WO1998016245A1

WO1998016245A1 - Procede de determination d'un auto-anticorps

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Publication number: WO1998016245A1
Application number: PCT/JP1997/001259
Authority: WO
Inventors: Tomohiko Taminato
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 1998-04-23
Anticipated expiration: 1999-04-15
Also published as: JP4233608B2

Description

明細書自己抗体測定方法技術分野

本発明は CD38ぺプチド断片を用いた抗 CD38自己抗体の測定方法、 GD38ぺプチド、その断片およびその変異体を含有する自己免疫疾患治療用医薬組成物に関する。背景技術

インスリン依存型糖尿病（I DDM ) は、膝島に自己免疫的炎症（膝島炎）が起こつてインスリンを産生 ■ 分泌する細胞（細胞）が破壊され、インスリンが極度に欠乏するために発病する。従って、 I DDMおよび塍島炎の根本的治療としては発病前治療、早期治療、即ち隧細胞が破壊される前に治療を行う必要があり、その早期診断方法が重要である。しかし、現在行われているのは病理解剖または生体検査による発病後の診断方法のみであり、診断された時点では既にインスリン生産細胞が破壊されている。発病前の病理解剖等の上記方法による診断は倫理上不可能であることから、インスリン依存型糖尿病および膝島炎患者を発病前に診断する方法が種々試みられているが、いずれも不十分であった。

CD38は分子量 46kDaの糖タンパク質であり、主としてリンパ球表面に認められ、 T細胞、 B細胞の分化および活性化のマーカ一として、さらに、 T細胞、 B細胞の悪性度（幼若度）の指標として用いられている。最近、 CD38分子の cDNAをプローブにしたノーザンブロット解析や、 GD38分子に対する特異抗体を用いた免疫組織染色により、 CD38は白血球、免疫細胞に限らず、ラット脳、十二指腸、心臓、脳下垂体、膝島にも発現していることが確認された。

CD38はさらに、細胞内に環状 ADP リボース（cyc l i c ADP- r i bos e； cADPR ) を生成させ、この cADPRを介して細胞内カルシウムの移動を制御していることも明らかとなつた。 1 993年 Okamotoらは、膝島細胞において cADPRが細胞内カルシゥムの増加を介してインスリン分泌を促進するという新たな仮説を提唱した。発明の開示

CD38は膜結合型蛋白で可溶性部分が血中流出し、機能発現すると考えられる。そこで、 CD38のアミノ酸配列から細胞膜外にあり、機能調節に関与していると推定されるべプチド断片 3種類を用い、抗 CD38抗体陽性血清を測定したところ、 3種類のペプチド断片のうち C末端部分（配列番号 1 ) のペプチドが最も強い反 J心 ¾r示しに。

本発明者は膝島細胞において GD38免疫活性が細胞外周（おそらく細胞表面）に局在し、さらに市販の抗 CD38モノクローナル抗体処理によってインスリン分泌が有意に抑制されることを見出した。

糖尿病患者において抗 CD38抗体の存在を検討したところ、 I DDM患者血清の約 68%に検出された。さらに、 I DDMの最適モデル動物として評価の確立している NODマウスにおいては、膝島における自己免疫的炎症が起こっている第 7週齢以後、 50- 70%に抗 CD38抗体が検出された。このように、ヒトおよびモデル動物の血中に CD38に対する自己抗体が出現していることを見出した。

この抗体はそれ自体がィンスリン分泌を抑制していると同時に、膝島において薛島炎が起こり細胞の破壊が進行していることを示すマーカ一としての意義を有すると考えられる。従って、抗 CD38抗体はインスリン分泌機構に深く関与していることから、抗 CD38抗体を測定することは I DDMおよび膝島炎の発病予知に寄与し得ると考えられる。

一方、抗 CD38抗体によりインスりン分泌が抑制されることから CD38はインスリン分泌の調節■ 制御に重要な役割を果たしている可能性がある。

本発明は CD38の C末端部分のぺプチドを用い、糖尿病患者血清中の抗 CD38自己抗体の測定系を確立し、抗 CD38 自己抗体と糖尿病発生機構との関連性について解析を行った結果を基礎とする。

