)

X

II - ₊

R⁷— 0— R²—〇一 P— 0 . X² (V)

I

H

[式中、 R⁷は一般式（II)中の R³と同様、あるいはァクリジン等のインターカレー夕一等の保護基または官能基を表し、

X²

は前記 X¹と同様のカチォニック塩を表し、 R²および Xは前記と同義を表す。 ] とを縮合剤の存在下、ピリジンあるいはァセトニトリル—ピリジン（1:1, v/v)中、室温で 1~10分反応させる。

ここで用いられる縮合剤としては、例えば、式

0

II

RSPX³ で表されるようなリン酸クロリド、式

0

II

R⁸CX³ で表されるようなァシルク口リド、式

0

II

(R⁸C) ₂0 で表されるような酸無水物、式

R PX³ - Y

で表されるようなホスホニゥム塩などが挙げられる。

[式中、 R⁸は互いに異なっていてもよく、メチル基、ェチル基、イソプロピル基、 t -プチル基等のアルキル基、フエニル基等のァリール基、メトキシ基、ェトキシ基、イソプロポキシ基、 t-ブトキシ基等のアルコキシ基、フエノキシ基、へキサフルオロフエノキシ基等のァリールォキシ基、 N， N-ジメチルァミノ基、 N， N- ジェチルァミノ基、 N, N-メチルェチルァミノ基、 N， N-ジフエニルァミノ基等の N, N-ジアルキルアミノ基、 N, N-ジフエニルァミノ基等の N， N-ジァリールァミノ基、ピロリジニル基、ビペリジニル基、モノホニル基等の環状アミン残基等、好ましくは、ビロリジニル基を表す。 X³は、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子

(式中、 Rは水素原子、ハロゲン原子または N0₂を表す。）

(式中、 Rは水素原子または N0₂を表す。）

N = N

- ^Νγ^Ν

R

(式中、 Rは水素原子またはニトロフヱニル基を表す。）

等のァゾリド基、

(式中、 iま水素原子またはフヱニル基を表す。）

— 0-N '

R

(式中、 Rは互いに異なっていてもよいハロゲン原子、 CF₃または N0₂を表す。）

— 0-N' 、、N

N 一。 n

(式中、 Rは互いに異なっていてもよい Cl、 Fまたは N0₂を表し、 mは 0~5の数を表す。）等の活性化エステル、

Y

は塩素イオン、 PF ₆イオン、 BF ₄イオン、 C10₄イオン等のァニオンを表す。 ] 好ましくは、

[式中、 R³はメチル基、ェチル基等の炭素数 1〜 6の低級アルキル基]、例えば、

一

などが挙げられる。

また、本発明においては、 c - x^d · γ (式中、 Γ、 X³および

Υ

は前記と同義を表す）、

+

•X³ · Υ

R R⁸ ₂ Ν'

(式中、、x³および

Y

は前記と同義を表す）、

(式中、 R^s、 X³および

Y

は前記と同義を表す）、または

R

R ''

(式中、 R^s、 X³および

Y

は前記と同義を表す）で表される化合物などを縮合剤として使用することもできる。かくして一般式 (VI )

で表される化合物を得ることができる。

く反応工程 4 >

この工程は、反応工程 3で固相合成された H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体を塩基性条件下で固相から分離し、さらに加水分解により脱保護化して、 H -ホスホネ一卜オリゴヌクレオチド誘導体を単離する工程である（図 6参照）。反応工程 3で得られる一般式 (VI )で表される化合物を、 Ν,Ο-ビストリメチルシリルトリフルォロアセトアミド-プロビルアミン-ァセトニトリノレ（1 :2:2, ν/ν/ν ) 等の無水塩基性の条件下に、通常、室温で 30分〜 1時間反応させ、次いで、濾過により固相担体を除去し、濾液を減圧下留去した後に、ァセトニトリル-水（1 : 1 , ν/ν) またはジォキサン-水（1 : 1 , ν/ν) または THF-水（1 : 1 , ν/ν) で、室温下、 5分間加水分解処理することによって、本発明の前記一般式（I ) で表される Η -ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。

以上の反応工程により得られる本発明の Η-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体は以下のような特徴を有する。

まず、本発明の Η-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体はリン酸部位の立体障害が従来のものに比べて小さく、アンチセンスとして用いた場合、標的遺伝子との二重鎖を形成し易く、ホスホロチォェ一ト型 DNAやメチルホスホネ一ト型 DNA 、さらには、天然型 DNAよりも有利である。また、中性分子であるために、二重鎖を形成したときに相補鎖のリン酸負電荷との静電反発が起こらないため、天然型 DNAよりも安定な二重鎖を形成できる点で有利である。さらに、 DNAのリン酸部に負電荷を持たないため、 RNAとの間に形成される二重鎖は、 DNAの負電荷を認識して Aを分解する酵素である RNaseHの基質となりにくいが、標的遺伝子に対するァンチセンス効果の選択性はホスホロチォェ一ト型 DNAより有利である。さらに、メチルホスホネート型 DNAよりも高い水溶性を有するため、高濃度で細胞に投与することが可能である。

従って、本発明の H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体は、特に、アンチセンスとして有用であり、例えば、 HIV、 HCV、 HCMV、 HSV、 HTLV等のウィルスの増殖に際して生成するメッセンジャー RNA、通常、対象とするウィルスの生存に必須のタンパク質をコードするメッセンジャー RNA、例えば、 HIVの「TAR」、「U5」、「rev」、 rtatj (O.Zelphati,et al. ,Antisense Res. Dev. ,3,323(1993), B.Bo rdier，et al., Nucleic Acids Res. ,20,5999(1992)) 、 HCVの「5に UTR」 (M.Alt, et al.,Hepatology,22, 707(1995)) 、 HSVの「IE110」、「UL30」、「UL37」、「 UL37j (A.Peyman,et al. ,Biol.Chem.Hoppe Seyler，376, 195(1995)、 J.A.Smith, et al., J. Virol, 69, 1925(1995)) 、 HTLV- 1の「tax」などに相補的な塩基配列を有するウィルス増殖阻害剤として、或いは急性および慢性白血病、肝臓癌、乳癌、大腸癌等の腫瘍細胞の増殖に際して特異的に生成するメッセンジャー RNA、通常、対象とする腫瘍細胞の生存に必須のタンパク質をコードするメッセンジャー MA、例えば、急性白血病の「AML- 1」 (C . Sakakura, et al . ,Proc . Natl .Acad. Sci . USA, 91,11723(1994)) 、急性および慢性骨髄白血病に関する「bcr- abl」 (A.M.Tarai ,et al., Blood, 84,601(1994)) 、白血病、その他の癌に関する「c- myc」、「c - m ybj (S.Kimura,et al., Cancer Res.，55, 1379(1995)、 M.Ratajczak,Proc.Natl. A cad. Sci. USA, 89, 11823(1992)_N Y.Mizutani, J. Immunother. Emphasis Tumor Immun ol. ,17,78(1995)) 、大腸癌に関する「APC」、乳癌に関する「BCA - 1」などに相補 14 的な塩基配列を有する腫瘍細胞増殖阻害剤等として使用されうる。このアンチセンスは、通常、 4〜30、好ましくは、 10〜20程度の長さの前記一般式（I )で表されるオリゴヌクレオチド誘導体を有効成分としている。また、その製剤の成分や使用割合などは特に制限はなく、従来アンチセンス治療剤として知られている種々の製剤と同様に使用することができる。

なお、本発明の H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体は合成化学的に、塩基部およびリン酸部に特に保護基を用いる必要がないため、合成反応の工程が短縮され、大量合成にも適している。図面の簡単な説明

図 1は、 H-ホスホネートヌクレオチドの塩基性条件下での挙動を示す図である図 2は、 H-ホスホネートオリゴヌクレオチドの単位となるモノマーの合成法を示す図である。

