WO1998017788A1

WO1998017788A1 - Novel secondary alcohol dehydrogenase, process for preparing said enzyme, and process for preparing alcohols and ketones using said enzyme

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Publication number: WO1998017788A1
Application number: PCT/JP1997/003800
Authority: WO
Inventors: Hiroaki Yamamoto; Naoki Kawada; Akinobu Matsuyama
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1996-10-22
Filing date: 1997-10-21
Publication date: 1998-04-30
Anticipated expiration: 1999-04-22
Also published as: EP0875562A1; US20020064847A1; EP0875562A4

Description

明細書新規な 2級アルコール脱水素酵素、該酵素の製造方法、及び該酵素を用いたアルコール、ケトンの製造方法技術分野

本発明は、アルコール、アルデヒド、ケトンの製造、特に光学活性アルコールの製造に有用な新規な 2級アルコール脱水素酵、該酵素の製造方法、及び該酵素を用いてアルコール、アルデヒド、ケトン、特に光学活性アルコールを製造する方法に関する。背景技術

微生物の生産するフエニルエタノールなど 2級アルコールの脱水素酵素としては、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、 NAD P +と略す）を要求するラク卜バチルス ·ケファー（Lactobacillus kefir) 由来の 2級アルコール脱水素酵素（特閧平 4- 330278 ^公報）やサ一モアナエロビゥム 'ブロツキー (Thermoanaerobium brockii) 由来のアルコール脱水素酵素 (J.Am .Chem.Soc. 108, 162-169 (1986)) が知られている。また、補酵素として NAD ⁺を要求する 2級アルコール脱水素酵素としては、ピキア ·エスピー NRRL- Y- 113 28 (Pichia sp. NRRL-Y-11328: Eur. J.Biochem. 101, 401-406 (1979)) 、シユードモナス ·エスピー SPD6 (Pseudomonas sp. SPD6: Bioorg.Chem. 19, 398-417( 1991)) 、シュ一ドモナス · フルォレツセンス NRRL B-1244 (Pseudomonas fluor escens NRRL B-1244:特開昭 59- 17982号公報）、シュ一ドモナス 'マルトフイラ MBllL (Pseudomonas maltophilia MBllL: FEMS Microbiol. Lett. 93, 49-56 (19 92)) 、シュ一ドモナス ·エスピー PED (Pseudomonas sp. PED: J.Org.Chem. 57 ， 1526-1532 (1992)) 、シュ一ドモナス 'エスピー ATCC 21439 (Pseudomonas s p. ATCC 21439: Eur. J.Biochem. 119, 359-364 (1981)) 、キャンディダ .ボイディニー SAH (Candida boidinii SAHM: Biochim.Biophys.Acta 716, 298-307(19 92)) 、ミコバクテリゥム ·バカェ JOB- 5 (Mycobacterium vaccae JOB- 5: J. Gen .Microbiol. 131, 2901-2907 (1985)) 、ロドコッカス . ロドクロウス PNKbl (R hodococcus rhodochrous PNKbl： Arch. icrobiol. 153, 163-168 (1990)) 、コマモナス ·テリゲナ (Comamonas terrigena: Biochim.Biophys.Acta 661, 74-86 ( 1981)) 、アースロバクタ一 'エスピー SBA (Arthrobacter sp. SBA: 特開昭 5卜 57882号公報）及びキャンディダ ·パラプシロシス IF0 1396 (Candida parapsil osis IFO 1396:特開平 7-231789号) が報告されている。