即ち、本発明は CD38ペプチド断片を用いた抗 CD38自己抗体の測定方法、 GD38 ぺプチド断片を用いた自己免疫疾患治療用医薬組成物、および配列番号 1記載のアミノ酸配列を有するペプチドに関する。

本発明は CD38ぺプチド断片、好ましくは CD38ぺプチドの細胞外領域における 10-30 ァミノ酸残基からなるぺプチド断片、よリ好ましくは配列番号 1 記載のァミノ酸配列を含むぺプチドまたはそのアミノ酸配列に 1 または数個のァミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる少なくとも 1 つの変異を有するぺプチドを用いた抗 CD38自己抗体の測定方法に関する。

抗 GD38自己抗体の測定は競合法、サンドウイツチ法等を用いることができる。例えば、 CD38ぺプチド断片をマイクロタイタープレートにアビジン一ビォチン法などにより固相し、患者より入手した検体、例えば血清、血漿を加え、ペルォキシダーゼまたはアル力リホスファターゼなどで標識した抗 CD38抗体に対する抗体を反応させ、対応する基質、例えばオルトフエ二レンジァミンまたはテトラメチルベンチジン、あるいは 4-ニトロフエニルホスフェートを加え、呈色反応を行った後、吸光度を測定する。

また、本発明のぺプチド断片またはその変異体はヒト CD38 のァミノ酸配列 (Jackson DG. , Bel I Jl. , J Immono!. 144, 2811-2815, 1990) Iこ基づし、てメリ一フィールド固相合成方法（Merrifield , R. B. , J. Am. Chem. Soc. , 85， 2149- 2156 (1963)) により化学合成することができる。

本発明はさらに、化学的に修飾されていてもよい、 CD38ペプチド、そのぺプチド断片またはその変異体を含有する自己免疫疾患治療用医薬組成物、特に自己免疫疾患が薛島炎または糖尿病である該組成物に関する。

「化学的修飾」とは治療薬としてペプチドを投与する場合、生体中に存在する様々なプロテアーゼによる分解から保護するために行われるあらゆる修飾を意味し、典型的にはポリエチレングリコール（PEG) などでペプチドを修飾することを意味する。例えば、治療薬としてペプチドを投与すると生体中に存在する様々なプロテア一ゼによる分解を受ける場合がある。そのためぺプチドを治療薬として投与する場合、大量投与しなければその効果は期待できないが、生体への影響から大量投与は避けなければならない。そのためプロテアーゼ等の影響を受けにくい形態で投与すれば少量でかつ有効濃度をより長く維持することが可能となる。インタ一ロイキン（）等を PEG等で修飾することにより、生体中での分解が抑制され有効濃度が長時間維持されることが報告されている。そこで、それらのぺプチド修飾方法を CD38 ぺプチド、そのべプチド断片およびその変異体に応用することができる。

CD38 ぺプチドのぺプチド断片とは配列番号 2 記載のアミノ酸配列から任意に選ばれる 5以上のァミノ酸残基を有するぺプチドであり、好ましくは細胞外領域を含むぺプチド、より好ましくは自己抗体の抗原部位を含むぺプチドを意味する

CD38ぺプチドまたはそのべプチド断片の変異体とは CD38 ぺプチドまたはそのペプチド断片のアミノ酸配列に 1 または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加等の中から選ばれる少なくとも 1 つの変異を有するぺプチドを意味する。このようなペプチドおよびそれらの変異体の作製方法は Molecular Cloning A Laboratory Manual 第 2 版、 an ι at ι s, T. et a I , Gold Spring Harbor Laboratories (New York) , (1989) ) に記載されている。

ィンスリン依存型糖尿病は膝臓が自己免疫反応によリ）S細胞が破壊され、ィンスリン分泌機能が低下することに起因する自己免疫疾患である。一般に、自己免疫疾患に対して自己抗原投与により免疫応答を起こさなくする状態、つまり「免疫寛容」を誘導することによって抗原特異的に免疫抑制し、発病を防ぐ治療方法がある。従って、本発明の CD38 ぺプチド、その断片およびそれらの変異体は自己免疫疾患である IDDM の治療に用い得る。これらは降島に対する自己抗体の攻撃を中和する効果も期待できる。

