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WO1998014600A1 - SISTEMA DE TRANSFORMACION EN $i(CANDIDA UTILIS) - Google Patents

SISTEMA DE TRANSFORMACION EN $i(CANDIDA UTILIS) Download PDF

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WO1998014600A1
WO1998014600A1 PCT/CU1997/000005 CU9700005W WO9814600A1 WO 1998014600 A1 WO1998014600 A1 WO 1998014600A1 CU 9700005 W CU9700005 W CU 9700005W WO 9814600 A1 WO9814600 A1 WO 9814600A1
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WO
WIPO (PCT)
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yeast
host
candida
defective
gene
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/CU1997/000005
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Luis Rodriguez Menocal
Francisco Pablo Chavez Espinoza
María Elena GONZALEZ MARTINEZ
Tanilo Rivero Baeza
Liliana Besabe Tuero
Edenia Paifer Reyes
Julio Marcos Delgado Boada
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Original Assignee
Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
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Publication date
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Priority to CA002268004A priority patent/CA2268004A1/en
Priority to EP97943729A priority patent/EP0956356A1/en
Priority to AU45485/97A priority patent/AU744698B2/en
Priority to BR9713313-2A priority patent/BR9713313A/pt
Publication of WO1998014600A1 publication Critical patent/WO1998014600A1/es
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2431—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase

Definitions

  • the present invention is related to the field of genetic engineering and biotechnology, and in particular to the development of a host-vector system for the genetic transformation of the yeast Candida or tilis, which allows the expression and secretion of heterologous proteins in this yeast, which can be subsequently used for various purposes.
  • Escherichia coli bacteria have been for some time the most widely used microorganism for these purposes by various biotechnology companies, due to the knowledge they have regarding their genetics, their easy handling and their large-scale culture systems.
  • heterologous proteins in euca ⁇ ot systems has some advantages over prokaryotic systems. Among these we can point out the ability to grow at high cell densities and the possibility of adapting their culture to continuous systems.
  • yeasts are able to secrete proteins to the culture medium in considerable greater amounts compared to E. coli, and the culture media used for yeast growth are cheaper than those used in bacteria (Lemome, Y., 1988. Heterologous expression ⁇ n yeast. 8th International Biotechnology Symposium, Paris, July 17-22).
  • these systems can carry out other post-translational modifications such as glycosylation, which is absent in bacterial systems (Fiers, W., 1988.
  • Saccharomyces cerevisiae protein expression in Saccharomyces has faced problems ranging from low levels of expression obtained using its homologous promoters until hyperglycosylation of the products secreted to the medium, that is why in recent years the search for unconventional yeasts for use in the expression of heterologous proteins has intensified.
  • Candida utilis yeast is particularly interesting because of its peculiar characteristics. First, it uses a wide spectrum of cheap carbon sources such as xylose, sucrose, maltose among others. Another interesting feature is that it is possible to efficiently produce a large number of cells in a continuous culture.
  • Candida utilis like Saccnaromyces cerevisiae and Kl uyveromyces lactis, have been authorized by the FDA (Food an Drug Administration) as safe sources of food additives. At the same time, Candida utilis has been used as a source for the industrial production of L-glutamma, ethyl acetate, mvertase, among other products.
  • a preliminary transformation system in Candida utilis has been described by Ho, I. et. al., 1984, (Biotechnology and Bioengmeenng Symp. 14: 295-301). In the mentioned work there is no direct evidence of the presence of the antibiotic resistance marker, so the direct verification of the transformation is incomplete.
  • Candida utilis could be an attractive organism for commercial use as an expression system for heterologous proteins.
  • the objective of the present invention has been to provide a transformation system that allows to express heterologous proteins in Candida yeast or tilis, based on obtaining auxotrophic mutants of this species as well as in the isolation of genes, from a genomic library , which complement said auxotrophies.
  • the transformation process described here provides means for the introduction of DNA fragments or sequences into a host strain of Candida utilis and allows this yeast to be used for protein expression and production.
  • the isolation of genes whose promoter and thermatoring sequences can serve for the expression of heterologous genes in said yeast has been a purpose of this invention.
  • transformed yeast cells can be identified and selected by the methods described in the present invention.
  • New strains of Candida utilis, vectors and subclones are provided.
  • the new strains are used as hosts for the introduction of recombinant DNA fragments.
  • the invention also relates to the stable transformation and maintenance of said DNA fragments in the host cells, where the marker is integrated by homologous recombination in the yeast genome.
  • the invention consists of a new transformation system for the yeast Can ⁇ ida or tilis, which uses new auxotrophic mutants isolated from strain NRRL Y-1084 of said yeast as hosts.
  • mutants are deficient in the enzyme orot ⁇ dm-5 phosphate decarboxylase of the uracil biosmhesis pathway or in the enzyme imidazole glycerol phosphate dehydratase of the biosmtetic pathway of histidma, which were obtained by using classical mutagenesis caused by physical agents chemists known from the state of the art (Sherman, F. et al., 1986. Laboratory course: Manual for methods m yeast genetics. Cold Sprmg Harbor Laboratory Press, NY). These mutants showed a high stability (reversal frequency approximately 10) and can be efficiently transformed by the method described in the present invention.
  • the URA3 gene coding for the enzyme orotidin 5-monophosphate decarboxylase and the HIS3 gene coding for the enzyme Imidazol-glycerol phosphate dehydratase, were isolated as selection markers for the new Candida or tilis mutants, which were isolated at from a library of Candida utilis constructed in plasmid pUC19 and identified by complement of the pyrF and h ⁇ sb463 mutations of the E strains. coli MC1066 and KC8 respectively.
  • the URA3 gene of C. u til is complement the URA3 mutation of Sa ccnaro yces cerevisiae SEY 2202. The complete sequence of the isolated genes was determined and the predicted amino acid sequence showed a high similarity with that of the same gene from other yeasts and mushrooms .
  • the mtegrative vectors constructed to perform the transformation of this mutant were pURA5 and pUREC3. These plasmids contain the URA3 gene isolated from Candida utilis as a selection marker, in addition to presenting chromosomal DNA regions that are flanking it, thus favoring integration into the Candida utilis locus by homologous recombination.
  • Another novel aspect of the present invention is the isolation of the gene that encodes the enzyme sucrose invertase or P-fructofuranosidase ⁇ INV1) of Candida utilis, as well as the identification of the promoter, thermator regions and the signal sequence of this gene, which can also be advantageously used in the protein expression of different origins in said yeast.
  • the present invention also provides a series of expression vectors based on the system described above, which are used for the transformation of mutants isolated from C. utilis with a view to obtaining heterologous proteins.
  • the transformation system of the present invention uses as new hosts auxotrophic mutants from strain NRRL Y-1084 of Candiaa or tilis, which are mainly defective in the biosynthetic pathway of uracil and histidma, within which they were selected by its characteristics the imitant CUT-35 for uracil, as well as for the histidm the TMN-3 mutant.
  • auxotrophic mutants from strain NRRL Y-1084 of Candiaa or tilis, which are mainly defective in the biosynthetic pathway of uracil and histidma, within which they were selected by its characteristics the imitant CUT-35 for uracil, as well as for the histidm the TMN-3 mutant.
  • a selection marker for the transformation which may be an auxotrophy marker or a dominant marker
  • a classic mutagenesis was carried out in the Candida utilis yeast.
  • cultures of the selected yeast strain (NRRL Y-1084), were inoculated in 100 ml of YPG medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) and incubated in a shack at 30 ° C of 10-20 hours 50 ml of culture were taken and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. Later The cells were washed twice with sterile 0.1M citrate buffer (pH 5.5) and then resuspended in 50 ml of the same buffer.
  • the minimum medium (YNB; Yeast Nitrogen Base) used for enrichment with the antibiotic was not supplemented with the metabolite produced by the biosynthetic pathway in which the defect is sought. For example, for the isolation of auxotrophic mutants to uracil, it is not added to the medium. Incubation was continued until the optical density (OD) of the culture reached 20-30 ⁇ of the initial OD. When the culture reached the desired OD, the cell suspension was treated with 25 units / ml of a nystatma solution. The solution treated with the antibiotic was incubated at 30 ° C for 30 minutes without stirring.
  • OD optical density
  • nystatma was removed from the medium by washing the cell suspension twice with distilled water and then the cells were resuspended in a suitable volume to obtain 150 to 200 colonies per plate.
  • Landscape and Selection Plates containing the mutagenized colonies according to the enrichment performed in the previous example were plated in YNB minimal medium with and without uracil. The colonies that did not grow in the absence of uracil were taken for further analysis.
  • ura3 and ura5 mutants were grown in the presence of the toxic acid compound 5-fluorotok (5-FOA). Resistant colonies were selected as ura 3 or ura5 mutants.
  • 5-FOA the toxic acid compound 5-fluorotok
  • Example 2 Isolation of uz a3 mutants.
  • mutants were checked for the frequency of reversion, highlighting a group of about 23 mutants for presenting a reversal frequency of the order of 10 " , which gives them acceptable stability as hosts with a view to being transformed.
  • the ura auxotrophic mutants thus obtained were checked for ODCase activity (activity of the URA3 gene product), by the method described by Yoshimoto et. al., 1978 (Methods Enzymol. 51: 74-79), as well as 8 of them were determined Its growth parameters. The results of the reversal frequency, as well as these last determined characteristics, are shown in Table 1. Table 1. Summary of the characteristics of the most significant ura3 mutants. Name Frequency Activity Growth Reversal OMPDCase
  • Example 3 Isolation of mutants other than the ura phenotype.
  • the cell suspension obtained according to enrichment with nystatin was disseminated in YPG plates, which were incubated at 30 ° C for 50 hours. Subsequently, the colonies contained in the YPG plates were replicated on plates containing YNB minimum medium, and incubated at 30 ° C for 48 hours. Colonies that did not grow on the YNB plates were taken for later analysis.
  • auxotrophic mutants As a result, about 2411 colonies were checked and a 2% appearance of auxotrophic mutants was obtained. These mutants were checked through the Holliday test and the Finchan test, from which it was obtained that 90% of the mutants obtained responded to the his phenotype, " 2% to the lys phenotype " , 1% to the leu phenotype " , 1% at phenotype meth, 1% to ade phenotype ", and 5% did not show a simple auxotrophic phenotype (Naa).
  • the mutants obtained were checked for the frequency of reversal, thus selecting the most stable for presenting a frequency of reversal between 10 'and 10 (Table 2).
  • Example 4 Construction of a genomic bookstore of Candida utilis.
  • the chromosomal DNA extracted from Candida or tilis NRRL Y-1084 was partially digested with the Sau3A enzyme and fragments of sizes between 6 and 9 kb were isolated by low melting agarose gel electrophoresis
  • LGT LGT
  • F ' D Lac x74, hsr, hs, rpsl, galU, galK, trip C 9030F, leuB, pyrF :: tn5
  • Example 5 Isolation of the URA3 gene from Candida utilis.
  • the plasmid was purified and rechecked by transformation in this strain of Escne ⁇ chia coli MC1066 that the restoration of the URA3 phenotype is associated with the presence of the plasmid.