しかし、これらの 2級アルコール脱水素酵素の立体選択性は満足できるものではない。たとえば、 2級アルコール脱水素酵素の基質として最も報告の多い 2— ブ夕ノールに対して、（S) — 2—ブ夕ノ一ルを立体選択的に酸化し、 2—ブ夕ノンを生成する活性を有することが報告されている酵素は、キャンディダ ·パラプシロシス IF0 1396由来の 2級アルコール脱水素酵素のみである（シユードモナス 'エスピー ATCC 21439、シュ一ドモナス 'エスピ一 SPD6、コマモナス ' テリゲナ、キャンディダ ·ボイディ二一 SAHM、ビキア ·エスピー NRRL-Y- 11328 が産生する酵素においては R体が優先的に酸化され、シユードモナス · フルォレツセンス NRRL B-1244 が産生する酵素においては立体選択性を示さず、ミコバクテリウム 'バカェ JOB- 5、ロドコッカス · ロドクロウス PNKbl、シユードモナス - エスピー PED、シユードモナス 'マルトフイラ MB11L が産生する酵素においてはその立体選択性は記載されていない）。なお、パン酵母（Saccharomyces cerevi siae) 由来の 1級アルコール脱水素酵素（SADH I) が 2—ブ夕ノールの S体を優先的に酸化するという報告はあるが (Arch. Biochem. Biophys. 126, 933-944 ( 1968), J. Biol. Chem. 268, 7792-7798 (1993)) 、その相対活性はエタノールの 1%程度と極めて低く、到底実用に耐えられるものではない。このような状況から、高い立体選択性と広い基質特異性を持った 2級アルコール脱水素酵素を見いだすことが求められていた。発明の開示

我々は、ゲォトリカム 'キャンディダムがラセミ体 1 , 3—ブタンジオールに作用し、その（S) —体のみを立体選択的に酸化し、 4ーヒドロキシ 2—ブ夕ノンを生成することにより、（R) — 1 , 3—ブタンジオールを残存させる能力を有すること（特公平 6— 9595 1号公報）に若目し、ゲォトリカム .キャンディダムが生産する（S) — 1 , 3—ブタンジオール脱水素酵素を精製し、その酵素化学的性質を検討した結果、（S) — 1， 3—ブタンジォ一ルだけでなく、（ S) —フヱニルェ夕ノール、（S) — 3—ヒドロキシ一酪酸エステル、（S) — 2—ォク夕ノールなどに対して S体を優先的に酸化する高い立体選択性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、次の（1) 〜（3) に示す理化学的性質を有する酵素に関する

(1) 作用

NAD+ (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、アルコールを酸ィ匕し、ケトン又はアルデヒドを生成する。また、 NADH (還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。

(2) 基質特異性

芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。 1級アルコールに比較して 2級アルコールに対して活性が高い。フ；二ルェ夕ノールの（S) 体を優先的に酸化する。

芳香族置換を含む脂肪族アルデヒド又はケトンを還元反応の基質とする。

(3) 分子量

SD S— PAGEで測定した場合、約 51，000。ゲル濾過で測定した場合、約 107， 000。

本発明の酵素の上記以外の理化学的性質、及び酵素学的性質は以下の通りである。

(4) 作用至適 pH

(5) 一 1 , 3—ブタンジオール酸化反応の至適 pHが 8.0〜9.0であり、 4—ヒド口キシー 2—ブ夕ノン還元反応の至適 pHが 7.0である。

(5) 安定 pH範囲

pH9〜llの範囲で比較的安定である。

(6) 作用適温の範囲

(S) - 1 , 3—ブタンジオール酸化反応の ¾適温度は 55°Cである。

(7) 安定性

30°Cまで比較的安定である。

(8) 阻害

S H試薬であるパラクロロ水銀安息香酸（PCMB: p-chloromercuribenzoic acid) ゃョ一ドアセトアミド（IAA: iodoacetamide) により完全に阻害される。塩化水銀、塩化亜鉛などの重金属により阻害され、高濃度のエチレンジアミンテトラ酢酸や 2 _メルカプトエタノールによって阻害される。

(9) 精製方法

蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーなどを適当に組み合わせることにより精製することができる。たとえば、酵母菌体を破砕後、プ口夕ミン硫酸処理、硫安沈澱、 DEAE—トヨパール陰イオン交換クロマトグラフィ一、ブル一セファロ一ス 'ァフィ二ティークロマトグラフィー、プチルートョパール疎水クロマトグラフィー、 T SKG 3000 SWゲルろ過、モノ Q陰ィオン交換クロマ卜グラフィ一を行うことによりポリアクリルアミドゲル電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。