図 3は、 5'末端のホスホネートの合成法を示す図である。

図 4は、固相へのリンカ一の導入方法を示す図である。

図 5は、 H-ホスホネ一トオリゴヌクレオチドの固相合成の工程を示す図である図 6は、固相合成された H-ホスホネートオリゴヌクレオチドから保護基を除去する工程を示す図である。

図 7は、 H-ホスホネートオリゴヌクレオチドの単位となるモノマーの合成法を示す図である。

図 8は、 5，末端のホスホネートの合成法を示す図である。

図 9は、本発明において用いられる固相へのリンカーの導入方法を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げてさらに本発明を具体的に説明するが、下記の実施例は本発明を制限するものではない。

く実施例 1> H-ホスホネート DNAの化学合成

( 1 ) 縮合剤、 2-ベンゾトリアゾール- 1 -ィルォキシ -1， 3-ジメチル- 2-ピロリジン- 1 -ィル- 1,3，2-ジァザホスホラニゥムへキサフルォロホスフェート（2 - B enzotriazol- 1 -yloxy-l,3-dimethyl-2-pyrrolydin- 1 -yl- 1,3,2-diazaphosp holanium hexaf luorophosphate) (BDPP)の合成

1，3 -ジメチル- 2-ピロリジン- 1-ィル -1，3，2-ジァザホスホレン（1，3- Dimethyl- 2-pyrrolydin-l-yl-l,3,2-diazaphospholane) (F. Ramirez, A. V. Patwardham , H. J. Kugler, C. P. Smith, J. Am. Chem. Soc, 89， 6276 (1967)を参照) ( 4.59 g, 25廳 ol) をよく攪袢した無水 CH₂C1₂ (50 mL)中の卜ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル (1-hydroxybenzotriazol) (3.32g, 25誦 ol) 及び CC (4.8 mL, 5 O mmol)の懸濁液に、アルゴン下、 - 78°Cで、 5分間かけて滴下した。同じ温度で 2 時間攪拌後、この混合液を室温まで徐々に暖め、 KPF₆ (4.6 g, 25腿 ol)を含む水 (100 mL)で洗浄した。その有機相を Na₂S0₄で乾燥し、濾過し、半量まで濃縮した。エーテル（50 mL)を上記混合液に加え、濾過により淡黄色の沈殿物を回収した。その沈殿物をエーテルで洗浄し、真空中（in vacuo), P₂0₅で乾燥し、 BDPP (8.56 g)を 73 の収率で得た。この化合物は、無色針晶として酢酸ェチルから再結晶させることができた。

Mp 128-129 °C(dec);

³¹P NMR (CDC )(541.52 (s, P+), -142.90 (7重線， J = 711.6 Hz, PF₆- );

Ή NMR (CDCla) 52.14 (4H, ddd, J = 7.7 Hz, 5.3 Hz, 1.3 Hz, ピロリジニル基の 3，4- CH₂)， 2.87 (6H, d， J = 11.2 Hz, N-CHa), 2.91 (2H, ddd, J： 8.9 Hz, 7.3 Hz, 5.6 Hz, ピロリジニル基の 2又は 5- CH₂ )， 3.50(2H, ddd, J = 12.9 Hz, 9.1 Hz, 5.8 Hz, ピロリジニル基の 2又は 5- CH₂ ), 3.64 (4H, ddd, J二 8.9 Hz, 4.3 Hz, 2.3 Hz, ジァザホスホレンの 4，5- CH₂ ), 7.52 (1H, ddd, J = 8.3H z， 6.8 Hz, 1.3 Hz，ベンゾトリァゾリル基の 6- H), 7.72 (1H, dd, J = 8.6 Hz,

6.8 Hz, ベンゾトリアゾリル基の 5- H), 7.78 (1H, d, J = 8.6 Hz, ベンゾトリァゾリル基の 4- H)， 8.07 (1H, d， J 二 8.3 Hz, ベンゾトリアゾリル基の 7- H);

¹³C NMR (CDCla) 526.45 (d, J = 9.8 Hz, N- CH₃ ), 30.95 (d, J = 6.1 Hz,ピロリジニル基の 3，4-C), 45.78 (d, J二 15.8 Hz, ジァザホスホレンの 4,5- C), 4 8.68 (d, J = 4.9 Hz, ピロリジニル基の 2, 5- C) , 108.19, 120.63, 126.15,127. 58, 130.60, 142.89 (ベンヅトリアゾリル基）； Anal. C₁₄H₂₂F₆N₆0P₂の計算値： C, 36.06; H, 4.76; N, 18.02. 実測値： C, 35.88; H, 4.59; N, 18.15.

BDPPの

の計算値： 321.159.実測値： 321.158 (2 ) モノマー、 1，8-ジァザビシクロ [5.4.0]ゥンデク- 7-ェニゥム 5'- 0-ジメトキシトリチルデォキシアデノシン- 3，-ィルホスホネート（1，8- Diazabicyclo [5.4.0]undec-7-enium 5 -0-dimethoxytrityldeoxyadenosin-3' -yl phosphonat e) (以下、「2a」と称することがある）の合成

以下の方法 A及び方法 Bを用いてモノマーの合成を行った。

方法 A (図 2) ： 5，- 0-ジメトキシトリチルデォキシアデノシン（5，_0- Dimeth ox tr i ty 1 deoxyadenos ine ) (以下、「la」と称することがある）（0.554 g， 1 m mol)を無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水（coevaporation) により乾燥し、最終的に無水ピリジン（5 mL)中に溶解した。この溶液にホスホン酸ジフヱニル（1. 64 g,7 mmol)を加えた。 20分の攪拌の後、この混合液を H₂0- Et₃N (1: 1, v/v, 2 mL)で処理し、さらに 20分室温で攪拌した。この混合液を MeOH (5 mL)で希釈し、 1 Mのトリエチルアンモニゥムヒドロゲンカルボネ一卜（triethyla画 onium hydr ogencarbonate) (10 mL)を加えた。この混合液を Et₂0 (10 mL x 3)で 3回洗浄し、その有機相を 1 Mの卜リエチルアンモニゥムヒドロゲンカルボネート（triethyla 誦 onium hydrogencarbonate) で逆抽出した。この水相 (The aqueous layer) と洗浄液 (washings) を混合し、 CHC -MeOH (2:1， v/v, 10 mL x 3)で 3回抽出し、その水相を CHC1₃- MeOH (2:1, v/v)で数回逆抽出した。その有機相と洗浄液（wa shings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、減圧下、濃縮して乾固した。その残留物をシリカゲルカラム（30 gのシリカゲル）に通した。クロマトグラフィ一は、メタノール勾配（0-155 を適用して、 0.5%トリェチルァミンを含む CHC1₃ を用いて行った。「2a」を含む画分を混合し、濃縮して乾固した。生成物を CHC1 3-MeOH (2: 1, v/v, 10 mL)に溶解し、 0.2 Mの 1，8-ジァザビシクロ [5.4.0]ゥンデク- 7-ェニゥムヒドロゲンカルボネート（1,8- diazabicyclo[5.4.0]undec- 7- eniu m hydrogencarbonate) (10 mL)で洗浄した。その水相を CHC1₃- MeOH (2:1)で数回逆抽出し、その有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥させ、濾過し、減圧下、濃縮して乾固し、無色の発泡体として「2a」 (0.631 g,88%) を得た。