  • the plasmid pURA5 was digested with several restriction enzymes according to the sites present in the vector of the püC19 library. With a view to the boundary of the Candida URA 3 gene, you use the fragments corresponding to the digestions EcoRI (1.9 kb), HincII (1.5 kb), Sacl (l, lkb) were subcloned into pBluesc ⁇ pt SK (+) giving rise to plasmids pUREc-3, püRHmc-1 and pURSac-4, respectively. Of these plasmids only pURSac-4 was not able to complement the pyrF mutation of Escherichia coli ( Figure 2).
  • the 1.9 kb EcoRI fragment (pUREc-3, Figure 3) containing the useful Candida URA 3 gene is double sequenced RAMIFICATION by the method of Sanger et. to the. (1977, Proc. Nati. Acad. Sci USA 74: 5463-5467).
  • the 3'-untranslated region contains a possible TATAAAA polyadenylation signal (AATAAAA consensus) found in the 3 'terminal region of most euca ⁇ otic genes (Guo, Z and Sherman, F., 1995. Mol. Cell. Biol. 15: 5983-5990).
  • AATAAAA consensus TATAAAA polyadenylation signal found in the 3 'terminal region of most euca ⁇ otic genes (Guo, Z and Sherman, F., 1995. Mol. Cell. Biol. 15: 5983-5990).
  • Example 7 Complementation analysis in Saccharomyces cerevisiae.
  • the 2.8 kb Kpnl / Xbal fragment of the purasmid pURA5 was cloned into a pBR322 derivative vector (pBSARTR -3) .
  • the vector pBSARTR 3 contains a Autonomous replication sequence (ARS1) and the TRIP1 selection marker, both from Saccnaromyces cerevisiae.
  • pUT64 vector was obtained for Saccharomyces cerevisiae ( Figure 5) which was used to transform the Saccnaromyces cerevisiae strain SEY2202 (URA3-52-, leu2-111, h ⁇ s3-) using the Lithium Acetate method previously reported by Ito. et. al., 1983 (J. Bacteriol. 153: 163-168). The transformants were obtained 48 hours after the transformation was performed and the presence of the plasmid was checked by hybridization ⁇ e colonies and southern blot experiments.
  • transformation frequency obtained (2-5 x 10 "transf / mg) corresponded to that reported in the literature for other auxotrophic markers obtained in yeasts.
  • the ⁇ tante ara 3 strain of Candi ⁇ a j til is CUT35 (Number of Pending Deposit) was transformed by the lithium acetate method reported by Ito. et. to the. (1983, J. Bacte ⁇ ol. 153: 163-168) and using as a selection marker the Candida URA3 gene or previously isolated tilis.
  • the transformation with plasmids pURA5 and p C URA3 carrying the URA3 gene of Candida utilis was carried out by integrating said gene by homologous recombination in the corresponding region of the Candida utii is genome.
  • the plasmid pOC URA 3 was obtained by cloning the 1.9 kb EcoRI fragment of the URA3 gene from Candida utilis in the vector pUC19 ( Figure 6). To do this, the plasmids were digested with the restriction enzyme Xhol which is located towards the end of the structural gene. The linearization of the plasmid favors the homologous integration in the genomic locus
  • the transformation procedure used which is based on the treatment of intact yeast cells with alkali metal cations, is basically the same used for Saccnaromyces cerevisiae, with 50 mM Lithium Acetate instead of 100 mM.
  • the selection of the transformants was carried out in a minimal medium YNB lacking uracil.
  • the mitotic stability of these transformants is high, due to the homologous integration mechanism.
  • the transformation frequency coincides with that reported for mtegrative plasmids of Saccnaromyces cerevisiae and other unconventional yeasts using integrative vectors (Table 3).
  • the mutant strain ura3 of Candida utilis CUT35 was transformed by the electroporation method reported by Kondo, K. et al., 1995, (J. Bacteriol. 177: 7171-7177) and using the URA3 gene of Candida utilis as the selection marker previously isolated.
  • the transformation with plasmids pURA5 and pxxC URA 3 carriers of the Candida utilis URA3 gene was carried out by means of ⁇ -integration of said gene by homologous recombination in the corresponding region of the Candida utilis genome.
  • the transformation procedure used is based on the treatment of intact yeast cells with an electric field set to the following conditions 0.7 kV (3.5 kV / cm), a resistance of 800 ⁇ and a capacitance of 25 F.
  • both plasmids were digested with the restriction enzyme Xhol which is toward the end of the structural gene which favors the homologous integration event.
  • YNB Yeast Nitrogen Base
  • the HIS3 gene of Candida utilis was isolated and characterized from the library previously described in Example 4.
  • DNA fragments, which contain the HIS3 gene of Candida utilis, were isolated from a genomic library for their ability to complement the mutation h ⁇ sB463 ⁇ e Escherichia col i KC8 (hsd, h ⁇ sB463, leuB6, pyrF :: Tn5 Km, trp (9830 (lact YA), stm, galU, gal), taking into consideration that the HIS3 gene of Saccharomyces cerevisiae complements the h ⁇ sb463 mutation of Escherichia coli, using fortuitous promoter sequences in Escherichia coli.
  • Imidazole glycerol phosphate dehydratase from Candida or til is, approximately 10 " transforming cells were seeded in selective medium (M9 supplemented with uracil, leucma and tryptophan. Plasmid DNA was extracted from colonies capable of growing therein. medium and therefore capable of complementing the h ⁇ sb463 mutation of the Escnericma coli KC8 strain. The plasmids obtained were used to retransform the Escherichia coli KC8 strain. All plasmids capable of supplying the histidma requirement were called pHCU.
  • PCR band of approximately 500 bp that Southerbott demonstrated that hybrid with the genomic DNA of Candida utilis was cloned into T-Vector (pMOSBLUE, Amershan) and the predicted ammoacidic sequence of its nucleotide sequence was highly homologous to H ⁇ s3p from other yeasts and fungi. Plasmid pHCU 37 ( Figure 9), was used to determine the sequence of the HIS3 gene of Candida utilis.
  • Example 11 Sequencing of the HIS3 gene of Candida utilis. The HIS3 gene of Candida or tilis was completely sequenced double RAMIFICATION by the method of Sanger et. to the. (1977). Universal oligonucleotides of the M13mp / pUC series were used.
  • Example 13 Sequencing of the INVl gene from Candida utilis.
  • a total of 2607 bp of clone pCI-6 containing the INVl gene encoding the Candida utilis mvertase was completely sequenced double RAMIFICATION by the method of Sanger et. al., (1977), both universal oligos of the M13mp / pUC series as well as internal oligos derived from the sequence were used for this.
  • the complete sequence of the 2607 bp fragment is shown in Figure 12 (No. Sec. Sec: 5, 6). This fragment contains an open frame ⁇ e reading ⁇ e 1602 bp (534 codons ⁇ .
  • the Candida INVl gene utilis codes for a theoretical molecular mass protein 60 703 Da.
  • Candida utilis mvertase is a periplasmic enzyme, it must have a peptide signal at its N-thermal end. Analyzing the sequence towards the 5 end of the gene reveals two ATG codons (ATGi and ATG 2 in Figure 12) giving rise to ORF coding for proteins that differ only in the size of their N-thermal ends. Applying von Heijne G.'s (1986, Nuc ⁇ . Acids Res.
  • N-glycosylation sites according to the general NXT / S rule are found in the asparagraphs of positions 40, 88, 141, 187, 245, 277, 344, 348, 365, 373, 379 and 399 of the sequence of the mature protein.
  • the 5-non-translated region shows two possible TATA boxes (TATAA consensus), in the -18 to -14 and -212 to -208 regions, in addition to several possible Migl repressor binding sites (SYGGRG consensus).
  • FIG. 1 Plasmid pURA5, resulting from the Candida utilis library, where the Candida utilis DNA fragment that complements a pyrF mutation in Escne ⁇ chia with MC1066 and URA3 of Saccnaromyces cerevisiae SEY 2202 was identified.
  • Figure 2. Location, restriction map and complement analysis of the URA 3 gene of Candida utlilis. Sequencing strategy of said gene.
  • Figure 4 DNA sequence corresponding to the fragment that contains the URA3 gene of Candida or til is.
  • Figure 5. Plasmid pUT64 obtained for the complementation experiments of the ura3 mutation in Sa ccnaromyces cere ⁇ siae.
  • Figure 8 Peptide sequence and DNA corresponding to the oligonucleotides used in the PCR reaction for the isolation of the HIS3 ⁇ e Candida useful gene.
  • Candida u tilis which contains a fragment capable of complementing the h ⁇ sB463 mutation of Esche ⁇ chia coli KC8.
  • Figure 11 Peptide sequence and DNA corresponding to the oligonucleotides used in the PCR reaction for the isolation of the INVl gene from Candida utilis.
  • TYPE Z nucleic acid. RAMIFICATION: simple ⁇ Z, TOPOLOGY: linear di) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomic)
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTI-SENSE NO
  • GAGTCATCAC CATCGTACTT TAACGACTTA CTATTCTCAT TGAGTATTGA GAAGAAGGAT 240 AGAGAAATGG CTGAACGAAC GGTGAAACCC CAGAGAAGAG CTCTTGTGAA TCGTACAACA 300
  • CAAGGACTCT ACGACCACTG GTGGCTTTGA TATGATTTCC GCCAGTACT TGTAAGAGGT 1140
  • MOLECULE TYPE DNA (genus ico)
  • HYPOTHETICS NO ' ⁇ v)
  • ANTI-SENSE NO

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Abstract

La presente invención proporciona un sistema de transformación útil para expresar proteínas heterólogas en la levadura Candida utilis, basado en la obtención de mutantes auxotróficos de esta especie así como en el aislamiento de diferentes genes, a partir de una librería genómica, que complementan dichas auxotrofías. El sistema de transformación emplea como hospederos nuevos mutantes auxotróficos obtenidos a partir de la cepa NRRL Y-1084 de Candida utilis, los cuales son defectivos principalmente en las vías biosintéticas del uracilo y la histidina, los cuales son transformados con plásmidos que contienen como marcadores de selección los genes URA3 e HIS3 de Candida utilis. Otro aspecto de la invención es el aislamiento del gen codificante para la enzima sucrosa invertasa o β-fructofuranosidasa de Candida utilis, así como la identificación de secuencias promotoras, señales de secreción y terminadoras de dicho gen INV1. Estas secuencias pueden ser ventajosamente utilizadas para lograr la expresión de protéinas heterólogas en esta levadura.

Description

SISTEMA DE TRANSFORMACIÓN EN CANDIDA UTILIS . Sector Técnico
La presente invención esta relacionada con el campo de la ingeniería genética y la biotecnología, y en particular con el desarrollo de un sistema hospedero-vector para la transformación genética de la levadura Candida u tilis , que permita la expresión y la secreción de proteínas heterologas en esta levadura, las cuales puedan ser posteriormente utilizadas con diversos fines. Técnica Anterior.
La ingeniería genética y las biotecnologías en general han abierto un camino sin precedentes en la producción de compuestos de ínteres tanto desde el punto de vista medico, alimenticio o industrial, los cuales reportan grandes beneficios al hombre.