なお、本発明において、 2級アルコール脱水素酵素活性の測定は、リン酸力リウム緩衝液（pH8.0- 50〃mol) 、 N AD⁺-2.5 ffloK ( S) — 1， 3—ブタンジォ一ル- 50〃mol 及び酵素を含む反応液中 30°Cで反応させ、 NADHの生成に由来する 340 nmの吸光度の増大を測定することにより行った。 1Uは、 1分間に l /mol の NADHの生成を触媒する酵素量とした。

なお、ゲォトリカム属の生産する 2級アルコール脱水素酵素に関しては、ゲォトリカム .キャンディダムの菌体を用いた光学活性 3—ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法は知られていたが（Helv.Chim.Acta 66, 485-488 (1983)) 、この還元反応に関 -する酵素の特定はされていない。最近、ゲォトリカム ·キャンディダム IF04597株のァセトンパウダーを用いた光活性アルコールの製造方法が記載され、アルコール脱水素酵素の関与が指摘されているが（Tetrahedron Lett. 37 , 1629-1632 (1996)， Tetrahedron Lett. 37, 5727-5730 (1996)) 、補酵素として NADP+が NAD +よりもこの還元反応に効率的に作用することが記載されており、また、該酵素を特定し得るような酵素化学的性質の記載はない。また、ゲオトリカム .キャンディダム SC 5469株より 4一クロロー 3—ォキソ酪酸エステルを（S) —4—クロロー 3—ヒドロキシ酪酸エステルへ還元する酵素を部分精製したという報告があるが (Enzyme icrob.Technol. 14, 731-738 (1992)) 、酵素の精製度合いが低く性状の特定が困難であるとはいえ、分子量が 95万であり、補酵素として NADPを要求することから、少なくとも本発明の酵素とは明らかに異なるものである。また、ゲォトリカム 'エスピー WF9101株の 2級アルコ一ル脱水素酵素に関して rBiosci. Biotech. Biochem. 60, 1191-1192 (1996)」に記載があるが、酵素の精製方法、精製酵素の分子量や至適 pH、至適温度などの酵素化学的性質に関しては明らかになっていない。

また、本発明は、次の（1) ~ (3) に示す理化学的性質を有する酵素をコードする DNAに関する。 (1) 作用

(2) 基質特異性

芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。 1級アルコールに比較して 2級アルコールに対して活性が高い。フヱニルエタノールの（S) 体を優先的に酸化する。

( 3 ) 分子量

SDS— PAGEで測定した場合約 51， 000。ゲル濾過で測定した場合約 107， 000。本発明の DN Aは、以下のレプリカを用いた活性染色法により、当業者が容易に調製することができる。

ゲォトリカム属に属し、 2級アルコール脱水素酵素生産能を有する微生物を培養し、細胞壁分解酵素によりスフヱ口プラス卜とし、通常の方法（例えば J.Biol · Chem. 268, 26212-26219 (1993)， Meth. Cell. Biol. 29， 39-44 (1975)) により染色体 DN Aを調製する。精製した染色体 DN Aを適当な制限酵素（HindIII， Eco RI, BamHI, Sau3AIなど）により完全もしくは部分消化し、 2〜8 kb程度の DNA 断片を大腸菌の発現ベクター、例えば、 PUC18 (宝酒造製）、 PKK223- 3 (フアルマシァ製）、 pET誘導体（宝酒造など）、 pMAL-p2 (NEB製）などに導入し、得られた組換えプラスミドで大腸菌（ェシヱリヒア 'コリ JM109株など）を形質転換し、得られた形質転換株をプラスミドに応じた抗生物質（例えば/?一ラク夕マーゼ遺伝子を持つプラスミドではアンピシリンを 50 mg/L) を含む LB培地（Bacto - T ryptone 10 g, Bacto - Yeast extract 5 g, 塩化ナ卜リウム 10 g, Bacto - Agar 1 5 g/L) などのプレート上で培養し、適当な誘導物質（例えば、 lac， trp，trcプロモー夕一では IPTG) などの添加や温度上昇などにより酵素遺伝子を発現させる。得られた形質転換株のコロニーをプレートから濾紙などに写し取り（これをレプリカという）、このレプリカ上でリゾチームやクロ口ホルムなどにより菌を溶菌させ（例えば、 10 mg/mい Jゾチーム中で室温 30分程度放置する）、（S ) — 1 , 3—ブタンジオールなどの基質と、 N A D ^T、フエナジンメトサルフエ一卜（P MS), ニトロブル一テトラゾリゥム（NBT ) を含む反応液（例えば、 100 mM ( S )-l ，3 -ブタンジオール、 1 .3 mM NAD+、 0. 128 mM PMS、 0.48 mM NBTを含む反応液）にレプリカを浸し、反応させることにより、ゲォトリカム属由来の 2級アルコール脱水素酵素生産能をプラスミドにより付与された形質転換株のみが紫色を呈する。宿主として利用する大腸閑 JM109株、 HB101株、及び pUC18、 pKK223- 3などのプラスミドにより形質転換された大腸菌は（S )- 1 , 3-ブタンジオール脱水素酵素活性を有せず、レプリカを用いた活性染色法では紫色に染色されない。