方法 B (図 2) ：無水ピリジン（10 mL)中のリン酸（0.082 g, 10誦 ol, 無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥したもの）溶液にビス（2-ォキソ -3-ォキサゾリジニル）ホスフィニッククロライド（bis(2- OXO-3- oxazolidinyl)phosp hinic chloride ) (1.40 g, 5.5誦 ol)を加えた。その反応混合液を室温で 20分間攪拌した。その混合液に 5'- 0-ジメチルトリルデォキシアデノシン（5'- 0- dimeth ox tr i ty 1 deoxyadenos ine ) (la) (0.554 g, 1 麵 ol)を添加した。 6時間の攪拌後，H₂0 (1 mL)をその混合液に添加した。それを CHC1₃- MeOH (2:1, v/v, 10 mいで希釈し， 1 Mのトリェチルアンモニゥムヒドロゲンカルボネート（triethylammon ium hydrogencarbonate) (10 mL x 3)で 3回洗浄し，その水相を CHC1₃- MeOH (2: 1 ， v/v)で数回逆抽出した。その有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、濃縮して乾固した。その粗生成物（トリェチルアンモニゥム塩（triethyla腿 onium salt) )をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、方法 Aで述べたようにして DBU塩に変換し、無色の発泡体として「2a」 (0.60 0 g,78%)を得た。

³¹P墜 (CDC1₃)53.74 (dd, J 612.8 Hz, 8.5 Hz); Ή NMR (CDCL) (51.66 (2H， m， DBUの CH₂ ), 1.73 (4H， m, DBUの CH₂)， 1.97 (2H, 5重線， J = 5.6 Hz, DBUの CH₂ )，2.42-2.80 (2H， m, 2，，2"- H)， 2.83 (2H， m， DBUの CH₂)， 3.36-3.44 (8H, m, 5，，5"-H， DBUの CH₂ )，3.77 (6H, s, MTrの 0 CH₃), 4.22 (1H， m, 4， - H), 4.91 (1H, m, 3， - H), 5.96 (2H， bs， 6-NH2), 6.52 (1H, t， J = 6.8 Hz, 1， - H)， 6.78 (4H, d, J = 8.9 Hz, MTrの 3， 3，，5， 5， -H ) ， 6.96 (1H, d, J = 612.3 Hz，P- H), 7.15-7.42 (9H， m， 3，3' ,5，5， - Hを除く DMT rの ArH)， 7.99 (1H, s， 2- H), 8.26 (1H, s, 8 - H);

¹ C NMR (CDC ) δ 19.50， 23.99, 26.85, 28.99, 32.11， 37.90, 39.86 (2， - C), 48.56, 54.22, 55.15,63.65 (5，- C), 73.67 (d, J = 3.7 Hz, 3，- C), 84.1 7 ( - C)， 85.61 (d, J= 7.3 Hz, 4，- C)， 86.38, 113.08,119.84 (5-C), 126.76 , 127.75, 128.18, 130.06, 135.67, 135.74, 138.78 (8- C), 144.55, 149.72 ( 2-0,152.81 (4-C), 155.40 (6- C), 158.40, 166.11.

「2a」の Anal C₄。H₄

·5Η₂0の計算値： C,55.87;H，6.80;N,11.40.実測値： C, 55.83;H,6.72;N, 11.28.

「2a」

の計算値： 618.212.実測値： 618.212.

( 3) モノマー、 1,8-ジァザビシクロ [5.4.0]ゥンデク -7-ェニゥム 5，- 0-ジメトキシトリチルデォキシシチジン- 3，-ィルホスホネート（l，8-Diazabicyclo[5 .4.0]undec-7-enium 5' -0-dimethoxytrityldeoxycytidin-3' -yl phosphonate) ( 以下、「2b」と称することがある）の合成

「2a」の場合において述べたような方法 A及び Bを用いて、 5，- 0 -ジメトキシ卜リナノレテオキシシナシン (5' -O-dimethoxytrityldeoxycytidine) (以下、「1 b」と称することがある）（0.530 g, 1 画 ol)から「2b」が無色の発泡体としてそれぞれ 91% (0.679 g)と 74% (0.552 g)の収率で得られた。

3¹P NMR (CDCh) 53.83 (dd, J = 612.8 Hz, 8.6 Hz);

Ή NMR(CDC1₃) 51.66 (2H, m， DBUの CH₂)， 1.71 (4H， m, DBUの CH₂), 1.97 ( 2H, 5重線, J = 5.6 Hz, DBUの CH₂), 2.22 (1H, m, 2，- H)， 2.66 (1H, m， 2"- H ), 2.81 (2H, m， DBUの CH₂), 3.35-3.51 (8H， m,DBl^5，，5"-H, CH , 3.78 (6H ， s, DMTrの 0CH₃)， 4.40 (1H, m， 4， - H)， 5.05 (1H， m, 3， - H)， 5.51(2H, d, J 二 7.3 Hz, 5-H), 5.91 (2H, bs, 4- NH₂)， 6.30 (1H, t, J = 6.1 Hz, l'-H), 6. 82 (4H, d， J = 8.9 Hz, DMTrの 3，3，，5，5， -H)， 6.92 (1H, d, J = 613.3 Hz, P- H), 7.17-7.41 (9H， m, 3， 3，，5,5， -Hを除く DMTrの ArH), 7.80 (1H, d, J = 7.3 Hz, 6 - H);

¹³C N R (CDC ) (519.32, 23.87, 26.62, 30.44,32.04, 37.83， 40.42 (2 C )， 48.41, 54.11, 55.13, 62.97 (5，- C), 72.60 (3，- C)， 84.82 (l'-C), 85.59 (4，- C), 86.47, 94.74 (5-C), 113.08, 126.77, 127.76, 128.01， 129.97, 135. 38， 135.47, 140.56 (6-C), 144.46, 155.89 (2- C)， 158.38, 165.48 (4- C)， 165 .89.

「2b」の Anal C₃₉H₄ eNsOaP, ·4Η₂0の計算値： 57.27;11，6.90; 8.56.実測値： C,57.38;H,7.06;N,8.82.

「2b」

の計算値： 594.201.実測値： 594.203.

(4) モノマ一、 1，8-ジァザビシクロ [5.4.0]ゥンデク- 7-ェニゥム 5，- 0-ジメトキシトリチルデォキシグアノシン- 3'-ィルホスホネート（l，8-Diazabicyclo [5.4.0]undec-7-enium 5 -O-dimethoxytrityldeoxyguanosin-3' -yl pnosphonate ) (以下、「2c」と称することがある）の合成

「2a」の場合において述べたような方法 A及び Bを用いて、 5'- 0-ジメトキシ卜リチノレデォキシク、 'ソ⁷ノシン ( 5 ' -0-d imethoxy t r i t 1 deoxyguanos ι ne (以下、「lc」と称することがある）（0.570 g,. 1 mmol)から無色の発泡体として（2c)をそれぞれ 94% (0.739 g)と 87% (0.684 g) の収率で得た。

3¹P NMR (CDC1₃) 53.07 (dd, J = 618.9 Hz, 8.5 Hz);

Ή N R(CDC1₃) dl.58-1.78 (6H, m， DBUの CH ， 1.95 (2H, 5重線, J : 5.6 Hz, DBUの CH₂), 2.31-2.54(2H, m， 2，，2" - H), 2.62-2.78 (2H, m， DBUの CH₂)， 3 .28-3.48 (8H， m， 5，，5"-H, DBUの CH₂), 3.78(6H, s, DMTrの 0CH₃)， 4.37 (1H, m, 4，- H)， 4.99 (1H, m， 3，- H), 6.17 (1H, dd， J = 9.6 Hz, 4.3 Hz, l'-H), 6 .48 (2H, bs, 2-NH₂), 6.82 (4H, d, J = 8.6 Hz, DMTrの 3，3，，5，5， - H), 7.02 ( 1H, d， J 二 619.3 Ηζ,Ρ- H)， 7.16-7.44 (9H, m， 3，3，，5，5， - Hを除く DMTrの ArH),

7.65 (1H, s， 8-H);

1³C NMR (CDC1₃)19.89, 24.17, 26.97. 29.09, 33.26, 39.01, 41.33 (2，- C)，

48.55, 54.13, 55.20. 63.90 (5，- C)， 74.90 (3，- C)， 83,70 (l'-C), 85.16 (4 ，- C), 86.43, 113.19, 117.29 (5-C), 126.82, 127.81, 128.12, 130.03, 130.0 6， 133.69, 135.67 (8- C), 135.70, 144.56, 150.71 (4 - C)， 155.58 (2- C)， 158 .49 (6 - C)， 165.57.