一般に、自己抗原タンパク質、抗原ペプチドなどの投与方法は抗原量、投与経路および抗原形態などの様々な要素が関係する。このうち特に治療への応用が検討されているのは経口投与による「免疫寛容」の誘導である。抗原が経口的に摂取された時に生じる免疫寛容を「経口トレランス」といい、原因抗原が明確な自己免疫疾患の治療方法としては経口投与が有用と考えられている。自己免疫疾患である慢性関節リュウマチにおいて原因抗原であるコラーゲンの経口投与によリ関節炎の発生が抑制されたことが報告されておリ、臨床への応用も試みられている。そこで、慢性関節リュウマチでのコラーゲン療法を応用し、 DM および膝島炎においても発病前もしくは発病早期に CD38 ペプチド、そのペプチド断片またはそれらの変異体を経口投与し、経口トレランスによる抗原特異的免疫抑制の有用性が示されれば患者の負担が大きく軽減され、画期的な治療薬となることが期待できる。本発明の治療用医薬組成物に用いる CD38 ぺプチド、そのぺプチド断片またはそれらの変異体は遺伝子工学的に作製されたものでもよい。

本発明は、さらに、経口、経鼻、静脈内、腹腔内および胸腺内投与可能な剤形から選ばれる治療用医薬組成物に関する。

本発明のぺプチドを含有する治療用医薬組成物を投与する場合は通常の剤形、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤；水剤；油性懸濁剤；シ口ップ剤またはエリキシル剤等の液剤；および水性または油製懸濁注射剤等を用いることができる。いずれの場合も、その調製に際しては、慣用の賦形剤、結合剤、水溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤等の担体を必要に応じて用いることができ、また、他の添加剤、例えば保存剤、安定化剤等を含む物であつても良い。図面の簡単な説明

図 1 はインスリン放出作用に対する抗 GD 38抗体の作用を示すグラフである。実施例

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。実施例 1

GD 38抗原のィンスリン分泌機構における役割一CD38ぺプチド断片

CD 38 抗原に対する抗体がィンスリン分泌を抑制することから、この抗原はインスリン分泌機序において重要な役割を果たしていると推定される。一方、本抗原は様々な酵素活性などの多彩な機能を有することが知られている。今回は、 GD 38 抗原の断片に対する抗体を作成してそれらのインスリン分泌に及ぼす効果について検討し、本抗原の構造一機能連関と、インスリン分泌機構に果たす意義について追求した。

方法 ( 1 ) in 6 細胞（膝臓細胞由来インスリン分泌細胞株）： Min 6 細胞は 10% FCS D EM (Glucose 20mM) にて培養した。

( 2 ) 抗 CD38抗体：抗 GD38モノクローナル抗体（T10;マウス lgG1) , および二種類の CD38 ぺプチド断片 287-297 (N-Cys Va I Lys Asn Pro 6lu Asp Ser Ser Cys Thr - C: 287-Ag) 、 241-255 ( N-Cys Ser Asn Asn Pro Va I Ser Val Phe Trp Lys Thr Va I Ser Arg-C ; 241 -Ag ) をそれぞれ Keyhole Limpet Hemocyan ine と抱合し、家兎に免疫して作成したポリクローナル抗体を用いた。

( 3 ) インスリン分泌： Min 6 細胞を 48 穴プレー卜に培養し、分泌実験時には 10/oFGS 添加 KRB緩衝液を培地とした。これに抗 CD38 抗体、 D-グルコース (5, 20mM)、および種々のインスリン分泌刺激物質を加え、 30 分間で培養液に分泌されたインスリンを R I Aによって測定した。