呈色反応を示した形質転換株よりプラスミドを調製し、挿入された D N Α断片を部分的に欠失させたプラスミドを制限酵素消化ゃェンドヌクレアーゼにより調製し、欠失プラスミドで形質転換された大腸菌が 2級アルコール脱水素酵素生産能を有するかどうかをレプリカ法により調べることにより、 2級アルコール脱水素酵素遺伝子をコードする D N Aの領域を特定することができる。特定された D N A 領域の塩基配列を解析し、開始コドン、終止コドン、翻訳産物の分子量などからオープンリーディングフレームを特定することにより、ゲォ卜リカム属の生産する 2級アルコール脱水素酵素をコードする D N Aをクローニングすることができる。

なお、上記クローニングに際して遺伝子源として使用される 2級アルコール脱水素酵素生産能を有する微生物としては、 2級アルコール脱水素酵素生産能を有するゲオトリカム属に属するすべての菌株、突然変異株、変種などを含む。それらのうち特に好ましい菌株は、ゲォトリカム 'キャンディダム IF0 4601, IF0 5 368, IF0 5767、ゲォトリカム 'キヤピテ一タム（Geotrichum capitatum) JC 3 908、ゲォトリカム ·エリエンス（Geotrichum eriense) JCM 3912、ゲォトリカム • フラグランス（Geotrichum fragrans) JCM 1794、ゲォトリカム ·クレバー二一 (Geotrichum klebahnii ) JCM 2171、ゲォトリカム · レク夕ングレイ夕ム（Geo trichum rectangulatum ) JCM1750, ゲォトリカム · ファーメン夕ンス（Geotric hum fermentans ) IFO 1199, CBS 2143 などがあげられる。

ゲォトリカム属の生産する 2級アルコール脱水素酵素をコードする D N Aが大腸菌内で機能的に発現することは、ゲォトリカム属由来のリパーゼ遺伝子のクロ一二ングにおいて、オープンリ一ディングフレームに付随してクローニングされた制御領域が大腸菌により正しく認識され、リパーゼ遺伝子が正常に発現し、リパ —ゼ活性が発現したことが報告されていること（欧州特許第 2 4 3 3 3 8号明細書）、従来報告されているゲォトリカム属 ώ来の遺伝子にはイントロンが含まれていないこと（J. Biochem. 113, 776-780 ( 1993 ) ) などから、十分な蓋然性がある。また、大腸菌における発現べクタ一、例えば、 pUC18、 pKK223- 3、 pET、 pMAL - p2などを用い、プロモ一夕一の下流に順方向にオープンリ一ディングフレームを連結すれば、ゲォ卜リカム属由来の 2級アルコール脱水素^素を直接もしくは融合タンパク質として発現可能である。