「2C」の Anal

·6Η₂0の計算値 : 53.74;11,6.76;^10.97.実測値： C, 53.58;Η,6.54;Ν, 10.87.

「2C」の FAB+(M- DBU+H C H NsOeP,の計算値： 634.207.実測値： 634.208.

(5) 5，末端のホスホネ一ト、トリエチルアンモニゥム 6- (ジメトキシトリチリレ才キシ)へキシノレホスホネ——卜 (Triethyla腿 onium 6— (dimethoxytrityloxy)h exyl phosphonate) (以下、「3」と称することがある）の合成（図 3)

1，6-へキサンジオール（1，6- Hexanediol) (0.104g, 1 舰 ol)を無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥させ、最終的に無水ピリジン（10 mL)中に溶解した。この溶液にジメトキシトリチルクロライド（dimethoxytrityl chloride) (0 .373 g, 1.1 誦 ol)を添加し、この混合液を室温で 3時間攪拌した。この混合液を CHC1₃で希釈し、 5% NaHC0₃で 3回洗浄し、その水相を CHC1₃で逆抽出した。その有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、濃縮して乾固し、 6- (ジメトキシトリチルォキシ）へキサノ一ル（6- (dimethoxytrityloxy) hexanol) を粗混合液として得た。他方、無水ピリジン（10 mL)中のホスホン酸（0 .082 g, 10 mmol, 無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥したもの）の溶液に、ビス（2-ォキソ -3-ォキサゾリジニル）ホスフィニッククロライド（bis(2 -oxo-3-oxazolidinyl)Dhosphinic chloride) (1.40 g, 5.5 mmol)を添カ卩した。 2 0分間の攪拌の後、この混合液を 6- ( dimethoxytr i ty 1 oxy ) hexano 1を含む混合液に添加した。 20分間の攪拌後、この混合液をピリジン（5 mL)で希釈し、 1 Mのトリエチノレアンモニゥムヒドロゲンカノレボネ一卜 (triethylammonium hydrogencarbona te) (10 mL)を添加した。この混合液を Et₂0で 5回洗浄し、有機相を 1 Mのトリェチ Jレアンモニゥムヒドンカリレホ不——卜 (triethylammonium hydrogencarbonate ) で逆抽出した。水相と洗浄液（washings) を混合し、 CHC1₃で 3回抽出し、この有機相を CHC1₃で逆抽出した。有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、減圧下、濃縮して乾固し、「3」 (0.265 g, 63%)を淡黄色の油状物として得た。その残留物をシリカゲルカラム（30 gのシリカゲル）に通した。メタノールの勾配（0-4 )を適用して、 0.5%のトリチルァミン含む CHC1₃を用いてクロマトグラフィーを行った。「3」を含む画分を混合し、濃縮して乾固した。その生成物を CHCL- MeOH (2:1, v/v, 10 mL)に溶解し、 1 Mのトリェチルアンモニゥムヒドロゲンカノレボネー卜 (triethylammonium hydrogencarbonate) (10 mL)で洗浄した。水相を CHC1₃ (10 mL)で逆抽出し、有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、減圧下、濃縮して乾固し、「3」 (0.230 g, 5 3%)を無色の油状物として得た。

³¹P NMR (CDCla) 55.11 (dt, J = 607.9, 7.4 Hz);

NMR (CDCh) (51.19 (9H， t, J = 7.3 Hz, Et₃Nの CH₃)， 1.28 (2H, m, CH2 ), 1.52 (4H, m, CH₂)， 2.77 (8H, q， J = 7.3 Hz, Et₃Nの CH₂, CH₂)， 2.94 (2H ， t， J二 6.9 Hz, CH₂)， 3.67 (6H， s， DMTrの 0CH₃)， 3.74 (2H， t, J = 6.9 Hz ， CH₂)， 6.72 (4H, d, J 二 8.9 Hz, DMTrの 3， 3，，5， 5， -H)， 6.76 (1H, d, J = 6 08.1 Hz, P-H), 7.06-7.36 (9H， m, 3,3，，5,5， -Hを除く DMTrの ArH);

¹³C NMR (CDC1₃)(5 9.20， 25.55, 25.79, 29.80, 30.57, 45.32, 63.1, 63.31 , 76.53, 85.30, 112.63, 126.20, 127.35, 127.85, 129.67, 136.41, 145.16, 157.97.

(6) 固相 LCAA- CPGへのリンカ一の導入（図 4) 1，6-へキサンジオール（0. 118 g, 1 mmol ) を無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥させ、最終的に無水ピリジン（10 mL )に溶解した。この溶液にジメトキシトリチルクロライド (dimethoxytrityl chloride) ( 0.373 g, 1. 1 腸 1 )を添加し、この混合液を室温で 3時間攪拌した。この混合液を CHC1₃ (20 mL)で希釈し、 5% NaHC0₃ (20 mL x 3)で 3回洗浄し、その水相を CHC1₃ (50 mL)で逆抽出した。その有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂ S0₄を通じて乾燥し、濾過し、濃縮して乾固し、 6- (ジメトキシトリチルォキシ）へキサノール（6- (dimethoxytrityl oxy)hexanol) を淡黄色の油状物として得た。他方、無水 CH₃CN (4 mL)中のトリァゾール（0.173 g, 2.5 mmol, 無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥したもの）の溶液にォキサリルクロライド（oxalyl chloride) (44 μ. , 0.5 mmol ) とピリジン（0.2 mL)を添加した。 5分間の放置後、この混合液をピリジン- CH₃CN( 2 : 1， v/v, 3 mL)中の 6- (ジメ卜キシトリチルォキシ）へキサノール（6- (dimethox ytrityloxy)hexanol) の溶液に添加した。 1時間の放置後、この混合液を反応容器の中の LCAA-CPG ( 1 g)に添加した。この混合液を 30分放置後、 CH₃CN、無水 MeOH 及び CH₃CNで順次洗浄した。 CPGゲルを Ac₂0-ピリジン（1 : 9, v/v, 5 mL)で処理した。 3時間の放置後、 CPGゲルをピリジン、続いて CH₃CNで洗浄し、減圧下で乾燥させ、 LCAA-CPGに結合した 6- (ジメトキシトリチルォキシ）へキシルォキザレート（ 6 - ( d imethoxy t r i ty 1 oxy ) hex 1 oxalate) を得た。 LCM- CPGに対する 6- (ジメトキシトリチルォキシ）へキシルォキザレート（6-(dimethoxytrityloxy)hexyl oxala te) の負荷量は、 DMTr解析により 29〃mol/g と評価された。

( 7 ) オリゴマー、 H-ホスホネートオリゴデォキシリボヌクレオチドの合成固相合成は、「Appl ied Biosystems 380A synthesizers で、又は反応容器として、先端に制止装置をを有し底に栓を有するガラスフィルター（10 顏 X 50 誦 )を用いて手動で行った。鎖の伸長の各サイクルは、脱トリチル化（detritylati on) (CH₂C1₂中の 1% TFA ； 15秒)、洗浄（CH₂C1₂、次いでピリジン）、カップリング（ピリジン中において 0.1 Mのモノマ一（「2a」、「2b」、「2c」）及び 0.5 Mの BDPP; 2分）、洗浄（ピリジン）、キヤッビング（0· 1 M トリェチルアンモニゥムェチルホスホネート，ピリジン中の 0.5 M BDPP; 2分）、洗浄（ピリジン、次いで CH₂ Cl₂ )から構成した。合成の最終サイクルにおいて、卜リメチルアンモニゥム 6- ( ジメトキシトリチルォキシ）へキシルホスホネート（triethyla腿 onium 6- (dime thoxytrityloxy)hexyl phosphonate) (3) をモノマー単位（「2a」、「2b」、「 2c」）の代わりに用いた（図 5 ) 。一般に、 1サイクル当たりの平均収率は、 DMTr 解析により 96- 99%と評価された。鎖の伸長後、 DMTr群を CH₂C1₂中の 1% TFAで 15秒処理することによって除去し、 CH₂C1₂、次いで CHaCNで洗浄した。 CPGゲル上の H- ホスホネートオリゴマーを N, 0-ビス（トリメチルシリノレ）ァセトアミド- CH₃CN (N , 0-bis(trimethylsi lyl )acetamide-CH3CN) ( 1 :2, v/v， 300 / L)で 20分間処理し、この混合液に n- PrNH₂ (200〃L )を添加し 30分間放置した。 CPGゲルを濾過により除去し、濾液を減圧下濃縮した。この粗精製物を「01igo- Pak EX (Mi ll ipore社製 )」カートリッジ上で精製した。生成物を H₂0- CH₃CN (3 :2, v/v)を用いて溶出させ、この溶出液を濃縮して乾固し、 3'及び 5'末端に 6- (ヒドロキシ）へキシルホスホネ一ト（6- (hydroxy)hexyl phosphonate) を有する H-ホスホネートオリゴデォキシリボヌクレオチドを得た（図 6 ) 。