( 4 ) [Ca ^{2 +}] ί

の測定： 1-[2- (5'カルボキシォキサゾル- 2'-ィル） -6-ァミノべンゾフラン- 5-ォキシ ]-2- (2'-ァミノ -5'-メチルフエノキシ）エタン- Ν, Ν, Ν', N' -四酢酸五カリウム塩（C₂₉H₂₂K₅N₃₀0₁₄； Fura-2) AM (終濃度 2 M) を負荷した Min 6細胞を、流速 0.3 ml/min で灌流しながら ARGUS 100 (浜松 PHOTONICS社製）によつて蛍光 340 nm/380 nm比を測光し、 [Ca ^{2 +}] i を経時的に測定した。

成績

( 1 ) 抗 GD38 モノクローナル抗体を前処理することによって、 D-gl ucose (20m ) 、 D-mannose (20mM) 、 L-arginine ( 10mM) 、 " - KIC ( 10mM) 、 glucagon (1 μ M) 、 f orsko I in lD j M) 、 Carbamy I cho I i ne い iJO ju M) 、などによるィンスリン分泌が強く抑制された。得られた結果を図 1 に示す。

( 2 ) 287-Ab を用いた場合には、抗 CD38 モノクローナル抗体とほぼ同様の効果が見られた。なお、 CD38抗原の断片 67-81 (N-Cys Val Lys Tyr Thr Glu Me His Pro Glu Met Arg His Val Asp— G； 67—Ag) を免疫抗原として得られた抗体 67-Ab を用いた場合 287-Abのような強いインスリン分泌抑制効果は得られなかった。

( 3 ) 241-Abはィンスリン分泌に明らかな効果を及ぼさなかった。 ( 4 ) 抗 GD38 モノク口一ナル抗体および 287- Ab の処理は D- glucose による [Ca ^{2 +}] i 反応を遅延、低下させた。

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CD38 抗原のなかでも特に、フラグメント 287-297 近傍がインスリン分泌、 [Ca ^{2 +} ] i 反応、すなわち睦 yS細胞内情報伝達系に深く関与しており、この膜外蛋白の構造一機能連関の重要な意義が確認された。実施例 2

抗 CD38抗体の測定

方法

配列番号 1 に記載のぺプチド 287- Ag を抗原とし、 EIA 用 96 穴プレー卜へ吸着 ' 固相化を行った後、 BSA で一昼夜ブロッキングを行い測定に用いた。サンプルとしてヒト、ラット、マウス等の血清を用いた。上記で作製した抗原固相 96 穴マイクロプレートに血清サンプルを添加し、室温で約 60 分間緩やかに振盪で十分に反応させる。血清サンプルを捨て、洗浄操作を十分に行った後、ビォチン化二次抗体液を加える。

ビォチン化二次抗体は血清サンプルがヒ卜の場合にはビォチン化抗ヒト IgGを、ラット、マウスの場合にはそれぞれビォチン化抗ラット lgG、ビォチン化抗マウス IgGを用いる。室温で約 60分間緩やかに振盪した後、洗浄操作を十分に行う。次いでアビジン一 DH および、ビォチン化ペルォキシダーゼまたはビォチン化ァルカリフォスファタ一ゼを加えて、室温で約 30 分間緩やかに振盪する。 ABC 試薬を捨て、 PBS を 100 ml/wel I ずつ加えて約 5 分間緩やかに振盪した後、洗浄操作を十分に行う。基質（オルトフエ二レンジァミン（0P) 、テトラメチルベンチジン（TMB) 、 4-二トロフエニルフォスフェートまたは 2, 2'-ァジノ-ビス（1- ェチルベンゾチアゾリン- 6-スルホン酸）（ABTS) 等）溶液を加え、室温、暗所で呈色反応を起こさせ、吸光度を計測する。

成績

ヒトにおいては 1δ0例の糖尿病患者血清を用いて、抗 CD38 抗体を測定した。その結果、 IDDM においては 32 例中 22 例（68%) が陽性であり、これに対してインスリン非依存型糖尿病（NIDDM) においては 128例中 16例（12.5%) のみが陽性であった。

IDDM のモデル動物である NOD マウスにおいては、滕島における自己免疫的炎症（膝島炎）が起こっている第 7 週齢以降では 84%の陽性率であった。本マウスの系では第 11 週齢以降に糖尿病が発病する。なお、膝島炎が未だ起こっていない第 5週齢では全例が陰性であった。