La bacteria Escherichia coli ha sido durante algún tiempo el microorganismo mas utilizado con estos fines por diversas compañías biotecnologicas, debido al conocimiento que se tiene en _o concerniente a su genética, su fácil manipulación y a sus sistemas de cultivo a gran escala.
Sin embargo, las esperanzas de producción de proteínas de ínteres en este microorganismo se ven afectadas por diversos factores. En primer lugar, la presencia de pirógenos y compuestos tóxicos en la pared celular de Escherichia coli han originado regulaciones que limitan su uso, cuando los productos obtenidos son para uso medico o para la industria alimenticia. También las proteínas que son sobrexpresadas en E . coli generalmente aparecen en forma msoluble y no pueden ser secretadas. Por otra parte los mecanismos de transcripción, traducción y procesamiento postraduccional difieren αe los presentes en organismos eucaπotas, por lo que las proteínas producidas difieren en alguna medida de las obtenidas a partir de fuentes naturales.
La posibilidad de producir proteínas heterologas en sistemas eucaπotas, tales como las levaduras, tiene algunas ventajas con relación a los sistemas procariotas. Entre estas podemos señalar la capacidad de crecer a altas densidades celulares y la posibilidad de adaptar su cultivo a sistemas continuos. Ademas las levaduras son capaces de secretar proteínas al medio de cultivo en considerable mayor cantidad en comparación con E . coli , y los medios de cultivos utilizados para el crecimiento de levaduras son mas económicos que los utilizados en bacterias (Lemome, Y., 1988. Heterologous expression ín yeast. 8th International Biotechnology Symposium, París, July 17-22) . Ademas estos sistemas pueden llevar a cabo otras modificaciones postraduccionales como es el caso de la glicosilacion, la cual esta ausente en los sistemas bacterianos (Fiers, W., 1988. Engmeeπng Maximal Expression of Heterologous Gene m Microorganism. 8th International Biotechnology Symposium, París, July 17-22) .Ademas, estos sistemas generalmente tienen cierta preferencia por el mismo uso de codones utilizados por las células de los organismos superiores (Kigsman, S.M. et al., 1990. Heterologous Gene Expression m Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology & Genetic Engmeeπng Reviews, 3, Ed. G.E. Russell).
Todo esto ha conducido al desarrollo y diseminación de nuevos sistemas de transformación, y con particular ínteres en las levaduras, como son los descritos primeramente para especies del genero Saccharomyces, con especial énfasis en Saccharomyces cerevisiae . Sin embargo, la expresión de proteínas en Saccharomyces ha afrontado problemas que van desde los ba os niveles de expresión obtenidos usando sus promotores homólogos hasta la hiperglicosilación de los productos secretados al medio, es por esto que en los últimos años se ha intensificado la búsqueda de levaduras no convencionales para su uso en la expresión de proteínas heterólogas .
El desarrollo de técnicas de transformación en otras levaduras no-Saccharomyces, como Hansenula polymorpha , Pichia pastoris, y levaduras del genero Kluyveromyces (Sudbery, P., 1994. Yeast 10: 1707-1726) ha permitido un rápido avance en el conocimiento y perfeccionamiento de estos sistemas, así como una mayor utilización de los mismos, tanto con fines vacunales, diagnósticos e industriales.
También dentro del genero Candida se han reportado varios sistemas de transformación y de expresión como los reportados para las levaduras Candida tropical is, Candida boidiini , Candida glabra ta , Candida parapsilosis, Candida mal tosa y Candida albicans, todas ellas con un marcado ínteres médico, debido a que muchas de estas especies son causantes de enfermedades oportunistas en humanos. Dentro del genero Candida, la levadura Candida utilis , resulta particularmente interesante por sus características peculiares. En primer lugar, emplea un gran espectro de fuentes de carbono baratas como la xilosa, sacarosa, maltosa entre otras. Otra característica interesante es que es posible producir eficientemente una gran cantidad de células en un cultivo continuo. Además, Candida utilis , al igual que Saccnaromyces cerevisiae y Kl uyveromyces lactis , han sido autorizadas por la FDA (Food an Drug Administration) como fuentes seguras en aditivos alimenticios. Al mismo tiempo, Candida utilis ha sido utilizada como fuente para la producción industrial de L-glutamma, etil acetato, mvertasa, entre otros productos. Un sistema de transformación preliminar en Candida utilis ha sido descrito por Ho, I. et . al., 1984, (Biotechnology and Bioengmeenng Symp. 14: 295-301). En el mencionado trabajo no se presentan evidencias directas de la presencia del marcador de resistencia al antibiótico, por lo que resulta incompleta la verificación directa de la transformación. Recientemente una nueva estrategia para un sistema de trasformacion para Candiαa utilis fue reportado por Kondo, K. et al., 1995, (J. Bacteriol. 177: 7171-7177). Ellos obtuvieron transformantes resistentes a cicloheximida mediante el uso de un gen marcador que contiene una forma mutada del gen πbosomal L41 que confiere la resistencia. También utilizan fragmentos de ADN ribosomal (rADN) como blanco de múltiple integración, debido a que el marcador necesita estar presente en múltiples copias para conferir resistencia .
Sin embargo, hasta la actualidad, no existe ningún sistema de transformación en esta levadura basado en marcadores de auxotrofia debido a la inexistencia de mutantes para el desarrollo de dicho sistema.
Si tenemos en cuenta el conocimiento obtenido en su explotación industrial y su novedad desde el punto de vista genético, Candida utilis pudiera ser un organismo atractivo para su utilización comercial como sistema de expresión de proteínas heterologas .
Divulgación de la invención .
El objetivo de la presente invención ha sido proporcionar un sistema de transformación que permita expresar proteínas heterologas en la levadura Candida u tilis , basado en la obtención de mutantes auxotroficos de esta especie asi como en el aislamiento de los genes, a partir de una librería genomica, que complementan dichas auxotrofias. El proceso de transformación descrito aquí proporciona medios para la introducción de fragmentos o secuencias de ADN en una cepa hospedera de Candida utilis y permite a esta levadura ser utilizada para la expresión y producción de proteínas. Al mismo tiempo el aislamiento de genes cuyas secuencias promotoras y termmadoras puedan servir para la expresión de genes heterologos en dicha levadura, ha sido un proposito de esta invención. Ademas, las células de levaduras transformadas pueden ser identificadas y seleccionadas mediante los métodos descritos en la presente invención.
Nuevas cepas de Candida utilis, vectores y subclones son proporcionados. Las nuevas cepas son utilizadas como hospederos para la introducción de fragmentos de AND recombmante .
La invención también se relaciona con la transformación estable y el mantenimiento de dichos fragmentos de ADN en las células hospederas, donde el marcador es integrado por recombinacion homologa en el genoma de la levadura. Concretamente la invención consiste en un nuevo sistema de transformación de la levadura Canαida u tilis, el cual utiliza como hospederos nuevos mutantes auxotroficos aislados a partir de la cepa NRRL Y-1084 de dicha levadura. Estos mutantes son deficientes en la enzima orotιdm-5 fosfato descarboxilasa de la vía de biosmtesis del uracilo o en la enzima ímidazol glicerol fosfato deshidratasa de la vía biosmtetica de la histidma, los cuales fueron obtenidos mediante el uso de mutagenesis clásica provocada por agentes físicos y químicos conocidos a partir del estado del arte (Sherman, F. et al., 1986. Laboratory course: Manual for methods m yeast genetics. Cold Sprmg Harbor Laboratory Press, NY) . Estos mutantes presentaron una elevada estabilidad (frecuencia de reversión aproximadamente de 10 ) y pueden ser eficientemente transformados mediante el procedimiento descrito en la presente invención. A su vez se aislaron como marcadores de selección para los nuevos mutantes de Candida u tilis el gen URA3, codificante para la enzima orotidin 5 -monofosfato descarboxilasa y el gen HIS3 codificante para la enzima Imidazol-glicerol-fosfato deshidratasa, los cuales fueron aislados a partir de una genoteca de Candida utilis construida en el plasmido pUC19 e identificados por complementacion de las mutaciones pyrF e hιsb463 de las cepas de E . coli MC1066 y KC8 respectivamente. Igualmente el gen URA3 de C. u til is complemento la mutación URA3 de Sa ccnaro yces cerevisiae SEY 2202. La secuencia completa de los genes aislados fue determinada y la secuencia aminoacidica predicha mostró una elevada similaπdad con la del mismo gen proveniente de otras levaduras y hongos .
Los vectores mtegrativos construidos para realizar la transformación de este mutante fueron el pURA5 y el pUREC3. Estos plasmidos contienen el gen URA3 aislado de Candida utilis como marcador de selección, ademas de presentar regiones ADN cromosomal que se encuentran flanqueando al mismo, favoreciendo asi la integración en el locus de Candida utilis mediante recombmacion homologa. Otro aspecto novedoso de la presente invención, es el aislamiento del gen que codifica para la enzima sacarosa invertasa o P-fructofuranosidasa { INV1 ) de Candida utilis, asi como la identificación de las regiones promotoras, termmadoras y la secuencia señal de este gen, las cuales igualmente pueden ser ventajosamente utilizadas en la expresión de proteínas de diferentes orígenes en dicha levadura .
La presente invención también brinda una serie de vectores de expresión basados en el sistema descrito anteriormente, los cuales son utilizados para la transformación de los mutantes aislados a partir de C. utilis con vistas a la obtención de proteínas heterólogas.
El sistema de transformación de la presente invención utiliza como hospederos nuevos mutantes auxotroficos a partir de la cepa NRRL Y-1084 de Candiaa u tilis , ios cuales son defectivos fundamentalmente en la vía biosintética del uracilo y la histidma, dentro de los cuales fueron seleccionados por sus características el imitante CUT-35 para el uracilo, así como para la histidma el mutante TMN-3. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN:
Ejemplo 1 : Mαtagénesis de Candi da utilis
Con el objetivo de desarrollar un sistema de transformación en un microorganismo son generalmente requeridos tres elementos : (1) un marcador de selección para la transformación, que puede ser un marcador de auxotrofia o un marcador dominante,
(2) un mutante hospedero adecuado para dicha selección y
(3) un método para ser capaz de transformar a este hospedero y que permita a éste adquirir de forma eficiente el ADN extranuclear .
Con vistas a lograr el segundo objetivo se llevó a cabo una mutagénesis clásica en la levadura Candida utilis . Para esto cultivos de la cepa de levadura seleccionada (NRRL Y-1084), se inocularon en 100 mi de medio YPG (Extracto de levadura 1%, peptona 2%, glucosa 2%) y se incubaron en una zaranda a 30°C de 10-20 horas. Se tomaron 50 mi de cultivo y se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 minutos. Posteriormente las células se lavaron 2 veces con buffer citrato 0.1M (pH 5.5) estéril y se resuspendieron después en 50 mi del mismo buffer. A continuación, 10 mi de esta suspensión es tratada con una solución de NTG (Nitroso Guanidma) a una concentración final de 50 mg/ml. La suspensión en presencia del mutageno se incubo durante 30 minutos a 30°C en reposo. El mutágeno es removido de la suspensión lavando 2 veces con agua destilada. Las células se resuspendieron en 50 mi de YPG y luego se transfirieron a un erlenmeyer con 100 mi de YPG. Este cultivo de células mutagenizadas se incubo a 30"C durante 48 horas. Enriqu czíiniento con Nistatina .