以にテカチミンレート H-ホス小不一ト (Decathymidyiate H- phosphonate) (T10)とテトラヌクレオチド H-ホスホネート（Tetranucleotide H- phosphonate) (CAGT)の合成例を示す。

合成例 1 ：化学式

で示されるデカチミジレート H-ホスホネート（Decathymidylate H-phosphonate ) (T10 )の合成

差替え用紙（規則 26) 24/1 - 上記した典型的な工程を用いて、 LCM- CPGに結合した l〃molの 6- (ジメトキシ卜リチノレ才キシ)へキシノレ才キザレー卜 (6— (dirmethoxytrityloxy)hexyl oxalate) からデカチミジレート H-ホスホネート（decathymidylate H-phosphonate) (61. 4 A260 units)を 82%の収率で得た。

UV (CH3CN-H2O, 1:1， v/vUmax: 262.8 run, λιηΐη 233.0 nm;

³¹P NMR (CD₃CN- H₂0， 1: 1, v/v) (510.95- 11.49 (多重線，平均値として J二 731.6 Hz); FAB M+D+C H SN O PHの計算値： 3165.29.実測値： 3165.25

差替え用紙（規則 26) 25 合成例 2：化学式

で示されるテトラヌクレオチド H-ホスホネート（Tetranucleotide H- phosphona te) (CAGT)の合成

上記した典型的な工程を用いて、 LCM-CPGに結合した l〃molの 6- (ジメトキシトリチルォキシ）へキシルォキザレート（6- (dirmethoxytrityloxy)hexyl oxalate) からテ卜ラヌクレオチド H-ホスホネ一卜 (tetranucleotide H - phosphonate ) (31.0 A2 60 units)を 84°の収率で得た。

UV (CH₃CN-H₂0, 1:1, v/v)人 max 259.2 nm, 入 min 229.8 nm;

³¹P丽 R(CD₃CN- H₂0， 1:1， v/v) (510.97- 12.29 (多重線，平均値として J二 7 28.8 Hz); FAB⁺(M+1)⁺C₅₁H₇₇N₁₅0₂₅ P₅の計算値： 1455.12.実測値： 1455.09.

差替え用紙（規則 26) 25/1 得られたテトラヌクレオチド H-ホスホネート（tetranucleotide H- phosphona te) (1.0 A₂₆。 units)を濃 NH₃-ピリジン（9: 1, v/v, 5 mL)で室温にて 10分間処理し、 H-ホスホネートのジエステル結合を切断した。この混合液を脱水して乾燥させ、無水ピリジン（300〃L)中に溶解した。この溶液に Et₃N (42 zL)及び BSTFA (8 1〃L)を添加した。室温で 2時間の放置後、無水デカン（100 /L)中の 5.0 M t-Bu00

差替え用紙（規則 26) 26

Hを添加し、この混合液を室温で 10分間放置した。この混合液を脱水して乾燥させ、濃 NH₃-ピリジン（9: 1, v/v, 5 mL)中に溶解した。 5分間の放置後、この混合液を脱水して乾燥させ、 0.1M Tris- HC1緩衝液 (pH 8.0, 100 〃L)に溶解した。この溶液に、子牛の腸のアルカリホスファタ一ゼ（10 units)を添加し、 37°Cで 3時間ィンキュベ一卜し、 dC， dA, dG,及び dTのほぼ 1:1:1:1の混合液を得た（逆相解析 )。

く実施例 2 > H-ホスホネートオリゴデォキシリボヌクレオチドの化学合成実施例 1と異なる反応条件で H-ホスホネートオリゴデォキシリボヌクレオチドの化学合成を行った。

( 1 ) モノマー、トリメチルアンモニゥム 5， -0-ジメトキシトリチルデォキシァテノシン一 3，ーィノレホスホ不一卜 (Triethylammonium 5，一 0— dimethoxytritylde oxyadenosin-3' -yl phosphonate) (2a)の合成

以下の方法 A及び方法 Bを用いてモノマ一の合成を行った。

方法 A (図 7) ： 5，- 0-ジメトキシトリチルデォキシアデノシン（5，- 0-Dimeth oxy tr i ty Ideoxyadenos ine ) (la) (0.554 g, 1 minol)を無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥させ、最終的に無水ピリジン（5 mL)中に溶解した。この溶液にジフエニルホスホネート（diphenyl phosphonate) (1.64 g, 7誦 ol)を添加した。 20分の攪拌後、この混合液を H₂0- Et₃N (1:1, v/v, 2 mL)で処理し、室温でさらに 20分攪拌した。この混合液をピリジン（5 mL)で希釈し、 1 Mのトリエチルァンモニゥムヒドロゲンカノレボネ——卜 (triethyla腿 onium hydrogencarbonate) (1 O mL)を添加した。この混合液を Et₂0で 5回洗浄し、その有機相を 1 Mのトリェチルアンモニゥムヒドロゲン力ノレ不不——ト (triethylammonium hydrogencarbonate) で逆抽出した。その水相と洗浄液を混合し、 CHC1₃で 3回抽出し、この水相を CHC1 ₃で逆抽出した。有機相と洗浄液を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥させ、濾過し、減圧下、濃縮して乾固した。その残留物をシリカゲルカラム（30 gのシリカゲル）に通した。メタノールの勾配（0-15%)を適用して、 4%のトリチルァミン含む CHC1₃を 27 用いてクロマトグラフィーを行った。「2a」を含む画分を混合し、濃縮して乾固した。その生成物を CHC1₃(10 mL)に溶解し、 1 Mのトリェチルアンモニゥムヒドロゲンカノレボネー卜 (triethyla腿 onium hydrogenca bonate) (10 mL)で洗净し、シリカゲルを除去した。水相を CHC1₃ で逆抽出し、有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、減圧下、濃縮して乾固し、「2a」 (0.5 89 g， 82%)を無色の発泡体として得た。

方法 B (図 7) ：無水ピリジン（10 mL)中のホスホン酸（0.082 g, 10議 ol, 無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥したもの）の溶液に、ビス（2-ォキソ- 3-ォキサゾリジニル）ホスフィニッククロライド（bis(2- OXO- 3- oxazolidinyl )phosphinic chloride) (1.40 g, 5.5 腿 ol)を添加した。反応混合液を室温で 20 分間攪拌した。この混合液に 5'- 0-ジメ卜キシトリチルデォキシアデノシン（5'- O-dimethoxytrityldeoxyadenosine) (la)(0.554 g, 1 腿 ol)を添加した。 6時間の攪拌後、混合液を CHC1₃で希釈し、 1 Mのトリェチルアンモニゥムヒドロゲンカルボネ一ト（triethylammonium hydrogencarbonate) で 3回洗浄し、その水相を CHC 1₃で逆抽出した。有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、減圧下、濃縮して乾固した。その粗生成物を上記のようなシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色の発泡体として「2a」（0.563 g, 78%)を得た。