S¾ 5冊

抗 CD38 抗体は糖尿病発病前、膝島炎出現と同時期に検出されることから、糖尿病発病の予知に有用であり、インスリン依存型糖尿病の早期治療、発病予防に寄与しうるものと考えられる。配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 1 1

配列の型：ペプチド

配列：

Cys Va I Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr

5 10 配列番号： 2

配列の長さ： 300

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

ATG GCC AAC TGC GAG TTC AGC CCG GTG TCC GGG GAC AAA CCC TGC TGC 48 Met Ala Ans Cys Glu Phe Ser Pro Va I Ser G ly Asp Lys Pro Cys Cys CGG CTC TCT AGG AGA GCC CAA CTC TGT CTT GGC GTC AGT ATC CTG GTC 96 Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gin し eu Cys し eu Gly Val Ser I I e Leu Va I

20 25 30

CTG ATC CTC GTC GTG GTG CTC GCG GTG GTC GTC CCG AGG TGG CGC CAG 144 し eu I I e Leu Val Va I Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg I rp Arg Gin

35 40 45

ACG TGG AGC G6T CGG GGC AGC ACC AAG CGC TTT GCC GAG ACC GTC CTG 192 Thr Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr し ys Arg Phe Pro Glu Thr VaL Leu

50 55 60

GCG CGA TGC GTC AAG TAG ACT GAA ATT CAT CCT GAG ATG AGA CAT GTA 240 A I a Arg Cys Va I し ys Tyr Thr Glu l ie His Pro Glu Met Arg His Va I 65 70 75 80

GAC TGG CAA AGT GTA TGG GAT GCT TTC AAG GGT GCA TTT ATT TCA AAA 288 Asp Cys Gin Ser Va I Trp Asp Ala Phe し ys Gly Ala Phe l ie Ser し ys

85 90 95

CAT CCT TGC AAC ATT ACT GAA GAA GAC TAT GAG CCA CTA ATG AAG TTG 336 His Pro Cys Asn I I e Thr Glu G I u Asp Tyr Gin Pro し eu Met Lys し eu

100 105 110

6GA ACT GAG ACG GTA CCT TGC AAC AAG ATT CTT CTT TGG AGC AGA ATA 384 Gly Thr Gin Thr VaL Pro Cys Asn Lys I I e し eu し eu Trp Ser Arg l ie

115 120 125

AAA GAT CTG 6CC CAT CA6 TTC AGA GAG GTC CAG CGG GAC ATG TTC ACC 432 Lys Asp Leu A I a His Gin Phe Thr Gin Val Gin Arg Asp Met Phe Thr

130 135 140

CTG GAG GAC ACG CTG CTA GGC TAC CTT GCT GAT GAC CTC ACA TGG TGT 480 し eu G I u Asp Thr し eu し eu Gly Tyr し eu A I a Asp Asp Leu Thr Trp Cys 145 150 155 160 > ■σ O -H < > > > > >

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Claims

請求の範囲

1 . GD38ぺプチド断片を用いた抗 CD38自己抗体の測定方法。

2 . CD38ぺプチド断片が配列番号 1記載のァミノ酸配列を含むぺプチドまたはそのアミノ酸配列に 1 または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる少なくとも 1 つの変異を有するぺプチドである請求項 1記載の測定方法。

3 . 配列番号 1記載のアミノ酸配列を含むぺプチドまたはそのアミノ酸配列にまたは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる少なくとも 1 つの変異を有する CD38ぺプチド断片。

4 . 化学的に修飾されていてもよい、 CD38ペプチド、その断片またはその変異体を含有する自己免疫疾患治療用医薬組成物。

5 . CD38ペプチド、その断片またはその変異体が遺伝子工学的に作製されたものである請求項 4記載の治療用医薬組成物。

6 . 自己免疫疾患が (I萃島炎または糖尿病である請求項 4または 5記載の治療用医薬組成物。

7 . 経口、経鼻、静脈内、腹腔内および胸腺内投与可能な剤形から選ばれる請求項 4、 5または 6記載の治療用医薬組成物。