Aproximadamente 5 mi del cultivo expresado durante 48 horas en YPG se uso para inocular 100 mi de medio mínimo. El medio mínimo (YNB; Yeast Nitrogen Base) utilizado para el enriquecimiento con el antibiótico no fue suplementado con el metabolito producido por la vía biosintetica en la cual se busca el defecto. Por ejemplo, para el aislamiento de mutantes auxotroficos al uracilo, este no se añade al medio. La incubación se continuo hasta que la densidad óptica (DO) del cultivo alcanzo del 20 al 30 α de la DO inicial. Cuando el cultivo alcanzo la DO deseada, la suspensión celular se trato con 25 unidades/ml de una solución de nistatma. La solución tratada con el antibiótico se incubo a 30°C durante 30 minutos sin agitación. La nistatma se eliminó del medio lavando 2 veces la suspensión celular con agua destilada y después las células se resuspendieron en un volumen adecuado para obtener de 150 a 200 colonias por placas. Pestjμisaje y Selección . Las placas conteniendo las colonias mutagenizadas de acuerdo al enriquecimiento realizado en el ejemplo anterior se plaquearon en medio mínimo YNB con y sin uracilo. Las colonias que no crecieron en ausencia de uracilo fueron tomadas para análisis posteriores.
Específicamente para identificar la presencia mutantes ura3 y ura5, las células fueron crecidas en presencia del compuesto toxico acido 5-fluorotιco (5-FOA) . Las colonias resistentes se seleccionaron como mutantes ura 3 o ura5. Ejemplo 2 : Aislamiento de mutantes uz a3.
Después del enriquecimiento con nistatina el cultivo fue lavado dos veces con H20 destilada y diseminado directamente sobre placas de YNB conteniendo 0.75 -q/ml de 5-FOA (5- fluoro-orotic acid; Fluka) y 40 M-g/ml de uracilo. Las placas se incubaron durante cuatro días y las colonias que crecieron en las mismas fueron analizadas para comprobar el fenotipo ura . De las 4 x 10" células viables, después del enriquecimiento en nistatma, 79 colonias mostraron resistencia al 5-FOA. Estas colonias podrían ser URA3, ura5, o simplemente resistente al 5-FOA. Para confirmar la auxotrofia al uracilo, los supuestos mutantes fueron punteadas sobre placas de medio YPG e incubadas durante 48 horas a 30°C. Estas placas de YPG se replicaron sobre medio mínimo YNB con y sin uracilo, obteniéndose 67 mutantes con fenotipo ura .
A estos mutantes les fue chequeada la frecuencia de reversión destacándose un grupo de alrededor de 23 mutantes por presentar una frecuencia de reversión del orden de 10" , lo que les confiere una aceptable estabilidad como hospederos con vistas a ser transformados.
Los mutantes auxotroficos ura asi obtenidos, se les chequeo la actividad ODCasa (actividad del producto del gen URA3) , por el método descrito por Yoshimoto et . al., 1978 (Methods Enzymol. 51: 74-79), asi como se les determino a 8 de ellos sus parámetros de crecimiento. Los resultados de la frecuencia de reversión, así como estas últimas características determinadas se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Resumen de las características de los mutantes ura3 más significativos . Nombre Frecuencia Actividad Crecimiento de Reversión OMPDCasa
CUT35 < 5xl0"7 +++ CUT43 < lxlO"7 +++ CUT61 < lxlO"8 +++ CUT65 < lxlO"8 ++ CUT70 < 1x10" + CUT88 < 7xl0"7 +++ CUT93 lxlO"8 +++ CUT166 6xl0"8 +++
Ejemplo 3 : Aislamiento de otros mutantes distintos del fenotipo ura .
Con vistas de contar con una variedad de mutantes auxotróficos diferentes de uracilo, la suspensión celular obtenida de acuerdo al enriquecimiento con nistatina, se diseminó en placas de YPG, las que fueron incubadas a 30°C durante 50 horas. Posteriormente, las colonias contenidas en las placas de YPG se replicaron sobre placas conteniendo medio mínimo YNB, y se incubaron a 30°C durante 48 horas. Las colonias que no crecieron en las placas de YNB fueron tomadas para análisis posteriores.
Como resultado de esto fueron chequeadas alrededor de 2411 colonias y se obtuvo un 2% de aparición de mutantes auxotróficos. Estos mutantes fueron chequeados a través del test de Holliday y del test de Finchan, de donde se obtuvo que el 90% de los mutantes obtenidos respondió al fenotipo his", el 2% al fenotipo lys", el 1% al fenotipo leu", el 1% al fenotipo met , el 1% al fenotipo ade", y el 5% no mostró un fenotipo auxotrófico simple (Naa) .
A los mutantes obtenidos se les chequeó la frecuencia de reversión, seleccionándose asi los mas estables por presentar una frecuencia de reversión entre 10 ' y 10 (Tabla 2) .
Tabla 2. Frecuencia de reversión de los mutantes diferentes de uracilo más significativos .
Ñlombre Fenotipo Frecuencia de Reversión
Figure imgf000013_0001
TMN31 his lxlO"8
Figure imgf000013_0002
TMN12 his 5xl0"7
TMN13 his 2.5xl0"7
Figure imgf000013_0003
TMN74 his 2x10"
Figure imgf000013_0004
TMN45 lys 8x10"°
Figure imgf000013_0005
TMN82 Naa 2x10 '
Ejemplo 4 : Construcción de una lzibrería genómica de Candida utilis . El ADN cromosomal extraído de Candida u tilis NRRL Y-1084 se digirió parcialmente con la enzima Sau3A y los fragmentos de tallas comprendida entre 6 y 9 kb fueron aislados mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión
(LGT) . Estos fragmentos se ligaron al vector pUC19 previamente digerido con la enzima de restricción BamHI y tratado con fosfatasa alcalina. Esta ligazón se transformó en la cepa de Escherichia coli MC 1066 (F', D Lac x74, hsr, hs , rpsl, galU, galK, trip C 9030F, leuB, pyrF::tn5). Aproximadamente 95% de recombinantes fueron obtenidos en la librería genomica.
Ejemplo 5 : Aislamiento del gen URA3 de Candida utilis .
Con vistas a encontrar fragmentos αe ADN de Candiαa ^ ilis que complementen la mutación pyrF de la cepa αe Escneπcnia coli MC1066, alícuotas de la transformación anterior fueron plaqueadas en medio completo (LBA) y las colonias crecidas fueron replicadas en medio selectivo con el objetivo de encontrar individuos recombmantes que complementen en esta cepa de Escheπcma coli , considerando que el gen URA3 de Saccnaromyces zerevisiae complementa dicha mutación en E. coli .
De los individuos que complementaron se tomaron alrededor de 12 colonias, se purifico el plasmido y se rechequeo por transformación en esta cepa de Escneπchia coli MC1066 que la restauración del fenotipo URA3 esta asociado a la presencia del plasmido.
Paralelamente a estos plasmidos se le realizo un análisis de restricción con las enzimas hindIII y EcoRI que permitió identificar individuos recombinantes con fragmentos de 2.6 kb aproximadamente donde se encuentra contenido el gen URA3 de Candida utilis . Como resultado de este análisis se escogieron dos plasmidos, llamados pURA2 y püRA5 a los cuales se les realizo un mapa de restricción con vistas a identificar los sitios presentes en el fragmento clonado. En la Figura 1 se muestra el mapa del plasmido pURA5. Este plasmido fue posteriormente usado para posteriores análisis de complementacion y secuencia Ejemplo 6: Acotamiento y secuenciacion del gen URA3 de Candida utilis .
El plasmido pURA5 fue digerido con varias enzimas de restricción de acuerdo a los sitios presentes en el vector de la genoteca püC19. Con vistas al acotamiento del gen URA 3 de Candida utilis los fragmentos correspondientes a las digestiones EcoRI (1,9 kb) , HincII (1,5 kb) , Sacl (l,lkb) fueron subclonados en pBluescπpt SK( + ) dando lugar a los plasmidos pUREc-3, püRHmc-1 y pURSac-4, respectivamente. De dichos plasmidos solo el pURSac-4 no fue capaz de complementar la mutación pyrF de Escherichia coli (Figura 2) . El fragmento EcoRI de 1,9 kb (pUREc-3, Figura 3) conteniendo el gen URA 3 de Candida útil es fue secuenciado doble RAMIFICACIÓN por el método de Sanger et . al. (1977, Proc. Nati. Acad. Sci USA 74: 5463-5467).
Para ello se usaron tanto oligos universales de las series M13mp/pUC, asi como oligos internos derivados de la secuencia. La secuencia completa de 1179 pb del fragmento EcoRI es mostrada en la Figura 4 (No. Id. Sec: 1, 2) . Dicho fragmento contiene un marco abierto de lectura de 800 pb (266 codones) . El gen URA3 de Canαida u til is codifica para una protema de masa molecular teórica 29 436 Da. La secuencia nucleotidica flanqueante al codon de iniciación ATG (GAAAATG) corresponde bien con la consenso reportada en levadura (A/YAA/YAATG) , por Cigan y Donehue, 1987 (Gene 59: 1-18). La región 3' -no traducida contiene una posible señal de poliadenilacion TATAAAA (consenso AATAAAA) encontrada en la región 3' terminal de la mayoría de los genes eucaπóticos (Guo, Z y Sherman, F., 1995. Mol. Cell. Biol. 15: 5983-5990). Ejemplo 7 : Análisis de complementación en Saccharomyces cerevisiae .
Con el objetivo de verificar que el fragmento clonado corresponde al gen URA3 de Candida utilis y no a un fragmento de ADN con actividad supresora, el fragmento de 2,8 kb Kpnl/Xbal del piasmido pURA5 se clono en un vector derivativo de pBR322 (pBSARTR-3) . El vector pBSARTR 3 contiene una secuencia de replicacion autónoma (ARS1) y el marcador de selección TRIP1, ambos de Saccnaromyces cerevisiae . Como resultado se obtuvo el vector pUT64 para Saccharomyces cerevisiae (Figura 5) el cual fue usado para transformar la cepa Saccnaromyces cerevisiae SEY2202 ( URA3-52- , leu2- 112,hιs3-) usando el método de Acetato de Litio reportado previamente por Ito. et. al., 1983 (J. Bacteriol. 153: 163- 168) . Los transformantes se obtuvieron a las 48 horas de haberse realizado la transformación y la presencia del plasmido fue chequeada por hibridación αe colonias y experimentos de southern-blot .
La frecuencia de transformación obtenida (2-5 x 10" transf/mg) se correspondió con lo reportado en la literatura para otros marcadores auxotroficos obtenidos en levaduras.
Consecuentemente se demostró por complementación que el gen URA3 de Candida u tilis es capaz de complementar la mutación URA3 de Saccharomyces cerevisiae . Ejemplo 8 : Transformación de Candida utilis NRRL Y-1084 CUT35 con los plásmidos pURA y mediante el método de acetato de litio .