なお、ゲオトリカム属の 2級アルコール脱水素酵素遺伝子が大腸菌において大腸菌の機能するプロモー夕一の下流に正しく配置されていても機能的に発現できない可能性（遺伝子中にイントロンを含む場合など）も考えられるが、このような場合には、染色体 D N Aをランダムに大腸菌のプラスミドに挿入せず、ゲォトリカム属よりメッセンジャ一 R N A (以下、 mRNAと略す）を調製し、 mRNAから逆転写酵素などを利用して c D N Aを調製し、 c D N Aを大腸菌や酵母の発現べク夕一に導入することにより機能的に発現させることができる。このとき、酵母の宿主べクタ一系としては、サッカロミセス 'セレビシェ ( Saccharomyces cerevisi ae) などを利用できる。サヅカロミセス 'セレピシェ AB 1380， INVSc2, BJ2168株などは何れも（S)-l，3 -ブタンジオール脱水素酵素活性を有せず、レプリカを用いた活性染色法で染色されない。なお、酵母においてレプリカを用いた活性染色法を行う際には、大腸菌における溶菌酵素であるリゾチームの代わりにザィモリアーゼ（Zymnolyase ) を用いる必要があるが、それ以外は大腸菌の方法をそのまま利用できる。

本発明の酵素、または、該酵素を産生する形質転換体もしくはその処理物を、ケトンまたはアルデヒドに作用させ、該ケトンまたはアルデヒドを還元してアルコールを製造することができる。また、本発明の酵素の広い基質特異性と高い立体選択性を利用して、本発明の酵素、または、該酵素を産生する形質転換体もしくはその処理物を、非対称ケトンに作用させ、該非対称ケトンを還元して光学活性アルコールを製造することができる。例えば、 4 —ヒドロキシー 2 —ブ夕ノンからの（S ) — 1 , 3—ブタンジオール、ァセトフエノンからの（S ) —フエ二ルエタノール、 2—ブ夕ノンからの（S ) _ 2—ブ夕ノール、 2—ォク夕ノンからの（S ) — 2—ォク夕ノール、 3 —ォキソ一酪酸エステルからの（S ) — 3— ヒドロキシ酪酸エステル、 4—クロ口— 3—ォキソ酪酸エステルからの（R ) — 4 一クロ口— 3—ォキソ酪酸エステルなどの光学活性アルコールの生産を行うことができる。

更に、本発明の酵素、または、該酵素を産生する形質転換体もしくはその処理物をアルコールに作用させ、該アルコールを酸化してケトンまたはアルデヒドを製造することができる。

更に、本発明の酵素、または、該酵素を産生する形質転換体もしくはその処理物は、ラセミ体アルコールを基質として、 2級アルコール脱水素酵素の不斉酸化能を利用した光学活性アルコールの生産にも利用できる。即ち、本発明の酵素によって、光学活性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することにより、光学活性アルコールが生産される。例えば、（R S ) — 1 , 3—ブタンジオールから（R ) - 1 , 3—ブタンジオール、（R S ) —フエニルエタノールから（R ) —フエニルエタノール、（R S ) —3—ヒドロキシ酪酸ェステルから（R) — 3—ヒドロキシ酪酸エステル、（RS) 4—クロ口一ー3— ヒドロキシ酪酸エステルから（S) _ 4—クロ口一 3—ヒドロキシ酪酸エステルなどを得ることができる。

なお、本発明において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物等も含まれる。また、本発明において、形質転換体の処理物とは、本発明の酵素をコードする遺伝子を導入され、該遺伝子が機能的に発現した異種生物を、アセトン沈殿、凍結乾燥、機械的並びに酵素的方法による細胞壁の破砕、界面活性剤、有機溶媒などにより細胞壁の透過性を変化させたものなどをいう。異種生物の宿主としては、例えば、イシエリキア属（Escherichia) 、バチルス属（Bacillus) 、セラチア属（Serratia) 、シユードモナス厲（Pseudomonas) 、ブレビパクテリゥム属 (Brevibacterium) 、コ 'リネノ、'クテリゥム厲 (Corynebacterium) 、ス卜レプ卜コッカス属（Streptococcus) 、ラクトバチルス属（Lactobacillus) 、サッカロミセス (Saccharomyces; 、クレイべ口ミセス属 (Kluyveromyces) 、シゾ'サッカ口；セス (Schizosaccharomyces) 、ナコサヅカロミセス属 (Zygosaccharomyc es) 、ャロウィァ属（Yarrowia) 、トリコスポロン属（Trichosporon) 、口ドスポリディウム属（Rhodosporidium) 、ハンセヌラ属（Hansemila) 、ピキア属（P ichia) 、カンジダ属 (Candida) 、ノィロスポラ属（Neurospora) 、ァスペルギルス属 (Aspergillus) 、セファロスポリゥム属 (Cephalosporium) 、トリコデルマ属（Trichoderma) などが挙げられる。