³¹P NMR (CDCh) (53.88 (dd, J _PH = 616.5 Hz, J _P。_CH = 8.5 Hz);

Ή NMR (CDCh) dl.21 (9H, t， J = 7.3 Hz, Et₃NH+の CH₃)， 2.70-2.83 (2H, 111， 2'-H and 2"- H), 2.92 (6H, q， J = 7.3 Hz, CH₂Et₃NH+), 3.32 (3H, m， 5， - H, and 5- H), 3.69 (6H, s, DMTrの 0CH₃ ),4.33 (1H, m, 4，- H)， 4.98(1H, m, 3 ，- H), 5.93 (2H, bs， 6-NH2), 6.45 (1H, t, Jr, ₂- = 5.9 Hz, l'-H), 6.70 (4 H， d, J = 8.6 Hz, DMTrの 3，3，，5，5，- H)， 6.85 (1H, d, J _PII = 617.0 Hz, P- H) ， 7.14-7.34 (9H， m， 3，3，，5，5， - Hを除く DMTrの ArH)， 7.91 (1H， s, 2- H)， 8.20 (1H, s, 8 - H); 28

¹³C NMR (CDCls) 58.68 (Et₃NH+の CH₃ ), 39.70 (2，-C), 45.41 (Et₃NH+の CH₂ ), 55.11 (DMTrの 0CH₃)， 63.60 (5， - C)， 73.84(JPOC = 4.9 Hz, 3， - C)， 84.13 ( l'-C), 85.50 (JPOCC = 7.3 Hz, 4，- C)， 86.34 (MTrの tert-C)， 113.03 (DMTrの 3,3，，5，5，- C)， 119.87 (5- C)， 138.67 (8-C), 149.70 (C - 2), 152.83 (C- 4)， 15 5.42(C-6), 126,74, 127.73, 128.12, 130.03, 135.58, 135.63, 144.47, 158.3 8 (DMTr Ar-C).

(2) モノマ一、トリェチルアンモニゥム 5，- 0-ジメトキシトリチルデォキシシチジン一 3，ーィノレ 3、スホ不——卜 (Triethyla腿 onium 5，一 0— dimethoxytrityldeo xycytidin-3' -yl phosphonate) (2b)の合成

「2a」における場合に記載したような方法 A及び Bを用いて、 5'- 0-ジメトキシトリチルデォキシシチジン (5'-0-dimethoxytrityldeoxycytidine) (lb)(0.530 g, 1 mmol)から「2b」を無色の発泡体として、それぞれ収率 91% (0.635 g)及び 7 4¾ (0.518 g)で得た。

³¹P NMR (CDCh) 53.67 (dd， J_PH = 616.4 Hz, JPOCH = 8.5 Hz);

Ή NMR (CDC1₃)(51.21 (9H, t, J = 7.3 Hz, Et₃NH+の CH₃), 2.17 (1H， m, 2， - H)， 2.59 (1H, m, 2"-H), 2.93 (6H，q， J = 7.3 Hz, Et₃NH+の CH₂), 3.32 (3H, m, 5， - H， and 5"- H), 3.69 (6H, s， DMTrの 0CH₃ )，4. 15(1H, m, 4， - H), 4.83 ( 1H， m, 3，- H), 5.57 (1H, d， J = 7.6 Hz, 5-H), 6.20 (1H， t， J , ₂' = 5.9 H z， 1，- H)， 6.74 (4H, d, J = 8.9 Hz, DMTrの 3,3，，5， 5， -H)， 6.81 (1H, d, J_PH = 617.0 Hz, P-H), 7.11-7.34 (9H， m， 3，3，，5,5， - Hを除く MTrの ArH), 7.70 (1 H, d, J = 7.6 Hz, 6-H);

^,3C NMR(CDC1₃ ) (58.77 (Et₃NH+の CH₃ )， 40.61 (2，-C)， 45.61 (Et₃NH+の CH₂) , 55.20 (MTrの 0CH₃ ),62.82 (5，- C)， 72.82 (3，- C)， 84.91 (l'-C), 85.76 (4， - C)， 86.67 (DMTrの tert- C), 94.68 (C-5), 113.21 (DMTrの 3， 3，，5， 5， -C), 141.2 4 (6- C), 154.47 (2-C), 163.97 (C - 4)， 123.68, 126,93,127.91, 128.12, 130. 10, 135.38, 135.45, 144.46, 158.53 (DMTrの Ar- C). 29 グアノシン- 3，-ィルホスホネ一ト（Triethyla画 onium 5， - 0- dimethoxytrityl

( 3) モノマ一、トリェチルアンモニゥム 5， -0-ジメトキシトリチルデォキシ d eoxyguanosin-3' -yl phosphonate) (2c)の合成

「2a」の場合に記載したような方法 Aを用いて、 5'- 0-ジメトキシトリチルデォキシシチジン (5， - 0- dimethoxytrityldeoxycytidine) (lc)(0.570 g, 1 顏 ol)から「2C」（0,708 g, 94¾ )を無色の発泡体として得た。

^{3 1}P NMR (CDC ) 63.22 (dd, JPH 二 626.2 Hz, J_P。_CH = 8.6 Hz);

Ή NMR (CDCla) (51.18 (9H， t, J = 7.3 Hz, Et₃NH+の CH₃ )，2.35 (1H， m， 2， - H), 2.58 (1H, in， 2"-H), 2.99 (6H， q, J = 7.3 Hz, Et₃NH+の CH₂), 3.26 (3H , m，5， - H, 及び 5"- H)， 3.69 (6H, s, DMTrの 0CH₃ ),4.29 (1H， m, 4，- H), 4.95 ( 1H， m, 3，- H). 6·10(1Η， dd, Jr , ₂' /Jr , ₂' ' = 4.6 Hz 及び 8.9 Hz, l'-H), 6. 74 (4H， d, J = 8.9 Hz, DMTrの 3,3，，5，5， - H)，6.91 (1H, d， JPH 625.5 Hz, P - H)， 7.11-7.35 (9H, m, 3,3，，5，5， - Hを除く DMTrの ArH),7.62 (1H, s， 8-H); )

¹³C NMR (CDCla) 58.86 (Et₃NH+の CH₃ ), 40.81 (2，- C)， 45.73 (Et₃NH+の CH₂ )， 55.19 (DMTrの 0CH₃ ), 63.67 (5， - C)， 74.81 (3，- C), 83.61 (1，-C)， 85.14 ( 4，- C)， 86.41(DMTrの tert- C)， 113.21 (DMTrの 3,3，，5，5， - C)， 117.10 (5-C), 13 5.60 (8 -ひ， 150.75 (4- C)， 154.66 (C-2), 158.13 (6 - C), 126,84， 127.85， 12 8.09， 130.02， 133.80, 144.51, 158.47 (DMTrの AT-C).