La cepa ñútante ara 3 de Candiαa j til is CUT35 (Numero de Deposito Pendiente) se transformo mediante el método de acetato de litio reportado por Ito. et . al. (1983, J. Bacteπol . 153: 163-168) y utilizando como marcador de selección el gen URA3 de Candida u tilis aislado previamente. La transformación con los plasmidos pURA5 y p C URA3 portadores del gen URA3 de Candida utilis fue realizada mediante la integración de dicho gen por recombinacion homologa en la región correspondiente del genoma de Candida utii is . Ξl plasmido pOC URA 3 fue obtenido mediante la clonación del fragmento EcoRI de 1.9 kb del gen URA3 de Candida utilis en el vector pUC19 (Figura 6) . Para ello, los plásmidos fueron digeridos con la enzima de restricción Xhol la cual se encuentra hacia el extremo del gen estructural. La linealización del plásmido favorece la integración homologa en el locus genómico
El procedimiento de transformación utilizado, que se basa en el tratamiento de las células intactas de levaduras con cationes de metales alcalinos, es básicamente el mismo utilizado para Saccnaromyces cerevisiae , con 50 mM de Acetato de Litio en lugar de 100 mM. La selección de los transformantes se realizo en medio mínimo YNB carente de uracilo. La estabilidad de mitótica de estos transformantes es alta, debido al mecanismo de integración homologa. La frecuencia de transformación coincide con lo reportado para plásmidos mtegrativos de Saccnaromyces cerevisiae y otras levaduras no convencionales usando vectores integrativos (Tabla 3) .
Ej mplo 9 : Transformación de Candida utilis NRRL Y-1084 con los plásmidos pURA5 y pUCURA3 mediante el método de electroporación .
La cepa mutante ura3 de Candida utilis CUT35 se transformo mediante el método de electroporación reportado por Kondo, K. et al., 1995, (J. Bacteriol . 177: 7171-7177) y utilizando como marcador de selección el gen URA3 de Candida utilis aislado previamente. La transformación con los plásmido pURA5 y pxxC URA 3 portadores del gen URA3 de Candida utilis fue realizada mediante integración αe dicho gen por recombmación homologa en la región correspondiente del genoma de Candida utilis . El procedimiento de transformación utilizado se basa en el tratamiento de las células intactas de levaduras con un campo eléctrico fijado a las siguientes condiciones 0,7 kV (3,5 kV/cm) , una resistencia de 800 Ω y una capacitancia de 25 F .
Previamente a la transformación, ambos plásmidos fueron digeridos con la enzima de restricción Xhol la cual se encuentra hacia el extremo del gen estructural lo que favorece el evento de integración homologa.
La selección de los transformantes se realizó en medio mínimo
YNB (Yeast Nitrogen Base) carente de uracilo.
La frecuencias de transformación tanto con el plásmido pURA5 como con el pO URA3 mediante este método, comparativamente con el de acetato de litio se muestran en la Tabla 3.
Tabla 2. Frecuencias de transformación obtenidas en la transformación de la cepa de Candida utilis CUT35 por diferentes métodos . En todos los casos los plásmidos fueron digeridos con Xhol ya que con plásmidos circulares no se obtuvieron transformantes.
Tabla 3
Frecuencia de transformación Vector Concentración de (# transí. /^q )
ADN(l-lg)
LiAc Electroporación pUCURA-3 0 . 1 - 70- 90
0 . 5 - 640
3 . 0 22 pURA- 5 0 . 1 - 40-50
0 . 5 - 670 3 0 21 -
La estabilidad mitótica de estos plásmidos es alta, debido al mecanismo de transformación.
La frecuencia de transformación coincidió con lo reportado para plásmidos mtegrativos en Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras no convencionales . En la Figura 7 se muestra el esquema de integración de los posibles eventos de integración en el genoma de Candida utilis asi como el Southern-blot de algunos de los transformantes obtenidos. Ejemplo 10 : Aislamiento del gen HIS3 de Candida utilis .
El gen HIS3 de Candida utilis fue aislado y caracterizado a partir de la genoteca previamente descrita en el Ejemplo 4. Fragmentos de ADN, los cuales contienen el gen HIS3 de Candida utilis, fueron aislados a partir de una librería genomica por su posibilidad de complementar la mutación hιsB463 αe Escherichia col i KC8 (hsd, hιsB463, leuB6, pyrF::Tn5 Km, trp (9830 (lact YA), stm, galU, gal), tomando en consideración que el gen HIS3 de Saccharomyces cerevisiae complementa la mutación hιsb463 of Escherichia coli , usando secuencias fortuitas del promotor en Escherichia coli .
Para aislar el gen que codifica para la enzima Imidazol glicerol fosfato deshidratasa de Candida u til is , se sembraron aproximadamente 10" células transformantes en medio selectivo (M9 suplementado con uracilo, leucma y triptofano. Se extrajo ADN plasmidico de colonias capaces de crecer en este medio y por consiguiente capaces de complementar la mutación hιsb463 de la cepa Escnericma coli KC8. Los plasmidos obtenidos fueron usados para retransformar la cepa de Escherichia coli KC8. Todos los plasmidos capaces de suplir el requerimiento de histidma fueron denominados pHCU . Para confirmar que las colonias his" contenían el gen HIS3 de Candida utilis y no un fragmento de ADN con actividad supresora, dos de los plasmidos obtenidos a partir de los transformantes his (pHCU37 y pHCU40) se sometieron a una reacción de PCR. Para esto se emplearon dos oligonucleotidos degenerados, diseñados a partir de dos regiones altamente conservadas en 5 secuencias de IGPDasas correspondientes a levaduras y hongos filamentosos y teniendo en cuenta el uso de codones de Candida utilis . La secuencia peptidica predicha, asi como la secuencia oligonucleotidica se muestran en la Figura 8. Una banda de PCR de aproximadamente 500 pb que por Souther- blot demostró que híbrida con el ADN genomico de Candida utilis, fue clonada en T-Vector (pMOSBLUE, Amershan) y la secuencia ammoacidica predicha de su secuencia nucleotidica resulto altamente homologa a Hιs3p de otras levaduras y hongos. El plasmido pHCU 37 (Figura 9), fue usado para la determinación de la secuencia del gen HIS3 de Candida utilis . Ejemplo 11 : Secuenciac on del gen HIS3 de Candida utilis . El gen HIS3 de Candida u tilis se secuencio completamente doble RAMIFICACIÓN por el método de Sanger et. al. (1977). Se emplearon oligonucleotidos universales de las series M13mp/pUC. Un total de 1190 pb del plasmido pHCU37 fueron secuenciados comenzando micialmente con oligos diseñados teniendo en cuenta el fragmento de PCR previamente clonado. Para el compietamiento de la secuencia del gen se sintetizaron oligonucleotidos internos diseñados a partir de la secuencia obtenida micialmente . La secuencia completa del gen se muestra en la Figura 10 (No. Id. Sec. : 5, 6) . El gen HIS3 de Candida utilis codifica para una proteina de masa molecular teórica de 24 518 Da. Ejemplo 12 : Aislami nto del gen INVl que codifica para la mvertasa de Candida utilis .
Con el objetivo de aislar el gen INVl que codifica para la mvertasa de Candida utilis se aprovecho el hecho que la secuencia aminoacidica de esta enzima presenta regiones altamente conservadas entre las especies, sobre esta base se las secuencias de las P-frctofuranosidasas de levaduras fueron alineadas. Dos oligonucleotidos degenerados usados en dicho PCR fueron diseñados según el uso de codones en Candida utilis . La secuencia peptidica asi como la de los oligos degenerados se muestra en la Figura 11. El PCR genero una banda de 417 pb que fue subclonaαa en el Vector-T (pMOSBlue, Amersham) . Dicha banda fue completamente secuenciada y la traducción de dicho fragmento de ADN corroboro la presencia de las regiones consenso ademas de una alta homología con las mvertasas reportadas en la literatura. Esto demostró que el fragmento aislado era perteneciente al gen INVl que codifica para una mvertasa en Candida utilis . Este fragmento se utilizo como sonαa para aislar el gen INVl de Candida u tilis . Luego del pesquizaje de la librería de Candida utilis, un total de 6 clones conteniendo el gen INVl de Candida utilis fueron aislados. Se seleccionaron 2 de los clones por su talla para el proceso de secuenciacion (pCI-6 y pCI-12) usando un PCR utilizando los ol gos usados en el aislamiento del fragmento anterior. Estos oligos fαeron usaαos para iniciar la secuencia entera del gen por ambas cadenas del plásmido pCI-6.
Ejemplo 13 : Secuenciación del gen INVl de Candida utilis . Un total de 2607 pb del clon pCI-6 que contiene el gen INVl que codifica para la mvertasa de Candida utilis fue secuenciado completamente doble RAMIFICACIÓN por el método de Sanger et. al., (1977), para esto se usaron tanto oligos universales de las series M13mp/pUC asi como oligos internos derivados de la secuencia. La secuencia completa del fragmento de 2607 pb es mostrada en la Figura 12 (No. Id. Sec: 5, 6) . Dicho fragmento contiene un marco abierto αe lectura αe 1602 pb (534 codones ¡ . El gen INVl de Candida utilis codifica para una protema de masa molecular teórica 60 703 Da.
Teniendo en cuenta que la mvertasa de Candida utilis es una enzima periplasmatica, debe tener en su extremo N-termmal una señal peptídica. Analizando la secuencia hacia el extremo 5 del gen revelan dos codones ATG (ATGi and ATG2 en la Figura 12) danαo lugar a ORF codificantes para proteínas que difieren solamente en el tamaño de sus extremos N-termmales . Aplicando el algoritmo de von Heijne G. (1986, Nucí. Acids Res. 14: 4683-4690) para predecir el sitio de corte de la señal peptidasa de la protema madura derivada de ambos ATG revelan que en ambos casos el sitio de corte esta ubicado entre los mismos residuos (S39 y S40 para ATGi y S26 y S27 para ATG2) , dando lugar a peptidos señales de 39 y 26 aminoácidos respectivamente. Teniendo en cuenta el tamaño promedio de las secuencias señales en levadura (estimado alrededor de 20 residuos), podemos sugerir que el codon de iniciación del gen INVl es el segundo ATG. Once sitios potenciales de N-glicosilacion acorde a la regia general N-X-T/S, se encuentran en las asparagmas de las posiciones 40, 88, 141, 187, 245, 277, 344, 348, 365, 373, 379 y 399 de la secuencia de la proteina madura. La región 5 -no traducida muestra dos posibles cajas TATA (consenso TATAA) , en las regiones -18 a -14 y -212 a -208, ademas de varios posibles sitios de unión del represor Migl (consenso SYGGRG) .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.
Figura 1. Plasmido pURA5, resultante de la genoteca de Candida utilis, donde se identifico el fragmento de ADN de Candida utilis que complementa una mutación pyrF en Escneπchia con MC1066 y URA3 de Saccnaromyces cerevisiae SEY 2202. Figura 2. Ubicación, mapa de restricción y análisis de complementacion del gen URA 3 de Candida utlilis . Estrategia de secuenciacion de dicho gen.