2級アルコール脱水素酵素による酸化反応に付随して NAD +から生成する NA DHの、 NAD'への再生は、微生物の含有する NADHから NAD +を再生する酵素（系）によって行ってもよいし、 NADHから NAD ⁺を生成する能力を有する微生物もしくは酵素、たとえば、グル夕ミン酸脱水素酵素、 N AD Hォキシダーゼ、 NAD H脱水素酵素などを反応系に添加することにより行ってもよいし、本発明の酵素の基質特異性を利用して反応系にァセトンなど還元反応の基質を添加して 2級アルコール脱水素酵素自身により NADHからの NAD +の再生を同時に行ってもよい。

また、還元反応に付随して NAD Hから生成する NAD ⁺の、 NAD Hへの再生は、微生物の持つ NAD +還元能（解糖系など）を用いて行うことができる。これら N A D ⁺還元能は、反応系にグルコースやェ夕ノ一ルを添加することにより増強することが可能である。また、 NAD+から NADHを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによつても行うことができる。たとえば、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素を含む微生物、その処理物、ならびに精製酵素を用いて NAD Hの再生を行うことができる。また、本発明の 2級アルコール脱水素酵素の性質を利用して、反応系にイソプロバノールなど本発明の酵素の酸化反応の基質を添加することにより、 2級アルコール脱水素酵素自身を用いて NADHの再生を行うこともできる。図面の簡単な説明

図 1は、精製 2級アルコール脱水素酵素のドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるパターンを示す図である。レーン 1は精製 2級アルコール脱水素酵素、レーン 2は分子量マーカーを示す。

図 2は、 2級アルコ一ル脱水素酵素の精製工程を示す図である。

図 3は、 2級アルコール脱水素酵素の、（S) — l， 3—ブタンジオール酸化反応の pH依存性を示す図である。

図 4は、 2級アルコール脱水素酵素の、 4ーヒドロキシー 2—ブ夕ノン還元反応の p H依存性を示す図である。

図 5は、 2級アルコール脱水素酵素の（S) — 1， 3—ブタンジオール酸化反応の温度依存性を示す図である。

図 6は、 2級アルコール脱水素酵素を各 pHにおいて 30°C、 30分処理した後の残存活性を示す図である。

図 7は、 2級アルコール脱水素酵素を各温度で 10分処理した後の残存活性を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

[実施例 1 ] ( 2級アルコール脱水素酵素の精製）

ゲォトリカム 'キャンディダム IF0 4601 株を YM培地（グルコース 1 0 g, パクトペプトン 5 g，酵母エキス 3 g, 麦芽エキス 3 g/L, pH 6.0) で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体を超高圧細胞破砕装置により破碎後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、核酸及びミクロゾームを除去した。遠心分離により得られた上清に、硫安を添加して 3 0%〜 7 0 %飽和において沈澱した画分を回収した。更に、 D EAE—トヨパールを用いたァニオン交換クロマトグラフィ一を行い、塩化ナトリゥムの濃度勾配溶出を行い、 2級アルコール脱水素酵素活性を有するピークを回収した。得られた画分をブルー一セファロースのァフィ二ティ一カラムに添加し、素通り画分を回収した。この素通り画分をブチルートヨパールを用いて疎水クロマトグラフィーを行い、 3 3 %硫安飽和〜 0 %までの勾配溶出を行い、 2級アルコール脱水素酵素の活性ピークを回収した。この両分を更に T S Kゲル G 3 0 0 0 の！！？ Cゲルろ過により精製した。活性両分を更にモノ Q (Mono Q)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィ一により精製した。得られた 2級アルコール脱水素酵素標品は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において 2本のバンドを生成し、活性染色の結果、移動度の小さいバンドが 2級ァルコール脱水素酵素であることが明らかになった。このバンドの分子量は、 51,0 00 であった（図 1 )。また、 T SKゲル G 3 0 0 0 SWXLの分析用ゲルろ過力ラムを用いて精製酵素の分子量を測定したところ、 107,000 であった。精製の要約を図 2に示す。精製酵素の比活性は、 22.1 U/mg-タンパク質であった。 [実施例 2 ] ( 2級アルコール脱水素酵素の至適 p H)