(4) 5'末端ホスホン酸、トリチルアンモニゥム 5- (ジメトキシトリチルォキシ)ペンチノレホスホネ一ト (Triethylammonium 5— (dimethoxytrityloxy)pentyl phosphonate) (3)の合成 (図 8)

1,5-ペン夕ンジオール（1，5- Pentanediol) (0.104 g, 1 誦 ol)を無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥させ、最終的に無水ピリジン（10 mL)中に溶解した。この溶液にジメトキシトリチルクロライド（dimethoxytrityl chloride) (0.373 g, 1.1 醒 ol)を添加し、この混合液を室温で 3時間攪拌した。この混合液を CHC1₃で希釈し、 5% NaHC0₃で 3回洗浄し、その水相を CHC1₃で逆抽出した。その 30 有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、濃縮して乾固し、 5- (ジメトキシトリチルォキシ）ペン夕ノール（5- (dimethoxytritylox y)pentanol) を粗混合液として得た。他方、無水ピリジン（10 mL)中のホスホン酸（0.082 g, 10讓 ol, 無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥したもの ) の溶液に、ビス（2-ォキソ -3-ォキサゾリジニル）ホスフィニッククロライド（b is(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinic chloride) (1.40 g, 5.5 mmol)を添カロした。 20分間の攪袢の後、この混合液を 5- (ジメチルトリチルォキシ）ペン夕ノール（ 5 - ( d ime thoxy t r i ty 1 oxy ) pentano 1 ) を含む混合液に添加した。 20分間の攪拌後、この混合液をピリジン（5 mL)で希釈し、 1 Mのトリエチルアンモニゥムヒドロゲンカノレポ'不一卜 (triethyla醒 onium hydrogencarbonate) (10 mL)を添カロした。この混合被を Et₂0で 5回洗浄し、有機相を 1 Mのトリエチルアンモニゥムヒドロゲン力レボネー卜 (triethylammonium hydrogencarbonate) で逆抽出した ₀ 水目と洗净液（washings) を混合し、 CHC1₃で 3回抽出し、この有機相を CHC1₃で逆抽出した。有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、減圧下、濃縮して乾固し、「3」 (0.265 g, 63%)を淡黄色の油状物として得た。この物質は、これ以上精製しなくとも分析上純粋であった。

³¹P NMR (CDCla) 54.99 (dt, J_PH = 614.0 Hz, J_P。_CH 二 7.3 Hz);

Ή NMR (CDC ) (51.15 (9H, t, J 二 7.3 Hz, Et₃NH+の CH₃), 1.36 (2H, m， C H₂), 1.50 (4H, m, 2xCH₂), 2.87 (6H, q, J = 7.3 Hz, Et₃NH+の CH₂), 2.90 (2 H, dd， J = 6.9 Hz 及び 3.0 Hz, DMTrO-CH₂), 3.63 (6H, s, DMTrの 0CH₃), 3.74 (2H， dd, J = 6.9 Hz 及び 7.6 Hz, P-0CH₂), 6.69 (4H, d， J = 8.6 Hz, DMTrの 3，3，，5，5，- H)， 6.73 (1H， d, J_PH 613.7 Hz, P- H), 7.05-7.55 (9H, m, 3，3，， 5,5， - Hを除く DMTrの ArH);

¹³C NMR (CDCla) (58.07 (Et₃NH+の CH₃ )， 22.32 (CH₂), 29.35 (CH₂)， 30.32( JPOCC = 7.3 Hz, P-OCH2CH2), 44.93 (Et₃NH+の CH₂ ), 54.72 (DMTrの 0CH₃)， 62. 88 (CH2), 63.27 (JPOC = 4.9 Hz, P-0CH₂), 85.18 (DMTrの tert-C), 112.53 (D 31

^1 の3,3，，5,5，-0, 123.40, 126.09， 127.24, 127.71, 129.56. 135.78, 136.2 1， 145.01, 149.07, 157.84 (DMTrの Ar- C).

( 5) 固相 LCAA- CPGへのリンカ一の導入（図 9 )

1,5-ペン夕ンジオール（1，5- Pentanediol) (0.104 g, 1 腿 ol)を無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥させ、最終的に無水ピリジン（10 mL)中に溶解した。この溶液にジメトキシトリチルクロライド（dimethoxytrityl chloride) (0.373 g, 1.1 顏 ol)を添加し、この混合液を室温で 3時間攪拌した。この混合液を CHC1₃で希釈し、 5% NaHC0₃で 3回洗浄し、その水相を CHCLで逆抽出した。その有機相と洗浄液（washings) を混合し、 Na₂S0₄を通じて乾燥し、濾過し、濃縮して乾固し、粗 5- (ジメトキシトリチルォキシ）ペン夕ノール（5- (dimethoxytrityl oxy)pentanol) を得た。他方、無水 CH₃CN(4 mL)中の卜リアゾール（0.173 g, 2.5 腿 ol, 無水ピリジンを用いた繰り返し共脱水により乾燥したもの）の溶液に、ォキサリルクロライド（oxalyl chloride) (44 uL, 0.5 腿 ol)及びピリジン（0.2 mL)を添加した。 5分間の放置後、この混合液をピリジン- CH₃CN (2:1, v/v, 3 mL )中の 5- (ジメトキシトリチルォキシ）ペンタノ一ル（5- (dimethoxytrityloxy)pen tanol) の溶液に添加した。 1時間の放置後、この混合液を反応容器中の LCAA- CPG

(1 g)に添加した。この混合液を 1時間放置し、順次 CH₃CN、無水 Me0H、及び CH₃C Nで洗浄した。 CPGゲルを Ac₂0ピリジン（1:9, v/v, 5 mL)で処理した。 3時間の放置後、 CPGゲルをビリジン、次いで、 CH₃CNで洗浄し、減圧下乾燥させ、 LCAA- CPGに結合した 5- (ジメトキシトリチルォキシ）ペンチルォキザレ一ト（5- (dimethoxytr ityloxy;pentyl oxalate) を得た。

( 6) H-ホスホネ一卜オリゴデォキシリボヌクレオチド（H- phosphonate olig odeoxyribionucleotide) の固相合

合成例 1.

実施例 1の合成例 1において使用したモノマーが、方法 Aまたは方法 Bで DBUの代わりに TEAを使用して得られたチミジンモノマーである以外は同様にして、デカ 32 チミジレート H-ホスホネ一ト（Decathymidylate H-phosphonate) を合成した。合成例 2.

実施例 1の合成例 1において使用したモノマーが、方法 Aまたは方法 Bで DBUの代わりに TEAを使用して得られたチミジンモノマーであり、縮合剤として BDPPの代わりに PyFOPを使用した以外は同様にして、デカチミジレート H-ホスホネート（ Decathymidylate H-phosphonate) を合成した。

合成例 3.

実施例 1の合成例 2において使用したモノマーが、方法 Aまたは方法 Bで DBUの代わりに TEAを使用して得られたチミジンモノマーである以外は同様にして、テトラヌクレオチド H-ホスホネート（Tetranucleotide H- phosphonate) を合成した以上の実施例の結果を表 1に示す。

表 1 オリゴモノマー縮合剤平均収率 (％) 脱保護前脱保護後の単位の塩（計算値）の収率 (％) の収率 (％) 実施例 T 10 DBU BDP P 99 61. 4 OD 合成例 (82%) 実施例 2 T 10 TEA BDPP 96 65 43. 50D 合成例 1 (58%) 実施例 2 T 10 TEA PyFOP* 95 62 42. 0OD 合成例 2 (56%) 実施例 1 CAGT DBU BDPP 99 95 31. 0OD 合成例 2 (84%) 実施例 2 CAGT TEA BDPP 96 26. 40D 合成例 3 ( 71 %) 33

* P y F O P ： ( Ν - Ρ⁺— 0

し/

文献 (H.H. Jensen, C. E. Olsen, A. Holm, J. Org. Chem. , 59, 1257( 1994)) に従って合成した。く参考例 1 > テトラヌクレオチドメチルホスホネ一ト（tetranucleotide met hylphosphonate)の合成

ォキザリルリンカ一（oxalyl linker)を介して LCAA- CPGに結合したテトラヌクレォチド H-ホスホネート（tetranucleotide H-phosphonate )( 1 〃mol )を 1₂の 5 %メタノールーピリジン溶液（9: 1， v/v)で室温で 1 0分間反応した後、ピリジン、ァセトニトリルで順次洗浄した。ついで、 CPGゲルを n- PrNH广ァセトニトリル（1 :4， v/v) 中で室温で 3 0分間処理した。 CPGゲルを濾過により除去し、濾液を減圧下濃縮した。この粗精製物を逆相 HPLCにより精製することでテトラ pヌクレオチドメナリレホスホネ一卜 (tetranucleotide methylpnosphonate)を得た ₀

^{3 1}P NMR (CD₃CN- H₂0， 1 : 1， v/v) ό" 0.05-1.16,

FAB MS (FAB ) Calcd for C_ssH_8SN_i50₃。P₅ : 1603, Found 1603.