Figura 3. Plasmido pUREC3, obtenido a partir de una digestión con la enzima de restricción EcoRI en el plasmido pURA5 y capaz de complementar la mutación URA3 de Saccharomyces cerevisiae .
Figura 4. Secuencia de ADN correspondiente al fragmento que contiene el gen URA3 de Candida u til is . Figura 5. Plasmido pUT64 obtenido para los experimentos de complementacion de la mutación ura3 en Sa ccnaromyces cere ísiae .
Figura 6. Mapa αel plasmido pOC URA3 utilizado en los experimentos de transformación de la levadura Candida utilis . Figura 7. (A) Esquema de los posibles eventos de integración durante la transformación
(B) Southern-blot de algunos de los transformantes.
Figura 8. Secuencia de peptidica y de ADN correspondiente a los oligonucleotidos utilizados en la reacción de PCR para el aislamiento del gen HIS3 αe Candida util is .
Figura 9. Plasmido pHCU37, resultante de la genoteca de
Candida u tilis, que contiene un fragmento capaz de complementar la mutación hιsB463 de Escheπchia coli KC8.
Figura 10. Secuencia de ADN correspondiente al fragmento que contiene el gen HIS3 de Ca ndida u til is .
Figura 11. Secuencia peptidica y de ADN correspondiente a los oligonucleotidos utilizados en la reacción de PCR para el aislamiento del gen INVl de Candida utilis .
Figura 12. Secuencia de ADN correspondiente al fragmento que contiene el gen INVl de Candida u til is . LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENRAL :
(i) SOLICITANTE:
.A) NOMBRE: CENTRO DE INGENIERÍA GENTICA Y BIOTECNOLOGÍA
(B) DIRECCIÓN: AVE. 31 ENTRE 158 Y 190, CUBANACAN, PLAYA.
(C) CIUDAD: CIUDAD DE LA HABANA (D) ESTADO: CIUDAD DE LA HABANA
(E) PAÍS: CUBA
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 12100
(G) TELÉFONO: 53 7 216013 (H) TELEFAX: 53 7 336008 di) TITULO DE LA INVENCIÓN: SISTEMA DE TRANFORMACION EN CANDIDA UTILIS. ím) NUMERO DE SECUENCIAS: 6
!ιv) FORMA LEGIBLE PRO MAQUINA:
A) TIPO DE SOPORTE: Disco flexible ,B) ORDENADOR: IBM PC compatible 'O SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOPORTE LÓGICO: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO)
(vi) DATOS DE SOLICITUD DE PRIORIDAD:
(A) NÚMBERO DE SOLICITUD: 82/96
(3) FECHA DE SOLICITUD: 03-OCT-1996
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: Α) LONGITUD: 1179 pares de base
3) TIPO: acido nucleico Z . RAMIFICACIÓN: simple < Z , TOPOLOGÍA: lineal di) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(m) HIPOTÉTICA: NO dv ) ANT I - SENT I DO : NO ívι) FUENTE ORIGINAL:
Αj ORGANISMOO: Candiαa utilis
(B) CEPA: NRRL Y-1084 (lx) RASGOS:
I ?.) NOMBRE /CLAVE: PEPTIDOO MADURO '3) LOCALIZACION: 1..1179
Z t OTRA INFORMACIÓN: /producto= "Orotidm 5 ' -monofosfato αescarboxilasa" /gen= " URA3" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NO. 1:
CAAATAGCTC TCTACTTGCT TCTGCTCAAC AAGCTGCTGG AACTGCTGCT GCTCTTTTGG 60 GTTCAATTGG TCCATCCTTG CTACTTTTCC GCCTAGTTTC GATTCCGATT CTGATAGAGA 120
AGCCCAGCTA TGAATGGAAG AAATTTTTCA CTTTTGTATG TCCTTTTTTT CACGCTTCGT 180
TGCTTCGGAC AAAAAAATAG TGGAGGCACT CGGTGGAGGG AAGCTATCCT CGAGATGAAA 240
AATTTCAAGC TCATCTCATC GTCCAAGTGG GACAGCAAGC TGAGGCTTCT GAAGAGGTTG 300
AGGAAAATGG TCACCACGTT ATCGTACACA GAGAGGGCAT CGCACCCTTC GCCACTTGCT 360 AAGCGTCTGT TTTCGCTTAT GGAGTCCAAG AAGACGAACC TGTGTGCCAG TGTCGATGTT 420
CGTACCACAG AGGAGTTGCT CAAGCTCGTT GATACGCTTG GTCCTTATAT CTGTCTGTTG 480
AAGACGCATA TTGATATCAT TGATGACTTC TCTATGGAGT CTACTGTGGC TCCACTGTTG 540
GAGCTTTCAA AAGAGCACAA TTTCCTCATC TTTGAGGACC GTAAGTTTGC TGATATCGGC 600
AACACCGTCA AGGCACAGTA CGCCGGTGGT GCGTTCAAGA TTGCACAATG GGCAGACATC 660 ACCAACGCCC ACGGTGTCAC CGGTCGAGGT ATCGTCAAGG GGTTGAAGGA GGCTGCACAG 720
GAAACCACGG ATGAGCCAAG AGGGCTGTTG ATGCTTGCTG AGCTAAGCTC CAAGGGCTCC 780
TTCGCTCACG GGACATATAC CGAGGAGACC GTGGAGATTG CCAAAACTGA TAAGGACTTT 840
TGTATTGGAT TCATCGCACA GAGAGACATG GGTGGCAGAG AAGATGGGTT CGACTGGATC 900
ATCATGACAC CAGGCGT GG ACTCGACGAT AAGGGCGACT CCCTGGGCCA ACAGTACAGA 960 ACTGTCGATG AGGTTGTCAG TGGTGGCTGT GACATCATCA TCGTTGGTAG AGGCTTGTTT 1020
GGAAAGGGAA GAGATCCAAC AGTGGAAGGT GAGCGTTATA GAAAAGCAGG CTGGGATGCT 1080
TATCTCAAGA GATACTCAGC TCAATAAACG TTGAGCTCTG GCTTGTATAG GTTCACTTGT 1140
ATAAAATGTT CATTACTGTT TTCGGAAGTT GTAGATTGC 1179
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 266 aminoácidos
(3) TIPO: aminoacidica
(C) RAMIFICACIÓN: simple
(0) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
(iii) HIPOTÉTICA: NO ( iv ) ANT I - SENT I DO : NO
(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Candida utilis
(B) CEPA: NRRL Y-1084 (íx) RASGOS:
(A) NOMBRE/CLAVE: PROTEÍNA
(B) LOCALIZACION: 1..266
(xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 2: Met Val Thr Thr Leu Ser Tyr Thr Glu Arg Ala Ser His Pro Ser Pro 1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Leu Phe Ser Leu Met Glu Ser Lys Lys Thr Asn Leu 20 25 30
Cys Ala Ser Val Asp Val Arg Thr Thr Glu Glu Leu Leu Lys Leu Val 35 40 45
Asp Thr Leu Gly Pro Tyr He Cys Leu Leu Lys Thi His He Asp He 50 55 60
He Asp Asp Pne Ser Met Glu Ser Thr Val Ala Pro Leu Leu Glu Leu 65 70 75 80
Ser Lys Glu His Asn Phe Leu He Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp 85 90 95
:ie Gly Asn Thr Val Lys Ala Gln Tyr Ala Gly Gly Ala Phe Lys He 100 105 110
Ala Gln Trp Ala Asp He Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Arg Gly 115 120 125
He Val Lys Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gln Glu Thr Thr Asp Glu Pro 130 135 140
Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Phe Ala 145 150 155 160 His Gly Thr Tyr Thr Glu Glu Thr Val Glu He Ala Lys Thr Asp Lys
165 170 175
Asp Phe Cys He Gly Phe He Ala Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg Glu 180 185 190
Asp Gly Phe Asp Trp He He Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Asp 195 200 205
Lys Gly Asp Ser Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val Val 210 215 220
Ser Gly Gly Cys Asp He He He Val Gly Arg Gly Leu Phe Gly Lys
225 230 235 240 Gly Arg Asp Pro Thr Val Glu Gly Glu Arg Tyr Arg Lys Ala Gly Trp
245 250 255 Asp Ala Tyr Leu Lys Arg Tyr Ser Ala Gln 260 265
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1190 pares de base
(B) TIPO: acido nucleico
(C) RAMIFICACIÓN: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(n) MOLECULE TIPO: ADN (genómico) (m) HIPOTÉTICA: NO (ív) ANTI-SENTIDO: NO
(vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Candida utilis (B) CEPA: NRRL Y-1084
(íx) RASGOS:
(A) NOMBRE/CLAVE: peptido maduro
(B) LOCALIZACIONH..1190 (D) OTRA INFORMACIÓN :/producto= "Enzima
Imidazol-glicerol-fosfato deshidratasa" /gen= "HIS3"
(xι) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 3:
ACCTCCCAAT CGCACAGGCA ACGATACAAA TTCAACGAGT ATTAACCATC TTGTGTGCTA 60
AAAAGAGTCG AAGAACAACA GTGCGCCAAA AAAAAAACTC CGGACCGCAC ACGACTCATC 120
GCTCTCGGAA TATCCCTCGG AATGCGCCAC TTCCGGGTGC GTGGCCATCG GAAGAGCGAA 180
GAGTCATCAC CATCGTACTT TAACGACTTA CTATTCTCAT TGAGTATTGA GAAGAAGGAT 240 AGAGAAATGG CTGAACGAAC GGTGAAACCC CAGAGAAGAG CTCTTGTGAA TCGTACAACA 300
AACGAAACGA AGATCCAGAT TTCCTTGAGT TTGGATGGTG GATACGTAAC GGTTCCGGAG 360
TCAATCTTCA AGGATAAGAA GTACGACGAT GCTACTCAAG TCACCTCTTC TCAGGTGATT 420
TCAATCAACA CGGGCGTTGG ATTCCTGGAC CACATGATCC ATGCTCTTGC GAAGCATGGT 480
GGGTGGAGTT TGATTGTGGA GTGTATTGGT GATTTGCACA TTGACGACCA CCACACCACC 540 GAGGACGTTG GTATTGCGCT GGGAGACGCC GTCAAGGAGG CCTTGGCATA TAGAGGTGTC 600
AAGAGATTTG GTAGCGGGTT TGCTCCATTG GACGAGGCTC TGAGCAGAGC CGTTGTTGAT 660
CTGAGTAACC GTCCGTTTGC CGTTGTTGAG CTGGGACTCA AGAGGGAAAA GATCGGTGAC 720
TTGTCATGTG AGATGATTCC TCACTTCTTG GAGAGTTTTG CCCAAGCAGC TCATATCACG 780 ATGCATGTTG ACTGTTTGAG AGGCTTCAAC GACCATCACA GAGCTGAATC CGCATTCAAG 840
GCCCTGGCAG TCGCCATTAA GGAATCCATC TCCAGTAACG GCACCAATGA TGTTCCCTCA 900
ACAAAGGGTG TTTTGTTCTA GATAGCAGTC TTTCTGTCTC TCTATTTATT CGATAAATAA 960
GAACTATGTA TATCTTTCTC TTTTAATTGT ATATGTACAT GCACAGCTGA CTTCATCAAC 1020
GGAAGATGTT ATTGAGTGCA GCCATTGTCT GACTGTCGTT ATCCTTCTTT GCGGATTTAC 1080
CAAGGACTCT ACGACCACTG GTGGCTTTGA TATGATTTCC GCCAGTACT TGTAAGAGGT 1140
GCAACGTCAA TGGAAACGGC ACCGTTAGCC TTGATGGTTG CACGGGTAGG 1190 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 210 aminoácidos
(B) TIPO: ammoacidica (C) RAMIFICACIÓN: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(n) TIPO DE MOLÉCULE: PROTEINA iin) HIPOTÉTICA: NO
(ív) ANTI-SENTIDO: NO