カリウム一リン酸緩衝液（ K P B ) 、トリスー塩酸緩衝液（ Tr i S- HC 1 )、ブリットン一ロビンソン緩衝液を用いて p Hを変化させて、 2級アルコール脱水素酵素の、（S) — l , 3—ブタンジオールの酸化活性、 4ーヒドロキシ一 2—ブ夕ノンの還元活性 [NAD^ をNADH(0.4〃mol) に変えた以外は（S) — 1 , 3— ブタンジオール酸化活性測定と同じ条件で測定] を、 NAD Hの減少にともなう 340nm の吸光度の減少を測定することによって調べた。最大活性を 1 00とした相対活性で表し、図 3、 4に示した。反応の ¾適 p Hは、（ S ) _ 1， 3—ブ夕ンジオール酸化反応が 8.0〜9.0 (図 3) 、 4—ヒドロキシ一 2—ブ夕ノンの還元反応が 7.0 (図 4) であった。

[実施例 3 ] (2級アルコール脱水素酵素の作用至適温度）

2級アルコール脱水素酵素活性を標準反応条件のうち温度だけを変化させて測定し、最大活性を 1 00とした相対活性で表し、図 5に示した。（ S ) — 1， 3 一ブタンジオール酸化の至適温度は 55 °Cであった。

[実施例 4 ] (2級アルコール脱水素酵素の p H安定性）

トリス一塩酸緩衝液 pH8.0〜9.0、ブリツトン—ロビンソン緩衝液 pH5.0〜12. 0中で 30°C、 30分間処理後の残存活性を測定し、最火活性を 1 00とした相対活性で表し、図 6に示した。 pH9.0〜11.0 において最も安定であった。

[実施例 5 ] (2級アルコール脱水素酵素の温度安定性）

2級アルコール脱水素酵素を pH8.0 で 10分問放置した後、残存活性を測定し最大活性を 1 00とした相対活性で表し、図 7に示した。 30°Cにおける残存活性が 5 1 %程度であった。

[実施例 6 ] (2級アルコール脱水素酵素の基質特異性）

2級アルコール脱水素酵素を種々のアルコール、アルデヒドと反応し、その酸化、還元反応の活性を（S) — 1 , 3—ブタンジオールの酸化、 4ーヒドロキシ一 2—ブ夕ノンの還元を 100とした相対活性で表し、表 1に示した。 14

表 1 δ 3¾ 基質濃度補酵累相対活性

(m ) (¾)

酸化反応

(S)-l, 3-ブタンジオール 50 NAD+ 100

50 NADP+ 2. 4

00- 1, 3-ブタンジオール , 50 NAD+ 8. 8

(S) -卜フエニルエタノール 50 NAD+ 267

00-1-フェニ^;レエ夕ノール 50 NAD+ 19. 2

(S) - 2-ォクタノール 5 NAD+ 187

00-2-ォクタノール 5 NAD+ 13. 3

(S) - 3-ヒドロキシ酪酸メチルエスヲ 50 NAD+ 138

00 - 3-ヒドロキシ酪酸メチルエスヲ 50 NAD+ 22. 1

(RS〉-2-ブタノール 100 NAD+ 85. 9

(S) -2-ブ夕ノール 50 NAD+ 112

(R) - 2-ブタノール 50 NAD+ 60. 0

(S)-l. 2 -プロパンジオール 50 NAD+ 23. 8

(R) - 1, 2-プロパンジオール 50 賺 10. 4

2-プロパノール 100 NAD+ 96. 8 シクロへキサノール 20 NAD+ 90. 4 メタノール 100 NAD+ 60. 8 エタノール 100 NAD+ 10. 7 ァリルアルコール 100 NADt 18. 7