く参考例 2 > テトラヌクレオチドヒドロキシメチルホスホネート（tetranucl eotide hydroxymethylphosphonate )の合成

ォキザリルリンカー（oxalyl linker)を介して LCAA- CPGに結合したテトラヌクレォチド H-ホスホネート（tetranucleotide H- phosphate )( 1 〃mol )をジォキサン（d ioxane)中で 1 Mの N，0-ビス（トリメチルシリル）ァセトアミド（N，0- bis(trimet hylsilyl )acetamide )と室温で 2時間反応させ、ついでホルムアルデヒドガス（ga seous formaldehyde )と 1 0分間反応した。ジォキサンで洗浄した後、 n- PrNHr "メ夕ノール（1 :4, v/v)中で室温で 3 0分間処理した。 CPGゲルを濾過により除去し、濾液を減圧下濃縮した。この粗精製物を逆相 HPLCにより精製することでテトラ

差替え用紙（規則 26) 34 ヌクレオチドヒドロキシメチルホスホネート（tetranucleotide hydroxymethylph osphonatejを得た o

^{3 1}P 腿 (CDaCN-aO, 1 : 1, ν/ν) δ 28.52-29.78,

FAB MS (FAB ) Calcd for C_5tH₈₆N₁₅0₃。P_s: 1603, Found 1603.

く参考例 3 > テトラヌクレオチドボラノホスホネ一ト（tetranucleotide bor anophosphonate )の合成

ォキザリルリンカ一（oxalyl l inker)を介して LCAA-CPGに結合したテトラヌクレォチド H-ホスホネート（tetranucleotide H- phosphate )( 1 〃mol )を 1 Mの N，0 -ビス（トリメチルシリル）ァセトアミド- Me₂S · BH₃ ( 5 ： 2 , v/v)と室温で 1時間反応させた。メタノールで洗浄した後、 n-PrNH₃-メタノール（ 1 : 4， v/v)中で室温で 3 0分間処理した。 CPGゲルを濾過により除去し、濾液を減圧下濃縮した。この粗精製物を逆相 HPLCにより精製することでテトラヌクレオチドボラノホスホネ ―卜 (tetranucleotide boranophosphonate)を得た。

^{3 1}P NMR (CD₃CN-H_¾0, 1 : 1, ν/ν) δ 92.41-94.89.

く参考例 4 > テトラヌクレオチドホスホアミデート（tetranucleotide phosp hoamidate)の合成

テトラヌクレオチド H-ホスホネ一ト（tetranucleotide H- phosphonate )(CAGT)を 5 %の1₂を含む飽和アンモニアピリジン溶液で 0 °Cで 5分間反応した。ついで、過剰の Lを NaHS0₃水溶液で処理し、得られた粗精製物を逆相 HPLCにより精製することでテトラヌクレオナドホスホア丁一ト (tetranucleotide phosphoamidate) ¾得た

^{3 1}P NMR (CD₃CN-H₂0, 1 : 1, v/v) δ 12.47-14.33,

FAB MS(FAB )Calcd for CsHO P; : 1528, Found 1528. 産業上の利用可能性

本発明により、新規な H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体、及び該誘導 35 体の合成方法が提供された。本発明の H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体は、標的遺伝子との二重鎖を形成しやすく、ホスホジエステラーゼ耐性で、かつ細胞への取り込み効率の高いなどの特性を有する。本発明の H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体は、特にアンチセンス核酸としての利用が期待される。

Claims

36 請求の範囲

1. 下記一般式（ I ) で表される H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体 _c

[式中、 Bは互いに異なっていてもよいピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R¹は水素原子、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシ基、ァルコキシ基、アルケニルォキシ基またはァシル基を表し、 R²は分岐していてもよいアルキレン基を表し、該アルキレン基は酸素原子を介していてもよい。 Xはへテ口原子を表し、 nは 1以上の数を表す。 ]

2. (a) —般式（11)、

R³-0-R²-0-R⁴ (II)

[式中、 R³は保護基を表し、は式

-CO CONH-R⁵

(式中、は担体を表す。）を表し、 R²は前記と同義を表す。 ] で表される化合物の保護基 R³を除去後、

一般式（ΙΠ)、 37

[式中、 R Bおよび Xは前記と同義を表し、 R⁶は保護基を表し、

X¹

はカチォニック塩を表す。 ] で表される塩基モノマー単位と反応させて、一般式（ IV),

(IV)

[式中、 Β、Χ、、Ι1²、ίί⁴, および R⁶は前記と同義を表す。 ] で表される化合物を得る工程、

(b) 前記工程で得られる一般式（IV)で表される化合物の保護基 R⁶を除去後、前記一般式（III)で表される塩基モノマー単位と反応させる工程、

(c) 前記（b) と同様の操作を繰り返し行うことによって得られる化合物と、

X

II - ₊

R⁷— 0— R²— 0— P—〇 ■ X² (V)

I

H

[式中、 R⁷は保護基を表し、 38

X²

は、カチォニック塩を表し、 R²および Xは前記と同義を表す。 ] で表される化合物とを縮合剤の存在下に反応させて、

一般式 (VI)、 χρηπ

[式中、 ΙΤ、Ι1²、Ι1⁴、、Βおよび Xは前記と同義を表し、 ηは 1以上の数を表す。 ] で表される化合物を得る工程、

(d) 前記工程（c) で得られる一般式（VI)で表される化合物を無水塩基性条件下に反応させ、次いで、加水分解処理することによって請求項 1記載の H ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体を得る工程、

から成ることを特徴とする H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法

3. 下記の一般式（V) で表される H-ホスホネートオリゴヌクレオチドの 5，末端合成用試薬。

X

II - ₊

R⁷— 0— R²—〇— P— 0. X² (V)

H 39

[式中、 R\

+

X²

、 R²および Xは前記と同義を表す。 ]

4. 下記の一般式（VII) で表される H-ホスホネートオリゴヌクレオチドの 5' 末端合成用試薬。

X

II - +

R⁷— 0— R⁹— 0— P— 0 · X² (VII)

I

H

[式中、 ITは炭素数 4以上の分岐をしていてもよいアルキレン基を表し、該アルキレン基は酸素原子を介していてもよい。 Γ、

+

X²

、 Xは前記と同義を表す。 ]

5. ウィルスの増殖に際して生成するメッセンジャー RNAに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド誘導体を有効成分とするウィルス増殖阻害剤であつて、該オリゴヌクレオチド誘導体が、請求項 1記載の Η-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体であることを特徴とするウィルス増殖阻害剤。

6. 腫瘍細胞の増殖に際して特異的に生成するメッセンジャー RNAに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド誘導体を有効成分とする腫瘍細胞増殖阻害剤であって、該ォリゴヌクレオチド誘導体が、請求項 1記載の Η—ホスホネートォリゴヌクレオチド誘導体であることを特徴とする腫瘍細胞増殖阻害剤。

7. 下記の一般式（V) で表される化合物の Η-ホスホネートオリゴヌクレオチドの 5' 末端合成における試薬としての使用。

X

II - ÷

R⁷— 0— R²— 0— Ρ— 0 · X² (V)

I

Η 40

[式中、 R\

+

X²

、 R²および Xは前記と同義を表す。 ]

8. 下記の一般式（VII) で表される化合物の H-ホスホネートオリゴヌクレオチドの 5' 末端合成における試薬としての使用。

X

II ₊

R⁷— 0— R⁹—〇一 P—〇 · X² (VII)

I

H

[式中、 R⁹は炭素数 4以上の分岐をしていてもよいアルキレン基を表し、該アルキレン基は酸素原子を介していてもよい。 R⁷、

X²

、 Xは前記と同義を表す。 ]