(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Candida utilis
(B) CEPA: NRRL Y-1084 ix) RASGOS:
(A) NOMBRE/CLAVE: PROTEINA (B) LOCALIZACION: 1..210
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 4: Met Ala Glu Arg Thr Val Lys Pro Gln Arg Arg Ala Leu Val Asn Arg 1 5 10 15
Thr Thr Asn Glu Thr Lys He Gln He Ser Leu Ser Leu Asp Gly Gly 20 25 30
Tyr Val Thr Val Pro Glu Ser He Phe Lys Asp Lys Lys Tyr Asp Asp 35 40 45
Ala Thr Gln Val Thr Ser Ser Gln Val He Ser He Asn Thr Gly Val 50 55 60
Gly Phe Leu Asp His Met He His Ala Leu Ala Lys His Gly Gly Trp 65 70 75 80
Ser Leu He Val Glu Cys He Gly Asp Leu riis He Asp Asp His His 85 90 95 Thr Thr Glu Asp Val Gly He Ala Leu Gly Asp Ala Val Lys Glu Ala 100 105 110
Leu Ala Tyr Arg Gly Val Lys Arg Phe Gly Ser Gly Phe Ala Pro Leu 115 120 125
Asp Glu Ala Leu Ser Arg Ala Val Val Asp Leu Ser Asn Arg Pro Phe
130 135 140
Ala Val Val Glu Leu Gly Leu Lys Arg Glu Lys He Gly Asp Leu Ser
145 150 155 160
:ys GH Met He Pro His Phe Leu Glu Ser Phe Ala Gln Ala Ala His 165 170 175
He Thr Met His Val Asp Cys Leu Arg Gly Phe Asn Asp His His Arg 180 185 190
Ala Glu Ser Ala Phe Lys Ala Leu Ala Val Ala He Lys Glu Ser He 195 200 205
Ser Ser 210
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO. 5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 2607 pares de base
(B) TIPO: acido nucleico 'O RAMIFICACIÓN: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal
(n) MOLECULE TIPO: ADN (geno ico) (m) HIPOTÉTICA: NO 'ιv) ANTI-SENTIDO: NO
'vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Candida utilis (B) CEPA: NRRL Y-1084
(ix) RASGOS:
(A) NOMBRE/CLAVE: peptido maduro (3) LOCALIZACIONH..2607 (D) OTRA INFORMACIÓN: /PRODUCTO= "Enzima mvertasa
(β-fructofuranosidasa) " /gen= "INVl"
íxi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 5:
ATCGGCACAG AAGCGACACT GATGTCCTCC GTCTAAAACT CATCGTTTAA TAACTTCTGC 60
ATTGGCAGCT CCGGAGCACA CTCAATTGGG ACTAAAAGAA GTAACATTTG TACTACAATG 120
AGTCGTATAG AGTCATGTAT AAGAAGAACA GCAAGAAAAG AAAATATTGG TGCAGAATTC 180 AACAGCTTCT GAGATCGTAA GAACAGCCAA TCATTTACCG GAATTCATTA TGATACCTAT 240
AGAAAGACAC AAATTGTTGG GTAAAACAAC AGAACATACC TGTATAGGGG TTTATACGAG 300
AATTTTCTTA GACGTCTCCC CCAGTGTCCG CCAAAGCAAC TTACATGTGG AGTTTGAATT 360
TGGATGCGCC TTTTCCTTTA AACGGTCACC TGAGGTCTGA ATCTCAATGC AAATATCATT 420 ACACCAATAA TAAAGGTGCA TATAACCCCA TAACCTGTAC ATAAAGAACG GCACATGATC 480
CAATTTATCG ACGTTATGCC TTGTCAGACC ATCGTCGTGA ACTTTTCTAA ACCGGATAAA 540
CTCTCGCACG GATTATAACG TGCGTCTGTG ATATGCACTC CGGAAAAAAC CCCCGTGGAG 600
AAGTGAAGCG GCCACCTGTG GAGCAGAAAT TTCGATCGAC GTTTCAAGTT CAAATGGTTT 660
CCTGTTGTCA AAGGGCTTGA GATTTACCAC TTGAGCATTT GTGCTCAGAA TTCGGAGAGC 720 ATTCCCATGA GTGGTGTCCA AAAACACTAT AAAAGCAGCA CAGGGATGTC GTTGACAAAA 780
GATGCCTCAG AGGACCAAGA AGACATCAAG AGTCTCACGA TGAACACTAG TTTAGTTGAT 840
TCCAGCATTT ACAGACCATT AGTCCATCTA ACGCCACCAG TGGGGTGGAT GAACGACCCT 900
AATGGTCTCT TCTACGATTC ATCTGAATCT ACTTACCATG TGTACTACCA ATACAACCCA 960
AACGATACGA TTTGGGGATT GCCTCTATAT TGGGGACATG CCACCTCTGA TGATTTGTTA 1020 ACGTGGGACC ACCATGCGCC TGCAATTGGA CCTGAGAATG ATGATGAGGG TATTTACTCT 1080
GGATCTATAG TCATAGACTA CGATAATACC TCAGGGTTCT TTGACGATTC AACAAGACCA 1140
GAACAGAGAA TCGTTGCCAT TTATACCAAT AACTTACCAG ATGTCGAGAC GCAAGACATT 1200
GCCTATTCCA CGGACGGTGG TTATACTTTC GAAAAGTATG AAAACAACCC AGTTATAGAC 1260
GTCAATTCGA CCCAATTTAG GGATCCGAAG GTGATTTGGT ATGAGGAAAC TGAACAATGG 1320 GTCATGACTG TGGCAAAGAG TCAAGAGTAC AAGATCCAGA TTTACACCTC TGACAATTTG 1380
AAAGACTGGA GTTTGGCCTC GAATTTCTCA ACCAAGGGTT ATGTTGGTTA TCAGTATGAA 1440
TGTCCAGGTC TATTCGAAGC CACTATTGAA AACCCAAAGA GTGGTGACCC AGAGAAGAAA 1500
TGGGTTATGG TCTTAGCAAT CAATCCAGGC TCACCTCTTG GTGGTTCCAT AAATGAATAC 1560
TTTGTTGGTG ATTTCAACGG TACTGAATTC ATTCCAGATG ATGACGCTAC AAGATTTATG 1620 GATACTGGTA AGGACTTCTA TGCCTTCCAA GCGTTCTTCA ATGCACCGGA GAATCGGTCA 1680
ATTGGAGTTG CCTGGTCATC GAACTGGCAG TATTCCAACC AGGTTCCGGA TCCTGATGGA 1740
TATAGAAGCT CCATGTCATC AATCAGAGAG TACACTCTGA GATATGTCAG TACGAATCCA 1800
GAATCTGAAC AGTTGATCCT TTGTCAAAAA CCATTCTTTG TGAACGAGAC AGACTTGAAG 1860 GTGGTTGAAG AGTACAAGGT TTCAAACAGT TCTTTGACCG TGGACCACAC GTTTGGAAGT 1920
AGCTTTGCAA ACTCCAACAC CACTGGACTG TTGGATTTCA ACATGACTTT CACGGTTAAC 1980 GGTACAACTG ACGTTACGCA GAAGGACTCC GTCACCTTTG AGCTCAGAAT CAAATCTAAC 2040
CAAAGCGACG AGGCAATTGC GCTTGGTTAC GATTACAACA ACGAGCAATT CTACATCAAC 2100
AGAGCCACAG AGAGCTACTT CCAGAGAACC AACCAGTTCT TCCAGGAGAG ATGGTCCACG 2160
TACGTTCAGC CTCTCACAAT CACCGAATCT GGTGATAAAC AGTACCAGCT CTACGGATTG 2220
GTTGATAACA ACATCCTTGA GTTGTACTTC AACGACGGGG CATTCACATC CACAAACACC 2280 TTCTTCTTGG AGAAGGGCAA GCCATCAAAC GTCGATATCG TGGCAAGCTC CTCCAAGGAG 2340
GCTTACCACC GTGGACCAGC TGACTGAGAC GTCTCACTGT TTGACGAATA CGCACGTGAA 2400
AGCTATATAA GGGATCACGT GGTCTAGCCA CCCCAGTCTA AAAGCTTCAG CAAACCGCCA 2460 CTATATAAAC AGACAGGTTT GTCACTTTTC AACAAAACAA ATATCTTCTT CTTTTACCCT 2520
TCAGAGTAGT TTGTACGAGT GCTTTTTTCA ATTATATATA CAACAACGTG AGCTGCCTTT 2580
GGATATGCAA TCAACAGCGC TCTCTTT 2607 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 6:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 533 aminoácidos (B) TIPO: aminoacidica
C) RAMIFICACIÓN: simple 'D) TOPOLOGÍA: lineal
(ιι) MCLECULE TIPO: PROTEINA (íii) HIPOTÉTICA: NO (ív) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Candida utilis
(B) CEPA: NRRL Y-1084
(íx) RASGOS: (A) NOMBRE/CLAVE: PROTEÍNA
'B) LOCALIZACIÓNH..533
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SΞC ID NO. 6: Met Ser Leu Thr Lys Asp Ala Ser Glu Asp Gln Glu Asp He Lys Ser 1 5 10 15
Leu Thr Met Asn Thr Ser Leu Val Asp Ser Ser He Tyr Arg Pro Leu 20 25 30
Val H s Leu Thr Pro Pro Val Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu 35 40 45 Phe Tyr Asp Ser Ser Glu Ser Thr Tyr His Val Tyr Tyr Gln Tyr Asn
50 55 60
Pro Asn Asp Thr He Trp Gly Leu Pro Leu Tyr Trp Gly His Ala Thr 65 70 75 80
Ser Asp Asp Leu Leu Thr Trp Asp His His Ala Pro Ala He Gly Pro 85 90 95
Glu Asn Asp Asp Glu Gly He Tyr Ser Gly Ser He Val He Asp Tyr 100 105 110
Asp Asn Thr Ser Gly Phe Phe Asp Asp Ser Thr Arg Pro Glu Gln Arg
115 120 125
He Val Ala He Tyr Thr Asn Asn Leu Pro Asp Val Glu Thr Gln Asp 130 135 140
He Ala Tyr Ser Thr Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Glu Lys Tyr Glu Asn 145 150 155 160
Asn Pro Val He Asp Val Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val 165 170 175
He Trp Tyr Glu Glu Thr Glu Gln Trp Val Met Thr Val Ala Lys Ser 180 185 190
Gln Glu Tyr Lys He Gln He Tyr Thr Ser Asp Asn Leu Lys Asp Trp 195 200 205
Ser Leu Ala Ser Asn Phe Ser Thr Lys Gly Tyr Val Gly Tyr Gln Tyr 210 215 220
Glu Cys Pro Gly Leu Phe Glu Ala Thr He Glu Asn Pro Lys Ser Gly 225 230 235 240
Asp Pro Glu Lys Lys Trp Val Met Val Leu Ala He Asn Pro Gly Ser 245 250 255 Pro Leu Gly Gly Ser He Asn Glu Tyr Phe Val Gly Asp Phe Asn Gly
260 265 270
Thr Glu Phe He Pro Asp Asp Asp Ala Thr Arg Phe Met Asp Thr Gly 275 280 285
Lys Asp Phe Tyr Ala Phe Gln Ala Phe Phe Asn Ala Pro Glu Asn Arg 290 295 300
Ser He Gly Val Ala Trp Ser Ser Asn Trp Gln Tyr Ser Asn Gln Val 305 310 315 320
Pro Asp Pro Asp Gly Tyr Arg Ser Ser Met Ser Ser He Arg Glu Tyr 325 330 335 Thr Leu Arg Tyr Val Ser Thr Asn Pro Glu Ser Glu Gln Leu He Leu
340 345 350 Cys Gln Lys Pro Phe Phe Val Asn Glu Thr Asp Leu Lys Val Val Glu 355 360 365
Glu Tyr Lys Val Ser Asn Ser Ser Leu Thr Val Asp His Thr Phe Gly 370 375 380
Ser Ser Phe Ala Asn Ser Asn Thr Thr Gly Leu Leu Asp Phe Asn Met
385 390 395 400
Thr Phe Thr Val Asn Gly Thr Thr Asp Val Thr Gln Lys Asp Ser Val 405 410 415
Thr Phe Glu Leu Arg He Lys Ser Asn Gln Ser Asp Glu Ala He Ala 420 425 430
Leu Gly Tyr Asp Tyr Asn Asn Glu GIn Phe Tyr He Asn Arg Ala Thr
435 440 445
Glu Ser Tyr Phe Gln Arg Thr Asn Gln Phe Phe Gln Glu Arg Trp Ser
450 455 460
Thr Tyr Val Gln Pro Leu Thr He Thr Glu Ser Giy Asp Lys Gln Tyr 465 470 475 480
Gln Leu Tyr Gly Leu Val Asp Asn Asn He Leu Giu Leu Tyr Phe Asn 485 490 495
Asp Gly Ala Phe Thr Ser Thr Asn Thr Phe Phe Leu Glu Lys Gly Lys 500 505 510 Pro Ser Asn Val Asp He Val Ala Ser Ser Ser Lys Glu Ala Tyr His 515 520 525
Arg Gly Pro Ala Asp 530

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un sistema de transformación para la levadura Candida utilis caracterizado porque emplea una célula de levadura hospedera capaz de ser transformada con un material ADN recombinante donde dicho hospedero es defectivo en al menos una via biosintética .