1-プロパノール 100 NAD+ 15. 5

1-ブタノ一ル 100 NAD+ 12. 9 グリセロール 50 NAD+ 0

還元反応

4 -ヒドロキシ -2-ブ夕ノン 20 NADH 100

20 NADPH 0

アセトン 100 NADH 164

ァセ卜フエノン 20 NADH 122

ァセ卜酢酸ェチルエステル 100 NADH 96. 8

2-ブタノン 100 NADH 20. 2

[実施例 7 ] (2級アルコール脱水素酵素の阻害剤に対する挙動）

2級アルコール脱水素酵素を種々の試薬中で 3 0 °C、 1 0分間処理し、残存活性を表 2に示した。 15 表 2 阻害剤濃度（）残存活性（％)

エチレンジァミン 4醉酸 1.0 63.5

10 9.8

塩化亜鉛 1.0 0.9

塩化コバルト 1.0 81.0

硫酸銅 1.0 71.5

P-クロ口水銀安息香酸 0.05 0.0

ョードアセトアミド 1.0 2.4

ジチオスレィトール 1.0 42.9

2-メルカプトエタノール 0.01¾ 6.8

塩化水銀 1.0 0.0 ョードアセトアミド、パラクロロ水銀安息香酸、塩化水銀、塩化亜鉛、高濃度の金属キレ一夕一、 2—メルカプトエタノールによって顕著に阻害された。

[実施例 8 ] 酵素反応論的解析

精製した 2級アルコール脱水素酵素の各種基質に対する反応速度定数を測定した結果、（S )-l , 3 -ブタンジオールに対する Km値は 41.4 mMであり、 Vmaxは 36.7 U/mg -タンパク質であった。また、（R)-l , 3 -ブタンジオールに対する Km値は 165 mM、 V maxは 4.43 U/mg -タンパク質であり、 E値は 33.0であった。産業上の利用の可能性

広い基質特異性と、高い立体選択性を有する 2級アルコール脱水素酵素が提供された。本酵素を利用することにより、光学活性アルコールゃケトン、特に光学活性アルコールゃケトンの効率的な生産方法が提供された。

Claims

請求の範囲

1. 次の（ 1) から（3) に示す理化学的性質を有する酵素。

(1) 作用

NAD+ (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、アルコールを酸化し、ケトン又はアルデヒドを生成する。また、 NADH (還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として、ケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。

(2) 基質特異性

芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基 Hとする。 1級アルコールに比較して 2級アルコールに対して活性が卨ぃ。フエ二ルェ夕ノールの（S) 体を優先的に酸化する。

(3) 分子量

SD S-PAGEで測定した場合約 51，000。ゲル濾過で測^した場合約 107,000。

2. ゲォトリカム（Geotrichmn) 属に属し、請求項 1の酵素を産生する微生物を培養し、培養物から該酵素を取得することを特徴とする、請求項 1記載の酵素の製造方法。

3. 請求項 2に記載の方法において、ゲオトリカム属に属する微生物が、ゲォトリカム .キャンディダム（Geotrichmn candidum) であることを特徴とする方法。

4. 請求項 1に記載の酵素をコードする DNA。

5. 請求項 4記載の DNAを含むベクター。

6. 請求項 5記載のベクターを保持する形質転換体。

7. 請求項 1に記載の酵素、または、該酵素を産生する形質転換体もしくはその処理物を、ケトンまたはアルデヒドに作用させ、該ケトンまたはアルデヒドを還元してアルコールを製造することを特徴とする、アルコールの製造方法。

8 . 請求項 1に記載の酵素、または、該酵素を産生する形質転換体もしくはその処理物を、非対称ケトンに作用させ、該非対称ケトンを還元して光学活性アルコールを製造することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。

9 . 詰求項 1に記載の酵素、または、該酵素を産生する形質転換体もしくはその処理物をアルコールに作用させ、該アルコールを酸化してケトンまたはアルデヒドを製造することを特徴とする、ケトンまたはアルコールの製造方法。

1 0 . 請求項 1に記載の酵素、または、該酵^を産生する形質転換体もしくはその処理物をラセミ体アルコールに作用させ、光学活性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。