2. Un sistema de transformación para la levadura Candida utilis según la reivindicación 1 caracterizado porque emplea una célula de levadura hospedera que es defectiva en al menos la via biosintética de un aminoácido.
3. Un sistema de transformación para la levadura Candida u til is según las reivindicación 2 caracterizado porque emplea una célula de levadura hospedera que es defectiva en la via biosintética del uracilo.
4. Un sistema de transformación de según la reivindicación 3 caracterizado porque dicha levadura hospedera es defectiva en la actividad de la enzima orotidin-5-fosfato descarboxilasa .
5. Un sistema de transformación según la reivindicación 4 caracterizado porque dicha célula de levadura hospedera es Candida u til is NRRL Y-1084 CUT35 (Número de Depósito Pendiente) .
6. Un sistema de transformación para la levadura Candida utilis según las reivindicación 2 caracterizado porque emplea una célula de levadura hospedera que es defectiva en al menos la via biosintética de la histidina.
7. Un sistema de transformación de según la reivindicación 6 caracterizado porque dicha levadura hospedera es defectiva en la actividad de la enzima imidazol glicerol fosfato deshidratasa .
8. Un sistema de transformación según la reivindicación 7 caracterizado porque dicha célula de levadura hospedera es Candida utilis NRRL Y-1084 TMN3.
9. Un sistema de transformación según la reivindicación 1 caracterizado porque dicho material ADN recombinante contiene un gen funcional que complementa el defecto en la vía biosmtetica en la cual el hospedero es defectivo.
10. Un sistema de transformación según la reivindicación 9 caracterizado porque dicho gen funcional es el gen URA3 de Candida utilis .
11. Un sistema de transformación según la reivindicación 10 caracterizado porque dicho material ADN recombinante son los plasmado pURA5 y el plasmido pOC URA3.
12. Un sistema de transformación según la reivindicación 9 caracterizado porque dicho gen funcional es el gen HIS3 de
Candida utilis .
13. Un sistema de transformación según reivindicación 12 caracterizado porque dicho material ADN recombinante son los plasmados pHCU37 y pHCU40.
14. Una célula hospedera de la levadura de Candida utilis capaz de ser transformado con un ADN recombinante donde dicho hospedero es defectivo al menos en una vía biosmtetica .
15. Una célula hospedera de levadura de la reivindicación 14 caracterizada porque dicha célula hospedera es defectiva en al menos la vía biosmtetica de un aminoácido.
16. Una célula hospedera de levadura según la reivindicación
15 caracterizada porque dicha célula hospedera es defectiva en la vía biosmtetica del uracilo.
17. Una célula hospedera de levadura según la reivindicación
16 caracterizada porque dicha célula hospedera es defectiva en la actividad de la enzima orotιdιn-5-fosfato descarboxilasa .
18. La célula hospedera de levadura según la reivindicación 17 caracterizada porque es la cepa Candida utilis NRRL Y- 1084 CUT35 (Numero de Deposito Pendiente) .
19. Una célula hospedera de levadura según la reivindicación 15 caracterizada porque dicha célula hospedera es defectiva en la vía biosmtetica de la histidma.
20. Una célula hospedera de levadura según la reivindicación 19 caracterizada porque dicha célula hospedera es defectiva en la actividad de la enzima ímidazol glicerol fosfato deshidratasa .
21. Una célula hospedera de levadura según la reivindicación 20 caracterizada porque es la cepa Candida utilis NRRL Y- 1084 TMN3.
22. Un material ADN recombmante capaz de transformar una célula hospedera de la levadura de Candida u tilis caracterizado porque dicho material ADN recombinante contiene un gen funcional que complementa el defecto en la vía biosintetica en la cual el hospedero es defectivo.
23. Un material ADN recombinante de acuerdo a la reivindicación 22 caracterizado porque dicho gen funcional es el gen URA3 de Candida utilis .
24. Un material ADN recombmante según la reivindicación 23 caracterizado porque dicho material ADN recombinante son plasmidos pURA5 y pUREC3.
25. Un material ADN recombinante según la reivindicación 22 caracterizado porque dicho gen funcional es el gen HIS3 de Candida u tilis .
26. Un material ADN recombmante según la reivindicación 25 caracterizado porque dicho material ADN recombinante son los plasmado pHCU37 y pHCU40.
27. Procedimiento para la transformación de la levadura Candida u til is caracterizado porque comprende:
(a) Tratamiento de una cepa hospedera de la levadura Candida utilis con sales de metales alcalino; (b) Contactar el producto celular del paso (a) con el material ADN recombinante bajo condiciones adecuadas para la transformación; (c) Proceder bajo condiciones apropiadas para la electroporacion de la cepa hospedera. (d) Plaqueo del producto celular del paso (c) bajo condiciones selectivas del medio de cultivo.
28. Procedimiento según la reivindicación 27 caracterizado porque las sales de metales alcalinos empleadas en el paso
(a) son de Acetato de Litio a una concentración de 50 mM.
29. Procedimiento según la reivindicación 27 caracterizado porque dichas condiciones adecuadas para la transformación del paso (b) comprenden:
- Igual volumen de solución de polietilenglicol (PEG) al 70% por volumen de mezcla de la suspensión celular tratada con sales de Acetato de Litio y el ADN recombinante;
- Incubación a 30°C durante 60 minutos;
- Shock térmico provocado por tratamiento de la mezcla a 42*"C durante 5 minutos; y
- Enfriamiento en hielo durante 5 minutos.
30. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 27 caracterizado porque las condiciones apropiadas para la electroporación de la cepa hospedera del paso (c) son:
- campo eléctrico de 3,5 kV/cm;
- resistencia de 800 ^, y - capacitancia de 25 ^F .
31. Procedimiento para la transformación de la levadura Candida u tilis según la reivindicación 27 caracterizado porque emplea una célula de levadura hospedera capaz de ser transformada con un material ADN recombinante donde dicho hospedero es defectivo en al menos una vía biosmtetica .
32. Procedimiento según la reivindicación 31 caracterizado porque emplea una célula de levadura hospedera que es defectiva en al menos la vía biosmtetica de un aminoácido.
33. Procedimiento según la reivindicación 32 caracterizado porque emplea una célula de levadura hospedera que es defectiva en la vía biosintetica del uracilo.
34. Procedimiento según la reivindicación 33 caracterizado porque dicha levadura hospedera es defectiva en la actividad de la enzima orotιdm-5-fosfato descarboxilasa .
35. Procedimiento según la reivindicación 34 caracterizado porque dicha célula de levadura hospedera es Candida utilis NRRL Y-1084 CUT35 (Numero de Deposito Pendiente) .
36. Procedimiento según la reivindicación 32 caracterizado porque emplea una célula de levadura hospedera que es defectiva en al menos la vía biosmtetica de la histidma.
37. Procedimiento según la reivindicación 36 caracterizado porque dicha levadura hospedera es defectiva en la actividad de la enzima ímidazol glicerol fosfato deshidratasa .
38. Procedimiento según la reivindicación 37 caracterizado porque dicha célula de levadura hospedera es Candida u tilis NRRL Y-1084 TMN3.
39. Procedimiento según la reivindicación 31 caracterizado porque dicho material ADN recombinante contiene un gen funcional que complementa el defecto en la via biosintética en la cual el hospedero es defectivo.
40. Procedimiento según la reivindicación 39 caracterizado porque dicho gen funcional es el gen URA3 de Candida u til is .
41. Procedimiento según la reivindicación 40 caracterizado porque dicho material ADN recombinante son los plásmido pURA5 y el piasmido pUC URA3.
42. Procedimiento según la reivindicación 39 caracterizado porque dicho gen funcional es el gen HIS3 de Candida u til is .
43. Procedimiento según la reivindicación 42 caracterizado porque dicho material ADN recombinante son los plásmidos pHCU37 y pHCU40.
44. Una secuencia de ADN codificante para el gen URA3 de Candida u til s (No. Id. Sec. 1) .
45. Una secuencia de ADN codificante para el gen HIS3 de Candida u tilis (No. Id. Sec. 3).
46. Una secuencia de ADN codificante para el gen INVl de Candida util is (No. Id. Sec. 5) .
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